[go: up one dir, main page]

WO2019112485A1 - Матричный ферментативный синтез днк с использованием фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов - Google Patents

Матричный ферментативный синтез днк с использованием фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов Download PDF

Info

Publication number
WO2019112485A1
WO2019112485A1 PCT/RU2018/050115 RU2018050115W WO2019112485A1 WO 2019112485 A1 WO2019112485 A1 WO 2019112485A1 RU 2018050115 W RU2018050115 W RU 2018050115W WO 2019112485 A1 WO2019112485 A1 WO 2019112485A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
primers
pcr
dna
oligonucleotides
oligonucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/RU2018/050115
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Максим Сергеевич КУПРЮШКИН
Инна Алексеевна ПЫШНАЯ
Елена Владимировна ДМИТРИЕНКО
Дмитрий Александрович СТЕЦЕНКО
Максим Леонидович ФИЛИПЕНКО
Игорь Петрович ОСКОРБИН
Григорий Александрович СТЕПАНОВ
Владимир Александрович Рихтер
Михаил Константинович ИВАНОВ
Дмитрий Владимирович ПЫШНЫЙ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Obshchestvo S Ogranichennoj Otvetstvennostyu "biolabmix"
Obshchestvo S Ogranichennoj Otvetstvennostyu "noogen"
Original Assignee
Obshchestvo S Ogranichennoj Otvetstvennostyu "biolabmix"
Obshchestvo S Ogranichennoj Otvetstvennostyu "noogen"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Obshchestvo S Ogranichennoj Otvetstvennostyu "biolabmix", Obshchestvo S Ogranichennoj Otvetstvennostyu "noogen" filed Critical Obshchestvo S Ogranichennoj Otvetstvennostyu "biolabmix"
Priority to JP2020550583A priority Critical patent/JP2021505205A/ja
Priority to EP18885630.6A priority patent/EP3736342A4/en
Priority to US16/769,680 priority patent/US11643433B2/en
Priority to KR1020207017372A priority patent/KR20200093580A/ko
Publication of WO2019112485A1 publication Critical patent/WO2019112485A1/ru
Priority to IL275003A priority patent/IL275003A/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/067—Pyrimidine radicals with ribosyl as the saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/167—Purine radicals with ribosyl as the saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the invention relates to the field of molecular biology and molecular diagnostics.
  • the subject of the invention is the use of new derivatives of oligonucleotides, namely phosphorylguanidines, containing one or more phosphate groups bearing on the phosphorus atom the residue of guanidine or substituted guanidine, as primers, seed when conducting polymerase chain reaction, including in combination with reverse transcription.
  • Ready-made reaction mixtures are pre-prepared mixtures of the components necessary for carrying out the stage of nucleic acid amplification, usually designed to solve routine research tasks.
  • Matrix enzymatic DNA synthesis is the process of elongation of an oligonucleotide primer from the 3'-end by successively inserting an additional nucleotide link catalyzed by a DNA polymerase.
  • a set of reaction mixtures - a pre-made set of ready-made reaction mixtures with a protocol for performing a routine task as part of a research experiment or diagnostic analysis.
  • kits for carrying out the polymerase chain reaction (PNR), reverse transcription, and reverse transcription with subsequent PNR in a single test tube have been widely used in the field of molecular and medical biology.
  • Primer - an oligomer consisting of parts of a partially or fully nucleotide nature, containing fragments of the structure, ensuring recognition of the DNA template by the principle of complementary interaction and the start of the polymerase reaction catalyzed by DNA polymerase, and extended from the 3'-terminus to at least one additional monomeric unit .
  • FG-oligonucleotides are derivatives of oligonucleotides containing one or more phosphate groups in which a guanidine or substituted guanidine residue is introduced on the phosphorus atom;
  • NK - nucleic acid DNA or RNA
  • GFP - green fluorescent protein (from the English green fluorescent protein);
  • k eff is the amplification coefficient
  • ROX ROX, BHQ2, FAM, TAMRA - fluorescent dyes
  • KRAS - proto-oncogene a member of the Ras protein family.
  • Oligonucleotides are widely used as primers for carrying out the polymerase chain reaction (PCR), which allows to increase the copy number of a DNA fragment, the boundaries of which are determined by the nucleotide sequence of primer seeds [1, 2].
  • PCR polymerase chain reaction
  • oligonucleotide derivatives include derivatives containing nucleotide units based on “closed” nucleic acids (LNA) [3] or oligoethylene glycol phosphodiester [4] as part of the so-called “cooperative” primers.
  • LNA closed nucleic acids
  • oligoethylene glycol phosphodiester oligoethylene glycol phosphodiester
  • Another way to improve the accuracy of PCR is to use as primers oligonucleotide derivatives with a temporary protection of the 3 ′ end fragment, removed under the action of chemical agents or physical stimuli — light or temperature [7, 8].
  • Partially uncharged oligonucleotides for example, containing phosphoethers residues, that is, carrying an aliphatic alcohol residue instead of one of the oxygen atoms, can be used as primers for DNA amplification, but their preparation requires the use of special phosphoramide nucleotide monomers and non-standard conditions of post-synthetic release and release synthesized oligonucleotides [10].
  • An example of the widespread use of partially uncharged oligonucleotides in reaction mixtures with different temperature conditions for primer extension and amplification of a DNA fragment using a wide range of DNA polymerases has not yet been described.
  • the closest analogue to the proposed method is the prototype, is the method of amplification in the presence of modified primers of oligonucleotides containing substituents at the phosphorus atom in the composition of the internucleotide phosphate groups introduced instead of the oxygen atom, namely oligonucleotides with phosphorothioate residues [11].
  • Primers with this type of skeletal modification can be obtained using standard nucleotide monomers, but special oxidizing agents.
  • the disadvantage of the prototype is the limited conditions of use of such a system, which are as follows:
  • the set of enzymes used is limited, namely, a polymerase lacking 3 ′ -> 5 ′ exonuclease activity (i.e., the use of polymerase with corrective activity will not lead to a decrease in non-specific amplification) ⁇ and capable of elongation of the primer in the range of 55 -61 ° C;
  • the conditions of the amplification reaction are thermal cyclic;
  • the number and position of phosphorylguanidine groups (FG) in the oligonucleotide is not limited, and is set and controlled during automatic synthesis, which allows to obtain both fully modified derivatives, and derivatives with partially substituted phosphodiester residues;
  • oligonucleotides with a wide range of physicochemical properties, possessing a single nucleotide sequence.
  • the key difference from the analogues of the presented invention is the inclusion of one or more phosphorylguanidine groups in the oligonucleotide primer structure.
  • the introduction of a guanidine group instead of one of the oxygen atoms significantly increases the volume of the substituent at the phosphorus atom and makes the phosphorylguanidine oligonucleotide derivatives uncharged under physiological conditions.
  • the presence of a bulky and uncharged group at the phosphorus atom in the composition of phosphorylguanidine derivatives of oligonucleotides leads to a change in their substrate properties as primers of the template enzymatic DNA synthesis.
  • the phosphorylguanidine group in the primer structure perturbs the structure of the primer-template complex of a polymerase with a DNA or RNA substrate, changing the efficiency of the enzyme.
  • the application primers with phosphorylguanidine grouping influences the final yield, composition, or rate of accumulation of the reaction products of the matrix enzymatic DNA synthesis.
  • the phosphorus-ilguanidine groups used in the primers for initialization of matrix enzymatic synthesis provide significant differences from the aforementioned analogues, for example, phosphorothioate-containing oligonucleotides.
  • the technical result of the claimed invention is to increase the reliability, sensitivity and specificity of the detection of the analyzed sequences of nucleic acids, as well as simplifying the method of matrix DNA synthesis.
  • the technical result is achieved by using a primer for matrix enzymatic synthesis of nucleic acids containing at least one inter-link phosphorylguanidine group.
  • the general structure of the primer is shown in FIG. 1 A, where Z is a phosphorylguanidine group.
  • template enzymatic DNA synthesis using the method described above can be used to amplify nucleic acids using both DNA and RNA as the primary template.
  • the method can be implemented in both thermocyclic and isothermal protocols, in particular, during amplification by the mechanism of a rolling ring.
  • the most popular is the application of the proposed method for PCR for research and diagnostic purposes.
  • the use of the method for detecting single nucleotide mutations using allele-specific PCR makes it possible to increase the sensitivity and specificity of the method.
  • the present invention discloses the use of phosphorylguanidine oligonucleotides that meet the above criteria for creating improved systems for detecting and quantifying nucleic acids based on PCR and RT-PCR.
  • FIG. 1 and FIG. 2 are descriptions of the compounds used in the examples.
  • FIG. 1 and FIG. 2 are descriptions of the compounds used in the examples.
  • FIG. 1 shows the structure of the primer and uncharged phosphoryl guanidine group (Z) in general form (A); Examples of used phosphorylguanidine groups (B) bearing guanidine residue (g ”), EG, EG, EG ', EG'-tetramethylguanidine (g'), 1,3-dimethylimidazolidin-2-imine (g), EG, EG'- bis (tetramethylene) guanidine (g '”).
  • FIG. 2 shows the sequence and structure of the oligonucleotides used in the examples of the invention, where g ”, g, g -phosphorylguanidine group, [ 32 P] is a radioactive label, * is a fluorescent label (FAM or TAMRA).
  • FIG. 3 illustrates the model systems used in the examples of the invention, in which FG-oligonucleotides act as primers (A) or matrices (B), where g is the phosphorylguanidine group.
  • FIG. 4 illustrates an example of the use of a phosphorylguanidine derivative of an oligonucleotide as a primer in a reaction catalyzed by a thermostable DNA-dependent DNA polymerase, in thermocyclic (1) and isothermal (2) modes.
  • FIG. the result of the electrophoretic analysis of the Mzo / Z complex (the system is shown in FIG. 3A) in the presence of Taq DNA polymerase under the thermal cyclic regime (A) is presented; the degree of accumulation of the full-size reaction product in the M 4 o / T complex (the system is shown in Fig. 3A) in the presence of Taq DNA polymerase under the isothermal mode; the sequences of the primers Z0 – ZF and TO TK are shown in FIG. 2
  • FIG. 5 illustrates an example of using a phosphorylguanidine oligonucleotide derivative as a primer in a reaction catalyzed by a mesophilic DNA-dependent DNA polymerase.
  • the degree of accumulation of the full-size reaction product in the M40 / T complex (the system is shown in FIG. 3A) in the presence of the DNA polymerase of phage T5, the sequences of the primers TO –––3 are shown in FIG. 2
  • FIG. 6 illustrates the ability of phosphorylguanidine oligonucleotide derivatives to act as a matrix in a reaction catalyzed by a thermostable DNA-dependent DNA polymerase.
  • FIG. The result of the electrophoretic analysis of the Z / Ns complex (the system is shown in Fig. 3B) in the presence of Taq DNA polymerase is presented; the sequences of the primers Z0 - ZF are shown in Fig. 1. 2
  • FIG. 7 illustrates the ability of phosphorylguanidine oligonucleotide derivatives to act as a matrix in a reaction catalyzed by a mesophilic DNA-dependent DNA polymerase.
  • the result of the electrophoretic analysis of the Z / Ns complex (the system is shown in Fig. 3B) in the presence of a Klenow fragment, the sequences of the primers Z0h-ZF are shown in Figs. 2
  • FIG. 8 shows changes in the effectiveness of PNR using phosphorylguanidine oligonucleotide derivatives as primers.
  • FIG. the table shows the amplification coefficients in the primer pair system, where one of the oligonucleotides contains at least one phosphorylguanidine group in comparison with the standard primer system (Q0-Z0).
  • the primer sequences are shown in FIG. 2.
  • the values of efficiency coefficients of the PNR, obtained from the results of three or more independent experiments, are given. SD - standard deviation
  • FIG. 9 illustrates the ability to control the length of a growing complementary strand of DNA using phosphorylguanidine groups as part of the original primer.
  • FIG. 9 The result of the analysis of the length of the PNR of the products of the eGFP gene fragment in the presence of the corresponding primer pairs is presented (signatures on the diagrams: Q0-Z0 is a pair of primers without modifications; Q0-ZH2 and Q0-ZH1 are pairs of unmodified primers with phosphorylguanidine oligonucleotide derivatives) by fragment analysis on an automatic capillary analyzer, where * is the FAM fluorescent label, the sequences of the primers Q0, Z0, ZH1 and ZH2 are shown in FIG. 2
  • FIG. 10 demonstrates the property of phosphorylguanidine oligonucleotide derivatives to reduce the likelihood of the accumulation of non-specific PCR products catalyzed by Taq DNA polymerase, including in combination with “hot start” technology.
  • FIG. the result of electrophoretic analysis of PNR catalyzed by Taq-DNA polymerase in the presence of the corresponding primer pairs is presented under standard conditions (A) and under the condition of a delayed “hot” start (B), the thermal denaturation curves of the amplification products of the eGFP gene fragment (C), where M is a marker of DNA lengths from 100 to 400 bp, primer sequences are shown in FIG. 2.
  • the melting region of non-specific products is indicated by a dotted line.
  • FIG. 11 illustrate that the presence of phosphorylguanidine groups does not cause the formation of mutations due to the interaction of the enzyme with modified monomers in the synthesis of a chain that is complementary. the original primer sequence.
  • FIG. Presents the result of sequencing DNA products by Sanger after amplification in the presence of pairs of standard primers (Q0-Z0) and pairs containing phosphorylguanidine derivatives of oligonucleotides (shown in the figures in the center) using native oligonucleotide primers Q0 (column on the right) and Z0 (column on the left) .
  • the frame highlights the area of the source primers, the sequences of all primers are shown in FIG. 2.
  • FIG. 2 The frame highlights the area of the source primers, the sequences of all primers are shown in FIG. 2.
  • FIG. 12 demonstrates the efficiency of using phosphorylguanidine oligonucleotide derivatives as primers for DNA-dependent DNA polymerases used in commercial PCR systems, including for the determination of DNA in human physiological fluids: whole blood and blood plasma.
  • FIG. Presents the result of electrophoretic analysis of PCR in system I (DNA-dependent DNA polymerase Pfu) and II (a mixture of DNA-dependent DNA polymerases Pfu and Taq) (panel A), system III (commercial system for PCR on whole physiological fluids) (panel B) using a pair of standard primers (Q0-Z0) and a pair of phosphorylguanidine derivatives.
  • M - DNA length marker from 100 to 500 bp
  • primer sequences are shown in FIG. 2
  • FIG. 13 illustrates the possibility of using phosphorylguanidine oligonucleotide derivatives as primers for RNA-dependent DNA polymerases (revertases).
  • FIG. 13 The values of the threshold cycle of amplification reactions after reverse transcription using RNA-dependent DNA polymerases MMLV and HIV-RBB in the presence of the SYBR and SYTO-13 intercalating dyes (highlighted in color) are presented, the sequences of the primers are shown in FIG. 2
  • FIG. 14 demonstrates the potential and benefits of using phosphorylguanidine oligonucleotide derivatives as primers in single-step RT-PCR systems.
  • FIG. The result of the electrophoretic analysis (A) and the thermal denaturation curves (B) of RT products with subsequent PCR using a pair of standard primers (U0-V0) and pairs of phosphorylguanidine derivatives (UH1-VH1; UH1-WH1), specific to the sequence of human U12 myRNA, are presented. as part of the total RNA of human cells.
  • M is a marker of DNA lengths from 100 to 400 bp
  • primer sequences are shown in FIG. 2, the area of mobility of non-specific products is indicated by a dotted line.
  • FIG. 15 illustrates the result of using phosphorylguanidine oligonucleotide derivatives as primers in a rolling ring amplification reaction (RCA).
  • FIG. the result of the electrophoretic analysis (A) and the amplification coefficients of the rolling ring reaction products using the standard primer (DO) and phosphorylguanidine derivatives (D2 and D3) specific to the sequence of the plasmid pUCl9 are presented, the sequences of the primers are shown in FIG. 2.
  • "K-" corresponds to the results of the control reaction without primers.
  • M - control the mobility of the original plasmid
  • FIG. 16 demonstrates an increase in the selectivity of mutation detection using phosphorylguanidine oligonucleotide derivatives as a primer in allele-specific PCR.
  • FIG. A schematic representation of an experiment to identify a T / C single nucleotide mutation in the KRAS gene in genomic DNA by allele-specific PCR in the presence of a pair of standard S0 + S primers and a pair of standard and phosphorylguanidine derivative S1 + S is presented. The primer sequences are shown in FIG. 2. Next to the primer designations is the value ACt.
  • modified oligonucleotides in enzymatic reactions of the matrix synthesis of nucleic acids may be accompanied by various effects that affect the overall yield of the reaction.
  • Most of the known chemical modifications in the composition of oligonucleotide primers leads to disruption of the interaction of nucleic acid substrates with enzymes.
  • never fully used uncharged oligonucleotide derivatives were used as primers, since it was evident from the literature that their carbohydrate-phosphate backbone is not recognized by enzymes [9].
  • the invention describes the possibility of using primers with phosphorylguanidine groups in the systems of matrix enzymatic DNA synthesis.
  • the method of matrix enzymatic DNA synthesis using primers containing phosphorus ilguanidine groups [12-14], as compared with analogues, combines a number of advantages disclosed in this invention, the combination of which ensures the achievement of a technical result.
  • each of the substituents Rl, R2, R3, and R4 may be a hydrogen atom H or an optionally substituted organic radical.
  • Each of the substituents Rl, R2, R3 and R4 is independently selected from the group consisting of H, C 1-10 alkyl, C2 10 alkenyl, C2-10 alkynyl, -C6-10 aryl, or -C5-10 heteroaryl (for example, Fig.
  • each alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, alkylene, or heteroalkylene may be further substituted; where in addition R1 and R2, together with the atom to which they are bound, form a 5-8 membered heterocycle; In some applications, R1 and R2 together with the atom to which they are linked form a 5–8 membered heterocycle, preferably pyrrolidine, piperidine, piperazine, morpholine, since the size of such substituents should not exclude the interaction of FG-oligonucleotides with the enzyme necessary for initiation matrix synthesis reactions.
  • R1 and R2 together with the atom to which they are attached, form a 5-membered heterocycle, for example, pyrrolidine (Fig. 1, g '").
  • R2 n R3 together form an alkylene or heteroalkylene chain 2-4 atoms long, and R1 and R4 are each independently selected from the group consisting of H and C1 4 alkyl.
  • R2 and R3 together form a CH2 CH2 chain, and R1 and R4 are -H or methyl (for example, Fig. 1, g).
  • Some of the preferred compounds encompassed by the present invention correspond to FG formulas bearing guanidine residue (g "), N, N, N ', N'- tetramethylguanidine (g '), 1,3-dimethylimidazolidin-2-imine (g), N, N'-bis (tetramethylene) guanidine (g "'), shown in FIG. 1B.
  • FIG. 1 The structure of the primer and uncharged phosphorylguanidino group (Z) in general form (A); examples of used phosphorylguanidine groups (B) carrying guanidine residue (g ”), K, K, d, YG-tetramethylguanidine (g '), 1,3-dimethylimidazolidin-2-imine (g),' -bis (tetramethylene) guanidine (g '”).
  • the algorithm for constructing a FG-modified primer involves the inclusion of at least one phosphorylguanidine group in the oligonucleotide and allows the use of fully uncharged phosphorylguanidine derivatives of oligonucleotides as primers (Fig. 2).
  • the presence of phosphorylguanidine groups in the primer does not preclude the introduction of additional functional groups that provide additional properties of the primers and the final product.
  • the possibility of introducing a fluorescent and radioactive label into FG-modified primers is presented.
  • One of the key properties and criteria for selecting (any) modified oligonucleotides for use as primers is their ability to form a competent primer-matrix complex to initiate a reaction and the ability to act as a template for synthesizing the 3 ′ end region of the complementary chain (when the sequence nucleotides of the original primer).
  • Replacing negatively charged inter-link phosphate groups with neutral groups, as well as changing the volume of substituents at the phosphorus atom, should affect the ability of the oligonucleotide to interact with the DNA and RNA matrix and be extended with DNA or RNA-dependent DNA polymerases.
  • the invention contains a description of examples demonstrating the possibility of oligonucleotides with phosphorylguanidine groups both to act as primers and to provide matrix properties upon elongation of the complementary chain.
  • Various applications of matrix DNA synthesis in particular, DNA amplification in molecular diagnostics, biotechnology and genetic engineering, involve the use of a wide range of DNA polymerases.
  • phosphorylguanidines act as substrates for a wide range of both mesophilic and thermophilic DNA-dependent DNA polymerases regardless of the presence of 3 '->5' / 5 '->3' exonuclease activity under thermocyclic and isothermal conditions (Example 2 3, 4, 5, 6, 10, 13), as well as RNA-dependent DNA polymerases (Example 11, 12).
  • the presented invention illustrates the possibility of using primers with phosphorylguanidine groups at different temperatures (temperature protocols) for carrying out polymerase (enzymatic) reactions.
  • the described property of a new class of primers can be applied in the development of synthesis and diagnostic systems based on different protocols for detecting and quantifying nucleic acids.
  • Reducing the yield of by-products can also be achieved by combining the use of primers with phosphorylguanidine groups with already known solutions aimed at modifying other components of the reaction mixture, for example, hot-start technologies.
  • phosphorylguanidines can alter the amplification coefficient.
  • the amplification efficiency can be comparable to the standard reaction with unmodified primers, and it can be significantly reduced up to the complete exclusion of amplification.
  • the effect on amplification efficiency can be due to the participation of modified monomers at two main stages: initiation of the polymerization reaction and elongation of the complementary chain, when the nucleotide sequence of the primer acts as a matrix.
  • the control of the synthesis of the 3 ’end region of one of the chains, in particular, the formation of sticky ends, is interesting for solving a number of genetic engineering problems in the design of artificial DNA molecules with a given nucleotide sequence.
  • PCR products with sticky ends can be used in the design of expression plasmid DNA vectors.
  • the present invention shows the possibility of both obtaining a full-sized complementary chain, and preventing the synthesis of part of the 3 ’end links.
  • An important parameter when selecting components of amplification systems is the possibility of carrying out the reaction when using various objects as a matrix, for example, synthetic nucleic acids, plasmid DNA, total RNA and genomic DNA of cells and tissues, viral nucleic acids, as well as whole physiological fluids (for example, blood and blood plasma), demanded in the diagnosis of human and animal diseases.
  • synthetic nucleic acids for example, synthetic nucleic acids, plasmid DNA, total RNA and genomic DNA of cells and tissues, viral nucleic acids, as well as whole physiological fluids (for example, blood and blood plasma), demanded in the diagnosis of human and animal diseases.
  • whole physiological fluids for example, blood and blood plasma
  • the laboratory practice for solving routine tasks includes commercially available ready-made reaction mixtures, in addition, complex step-by-step manipulations are usually carried out using reagent kits containing the necessary components and instructions for conducting an experiment and achieving a scientific or diagnostic result.
  • the method of matrix enzymatic DNA synthesis using primers with phosphorylguanidine groups can be implemented using ready-made reaction mixtures and reagent kits or reaction mixtures for detecting and amplifying nucleic acids, which are in demand for solving both research and diagnostic problems.
  • nucleic acid amplification stages using phosphorylguanidine oligonucleotide derivatives can become part of more complex protocols and reagent kits for their implementation, for example, preparing DNA libraries for differential analysis of gene expression using high-performance methods.
  • the application of the proposed method can not only improve the outcome of a particular stage of the matrix DNA synthesis, but also, in individual applications, will allow to exclude stages, for example, intermediate purification from non-specific by-products.
  • PG-oligonucleotides and unmodified oligodeoxyribonucleotides are shown in FIG. 2. Oligonucleotides contained from 8 to 40 nucleotide units. Phosphorylguanidine groups (PG) are represented as unmodified (g ”), branched (g’), closed (g) residue and guanidine residue with bulky substituents (g ’”) (Fig. 1B). The amount of FG in the oligonucleotide composition varied from one group to 100% (Fig. 2).
  • FG oligonucleotides acted as primer oligonucleotides (Fig. 3A) or matrices (Fig. 3B), contained a fluorescent (* - FAM or TAMRA) or radioactive label ([ 32 P]).
  • plasmid DNA containing the eGFP gene were used as matrices; whole blood and human blood plasma preparations containing pre-added plasmid DNA; Hepatitis C virus RNA (HCV); total human adenocarcinoma RNA cells of human breast MCF-7; plasmid pUCl9; human genomic DNA.
  • HCV Hepatitis C virus RNA
  • HCV Hepatitis C virus RNA
  • pUCl9 human genomic DNA.
  • DNA polymerases Mesophilic and thermophilic enzymes with and without 3 '- 5' / 5 '-> 3' exonuclease activity were used as DNA polymerases: Taq DNA polymerase, phage T5 DNA polymerase, E. coli DNA polymerase I (Klenow Fragment) , Pfu DNA polymerase, RNA-dependent DNA polymerase (revertase) MMLV and HIV-rbb; DNA polymerase phi29.
  • Example. 2 (PG-oligonucleotide as a primer in the reaction catalyzed by thermostable polymerase, in thermocyclic (1) and isothermal (2) modes)
  • reaction mixtures (10 ⁇ l) contained: native Mzo oligonucleotide (10 ⁇ M); unmodified oligonucleotide Z0 or FG-oligonucleotide Zl-ZHl (10 ⁇ M, sequences of primers Z0-ZF are shown in Fig.
  • the reaction mixtures (10 ⁇ l) contained: native oligonucleotide M40 (30 ⁇ M), radioactively labeled oligonucleotide T (NTZ (10 ⁇ M, sequences of primers TO - TZ presented in Fig. 2); a set of triphosphates (0.2 mM each), 1.8 mM MgCh, Tris-HCl (10 mM) pH 8.8, KC1 (50 mM); 0.1% Tween-20, Taq DNA polymerase (1 unit.).
  • the reaction was carried out in isothermal mode (Fig.
  • FG oligonucleotides are able to act as primers in the presence of a thermostable Taq DNA polymerase and, under conditions of a thermal cyclic temperature regime, can be completed to a full-sized product, like the native oligonucleotide primer Z0.
  • a decrease in the efficiency of elongation is observed for the oligonucleotide Zl, 2, containing two GFs near the 3 'end.
  • Fig. 4B Under isothermal conditions (Fig. 4B), a similar result was observed: the degree of accumulation of the full-length reaction product for T1 and T2 oligonucleotides is close to that for TO.
  • a decrease in the accumulation rate of the full-length reaction product is observed for the TK oligonucleotide containing PGs near the 3 'end.
  • Example. 3 (PG-oligonucleotide as a primer in the reaction catalyzed by mesophilic polymerase)
  • the reaction mixtures contained: native oligonucleotide M40 (30 ⁇ M), radioactively labeled oligonucleotide T0-KG3 (10 ⁇ M, sequences of primers TO - TZ are shown in FIG. 2); a set of triphosphates (0.2 mM each), MgCh (20 mm), Tris-HC1 (50 mm), pH 8.0, NaCl (100 ⁇ M), DTT (5 mm), 0, 1 mg / ml BSA; Phage T5 DNA polymerase (500 ⁇ M).
  • reaction was carried out for 6-60 minutes and stopped by adding a solution for applying samples during electrophoresis containing 7 mM EDTA. All samples were separated and analyzed similarly. example 2 (2). The relative error of determination in all experiments did not exceed 15% (Fig. 5).
  • Example. 4 (PG-oligonucleotide as a matrix in the reaction catalyzed by thermostable polymerase)
  • reaction mixtures (10 ⁇ l) contained: unmodified Z0 oligonucleotide or FG-oligonucleotide Zl- ⁇ ZF (10 ⁇ M, sequences of primers Z0 h-ZF are shown in Fig. 2 ), fluorescently labeled native primer FAM-Ns (10 ⁇ M, the sequence is shown in Fig.
  • FG oligonucleotides are able to act as templates in the presence of a thermostable Taq DNA polymerase under the conditions of a thermal cyclic regime.
  • the efficiency of completing the native oligonucleotide to a full-sized product increases with the removal of the FGD from the 3'-end of the FG-oligonucleotide.
  • FG-oligonucleotide containing a successive (ZH1) and alternating modified FG (ZH2, ZF) has the maximum impact on the yield of a full-sized product.
  • Example. 5 (PG-oligonucleotides as a matrix in the reaction catalyzed by mesophilic polymerase)
  • the reaction mixtures (10 ⁇ l) contained: 10 ⁇ M unmodified Z0 oligonucleotide or FG-oligonucleotide Zl- ⁇ ZF (sequences of Z0-ZF primers are shown in Fig. 2), 10 ⁇ M TAMRA-labeled native primer * Ns (Fig. 2), a complete set of dNTP triphosphates (10 mM), Klenow Fragment (2 units of act.), Tris-HC1 (50 mM), pH 7.6, MgCh (10 mM), DTT (5 mM). The reaction was carried out for 30 minutes in isothermal mode at 37 ° C. The reaction was stopped and analyzed as in example 2.
  • Amplification of the eGFP gene fragment was performed in a reaction buffer containing 50 mM Tris-HC1, pH 8.5, 50 mM KC1, 0.2 mM of each deoxynucleoside triphosphate, 2 mM MgCh, 0.03 uAc / ⁇ l Taq DNA polymerase.
  • Amplification mode 95 ° ⁇ 5 min, 47 cycles: 95 ° ⁇ - 10 s, 61 ° ⁇ - 10 s, 72 ° ⁇ - 10 s.
  • the primers used were the pairs shown in FIG. 8, (direct + reverse), based on standard native oligonucleotides and FG oligonucleotides.
  • FG oligonucleotides differed in the number and location of phosphorylguanidine units in the oligonucleotide chain.
  • Oligonucleotide sequences are shown in FIG. 2. The concentration of each primer was 500 nM.
  • the efficiency of amplification was determined by the method of Poland in real time in the presence of the intercalating dye SYBR Green I on a LightCycler 96 device (Roche, Switzerland).
  • the amplification efficiency was compared using the amplification coefficients (k eff ) using the linearizing coordinates C t (lg Co) approach (where C t is the threshold cycle, Co is the initial concentration of the matrix) implemented in LightCycler 96 Software version 1.1.0.1320.
  • the values of the amplification coefficients are shown in FIG. 8 (the values of the efficiency coefficients of PNR, obtained from the results of three or more independent experiments; SD is the standard deviation). It is seen that single FGs in the primer structure (see primers Z1- ⁇ Z9) do not significantly affect the efficiency of amplification.
  • the effect of phosphorylguanidine groups is determined by their position in the primer-primer chain. Contract-located PGs (primer ZH1) significantly reduce k eff to 1.44. The introduction of modifications to the “one through” position (alternating modified phosphorylguanidine units) ensures the accumulation of a full-sized product.
  • Amplification of the eGFP gene fragment was performed in the reaction buffer as described previously in example 6.
  • Amplification mode 95 ° ⁇ 5 min, 28 cycles: 95 ° ⁇ - 10 s, 61 ° ⁇ - 10 s, 72 ° ⁇ - 10 s.
  • plasmid DNA containing the eGFP gene was used in an amount of 10 10 g per reaction.
  • the primers used were pairs (* Q0 - Z0), (* Q0 - ZH1), (* Q0 - ZH2), where * is the fluorescent label FAM. Sequences of FG oligonucleotides are shown in FIG. 2. The concentration of each primer was 500 nM.
  • Example. 8 (comparison of the accumulation of specific and non-specific PCR products catalyzed by 7a ⁇ / - DNA polymerase using standard and FG-modified oligodeoxyribonucleotides as primers)
  • Amplification of the eGFP gene fragment was performed in the reaction buffer as described previously in example 6.
  • pairs of standard native oligonucleotides Q0 - Z0,) of modified PG-oligonucleotides (QH2 - ZH2), standard and modified oligonucleotides (QH2 - Z0), and a mixture of three oligonucleotides (Z0 QH2 / Q0 , the last in the ratio of 50/50%).
  • Oligonucleotide sequences are shown in FIG. 2.
  • the concentration of primers was 500 nM.
  • PCR products were performed by electrophoresis in agarose gel (Fig. 10A and B, M - a marker of DNA lengths from 100 to 400 bp) and by thermal denaturation PCR products on an iQ5 instrument (Bio-Rad, USA) in the presence of the SYBR Green I intercalating dye (Fig. 10B).
  • Amplification of the eGFP gene fragment was performed in the reaction buffer as described previously in example 6.
  • FIG. Figure 11 shows the results of sequencing DNA products by Sanger after amplification in the presence of primer pairs, centered using native Q0 oligonucleotide primers (column on the right) and Z0 (column on the left). The frame highlighted area of the original primers.
  • nucleotide composition of the growing DNA chain in the presence of pairs of native primers corresponds to the composition in the presence of pairs, one or both of which contains PG.
  • the presence of FG in the original primer does not cause mutations in the growing DNA chain when constructing a complementary chain in the primer region.
  • the presence of GF in a row in adjacent positions terminates the extension of the growing chain on the modified matrix and allows you to control the length of the final product, forming single-stranded “sticky ends”, as described in Example 7.
  • Example. 10 use of FG-oligonucleotides as primers for DNA polymerases used in commercial PCR systems
  • System I contained the Pfu DNA polymerase (ZAO Sileks, Russia); System II - a mixture of Taq and Pfu polymerases for PCR of long fragments (PCR type “Long Range”) (Biolabmix LLC, Russia); System III - for carrying out PCR on whole blood “InBlood PCR kit” (CJSC Evrogen, Russia) with “InBlood” polymerase (CJSC Evrogen, Russia).
  • amplification was carried out in the following mode: pre-denaturation of 95 ° C - 5 min, 32 cycles: 9 ° C - 10 s, 61 ° C - 10 s, 72 ° s
  • the primer pairs used were (Q0 - Z0), (Q0 - ZH2), (QH2 - Z0), (QH2 - ZH2). Oligonucleotide sequences are shown in FIG. 2
  • FIG. 12 The results of the analysis of PCR products by agarose gel electrophoresis are presented in FIG. 12 (where M is a marker of DNA lengths from 100 to 500 bp). It can be seen (Fig. 12 A and B) that when using FG-oligonucleotides as primers in the presence of various commercial polymerases and buffer mixtures, a PCR product of a given length is specifically formed. FG oligonucleotides are suitable for carrying out PCR in physiological fluids. The presented results allow us to conclude that it is possible to efficiently use FG-modified oligodeoxyribonucleotides as primers-primers in PCR catalyzed by various DNA polymerases used in commercial PCR systems.
  • Example. 11 (PG-oligonucleotides as primers for RNA-dependent DNA polymerases (revertaz))
  • This example demonstrates the possibility of using F7-oligonucleotides P7-P24 labeled with fluorescein as primers in detecting Hepatitis C virus RNA (HCV) compared to the native P0 oligonucleotide.
  • Oligonucleotide sequences are shown in FIG. 2.
  • Modified FG primers contained from 7 (from the 5'-end of oligonucleotides) to 21 FG in a row. Fresh blood serum from HCV-infected donors was used as a starting material for analysis.
  • HCV RNA was isolated using the RealBest Extraction 100 kit (Vector-Best) and introduced into the RT-PCR reaction as part of the procedure described, using either native P0 oligonucleotide P7 or P21 and revertase (MMLV) during the reverse transcription stage. or HIV-RBB).
  • the reverse transcription reaction (50 ⁇ l) was performed in a mixture of the following composition: FG-oligonucleotides (0.5 ⁇ M), MgCk (3 mM), Tris-HC1 (50 mM) pH 8.0, (NH 4 ) 2 S0 4 (10 mM), KC1 (30 mM), 0.01% Tween-20, a set of triphosphates dNTP (0.4 mM each), BSA 100 ⁇ g / ml, MMLV or HIV-rbb (10 units of act.).
  • the reverse transcription reaction was carried out in at least two repetitions in the temperature mode: 45 ° C - 30 minutes, 95 ° C - 3 minutes.
  • PCR was performed in a mixture of the following composition: primers CTCCCGGGAGAGCCATAG and TCCAAGAAAGGACCCGGTC (0.5 ⁇ M each), buffer (MgCh (3 mM), Tpnc-S0 4 (50 mM) pH 8.0, (NH 4 ) 2 S0 4 (10 mM), KC1 (30 mM), 0.01% Tween-20), Taq DNA polymerase (1 unit act.), probe fluorescently labeled hydrolysable probe probe 5'-ROX-TCTGCGGAACCGGTGAGTACACCG- (BHQ2) (0.25 ⁇ M), SYBR Green I (at a dilution of 1/10000) _ or SYTO-13 (at a dilution of 1/2500).
  • Amplification was carried out in the mode of 50 ° ⁇ - 2 min, 49 cycles: 94 ° ⁇ - 10 s, 60 ° ⁇ - 20 s, 5 ° ⁇ - 5 s, 95 ° ⁇ - 1 min.
  • the process of HCV detection using the CFX96 instrument (BioRad, USA) and RealBest RNA HCV kit was performed in real time via two channels: ROX-specific detection of a fluorescently labeled hydrolyzing probe and FAM-non-specific detection of dsDNA using the SYBR Green I dye (Fig. 13 , the usual typeface) or SYTO-13 (Fig. 13, highlighted in bold and color).
  • SYBR Green I dye Fig. 13 , the usual typeface
  • SYTO-13 Fig. 13, highlighted in bold and color
  • Comparison of substrate properties of FG-oligonucleotides and native oligonucleotide as primers primers were performed by determining the value of the reaction threshold cycle (Ct (cycle threshold)) shown in FIG. 13.
  • the Ct value was calculated as previously described in Example 6. It can be seen that the FG oligonucleotides can act as primers when cDNA is obtained on the matrix of the analyzed RNA using RNA-dependent DNA polymerases (MMLV reverse transcriptase and HIV-RB).
  • Example 12 (FG-oligonucleotides as primers for DNA polymerases in one-step RT-PCR systems)
  • the system for one-step RT-PCR "BioMaster RT-PCR SYBR Blue (2x)" (Biolabmix LLC), containing MMLV revertase and thermostable DNA-dependent Taq DNA polymerase, used primers specific to human U12 mRNA.
  • oligonucleotides U0, V0
  • FG oligonucleotides UH1, VH1, WH1
  • concentration of each primer was 480-700 nM.
  • RT-PCR was performed on a preparation of total RNA of human breast adenocarcinoma cells MCF-7 in a concentration range from 6 ng / ⁇ l to 8 pg / ⁇ l.
  • Amplification mode 95 ° ⁇ 5 min, 48 cycles: 95 ° ⁇ - 10 s, 60 ° ⁇ - 10 s, 72 ° ⁇ - 10 s.
  • RT-PCR products The analysis of RT-PCR products was performed by thermal denaturation and horizontal gel electrophoresis in a 1.5% gel, followed by visualization of the nucleotide material with ethidium bromide (Fig. 14A, where the DNA length marker is from 100 to 400 and. I.).
  • Fig. 14A where the DNA length marker is from 100 to 400 and. I.
  • the apparent efficiency ratios were determined: 1.7 for the pair (U0 - V0), 1.63 for (UH1 - VH1) and 1.56 for (UH1 - WH1).
  • FG-modified primers when using FG-modified primers to a much lesser extent, the formation of non-specific amplification products with a lower melting point.
  • the obtained results demonstrate the fundamental possibility of using FG-oligonucleotides as primers in one-step systems for RT-PCR, i.e. FG-modified primers are able to act as primers at the RT stage (catalyzed by RNA-dependent DNA polymerase), and then at the amplification stage (catalyzed by DNA-dependent DNA polymerase).
  • Example 13 (PG-oligonucleotides as primers in the reaction of the amplification of the mechanism of the rolling ring (RCA))
  • This example demonstrates a comparison of the efficiency of the DNA amplification reaction using the rolling ring mechanism (RCA) using FG oligonucleotides and a native oligonucleotide.
  • DNA amplification of plasmid pUCl9 was performed in reaction buffer containing Tris-HCl (50 mM) pH 7.5, MgCh (10 mM), (NH 4 ) 2 S0 4 (10 mM), DTT (4 mM), in the presence of a set of deoxynucleoside triphosphates (0.2 mM each), BSA (200 ng / ⁇ l), intercalating dye SYBR Green I, DNA polymerase pY29 (0.5 units of act. / ⁇ l), 1 ⁇ M of one of the primers.
  • Amplification mode 14 hours at 30 ° C.
  • FG oligonucleotides D2 and D3 and the native oligonucleotide D0 were used as primers. Oligonucleotide sequences are shown in FIG. 2. Modified FG primers contained 2 and up to 3 FG in a row from the 3 ′ end of the oligonucleotide.
  • the amplification product (for each primer D2, D3 and D0) was diluted 3 times 6 times and 50 ⁇ l of the resulting solution was used to estimate the amplification coefficient by PCR in nine repetitions in real time in the presence of a fluorescently labeled hydrolyzing probe per pUC9 length of 105 nucleotides .
  • the average value of the reaction threshold cycle (Ct) and the difference (ACt) between the Ct of the specific primer and the dilution of the initial matrix corresponding to the initial conditions of the amplification reaction DNA amplification of the plasmid pUCl9 in the amount of 0.2 g
  • the obtained ACt value was used to calculate the amplification coefficient of RCA with the assumption that the effectiveness of the initial conditions is 1 (Fig. 11 B).
  • the amplification factor when using FG-oligonucleotides D2 and D3 is higher than that of the original native primer D0, namely, 247.3 and 29.9, respectively, compared to 9.4.
  • Example 14 (increased selectivity of mutation detection using FG-oligonucleotide as a primer allele-specific PCR)
  • Amplification of the matrix was performed in a buffer containing Tris-HCl (65 mM), pH 8.9; (NH 4 ) 2 S0 4 (24 mM); MgS0 4 (3 mM), 0.05% Tween-20, a set of deoxynucleoside triphosphates (0.2 mM each), Taq DNA polymerase (0.03 uAc / ⁇ l), fluorescently labeled hydrolysable probe 5'-HEX - CTGTATCGTCAAGGCACTCTTGC-BHQ2-3 '(100 nM).
  • Amplification mode 95 ° ⁇ 3 min, 50 cycles: 95 ° ⁇ - 10 s, 60 ° ⁇ - 40 s.
  • Oligonucleotide pairs (direct + reverse) were used as primers: S0 + S and S1 + S, where S and S0 are native oligonucleotides, S1 is PG-oligonucleotide.
  • S and S0 are native oligonucleotides
  • S1 is PG-oligonucleotide.
  • Each primer was added to the reaction mixture at a concentration of 300 nM.
  • Primer structures are shown in FIG. 2.
  • a schematic representation of the detection of a T / C single nucleotide mutation in a matrix by the method of allele-specific PCR in the presence of S0 + S and S1 + S primer pairs is shown in FIG. sixteen.
  • the selectivity of mutation detection was determined by real-time PCR on a LightCycler 96 device (Roche, Switzerland).
  • Mullis K.B., Faloona F.A Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction // Methods Enzymol. - 1987. - V. 155. - P. 335-350.
  • Kupryushkin MC Magnificent DV, Stetsenko DA. Phosphorylguanidines. New class of nucleic acid analogs // Acta naturae. - 2014. - V. 6. - N ° 4 (23). - pp. 53-55.
  • Kuznetsov NA Kupryushkin MS, Abramova TV, Kuznetsova AA, Miroshnikova AD, Stetsenko DA, Pyshnyi DV, Fedorova OS New Oligonucleotide Derivatives as Unreactive Substrate Analogues & Potential Inhibitors Of Human Apurinic / Apyrimidinic Endonuclease APE1 // Molecular BioSystems. - 2016. - V. 12. -N 1. - P. 67-75.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области молекулярной биологии, биотехнологии и молекулярной диагностики. Изобретение может быть использовано в разработке и оптимизации ПЦР и ОТ-ПЦР систем, применяемых для выявления нуклеиновых кислот, в том числе при диагностике генетических, вирусных и других заболеваний. Суть предлагаемого способа состоит в том, что нейтральные производные олигонуклеотидов, а именно фосфорилгуанидины, содержащих одну или более фосфатных групп, в которых на атоме фосфора введен остаток гуанидина или замещенного гуанидина, используют в качестве праймеров при проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) и ПЦР в сочетании с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Изобретение позволяет получать более достоверные, специфичные и селективные результаты при проведении ПЦР, в частности повышать чувствительность ПЦР за счет снижения выхода побочных продуктов амплификации ДНК и/или контролировать выход ПЦР-продукта, в том числе, намеренно подавлять, за счет использования разных комбинаций положения и числа модифицированных фосфатных групп в составе олигонуклеотидных праймеров.

Description

МАТРИЧНЫЙ ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ ДНК С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФОСФОРИЛГУАНИДИНОВЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ
Описание изобретения
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Изобретение относится к области молекулярной биологии и молекулярной диагностики. Предметом изобретения является использование новых производных олигонуклеотидов, а именно фосфорилгуанидинов, содержащих одну или более фосфатных групп, несущих на атоме фосфора остаток гуанидина или замещенного гуанидина, в качестве праймеров-затравок при проведении полимеразной цепной реакции в том числе в сочетании с обратной транскрипцией.
Термины и определения:
Готовые реакционные смеси - заранее подготовленные смеси компонентов, необходимых для проведения стадии амплификации нуклеиновых кислот, обычно предназначенные для решения рутинных исследовательских задач.
Матричный ферментативный синтез ДНК - процесс удлинения олигонуклеотида- праймера с З’-конца путем последовательного встраивания дополнительного нуклеотидного звена, катализируемого ДНК-полимеразой.
Набор реакционных смесей - заранее составленный комплект готовых реакционных смесей с протоколом для выполнения рутинной задачи в рамках исследовательского эксперимента или диагностического анализа. Например, широкое применение в области молекулярной и медицинской биологии получили наборы для проведения полимеразной цепной реакции (ПНР), обратной транскрипции, а также обратной транскрипции с последующей ПНР в одной пробирке.
Праймер - олигомер, состоящий из звеньев частично или полностью нуклеотидной природы, содержащий фрагменты структуры, обеспечивающие узнавание ДНК-матрицы по принципу комплементарного взаимодействия и начало полимеразной реакции, катализируемой ДНК-полимеразой, и удлиняемый с З’-конца хотя бы на одно дополнительное мономерное звено. ФГ-олигонуклеотиды - производные олигонуклеотидов, содержащие одну или более фосфатных групп, в которых на атоме фосфора введен остаток гуанидина или замещенного гуанидина;
Сокращения и условные обозначения
БСА - бычий сывороточный альбумин;
ДТТ - дитиотреитол;
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;
дц - двуцепочечная;
мяРНК - малая ядерная РНК;
НК - нуклеиновая кислота (ДНК или РНК);
ОТ - обратная транскрипция;
ОТ-ПЦР - ПЦР в сочетании с обратной транскрипцией;
п.н. - пары нуклеотидов;
ПЦР - полимеразная цепная реакция;
ревертаза - РНК-зависимая ДНК-полимераза;
РНК - рибонуклеиновая кислота;
Трис - трис(гидроксиметил)аминометан;
ФГ - фосфорилгуанидиновая группа;
Фрагмент Кленова - часть бактериальной ДНК-полимеразы I E.coli с полимеразной и 3'-5'- экзонуклеазной активностями и отсутствующей 5'-3'-экзонуклеазной активностью;
Ct - пороговый цикл;
GFP - зеленый флуоресцентный белок (от англ green fluorescent protein);
keff - коэффициент амплификации;
LNA - «замкнутая» нуклеиновая кислота (от англ «locked nucleic acid»);
ROX, BHQ2, FAM, TAMRA - флуоресцентные красители;
RCA - реакция амплификации катящегося кольца;
SD - стандартное отклонение;
SYBR Green I, SYTO-13 - интеркалирующие флуоресцентные красители;
KRAS - протоонкоген, представитель семейства белков Ras. Уровень техники
Олигонуклеотиды широко используют в качестве праймеров для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющей увеличивать копийность фрагмента ДНК, границы которого определяются нуклеотидной последовательностью праймеров- затравок [1, 2].
Структура праймеров в значительной степени определяет эффективность протекания ПЦР, что заставляет выбирать их последовательность в рамках рационального дизайна и в строгом соответствии с набором установленных критериев. Наиболее часто в качестве праймеров-затравок используют нативные олигодезоксирибонуклеотиды. Помимо нативных олигонуклеотидов в качестве праймеров предложен ряд олигонуклеотидных производных, в состав которых модифицированные фрагменты вводят с целью изменения эффективности ПЦР. Например, к числу таких олигонуклеотидных производных относят производные, содержащие нуклеотидные звенья на основе «замкнутых» нуклеиновых кислот (LNA) [3] или фосфодиэфира олигоэтиленгликоля [4] в составе так называемых «кооперативных» праймеров. Кроме того, наличие указанных модификаций значительно влияет на температуру плавления формируемых комплементарных комплексов между ДНК-матрицей и модифицированным олигонуклеотидом-праймером: LNA-звенья повышают, в то время как гексаэтиленгликоль снижает.
Помимо изменения структуры углеводно-фосфатного остова, альтернативными вариантами, оказывающими влияние на эффективность ПЦР, являются модификации гетероциклических азотистых оснований [5], введение группировок ненуклеотидной природы, повышающих стабильность комплексов праймера с амплифицируемой ДНК [6].
Другим способом повышения точности ПЦР является использование в качестве праймеров олигонуклеотидных производных с временной защитой 3 '-концевого фрагмента, удаляемой под действием химических агентов или физических стимулов - света или температуры [7, 8].
Недостатком таких вышеописанных типов праймеров на основе производных олигонуклеотидов является необходимость предварительного получения дополнительных мономеров-модификаторов, которые затем должны быть использованы в ходе автоматического олигонуклеотидного синтеза. Полностью незаряженные производные олигонуклеотидов такие, как морфолиновые и пептидилнуклеотидные не используют в качестве праймеров, поскольку их углеводофосфатный остов не узнается ферментами [9] и их синтез достаточно трудоемок с точки зрения времени и ресурсов.
Частично незаряженные олигонуклеотиды, например, содержащие остатки фосфотриэфиров, то есть несущие остаток алифатического спирта вместо одного из атомов кислорода, могут быть использованы в качестве праймеров при амплификации ДНК, однако их получение требует использования специальных фосфороамидных нуклеотидных мономеров и нестандартных условий пост-синтетического деблокирования и выделения синтезированных олигонуклеотидов [10]. До сих пор не описано примера широкого применения частично незаряженных олигонуклеотидов в реакционных смесях с различным температурным режимом удлинения праймеров и амплификации фрагмента ДНК с применением широкого набора ДНК-полимераз.
Наиболее близким аналогом к предлагаемому способу - прототипом, является способ амплификации в присутствии модифицированных праймеров олигонуклеотидов, содержащих заместители при атоме фосфора в составе межнуклеотидных фосфатных группировок, вводимых вместо атома кислорода, а именно олигонуклеотиды с фосфоротиоатными остатками [11]. Праймеры с таким типом модификации остова могут быть получены с использованием стандартных нуклеотидных мономеров, но специальных окисляющих агентов. Недостатком прототипа является ограниченность условий использования такой системы, заключающаяся в следующем:
- фосфоротиоатсодержащие праймеры используют только при выявлении ДНК;
- в прототипе ограничен набор используемых ферментов, а именно, полимеразы, лишенной 3 '— >5 ' экзонуклеазной активности, (т.е. применение полимеразы с корректирующей активностью не будет приводить к уменьшению неспецифической амплификации)† и способной к удлинению праймера в диапазоне 55-61 °С;
- условия проведения реакции амплифицирования термоциклические;
- необходимость введения 5’ -концевой метки в модифицированный олигонуклеотид, используемый для детекции ДНК-продукта. При этом использование фосфорилгуанидинов в ферментативных реакциях является эффективным исходя из свойств данного класса соединений в связи со следующим:
- их синтез не требует включения в синтетический регламент дополнительных амидофосфитных мономеров предшественников и проводится на стандартном автоматическом ДНК/РНК синтезаторе;
- число и положение фосфорилгуанидиновых групп (ФГ) в олигонуклеотиде не ограничено, и задается и контролируется при автоматическом синтезе, что позволяет получать как полностью модифицированные производные, так и производные с частично замещенными фосфодиэфирными остатками;
- наличие ФГ не приводит к значительному изменению температуры плавления НК/НК комплексов в условиях умеренной ионной силы растворов;
- введение гуанидиновой группы (как минимум восьми атомов) вместо одного из атомов кислорода (отрицательно заряженного в физиологических условиях) значительно увеличивает объем заместителя при атоме фосфора и делает ФГ незаряженной в физиологических условиях, что показано на примере 1 настоящего описания;
- введение ФГ в состав олигонуклеотида приводит к его химической устойчивости в широком диапазоне pH и устойчивости к действию нуклеаз;
- изменяя положения и количества фосфорилгуанидиновых групп возможно получать олигонуклеотиды с широким спектром физико-химических свойств, обладающих одной нуклеотидной последовательностью .
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Ключевым отличием от аналогов представленного изобретения является включение в структуру олигонуклеотидного праймера одной или более фосфорилгуанидиновых группировок. Введение гуанидиновой группы вместо одного из атомов кислорода значительно увеличивает объем заместителя при атоме фосфора и делает фосфорилгуанидиновые производные олигонуклеотидов незаряженными в физиологических условиях. Наличие объемной и незаряженной группы при атоме фосфора в составе фосфорилгуанидиновых производных олигонуклеотидов приводит к изменению их субстратных свойств в качестве праймеров матричного ферментативного синтеза ДНК. На начальных этапах реакции фосфорилгуанидиновая группировка в структуре праймера возмущает структуру праймер-матричного комплекса полимеразы с ДНК- или РНК- субстатом, изменяя эффективность действия фермента. В результате, применение праймеров с фосфорилгуанидиновой группировкой влияет на конечный выход, состав или скорость накопления продуктов реакции матричного ферментативного синтеза ДНК. В частности, с использованием фосфорилгуанидиновых производных олигонуклеотидов в ПЦР можно повысить чувствительность реакции и специфичность накопление целевого продукта. Таким образом, используемые фосфор илгуанидиновые группировки в составе праймеров для инициализации матричного ферментативного синтеза обеспечивают существенные отличия от упомянутых аналогов, например, фосфоротиоатсодержащих олигонуклеотидов .
Техническим результатом заявленного изобретения является повышение достоверности, чувствительности и специфичности выявления анализируемых последовательностей нуклеиновых кислот, а также упрощение способа матричного синтеза ДНК.
Технический результат достигается тем, что для матричного ферментативного синтеза нуклеиновых кислот применяют праймер, содержащий в своем составе по крайней мере одну межзвенную фосфорилгуанидиновую группу. Общая структура праймера представлена на Фиг. 1 А, где Z - фосфорилгуанидиновая группа.
В конкретных применениях матричный ферментативный синтез ДНК по вышеописанному способу может применяться для амплификации нуклеиновых кислот с использованием в качестве первичной матрицы как ДНК, так и РНК. Способ может быть реализован как в термоциклических и изотермических протоколах, в частности, при амплификации по механизму катящегося кольца. Наиболее востребованным представляется применение предложенного способа для проведения ПЦР в исследовательских и диагностических целях. В частности, применение способа для выявления однонуклеотидных мутаций с помощью аллель-специфичной ПЦР позволяет повысить чувствительность и специфичность метода. Не менее востребованным представляется применение ферментативного синтеза ДНК с использованием фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов в реакциях обратной транскрипции как самостоятельно, так и в сочетании с последующей ПЦР.
В обычной лабораторной практике рутинные протоколы зачастую реализуются с помощью коммерчески доступных готовых реакционных смесей и наборов таких смесей с инструкцией поэтапного проведения эксперимента для достижения требуемого результата. Матричный ферментативный синтез ДНК по вышеописанному способу может стать основным этапом или являться неотъемлемой частью более сложного протокола для проведения эксперимента в научно-исследовательских или медицинских диагностических целях.
Таким образом, в данном изобретении раскрыто использование фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов, которые соответствуют вышеизложенным критериям для создания улучшенных систем детекции и количественного определения нуклеиновых кислот, основанных на ПЦР и ОТ-ПЦР.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ
Заявленное изобретения поясняется следующими рисунками:
Фиг. 1 и Фиг. 2 представляют описание используемых в примерах соединений. На Фиг.
1 представлена структура праймера и незаряженной фосфорилгуанидиной группы (Z) в общем виде (А); примеры использованных фосфорилгуанидиновых групп (Б), несущих остаток гуанидина (g”), ЕГ,ЕГ,ЕГ’,ЕГ’-тетраметилгуанидина (g’), 1,3- диметилимидазолидин-2-имина (g), ЕГ,ЕГ’-бис(тетраметилен)гуанидина (g’”). На Фиг. 2 приведены последовательности и структура олигонуклеотидов, используемых в примерах к изобретению, где g”, g, g -фосфорилгуанидиновая группа, [32Р] - радиоактивная метка, * - флуоресцентная метка (FAM или TAMRA).
Фиг. 3 иллюстрирует модельные системы, используемые в примерах к изобретению, в которых ФГ -олигонуклеотиды выступают в качестве праймеров (А) или матриц (Б), где g - фосфорилгуанидиновая группа.
Фиг. 4 иллюстрирует пример применения фосфорилгуанидинового производного олигонуклеотида в качестве праймера в реакции, катализируемой термостабильной ДНК -зависимой ДНК-полимеразой, в термоциклическом (1) и изотермическом (2) режимах. На Фиг. представлен результат электрофоретического анализа комплекса Мзо/Z (система представлена на Фиг. ЗА) в присутствии Taq ДНК- полимеразы при термоциклическом режиме (А); степень накопления полноразмерного продукта реакции в комплексе М4о/Т (система представлена на Фиг. ЗА) в присутствии Taq ДНК- полимеразы при изотермическом режиме, последовательности праймеров Z0 - ZF и ТО ТЗ представлены на Фиг. 2.
Фиг. 5 иллюстрирует пример использования фосфорилгуанидинового производного олигонуклеотида в качестве праймера в реакции, катализируемой мезофильной ДНК- зависимой ДНК-полимеразой. Степень накопления полноразмерного продукта реакции в комплексе М40/Т (система представлена на Фиг. ЗА) в присутствии ДНК- полимеразы фага Т5, последовательности праймеров ТО ч- ТЗ представлены на Фиг. 2. Фиг. 6 иллюстрирует способность фосфорилгуанидиновых производных олигонуклеотидов выступать в качестве матрицы в реакции, катализируемой термостабильной ДНК-зависимой ДНК-полимеразой. На Фиг. Представлен результат электрофоретического анализа комплекса Z/Ns (система представлена на Фиг. ЗБ) в присутствии Taq ДНК- полимеразы, последовательности праймеров Z0 - ZF представлены на Фиг. 2.
Фиг. 7 иллюстрирует способность фосфорилгуанидиновых производных олигонуклеотидов выступать в качестве матрицы в реакции, катализируемой мезофильной ДНК-зависимой ДНК-полимеразой. Результат электрофоретического анализа комплекса Z/Ns (система представлена на Фиг. ЗБ) в присутствии фрагмент Кленова, последовательности праймеров Z0 ч- ZF представлены на Фиг. 2.
Фиг. 8 демонстрирует изменения в эффективности ПНР с использованием фосфорилгуанидиновых производных олигонуклеотидов в качестве праймеров. На Фиг. в виде таблицы представлены коэффициенты амплификации в системе пар праймеров, где один из олигонуклеотидов содержит ,хотя бы одну фосфорилгуанидиновую группировку в сравнении с системой стандартных праймеров (Q0-Z0). Последовательности праймеров представлены на Фиг. 2. Приведены значения коэффициентов эффективности ПНР, полученных по результатам трех или более независимых экспериментов. SD - стандартное отклонение
Фиг. 9 иллюстрирует возможность регулирования длины растущей комплементарной цепи ДНК с помощью фосфорилгуанидиновых группировок в составе исходного праймера. На Фиг. представлен результат анализа длины ПНР продуктов фрагмента гена eGFP в присутствии соответствующих пар праймеров (подписи над диаграммами : Q0-Z0 - пара праймеров без модификаций; Q0-ZH2 и Q0-ZH1 - пары немодифицированного праймера с фосфорилгуанидиновыми производными олигонуклеотидов) методом фрагментного анализа на автоматическом капиллярном анализаторе, где * - флуоресцентная метка FAM, последовательности праймеров Q0, Z0, ZH1 и ZH2 представлены на Фиг. 2.
Фиг. 10 демонстрирует свойство фосфорилгуанидиновых производных олигонуклеотидов снижать вероятность накопления неспецифичных продуктов ПЦР, катализируемой Taq ДНК- полимеразой, в том числе в сочетании с технологией «горячего старта». На Фиг. представлен результат электрофоретического анализа ПНР, катализируемой Taq- ДНК полимеразой в присутствии соответствующих пар праймеров, в стандартных условиях (А) и в условии отложенного «горячего» старта (Б), кривые термической денатурации продуктов амплификации фрагмента гена eGFP (В), где M - маркер длин ДНК от 100 до 400 п.н., последовательности праймеров представлены на Фиг. 2. Область плавления неспецифических продуктов выделена пунктиром.
Фиг. 11 иллюстрируют, что наличие фосфорилгуанидиновых группировок не вызывает образования мутаций, обусловленных взаимодействием фермента с модифицированными мономерами при синтезе цепи, комплементарной. исходной последовательности праймеров. На фиг. представлен результат секвенирования ДНК- продуктов по Сэнгеру после амплификации в присутствии пар стандартных праймеров (Q0-Z0) и пар, содержащих фосфорилгуанидиновые производные олигонуклеотидов (представлены на рисунках по центру) с помощью нативных олигонуклеотидных праймеров Q0 (колонка справа) и Z0 (колонка слева). Рамкой выделена область исходных праймеров, последовательности всех праймеров представлены на Фиг. 2. Фиг. 12 демонстрирует эффективность использования фосфорилгуанидиновых производных олигонуклеотидов в качестве праймеров для ДНК-зависимых ДНК- полимераз, используемым в коммерческих ПЦР-системах, в том числе для определения ДНК в составе физиологических жидкостей человека: цельной крови и плазмы крови. На Фиг. представлен результат электрофоретического анализа ПЦР в системе I (ДНК- зависимая ДНК-полимераза Pfu) и II (смесь ДНК-зависимых ДНК-полимераз Pfu и Taq) (панель А), системе III (коммерческая система для ПЦР на цельных физиологических жидкостях) (панель Б) с использованием пары стандартных праймеров (Q0-Z0) и пары фосфорилгуанидиновых производных. М - маркер длины ДНК от 100 до 500 п.н., последовательности праймеров представлены на Фиг. 2.
Фиг. 13 иллюстрирует возможность применения фосфорилгуанидиновых производных олигонуклеотидов в качестве праймеров для РНК -зависимых ДНК-полимераз (ревертаз). На Фиг. представлены значения порогового цикла реакций амплификации после проведения обратной транскрипции с помощью РНК-зависимых ДНК-полимераз MMLV и HIV-рбб в присутствии интеркаллирующих красителей SYBR и SYTO-13 (выделено цветом), последовательности праймеров представлены на Фиг. 2
Фиг. 14 демонстрирует возможность и преимущества применения фосфорилгуанидиновых производных олигонуклеотидов в качестве праймеров в одношаговых системах ОТ-ПЦР На Фиг. представлен результат электрофоретического анализа (А) и кривые термической денатурации (Б) продуктов продуктов ОТ с последующей ПЦР с использованием пары стандартных праймеров (U0-V0) и пар фосфорилгуанидиновых производных (UH1-VH1; UH1-WH1), специфичными к последовательности U12 мяРНК человека в составе суммарной РНК клеток человека. М - маркер длин ДНК от 100 до 400 п.н., последовательности праймеров представлены на Фиг. 2, область подвижности неспецифических продуктов выделена пунктиром. Фиг. 15 иллюстрирует результат применения фосфорилгуанидиновых производных олигонуклеотидов в качестве праймеров в реакции амплификации по механизму катящегося кольца (RCA). На Фиг. представлен результат электрофоретического анализа (А) и коэффициенты амплификации продуктов реакции катящегося кольца с использованием стандартного праймера (DO) и фосфорилгуанидиновых производных (D2 и D3), специфичных к последовательности плазмиды pUCl9, последовательности праймеров представлены на Фиг. 2. «К-» соответствует результатам контрольной реакции без праймеров. М - контроль подвижности исходной плазмиды
Фиг. 16 демонстрирует повышение селективности выявления мутации с помощью фосфорилгуанидиновых производных олигонуклеотидов в качестве праймера в аллель- специфичной ПЦР На Фиг. представлено схематическое изображение эксперимента по выявлению однонуклеотидной мутации Т/С в составе гена KRAS в геномной ДНК методом аллель-специфичной ПЦР в присутствии пары стандартных праймеров S0+S и пары стандартного и фосфорилгуанидинового производного S1+S. Последовательности праймеров представлены на Фиг. 2. Рядом с обозначениями праймеров указано значение ACt.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Применение модифицированных олигонуклеотидов в ферментативных реакциях матричного синтеза нуклеиновых кислот может сопровождаться различными эффектами, влияющими на общий выход реакции. Большинство известных химических модификаций в составе олигонуклеотидных праймеров приводит к нарушению взаимодействия субстратов нуклеиновых кислот с ферментами. При этом никогда ранее не применяли полностью незаряженные производные олигонуклеотидов в качестве праймеров, поскольку было очевидно по литературным данным, что их углеводо-фосфатный остов не узнаётся ферментами [9].
Изобретение описывает возможности применения праймеров с фосфорилгуанидиновыми группировками в системах матричного ферментативного синтеза ДНК. Способ матричного ферментативного синтеза ДНК с использованием праймеров содержащих фосфор илгуанидиновые группировки [12-14] по сравнению с аналогами сочетает в себе ряд раскрываемых в данном изобретении преимуществ, комбинация которых обеспечивает достижение технического результата.
Общая структура праймера, содержащего фосфорилгуанидиновую группу (Z) представлена на Фиг. 1А, где каждый из заместителей Rl, R2, R3 и R4 может быть атомом водорода Н или опционально замещенным органическим радикалом. Каждый из заместителей Rl, R2, R3 и R4 независимо выбирается из группы, включающей Н, С 1 - 10 алкил, С2 10 алкенил, С2-10 алкинил, -С6-10 арил или -С5-10 гетероарил (например, Фиг. 1А, g”,g’); где каждый алкил, алкенил, алкинил, арил, гетероарил, алкилен или гетероалкилен может быть дополнительно замещён; где дополнительно R1 и R2, вместе с атомом, с которым они связаны, образуют 5-8-членный гетероцикл; В некоторых применениях R1 и R2 вместе с атомом, с которым они связаны, образуют 5-8-членный гетероцикл, предпочтительно пирролидин, пиперидин, пиперазин, морфолин, так как размеры таких заместителей не должны исключать взаимодействия ФГ -олигонуклеотидов с ферментом, необходимого для инициации реакции матричного синтеза. Предпочтительно, R1 и R2 вместе с атомом, с которым они связаны, образуют 5 -членный гетероцикл, например, пирролидин (Фиг. 1, g’”). В некоторых применениях R2 n R3 вместе образуют алкиленовую или гетероалкиленовую цепь длиной 2-4 атома, a R1 и R4 каждый независимо выбираются из группы, включающей Н и С1 4 алкил. В некоторых применениях R2 и R3 вместе составляют цепь СН2 СН2 , a R1 и R4 есть -Н или метил (например, Фиг. 1, g). Часть предпочтительных соединений, охватываемых настоящим изобретением, соответствуют формулам ФГ, несущих остаток гуанидина (g”), N,N,N’,N’- тетраметилгуанидина (g’), 1,3-диметилимидазолидин-2-имина (g), N,N’- бис(тетраметилен)гуанидина (g”’), приведённым на Фиг. 1Б.
Фиг. 1. Структура праймера и незаряженной фосфорилгуанидиной группы (Z) в общем виде (А); примеры использованных фосфорилгуанидиновых групп (Б), несущих остаток гуанидина (g”), К,К,й ,йГ-тетраметилгуанидина (g’), 1,3- диметилимидазолидин-2-имина (g), , ’-бис(тетраметилен)гуанидина (g’”).
Алгоритм конструирования ФГ-модифицированного праймера предполагает включение в олигонуклеотид хотя бы одной фосфорилгуанидиновой группировки и позволяет применять полностью незаряженные фосфорилгуанидиновые производные олигонуклеотидов в качестве праймеров (Фиг. 2). Вместе с тем, наличие фосфорилгуанидиновой группировки в составе праймера не исключает введения дополнительных функциональных групп, обеспечивающих дополнительные свойства праймеров и конечного продукта. Например, для дальнейшей детекции продуктов реакции матричного синтеза ДНК представлена возможность введения флуоресцентных и радиоактивной метки в ФГ-модифицированные праймеры.
Одним из ключевых свойств и критериев отбора (любых) модифицированных олигонуклеотидов для использования в качестве праймеров является их способность к формированию компетентного праймер-матричного комплекса для инициации реакции и способность выступать в качестве матрицы для синтеза 3’ -концевого района комплементарной цепи (когда матрицей выступает последовательность нуклеотидов исходного праймера). Замена отрицательно заряженных межзвенных фосфатных групп нейтральными группами, а также изменение объема заместителей при атоме фосфора должны влиять на способность олигонуклеотида взаимодействовать с ДНК- и РНК- матрицей и удлиняться ДНК- или РНК-зависимыми ДНК-полимеразами. Изобретение содержит описание примеров, демонстрирующих возможность олигонуклеотидов с фосфорилгуанидиновыми группировками как выступать в качестве праймеров, так и обеспечивать матричные свойства при элонгации комплементарной цепи. Различные приложения матричного синтеза ДНК, в частности, амплификация ДНК в молекулярной диагностике, биотехнологии и генетической инженерии предполагают использование широкого набора ДНК-полимераз. Показано, что фосфорилгуанидины выступают субстратами для широкого набора как мезофильных, так и термофильных ДНК -зависимых ДНК-полимераз вне зависимости от наличия 3 '— >5 '/5 '— >3 ' экзонуклеазной активности в условиях термоциклического и изотемпературного режима (Пример 2, 3, 4, 5, 6, 10, 13), а также РНК-зависимых ДНК-полимераз (Пример 11, 12). Представленное изобретение иллюстрирует возможность использования праймеров с фосфорилгуанидиновыми группировками при различных температурах (температурных протоколах) проведения полимеразных (ферментативных) реакций. Описанное свойство нового класса праймеров может быть применено при разработке систем синтеза и диагностики, основанных на разных протоколах выявления и количественного определения нуклеиновых кислот.
Наиболее востребованным представляется применение ФГ-модифицированных праймеров для амплификации ДНК в реакции ПЦР, а также РНК в реакции обратной транскрипции с последующей ПЦР. Результаты, полученные с использованием праймеров с заранее подобранным числом и положением фосфорилгуанидиновых группировок, демонстрируют повышенную специфичность и чувствительность за счет снижения выхода неспецифичных продуктов реакции. Ключевым признаком, обеспечивающим повышение качества результатов качественного и количественного определения нуклеиновых кислот методом ПЦР и ОТ-ПЦР с праймерами, содержащими фосфор илгуанидиновые группировки, является снижение выхода коротких неспецифических продуктов, зачастую классифицируемых как «праймер-димеры». (Пример 8, 10, 12). Описанное свойство позволит снижать уровень чувствительности и достоверность количественного определения нуклеиновых кислот. Снижение выхода побочных продуктов может также достигаться сочетанием использования праймеров с фосфорилгуанидиновыми группировками с уже известными решениями, направленными на модификацию других компонентов реакционной смеси, например, технологий «горячего старта». При использовании в ПЦР фосфорилгуанидины способны изменять коэффициент амплификации. В зависимости от положения, количества и частоты ФГ- модифицированных мономеров эффективность амплификации может быть сравнима со стандартной реакцией с немодифицированными праймерами, так и значительно снижена вплоть до полного исключения амплификации.. Влияние на эффективность амплификации может быть обусловлена участием модифицированных мономеров на двух основных стадиях - инициации реакции полимеризации и элонгации комплементарной цепи, когда последовательность нуклеотидов праймера выступает матрицей. При подборе положения и числа модифицированных мономеров, позволяющих лишь незначительно (в пределах 10- 15 %) снижать эффективность амплификации,, использование праймеров с фосфорилгуанидиновыми группировками не потребует изменения протокола амплификации, в частности ПЦР и ОТ-ПЦР, при переходе от стандартных (немодифицированных) праймеров для решения частных задач. Кроме того, в примерах продемонстрирована возможность одновременного использования в ферментативных реакциях ФГ-модифицированных и стандартных праймеров (Фиг. 10, Пример 8). Показано также, что матричный ферментативный синтез с применением праймеров, содержащие фосфорилгуанидиновые группировки, может быть успешно реализован в протоколах изотермической амплификации ДНК по механизму «катящегося кольца». Применение ФГ- модифицированных праймеров в аллель-специфичной ПЦР позволяет увеличить достоверность выявления однонуклеотидных мутаций в геноме.
С помощью секвенирования по методу Сэнгера было показано, что наличие фосфорилгуанидиновых группировок не вызывает образования мутаций, обусловленных взаимодействием фермента с модифицированными мономерами. Данное свойство обеспечивает применимость ФГ-модифицированных праймеров для решения исследовательских и прикладных задач, связанных с амплификацией нуклеиновых кислот, конструированием заранее заданных последовательностей и определением их первичной структуры.
Контроль синтеза 3’ -концевого района одной из цепей, в частности формирование «липких» концов представляется интересным для решения ряда генно-инженерных задач по конструированию искусственных ДНК-молекул с заданной последовательностью нуклеотидов. Например, продукты ПЦР с «липкими» концами могут быть использованы при конструировании экспрессирующих плазмидных ДНК-векторов. В представленном изобретении показана возможность как получения, полноразмерной комплементарной цепи, так и предотвращения синтеза части 3’ -концевых звеньев.
Важным параметром при выборе компонентов систем амплификации является возможность проведения реакции при использовании в качестве матрицы различных объектов, например, синтетических нуклеиновых кислот, плазмидных ДНК, суммарной РНК и геномной ДНК клеток и тканей, вирусных нуклеиновых кислот, а также цельных физиологических жидкостей (например, крови и плазмы крови), востребованных в диагностике заболеваний человека и животных. В примерах, описывающих данное изобретение, представлено успешное использование ФГ-модифицированных праймеров с разными вариантами матриц, что обеспечивает возможности широкого внедрения полученного технического результата.
Зачастую, в лабораторную практику для решения рутинных задач входят коммерчески доступные готовые реакционные смеси, кроме того сложные поэтапные манипуляции обычно реализуют с помощью наборов реагентов, содержащих необходимые компоненты и инструкции для проведения эксперимента и достижения научного или диагностического результата. В своих применениях способ матричного ферментативного синтеза ДНК с помощью праймеров с фосфорилгуанидиновыми группировками может быть реализован с применением готовых реакционных смесей и наборов реагентов или реакционных смесей для детекции и амплификации нуклеиновых кислот, востребованных для решения как исследовательских, так и диагностических задач. Более того стадии амплификации нуклеиновых кислот с применением фосфорилгуанидиновых производных олигонуклеотидов могут стать частью более сложных протоколов и наборов реагентов для их проведения, например, подготовки ДНК-библиотек для дифференциального анализа экспрессии генов с применением высокопроизводительных методов. Применение предложенного способа может не только улучшить результат конкретной стадии матричного синтеза ДНК, но и в отдельных применениях позволит исключить стадии, например, промежуточной очистки от неспецифичных побочных продуктов.
Изобретение подробнее проиллюстрировано ниже следующими примерами конкретного выполнения, которые не ограничивают объем изобретения. Многочисленные варианты осуществления изобретения в объеме формулы изобретения, которые вытекают из примеров, должны быть очевидны специалистам в данной области техники на основе вышеприведенного описания и последующих примеров. Пригодность конкретной группы, их комбинации и положение в составе олигонуклеотидов, используемых в качестве праймеров в реакциях матричного синтеза ДНК, определяют эмпирически самостоятельно специалистом в данной области техники.
Пример. 1 (описание используемых ниже систем)
ФГ -олигонуклеотиды и немодифицированные олигодезоксирибонуклеотиды представлены на Фиг. 2. Олигонуклеотиды содержали от 8 до 40 нуклеотидных звеньев. Фосфорилгуанидиновые группы (ФГ) представлены в виде немодифицированного (g”), разветвленного (g’), замкнутого (g) остатка и гуанидинового остатка с объемными заместителями (g’”) (Фиг. 1Б). Количество ФГ в составе олигонуклеотидов варьировали от одной группы до 100 % (Фиг. 2).
ФГ-олигонуклеотиды выступали в качестве олигонуклеотидов-праймеров (Фиг. ЗА) или матриц (Фиг. ЗБ), содержали флуоресцентную (* - FAM или TAMRA) или радиоактивную метку ([32Р]).
В качестве матриц использовали нативные и ФГ-олигонуклеотиды (Фиг. 2), плазмидную ДНК, содержащую ген eGFP; препараты цельной крови и плазмы крови человека, содержащие предварительно добавленную плазмидную ДНК; РНК вируса гепатита С (ВГС); суммарную РНК клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7; плазмиду pUCl9; геномную ДНК-человека.
В качестве ДНК-полимераз использовали мезофильные и термофильные ферменты с и без 3 '— >5 '/5 '— >3 ' экзонуклеазной активности: Taq ДНК-полимеразу, ДНК-полимеразу фага Т5, ДНК полимераза I Е. coli (Фрагмент Кленова), Pfu ДНК-полимеразу, РНК- зависимые ДНК-полимеразы (ревертазы) MMLV и HIV-рбб; ДНК полимеразу phi29.
Пример. 2 (ФГ-олигонуклеотид как праймер в реакции, катализируемой термостабильной полимеразой, в термоциклическом (1) и изотермическом (2) режимах)
(1) Для демонстрации применения ФГ-олигонуклеотидов как праймеров (система представлена на Фиг. ЗА) реакционные смеси (10 мкл) содержали: нативный олигонуклеотид Мзо (10 мкМ); немодифицированный олигонуклеотид Z0 либо ФГ- олигонуклеотид Zl-^ZHl (10 мкМ, последовательности праймеров Z0 - ZF представлены на Фиг. 2); набор трифосфатов (по 0,1 мМ каждый) dATP, dCTP, dGTP и флуоресцентно- меченный dUTP (ф луоресцеин-6-аминотиокарбонил- [5-(3 -аминоаллил)-2 '-д езоксиуридин- 5'-трифосфат]); 1,8 мМ MgCl2, Трис-НС1 (10 мМ) pH 8,8, КС1 (50 мМ); 0,1 % Tween-20, Taq ДНК-полимеразу (2 ед.акт.). Реакцию проводили в термоциклическом режиме: 95 °С - 10 с, 61 °С - 10 с, 72 °С - 30 с (32 цикла). Через 25 минут реакцию останавливали добавлением 2% раствора перхлората лития в ацетоне. Все образцы разделяли с помощью электрофоретического анализа в 20% денатурирующем полиакриламидном геле, результат электрофоретического анализа фиксировали флуоресцентным сканером (Фиг. 4А). Эффективность удлинения ФГ-олигонуклеотидов на матрице ДНК (дорожки Zl - ZF на Фиг. 4А) сравнивали с таковой для нативного олигонуклеотида Z0 (дорожка Z0 на Фиг. 4А).
(2) Для демонстрации применения ФГ-олигонуклеотидов как праймеров (система представлена на Фиг. ЗА) реакционные смеси (10 мкл) содержали: нативный олигонуклеотид М40 (30 мкМ), радиоактивномеченный олигонуклеотид Т(НТЗ (10 мкМ, последовательности праймеров ТО - ТЗ представлены на Фиг. 2); набор трифосфатов (по 0,2 мМ каждый), 1,8 мМ MgCh, Трис-НС1 (10 мМ) pH 8,8, КС1 (50 мМ); 0,1 % Tween-20, Taq ДНК- полимеразу (1 ед.акт.). Реакцию проводили в изотермическом режиме (Фиг. 4Б) течение 20-120 минут при 37 °С и останавливали добавлением 2% раствора перхлората лития в ацетоне. Все образцы разделяли с помощью электрофоретического анализа в 15% денатурирующем полиакриламидном геле. Степень накопления полноразмерного продукта реакции рассчитывали как отношение интенсивности в полосе, соответствующей продукту реакции, к суммарной интенсивности всех полос в дорожке. Относительная погрешность определения во всех экспериментах не превышала 15% (Фиг. 4Б).
Видно (Фиг. 4А), что ФГ-олигонуклеотиды способны выступать в качестве праймеров в присутствии термостабильной Taq ДНК-полимеразы и в условиях термоциклического режима температур достраиваться до полноразмерного продукта, как и нативный олигонуклеотидный праймер Z0. Снижение эффективности удлинения наблюдается для олигонуклеотида Zl,2, содержащего вблизи 3 '-конца две подряд ФГ. В изотермических условиях (Фиг. 4Б) наблюдался аналогичный результат: степень накопления полноразмерного продукта реакции для олигонуклеотидов Т1 и Т2 близка к таковому для ТО. Снижение степени накопления полноразмерного продукта реакции наблюдается для олигонуклеотида ТЗ, содержащего ФГ вблизи 3 '-конца.
Пример. 3 (ФГ-олигонуклеотид как праймер в реакции, катализируемой мезофильной полимеразой)
Для демонстрации применения ФГ -олигонуклеотидов как праймеров (система представлена на Фиг. ЗА) реакционные смеси (5 мкл) содержали: нативный олигонуклеотид М40 (30 мкМ), радиоактивномеченный олигонуклеотид T0-KG3 (10 мкМ, последовательности праймеров ТО - ТЗ представлены на Фиг. 2); набор трифосфатов (по 0,2 мМ каждый), MgCh (20 мМ), Трис-НС1 (50 мМ) pH 8,0, NaCl (100 мкМ), ДТТ (5 мМ), 0, 1 мг/мл БСА; ДНК-полимеразу фага Т5 (500 мкМ). Реакцию проводили в течение 6-60 минут и останавливали добавлением раствора для нанесения проб при электрофорезе, содержащего 7 мМ ЭДТА. Все образцы разделяли и анализировали аналогично примеру 2 (2). Относительная погрешность определения во всех экспериментах не превышала 15% (Фиг. 5).
Видно (Фиг. 5), что все ФГ-олигонуклеотиды способны выступать в качестве праймеров в присутствии мезофильной ДНК-полимеразы фага Т5 в условиях изотермического режима, хотя эффективность достраивания ФГ- олигонуклеотидов до полноразмерного продукта меньше, чем в случае нативного олигонуклеотида ТО.
Пример. 4 (ФГ-олигонуклеотид как матрица в реакции, катализируемой термостабильной полимеразой)
Для демонстрации применения ФГ-олигонуклеотидов как матриц (система представлена на Фиг. ЗБ) реакционные смеси (10 мкл) содержали: немодифицированный олигонуклеотид Z0 либо ФГ-олигонуклеотид Zl-^ZF (10 мкМ, последовательности праймеров Z0 ч- ZF представлены на Фиг. 2), флуоресцентно-меченный нативный праймер FAM-Ns (10 мкМ, последовательность представлена на Фиг. 2), полный набор трифосфатов dNTP (10 мМ), Taq ДНК- полимеразу (2 ед.акт.), 1,8 мМ MgCl2, Трис-НС1 (10 мМ) pH 8,8, КС1 (50 мМ); 0, 1 % Tween-20. Реакцию проводили в термоциклическом режиме: 95 °С - 10 с, 61 °С - 10 с, 72 °С - 30 с (32 цикла). Реакцию останавливали и анализировали аналогично примеру 2(1).
Видно (Фиг. 6), что все ФГ-олигонуклеотиды способны выступать в качестве матриц в присутствии термостабильной Taq ДНК-полимеразы в условиях термоциклического режима. Эффективность достраивания нативного олигонуклеотида до полноразмерного продукта увеличивается при удалении ФГЗ от 3 '-конца ФГ-олигонуклеотида. Максимальное влияние на выход полноразмерного продукта оказывает ФГ- олигонуклеотид, содержащий подряд (ZH1) и чередующиеся модифицированные ФГ (ZH2, ZF).
Пример. 5 (ФГ-олигонуклеотиды как матрица в реакции, катализируемой мезофильной полимеразой)
Для демонстрации применения ФГ-олигонуклеотидов как матриц (система представлена на Фиг. ЗБ) реакционные смеси (10 мкл) содержали: 10 мкМ немодифицированный олигонуклеотид Z0 либо ФГ-олигонуклеотид Zl-^ZF (последовательности праймеров Z0 - ZF представлены на Фиг. 2), 10 мкМ TAMRA- меченный нативный праймер *Ns (Фиг. 2), полный набор трифосфатов dNTP (10 мМ), Фрагмент Кленова (2 ед.акт.), Трис-НС1 (50 мМ), pH 7,6, MgCh (10 мМ), ДТТ (5 мМ). Реакцию проводили 30 минут в изотемпературном режиме при 37 °С. Реакцию останавливали и анализировали аналогично примеру 2.
Было получено (Фиг. 7), что все ФГ- олигонуклеотиды способны выступать в качестве матриц в присутствии мезофильной полимеразы - Фрагмента Кленова, в условиях изотемпературного режима. Эффективность достраивания нативного олигонуклеотидов до полноразмерного продукта увеличивается при удалении ФГЗ от 3 '-конца нативного олигонуклеотида. Максимальное влияние на выход полноразмерного продукта оказывает ФГ-олигонуклеотид ZH1, содержащий подряд фосфорилгуанидиновые группы.
Пример. 6 (эффективность ПЦР с использованием ФГ-олигодезоксирибонуклеотидов в качестве праймеров)
Амплификацию фрагмента гена eGFP проводили в реакционном буфере, содержащем 50 мМ Трис-НС1, pH 8,5, 50 мМ КС1, 0,2 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 2 мМ MgCh, 0,03 ед.акт./мкл Taq ДНК-полимеразы.
Режим амплификации 95°С 5 мин, 47 циклов: 95 °С - 10 с, 61 °С - 10 с, 72°С - 10 с.
В качестве матрицы использовали последовательное 10-кратное разведение плазмидной ДНК, содержащей ген eGFP, от 10 9 г до 10 17 г.
В качестве праймеров использовали пары, представленные на Фиг. 8, (прямой + обратный), на основе стандартных нативных олигонуклеотидов и ФГ- олигонуклеотидов. ФГ-олигонуклеотиды отличались по количеству и расположению фосфорилгуанидиновых звеньев в олигонуклеотидной цепи. Последовательности олигонуклеотидов представлены на Фиг. 2. Концентрация каждого праймера составляла 500 нМ.
Эффективность амплификации определяли методом ПНР в режиме реального времени в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I на приборе LightCycler 96 (Roche, Швейцария).
Сравнение эффективности амплификации проводили по значениям коэффициентов амплификации (keff), используя подход линеаризующих координат зависимости Ct(lg Со) (где Ct - пороговый цикл, Со - исходная концентрация матрицы), реализованный в программе LightCycler 96 Software версии 1.1.0.1320. Значения коэффициентов амплификации представлены на Фиг. 8 (приведены значения коэффициентов эффективности ПНР, полученных по результатам трех или более независимых экспериментов; SD - стандартное отклонение). Видно, что единичные ФГ в структуре праймера (см. праймеры Z1-^Z9) несущественно влияют на эффективность амплификации. Влияние фосфорилгуанидиновых групп определяется их положением в цепи праймера- затравки. Подряд-расположенные ФГ (праймер ZH1) значительно уменьшают keff до 1,44. Введение модификаций в положения «через один» (чередующиеся модифицированные фосфорилгуанидиновые звенья) обеспечивает накопление полноразмерного продукта.
Пример. 7 (определение длины растущей цепи ДНК)
Амплификацию фрагмента гена eGFP проводили в реакционном буфере как описано ранее в примере 6.
Режим амплификации 95°С 5 мин, 28 циклов: 95 °С - 10 с, 61 °С - 10 с, 72 °С - 10 с.
В качестве матрицы использовали плазмидную ДНК, содержащую ген eGFP, в количестве Ю 10 г на реакцию.
В качестве праймеров использовали пары (*Q0 - Z0), (*Q0 - ZH1), (*Q0 - ZH2), где * - флуоресцентная метка FAM. Последовательности ФГ-олигонуклеотидов представлены на Фиг. 2. Концентрация каждого праймера составляла 500 нМ.
Определение точной длины продуктов ПНР с использованием фрагментного анализа проводили на автоматическом капиллярном анализаторе. Из представленных на Фиг. 9 данных видно, что применение олигонуклеотидов Z0 и ZH2 позволяет получать полноразмерные ПЦР-продукты длиной 228 п.н. В то время как использование олигонуклеотида ZH1 приводит к терминации синтеза комплементарной цепи за 8 нуклеотидов до 5 '-конца, что, очевидно, приводит к формированию ДНК-молекул с «липкими» концами.
Пример. 8 (сравнение накопления специфичных и неспецифичных продуктов ПЦР, катализируемой 7а</-ДНК полимеразой при использовании стандартных и ФГ- модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов в качестве праймеров)
Амплификацию фрагмента гена eGFP проводили в реакционном буфере как описано ранее в примере 6.
Режим амплификации описан ранее в примере 7.
Используемая матрица описана ранее в примере 6.
В качестве праймеров (прямой - обратный) использовали пары из стандартных нативных олигонуклеотидов (Q0 - Z0,) модифицированных ФГ-олигонуклеотидов (QH2 - ZH2), стандартного и модифицированного олигонуклеотидов (QH2 - Z0), а также смесь трех олигонуклеотидов (Z0 QH2/Q0, последние в соотношении 50/50 %).
Последовательности олигонуклеотидов представлены на Фиг. 2. Концентрация праймеров составляла 500 нМ.
Анализ продуктов ПЦР проводили методом электрофореза в агарозном геле (Фиг. 10А и Б, М - маркер длин ДНК от 100 до 400 п.н.) и методом термической денатурации продуктов ПЦР на приборе iQ5 (Bio-Rad, США) в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I (Фиг. 10В).
Видно (Фиг. 10А и В), что применение пары модифицированных ФГ- олигонуклеотидов (QH2 - ZH2) увеличивает достоверность и позволяет значительно уменьшить образование неспецифических продуктов, по сравнению с использованием как нативных олигонуклеотидов (Q0 - Z0), так и смесей из нативного и модифицированного олигонуклеотидов (QH2 - Z0) и (Z0 - QH2/Q0).
Полное отсутствие неспецифических продуктов было достигнуто при использовании ПЦР-систем с отложенным «горячим» стартом на модифицированных ФГ - олигонуклеотидных праймерах, по сравнению с нативными праймерами (Фиг. 10Б).
Пример. 9 (анализ мутаций в растущей цепи ДНК)
Амплификацию фрагмента гена eGFP проводили в реакционном буфере как описано ранее в примере 6.
Режим амплификации описан ранее в примере 7.
Используемая матрица описана ранее в примере 6.
В качестве праймеров (прямой - обратный) использовали пары (Q0 - Z0), (Q0 - ZH1), (QH2 - ZH2). Последовательности олигонуклеотидов представлены на Фиг. 2.
По завершении амплификации осуществляли очистку продуктов ПЦР и их секвенирование по Сэнгеру по стандартной методике с применением флуоресцентно меченых терминаторов BigDye 3.1. При секвенировании использовали нативные олигонуклеотидные праймеры Q0 и Z0. На Фиг. 11 представлены результаты секвенирования ДНК-продуктов по Сэнгеру после амплификации в присутствии пар праймеров, приведенных по центру с помощью нативных олигонуклеотидных праймеров Q0 (колонка справа) и Z0 (колонка слева). Рамкой выделена область исходных праймеров.
Видно (Фиг. 11), что нуклеотидный состав растущей цепи ДНК в присутствии пар нативных праймеров соответствует составу в присутствии пар, один или оба из которых содержит ФГ. Наличие ФГ в исходном праймере не вызывает появления мутаций в растущей цепи ДНК при построении комплементарной цепи в области праймера. В то же время наличие ФГ подряд в соседних положениях терминирует удлинение растущей цепи на модифицированной матрице и позволяет контролировать длину конечного продукта, формируя одноцепочечные «липкие концы», как и описано в примере 7.
Пример. 10 (использование ФГ-олигонуклеотидов как праймеров для ДНК- полимераз, используемым в коммерческих ПЦР-системах) Для демонстрации использования ФГ- олигонуклеотидов как праймеров были выбраны три коммерческие системы. Система I содержала ДНК-полимеразу Pfu (ЗАО «Силекс», Россия); система II - смесь Taq и Pfu полимераз для проведения ПЦР длинных фрагментов (ПЦР типа“Long Range”) (ООО «Биолабмикс», Россия); система III - для проведения ПЦР на цельной крови «InBlood PCR kit» (ЗАО «Евроген», Россия) с полимеразой“InBlood” (ЗАО «Евроген», Россия).
Для систем I и II в качестве матрицы использовали 1 нг плазмидной ДНК, содержащей ген eGFP, амплификацию проводили в режиме: предварительная денатурация 95 °С - 5 мин, 32 цикла: 9 °С - 10 с, 61 °С - 10 с, 72 °С.
Для системы III в качестве матрицы использовали препараты цельной крови и плазмы крови человека, содержащие предварительно добавленные 0,2 нг плазмидной ДНК на 1 мкл физиологической жидкости, в отношении 2% (только для плазмы крови), 5%, 10%, 20%, 25% от общего объема реакционной смеси в 25 мкл. Амплификацию проводили в режиме 95 °С - 5 мин, 26 циклов: 95 °С - 10 с, 61 °С - 10 с, 72 °С - 10 с.
В качестве пар праймеров использовали (Q0 - Z0), (Q0 - ZH2), (QH2 - Z0) , (QH2 - ZH2). Последовательности олигонуклеотидов представлены на Фиг. 2.
Результаты анализа продуктов ПЦР методом электрофореза в агарозном геле представлены на Фиг. 12 (где М - маркер длин ДНК от 100 до 500 п.н.). Видно (Фиг. 12 А и Б), что при использовании ФГ -олигонуклеотидов как праймеров в присутствии различных коммерческих полимераз и буферных смесей специфично образуется продукт ПЦР заданной длины. ФГ-олигонуклеотиды пригодны для проведения ПЦР в физиологических жидкостях. Представленные результаты позволяют сделать вывод о возможности эффективного применения ФГ-модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов в качестве праймеров-затравок в ПЦР, катализируемых различными ДНК-полимеразами, используемыми в коммерческих ПЦР-системах.
Пример. 11 (ФГ-олигонуклеотиды как праймеры для РНК-зависимых ДНК- полимераз (ревертаз))
В данном примере продемонстрирована возможность использования ФГ- олигонуклеотидов Р7 - Р24, меченных флуоресцеином, как праймеров при выявлении РНК вируса гепатита С (ВГС) по сравнению с нативным олигонуклеотидом Р0. Последовательности олигонуклеотидов представлены на Фиг. 2. Модифицированные ФГ- праймеры содержали от 7 (со стороны 5 '-конца олигонуклеотидов) до 21 ФГ подряд. В качестве исходного материала для анализа использовали свежую сыворотку крови ВГС-инфицированных доноров. РНК ВГС выделяли с использованием набора «РеалБест» Экстракция 100 (Вектор-Бест) и вносили ее в рамках описанной процедуры в реакцию ОТ- ПЦР, используя на этапе обратной транскрипции либо нативный олигонуклеотид Р0, либо ФГ-олигонуклеотиды Р7 - Р21 и ревертазу (MMLV или HIV-рбб). Реакцию обратной транскрипции (50 мкл) проводили в смеси следующего состава: ФГ-олигонуклеотиды (0,5 мкМ), MgCk (3 мМ), Трис-НС1 (50 мМ) pH 8,0, (NH4)2S04 (10 мМ), КС1 (30 мМ), 0,01% Tween-20, набор трифосфатов dNTP (по 0,4 мМ каждый), БСА 100 мкг/мл, MMLV или HIV- рбб (10 ед.акт.). Реакцию обратной транскрипции проводили не менее чем в двух повторах в температурном режиме: 45 °С - 30 мин, 95 °С - 3 мин.
Далее полученную кДНК использовали для ПЦР ВГС-специфичного фрагмента. ПЦР проводили в смеси следующего состава: праймеры CTCCCGGGAGAGCCATAG и TCCAAGAAAGGACCCGGTC (по 0,5 мкМ каждый), буфер (MgCh (3 мМ), Tpnc-S04 (50 мМ) pH 8,0, (NH4)2S04 (10 мМ), КС1 (30 мМ), 0,01% Tween-20), Taq ДНК-полимеразу (1 ед.акт.), зонд флуоресцентно меченный гидролизующийся зонд зонд 5'-ROX- TCTGCGGAACCGGTGAGTACACCG-(BHQ2) (0,25 мкМ), SYBR Green I (в разведении 1/10000)_или SYTO-13 (в разведении 1/2500). Амплификацию осуществляли в режиме 50 °С - 2 мин, 49 циклов: 94 °С - 10 с, 60 °С - 20 с, 5 °С - 5 с, 95 °С - 1 мин. Процесс выявления ВГС с использованием прибора CFX96 (BioRad, США) и набора РеалБест РНК ВГС осуществляли в режиме реального времени по двум каналам: ROX-специфическая детекция флуоресцентно меченного гидролизующегося зонда и FAM-неспецифическая детекция дцДНК с помощью красителя SYBR Green I (Фиг. 13, обычное начертание) или SYTO-13 (Фиг. 13, выделено полужирным и цветом). В результате амплификации нарабатывали фрагмент ДНК длиной 79 и. и., имеющий в буферных условиях для ТЩР температуру плавления 86-88 °С.
Сравнение субстратных свойств ФГ-олигонуклеотидов и нативного олигонуклеотида как праймеров затравок проводили с помощью определения значения порогового цикла реакции - Ct (cycle threshold), представленного на Фиг. 13. Значение Ct рассчитывали как описано ранее в примере 6. Видно, что ФГ-олигонуклеотиды могут выступать как праймеры-затравки при получении кДНК на матрице анализируемой РНК с помощью РНК -зависимых ДНК-полимераз (ревертаз MMLV и HIV-рбб).
Пример 12 (ФГ-олигонуклеотиды как праймеры для ДНК-полимераз в одношаговых системах ОТ-ПЦР) В системе для одношаговой ОТ-ПЦР «БиоМастер ОТ-ПЦР SYBR Blue (2х)» (ООО «Биолабмикс»), содержащей ревертазу MMLV и термостабильную ДНК-зависимую Taq ДНК-полимеразу, использовали специфичные к последовательности U12 мяРНК человека праймеры.
В качестве праймеров использовали нативные олигонуклеотиды (U0, V0) и ФГ- олигонуклеотиды (UH1, VH1, WH1) Последовательности олигонуклеотидов представлены на Фиг. 2. Концентрация каждого праймера составляла 480-700 нМ.
ОТ-ПЦР проводили на препарате суммарной РНК клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 в диапазоне концентрации от 6 нг/мкл до 8 пг/мкл.
Реакцию ревертирования проводили при 45 °С - 45 мин
Режим амплификации 95 °С 5 мин, 48 циклов: 95 °С - 10 с, 60 °С - 10 с, 72 °С - 10 с.
Анализ продуктов ОТ-ПЦР проводили методами термической денатурации и горизонтального гель-электрофореза в 1,5% геле с последующей визуализацией нуклеотидного материала бромистым этидием (Фиг. 14 А, где маркер длин ДНК от 100 до 400 и. и.). Для анализируемых пар праймеров определяли кажущиеся коэффициенты эффективности: 1,7 для пары (U0 - V0), 1,63 для (UH1 - VH1) и 1,56 для (UH1 - WH1).
Видно (Фиг. 14Б), что при использовании ФГ-модифицированных праймеров в значительно меньшей степени происходит образование неспецифических продуктов амплификации с пониженной температурой плавления. Полученные результаты демонстрируют принципиальную возможность использования ФГ-олигонуклеотидов в качестве праймеров в одношаговых системах для ОТ-ПЦР, т.е. ФГ-модифицированные праймеры способны выполнять роль затравок на стадии ОТ (катализируемой РНК- зависимой ДНК-полимеразой), а затем на стадии амплификации (катализируемой ДНК- зависимой ДНК-полимеразой).
Пример 13 (ФГ-олигонуклеотиды как праймеры в реакции амплификации по механизму катящегося кольца (RCA))
В данном примере продемонстрировано сравнение эффективности реакции амплификации ДНК по механизму катящегося кольца (RCA) при использовании ФГ- олигонуклеотидов и нативного олигонуклеотида.
Амплификацию ДНК плазмиды pUCl9 (0,2 иг) проводили в реакционном буфере, содержащем Tris-HCl (50 мМ) pH 7.5, MgCh (10 мМ), (NH4)2S04 (10 мМ), ДТТ (4 мМ), в присутствии набора дезоксинуклеозидтрифосфатов (по 0,2 мМ каждый), БСА (200 нг/мкл), интеркалирующего красителя SYBR Green I, ДНК-полимеразы рЫ29 (0,5 ед.акт./мкл), 1мкМ одного из праймеров. Режим амплификации 14 часов при 30°С.
В качестве праймеров использовали ФГ- олигонуклеотиды D2 и D3 и нативный олигонуклеотид D0. Последовательности олигонуклеотидов представлены на Фиг. 2. Модифицированные ФГ-праймеры содержали 2 и до 3 ФГ подряд со стороны 3 '-конца олигонуклеотида .
Анализ продуктов амплификации проводили агарозным гель-электрофорезом в 0,8% агарозе, используя в качестве маркера (М) 200 иг плазмиды pUCl9. Результаты анализа представлены на Фиг. 15 А, «К-» соответствует результатам контрольной реакции без праймеров. Видно (Фиг. 15 А), что в случае ФГ-олигонуклеотидов наблюдается накопление продукта амплификации. Одновременно продукт амплификации (для каждого праймера D2, D3 и D0) разводили в ЗхЮ 6 раз и использовали по 50 мкл полученного раствора для оценки коэффициента амплификации методом ПЦР в девять повторениях в режиме реального времени в присутствии флуоресцентно меченного гидролизующегося зонда на участок pUC9 длиной 105 нуклеотидов. Далее рассчитывали среднее значение порогового цикла реакции (Ct) и разницу (ACt) между Ct конкретного праймера и разведения исходной матрицы, соответствующим начальным условиям реакции амплификации (амплификации ДНК плазмиды pUCl9 в количестве 0,2 иг).
Полученное значение ACt использовали для расчёта коэффициента амплификации RCA с допущением, что эффективность начальных условий составляет 1 (Фиг. 11 Б). При сравнении данных, представленных в Таблице, видно, что коэффициент амплификации при использовании ФГ-олигонуклеотидов D2 и D3 выше, чем у исходного нативного праймера D0, аименно, 247,3 и 29,9, соответсвенно, по сравнению с 9,4.
Пример 14 (повышение селективности выявления мутации с помощью ФГ- олигонуклеотида как праймера аллель-специфичной ПЦР)
Амплификацию матрицы проводили в буфере, содержащем Трис-НС1 (65 мМ) pH 8,9; (NH4)2S04 (24 мМ); MgS04 (3 мМ), 0,05% Tween-20, набора дезоксинуклеозидтрифосфатов (по 0,2 мМ каждого), Taq ДНК-полимеразы (0,03 ед.акт./мкл), флуоресцентно меченный гидролизующийся зонд 5’-НЕХ- CTGTATCGTCAAGGCACTCTTGC-BHQ2-3’ (100 нМ).
Режим амплификации: 95°С 3 мин, 50 циклов: 95 °С - 10 с, 60 °С - 40 с.
В качестве матриц использовали 2 иг геномной ДНК человека, выделенной из гистологического блока с тканью колоректального рака, без или с добавлением контрольной плазмиды, содержащей мутацию c.38G>A (G13D) в фрагменте гена KRAS (GACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTG(G/A)CGTAGGCAAGAGTGCCTT GACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATG), в количестве 1,1% относительно общего количества фрагмента гена KRAS в геномной ДНК.
В качестве праймеров использовали пары олигонуклеотидов (прямой + обратный): S0+S и S1+S, где S и S0 нативные олигонуклеотиды, S1 - ФГ-олигонуклеотид. Каждый праймер вносили в реакционную смесь в концентрации 300 нМ. Структуры праймеров представлены на Фиг. 2. Схематическое изображение выявления однонуклеотидной мутации Т/С в составе матрицы методом аллель-специфичной ПЦР в присутствии пар праймеров S0+S и S1+S представлено на Фиг. 16.
Селективность выявления мутации определяли методом ПЦР в режиме реального времени на приборе LightCycler 96 (Roche, Швейцария).
Для каждой пары праймеров рассчитывали среднее значение порогового цикла реакции (Ct) и разницу (ACt) между образцом, содержащим 1,1% мутации и образцом без мутации. Было получено, что ACt пары (S1+S) составляет 9,27, в то время как (S0+S) 4,42 (Фиг. 16, значение ACt указано рядом с обозначениями соответствующих праймеров). Таким образом, можно заключить, что селективность пары, содержащей ФГ- олигонуклеотид, выше, чем пары на основе нативных олигонуклеотидов.
Список цитированной литературы Saiki R.K., Scharf S., Faloona F., Mullis K.B., Horn G.T., Erlich H.A., Amheim N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia // Science. - 1985. - V. 230. - P. 1350-1354.
Mullis K.B., Faloona F.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction // Methods Enzymol. - 1987. - V. 155. - P. 335-350.
Ballantyne K.N., van Oorschot R.A., Mitchell R.J. Locked nucleic acids in PCR primers increase sensitivity and performance // Genomics. - 2008. - V. 91. - P. 301-305.
Brent C. Satterfield cooperative primers : 2.5 million-fold improvement in the reduction of nonspecific amplification // J. Mol. Diagn. - 2014. - V. 16. - P. 163-173.
Bodepudi V., Schoenbrunner N.J., Will S. Methods and reagents for reducing non-specific amplification // WO 2013091835 Al, 27 June 2013.
Schneider U.V., Mikkelsen N.D., Lindqvist A., Okkels L.M., Johnk N., Lisby G. Improved efficiency and robustness in qPCR and multiplex end-point PCR by twisted intercalating nucleic acid modified primers // PLoS One. - 2012. - V. 7. - e3845l.
Wanli Bi. Nucleic acid amplification using a reversibly modified oligonucleotide // US 8,334,099 B2. 18 December 2012.
Lebedev A.V., Paul N., Yee J., Timoshchuk V.A., Shum J., Miyagi K., Kellum J., Hogrefe R.I., Zon G. Hot start PCR with heat-activatable primers: a novel approach for improved PCR performance // Nucleic Acids Res. - 2008. - V. 36. - el3 l.
Summerton J., Stein D., Huang S.B., Matthews P., Weller D., Partridge M. Morpholino and phosphorothioate antisense oligomers compared in cell-free and in-cell systems // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. - 1997. - V. 7. - P. 63-70.
Chan H.W.-H., Yang Y.-S., Chen W.-Y. Partially neutral single- stranded oligonucleotide // US 20170015699 Al, January 2017.
Robinson P.S., Holme J., Jain N. Polymerase chain reaction detection system using oligonucleotides comprising a phosphorothioate group // WO2013140107 Al, 26 September 2013.
Stetsenko D., Kupryushkin M., Pyshnyi D. Modified oligonucleotides and methods for their synthesis // WO 2016028187 Al, publication date 25 February 2016.
Купрюшкин M.C., Пышный Д.В., Стеценко Д.А.. Фосфорилгуанидины. Новый класс аналогов нуклеиновых кислот // Acta naturae. - 2014. - Т. 6. - N° 4 (23). - С. 53-55. Kuznetsov N.A., Kupryushkin M.S., Abramova T.V., Kuznetsova A. A., Miroshnikova A.D., Stetsenko D.A., Pyshnyi D.V, Fedorova O.S. New Oligonucleotide Derivatives as Unreactive Substrate Analogues and Potential Inhibitors of Human Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease APE1 // Molecular BioSystems. - 2016. - V. 12. -N 1. - P. 67-75.

Claims

Формула изобретения
1. Способ матричного ферментативного синтеза ДНК, отличающийся тем, что для инициации реакции используют праймер, содержащий от по крайней мере одну межзвенную фосфор илгуанидиновую группу, соответствующую общей формуле (I):
Figure imgf000031_0001
X - звено или цепь звеньев олигомера (праймера) с 5’ -стороны от межзвенной фосфорилгуанидиновой группы,
Y - звено или цепь звеньев олигомера (праймера) с 3’ -стороны от межзвенной фосфорилгуанидиновой группы.
Каждый из заместителей Rl, R2, R3 и R4 может быть атомом водорода Н или опционально замещенным органическим радикалом.
2. Способ матричного ферментативного синтеза ДНК по и. 1, применяемый для амплификации нуклеиновых кислот.
3. Способ матричного ферментативного синтеза ДНК по и. 1, применяемый для проведения полимеразной цепной реакции.
4. Способ матричного ферментативного синтеза ДНК по и. 1, используемый для проведения аллель-специфичной полимеразной цепной реакции;
5. Способ матричного ферментативного синтеза ДНК по и. 1, применяемый для обратной транскрипции;
6. Способ матричного ферментативного синтеза ДНК по и. 1, применяемый на обеих стадиях обратной транскрипции и последующей полимеразной цепной реакции;
7. Способ матричного ферментативного синтеза ДНК по и. 1, применяемый для амплификации нуклеиновых кислот по механизму катящегося кольца;
8. Реакционная смесь для матричного ферментативного синтеза ДНК по п.1.
9. Набор реакционных смесей для матричного ферментативного синтеза ДНК по п.1.
PCT/RU2018/050115 2017-04-12 2018-09-17 Матричный ферментативный синтез днк с использованием фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов Ceased WO2019112485A1 (ru)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020550583A JP2021505205A (ja) 2017-12-04 2018-09-17 ホスホリルグアニジンオリゴヌクレオチドを使用した鋳型に基づく酵素的ｄｎａ合成の方法、およびその方法を実施するための反応混合物
EP18885630.6A EP3736342A4 (en) 2017-12-04 2018-09-17 TEMPLATE DIRECTED ENZYMATIC DNA SYNTHESIS USING PHOSPHORYLGUANIDINE OLIGONUCLEOTIDES
US16/769,680 US11643433B2 (en) 2017-04-12 2018-09-17 Method for template-based enzymatic DNA synthesis using phosphoryl guanidine oligonucleotides and reaction mixtures for carrying out the method
KR1020207017372A KR20200093580A (ko) 2017-12-04 2018-09-17 포스포릴 구아니딘 올리고뉴클레오티드를 이용한 템플릿-기반 효소적 dna 합성 방법 및 그의 이행을 위한 반응 혼합물
IL275003A IL275003A (en) 2017-12-04 2020-05-31 A method for template-based enzymatic DNA synthesis using phosphorylguanidine oligonucleotides and reaction mixtures for carrying out the method

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2017140645A RU2698134C2 (ru) 2017-12-04 2017-12-04 Способ амплификации нуклеиновых кислот с использованием фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов
RU2017140645 2017-12-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019112485A1 true WO2019112485A1 (ru) 2019-06-13

Family

ID=66751724

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2018/050115 Ceased WO2019112485A1 (ru) 2017-04-12 2018-09-17 Матричный ферментативный синтез днк с использованием фосфорилгуанидиновых олигонуклеотидов

Country Status (7)

Country Link
US (1) US11643433B2 (ru)
EP (1) EP3736342A4 (ru)
JP (1) JP2021505205A (ru)
KR (1) KR20200093580A (ru)
IL (1) IL275003A (ru)
RU (1) RU2698134C2 (ru)
WO (1) WO2019112485A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11208430B2 (en) 2014-08-22 2021-12-28 Noogen Llc Modified oligonucleotides and methods for their synthesis

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8334099B2 (en) 2006-07-31 2012-12-18 Wanli Bi Nucleic acid amplification using a reversibly modified oligonucleotide
WO2013091835A1 (en) 2011-12-22 2013-06-27 Roche Diagnostics Gmbh Methods and reagents for reducing non-specific amplification
WO2013140107A1 (en) 2012-03-22 2013-09-26 Lgc Genomics Limited Polymerase chain reaction detection system using oligonucleotides comprising a phosphorothioate group
WO2016028187A1 (en) 2014-08-22 2016-02-25 Noogen Llc Modified oligonucleotides and methods for their synthesis
US20170015699A1 (en) 2015-07-15 2017-01-19 Orizhan Bioscience Limited Partially Neutral Single-Stranded Oligonucleotide

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8334099B2 (en) 2006-07-31 2012-12-18 Wanli Bi Nucleic acid amplification using a reversibly modified oligonucleotide
WO2013091835A1 (en) 2011-12-22 2013-06-27 Roche Diagnostics Gmbh Methods and reagents for reducing non-specific amplification
WO2013140107A1 (en) 2012-03-22 2013-09-26 Lgc Genomics Limited Polymerase chain reaction detection system using oligonucleotides comprising a phosphorothioate group
WO2016028187A1 (en) 2014-08-22 2016-02-25 Noogen Llc Modified oligonucleotides and methods for their synthesis
US20170015699A1 (en) 2015-07-15 2017-01-19 Orizhan Bioscience Limited Partially Neutral Single-Stranded Oligonucleotide

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BALLANTYNE K.N.VAN OORSCHOT R.A.MITCHELL R.J.: "Locked nucleic acids in PCR primers increase sensitivity and performance", GENOMICS, vol. 91, 2008, pages 301 - 305, XP022482717, DOI: 10.1016/j.ygeno.2007.10.016
BRENT C.: "Satterfield cooperative primers : 2.5 million-fold improvement in the reduction of non-specific amplification", J. MOL. DIAGN., vol. 16, 2014, pages 163 - 173
KUPRIUSHKIN M. S. DR: "Phosphoryl Guanidines: A New Type of Nucleic Acid Analogues", ACTA NATURAE (RUSSIAN VERSION), vol. 6, no. 4, 2014, pages 123 - 125, XP009521597, ISSN: 2075-8243 *
KUPRYUSHKIN MSPYSHNYI DVSTETSENKO D.A.: "Phosphoryl guanidines. A new class of nucleic acid analogues", ACTA NATURAE, vol. 6, no. 4, 2014, pages 116 - 118
KUZNETSOV N.A.KUPRYUSHKIN M.S.ABRAMOVA T.V.KUZNETSOVA A.A.MIROSHNIKOVA A.D.STETSENKO D.A.PYSHNYI D.VFEDOROVA O.S.: "New Oligonucleotide Derivatives as Unreactive Substrate Analogues and Potential Inhibitors of Human Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease APEI", MOLECULAR BIOSYSTEMS, vol. 12, no. 1, 2016, pages 67 - 75
LEBEDEV A.V.PAUL N.YEE J.TIMOSHCHUK V.A.SHUM J.MIYAGI K.KELLUM J.HOGREFE R.I.ZON G.: "Hot start PCR with heat-activatable primers: a novel approach for improved PCR performance", NUCLEIC ACIDS RES., vol. 36, 2008, pages e131
MULLIS K.B.FALOONA F.A.: "Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction", METHODS ENZYMOL., vol. 155, 1987, pages 335 - 350, XP009003171, DOI: 10.1016/0076-6879(87)55023-6
SAIKI R.K.SCHARF S.FALOONA F.MULLIS K.B.HORN G.T.ERLICH H.A.ARNHEIM N.: "Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia", SCIENCE, vol. 230, 1985, pages 1350 - 1354, XP009017837, DOI: 10.1126/science.2999980
SCHNEIDER U.V.MIKKELSEN N.D.LINDQVIST A.OKKELS L.M.JOHNK N.LISBY G.: "Improved efficiency and robustness in qPCR and multiplex end-point PCR by twisted intercalating nucleic acid modified primers", PLOS ONE, vol. 7, 2012, pages e38451
See also references of EP3736342A4
SUMMERTON J.STEIN D.HUANG S.B.MATTHEWS P.WELLER D.PARTRIDGE M.: "Morpholino and phosphorothioate antisense oligomers compared in cell-free and in-cell systems", ANTISENSE NUCLEIC ACID DRUG DEV., vol. 7, 1997, pages 63 - 70

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11208430B2 (en) 2014-08-22 2021-12-28 Noogen Llc Modified oligonucleotides and methods for their synthesis
US12415828B2 (en) 2014-08-22 2025-09-16 Noogen Llc Modified oligonucleotides and methods for their synthesis

Also Published As

Publication number Publication date
IL275003A (en) 2020-07-30
RU2698134C2 (ru) 2019-08-22
RU2017140645A (ru) 2019-06-04
US20200369709A1 (en) 2020-11-26
US11643433B2 (en) 2023-05-09
RU2017140645A3 (ru) 2019-06-04
EP3736342A1 (en) 2020-11-11
KR20200093580A (ko) 2020-08-05
EP3736342A4 (en) 2021-09-01
JP2021505205A (ja) 2021-02-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107429296B (zh) 捕获、检测和定量小rna的方法、组合物与试剂盒
JP6970205B2 (ja) Ｄｎａおよびｒｎａの同時濃縮を含むプライマー伸長標的濃縮およびそれに対する向上
ES2908415T3 (es) Composición y método para la síntesis y amplificación de ácidos nucleicos mediante el uso de RT
EP3532635B1 (en) Barcoded circular library construction for identification of chimeric products
JP5809385B2 (ja) 環状ゲノムのローリングサークル増幅
EP3063292B1 (en) Nucleic acid probe with single fluorophore label bound to internal cytosine for use in loop mediated isothermal amplification
CN104487596B (zh) 用于聚合酶链式反应(pcr)的新型组合物、方法和试剂盒
CN113832258A (zh) 使用衰减型探针的核糖核酸扩增和检测
CN110088296B (zh) 改进的多重和多步扩增反应及其试剂
CN105658811A (zh) 利用核苷酸类似物和解旋酶恒温扩增dna分子的方法
US11643433B2 (en) Method for template-based enzymatic DNA synthesis using phosphoryl guanidine oligonucleotides and reaction mixtures for carrying out the method
EP3252168B1 (en) Pcr primer linked to complementary nucleotide sequence or complementary nucleotide sequence including mis-matched nucleotides and method for amplifying nucleic acid using same
JP7490071B2 (ja) シーケンシングのための新規核酸鋳型構造
EP4019648B1 (en) Method for amplifying nucleotide sequence, and sequence determination method
EP1594982A2 (en) Methods and compositions for rna detection and quantitation
EP1004676A1 (en) Methods for dna amplification and kits therefor
CN100471952C (zh) 具有多态性序列位点的核酸的鉴定方法
JP3587284B2 (ja) 遺伝子工学用色素含有剤
EP3856931B1 (en) Allele-specific design of cooperative primers for improved nucleic acid variant genotyping
Kireev et al. RT-qPCR detection of low-copy HIV RNA with Yin-Yang probes
JP3291555B2 (ja) プローブライブラリーの製造方法、該製造方法により得られたプローブライブラリー、該プローブライブラリーから他のｄｎａまたはｒｎａとハイブリッドするプローブを精製する方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18885630

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 275003

Country of ref document: IL

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020550583

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20207017372

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018885630

Country of ref document: EP

Effective date: 20200706