WO2019121162A1

WO2019121162A1 - Messgerät, messverfahren, hochdurchsatz-testgerät und messkit für elektrophysiologische messungen, insbesondere an zellaggregaten

Info

Publication number: WO2019121162A1
Application number: PCT/EP2018/084341
Authority: WO
Inventors: Steffen Hering
Original assignee: Chanpharm GmbH
Current assignee: Chanpharm GmbH
Priority date: 2017-12-19
Filing date: 2018-12-11
Publication date: 2019-06-27
Anticipated expiration: 2020-06-19
Also published as: DE102017130518B4; DE102017130518A1

Abstract

Ein elektrophysiologisches Messgerät (100) zur Erfassung mindestens eines elektrischen Messwerts an einer biologischen Zellprobe (1), umfasst eine Halteeinrichtung (10) mit einem Innenraum (11), der einen Bodenbereich (14) und einen Wandbereich (15) aufweist und zur Aufnahme der Zellprobe (1) in einem physiologischen Umgebungsmedium (2) konfiguriert ist, eine Perfusionseinrichtung (20) mit mindestens einer Mess-Perfusionskammer (21A), (21B), die zur Aufnahme eines Perfusionsmediums (3A), (3B) konfiguriert ist und über mindestens eine Mess-Perfusionsöffnung (22A), (22B) mit dem Innenraum (11) der Halteeinrichtung (10) verbunden ist, wobei eine zum Innenraum (11) der Halteeinrichtung 10 weisende Randfläche der Mess-Perfusionsöffnung (22A), (22B) aus einem elektrisch isolierenden Material gebildet ist, eine Elektrodeneinrichtung (30) mit mindestens einer Mess-Elektrode (31A), (31B), die jeweils für einen elektrischen Kontakt mit dem Perfusionsmedium in der mindestens einen Mess-Perfusionskammer (21A), (21B) angeordnet ist, und eine Messeinrichtung (40), die zur Erfassung des mindestens einen elektrischen Messwerts mit der mindestens einen Mess- Elektrode (31A), (31B) verbunden ist, wobei die Halteeinrichtung (10) mindestens einen Fixierabschnitt (12), (12A), (12B) aufweist, der benachbart zu der mindestens einen Mess-Perfusionsöffnung (22A), (22B) der mindestens einen Mess-Perfusionskammer (21A), (21B) angeordnet ist, und geometrische Eigenschaften des Fixierabschnitts (12), (12A), (12B) so gewählt sind, dass die Zellprobe (1) mittels des Fixierabschnitts (12), (12A), (12B) in einem deformierten Zustand in der Halteeinrichtung (10) fixierbar ist. Weiterhin wird ein Hochdurchsatz- Testgerät, ein elektrophysiologisches Messverfahren und ein Messkit für pharmakologische Untersuchungen beschrieben.

Description

Messgerät, Messverfahren, Hochdurchsatz-Testgerät und Messkit für elektrophysiologische Messungen, insbesondere an Zellaggregaten

Die Erfindung betrifft ein elektrophysiologisches Messgerät und ein elektrophysiologisches Mess verfahren zur Erfassung mindestens eines elektrischen Messwerts an einer biologischen Zell probe, insbesondere ein Messgerät und ein Messverfahren zur Erfassung von einem Aktionspo tential und/oder Oberflächenpotentialen der Zellprobe und/oder einem lonenstrom durch min destens eine Zellmembran der Zellprobe. Die Erfindung betrifft des Weiteren ein Hochdurchsatz- Testgerät, das eine Vielzahl von elektrophysiologischen Messgeräten enthält, und ein Messkit zur Erfassung mindestens eines elektrischen Messwerts an einer biologischen Zellprobe. Anwendun gen der Erfindung sind bei der Charakterisierung von biologischen Proben, insbesondere von Zel laggregaten, in der Pharmakologie, Medizin, Biochemie und/oder Biomedizin gegeben.

In der vorliegenden Beschreibung wird auf den folgenden Stand der Technik Bezug genommen, der den technischen Hintergrund der Erfindung darstellt:

[1] EP 1 040 349 Bl;

[2] O. P. Hamill et al. in "Pflügers Arch." 1981 Aug; 391(2):85-100;

[3] EP 1 349 916 A2;

[4] EP 1 311 655 Bl;

[5] US 2002/0064841 Al;

[6] EP 0 938 674 Bl;

[7] Y. I. Zilberter et al. in "Pflügers Arch." 1982 Aug;394(2):150-5;

[8] B. Schubert, R. Bodewei, S. Hering, A. Wollenberger in "J. Mol. Cell. Cardiol." 1987

Nov; 19(ll):1129-39;

[9] M. Huch et al. in "Development" 2017 Mar 15; 144(6);

[10] P. Saxena et al. in "Br. J. Pharmacol." 2017 Jul 6. doi: 10.1111/bph.13942;

[11] M. Hencek et al. in "Pflügers Arch." 1969;313(l):71-9; und

[12] N. Akaike et al. in "Jpn. J. Physiol." 1994;44(5):433-73.

Elektrophysiologische Untersuchungen an Proben aus mindestens einer biologischen Zelle oder Zellaggregaten umfassen insbesondere die Messung von lonenströmen durch die Zellmembran (”patch-clamp"-Messung) oder die Messung von Aktionspotentialen an der Zellmembran ("cur- rent-clamp"-Messung). Bei dem älteren "voltage-clamp"-Verfahren wird ein Kompensationsstrom in die Probe geleitet, um die Membranspannung konstant zu halten, wohingegen bei "patch- clamp"-Messungen wegen der geringen Stromamplituden auf die Injektion eines Kompensations stromes während der Messung verzichtet werden kann.

Es ist bekannt, elektrophysiologische Messungen an Pipettenspitzen oder mit planaren Messgerä ten durchzuführen, bei denen einzelne Zellen oder rekonstituierte Membransysteme auf einer Pore in einer ebenen Oberfläche ("patch-Pore") positioniert werden ([1], [2]). Es können mehrere Poren in einer Oberfläche vorhanden sein und somit mehrere Einzelzellen gleichzeitig mit der "patch-clamp" Technik ([2]) untersucht werden. Die (Multiarray-)-"patch-clamp"-Methode bzw. "patch-clamp"-Chips werden z. B. in [1] und [3] beschrieben.

Figur 15 (Stand der Technik) zeigt ein Beispiel eines herkömmlichen planaren "patch-clamp"- Messgeräts 100', das eine Halteeinrichtung 10' zur Aufnahme einer Suspension 2' biologischer Zel len 1' und eine Mess-Perfusionskammer 21' mit einer Mess-Pore 22' aufweist. Die Mess-Perfu- sionskammer 21' ist mit einer Platte 23' mit adhäsiver Oberfläche verschlossen, in der die Mess- Pore 22' gebildet ist. Über Zufuhr- und Abfuhrleitungen 24' kann durch die Mess-Perfusionskam- mer 21' ein Perfusionsmedium geleitet werden, das je nach "patch-clamp"-Konfiguration eine int razelluläre (”whole-ceN"-Konfiguration) oder extrazelluläre Lösung (”cell-attached"-Konfiguration) umfasst ([2]). In der Mess-Perfusionskammer 21' befindet sich eine Elektrode 31', die zur Erfas sung eines Potentials oder eines Stroms relativ zu einer Referenzelektrode 16' in der Halteeinrich tung 10' mit einem Operationsverstärker (nicht gezeigt) verbunden ist.

Für die "patch-clamp"-Messung ist eine abdichtende Adhäsion der Zelloberfläche im Randbereich der Mess-Pore 22' mit der Bildung eines hohen elektrischen Widerstands (”seal"-Widerstand) zwi schen dem Potential in der Pore und dem Potential in der Umgebung der Zellprobe erforderlich ([2]). Die Oberflächen herkömmlicher "patch-clamp"-Messgeräte ("adhärente Oberflächen") be stehen daher aus elektrisch isolierenden Materialien, auf denen Zellen gut haften, wie z.B. Glas, und sie können zusätzlich Beschichtungen aufweisen, die das Anhaften der Zellen verbessern ([1],

[3] )·

Zur elektrophysiologischen Messung mit dem Messgerät 100' wird die Suspension 2' in die Hal teeinrichtung 10' gefüllt und durch einen Fluidkanal 11' über die Mess-Pore 22' geleitet. Eine der Zellen wird durch Anlegen eines Unterdrucks in der Mess-Perfusionskammer 21' oder einer zu sätzlichen Saugeinrichtung oder durch elektrostatische Kräfte in der Mess-Pore 22' platziert ([1], [4]). Anschließend folgt an der Zelle 1' in der Mess-Pore 22' die Messung von lonenströmen durch die Membran der Zelle ([2]).

Die herkömmliche Technik, z. B. gemäß Figur 15, hat den Nachteil, dass die verabreichte Suspen sion eine möglichst hohe Zelldichte (z.B. 10⁶ Zellen/ml) aufweisen muss, damit eine Zelle mit ho her Wahrscheinlichkeit auf der Mess-Pore 22' platziert werden kann. Aus [5] und [6] ist zwar be kannt, die Halteeinrichtung an der Mess-Pore als Trichter zu gestalten, der die Zellen zur Mess- Pore lenkt. Der Trichter hat jedoch nur eine grobe Zuführungsfunktion. Ein weiterer Nachteil be steht darin, dass die Zellen eine bestimmte Größe (Durchmesser z. B. < 30 pm) nicht überschrei ten dürfen, damit sie in der Suspension in einem schwebenden Zustand gehalten werden können und nicht auf den Boden der Halteeinrichtung absinken. Große Zellen mit einem Durchmesser von z. B. 500 pm bis 800 pm, wie z.B. Xenopus Oozyten, lassen sich mit dem herkömmlichen planaren Messgerät nicht untersuchen. Aufgrund der Größenbeschränkung ist das "patch-clamp"-Messge- rät auf die Untersuchung von kleineren Zellen beschränkt und für Zellaggregate ungeeignet.

Von Y. I. Zilberter et al. [7] wird eine elektrophysiologische Messung an einer großen zylinderför migen Zelle (Abmessungen: 200 pm Länge, Durchmesser: 50 pm) beschrieben, die an einer Pipet tenspitze positioniert ist. Die Mündung der Pipettenspitze (Mess-Pore) ist dafür ausgelegt, einen so genannten Makropatch zu bilden, der anders als bei der "patch-clamp"-Messung an einzelnen lonenkanälen eine Vielzahl von z.B. 10 bis 1000 lonenkanälen abdeckt. Ein Teil der Oberfläche der Zelle wird mit der patch-Pipette isoliert, und bei Applikation eines Potentialsprungs fällt das ge samte Potential an dem Makropatch ab. Diese Messung hat eine hohe Genauigkeit, da die restli che Membranoberfläche der Zelle viel größer als der Makropatch unter der Mess-Pore ist und da mit der Widerstand der restlichen Oberfläche in Relation zum Makropatch vernachlässigbar klein ist. Dies ermöglicht eine schnelle Umladung und die Messung schneller Natriumströme. Die an ei ner einzelnen Zelle ausgeführte Technik gemäß [7] wurde von Schubert et al. [8] auf die Messung an einem Zellaggregat übertragen. Dabei erwies es sich jedoch als schwierig, das Zellaggregat zu verlässig an der Pipettenspitze zu halten.

Elektrophysiologische Untersuchungen von Zellaggregaten haben im Vergleich zur Messung an Einzelzellen den Vorteil, dass im Zellaggregat eine dreidimensionale, "in vivo"-ähnliche Mikroum gebung der Zellen geschaffen wird. Besonderes Interesse besteht dabei an Zellaggregaten aus dif- ferenzierten Zellen, insbesondere Stammzellen (so genannter "Organoid", "Spheroid", "Cell Ag gregate", oder "Cell Cluster", insbesondere "Cardiac Body") und/oder aus Gewebefasern, wie z. B. Muskelfasern. Zellen in dreidimensionalen Strukturen wachsen generell unter ähnlichen Bedin gungen wie in nativem Gewebe und sind deshalb besonders geeignet für z. B. toxikologische, pharmakologische und physiologische "patch-clamp"-Untersuchungen. Zellaggregate begünstigen ferner Differenzierungsprozesse der Einzelzellen, und sie weisen homogenere Eigenschaften auf ([9]), was sich auf die Homogenität z. B. von gemessenen Aktionspotentialen auswirkt. So haben die Aktionspotentiale von einzelnen Herzzellen eine hohe Variabilität, z. B. der Länge des Aktions potentials und des Ruhepotentials. Diese Variabilität erschwert es, zu statistisch signifikanten Aus sagen über Veränderungen am Aktionspotential bei Testung von Substanzen zu gelangen ([10]).

Im Aggregat hingegen wird die Variabilität ausgeglichen, da Einzelzellen innerhalb des Aggregates durch Nexuskontakte (elektrische Verbindungen zwischen benachbarten Zellen) verbunden sind. Ein Aggregat aus differenzierten Stammzellen ähnelt durch diese synzytiale Struktur einem Herz muskelsegment. Auf Basis der Nexuskontakte können sich Aktionspotentiale in Aggregaten, wie in nativen Muskeln, ausbreiten und gemessen werden. Substanztestungen an Aggregaten können mit weniger Variabilität als an Einzelzellen erfolgen.

Ein Nachteil der Zellaggregate besteht jedoch darin, dass keine elektrophysiologischen Messge räte verfügbar sind, mit denen unter praktischen Bedingungen routinemäßig und zuverlässig an Zellaggregaten gemessen werden kann. Ein weiter Nachteil der Messung an Zellaggregaten be steht darin, dass diese aufgrund der Ausbildung von Myofibrillen zwischenzelluläre Kräfte und Kontraktionen zeigen, so dass sich ihre Größe und Form während der Messung wiederholt än dern. Es sind verschiedene Messvorrichtungen bekannt, mit denen die Kontraktionen z. B. mit op tischen Mitteln oder einer Impedanzmessung untersucht wird. Die Kontraktionen stellen eine Her ausforderung bei elektrophysiologischen Untersuchungen dar, da sie den Kontakt des Zellaggre gats zur Mess-Pore (den "seal-Widerstand") verändern und damit das Ergebnis einer "patch- clamp"-Messung beeinträchtigen können ([2]). Auswirkungen von Kontraktionen auf das Ergebnis elektrophysiologischer Untersuchungen können zwar vermieden werden, wenn ein Zellaggregat auf dem Messgerät festgespannt wird, wie von M. Hencek et al. [11] bei einer Untersuchung an einer Herzmuskelfaser mit dem "voltage-clamp"-Verfahren gezeigt wurde. Das Aufspannen von Muskelfasern kann jedoch nicht auf die Untersuchung empfindlicher Zellaggregate übertragen werden.

Ein weiterer Nachteil der Messung an Zellaggregaten besteht darin, dass Zellzwischenräumen un ter physiologischen Bedingungen mit einer elektrisch leitenden, wässrigen Flüssigkeit gefüllt sind, die durch Leckströme zwischen den Zellen außerhalb der Nexuskontakte die elektrophysiologi- sche Untersuchung beeinträchtigen kann. Von M. Hencek et al. [11] wurde daher die Flüssigkeit in den Zellzwischenräumen der Muskelfaser mittels Perfusion durch eine nicht-leitende Saccharose- Lösung ersetzt. Die Perfusion der Oberfläche der aufgespannten Muskelfaser erfolgte durch eine Ringöffnung, die konzentrisch um die Mess-Pore angeordnet ist. Zellaggregate haben jedoch eine runde Form, was die Perfusion eines Abschnittes des Aggregates erschwert.

Ein weiteres Problem ergibt sich daraus, dass herkömmliche elektrophysiologische Messgeräte keine gleichzeitigen Messungen insbesondere von Aktionspotentialen und lonenströmen an Zell aggregaten ermöglichen. Für die lonenstrommessungen ("patch-clamp") oder Aktionspotential messungen ("current-clamp") an Einzelzellen enthalten diese Messgeräte jeweils eine Elektrode. Für die gleichzeitige Erfassung von Aktionspotentialen und lonenströmen wären jedoch mindes tens zwei ableitende Elektroden und eine ausreichende Isolation der Aggregatoberfläche unter der Mess-Pore erforderlich. Die für "patch-clamp"-Messungen an Aggregaten oder Oozyten erfor derlichen patch-Poren ("Makropatches") sind größer (z.B. Durchmesser > 2 pm bis 100 pm) als für "patch-clamp" Messungen an Einzelzellen und können bei Messungen an Aggregaten mehr als eine Zelloberfläche umfassen.

Schließlich ist kein bekanntes elektrophysiologisches Messgerät für zuverlässige und reproduzier bare "patch-clamp"-Messungen an Zellaggregaten geeignet, da einzelne Zellaggregate oder große Zellen nicht gezielt in einer Mess-Pore positioniert werden können. Eine gezielte Applikation von Aggregaten oder großen Zellen ist jedoch besonders wichtig bei Hochdurchsatzverfahren, wenn die Messungen an mehreren Aggregaten oder Oozyten gleichzeitig erfolgen und die Aggregate oder Oozyten mit automatischen Pipettiersystemen verabreicht werden sollen. Einzelne Aggre gate oder große Zellen, die ggf. ungezielt in ein Zellreservoir (Figur 15) verabreicht werden, sinken unter Schwerkrafteinwirkung auf die adhärente Oberfläche neben die Mess-Pore, wo sie anhaften und für lonenstrommessungen nicht mehr verwendbar sind. Ferner wäre die Zufuhr einer Suspen sion mit einer Vielzahl von Zellaggregaten oder großen Zellen nachteilig, da dies die benötigten Zellmengen stark erhöhen und damit hohe Kosten verursachen würde.

Aufgrund der genannten Herausforderungen ist kein Hochdurchsatz-Testgerät und auch kein Messkit verfügbar, mit dem Zellaggregate zuverlässig untersucht werden können. In [6] wird zwar erwähnt, dass sich in einem Trichter über einer Mess-Pore ein Zellhaufen bilden kann. Dabei han delt es sich jedoch nicht um Zellaggregate, die durch Differenzierungsprozesse geprägt sind und aus miteinander gewachsenen und verbundenen Zellen bestehen. Die elektrophysiologische Mes sung erfolgt in [6], mit extrazellulären Elektroden an Zellhaufen, die sich ggf. im Trichterbereich bilden.

Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes elektrophysiologisches Messgerät und ein ver bessertes elektrophysiologisches Messverfahren zur Erfassung mindestens eines elektrischen Messwerts an einer biologischen Zellprobe bereitzustellen, mit denen Nachteile und Beschrän kungen herkömmlicher Techniken vermieden werden können. Das Messgerät bzw. das Messver fahren sollen insbesondere elektrophysiologische Untersuchungen mit erhöhter Genauigkeit, Re produzierbarkeit und Zuverlässigkeit ermöglichen, für die Untersuchung von Zellaggregaten und/oder größeren Zellen geeignet sein, einen erweiterten Anwendungsbereich aufweisen, für Hochdurchsatzverfahren (insbesondere Hochdurchsatztestverfahren) geeignet sein, eine Halte rung der Zellprobe mit erhöhter Stabilität ermöglichen und/oder die gleichzeitige Messung ver schiedener elektrischer Messwerte ermöglichen. Die Aufgabe der Erfindung ist es des Weiteren, ein verbessertes Hochdurchsatz-Testgerät und ein verbessertes elektrophysiologisches Messkit zur Erfassung mindestens eines elektrischen Messwerts an einer biologischen Zellprobe bereitzu stellen, mit dem Nachteile und Beschränkungen herkömmlicher Techniken vermieden werden können.

Diese Aufgaben werden durch ein Messgerät, ein Messverfahren, ein Hochdurchsatz-Testgerät bzw. ein Messkit mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Anwen dungen und Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.

Gemäß einem ersten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung wird die obige Aufgabe durch ein elektrophysiologisches Messgerät gelöst, das zur Erfassung mindestens eines elektrischen Mess werts an einer biologischen Zellprobe eingerichtet ist. Das Messgerät umfasst mindestens eine Halteeinrichtung, eine Perfusionseinrichtung, eine Elektrodeneinrichtung und eine Messeinrich tung.

Die Halteeinrichtung weist einen Innenraum auf, der zur Aufnahme der Zellprobe mit einer cha rakteristischen Größe (maximale Querschnittsdimension, z. B. Durchmesser) insbesondere im Be reich von 50 pm bis 1 mm in einem physiologischen Umgebungsmedium ausgelegt ist. Die Hal teeinrichtung hat einen Bodenbereich, der einen Teilbereich der Halteeinrichtung an deren Unter seite umfasst. Der Bodenbereich kann eine Bodenwand mit mindestens einer Perfusionsöffnung umfassen oder hin zu der Perfusionseinrichtung offen sein (Bodenöffnung). Der Bodenbereich ist horizontal ausgerichtet. Die Vertikalrichtung wird auch als Längsrichtung der Halteeinrichtung be zeichnet. Des Weiteren hat die Halteeinrichtung einen Wandbereich, der die Halteeinrichtung seitlich quer zu der Längsrichtung begrenzt. An der Oberseite ist die Halteeinrichtung offen oder durch einen Deckel verschlossen.

Die Perfusionseinrichtung umfasst eine oder mehrere Mess-Perfusionskammern. Jede Mess-Per- fusionskammer ist zur Aufnahme eines Perfusionsmediums konfiguriert und an mindestens einer Mess-Perfusionsöffnung (auch als Perfusionspore bezeichnet) hin zum Innenraum der Halteein richtung offen. Die Innenform der Mess-Perfusionskammer ist frei wählbar und vorzugsweise eine Quaderform, eine Zylinderform oder eine langgestreckte Kanalform oder eine Zusammensetzung aus diesen. Die Mess-Perfusionskammer kann einteilig geformt und über eine einzige, vorzugs weise kreisförmige Mess-Perfusionsöffnung mit dem Innenraum der Halteeinrichtung verbunden sein (einseitige Perfusion). Die Mess-Perfusionskammer kann alternativ mehrteilig geformt und über mehrere, vorzugsweise kreisförmige Mess-Perfusionsöffnungen mit dem Innenraum der Hal teeinrichtung verbunden sein (durchströmende Perfusion). Des Weiteren können zwei oder mehr Mess-Perfusionskammern jeweils über eine oder mehrere Mess-Perfusionsöffnungen mit dem In nenraum der Halteeinrichtung verbunden sein. Des Weiteren können zwei oder mehr Halteein richtungen vorgesehen sein, die gemeinsam mit mindestens einer Mess-Perfusionskammer oder getrennt mit mehreren Mess-Perfusionskammern verbunden sind. Wenn mehrere Mess-Perfusi- onsöffnungen vorgesehen sind, können diese den gleichen Durchmesser oder verschiedene Durchmesser aufweisen. Eine in der Mess-Perfusionsöffnung positionierte Zellprobe ist durch die Mess-Perfusionsöffnung(en) mit einem Perfusionsmedium in der zugehörigen Mess-Perfusions- kammer perfundierbar. Eine zum Innenraum der Halteeinrichtung weisende Randfläche der Mess- Perfusionsöffnung(en) ist aus einem elektrisch isolierenden Material gebildet.

Vorzugsweise ist jede Mess-Perfusionskammer für eine Durchströmung mit dem Perfusionsme dium, Spülung der Zellprobe mit dem Perfusionsmedium und/oder die Bildung eines Über- oder Unterdrucks im Perfusionsmedium (relativ zum Druck in der Halteeinrichtung) ausgelegt und hierzu jeweils mit einer Druckeinrichtung und Steuerelementen, wie z. B. Ventilen ausgestattet und zur Verbindung mit einem Flüssigkeitsreservoir des jeweiligen Perfusionsmediums ausgelegt. Die Perfusionskammern der Perfusionseinrichtung sind insbesondere für eine individuelle Einstel lung eines Unterdrucks an der jeweils zugehörigen Perfusionsöffnung ausgelegt.

Die Elektrodeneinrichtung weist eine oder mehrere Mess-Elektroden auf. Jede Mess-Elektrode ist in Bezug auf jeweils eine Mess-Perfusionskammer so angeordnet, dass bei Befüllung der Mess- Perfusionskammer mit einem Perfusionsmedium ein elektrischer Kontakt mit dem Perfusionsme dium gegeben ist. Die Mess-Elektrode ist in der Mess-Perfusionskammer oder in einem mit der Mess-Perfusionskammer verbundenen Raum, wie z. B. einer Flüssigkeitsleitung, angeordnet. Die Messeinrichtung, die vorzugsweise mindestens einen Spannungsverstärker und/oder Operations verstärker umfasst, ist zur Erfassung des mindestens einen elektrischen Messwerts mit der min destens einen Mess-Elektrode verbunden.

Gemäß der Erfindung weist der Innenraum der Halteeinrichtung in einem Teilbereich, der benach bart (oder: angrenzend) zu der mindestens einen Mess-Perfusionsöffnung der mindestens einen Mess-Perfusionskammer angeordnet ist, mindestens einen Fixierabschnitt auf. Die Anordnung be nachbart zu der mindestens einen Mess-Perfusionsöffnung der mindestens einen Mess-Perfusi- onskammer bedeutet vorzugsweise, dass der Fixierabschnitt die mindestens eine Mess-Perfusi- onsöffnung enthält, die mindestens eine Mess-Perfusionsöffnung zum Wandbereich der Halteein richtung mündet, die mindestens eine Mess-Perfusionsöffnung zum Bodenbereich der Halteein richtung mündet, und/oder die mindestens eine Mess-Perfusionsöffnung mit einem Abstand vom Bodenbereich gleich der Höhe einer Perfusionskammer angeordnet ist.

Der mindestens eine Fixierabschnitt zeichnet sich durch derartige geometrische Eigenschaften des Innenraums der Halteeinrichtung aus, dass die Zellprobe in dem Fixierabschnitt in einem defor mierten, z. B. elongierten, eingeschnürten und/oder komprimierten Zustand, fixierbar ist. Geo metrische Eigenschaften, insbesondere umfassend einen Innendurchmesser des Fixierabschnitts, eine axiale Länge des Fixierabschnitts in einer Längsrichtung der Halteeinrichtung (insbesondere senkrecht zur Randfläche der mindestens einen Mess-Perfusionsöffnung) und/oder eine Neigung der Innenwand des Fixierabschnitts hin zur mindestens einen Mess-Perfusionsöffnung, sind so ge wählt, dass die Zellprobe in dem Fixierabschnitt ortsfest positionierbar ist (Konfiguration des Fi xierabschnitts für eine Deformation der Zellprobe).

Der Innendurchmesser des Fixierabschnitts ist vorzugsweise geringer als 400 pm, insbesondere geringer als 100 pm. Der Fixierabschnitt ist so geformt, dass die Haltekraft, die im Fixierabschnitt auf die deformierte Zellprobe wirkt, größer als intrazelluläre Deformationskräfte der Zellprobe, Druckkräfte an der jeweiligen Mess-Perfusionsöffnung (und/oder ggf. mindestens einer weiteren Perfusionsöffnung) und/oder Perfusions-Strömungskräfte im Innenraum der Halteeinrichtung an der mindestens einen Mess-Perfusionsöffnung ist. Gemäß einem zweiten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung wird die obige Aufgabe durch ein elektrophysiologisches Messverfahren, vorzugsweise unter Verwendung des Messgeräts gemäß dem ersten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung gelöst, wobei folgenden Schritte vorgese hen sind. Die Zellprobe wird an einer Halteeinrichtung bereitgestellt, indem die Zellprobe mit ei ner Trägerflüssigkeit (Suspensionsflüssigkeit) in einen Innenraum der Halteeinrichtung geliefert wird. Die Zellprobe umfasst ein Zellaggregat aus differenzierten Zellen, wie z. B. differenzierten Stammzellen (so genannter "Organoid", "Spheroid", "Cell Aggregate", oder "Cell Cluster", insbe sondere "Cardiac Body") und/oder Gewebefasern, wie z. B. Muskelfasern, oder eine große Einzel zellen mit einem Durchmesser von mindestens 500 pm. Eine Perfusionseinrichtung wird derart mit einem Unterdrück beaufschlagt, dass die Zellprobe in mindestens einen Fixierabschnitt der Halteeinrichtung bis zur Mess-Perfusionsöffnung gezogen wird. In dem mindestens einen Fixierab schnitt wird die Zellprobe deformiert, z. B. elongiert, eingeschnürt und/oder quer zur Längsrich tung der Halteeinrichtung komprimiert. Der Durchmesser der Zellprobe im Fixierabschnitt ist quer zur Längsrichtung der Halteeinrichtung vorzugsweise geringer als 400 pm, insbesondere geringer als 100 pm. Zellproben, wie insbesondere Zellaggregate, z. B. Spheroid-Aggregate, oder große Ein zelzellen, weisen eine Elastizität auf, die eine Kompression der Zellprobe ohne einen Funktions verlust ermöglicht. Im deformierten Zustand wirken elastische Rückstellkräfte auf die Innenseite, z. B. Innenwand des Fixierabschnitts, unter deren Wirkung die Zellprobe im Fixierabschnitt orts fest positioniert ist. Wenn die Zellprobe in mindestens einer Mess-Perfusionsöffnung in dem min destens einem Fixierabschnitt sitzt, wird die Perfusionseinrichtung so betrieben, dass die Mess- Perfusionskammer von einem Perfusionsmedium durchströmt und die an der Mess-Perfusionsöff- nung frei liegende Oberfläche der Zellprobe mit dem Perfusionsmedium gespült wird. Es wird mit der Messeinrichtung mindestens ein elektrischer Messwert der Zellprobe erfasst, der zur elektro- physiologischen Charakterisierung der Zellprobe geeignet ist. Vorzugsweise erfolgt die Positionie rung und Fixierung der Zellprobe auf Mess-Perfusionsöffnungen für die Messung von lonenströ- men durch Membranoberflächen, z. B. von Aggregaten (Aggregat-patches) mit Hilfe der patch- clamp Technik (z. B. [2]) und/oder die Messung von Aktionspotentialen und/oder Oberflächenpo tentialen. Vorteilhafterweise kann nach der Erfassung des mindestens einen elektrischen Mess werts die Zellprobe aus dem elektrophysiologischen Messgerät entnommen und für biochemische und molekularbiologische Untersuchungen aufgearbeitet und/oder in ein Zellkulturgefäß über führt werden.

Gemäß einem dritten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung wird die obige Aufgabe durch ein Hochdurchsatz-Testgerät gelöst, das eine Vielzahl von Messgeräten gemäß dem ersten allgemei nen Gesichtspunkt der Erfindung umfasst. Gemäß einem vierten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung wird die obige Aufgabe durch ein Messkit (Test-Kit) gelöst, welches das Messgerät gemäß dem ersten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung und mindestens eine Testsubstanz mit einer physiologischen, insbesondere arrhyth- mogenen, Wirkung auf die Zellprobe umfasst. Vorzugsweise ist die mindestens eine Testsubstanz zur Beeinflussung von Parametern des Aktionspotentials, insbesondere Anstiegssteilheit, Länge und/oder Auftreten von Nachpotentialen, und/oder von lonenströmen (Hemmung-Stimulation) geeignet.

Im Unterschied zu den herkömmlichen Techniken zeichnet sich das erfindungsgemäße Messgerät durch den Fixierabschnitt der Halteeinrichtung aus. Anders als bei elektrophysiologischen Unter suchungen an Pipettenspitzen oder an Mess-Poren von planaren Messgeräten erlaubt der Fixier abschnitt, Zellaggregate und/oder große Zellen zuverlässig an der Mess-Perfusionsöffnung zu hal ten. Selbst wenn rhythmische Deformationen der Zellprobe auftreten, kann diese stabil in der mindestens einen Mess-Perfusionsöffnung gehalten werden, so dass unerwünschte Einflüsse auf das Ergebnis der elektrophysiologischen Untersuchung vermieden werden. Die Halterung der Zell probe durch einen Unterdrück an der Mess-Perfusionsöffnung wird mit der Erfindung verbessert, was einen Vorteil im Vergleich zu herkömmlichen Techniken darstellt. Es können mehrere Mess- Perfusionsöffnungen zum mindestens einen Fixierabschnitt benachbart angeordnet sein, z. B. in den Fixierabschnitt münden, so dass sich neue Anwendungen, z. B. hinsichtlich der gleichzeitigen Messung von lonenströmen und Aktionspotentialen ergeben. Durch Wandschluss mit der Innen wand der Halteeinrichtung in dem Fixierabschnitt kann die Zellprobe in der Halteeinrichtung be reits vor dem Herstellen eines Kontaktes (seal-Kontakt) mit der mindestens einen Mess-Perfusi- onsöffnung von einem Flüssigkeitssog erfasst und in Richtung der mindestens einen Mess-Perfusi- onsöffnung gesaugt werden. Dieses gezielte Positionieren einer Zellprobe auf der mindestens ei nen Mess-Perfusionsöffnung durch den Ansaugvorgang beschleunigt vorteilhafterweise den Messvorgang.

Vorteilhafterweise ist die Erfindung insbesondere für Hochdurchsatzverfahren geeignet, indem das erfindungsgemäße Messgerät mit einer Vielzahl von Halteeinrichtungen jeweils mit einem oder mehreren Fixierabschnitten ausgestattet und/oder eine Vielzahl von erfindungsgemäßen Messgeräten zu dem Hochdurchsatz-Testgerät kombiniert werden, wodurch eine Vielzahl von Zellproben gleichzeitig untersucht werden können. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann der Innenraum der Halteeinrich tung des Weiteren einen Führungsabschnitt aufweisen, der ein größeres Volumen als der Fixierab schnitt aufweist und entgegengesetzt zur Position der Mess-Perfusionsöffnung zu dem Fixierab schnitt benachbart angeordnet ist. Die Halteeinrichtung ist vorzugsweise zweistufig mit dem Füh rungsabschnitt und dem Fixierabschnitt aufgebaut, die jeweils eine Funktion der Halteeinrichtung hinsichtlich der Zuführung und der Fixierung der Zellprobe erfüllen. Vorteilhafterweise vereinfacht der Führungsabschnitt mit dem größeren Volumen die Zuführung der Zellprobe zu dem Fixierab schnitt, indem der Führungsabschnitt zusätzlich zur Zellprobe ein größeres Volumen der Träger flüssigkeit aufnimmt und damit die Zuführung der Zellprobe zu dem Fixierabschnitt vereinfacht.

Besonders bevorzugt weist der Führungsabschnitt eine Trichterform auf, die sich hin zum Fixierab schnitt verjüngt. Vorteilhafterweise ist der Führungsabschnitt somit an seiner weiteren Oberseite zur Aufnahme der Zellprobe in einem nicht-deformierten, insbesondere nicht-komprimierten (entspannten) Zustand und für ein Deformieren der Zellprobe beim Ansaugen in den Fixierab schnitt konfiguriert. Vorteilhafterweise wird durch die Trichterform des Führungsabschnitts die Zellprobe unter der Wirkung der Schwerkraft gezielt hin zum Fixierabschnitt bewegt. Der Füh rungsabschnitt der Halteeinrichtung kann in mehre Fixierabschnitte münden, die jeweils eine oder mehrere Mess-Perfusionsöffnungen aufweisen.

Vorteilhafterweise ist der Fixierabschnitt durch die deformierte Zellprobe in axialer Richtung (Längsrichtung der Halteeinrichtung) verschlossen, so dass der mindestens eine Fixierabschnitt eine Durchmischung einer Suspensionsflüssigkeit in der Halteeinrichtung und eines Perfusionsme diums zumindest während des Messzeitraums behindert. Dies ist besonders unter Messbedingun gen von Vorteil, wenn die Zellprobe kontinuierlich perfundiert wird, d.h. das Perfusionsmedium in der mindestens einen Perfusionskammer stetig erneuert wird.

Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht in der Variabilität der Position der Mess-Perfusionsöff- nung relativ zum Fixierabschnitt. Gemäß einer ersten Variante der Erfindung mündet die mindes tens eine Mess-Perfusionsöffnung der mindestens einen Mess-Perfusionskammer in dem Boden bereich der Halteeinrichtung. In diesem Fall können sich Vorteile aus einer in radialen Richtungen allseits gleichartigen Haltekraft der Zellprobe im Fixierabschnitt und für den Aufbau des Messge räts als Fluidikchip ergeben. Alternativ oder zusätzlich mündet die mindestens eine Mess-Perfusi- onsöffnung gemäß einer zweiten Variante der Erfindung in dem Wandbereich der Halteeinrich tung in einer radialen Richtung in den Innenraum der Halteeinrichtung. Vorteilhafterweise ermög licht dies durch Anlegen eines Unterdrucks die zusätzliche Fixierung der Zellprobe auf der Mess- Perfusionsöffnung, eine seitliche Perfusion der Zellprobe oder sogar, bei Bereitstellung von zwei Mess-Perfusionsöffnungen eine Durchströmung der Zellprobe mit dem Perfusionsmedium. Beide Varianten können kombiniert sein, indem bei zwei übereinander angeordneten Perfusionskam mern eine erste Mess-Perfusionsöffnung lateral am Wandbereich in die Halteeinrichtung mündet und eine zweite Mess-Perfusionsöffnung axial unterhalb des Bodenbereichs der Halteeinrichtung mündet.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist die Perfusionseinrich tung mindestens zwei Mess-Perfusionskammern auf, die in der Konfiguration des Messgeräts übereinander angeordnet sind. Eine untere Mess-Perfusionskammer mündet über eine zentrale Mess-Perfusionsöffnung hin zum Bodenbereich der Halteeinrichtung. Mindestens eine obere Mess-Perfusionskammer, die über der unteren Mess-Perfusionskammer angeordnet ist/sind, mündet seitlich über eine allseits umlaufende Mess-Perfusionsöffnung am Wandbereich der Hal teeinrichtung. Die Anordnung von mindestens zwei Mess-Perfusionskammern kann mehrere Vor teile haben. Die Mess-Perfusionskammern können für die gleichzeitige Messung verschiedener elektrophysiologischer Größen verwendet werden. Des Weiteren können die Mess-Perfusions- kammern als Kanäle mit einer derart geringen Höhe konfiguriert sein, dass eine laterale Deforma tion der Zellprobe bei der Perfusion durch die mindestens eine umlaufende Mess-Perfusionsöff- nung vermieden wird. Gemäß vorteilhaften Ausführungsformen des Messverfahrens kann dabei der im Fixierabschnitt fixierte Teil der Zellprobe an die unterhalb des Fixierabschnitts angeordnete Mess-Perfusionsöffnung gesaugt werden, die mit einer separaten Saugleitung und separaten Un terdruckkammern oder Mikrofluidkanälen verbunden ist.

Vorteilhafterweise kann die mindestens eine obere Mess-Perfusionskammer an der umlaufenden Mess-Perfusionsöffnung eine kammerförmige Ausnehmung aufweisen, die so angeordnet ist, dass Perfusionsmedium in der kammerförmigen Ausnehmung die Zellprobe allseits umspülen kann. Damit wird eine allseitige Perfusionswirkung verbessert.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann die Perfusionseinrich tung mindestens eine Isolations-Perfusionskammer aufweisen, die zur Aufnahme eines elektrisch nicht-leitenden Isolationsmediums konfiguriert ist und über mindestens eine Isolations-Perfu- sionsöffnung mit dem Innenraum der Halteeinrichtung, insbesondere an den Fixierabschnitt an grenzend oder in diesen mündend, verbunden ist. Die mindestens eine Isolations-Perfusionsöff- nung ist vorzugsweise jeweils benachbart zu der mindestens einen Mess-Perfusionsöffnung der mindestens einen Mess-Perfusionskammer angeordnet. Bei Beaufschlagung des Isolationsmedi ums in einer Isolations-Perfusionskammer mit einem Überdruck ist die Zellprobe im Fixierab schnitt mit dem Isolationsmedium perfundierbar. Über die mindestens eine Isolations-Perfusions öffnung kann das Isolationsmedium in die Zellprobe gepresst werden, um das physiologische, salz haltige Medium in den Zellzwischenräumen durch das Isolationsmedium zu ersetzen. Das Isolati onsmedium umfasst z. B. eine Saccharose- und/oder Glukose-Lösung in deionisiertem Wasser oder eine andere isoosmolare ionenfreie Flüssigkeit. Die mindestens eine Isolations-Perfusions kammer ist mit einer Druckeinrichtung und Steuerelementen, wie z. B. Ventilen ausgestattet und zur Verbindung mit einem Flüssigkeitsreservoir des jeweiligen Isolationsmediums ausgelegt.

Vorzugsweise wird die Isolations-Perfusionsöffnung, die mit einem Isolationsmedium durchspült wird, mit einem anderen Druck als die Mess-Perfusionsöffnung beaufschlagt. Vorteilhafterweise wird die Zellprobe dabei nicht nur im Fixierabschnitt seitlich komprimiert, sondern auch in der Längsrichtung elongiert (länglich deformiert), was die Durchspülung des elongierten Abschnittes der Zellprobe mit Isolationsmedium verbessert. Dies geschieht durch das Einsaugen in den Fixier abschnitt und das gleichzeitige Einsaugen in eine darunter befindliche Mess-Perfusionsöffnung.

Die Ausführungsform mit der mindestens einen Isolations-Perfusionskammer hat insbesondere bei der Messung von Zellaggregaten den Vorteil, dass Leckströme zwischen den Zellen des Zellag gregats außerhalb der Nexuskontakte vermindert oder sogar vollständig ausgeschlossen werden. Diese Verringerung der Leckströme ist zumindest in der Umgebung der Mess-Perfusionsöffnung, vorzugsweise jedoch in des gesamten des Zellaggregats gegeben. Die erfindungsgemäße Defor mation des Zellaggregats im Fixierabschnitt hat dabei den besonderen Vorteil, dass durch eine Verengung des Zellaggregats leitende Flüssigkeit in den Zellzwischenräumen verdrängt und der zu spülende Raum verkleinert wird, so dass sich die Effektivität der Perfusion mit dem Isolationsme dium verbessert. Vorteilhafterweise erfolgt eine Verformung der Spheroide von einer Kugelform in eine längliche Ellipsoidform oder eine eingeschnürte und elongierte Form, so dass bei einer Durchspülung des Zellaggregats mit dem Isolationsmedium dieses einen möglichst kurzen Weg durch das Zellaggregat fließt.

Die Perfusion mit einem isolierenden Medium kann bei Anwendungen der Erfindung unterblei ben, bei denen Leckströme zwischen den Zellen des Zellaggregats außerhalb der Nexuskontakte eine vernachlässigbare Störung darstellen oder bereits durch die Verdrängung von leitenden Me dien in den Zellzwischenräumen durch Zelldifferenzierungsprodukte in der Zellprobe vermindert oder ausgeschlossen sind. In diesen Fällen kann auf die Isolations-Perfusionskammer verzichtet werden.

Vorteilhafterweise besteht auch eine Variabilität der Position der mindestens einen Isolations- Perfusionsöffnung relativ zum Fixierabschnitt. Die mindestens eine Isolations-Perfusionsöffnung kann z. B. im Bodenbereich der Flalteeinrichtung und/oder für eine laterale Perfusion der Zell probe am Wandbereich der Flalteeinrichtung in den Innenraum der Flalteeinrichtung, insbeson dere hin zum Fixierabschnitt münden.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die mindestens eine Isolations- Perfusionsöffnung und die mindestens eine Mess-Perfusionsöffnung der mindestens einen Mess- Perfusionskammer so angeordnet sein, dass die Isolations-Perfusionsöffnung die Mess-Perfusions- öffnung umgibt. Vorzugsweise sind die Perfusionsöffnungen zueinander konzentrisch angeordnet. Diese Ausführungsformen der Erfindung haben den Vorteil, dass die Isolations-Perfusionsöffnung neben der Perfusionsfunktion zusätzlich den "seal"-Widerstand der Zellprobe erhöht. Vorteilhaf terweise ist eine hohe Gestaltungsfreiheit auch für die Isolations-Perfusionsöffnung gegeben, de ren Position insbesondere im Bodenbereich oder im Wandbereich der Flalteeinrichtung gewählt sein kann. Wenn die Isolations-Perfusionsöffnung im Wandbereich der Flalteeinrichtung angeord net ist, können eine Isolationslösung durch einen radialen Kanal fließen und durch ein gleichzeiti ges„ringförmiges Ansaugen" der Zellprobe die Fixierung auf der Mess-Perfusionsöffnung verbes sert werden.

Gemäß einer weiteren, besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung können die Isola- tions-Perfusionskammer und die mindestens eine Mess-Perfusionskammer axial übereinander (d. h. axial entlang der Längsausdehnung der Halteeinrichtung) angeordnet sein. Eine untere Mess- Perfusionskammer mündet mit einer zentralen Mess-Perfusionsöffnung am Bodenbereich der Halteeinrichtung, während die Isolations-Perfusionskammer oberhalb der unteren Mess-Perfusi- onskammer mit einer allseits umlaufenden Isolations-Perfusionsöffnung am Wandbereich der Hal teeinrichtung mündet. Es können insbesondere mindestens zwei Mess-Perfusionskammern über einander angeordnet sein, die eine untere Mess-Perfusionskammer und eine mittlere Mess-Perfu- sionskammer umfassen, über der die Isolations-Perfusionskammer angeordnet ist. Die untere Mess-Perfusionskammer weist die zentrale Mess-Perfusionsöffnung auf, die durch die mittlere Mess-Perfusionskammer und die Isolations-Perfusionskammer zum Bodenbereich der Halteein richtung hin offen ist. Die mittlere Mess-Perfusionskammer und die Isolations-Perfusionskammer münden jeweils über umlaufende Perfusionsöffnungen am Wandbereich der Halteeinrichtung. Bei Ausführungsformen der Erfindung, bei denen die mindestens eine Mess-Perfusionsöffnung und/oder die mindestens eine Isolations-Perfusionsöffnung für eine laterale Perfusion der Zell probe am Wandbereich der Halteeinrichtung konfiguriert sind, ist besonders bevorzugt vorzugs weise an der mindestens einen Mess-Perfusionsöffnung und/oder der mindestens einen Isolati- ons-Perfusionsöffnung eine Rückhalteeinrichtung angeordnet, die für Perfusionsflüssigkeiten durchlässig und für die Zellprobe undurchlässig ist. Besonders bevorzugt ist die Rückhalteeinrich tung mit dem Wandbereich der Halteeinrichtung fluchtend ausgerichtet. Vorteilhafterweise er möglicht die Rückhalteeinrichtung, dass eine laterale Deformation der Zellprobe bei der Perfusion durch die mindestens eine umlaufende Perfusionsöffnung vermieden und die Zellprobe stabili siert wird.

Vorzugsweise umfasst die Rückhalteeinrichtung ein poröses Material, insbesondere mit Porengrö ßen im Bereich von 100 nm bis 1 pm, ein Material mit durchgehenden Kanälen, insbesondere mit Durchmessern im Bereich von 100 nm bis 1 pm, ein Filtermaterial und/oder eine Verteilung von Säulenelementen, z. B. quaderförmige oder säulenförmige oder runde Säulenelemente.

Mit der Rückhalteeinrichtung wird eine zusätzliche Fixierung der Zellprobe insbesondere auf der zentralen Mess-Perfusionsöffnung erzielt, die senkrecht zwischen den Plattenelementen vorgese hen ist. Durch die Bereitstellung der Rückhalteeinrichtung werden seitlich einwirkende Strö mungskräfte (Wasserhammereffekte) minimiert und die Zellprobe am Bodenbereich und darunter in seitlicher Richtung stabilisiert. Dadurch werden Störungen des Kontaktes zwischen Zellprobe und zentraler Mess-Perfusionsöffnung vermindert.

Zusätzlich kann gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung die Perfu sionseinrichtung eine Test-Perfusionskammer aufweisen, die zur Aufnahme einer Testsubstanz konfiguriert ist und über eine Test-Perfusionsöffnung mit der Halteeinrichtung, benachbart zum Fixierabschnitt oder in diesen mündend, verbunden ist. Die Test-Perfusionsöffnung ist vorzugs weise in dem Wandbereich der Halteeinrichtung angeordnet. Vorteilhafterweise ermöglicht die Test-Perfusionskammer, der Zellprobe die Testsubstanz unabhängig von der chemischen Zusam mensetzung des Perfusionsmediums in der Mess-Perfusionskammer zuzuführen. Die Vergleich barkeit von elektrophysiologischen Messungen, die aufeinanderfolgend oder parallel mit einem Perfusionsmedium, aber mit verschiedenen Testsubstanzen durchgeführt werden, wird dadurch verbessert. Vorteilhafterweise kann die Perfusionseinrichtung zusätzlich mindestens eine Unterdruck-Kam mer aufweisen, die zur Aufnahme eines elektrisch nicht-leitenden, inerten Druckmediums konfi guriert ist und über mindestens eine Saugleitung mit einer Säugöffnung mit der Halteeinrichtung verbunden ist. Die mindestens eine Säugöffnung ist vorzugsweise zusätzlich zu der mindestens ei nen Mess-Perfusionsöffnung vorgesehen. Die mindestens eine Unterdruck-Kammer und die min destens eine Säugöffnung sind dafür konfiguriert, bei Beaufschlagung des Druckmediums in der mindestens einen Unterdruck-Kammer mit einem Unterdrück die Zellprobe im Fixierabschnitt an zusaugen. Vorzugsweise ist die mindestens eine Säugöffnung in dem Bodenbereich des Fixierab schnitts angeordnet. Daraus ergeben sich die Vorteile, dass ein Einsaugen der Zellprobe über die gesamte Länge des Fixierabschnitts hin erzielt und damit die Stabilität der Aufnahme der Zell probe im Fixierabschnitt optimiert wird. Randbereiche der Zellprobe neben der Mess-Perfusions- öffnung werden zusätzlich immobilisiert und dynamische Veränderungen im Leck-Strom durch Kontraktionen werden vermindert. Alternativ oder zusätzlich ist die mindestens eine Säugöffnung in dem Wandbereich des Fixierabschnitts angeordnet. Auch in diesem Fall ergibt sich der Vorteil, dass die Immobilisierung der Zellprobe im Fixierabschnitt verbessert werden kann.

Die mindestens eine Säugöffnung kann ringförmig gebildet sein und jeweils eine Mess-Perfusions- öffnung umgeben. Vorteilhafterweise wird damit ein gleichmäßiges Ansaugen des Randbereiches der Zellprobe erreicht, wodurch Bewegungs- oder Positionierungsartefakte weiter gemindert und die Bildung des "seal"-Widerstands verbessert werden.

Gemäß einer weiteren Variante der Erfindung können mehrere Säugöffnungen vorgesehen sein, wie z. B. eine Säugöffnung im Bodenbereich und eine oder mehr Säugöffnungen im Wandbereich. Die Säugöffnungen können jeweils mit einer separaten Unterdruck-Kammer verbunden sein, so dass sie vorteilhafterweise jeweils mit einem spezifischen Unterdrück beaufschlagt werden kön nen.

Vorteilhafterweise können die genannten Funktionen der mindestens einen Isolations-Perfusions öffnung und der mindestens einen Säugöffnung von mindestens einer Öffnung erfüllt werden, an der sequentiell zuerst ein Isolationsmedium mit einem Unterdrück beaufschlagt wird, um die Zell probe in den Fixierabschnitt zu ziehen, und anschließend das Isolationsmedium mit einem Über druck beaufschlagt wird, um die Zellprobe zu perfundieren. Bei der sequentiellen Nutzung der mindestens einen Öffnung kann ferner ein Medienwechsel erfolgen, indem zum Ansaugen zu nächst eine physiologische Lösung und zum Perfundieren das Isolationsmedium zugeführt wer den. Mit der Messeinrichtung wird mindestens ein elektrischer Messwert der Zellprobe erfasst, der ge mäß bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung einen lonenstrom durch mindestens eine Zellmembran einer Zelle der Zellprobe und/oder ein an einer Zellmembran generiertes Aktionspo tential umfasst. Vorteilhafterweise können somit erfindungsgemäß "patch clamp"- und/oder "vol- tage clamp"-Messungen durchgeführt werden.

Besonders bevorzugt weisen die Perfusionseinrichtung zwei Mess-Perfusionskammern und die Messeinrichtung zwei Messkreise auf. Vorteilhafterweise ermöglicht dies die gleichzeitige Mes sung verschiedener elektrophysiologischer Größen. Beispielsweise ist die gleichzeitige Messung sowohl des lonenstroms als auch des Aktionspotentials an einer Zellprobe vorgesehen. In diesem Fall weisen die Perfusionseinrichtung mindestens zwei Mess-Perfusionskammern und die Mess einrichtung mindestens zwei Messkreise auf, die jeweils für die Erfassung des Aktionspotentials der Zellprobe oder des lonenstroms durch eine Membran der Zellprobe konfiguriert sind. Diese Ausführungsform der Erfindung hat den besonderen Vorteil, dass insbesondere Zellaggregate voll ständig charakterisiert werden kann, ohne das Messgerät zu wechseln, was mit herkömmlichen Techniken nicht möglich war. An jeder Halteeinrichtung des Messgeräts können eine oder meh rere Mess-Perfusionsöffnungen für die lonenstrommessung und oder mehrere Mess-Perfusions- öffnungen für die Aktionspotentialmessung vorgesehen sein.

Die Halteeinrichtung kann mehrere, insbesondere zwei Fixierabschnitte aufweisen, was insbeson dere von Vorteil ist, wenn mehrere Mess-Perfusionskammern vorgesehen sind. Die Fixierab schnitte verbessern die Halterung der Zellprobe an den jeweiligen Perfusionsöffnungen. Beson ders bevorzugt sind hierzu die Mess-Perfusionsöffnungen der Mess-Perfusionskammern und die Fixierabschnitte zueinander unmittelbar benachbart angeordnet.

Wenn die Mess-Perfusionsöffnungen der Mess-Perfusionskammern zueinander unmittelbar be nachbart angeordnet sind, ergeben sich weitere Vorteile für die Auswertbarkeit der Messergeb nisse. Besonders bevorzugt ist eine konzentrische Anordnung der Mess-Perfusionsöffnungen der Mess-Perfusionskammern vorgesehen. Eine Mess-Perfusionsöffnung, die z. B. für die Messung des lonenstroms vorgesehen ist, hat die Gestalt einer Ringöffnung, welche die andere Mess-Perfusi- onsöffnung, die z. B. für Messung des Aktionspotentials vorgesehen ist, umgibt. Die konzentrische Anordnung hat besondere Vorteile für die Fixierung der Zellprobe auf Mess-Perfusionsöffnungen, da durch das Anlegen eines Unterdrucks ein über den gesamten Randbereich der Mess-Perfusi- onsöffnung gleichmäßiges (zentriertes) Anpressen des Aggregates gefördert wird, welches die Iso lation der Membranabschnitte unter der Perfusionsöffnung verbessert.

Wenn die Perfusionseinrichtung mit der mindestens einen Isolations-Perfusionskammer ausge stattet ist, ist die konzentrische Anordnung vorzugsweise so modifiziert, dass eine zentrale Mess- Perfusionsöffnung von einer ringförmigen Isolations-Perfusionsöffnung und diese von der zweiten ringförmigen Mess-Perfusionsöffnung umgeben ist. Die Anordnung der Isolations-Perfusionsöff- nung zwischen den Mess-Perfusionsöffnungen hat den Vorteil, dass die Isolations-Perfusionsöff- nung eine Doppelfunktion in Bezug auf die elektrische Isolation zwischen den Mess-Perfusionsöff- nungen und die Perfusion der Zellprobe mit dem Isolationsmedium erfüllen kann.

Vorteilhafterweise bestehen keine Beschränkungen hinsichtlich der Innenform des Fixierab schnitts, der gemäß bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung die Form eines Hohlzylinders (Rohrform) oder eines Flohlkonus (Trichter), der sich zur Mess-Perfusionsöffnung hin verjüngt, aufweisen kann. Der Hohlzylinder oder Trichter ermöglicht vorteilhafterweise durch einen allseiti gen Kontakt mit der Zellprobe deren Kompression und Elongation.

Gemäß vorteilhaften Varianten der Erfindung werden geometrische Eigenschaften des Fixierab schnitts in Form eines Hohlzylinders oder Trichters einzeln oder in Kombination vorzugsweise wie folgt gewählt. Die axiale Länge des Fixierabschnitts, d. h. die Länge in der Längsrichtung, ist vor zugsweise mindestens gleich dem 0,3-fachen Durchmesser, insbesondere mindestens gleich dem 0,8-fachen Durchmesser oder mindestens gleich dem 1,5-fachen Durchmesser der Zellprobe in einem nicht-komprimierten Zustand gewählt. Indem mindestens ein Teil der Zellprobe oder die vollständige Zellprobe im Fixierabschnitt in eine längliche Form komprimiert wird, wird vorteilhaf terweise die Halterung der Zellprobe während der Messung stabilisiert und des Weiteren die Per fusion der Zellprobe mit dem Isolationsmedium verbessert. Wenn der Fixierabschnitt die Trichter form aufweist, hat der Trichter vorzugsweise einen Trichterwinkel relativ zur Ebene der Randflä che der Mess-Perfusionsöffnung aufweist, der im Bereich von 50° bis 85° gewählt ist.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann der Fixierabschnitt ei nen umlaufenden Vorsprung in der Halteeinrichtung, z. B. in deren Wandbereich oder Bodenbe reich umfassen, wobei der umlaufende Vorsprung für eine radial allseitige Verankerung der Zell probe eingerichtet ist. Der umlaufende Vorsprung auf der Innenwand oder im Bodenbereich der Halteeinrichtung ist für eine Aufnahme der Zellprobe im eingeschnürten Zustand und eine Behin derung einer Verschiebung der Zellprobe in der Längsrichtung der Halteeinrichtung während der Messung konfiguriert. Der Vorsprung bildet eine lokal begrenzte, sich quer zur Längsrichtung der Halteeinrichtung erstreckende Verengung der Halteeinrichtung, und er wird z. B. durch eine Loch platte (Lochscheibe) oder ein Ringprofil gebildet. Die Lochplatte oder das Ringprofil hat ein zentra les Loch, das vorzugsweise in der Längsrichtung der Halteeinrichtung über der Mess-Perfusions- öffnung angeordnet ist. Die vorzugsweise ebene Platte mit dem Loch kann auch als zylindrischer Fixierabschnitt mit einem Abstand von der Mess-Perfusionsöffnung beschrieben werden. Die Höhe des umlaufenden Vorsprungs kann z. B. 40 pm für eine Zellprobe mit 200 pm Durchmesser betragen. Gemäß vorteilhaften Ausführungsformen des Messverfahrens kann dabei der im Fixier abschnitt fixierte Teil der Zellprobe an eine unterhalb des Vorsprungs angeordnete Mess-Perfusi- onsöffnung gesaugt werden, die mit einer separaten Saugleitung und separaten Unterdruckkam mern oder Mikrofluidkanälen verbunden ist.

Ausführungsformen mit einer Trichter- oder Zylinderform des Fixierabschnitts und der Bildung des Fixierabschnitts als umlaufender Vorsprung können kombiniert werden. In diesem Fall bildet min destens ein umlaufender Vorsprung auf der Innenoberfläche der Trichter- oder Zylinderform min destens ein Fixierelement, das für eine zusätzliche Verankerung der Zellprobe im Fixierabschnitt eingerichtet ist.

Für bevorzugte Anwendungen der Erfindung beträgt die axiale Länge des Fixierabschnitts gemäß den obigen Ausführungsformen vorzugsweise mindestens 40 pm, z. B. mindestens 100 pm, und/oder höchstens 300 pm pm, z. B. höchstens 800 pm, während die Dimension in der Querrich tung vorzugsweise mindestens 30 pm, z. B. mindestens 80 pm, und/oder höchstens 100 pm, z. B. höchstens 300 pm beträgt. Die Mess-Perfusionsöffnung der mindestens einen Mess-Perfusions- kammer hat vorzugsweise einen Durchmesser im Bereich von 5 pm bis 100 pm. In diesem Grö ßenbereich ergeben sich Vorteile für eine effektive Messung der elektrophysiologischen Größen.

Der Durchmesser des Fixierabschnitts, d. h. seine Dimension in einer Querrichtung senkrecht zur Längsrichtung, ist vorzugsweise höchstens gleich dem 0,9-fachen Durchmesser, insbesondere höchstens gleich dem 0,7-fachen Durchmesser der Zellprobe in einem nicht-komprimierten Zu stand gewählt. Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung kann eine Innenoberfläche des Fixierabschnitts aus einem elektrisch leitenden Material, wie z. B. Gold, gebildet sein. Vorteil hafterweise kann der Fixierabschnitt als Zusatzelektrode, z. B. für eine extrazelluläre elektrische Anregung der Zellprobe und/oder eine weitere Messung an der Zellprobe, verwendet werden. Al ternativ kann in der Flalteeinrichtung mindestens eine separate Anregungs-Elektrode angeordnet sein. Die leitende Innenoberfläche des Fixierabschnitts oder die Anregungs-Elektrode können z. B. mit einer Spannungsquelle verbunden und für die extrazelluläre elektrische Anregung der Zell probe oder eine weitere Messung konfiguriert sein. Beispielsweise kann an der Zellprobe eine Kontraktionsmessung vorgesehen sein, bei der elastische Eigenschaften der Zellprobe gemessen werden. Die Kontraktionsmessung erfolgt vorzugsweise mittels einer Druck- und/oder Impedanz messung, z. B. unter Verwendung der mindestens einen Anregungs-Elektrode.

Für "patch-clamp"-Messungen an der Zellprobe, insbesondere an einem Aggregat oder einer gro ßen Zelle, hat die Mess-Perfusionsöffnung (patch-Pore) vorzugsweise einen Durchmesser, der im Bereich von 5 pm bis 100 pm gewählt ist. Die patch-Pore ist damit größer als die Poren herkömm licher planarer patch-Systeme (0.5 pm bis 2 pm), die für Einzelzellen ausgelegt sind. Die erfin dungsgemäß größere patch-Pore ermöglicht "patch-clamp"-Messungen an größeren Oberflächen des Aggregates mit mehreren Einzelzellen oder entsprechende Messungen an größeren Oberflä chensegmenten von großen Zellen, wie z. B. Xenopus Oozyten. Für Aktionspotential-Messungen an der Zellprobe hat die Mess-Perfusionsöffnung (Elektroden-Pore) vorzugsweise einen Durch messer, der im Bereich von 5 pm bis 200 pm gewählt ist.

Besonders bevorzugt haben die Mess-Perfusionsöffnung für die "patch-clamp"-Messungen und für die Aktionspotential-Messungen die gleiche oder annähernd gleiche Größe, insbesondere den gleichen oder annähernd gleichen Durchmesser. Vorteilhafterweise vereinfacht dies einen Tausch der Funktion der Mess-Perfusionsöffnungen, indem jeweils passend Strom- oder Spannungsmess einrichtungen an die Elektroden der zugehörigen Perfusionskammern angeschlossen werden.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können die Flalteeinrich tung, die Perfusionseinrichtung und die Elektrodeneinrichtung als Mikrofluidikvorrichtung (Mikro- fluidikchip) aufgebaut sein. Die Mikrofluidikvorrichtung ist vorteilhafterweise eine kompakte, mehrlagige Konstruktion mit mehreren Plattenelementen, die jeweils zur Bildung der mindestens einen Flalteeinrichtung und der mindestens einen Perfusionseinrichtung strukturiert und mit den Elektroden der mindestens einen Elektrodeneinrichtung ausgestattet sind. Die Mikrofluidikvor- richtung weist mehrere Fluidikschnittstellen zur Zufuhr einer Suspensionsflüssigkeit mit Zellpro ben, des Mess-Perfusionsmediums und optional weiterer Medien und Elektrodenanschlüsse zur Verbindung der Elektroden mit der Messeinrichtung auf. Ein Vorteil dieser Ausführungsform be steht darin, dass durch die Verwendung von Plattenelementen der Wandbereich der Halteeinrich tung und damit der mindestens eine Fixierabschnitt gestaltet werden kann und die Aggregate dadurch lokal deformiert und besser in Längsrichtung fixiert werden können.

Die Gegenstände jeder bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, insbesondere die zweistu fige Bildung der Halteeinrichtung über der mindestens einen Perfusionsöffnung aus dem oberen Führungsabschnitt und dem unteren Fixierabschnitt, die axiale Anordnung von Mess- und/oder Isolations-Perfusionskammern und/oder die Bereitstellung der Isolations-Perfusionskammer, kön nen einzeln oder in Kombination als separate Gegenstände der Erfindung betrachtet werden, die erfindungsgemäß ohne die kennzeichnenden Merkmale des Hauptanspruchs, insbesondere ohne die oben erwähnte Konfiguration des Fixierabschnitts für eine Deformation der Zellprobe vorgese hen sein können.

Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden im Folgenden unter Bezug auf die beige fügten Zeichnungen beschrieben. Es zeigen:

Figur 1: eine schematische Ansicht einer ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen

Messgeräts;

Figur 2: schematische Ansichten einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen

Messgeräts;

Figur 3: Illustrationen einer trichterförmigen Halteeinrichtung und einer Rückhalteeinrich tung gemäß weiteren Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Messgeräts;

Figur 4: schematische Ansichten einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen

Messgeräts, bei der zwei Fixierabschnitte vorgesehen sind;

Figur 5: eine schematische Ansicht einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemä ßen Messgeräts, bei der ein Fixierabschnitt die Gestalt eines Trichters hat; Figur 6: eine schematische Teilansicht einer weiteren Ausführungsform des erfindungsge mäßen Messgeräts, bei der ein Fixierabschnitt in Gestalt eines umlaufenden Vor sprungs vorgesehen ist;

Figur 7: eine schematische Ansicht einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Floch- durchsatz-Testgeräts;

Figur 8: eine schematische Ansicht einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemä ßen Messgeräts, wobei die Untersuchung einer großen Einzelzelle gezeigt wird;

Figur 9: schematische Ansichten einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen

Messgeräts, bei der konzentrische Perfusionsöffnungen vorgesehen sind;

Figuren 10 bis 14: schematische Ansichten von weiteren Ausführungsformen des erfindungsgemä ßen Messgeräts; und

Figur 15: eine schematische Ansicht eines herkömmlichen planaren "patch-clamp"-Messge- räts (Stand der Technik).

Ausführungsformen der Erfindung werden im Folgenden unter beispielhaftem Bezug auf ein elekt- rophysiologisches Messgerät beschrieben, das mit einer einzigen Flalteeinrichtung mit einem oder zwei Fixierabschnitten ausgestattet ist. Die Erfindung ist nicht auf diese Varianten beschränkt, sondern entsprechend mit einem Messgerät oder Flochdurchsatz-Testgerät umsetzbar, das eine Vielzahl von Flalteeinrichtungen jeweils mit einem oder mehreren Fixierabschnitten umfasst. Es können beispielweise in einer Mikrofluidikvorrichtung 10 bis 300 Flalteeinrichtungen, jeweils ge koppelt mit mindestens einer Perfusionseinrichtung, mindestens einer Elektrodeneinrichtung und mindestens einer Messeinrichtung, vorgesehen sein, so dass eine Vielzahl von Zellproben gleich zeitig bereitgestellt und gleichzeitig oder aufeinanderfolgend untersucht werden können.

Des Weiteren wird beispielhaft auf Messungen von lonenströmen und/oder Aktionspotentialen Bezug genommen. Die Erfindung ist nicht auf diese Anwendung beschränkt ist, sondern entspre chend mit anderen elektrophysiologischen Messungen, wie z. B. Oberflächenpotentialen, oder weiteren Messungen, wie z. B. Fluoreszenz-Messungen oder der Erfassung von intrazellulärem Kalzium oder anderen Ionen, ausführbar. Einzelheiten von elektrophysiologischen Messungen, wie die Auswahl von elektrischen Messparametern, die Ableitung elektrophysiologischer Messsig nale von den Elektroden, die Anordnung von Elektroden, die Verstärkertechnik und/oder die Aus wahl von Perfusionsmedien, Einzelheiten der Probenpräparation und Einzelheiten der Handha bung von biologischen Zellproben, wie z. B. die Herstellung von Zellaggregaten, werden nicht be schrieben, da diese an sich von herkömmlichen Techniken bekannt sind.

Die Erfindung wird insbesondere in Bezug auf die Halteeinrichtung und deren Zusammenwirkung mit der Perfusionseinrichtung beschrieben. Das Messgerät oder Hochdurchsatz-Testgerät kann weitere Komponenten, wie zum Beispiel Flüssigkeitsreservoire, mehrere Pumpen zur Herstellung unterschiedlicher Drucke an verschiedenen Mess-Perfusionsöffnungen, Steuerelemente (z. B. steuerbare Ventile), Temperierungseinrichtungen, Befeuchtungseinrichtungen und dergleichen aufweisen. Eine erfindungsgemäße Vorrichtung kann insbesondere ein autarkes Gerät für Labor oder Industrieanwendungen zur Untersuchung von Zellproben sein. Alternativ kann die Vorrich tung Teil eines Kultivierungsgerätes für biologische Zellen sein, das insbesondere für die Kultivie rung von Zellaggregaten ausgelegt ist.

Figur 1 zeigt eine erste Ausführungsform des erfindungsgemäßen Messgeräts 100 in schemati scher Schnittansicht, wobei ein Fixierabschnitt 12 in Form eines Trichters vorgesehen ist. Das Messgerät umfasst eine Halteeinrichtung 10, eine Perfusionseinrichtung 20, eine Elektrodenein richtung 30 und eine Messeinrichtung 40. Das Messgerät 100 ist als Mikrofluidikvorrichtung aus ebenen Plattenelementen 10A, 20 A, 20B (teilweise gezeigt) aufgebaut, in denen jeweils die Hal teeinrichtung 10 und die Perfusionseinrichtung 20 als Kanäle oder andere Hohlräume gebildet sind. Alternativ kann die Halteeinrichtung 10 als Aufsatz auf den Plattenelementen 20A, 20B gebil det sein, welche die Perfusionseinrichtung 20 bilden. Die Halteeinrichtung 10 kann von den Plat tenelementen 20A, 20B trennbar angeordnet sein. Die Plattenelemente 10A, 20A, 20B erstrecken sich in einer Bezugsebene (horizontale x-y-Ebene) und die Halteeinrichtung 10 erstreckt sich in ei ner Längsrichtung (vertikale z-Richtung) senkrecht zu der Bezugsebene. Die Plattenelemente 10A, 20A, 20B sind vorzugsweise aus einem elektrisch isolierenden Material, wie z. B. Kunststoff (insbe sondere PDMS), Glas und/oder einer Keramik hergestellt. Die Verbindung der Plattenelemente 10A, 20A, 20B erfolgt durch ein Bondverfahren oder mechanisches Klemmen mit einer Klemmein richtung (z. B. äußere Klammern) oder durch Kleben.

Die Halteeinrichtung 10 hat einen sich in der Längsrichtung (z) erstreckenden Innenraum 11 in Ge stalt eines Trichters, der eine Aufnahme für die Zellprobe 1 in einem physiologischen Umgebungs- medium 2 bildet. Der Innenraum 11 weist einen Bodenbereich 14, in dem Mess-Perfusionsöffnun- gen 22A, 22B der Perfusionseinrichtung 20 in den Innenraum 11 münden, und einen seitlichen Wandbereich 15 auf. In einem zur Perfusionseinrichtung 20 weisenden Bereich (unterer Bereich) bildet der Innenraum 11 einen Fixierabschnitt 12 zur Aufnahme der Zellprobe 1 in einem defor mierten Zustand. Entgegengesetzt zum Bodenbereich 14 ist der Innenraum 11 offen oder mit ei nem lösbaren Deckel (nicht gezeigt) versehen.

Die Perfusionseinrichtung 20 umfasst zwei Lagen von Plattenelementen 20A, 20B, von denen im unteren Plattenelement 20B zwei Mess-Perfusionskammern 21A, 21B jeweils zur Aufnahme eines Perfusionsmediums 3A, 3B und im oberen Plattenelement 20A die Mess-Perfusionsöffnungen 22A, 22B gebildet sind. In abgewandelten Ausführungsformen der Erfindung können Abschnitte der Halteeinrichtung 10 (siehe z. B. Figur 2) und/oder die Mess-Perfusionskammern 21A, 21B (siehe z. B. Figur 7) in getrennten Plattenelementen angeordnet sein. Die Mess-Perfusionskam- mern 21A, 21B sind über die Mess-Perfusionsöffnungen 22A, 22B mit dem Innenraum 11 der Hal teeinrichtung 10 verbunden. Die zum Innenraum 11 weisenden Randflächen der Mess-Perfusions- öffnung 22A, 22B erstrecken sich parallel zur Bezugsebene (x-y-Ebene) und sind aus einem elektrisch isolierenden Material, vorzugsweise durch das Material des oberen Plattenelements 20A gebildet. Jede der Mess-Perfusionskammern 21A, 21B ist über die Zufuhr- und Abfuhrleitun gen 24A, 24B mit Reservoiren der Perfusionsmedien (nicht gezeigt) gekoppelt.

Die Elektrodeneinrichtung 30 umfasst zwei Mess-Elektroden 31A, 31B, die jeweils in den Mess- Perfusionskammern 21A, 21B angeordnet sind, und eine Referenzelektrode 32, die in dem Innen raum 11 der Halteeinrichtung 10 angeordnet ist. Die Messeinrichtung 40 umfasst eine Spannungs messeinrichtung 41A (Voltmeter mit Messverstärker), die mit der ersten Mess-Elektrode 31A ver bunden ist, und eine Strommesseinrichtung 41B (Amperemeter) mit einem Operationsverstärker 42B zur Stromverstärkung, der mit der zweiten Mess-Elektrode 31B verbunden ist. Die Referen zelektrode 32 ist in elektrischem Kontakt mit der extrazellulären Lösung in der Halteeinrichtung 10 in der Umgebung der Zellprobe 1 und an einen Masseanschluss des Operationsverstärkers 42B (so genannte "virtuelle Masse") angeschlossen.

Die erste Mess-Elektrode 31A steht in Kontakt mit dem Perfusionsmedium (extrazelluläre Lösung), wie z. B. isoosmolare (140 mM) Kaliumlösung (Chlorid oder teilweise Fluorid), die zusätzlich lono- phore, wie Nystatin oder Amphotericin B, enthalten kann, in der Mess-Perfusionskammer 21A.

Mit diesem Perfusionsmedium wird die Zellprobe 1 über die erste Mess-Perfusionsöffnung 22A (Elektroden-Pore, Durchmesser z. B. 20 miti) perfundiert. Über die erste Mess-Elektrode 31A wer den mit der Spannungsmesseinrichtung 41A Membranpotentiale und ggf. Aktionspotentiale ge messen. Über die zweite Mess-Elektrode 31B, die in Kontakt mit dem Perfusionsmedium, z. B. mit physiologische (Ringer) Lösung, in der Mess-Perfusionskammern 21A steht, werden lonenströme durch den von der Mess-Perfusionsöffnung 22B (patch-Pore, Durchmesser z. B. 20 pm) isolierten Oberflächenabschnitt der Zellprobe 1 gemessen. Die patch-Pore (Mess-Perfusionsöffnung 22B) wird separat von der Elektroden-Pore (Mess-Perfusionsöffnung 22A) mit der extrazellulären Lö sung perfundiert. Die Verwendung von lonophoren zur Permeabilisierung von Membranen ist als "perforated patch-clamp" Technik bekannt (Akaike et al. [12]).

Abweichend von der Darstellung in Figur 1 können optional weitere Elektroden (nicht gezeigt) in den Lösungen vorgesehen sein, z. B. um eine Bezugsmasse zu bilden, Aktionspotentiale zu stimu lieren und/oder Oberflächenpotentiale (EKG) abzuleiten, wobei diese Messungen unter Verwen dung von Differenzverstärkern erfolgen können.

Kontraktionsbedingte Veränderungen im Unterdrück im unteren Fixierabschnitt 12 oder oberhalb von diesem können mit einem Manometer erfasst und als Kontraktionsparameter ausgewertet werden (siehe Figur 12). Es können auch mehrere Fixierabschnitte vorgesehen sein (siehe Figur 4). Des Weiteren können alternativ oder zusätzlich mehrere Mess-Perfusionsöffnungen (Elektroden- Poren) zur Potentialmessung und/oder mehrere Mess-Perfusionsöffnungen (patch-Poren) zur Strommessung im Boden- oder Wandbereich des Fixierabschnitts 12, vorzugsweise zueinander benachbart, angeordnet sein. An den Mess-Perfusionsöffnungen können jeweils spezifische Perfu sionsmedien aus getrennten Mess-Perfusionskammern bereitgestellt werden.

Figur 1 stellt ein planares "patch-clamp"-Messgerät, insbesondere für Zellaggregate, mit trichter förmiger Halteeinrichtung 10 für das Positionieren der Zellprobe 1 auf mindestens einer patch- Pore (Mess-Perfusionsöffnung 22B) und/oder mindestens einer Elektroden-Pore (Mess-Perfu- sionsöffnung 22A) dar. Die Poren sind mit verschiedenen Kompartimenten oder Mikrofluidkanä len in dem unteren Plattenelement 20B verbunden und können mit verschiedenen Flüssigkeiten perfundiert werden. Das Anhaften (engl "sealen") der Zellprobe 1 an den Mess-Perfusionsöffnun- gen 22A, 22B ermöglicht die gleichzeitige Messung von Aktionspotentialen und "patch-clamp"- Untersuchungen nach Hamill et al. [2] in der Modifikation nach Zilberter et al. [7] Zur Durchführung der Messungen an einer Zellprobe 1, umfassend z. B. ein Zellaggregat, wird das Zellaggregat in einer physiologischen Lösung oder einem Nährmedium zunächst mit einer Zu fuhreinrichtung, z. B. einer Pipette 3 in die Halteeinrichtung 10 appliziert. Die Zufuhreinrichtung umfasst z. B. ein automatisches Pipettiersystem, wodurch der Vorgang vorteilhafterweise auto matisiert werden kann. Alternativ zur Verwendung der Pipette kann das Aggregat direkt mit me chanischen Mitteln von einer Oberfläche, z. B. eines Kultivierungssubstrates, in die Halteeinrich tung 10 zugeführt werden. Durch die Form der Halteeinrichtung 10 wird das absinkende Zellag gregat hin zu den Mess-Perfusionsöffnungen 22A, 22B im Plattenelement 20A geleitet. Durch schlüssigen Kontakt mit den Innenwänden der Halteeinrichtung 10 und durch einen Unterdrück in den Mess-Perfusionskammern 21A, 21B wird das Zellaggregat in den Fixierabschnitt 12 bis zum Bodenbereich 14 gesaugt und dabei komprimiert, so dass es auch nach Beendigung der Unter druckerzeugung am Bodenbereich 14 auf den Mess-Perfusionsöffnungen 22A, 22B sitzt. Dabei wird ein dichter Kontakt zwischen dem Zellaggregat und den Randflächen der Perfusionsöffnun gen 22A, 22B im Bodenbereich 14 gebildet.

Wenn das Zellaggregat im Fixierabschnitt 12 komprimiert fest sitzt, folgen die Strom- und/oder Spannungsmessungen, wobei das Zellaggregat von den Mess-Perfusionskammern 21A, 21B mit Perfusionsmedien gespült und elektrische Signale von den Elektroden 31A, 31B abgeleitet wer den. Vorteilhafterweise ermöglicht das Verfahren, dass während der "patch-clamp"-Messung gleichzeitig ein Aktionspotential abgeleitet wird. Über die Mess-Perfusionskammern 21A, 21B und die Mess-Perfusionsöffnungen 22A, 22B können Testlösungen mit Substanzen appliziert und be züglich ihrer Wirkung auf lonenkanäle untersucht werden. Alternativ können Lösungen mit Testsubstanzen direkt in die Halteeinrichtung 10 appliziert werden. Beispielweise kann ein Über lauf aus dem Trichter der Halteeinrichtung 10 in ein den Trichter umgebendes Reservoir vorgese hen sein, wobei die in der Halteeinrichtung 10 vorhandene Lösung durch Zu- und Abfluss ver dünnt und/oder ausgetauscht werden kann.

Der Operationsverstärker 42B kann bei Messungen an Zellaggregaten insbesondere in den folgen den zwei Anwendungen genutzt werden. Erstens kann vorgesehen sein, dass das Aggregat ein Ak tionspotential generiert. In diesem Fall wird kein Membranpotential vorgegeben, und es werden die lonenströme während des Aktionspotentials gemessen. Zweitens ist möglich, dass das Aggre gat kein Aktionspotential generiert. In diesem Fall wird das Membranpotential, z. B. in Gestalt ei nes Rechteckimpulses, auf die zentrale Mess-Perfusionsöffnung 21A (patch-Pore) appliziert, und es werden die lonenströme während der Spannungsänderung registriert. Da sich an der Mess-Per- fusionsöffnung 21A mehrere Zellen eines Zellaggregates befinden können, werden die durch die Mess-Perfusionsöffnung 21A isolierten Membanoberflächen auch als "Makropatches" bezeichnet. Die Messung erfolgt nach der von [7] Y. I. Zilberter et al. für Einzelzellen beschriebenen Methode.

Merkmale von abgewandelten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Messgeräts 100 mit der Halteeinrichtung 10, der Perfusionseinrichtung 20, der Elektrodeneinrichtung 30, der Mess einrichtung 40 und einer Rückhalteeinrichtung 50 sind schematisch in den Figuren 2 bis 6 und 8 bis 14 gezeigt.

In Figur 2A sind die Plattenelemente 10A, 10B, in denen die Halteeinrichtung 10 gebildet ist, sche matisch illustriert. Weitere Plattenelemente, in denen die Mess-Perfusionsöffnung und die mikro- fluidischen Perfusionskammern der Perfusionseinrichtung 20 gebildet sind, sind in Figur 2A nicht gezeigt. Figur 2B illustriert schematisch das oberste Plattenelement 20A, mit dem die Halteein richtung, z. B. durch Kleben, verbunden ist und das die Perfusionskammer (obere Mess-Perfusi- onskammer 21B oder Isolations-Perfusionskammer 25) aufnimmt. Abweichend von Figur 1 ist die Halteeinrichtung 10 gemäß den Figuren 2 und 3 zweistufig mit dem Fixierabschnitt 12 und einem Führungsabschnitt 13 gebildet. Ein weiterer Unterschied besteht in der Anordnung der Perfusi onsöffnungen 22B/26 und 22A. Schließlich ist die Elektrodeneinrichtung 30 für verschiedene, vom Nutzer wählbare Mess- und Perfusionsverfahren ausgelegt. Im Übrigen kann das Messgerät 100 der Figuren 2 und 3 insbesondere aufgebaut sein, wie oben unter Bezug auf Figur 1 beschrieben ist.

Die Halteeinrichtung 10 ist gemäß den Figuren 2A und 3A aus zwei Trichter-Formen zusammenge setzt, die relativ zur x-y-Bezugsebene der Halteeinrichtung 10 verschiedene Neigungswinkel auf weisen. Der obere, zur Perfusionseinrichtung 20 entgegengesetzte Bereich, durch den der Füh rungsabschnitt 13 gebildet wird, hat das größere Volumen und den flacheren Neigungswinkel. Die Zellprobe 1 in einer physiologischen Lösung oder einem Nährmedium wird im Führungsabschnitt 13 zum Fixierabschnitt 12 gelenkt und in diesen eingesaugt. Der Fixierabschnitt 12 mit dem gerin geren Volumen und dem steileren Neigungswinkel nimmt die Zellprobe 1 im fixierten Zustand auf. Die Zellprobe 1 (z. B. ein Spheroid) kann vollständig oder, wie in Figur 2A gezeigt, teilweise im Fi xierabschnitt 12 angeordnet sein. Die Zellprobe 1 hat z. B. im nicht deformierten Zustand einen Durchmesser von 200 pm (mit einem Volumen von rd. 4,2*10⁶ pm³), und der Fixierabschnitt 12 hat einen Durchmesser im Bereich von z. B. 50 pm bis 150 pm. Die Höhe des Fixierabschnitts 12 (Länge in Längsrichtung senkrecht zur x-y-Bezugsebene kann geringer (Figur 2A) oder größer (Fi gur 3A) als der Durchmesser der Zellprobe 1 und z. B. im Bereich von 40 pm bis 100 pm gewählt sein. Die Höhe des Führungsabschnitts 13 kann z. B. im Bereich von 500 miti bis 5 mm gewählt sein. Der Führungsabschnitts 13 kann wesentlich größer als der Fixierabschnitt 12 sein.

Die Perfusionseinrichtung 20, die mit drei oder vier Lagen von Plattenelementen (nicht gezeigt) gebildet ist, umfasst gemäß Figur 2A zwei Perfusionskammern 21A und 21B/25, von denen die un tere Perfusionskammer 21A über eine mittig angeordnete Perfusionsöffnung 22A mit dem Boden bereich 14 und die obere Perfusionskammer 21B/25 axial über der unteren Perfusionskammer 21A über eine ringförmige Perfusionsöffnung 22B/26 mit dem Boden- und Wandbereich 14, 15 der Halteeinrichtung 10 verbunden ist (weitere Gestaltungsvarianten, siehe Figuren 3B, 3C und 3D). Die Perfusionskammern und Perfusionsöffnungen können je nach Beaufschlagung mit Perfu sionsmedien und Verbindung der Elektroden 31A, 31B und 31C für verschiedene Funktionen als Mess-Perfusionskammern 21A, 21B oder Isolations-Perfusionskammern 25 verwendet werden, wie unten beschrieben ist.

Die Figuren 2B und 2C zeigen eine Draufsicht und eine Perspektivansicht auf den Bodenbereich der Halteeinrichtung 10 mit den Perfusionsöffnungen 22A und 22B/26 und einem Teil der quader förmigen Perfusionskammer 21B/25 im Plattenelement 20A. Die Breite B der quaderförmigen Per fusionskammer 21B/25 beträgt z. B. 300 pm, während der Durchmesser Dl des Bodenbereichs der Halteeinrichtung 100 pm beträgt. Die quaderförmige Perfusionskammer 21B/25 kann somit am Boden des Fixierabschnitts eine Stufe bilden. Alternativ kann Dl gleich der Breite B oder grö ßer als die Breite der quaderförmigen Perfusionskammer 21B/25 sein. Die Die Höhe H der quader förmigen Perfusionskammer 21B/25 beträgt z. B. 10 pm - 100 pm und für den Fall der Verwen dung von Mikro- oder Nanofluidikkanälen 100 nm - 5 pm. Die geringe Höhe von Mikro- oder Na- nokanäle hat den Vorteil, dass eine laterale Deformation der Zellprobe 1 vermieden wird (siehe auch Figur 13). Die mindestens eine obere Mess-Perfusionskammer 21B weist an der umlaufen den Mess-Perfusionsöffnung 22B eine kammerförmige Ausnehmung 23 auf, die durch die Quader form der Perfusionskammer gebildet wird und die allseitige Zufuhr des Perfusionsmediums för dert.

Am unteren Ende des Fixierabschnitts 12 kann, in die Perfusionsöffnung 22B/26 ragend, eine Rückhalteeinrichtung 50 vorgesehen sein, wie schematisch in den Figuren 3C, 3D und 14 gezeigt ist. Durch die Rückhalteeinrichtung 50 kann die Perfusionskammer 21B/25 an der Perfusionsöff nung 22B/26 in horizontale und/oder vertikale Perfusionsfenster unterteilt sein, welche für das jeweilige Perfusionsmedium durchlässig und für die Zellprobe undurchlässig sind. Mit der Rückhai- teeinrichtung 50 wird eine Stabilisierung der Zellprobe gegen laterale Strömungskräfte erzielt. Ge mäß den Figuren 3C, 3D kann die Rückhalteeinrichtung 50 z. B. durch Säulenelemente 51 gebildet werden, die als Verlängerung des Wandbereich 15 oder als Teil der Perfusionskammer in die Per fusionsöffnung 22B/26 ragen. Die Säulenelemente 51 können in die Perfusionskammer 21B/25 ragen oder auf der unteren Begrenzung der Perfusionskammer 21B/25 aufsitzen. Die Säulenele mente 51, z. B. in Gestalt von Quadern oder Zylindern, bilden schlitzartige Unterbrechungen mit einer Breite von rd. 100 nm bis 1 pm. Der geringe Abstand der Säulenelemente 51 verhindert, dass die Zellprobe 1 seitlich in die Perfusionskammer gesaugt wird. Durch die Säulenelemente 51 kann die Perfusionskammer gleichzeitig in der Höhe stabilisiert werden. Isolations-Perfusionsme- dium kann z. B. selbst durch die 10 pm- Zwischenräume der Säulenelemente 51 und in die Zell probe eintreten.

Messgeräte mit den Merkmalen gemäß den Figuren 2 und 3 können wahlweise für verschiedene elektrophysiologische Messungen verwendet werden. Gemäß einer ersten Variante werden beide Perfusionskammern als Mess-Perfusionskammern 21A, 21B verwendet. Die Mess-Perfusionskam- mern 21A, 21B sind über Zufuhr- und Abfuhrleitungen 24A, 24B mit Reservoiren der Perfusions medien für die Messung von Aktionspotentialen und lonenströmen gekoppelt. In diesem Fall wer den die Spannungsmesseinrichtung 41A mit der ersten Mess-Elektrode 31A und der Operations verstärker 42B der Strommesseinrichtung 41B mit der dritten Mess-Elektrode 32 verbunden, um gleichzeitig Aktionspotentiale und lonenströme zu messen. Gemäß einer zweiten Variante wird die obere Perfusionskammer als Isolations-Perfusionskammer 25 verwendet. Die Isolations-Perfu- sionskammer 25 ist über die Zufuhr- und Abfuhrleitungen 24B mit einem Reservoir eines Isolati- ons-Perfusionsmediums, wie z. B. einer salzfreien Saccharose-Lösung verbunden. In diesem Fall werden mit einem Umschalter wahlweise die Spannungsmesseinrichtung 41A mit der ersten Mess-Elektrode 31A oder der Operationsverstärker 42B der Strommesseinrichtung 41B mit der zweiten Mess-Elektrode 31B verbunden, um abwechselnd Aktionspotentiale oder lonenströme zu messen. Alternativ kann bei Verwendung der oberen Perfusionskammer als Isolations-Perfusions kammer 25 die untere Perfusionskammer ausschließlich zur Messung entweder von Aktionspo tentialen oder von lonenströmen vorgesehen sein. Die Perfusionskammer 21A, welche über die Mess-Perfusionsöffnung 22A mit der Halteeinrichtung verbunden ist, wird bei "patch clamp"-Mes- sungen typischerweise mit einer physiologischen Ringerlösung und bei Aktionspotentialmessun gen typischerweise mit einer isotonen Kaliumchloridlösung perfundiert.

Die Figuren 4A bis 4C zeigen schematische Ansichten einer weiteren Ausführungsform des erfin dungsgemäßen Messgeräts 100. Bei dieser Abwandlung der Ausführungsform gemäß Figur 2 weist die Halteeinrichtung 10 zwei getrennte Fixierabschnitte 12A, 12B und zwei getrennte Mess- Perfusionskammern 21A, 21B auf. Im Übrigen ist das Messgerät 100 aufgebaut, wie unter Bezug auf Figur 2 beschrieben ist. Die Halteeinrichtung 10 ist in den Plattenelementen 10A, 10B mit ei nem oben offenen Führungsabschnitt 13 und den Fixierabschnitten 12A, 12B gebildet. Die Perfusi onseinrichtung 20 ist wie in Figur 1 in weiteren Plattenelementen gebildet, von denen nur das obere Plattenelement 20A in Figur 4B schematisch gezeigt ist. Die Fixierabschnitte 12A, 12B ha ben jeweils eine Trichterform, deren obere, weitere Seite in den Führungsabschnitt 13 mündet und deren untere, engere Seite sich in eine quaderförmige Perfusionskammer öffnet, die als Isola- tions-Perfusionskammer 25 vorgesehen ist (siehe Figuren 4B und 4C).

Die Perfusionseinrichtung 20 umfasst die Mess-Perfusionskammern 21A, 21B, die jeweils über ge trennte Mess-Perfusionsöffnungen 22A, 22B mit dem Innenraum der Fixierabschnitte 12A, 12B verbunden sind, und die Isolations-Perfusionskammer 25, die über seitliche, ringförmige Isolati- ons-Perfusionsöffnungen 26A, 26B mit dem Innenraum der Fixierabschnitte 12A, 12B verbunden ist. Für die gleichzeitige Messung des Aktionspotentials und des lonenstroms an der Zellprobe 1 sind die Mess-Elektrode 31A in der Mess-Perfusionskammer 21A mit der Spannungsmesseinrich tung 41A und die Mess-Elektrode 31B in der Mess-Perfusionskammer 21B mit der Strommessein richtung 41B verbunden. Jede der Mess-Perfusionskammern 21A, 21B und der Isolations-Perfusi onskammer 25 ist über die Zufuhr- und Abfuhrleitungen 24A, 24B, 28 mit Reservoiren der Perfusi onsmedien (nicht gezeigt) gekoppelt. Die quaderförmige Isolations-Perfusionskammer 25 ist im oberen Plattenelement 20A (siehe Figur 4B) der Perfusionseinrichtung 20 gebildet. Die Mess-Per- fusionskammern 21A, 21B sind voneinander getrennt in einem gemeinsamen Plattenelement (nicht gezeigt) gebildet. Die Dimensionen Dl, B und H sind wie bei der Ausführungsform gemäß Figur 2 gewählt.

Die Ausführungsform gemäß Figur 4 ist besonders dann von Vorteil, wenn gleichzeitig lonen- ströme durch größere Membranpatches (Makropatches) und Aktionspotentiale gemessen werden sollen. Die Messungen erfolgen, wie oben beschrieben ist. Um die Membranpatches für Aktions potentialmessungen und lonenstrommessungen in den jeweiligen Mess-Perfusionsöffnungen 22A, 22B der jeweiligen Fixierabschnitte 11A, 11B entsprechend zu isolieren, werden die Wider stände der Zwischenzellkontakte durch Perfusion der quaderförmigen Isolations-Perfusionskam- mer 25 mit Isolationslösung mit einer nicht-leitenden Lösung erhöht. Als Isolations-Perfusionsme- dium wird eine isotone Saccharose-Lösung verwendet. Dies ermöglicht eine deutlich verbesserte Kontrolle der Membranspannung (Spannungsklemme) unter der durch die Mess-Perfusionsöff- nungen 22A und 22B isolierten Poren, die ggf. mehrere Zellen und damit Zwischenzellräume um fassen können. Die Mess-Perfusionsöffnungen 22A, 22B haben bei der gezeigten Ausführungs form verschiedene Durchmesser. Für Aktionspotentialmessungen beträgt der Durchmesser z. B.

20 pm bis 200pm, und für lonenstrommessungen beträgt der Durchmesser z. B. 10 pm bis 100 pm. Alternativ können die Mess-Perfusionsöffnungen 22A, 22B gleiche Durchmesser aufweisen.

Figur 5 zeigt eine schematische Ansicht einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Messgeräts 100. Bei dieser Abwandlung der Ausführungsformen gemäß den Figuren 1 oder 2 um fasst die Halteeinrichtung 10 einen einzigen, langgestreckten Trichter, dessen oberer, weiter Be reich einen Führungsabschnitt 13 und dessen unterer, enger Bereich den Fixierabschnitt 12 bildet. Im Übrigen ist das Messgerät 100 aufgebaut, wie oben unter Bezug auf die Figuren 1 oder 2 be schrieben ist. Der Durchmesser der Halteeinrichtung 10 verringert sich z. B. von D2 im Bereich von 2 mm bis 5 mm über H2 im Bereich von 1 cm bis 2 cm auf Dl im Bereich von 50 pm bis 700 pm. Vorteilhafterweise können im Fixierabschnitt Zellproben 1 mit einem Durchmesser im nicht-defor- mierten Zustand im Bereich von 100 pm bis 1 mm fixiert werden.

Merkmale einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Messgeräts 100 (teilweise gezeigt), bei welcher der Fixierabschnitt 12 einen umlaufenden Vorsprung in der Halteeinrichtung 10 umfasst, sind in Figur 6 schematisch illustriert. Die Halteeinrichtung 10 in Zylinderform weist an ihrem Bo denbereich 14 eine Lochplatte 17 mit einem zentralen, kreisförmigen Loch 17A auf. Die Lochplatte 17 besteht z. B. aus Glas oder Kunststoff, und wird ist bei einem Messgerät 100 in Gestalt eines Mikrofluidikchips durch ein Plattenelement zwischen der Halteeinrichtung und der Perfusionsein richtung gebildet. Das Loch 17A hat z. B. einen Durchmesser im Bereich von 50 pm bis 300 pm. Unterhalb der Lochplatte 17 befindet sich die Perfusionseinrichtung 20, von der lediglich die Isola- tions-Perfusionskammer 25 gezeigt ist (siehe Figur 2C). Am Boden der Isolations-Perfusionskam- mer 25 befindet sich die Mess-Perfusionsöffnung 22A, durch die eine Perfusionsflüssigkeit von der Mess-Perfusionskammer (nicht gezeigt) zuführbar ist. Der Abstand zwischen dem Loch 17A und der Mess-Perfusionsöffnung 22A beträgt z. B. 20 pm bis 80 pm.

Bei Erzeugung eines Unterdrucks in der Isolations-Perfusionskammer 25 wird eine Zellprobe 1 in der Halteeinrichtung 10 durch die Lochplatte 17 gesaugt. Die Zellprobe 1 wird eingeschnürt und im unteren Teil bis zur Mess-Perfusionsöffnung 22A elongiert (siehe Teilbild in Figur 6), bis die de formierte Zellprobe 1 in der Mess-Perfusionsöffnung 22A sitzt. Während der Messung wird der elongierte Teilbereich der Zellprobe mit hoher Wirksamkeit durch ein Isolationsmedium in der Isolations-Perfusionskammer 25 perfundiert. Figur 7 illustriert schematisch eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Hochdurchsatz-Test- geräts 200 mit einer Vielzahl von Messgeräten 100 jeweils mit einer Halteeinrichtung 10 und einer Perfusionseinrichtung 20. Des Weiteren sind Elektroden- und Messeinrichtungen (nicht darge stellt) vorgesehen, wie sie unter Bezug auf die anderen Figuren beschrieben sind. Die Messgeräte 100, die aufgebaut sind, sowie unterschiedlich angeordnete Mess-Perfusionsöffnungen wie unter Bezug auf die anderen Figuren beschrieben ist, bilden z. B. eine Reihe oder eine Matrixform mit Reihen und Spalten. Vorzugsweise sind die Messgeräte 100 in einer gemeinsamen Mikroflu- idikeinrichtung integriert angeordnet. Perfusionskammern mit gleichen Funktionen sind jeweils miteinander verbunden und mit einem gemeinsamen Perfusionsmedien-Reservoir gekoppelt. Ein Hochdurchsatz-Test mit dem Hochdurchsatz-Testgerät 200 umfasst die gleichzeitige elektrophysi- ologische Messung an einer Vielzahl von Zellproben mit jeweils einem der Messgeräte 100.

Figur 8 zeigt eine weitere Abwandlung der Ausführungsform des Messgeräts 100 gemäß den Figu ren 1 und 2. Die Halteeinrichtung 10, die wie in Figur 1 aufgebaut sein kann, ist mit einer Zell probe 1 in Gestalt einer großen Zelle, z. B. ein Oozyt eines afrikanischen Krallenfrosches (Xenopus laevis), gezeigt. Die Zelle sitzt während der Messung im komprimierten Zustand im Fixierabschnitt 12 der Halteeinrichtung 10. Die Perfusionseinrichtung 20 umfasst zwei Perfusionskammern, die wie in Figur 2 als Mess- und/oder Isolations-Perfusionskammern verwendet werden können. Eine zentrale Perfusionskammer, die vorzugsweise als Mess-Perfusionskammer 21B verwendet wird, ist über die Mess-Perfusionsöffnung 22B mit dem Bodenbereich 14 der Halteeinrichtung 10 ver bunden. Die erste Mess-Elektrode 31B in der Mess-Perfusionskammer 21B ist für eine lonen- strommessung mit dem Operationsverstärker 42B der Strommesseinrichtung 41B verbunden. Al ternativ oder zusätzlich kann die Mess-Elektrode 31B für eine Aktionspotentialmessung, ggf. über einen Umschalter, mit einer Spannungsmesseinrichtung (siehe Figur 2) koppelbar sein. Die zweite Perfusionskammer 21A, 25 in Gestalt von zwei Perfusionskanälen ist über eine ringförmige Perfu sionsöffnung 22A, 26, welche konzentrisch zur Mess-Perfusionsöffnung 22B angeordnet ist, mit dem Bodenbereich 14 der Halteeinrichtung 10 verbunden. In der zweiten Perfusionskammer 21B, 25 ist eine zweite Mess-Elektrode 31B angeordnet, die wiederum mit dem Operationsverstärker 42B der Strommesseinrichtung 41B und/oder der Spannungsmesseinrichtung 41A koppelbar ist. Die zweite Perfusionskammer 21A/25 kann als Isolations-Perfusionskammer 25 verwendet wer den, wie oben unter Bezug auf Figur 2 beschrieben wurde. Durch Anlegen eines starken Unter drucks kann die Membran unter 22B zerstört werden und eine„whole cell" Konfiguration für lo- nenstrommessungen nach [2] hergestellt werden. Bei der Ausführungsform des Messgeräts 100 gemäß Figur 9 enthält die Perfusionseinrichtung 20 drei Perfusionskammern 21A, 21B und 25, von denen die oberste Perfusionskammer eine Mess- Perfusionskammer 21A zur Messung von Aktionspotentialen, die mittlere Perfusionskammer eine Isolations-Perfusionskammer 25 zur Perfusion der Zellprobe 1 mit einem elektrisch isolierenden Isolations-Perfusionsmedium und die untere Perfusionskammer eine Mess-Perfusionskammer 21B zur Messung von lonenströmen umfasst (Figur 9A). Die Perfusionsöffnungen 22A, 25 und 22B sind zueinander konzentrisch angeordnet (Figur 9B), wobei die Randflächen 27 zwischen den Per fusionsöffnungen 22A, 25 und 22B adhäsive Oberflächen zur Bildung des "seal"-Widerstands mit der Oberfläche der Zellprobe 1 bilden.

Für die gleichzeitige Messung des Aktionspotentials und des lonenstroms an der Zellprobe 1 sind die Mess-Elektrode 31A der Mess-Perfusionskammer 21A mit der Spannungsmesseinrichtung (nicht gezeigt) und die Mess-Elektrode 31B der Mess-Perfusionskammer 21B mit der Strommess einrichtung 41B verbunden. Die äußerste Perfusionsöffnung 22A wird mit Kaliumlösung perfun diert, während die innerste Perfusionsöffnung 22A mit extrazellulärer Lösung (Ringer-Lösung) per fundiert wird. Über die mittlere Perfusionsöffnung 25 wird die Zellprobe mit dem Isolationsme dium gespült.

Die Ausführungsform gemäß Figur 9 ist besonders dann von Vorteil, wenn lonenströme durch grö ßere Membranpatches (Makropatches) gemessen werden sollen, die von mehreren Zellen an der Oberfläche eines Zellaggregates gebildet werden. In diesem Fall befinden sich unter der Öffnung der mittleren Mess-Perfusionsöffnung 22B mehr als eine Zelle mit Zwischenzellkontakten. Um den Membranpatch in der Mess-Perfusionsöffnung 22B entsprechend zu isolieren, werden die Wider stände der Zwischenzellkontakte durch Perfusion der Isolations-Perfusionsöffnung 26 mit einer nicht-leitenden Lösung erhöht. Als Isolations-Perfusionsmedium wird eine isotone Saccharose-Lö sung verwendet. Dies ermöglicht eine deutlich verbesserte Kontrolle der Membranspannung (Spannungsklemme) unter der durch die Mess-Perfusionsöffnung 22B isolierten zentrischen Pore, die ggf. mehrere Zellen und damit Zwischenzellräume umfassen kann. Durch einen geeignet ge wählten Unterdrück und die zusätzliche Isolation der Mess-Perfusionsöffnung 22B durch die kon zentrische Isolations-Perfusionsöffnung 26 werden die Randflächen 16 der Mess-Perfusionsöff- nungen 22A, 22B voneinander isoliert.

Figur 10 zeigt eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Messgeräts 100, bei der die Halteeinrichtung 10 als Ansaugeinrichtung verwendet wird. Die Halteeinrichtung 10 hat die Ge stalt eines Trichters, dessen engerer Bereich einen Fixierabschnitt 12 zur Aufnahme der Zellprobe 1 im komprimierten Zustand bildet. Anders als bei den übrigen Ausführungsformen ist der Fixier abschnitt 12 nicht durch einen Bodenbereich geschlossen, sondern mit einer Saugleitung 16 ver bunden, die mit einer Unterdruck-Kammer oder Säugpumpe (nicht dargestellt) koppelbar ist. Die Perfusionskammern 21A, 21B, die jeweils eine Mess-Elektrode 31A oder 31B enthalten, münden am Fixierabschnitt 12 in den Innenraum 11 der Flalteeinrichtung 10. Die Mess-Elektrode 31A der Mess-Perfusionskammer 21A ist mit der Spannungsmesseinrichtung (nicht gezeigt) und die Mess- Elektrode 31B der Mess-Perfusionskammer 21B ist mit der Strommesseinrichtung 41B verbunden, so dass gleichzeitige Messungen von Aktionspotentialen und lonenströmen möglich sind. Alterna tiv kann eine einzige Perfusionskammer vorgesehen sein, die für die Messung Aktionspotentialen oder lonenströmen konfiguriert ist.

Die Flalteeinrichtung 10 ist z. B. so bemessen, dass Zellaggregate oder Einzelzellen, insbesondere Oozyten, mit einem Durchmesser von rd. 50 pm bis 1000 pm angesaugt und komprimiert fixiert werden können. Mit dem Messgerät 100 gemäß Figur 10 wird die Zellprobe 1 von einer Oberflä che in die Röhren- oder Trichter-förmige Öffnung der Flalteeinrichtung 10 gesaugt, wo sie im Fi xierabschnitt 12 mit den Mess-Perfusionsöffnungen 22A, 22B einen seal-Kontakt herstellt.

Der Fixierabschnitt 12 des erfindungsgemäßen Messgeräts 100 kann mit einem Fixierelement oder mit mehreren Fixierelementen ausgestattet sein, welche die Zellprobe 1 im Fixierabschnitt 12 verankern. Gemäß Figur 11 wird ein Fixierelement 19 durch ein Ringprofil der Innenwand der Flalteeinrichtung 10 im Fixierabschnitt 12 gebildet. Mit dem Ringprofil hat die Innenwand eine Ge stalt derart, dass sich der Fixierabschnitt 12 zum Boden bereich 14 hin wie bei den anderen Aus führungsformen der Erfindung zunächst verjüngt und unmittelbar am Bodenbereich 14 wieder er weitert. Das Fixierelement 19 kann auch einen Fixierabschnitt in Gestalt eines umlaufenden Vor sprungs darstellen (siehe Figur 6), wobei in diesem Fall die Gestalt des übrigens Innenraums der Flalteeinrichtung nicht als Fixierabschnitt konfiguriert sein muss.

Figur 11 illustriert des Weiteren, dass mindestens eine Perfusionskammer 21A der Perfusionsein richtung 20 im Wandbereich 15 in den Fixierabschnitt 12 der Flalteeinrichtung 10 münden kann. Vorteilhafterweise wird in diesem Fall die Perfusionskammer 21A in dem gleichen Plattenelement 10A wie die Flalteeinrichtung 10 gebildet. Die Perfusionskammer 21A umfasst zwei Perfusionska näle, durch die der untere, erweiterte Bereich des Fixierabschnitts 12 spülbar ist. Eine Mess-Elekt- rode 31A ist in der Perfusionskammer 21A angeordnet, um Signale für Messungen von Aktionspo tentialen und/oder lonenströmen abzuleiten. Alternativ ist die Perfusionskammer 21A als Isola- tions-Perfusionskammer verwendbar. Eine weitere Mess-Perfusionskammer 21B der Perfusions einrichtung 20 ist unterhalb der Halteeinrichtung 10 angeordnet und mit dem Fixierabschnitt 12 über eine zentrale Mess-Perfusionsöffnung 22B verbunden. Die Mess-Perfusionskammer 21B ent hält mindestens eine Mess-Elektrode 31B, 31C, die mit der Spannungsmesseinrichtung 41A und/oder dem Operationsverstärker 42B der Strommesseinrichtung 41B koppelbar ist. Die Aus führungsform der Figur 11 kann so modifiziert werden, dass wie in Figur 9 unterhalb der Halteein richtung 10 zusätzlich eine oder mehrere Isolations-Perfusionskammern (nicht gezeigt) mit einer ringförmigen Isolations-Perfusionsöffnung angeordnet sind.

Da sich das Ringprofil des Fixierabschnitts 12 gemäß Figur 11 unmittelbar am Boden bereich 14 er weitert, wird eine umlaufende kammerförmige Ausnehmung 23 mit dreieckiger Querschnittsform am Bodenbereich 14 der Halteeinrichtung 10 gebildet. Vorteilhafterweise wird damit die gleiche Wirkung erzielt wie mit der quaderförmigen Perfusionskammer in Figur 2B. Diese Ausnehmung bildet einen umlaufenden Perfusionskanal zur Aufnahme eines Mess- oder Isolations-Perfusions mediums.

In Figur 12 ist eine weitere Abwandlung der Ausführungsform gemäß Figur 1 gezeigt, bei der die Halteeinrichtung 10 des Messgeräts 100 an ihrer Innenseite mindestens eine extrazelluläre Anre gungs-Elektrode 18. Mit der Anregungs-Elektrode 18 kann die Zellprobe 1 durch ein Potential ei nes Stimulators (nicht gezeigt) gereizt werden, um Kontraktionen der Zellprobe 1 (z. B. von Mus kelzellen) auszulösen. Zur Messung der Kontraktionen kann eine Manometereinrichtung 44 zur Messung von Druckvariationen als Kontraktionsparameter in einer der Perfusionskammern 21A, 21B der Perfusionseinrichtung 20 angeordnet sein. Alternativ oder zusätzlich kann die Anregungs- Elektrode 18 verwendet werden, um mit einer Spannungsmesseinrichtung 43 Oberflächenpoten tiale der Zellprobe 1 zu erfassen. Wenn mehrere Elektrode 18 in der Halteeinrichtung 10 angeord net sind, können Oberflächenpotentiale an verschiedenen Positionen der Zellprobe 1 registriert werden können.

Figur 13 zeigt eine Ausführungsform der Erfindung, bei der das Messgerät 100 übereinander eine untere Mess-Perfusionskammer 21A mit einer zentralen Mess-Perfusionsöffnung 22A, eine mitt lere Mess-Perfusionskammer 21B und eine Isolations-Perfusionskammer 25 aufweist. Die mittlere Mess-Perfusionskammer 21B und die zugehörige umlaufende Mess-Perfusionsöffnung 22B kön nen mit einer derart geringen Höhe, z. B. 20 pm, gebildet sein, dass die Zellprobe 1 vorteilhafter weise nicht in die seitlich einmündende Perfusionskammer gesaugt oder gedrückt werden kann. Eine weitere Variante des Messgeräts 100 gemäß Figur 2 ist in Figur 14 mit einer Rückhalteeinrich tung illustriert, die ein poröses Material 53 umfasst. Das poröse Material 53, das für das Perfusi onsmedium durchlässig und die Zellprobe 1 undurchlässig ist, kann die Säulenelemente 51, 52 ge mäß den Figuren 3C und 3D ersetzen oder ergänzen. Das poröse Material 53 wirkt wie ein Filter, der in der umlaufenden Perfusionsöffnung 22B/26 sitzt. Die untere Perfusionsöffnung 22A ist so mit von der Rückhalteeinrichtung umgeben, oder die Mess- oder Isolations-Perfusionskammer 21B/25 ist mit der Rückhalteeinrichtung ausgestattet. Das poröse Material 53 kann aus einem Granulat, einem porösen Glas, insbesondere einem Aerogel mit einer Porengröße im Bereich von 100 nm bis 1 pm, einem porösen Kunststoff und/oder aus einem Mikrosieb bestehen, dessen Po- ren durch Schlitze mit einem Abstand von 1 - 10 pm oder durch ein Bündel von Mikrofasern mit einem Innendurchmesser von 1-10 pm gebildet werden. Das poröse Material 53 kann als Teil von einem der Plattenelemente, z. B. mit Photolithographie-Technik gebildet sein.

Die in der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen offenbarten Merk- male der Erfindung können sowohl einzeln als auch in Kombination oder Unterkombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.

Claims

Ansprüche

1. Elektrophysiologisches Messgerät (100), das zur Erfassung mindestens eines elektrischen Messwerts an einer biologischen Zellprobe (1), insbesondere mit einer Querschnittsdimension im Bereich von 50 pm bis 1 mm, eingerichtet ist, umfassend

- eine Halteeinrichtung (10) mit einem Innenraum (11), der einen Bodenbereich (14) und einen Wandbereich (15) aufweist und zur Aufnahme der Zellprobe (1) in einem physiologischen Umge bungsmedium (2) konfiguriert ist,

- eine Perfusionseinrichtung (20) mit mindestens einer Mess-Perfusionskammer (21A, 21B), die zur Aufnahme eines Perfusionsmediums (3A, 3B) konfiguriert ist und über mindestens eine Mess- Perfusionsöffnung (22A, 22B) mit dem Innenraum (11) der Halteeinrichtung (10) verbunden ist, wobei eine zum Innenraum (11) der Halteeinrichtung (10) weisende Randfläche der Mess-Perfusi- onsöffnung (22A, 22B) aus einem elektrisch isolierenden Material gebildet ist,

- eine Elektrodeneinrichtung (30) mit mindestens einer Mess-Elektrode (31A, 31B), die jeweils für einen elektrischen Kontakt mit dem Perfusionsmedium in der mindestens einen Mess-Perfusions- kammer (21A, 21B) angeordnet ist, und

- eine Messeinrichtung (40), die zur Erfassung des mindestens einen elektrischen Messwerts mit der mindestens einen Mess-Elektrode (31A, 31B) verbunden ist,

dadurch gekennzeichnet, dass

- die Halteeinrichtung (10) mindestens einen Fixierabschnitt (12, 12A, 12B) aufweist, der benach bart zu der mindestens einen Mess-Perfusionsöffnung (22A, 22B) der mindestens einen Mess-Per- fusionskammer (21A, 21B) angeordnet ist, wobei

- geometrische Eigenschaften des Fixierabschnitts (12, 12A, 12B) so gewählt sind, dass die Zell probe (1) mittels des Fixierabschnitts (12, 12A, 12B) in einem deformierten Zustand in der Hal teeinrichtung (10) fixierbar ist.

2. Messgerät gemäß Anspruch 1, bei dem

- der Innenraum (11) der Halteeinrichtung (10) einen Führungsabschnitt (13) aufweist, der an den Fixierabschnitt (12, 12A, 12B) angrenzt und ein größeres Volumen als der Fixierabschnitt (12, 12A, 12B) aufweist.

3. Messgerät gemäß Anspruch 2, bei dem

- der Führungsabschnitt (13) eine Trichterform aufweist und für eine Zuführung der Zellprobe (1) in einem nicht-komprimierten Zustand zu dem Fixierabschnitt (12, 12A, 12B) eingerichtet ist.

4. Messgerät gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem

- die mindestens eine Mess-Perfusionsöffnung (22A, 22B) der mindestens einen Mess-Perfusions- kammer (21A, 21B) im Bodenbereich (14) der Halteeinrichtung (10) und/oder am Wandbereich (15) der Halteeinrichtung (10) in den Innenraum (11) der Halteeinrichtung (10) mündet.

5. Messgerät gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem

- die Perfusionseinrichtung (20) mindestens zwei Mess-Perfusionskammern (21A, 21B) aufweist, die übereinander angeordnet sind, wobei

- eine untere Mess-Perfusionskammer (21A) über eine zentrale Mess-Perfusionsöffnung (22A) im Bodenbereich (14) mit dem Innenraum (11) der Halteeinrichtung (10) verbunden ist, und

- mindestens eine obere Mess-Perfusionskammer (21B) über eine umlaufende Mess-Perfusions- öffnung (22B) am Wandbereich (15) mit dem Innenraum (11) der Halteeinrichtung (10) verbunden ist.

6. Messgerät gemäß Anspruch 5, bei dem

- die mindestens eine obere Mess-Perfusionskammer (21B) an der umlaufenden Mess-Perfusions- öffnung (22B) eine kammerförmige Ausnehmung (23) aufweisen, die so angeordnet ist, dass Per fusionsmedium in der kammerförmigen Ausnehmung (23) die Zellprobe (1) allseits umspülen kann.

7. Messgerät gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem

- die Perfusionseinrichtung eine Isolations-Perfusionskammer (25) aufweist, die zur Aufnahme eines elektrisch nicht-leitenden Isolationsmediums konfiguriert ist und über mindestens eine Iso- lations-Perfusionsöffnung (26) mit der Halteeinrichtung (10) verbunden ist, wobei

- die mindestens eine Isolations-Perfusionsöffnung (26) benachbart zu der Mess-Perfusionsöff- nung (22A, 22B) der mindestens einen Mess-Perfusionskammer (21A, 21B) angeordnet ist, und

- bei Beaufschlagung der Isolations-Perfusionskammer (25) mit einem Überdruck die mittels des Fixierabschnitts (12, 12A, 12B) fixierte Zellprobe (1) mit dem Isolationsmedium perfundierbar ist.

8. Messgerät gemäß Anspruch 7, bei dem

- die mindestens eine Isolations-Perfusionsöffnung (26) im Bodenbereich (14) der Halteeinrich tung (10) und/oder für eine laterale Perfusion der Zellprobe (1) am Wandbereich (15) der Hal teeinrichtung (10) in den Innenraum (11) der Halteeinrichtung (10) mündet.

9. Messgerät gemäß Anspruch 7 oder 8, bei dem

- die mindestens eine Isolations-Perfusionsöffnung (26) und die Mess-Perfusionsöffnung (22A, 22B) der mindestens einen Mess-Perfusionskammer (21A, 21B) zueinander konzentrisch angeord net sind.

10. Messgerät gemäß Anspruch 7 oder 8, bei dem

- die Isolations-Perfusionskammer (25) und die mindestens eine Mess-Perfusionskammer (21A, 21B) übereinander angeordnet sind, wobei

- die Isolations-Perfusionskammer (25) oberhalb der unteren Mess-Perfusionskammer (21A) über eine umlaufende Isolations-Perfusionsöffnung (26) am Wandbereich (15) mit dem Innenraum (11) der Halteeinrichtung (10) verbunden ist.

11. Messgerät gemäß Anspruch 10, bei dem

- zwischen der unteren Mess-Perfusionskammer (21A) und der Isolations-Perfusionskammer (25) eine mittlere Mess-Perfusionskammer (21B) über eine umlaufende Mess-Perfusionsöffnung (22B) am Wandbereich (15) mit dem Innenraum (11) der Halteeinrichtung (10) verbunden ist.

12. Messgerät gemäß Anspruch 10 oder 11, bei dem

- die Isolations-Perfusionskammer (25) oder die mittlere Mess-Perfusionskammer (21B) an der umlaufenden Mess-Perfusionsöffnung (22B) eine kammerförmige Ausnehmung (23) aufweisen, die so angeordnet ist, dass Perfusionsmedium in der kammerförmigen Ausnehmung (23) die Zell probe (1) allseits umspülen kann.

13. Messgerät gemäß einem der Ansprüche 4 bis 8 oder 10 bis 12, bei dem

- die mindestens eine Mess-Perfusionsöffnung (22A, 22B) und/oder die mindestens eine Isolati- ons-Perfusionsöffnung (26) für eine laterale Perfusion der Zellprobe (1) am Wandbereich (15) der Halteeinrichtung (10) in den Innenraum (11) der Halteeinrichtung (10) mündet, und

- an der mindestens einen Mess-Perfusionsöffnung (22A, 22B) und/oder der mindestens einen Isolations-Perfusionsöffnung (26) eine Rückhalteeinrichtung (50) angeordnet ist, die für Perfusi onsflüssigkeiten durchlässig und für die Zellprobe (1) undurchlässig ist.

14. Messgerät gemäß Anspruch 13, bei dem

- die Rückhalteeinrichtung (50) mindestens eines von einem porösen Material (53), insbesondere mit Porengrößen im Bereich von 100 nm bis 1 pm, einem Material mit durchgehenden Kanälen, insbesondere mit Durchmessern im Bereich von 100 nm bis 1 pm, einem Filtermaterial und einer Verteilung von Säulenelementen (50) umfasst.

15. Messgerät gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem

- die Perfusionseinrichtung zusätzlich eine Test-Perfusionskammer aufweist, die zur Aufnahme einer Testsubstanz konfiguriert ist und über eine Test-Perfusionsöffnung mit der Halteeinrichtung (10) verbunden ist, wobei

- die Test-Perfusionsöffnung in dem Wandbereich (15) der Halteeinrichtung (10) benachbart zu der Mess-Perfusionsöffnung (22A, 22B) der mindestens einen Mess-Perfusionskammer (21A, 21B) angeordnet ist.

16. Messgerät gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem

- die Halteeinrichtung (10) oder die Perfusionseinrichtung (20) zusätzlich mindestens eine Unter druck-Kammer aufweist, die zur Aufnahme eines elektrisch nicht-leitenden Druckmediums konfi guriert ist und über mindestens eine Saugleitung (16) mit der Halteeinrichtung (10) verbunden ist, wobei

- bei Beaufschlagung der mindestens einen Unterdruck-Kammer mit einem Unterdrück die Zell probe (1) in Eingriff mit dem Fixierabschnitt (12, 12A, 12B) ansaugbar ist.

17. Messgerät gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem

- die Messeinrichtung (40) für die Erfassung von einem Aktionspotential der Zellprobe (1) und/ oder einem lonenstrom durch eine Membran der Zellprobe (1) konfiguriert ist.

18. Messgerät gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem

- die Perfusionseinrichtung zwei Mess-Perfusionskammern (21A, 21B) und die Messeinrichtung (40) zwei Messkreise aufweist.

19. Messgerät gemäß Anspruch 18, bei dem

- die Messkreise jeweils für die Erfassung des Aktionspotentials der Zellprobe (1) oder des lonen- stroms durch eine Membran der Zellprobe (1) konfiguriert sind.

20. Messgerät gemäß Anspruch 18 oder 19, bei dem

- die Halteeinrichtung (10) zwei Fixierabschnitte (12A, 12B) aufweist.

21. Messgerät gemäß Anspruch 20, bei dem

- die Mess-Perfusionsöffnungen (22A, 22B) der Mess-Perfusionskammern (21A, 21B) und die Fi xierabschnitte (12A, 12B) zueinander benachbart angeordnet sind.

22. Messgerät gemäß einem der Ansprüche 17 bis 21, bei dem

- die Mess-Perfusionsöffnungen (22A, 22B) der Mess-Perfusionskammern (21A, 21B) zueinander konzentrisch angeordnet sind.

23. Messgerät gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem

- der mindestens eine Fixierabschnitt (12, 12A, 12B) der Halteeinrichtung (10) die Form eines Hohlzylinders oder eines Trichters aufweist.

24. Messgerät gemäß Anspruch 23, bei dem

- der mindestens eine Fixierabschnitt (12, 12A, 12B) der Halteeinrichtung (10) in Längsrichtung des Hohlzylinders oder Trichters eine Länge aufweist, die mindestens gleich dem 0,3-fachen Durchmesser, insbesondere mindestens gleich dem 1,5-fachen Durchmesser der Zellprobe (1) in einem nicht-komprimierten Zustand ist.

25. Messgerät gemäß einem der Ansprüche 23 oder 24, bei dem

- der mindestens eine Fixierabschnitt (12, 12A, 12B) der Halteeinrichtung (10) die Form des Trich ters aufweist, wobei

- der Trichter einen Trichterwinkel relativ zur Ebene der Randfläche der Mess-Perfusionsöffnung (22A, 22B) aufweist, der im Bereich von 50° bis 85° gewählt ist.

26. Messgerät gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem

- der mindestens eine Fixierabschnitt (12, 12A, 12B) der Halteeinrichtung (10) einen umlaufenden Vorsprung (17) in der Halteeinrichtung (10) umfasst, wobei der umlaufende Vorsprung (17) für eine Verankerung der Zellprobe (1) eingerichtet ist.

27. Messgerät gemäß Anspruch 26, bei dem

- der umlaufende Vorsprung (17) eine Dicke aufweist, die mindestens gleich dem 0,1-fachen Durchmesser und höchstens gleich dem 0,5-fachen Durchmesser der Zellprobe (1) in einem nicht komprimierten Zustand ist.

28. Messgerät gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem

- der mindestens eine Fixierabschnitt (12, 12A, 12B) der Halteeinrichtung (10) einen Innendurch messer aufweist, der höchstens gleich dem 0,9-fachen Durchmesser, insbesondere höchstens gleich dem 0,7-fachen Durchmesser der Zellprobe (1) in einem nicht-komprimierten Zustand ist.

29. Messgerät gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem

- die Mess-Perfusionsöffnung (22A, 22B) der mindestens einen Mess-Perfusionskammer (21A, 21B) einen Durchmesser im Bereich von 5 pm bis 100 pm aufweist.

30. Messgerät gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem

- eine Innenoberfläche des Fixierabschnitts (12, 12A, 12B) der Halteeinrichtung (10) aus einem elektrisch leitenden Material gebildet ist, und/oder

- in der Halteeinrichtung (10) eine Anregungs-Elektrode (18) angeordnet ist, die für eine extrazel luläre elektrische Anregung der Zellprobe (1) konfiguriert ist.

31. Messgerät gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem

- die Halteeinrichtung (10), die Perfusionseinrichtung und die Elektrodeneinrichtung (30) als Mik- rofluidikvorrichtung aufgebaut sind.

32. Hochdurchsatz-Testgerät, das eine Vielzahl von Messgeräten gemäß einem der vorher gehenden Ansprüche umfasst.

33. Elektrophysiologisches Messverfahren zur Erfassung mindestens eines elektrischen Messwerts an einer biologischen Zellprobe (1), insbesondere mit einer Querschnittsdimension im Bereich von 50 pm bis 1 mm, unter Verwendung eines Messgeräts oder eines Hochdurchsatz- Testgeräts gemäß einem der Ansprüche 1 bis 30, umfassend die Schritte

- Bereitstellung der Zellprobe (1) an der Halteeinrichtung (10),

- Beaufschlagung der Perfusionseinrichtung mit einem Unterdrück derart, dass die Zellprobe (1) in den Fixierabschnitt (12, 12A, 12B) der Halteeinrichtung (10) gezogen und mit diesem fixiert wird,

- Beaufschlagung der Perfusionseinrichtung mit einem Überdruck derart, dass die Zellprobe (1) mit mindestens einem Perfusionsmedium perfundiert wird, und

- Erfassung des mindestens einen elektrischen Messwerts mit der Messeinrichtung (40).

34. Messverfahren gemäß Anspruch 33, bei dem

- die Zellprobe (1) ein Spheroid-Aggregat oder eine Einzelzelle umfasst.

35. Messverfahren gemäß einem der Ansprüche 33 bis 34, bei dem

- die Erfassung des mindestens einen elektrischen Messwerts die Erfassung eines Aktionspotenti als der Zellprobe (1) und/oder eines lonenstroms durch eine Membran der Zellprobe (1) umfasst.

36. Messverfahren gemäß Anspruch 35, bei dem

- das Aktionspotential der Zellprobe (1) und der lonenstrom durch eine Membran der Zellprobe (1) gleichzeitig erfasst werden.

37. Messverfahren gemäß einem der Ansprüche 33 bis 36, bei dem

- die Zellprobe (1) mit einem elektrisch nicht-leitenden Isolationsmedium perfundiert wird.

38. Messverfahren gemäß einem der Ansprüche 33 bis 37, bei dem

- die Perfusionseinrichtung die Test-Perfusionskammer aufweist, und

- die mindestens eine Test-Perfusionskammer aufeinanderfolgend mit Testsubstanzen beauf schlagt wird und die Erfassung des mindestens einen elektrischen Messwerts in Abhängigkeit von der jeweiligen Testsubstanz erfolgt.

39. Messverfahren gemäß einem der Ansprüche 33 bis 38, mit dem Schritt

- Kontraktionsmessung an der Zellprobe (1), insbesondere mittels einer Druck- und/oder Impe danzmessung.

40. Messverfahren gemäß einem der Ansprüche 33 bis 39, bei dem

- der in dem Fixierabschnitt fixierte Teil der Zellprobe (1) an eine unterhalb des Fixierabschnitts angeordnete Mess-Perfusionsöffnung gesaugt wird, die mit einer separaten Saugleitung und sepa raten Unterdruckkammer oder Mikrofluidkanälen (21 A/B) verbunden ist.

41. Messverfahren gemäß einem der Ansprüche 33 bis 40, bei dem

- der mindestens eine Fixierabschnitt (12, 12A, 12B) eine Durchmischung einer Suspensionsflüssig keit in der Flalteeinrichtung und eines Perfusionsmediums (3A, 3B) behindert.

42. Messverfahren gemäß einem der Ansprüche 33 bis 41, bei dem

- nach der Erfassung des mindestens einen elektrischen Messwerts die Zellprobe aus dem elektro- physiologischen Messgerät (100) entnommen und für biochemische und molekularbiologische Untersuchungen aufgearbeitet und/oder in ein Zellkulturgefäß überführt wird.

43. Messkit, das für pharmakologische Untersuchungen, insbesondere Toxizitätstests, an

Zellaggregaten ausgelegt ist, umfassend

- das Messgerät gemäß einem der Ansprüche 1 bis 32, und

- mindestens eine Testsubstanz mit einer physiologischen, insbesondere arrhythmogenen, Wir kung auf die Zellprobe.

44. Messkit gemäß Anspruch 43, bei dem

- die mindestens eine Testsubstanz zur Beeinflussung von Parameter des Aktionspotentials, insbe sondere Anstiegssteilheit, Länge und/oder Auftreten von Nachpotentialen, und/oder von lonen- strömen (Hemmung-Stimulation) geeignet ist.