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WO2019188553A1 - 微生物の細胞の測定方法 - Google Patents

微生物の細胞の測定方法 Download PDF

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WO2019188553A1
WO2019188553A1 PCT/JP2019/011356 JP2019011356W WO2019188553A1 WO 2019188553 A1 WO2019188553 A1 WO 2019188553A1 JP 2019011356 W JP2019011356 W JP 2019011356W WO 2019188553 A1 WO2019188553 A1 WO 2019188553A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
dna
sample
microorganism
test sample
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2019/011356
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
隆志 副島
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Morinaga Milk Industry Co Ltd
Original Assignee
Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Morinaga Milk Industry Co Ltd filed Critical Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority to JP2020510729A priority Critical patent/JP7369115B2/ja
Publication of WO2019188553A1 publication Critical patent/WO2019188553A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring microbial cells in a test sample.
  • Non-Patent Documents 1 to 4 dairy products and other foods to which microorganisms such as lactic acid bacteria are added are widely accepted by consumers.
  • Non-Patent Documents 1 to 4 it is necessary to measure the content of microorganisms in the food by a shipping inspection of the food or the like or an acceptance inspection of the recipient.
  • test sample is filtered through a membrane filter, cultured in an appropriate medium, and grown.
  • a method for observing a colony is known (Patent Document 1).
  • Non-patent Document 5 a method using a modified NBB medium as a lactic acid bacteria detection medium
  • Non-patent Document 6 a method using a KOT medium
  • Non-patent Document 7 a method using chemiluminescence by luciferin-luciferase reaction using ATP in bacterial cells
  • Non-patent Document 8 a method using chemiluminescence by luciferin-luciferase reaction using ATP in bacterial cells
  • a capturing method (Non-Patent Document 9) is also known.
  • DNA in cells may be cleaved by various treatments received in production, shipment, acceptance, inspection, etc., such as heat treatment. If the DNA in the cell is cleaved, an error occurs if the amount of DNA in the test sample measured by digital PCR is the number of cells in the test sample.
  • an object of the present invention is to provide a method for accurately measuring the number of microorganism cells in a test sample.
  • the present invention for solving the above problems
  • a method for measuring the number of microbial cells in a test sample A DNA recovery step of recovering DNA contained in the test sample by performing DNA extraction operation on the test sample containing cells of the microorganism;
  • a cell number calculation step for calculating the number of cells of the microorganism in the test sample;
  • Have The cell number calculating step includes: The number of cells of the microorganism in the test sample is measured by dividing the measurement result of the amplification product by a DNA cleavage coefficient prepared in advance.
  • the DNA cleavage coefficient is Using a reference sample that has undergone the same treatment as the test sample, recovering DNA by the same operation as the test sample, and preparing a reference measurement sample; Measuring the amplification product of the target region of the gene inherently provided in a single target region of the microorganism-specific DNA in the reference measurement sample and the single cell of the microorganism; Dividing the measurement result of the amplification product of the target region of DNA unique to the microorganism by the measurement result of the amplification product of the target region of the gene that is provided in a single cell of the microorganism. .
  • measurement errors due to DNA cleavage in microorganisms can be eliminated. For example, accurately measuring the number of microorganism cells in a test sample that has undergone heat treatment. Can do.
  • the “DNA cleavage coefficient” means a coefficient relating to the degree of DNA cleavage received by microorganisms in the process of production, shipment, acceptance, inspection, and the like.
  • the “DNA cleavage coefficient” refers to the number of bacterial species, the number of target regions of DNA unique to each microorganism assigned to each strain, and the processing (for example, heat treatment) that the microorganism has undergone in the process of manufacture, shipment, acceptance, inspection, etc. Etc.) is a coefficient that can change depending on the degree.
  • the “reference sample” refers to a sample that has been subjected to the same treatment as the test sample.
  • the same processing as the sample to be tested is substantially the same for the products manufactured under the same conditions, such as the processing, such as heat treatment, received during manufacture, shipment, acceptance, inspection, etc. Means that.
  • the cell number calculating step further divides the measurement result of the amplification product by the DNA recovery rate derived from the microorganism prepared in advance, thereby calculating the cell number of the microorganism in the test sample. It is characterized by measuring.
  • the DNA recovery rate is A step of recovering DNA in a reference sample that has undergone the same treatment as the test sample and a control sample not containing cells of microorganisms by the same operation as the test sample; A total DNA amount measuring step for measuring the total DNA amount in the reference sample and the control sample; Subtracting the total DNA amount of the control sample from the total DNA amount in the reference sample to calculate the amount of DNA recovered from the microorganism in the reference sample; The calculated DNA recovery amount derived from the microorganism is calculated by a step of dividing by the theoretical addition amount of the microorganism added to the reference sample. By setting it as such a form, since the measurement error by extraction operation can be eliminated, the cell number of the microorganisms in a test sample can be measured more accurately.
  • the total DNA amount measuring step includes measuring the total DNA amount in the reference sample and the control sample using a spectrophotometer. By setting it as such a form, the cell number of the microorganisms in a test sample can be measured more accurately.
  • the cell is a living cell.
  • the target region of the gene that is provided in a single single cell of the microorganism is any one selected from the group consisting of a heat-resistant protein-derived gene, a pheS gene, an rpoB gene, and a tuf gene.
  • a target region of a gene By setting it as such a form, since a DNA cutting coefficient can be calculated more accurately, the cell number of the microorganisms in a test sample can be measured more accurately.
  • thermostable protein is a heat shock protein.
  • the heat shock protein is heat shock protein 60.
  • the present invention is a method for measuring the number of microbial cells in a test sample.
  • the method of the present invention is not limited to the method of determining the number of microbial cells, but also includes a method of detecting the presence of microbial cells together with a measured value of the number of cells.
  • the microorganism cell to be measured is not particularly limited as long as the microorganism DNA can be amplified, and examples thereof include bacteria, filamentous fungi, yeast cells and the like. In the method of the present invention, it is preferable to measure living cells of microorganisms.
  • Gram-positive bacteria include bacteria of the genus Lactobacillus, bacteria of the genus Orsenella, bacteria of the genus Carnobacterium, bacteria of the genus Weissella, bacteria of the genus Enterococcus, or Bifidobacterium ( Bifidobacterium) genus bacteria and the like can be mentioned.
  • the method of the present invention is preferably applied to the measurement of the number of Lactobacillus bacteria.
  • Lactobacillus examples include Lactobacillus paracasei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus gasseri, and Lactobacillus L.
  • test sample used in the method of the present invention is, for example, subjected to heat treatment.
  • heat treatment include heat treatment, homogenization, and sterilization.
  • said test sample can be employ
  • test sample that can be used in the method of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include foods, biological samples, vaccine preparations, drinking water, industrial water, environmental water, wastewater, soil, or wiped samples. be able to.
  • a food as a test sample from the viewpoint of the usefulness of measuring cells of microorganisms having physiological activity advantageous to a living body.
  • Beverages such as soft drinks, carbonated drinks, nutrient drinks, fruit juice drinks, lactic acid bacteria drinks (including concentrated concentrates and powders for preparation of these drinks); ice cream, ice sherbet, shaved ice and other frozen desserts; chocolate, caramel, Sweets such as candy, cakes, biscuits and cookies; dairy products such as milk, processed milk, milk drinks, fermented milk, butter; highly nutritious fluid foods such as enteral nutritional foods, child-rearing milk, sports drinks; foods for specified health use And functional foods such as health supplements.
  • the test sample may be the aforementioned food, biological sample, vaccine preparation, drinking water, industrial water, environmental water, wastewater, soil, wiped sample, or the like itself, which is diluted or concentrated.
  • any other pretreatment Preferred examples of the pretreatment include heat treatment, filtration, and centrifugation.
  • test sample is milk, dairy products, milk or food made from dairy products, bovine leukocytes and mammary epithelial cells can be mentioned as cells other than the cells of microorganisms present in the test sample. .
  • the enzyme is not particularly limited as long as it can decompose impurities, and examples thereof include lipolytic enzymes, proteolytic enzymes, and carbohydrases.
  • the enzyme one type of enzyme may be used alone, or two or more types of enzymes may be used in combination. Among them, it is preferable to use both lipolytic enzyme and proteolytic enzyme, or all of lipolytic enzyme, proteolytic enzyme, and carbohydrase.
  • the lipolytic enzyme include lipase and phosphatase.
  • proteolytic enzymes include serine protease, cysteine protease, proteinase K, and pronase (registered trademark).
  • the saccharide-degrading enzyme include amylase, cellulase, N-acetylmuramidase and the like.
  • the DNA recovery step is a step of recovering DNA contained in the test sample by performing a DNA extraction operation on the test sample containing microbial cells.
  • the DNA extraction operation a cooling centrifugation treatment and a cell crushing operation using glass beads can be preferably exemplified for the test sample.
  • the DNA extraction operation is not particularly limited.
  • a commercially available DNA extraction kit can also be used for DNA extraction.
  • Test measurement sample preparation process involves adding or processing the necessary reagents to the test sample and providing it for measurement of amplification products using the PCR method. This is a step of preparing a measurement sample (nucleic acid amplification reaction solution).
  • reagents usually used in the digital PCR method are added. Specifically, in addition to a primer for amplifying a target region, which will be described later, and a probe for measuring an amplification product, a reagent used in normal digital PCR, such as a dNTP mixed solution and a DNA polymerase, is added.
  • a reagent other than the primer and the probe for example, when using a digital PCR apparatus described later, QuantStudio (registered trademark) 3D digital PCR Master Mix v2 ( ⁇ 2) (Thermo Fisher Scientific) can be used.
  • the preparation step it is preferable to add a drug that suppresses the action of the nucleic acid amplification inhibitor to the test sample.
  • a drug that suppresses the function of the nucleic acid amplification inhibitor it is possible to improve the quantitativeness in the amplification step described later.
  • the “nucleic acid amplification inhibitor” is a substance that inhibits a nucleic acid amplification reaction or a nucleic acid extension reaction.
  • a positive charge inhibitor that adsorbs to a DNA template, or a nucleic acid synthase (DNA polymerase, etc.).
  • negative charge inhibitory substances examples include calcium ions, polyamines, and heme.
  • examples of the negative charge inhibitor include phenol, a phenol compound, heparin, and a cell wall outer membrane of Gram-negative bacteria. Foods and clinical specimens are said to contain many substances that inhibit such nucleic acid amplification reactions.
  • Drugs that suppress the action of the nucleic acid amplification inhibitor as described above include albumin, dextran, T4 gene 32 protein, acetamide, betaine, dimethyl sulfoxide, formamide, glycerol, polyethylene glycol, soybean trypsin inhibitor, ⁇ 2-macroglobulin, tetra From methylammonium chloride and lysozyme, hydrophilic drugs such as phosphorylase and lactate dehydrogenase can be exemplified. These hydrophilic drugs may be used alone or in combination of two or more.
  • polyethylene glycol 400 or polyethylene glycol 4000 can be preferably exemplified as polyethylene glycol.
  • betaine include trimethylglycine and its derivatives.
  • phosphorylase and lactate dehydrogenase include rabbit muscle-derived glycogen phosphorylase and lactate dehydrogenase.
  • glycogen phosphorylase b can be mentioned preferably.
  • albumin typified by BSA bovine serum albumin
  • BSA bovine serum albumin
  • T4 gene 32 protein is a single-stranded DNA-binding protein, and prevents the template from being degraded by nucleolytic enzymes by pre-binding to the single-stranded DNA that is the template in the nucleic acid amplification process. It is thought that inhibition of nucleic acid amplification may be reduced by binding to a nucleic acid amplification inhibitor similar to BSA (Abu Al-Soud, W. et al, Journal of Clinical Microbiology, 38: 4463 -4470, 2000)).
  • BSA, T4 Gene 32 protein, and proteinase inhibitor can reduce proteolytic activity by binding to proteinase and maximize the function of nucleic acid synthase. Sex has been suggested. In fact, there may be proteolytic enzymes remaining in milk and blood, so that the addition of BSA or proteolytic enzyme inhibitors (soybean trypsin inhibitor or ⁇ 2-macroglobulin) prevents the nucleic acid synthase from being degraded. Cases in which the nucleic acid amplification reaction progressed well have been introduced (Abu Al-Soud et al.).
  • Dextran is a polysaccharide generally synthesized by lactic acid bacteria using glucose as a raw material. It has been reported that a similar polysaccharide-peptide complex called mucin adheres to the intestinal mucosa (Ruas-Madiedo, P., Applied and Environmental Microbiology, 74: 1936-1940, 2008), and dextran is a negative charge inhibitor. It is presumed that there is a possibility of binding to these inhibitory substances by adsorbing in advance (adsorbed on nucleic acid synthase) or positive charge inhibitory substance (adsorbed on nucleic acid).
  • lysozyme is adsorbed to a nucleic acid amplification inhibitor thought to be contained in a large amount in milk (Abu Al-Soud et al.).
  • hydrophilic drugs represented by albumin, T4 gene 32 protein, dextran, and lysozyme are drugs that suppress the action of nucleic acid amplification inhibitors.
  • albumin examples include bovine serum albumin, ovalbumin, milk albumin, human serum albumin and the like. Of these, bovine serum albumin (BSA) can be preferably exemplified. Albumin may be a purified product, and may be used in combination with other components such as globulin as long as the effects of the present invention are not impaired. The albumin may be a fraction.
  • BSA bovine serum albumin
  • the concentration of albumin in the test sample is, for example, usually 0.0001 to 1% by mass, preferably 0.01 to 1% by mass, and more preferably 0.2 to 0.6% by mass.
  • dextran examples include dextran 40 and dextran 500, with dextran 40 being particularly preferred.
  • concentration of dextran in the test measurement sample is, for example, usually 1 to 8%, preferably 1 to 6%, more preferably 1 to 4%. In the preparation step, it is preferable to add dextran to the test sample so that the concentration of dextran in the test measurement sample falls within the above range.
  • T4 gene 32 protein a commercially available product (for example, Roche's: also called gp32) may be used.
  • concentration of the T4 gene 32 protein in the test sample is usually 0.01 to 1%, preferably 0.01 to 0.1%, more preferably 0.01. ⁇ 0.02%.
  • lysozyme lysozyme derived from egg white can be preferably mentioned.
  • concentration of lysozyme in the test sample is, for example, usually 1 to 20 ⁇ g / mL, preferably 6 to 15 ⁇ g / mL, and more preferably 9 to 13 ⁇ g / mL.
  • lysozyme is preferably added to the test sample so that the concentration of lysozyme in the test measurement sample falls within the above range.
  • lysozyme and polyethylene glycol are preferable to use as a drug that suppresses the action of the nucleic acid amplification inhibitor. Since lysozyme and polyethylene glycol inhibit a protein-derived nucleic acid amplification inhibitor contained in food, the quantification of microbial cells can be improved by adding them to a test sample.
  • lysozyme and polyethylene glycol are particularly preferable to use as a drug that suppresses the action of the nucleic acid amplification inhibitor. Since lysozyme and polyethylene glycol act in concert with nucleic acid amplification inhibitors to alter the surface structure of the nucleic acid amplification inhibitors, the combination of these results in more efficient use of protein-derived nucleic acid amplification inhibitors in the test sample. Can be inhibited.
  • a magnesium salt, an organic acid salt, a phosphate, or the like it is preferable to add a magnesium salt, an organic acid salt, a phosphate, or the like to the test sample or a solution of DNA extracted from the test sample.
  • the magnesium salt examples include magnesium chloride, magnesium sulfate, magnesium carbonate and the like. From the test sample or the test sample, the concentration of the magnesium salt in the test measurement sample (nucleic acid amplification reaction solution) is, for example, 1 to 10 mM, preferably 2 to 6 mM, more preferably 2 to 5 mM. It is preferable to add a magnesium salt to the extracted DNA solution.
  • organic acid salt examples include salts of citric acid, tartaric acid, propionic acid, butyric acid and the like.
  • the salt include sodium salt and potassium salt.
  • pyrophosphate etc. can be mentioned as a phosphate. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the concentration of the organic acid salt or phosphate in the test measurement sample (nucleic acid amplification reaction solution) is, for example, 0.1 to 20 mM, preferably 1 to 10 mM, more preferably 1 to 5 mM in the total amount.
  • nucleic acid amplification using the above-described digital PCR method including primers and probes, reagents for measuring amplification products, agents that suppress the action of nucleic acid amplification inhibitors, magnesium salts, silicates or phosphorus
  • the order of addition of the acid salts is not limited, and they may be added simultaneously (including premixed forms).
  • the amplification step is a step of amplifying the target region of the DNA of the cells in the test measurement sample prepared in the preparation step by the digital PCR method and measuring the amplification product.
  • means for amplifying the target region of cellular DNA is not limited to digital PCR.
  • a sample containing DNA to be measured is distributed to a chip having a large number of wells, and nucleic acid amplification is performed for each well. ”Is detected.
  • a commercially available digital PCR apparatus can be used for the digital PCR method.
  • the digital PCR for example, it is preferable to use Quant Studio (registered trademark) 3D digital PCR (Thermo Fisher Scientific) that performs analysis using a hydrophobic chip having 20000 wells.
  • the conditions for the nucleic acid amplification reaction are not particularly limited, and can be set as appropriate in consideration of the length of the DNA target region, the TM value of the primer, and the like.
  • the presence or absence of nucleic acid amplification in each well can be determined by hybridizing a probe labeled with a fluorescent molecule or the like to the amplification product. That is, a signal derived from the probe is observed in the well where the nucleic acid amplification reaction has occurred.
  • a probe labeled with a fluorescent molecule is used, the fluorescence emitted from the well can be detected by a device such as a chemirmiphotometer.
  • the “DNA target region” is a region targeted for amplification by digital PCR in the DNA of the microorganism to be measured.
  • the DNA target region is preferably set to include a sequence specific to the microorganism to be measured. Further, depending on the purpose, it may have a sequence common to a plurality of types of microorganisms.
  • the target region of DNA may be single or plural.
  • Primers used for nucleic acid amplification can be appropriately set based on the principle of the nucleic acid amplification method, and are not particularly limited as long as they can specifically amplify the target region of the DNA.
  • the primer set shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and the probe shown in SEQ ID NO: 3 can be used (see Table 4).
  • a primer common to a plurality of types of microorganisms when used, cells of a plurality of types of microorganisms in a test sample can be measured.
  • a primer specific to a specific microorganism when used, cells of the specific microorganism in the test sample can be measured.
  • the cell number calculating step is a step of calculating the number of cells of microorganisms in the test sample based on the measurement result obtained in the above-described amplification step.
  • the cell number calculation step includes measuring the number of microorganism cells in the test sample by dividing the measurement result of the amplification product obtained in the amplification step by a DNA cleavage coefficient prepared in advance.
  • the cell number calculation step it is more preferable to measure the number of microorganism cells in the test sample by dividing the measurement result of the amplification product by the DNA recovery rate derived from the microorganism prepared in advance.
  • the cell number calculation step it is more preferable to calculate the number of cells in the test sample by dividing the measurement result of the amplification product by the reaction rate of the PCR master mix calculated in advance.
  • the cell number calculation step it is more preferable to calculate the number of cells in the test sample by multiplying the measurement result of the amplification product by the dilution factor up to the preparation of the measurement sample.
  • the above-mentioned three types of coefficients are calculated in advance: the DNA cleavage coefficient, the microorganism-derived DNA recovery rate, and the PCR master mix reaction rate.
  • the DNA cleavage coefficient the DNA cleavage coefficient
  • the microorganism-derived DNA recovery rate the microorganism-derived DNA recovery rate
  • the PCR master mix reaction rate the PCR master mix reaction rate
  • the DNA cleavage coefficient is a step of using a reference sample to collect DNA by the same operation as the test sample and preparing a reference measurement sample, A step of measuring an amplification product of a target region of a gene unique to a target region of DNA unique to a microorganism and a single cell of a microorganism in a reference measurement sample; The measurement result of the amplification product of the target region of the DNA unique to the microorganism is divided by the measurement result of the amplification product of the target region of the gene that the single cell of the microorganism has as a single unit.
  • Preferred examples of the “target region of a gene that a single microbial cell unit comprises” include, for example, genes derived from heat-resistant proteins, pheS genes, rpoB genes, and tuf genes.
  • the target region of a gene that a single microbial cell unit comprises is preferably a gene derived from a heat-resistant protein. Since the target region of a gene that a single cell of a microorganism has is a gene derived from a heat-resistant protein, the DNA cleavage coefficient can be calculated without being affected by heat treatment.
  • heat shock protein 60 can be mentioned more preferably.
  • the method for measuring the amplification product of the target region of a gene provided in a single target cell of the above-described microorganism-specific DNA and a single microorganism cell in the reference measurement sample is the same method as the amplification step described above. Can be taken.
  • the primer set shown in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 and the probe shown in SEQ ID NO: 6 can be used (see Table 5).
  • the primer set shown in SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 and the probe shown in SEQ ID NO: 10 can be used (see Table 9).
  • the primer set shown in SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 and the probe shown in SEQ ID NO: 13 can be used (see Table 10).
  • the primer set shown in SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 and the probe shown in SEQ ID NO: 16 can be used (see Table 11).
  • the DNA cleavage coefficient can be calculated with high accuracy, so that the microorganism cells in the test sample can be measured with higher accuracy.
  • Microbial DNA recovery rate is A step of recovering DNA in a reference sample that has undergone the same treatment as the test sample and a control sample not containing cells of microorganisms by the same operation as the test sample; A total DNA amount measuring step for measuring the total DNA amount in the reference sample and the control sample; Calculating the amount of microorganism-derived DNA recovered in the reference sample by subtracting the total DNA amount of the control sample from the total DNA amount in the reference sample; The calculated amount of recovered microorganism-derived DNA is divided by the step of dividing by the theoretical amount of microorganisms added to the reference sample.
  • the DNA amount measurement step it is more preferable to measure the total DNA amount in the reference sample and the control sample using a spectrophotometer. By setting it as such a form, the cell number of the microorganisms in a test sample can be measured more accurately.
  • a theoretical value of the weight per cell of the microorganism can be preferably exemplified.
  • (C) PCR master mix reaction rate The PCR master mix reaction rate is the same as the test sample using a test sample containing an artificially synthesized gene having the DNA target region of the cell to be measured.
  • the result of the amplification product is calculated by a method for calculating the reaction rate of the PCR master mix.
  • a method for calculating the reaction rate of the PCR master mix from the result of the amplification product a method of dividing the measurement result of the amplification product by the artificially synthesized gene concentration in the test sample can be preferably mentioned. By setting it as such a form, the cell number of the microorganisms in a test sample can be measured more accurately.
  • the number of microbial cells in the test sample subjected to heat treatment was measured.
  • cDBC (abbreviation of concentrated direct component) in Table 2 is a drug that suppresses the action of a nucleic acid amplification inhibitor.
  • cDBC is bovine serum albumin (Sigma, hereinafter referred to as BSA), trisodium citrate dihydrate (Kanto Chemical, hereinafter referred to as TSC), magnesium chloride hexahydrate (Nacalai Tesque, hereinafter).
  • BSA bovine serum albumin
  • TSC trisodium citrate dihydrate
  • TSC trisodium citrate dihydrate
  • MgCl 2 egg white lysozyme
  • lysozyme (Wako Pure Chemical Industries, hereinafter simply referred to as lysozyme)
  • Brij58 registered trademark: Sigma
  • Table 4 shows the sequences of the forward primer and reverse primer, and TaqMan (registered trademark) probe used to measure the Lactobacillus paracasei 16SrDNA gene (target region of DNA unique to microorganisms).
  • Table 5 shows the sequences of the forward primer and reverse primer, and TaqMan (registered trademark) probe used for measuring the heat shock protein 60 gene (the target region of a gene that a single cell of a microorganism comprises). .
  • a prepared measurement sample for DNA cleavage coefficient calculation is a Quant Studio (reference measurement sample). 865 pL was dispensed into each well (approximately 18,000 wells) in the chip of (registered trademark) 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2 (Thermo Fisher Scientific) using a dedicated loader. After dispensing, digital PCR was performed under the PCR thermal cycle conditions shown in Table 6 using a digital PCR apparatus (Quant Studio (registered trademark) 3D Digital PCR System, Thermo Fisher Scientific).
  • Lactobacillus paracasei 16S rDNA gene target region of microorganism-specific DNA
  • heat shock protein 60 gene microorganism cell
  • Table 7 shows the measurement results. Further, the DNA cleavage coefficient was calculated by dividing the measured amount of Lactobacillus paracasei 16SrDNA by the amount of hsp60 gene. The DNA cleavage factor is shown in Table 7.
  • Lactobacillus paracasei 16S rDNA gene target region of DNA unique to microorganisms
  • the results of the heat shock protein 60 gene target region of a single microbial cell gene.
  • the DNA cleavage coefficient was calculated by dividing the measurement result.
  • reaction rate of PCR master mix containing cDBC was calculated when PCR was performed using a PCR master mix containing cDBC.
  • TTTTT (phesS gene) TTTTT (rpoB gene) TTTTT (tuf gene) TTTTT (Lactobacillus paracasei 16S rDNA specific region) artificially linked
  • the gene conjugate gBlocks (see SEQ ID NO: 7 and Table 8 manufactured by Integrated DNA Technologies) was diluted to a concentration shown in Table 12 using a TE buffer to prepare a test solution.
  • Lactobacillus paracasei pheS gene (the target region of a single gene of a single microbial cell) can be used to measure the forward primer and reverse primer, and the probe sequence. 9 shows.
  • the Lactobacillus paracasei rpoB gene (the target region of a single gene of a single microbial cell) can be used to measure a forward primer and a reverse primer, and a probe sequence. 10 shows.
  • Lactobacillus paracasei tuf gene (the target region of a single gene of a single microbial cell) can be used to measure a forward primer and a reverse primer, and a probe sequence. 11 shows.
  • test measurement sample a test measurement sample containing the recovered DNA was prepared.
  • the test measurement sample was prepared by the same method as in the above (2-1).
  • the present invention can be applied to the measurement of the number of microbial cells in a test sample that has been subjected to various processes in the process of shipment, acceptance, and inspection, such as heat treatment.

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Abstract

【課題】被検試料中の微生物の細胞を精度よく測定することのできる技術を提供すること。　【解決手段】被検試料中の微生物の細胞数を測定する方法であって、前記微生物の細胞を含む前記被検試料に対してＤＮＡの抽出操作を行うことにより、当該被検試料に含まれるＤＮＡを回収するＤＮＡ回収工程と、前記ＤＮＡ回収工程で回収したＤＮＡを含む被検測定用試料を調製する調製工程と、前記被検測定用試料中の前記微生物固有のＤＮＡのターゲット領域をデジタルＰＣＲ法により増幅させる増幅工程と、前記増幅工程で得た測定結果に基づいて、前記被検試料中の前記微生物の細胞数を算出する細胞数算出工程と、を有し、前記細胞数算出工程は、前記増幅産物の測定結果を予め用意したＤＮＡ切断係数で割ることにより、前記被検試料中の前記微生物の細胞数を測定することを特徴とする。

Description

微生物の細胞の測定方法
　本発明は、被検試料中の微生物の細胞を測定する方法に関する。
　現在、乳製品をはじめとして、乳酸菌などの微生物を添加した食品が広く消費者に受け入れられている（非特許文献１～非特許文献４）。ここで、乳酸菌などの微生物を含む食品を提供するにあたり、食品等の出荷検査や受け入れ先の受け入れ検査等で食品中の微生物含有量を測定する必要がある。
　微生物の検出・定量の技術として、例えば、乳酸菌が存在しない飲料中における乳酸菌生細胞による汚染の検出・定量を目的として、被検試料をメンブランフィルターでろ過後、適当な培地中で培養し、生育したコロニーを観察する方法が知られている（特許文献１）。
　また、乳酸菌検出培地として改変ＮＢＢ培地を使用する方法（非特許文献５）、ＫＯＴ培地を使用する方法（非特許文献６）も知られている。さらに、菌体中のＡＴＰを利用し、ルシフェリン－ルシフェラーゼ反応による化学発光を用いる方法（非特許文献７、非特許文献８）、また、培地中の菌の生育を培地の電気伝導度の変化で捕らえる方法（非特許文献９）も知られている。
特開平６－３１１８９４号公報
Yoshikawa, T. et al. 2009. Biosci. Biotechnol. Biochem. 73: 1439-1442. Inoue, R. et al. 2010. Immunol Med Microbiol. 61: 94-102. Iwabuchi, N. et al. 2012. Immunol Med Microbiol. 66: 230-239. Nishibayashi, R. et al. 2015. Plos One | DOI:10.1371/journal.pone.0129806. Back, W. 1980. Brauwelt. 120: 1562. Taguchi, H. et al. 1990. J. Am. Soc. Brew. Chem. 48: 72. Hysert, D. W. et al. 1976. J. Am. Soc. Brew. Chem. 34: 145. Soejima, T. et al. 2009. FEMS Microbiol. Lett. 294: 74-81. Vogel, H. & Bohak, I. 1990. Brauwelt. 130: 414.
　ところで、製造、出荷、受け入れ、検査等で受けたさまざまな処理、例えば熱処理等によって、細胞中のＤＮＡが切断することがある。細胞中のＤＮＡが切断している場合には、デジタルＰＣＲで測定した被検試料中の細胞のＤＮＡ量を被検試料中の細胞数とすると、誤差が生じる。
　前述した背景において、被検試料中の微生物の細胞を精度よく測定することのできる技術が求められていた。すなわち、本発明は、被検試料中の微生物の細胞数を精度よく測定する方法を提供することを課題とする。
　前記課題を解決する本発明は、
　被検試料中の微生物の細胞数を測定する方法であって、
　前記微生物の細胞を含む前記被検試料に対してＤＮＡの抽出操作を行うことにより、当該被検試料に含まれるＤＮＡを回収するＤＮＡ回収工程と、
　前記ＤＮＡ回収工程で回収したＤＮＡを含む被検測定用試料を調製する調製工程と、
　前記被検測定用試料中の前記微生物固有のＤＮＡのターゲット領域をデジタルＰＣＲ法により増幅させる増幅工程と、
　前記増幅工程で得た測定結果に基づいて、前記被検試料中の前記微生物の細胞数を算出する細胞数算出工程と、
　を有し、
　前記細胞数算出工程は、
　前記増幅産物の測定結果を予め用意したＤＮＡ切断係数で割ることにより、前記被検試料中の前記微生物の細胞数を測定することを特徴とする。
　そして、前記ＤＮＡ切断係数は、
　　被検試料と同一の処理を受けた基準試料を用いて、被検試料と同一の操作によりＤＮＡを回収し、基準測定用試料を調製する工程と、
　　基準測定用試料中の前記微生物固有のＤＮＡのターゲット領域及び前記微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域の増幅産物を測定する工程と、
　　前記微生物固有のＤＮＡのターゲット領域の増幅産物の測定結果を、前記微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域の増幅産物の測定結果で割る工程、によって算出されることを特徴とする。
　このような形態とすることで、微生物中のＤＮＡの切断による測定の誤差を解消することができるため、例えば、熱処理を受けたような被検試料中の微生物の細胞数を精度よく測定することができる。
　なお、本明細書において「ＤＮＡ切断係数」は、製造、出荷、受け入れ、検査等の過程で微生物が受けたＤＮＡの切断の程度に関する係数を意味する。
　ここで、「ＤＮＡ切断係数」は、菌種、菌株ごとに割り当てられた微生物固有のＤＮＡのターゲット領域の数、及び、微生物が製造、出荷、受け入れ、検査等の過程で受けた処理（例えば熱処理等）の程度に依存し変化し得る係数である。
　また、本発明において「基準試料」とは、被検試料と同一の処理を受けた試料をいう。また、「被検試料と同一の処理」は、同じ条件のもとに製造された製品において、製造、出荷、受け入れ、検査等で受けた処理、例えば熱処理等の条件が実質的に同一であることを意味する。
　本発明の好ましい形態では、前記細胞数算出工程は、さらに、前記増幅産物の測定結果を予め用意した前記微生物由来のＤＮＡ回収率で割ることにより、前記被検試料中の前記微生物の細胞数を測定することを特徴とする。
　そして、前記ＤＮＡ回収率は、
　　被検試料と同一の処理を受けた基準試料、及び、微生物の細胞を含まない対照試料中のＤＮＡを、被検試料と同一の操作により回収する工程と、
　　前記基準試料、及び、前記対照試料中の総ＤＮＡ量を測定する総ＤＮＡ量測定工程と、
　　前記基準試料中の総ＤＮＡ量から前記対照試料の総ＤＮＡ量を引くことにより、前記基準試料中の前記微生物由来のＤＮＡ回収量を算出する工程と、
　　算出した前記微生物由来のＤＮＡ回収量を、前記基準試料に添加した前記微生物の理論添加量で割る工程、によって算出されることを特徴とする。
　このような形態とすることで、抽出操作による測定の誤差を解消することができるため、被検試料中の微生物の細胞数をより精度よく測定することができる。
　本発明の好ましい形態では、前記総ＤＮＡ量測定工程は、分光光度計を用いて前記基準試料、及び、前記対照試料中の総ＤＮＡ量を測定することを含む。
　このような形態とすることで、被検試料中の微生物の細胞数をより精度よく測定することができる。
　本発明の好ましい形態では、前記細胞が生細胞である。
　本発明の好ましい形態では、前記微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域は、耐熱性タンパク質由来の遺伝子、ｐｈｅＳ遺伝子、ｒｐｏＢ遺伝子、及びｔｕｆ遺伝子からなる群から選択されるいずれかの遺伝子のターゲット領域である。
　このような形態とすることで、ＤＮＡ切断係数をより精度よく算出することができるため、被検試料中の微生物の細胞数をより精度よく測定することができる。
　本発明の好ましい形態では、前記耐熱性タンパク質はヒートショックプロテインである。
　このような形態とすることで、ＤＮＡ切断係数をより精度よく算出することができるため、被検試料中の微生物の細胞数をより精度よく測定することができる。
　本発明の好ましい形態では、前記ヒートショックプロテインはヒートショックプロテイン６０である。
　本発明によれば、被検試料中の微生物の細胞を精度よく測定することができる。
　次に、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができる。
＜１＞微生物の細胞の測定方法
　本発明は、被検試料中の微生物の細胞数を測定する方法である。
　本発明の方法は、微生物の細胞の数を決定する方法に限定されず、微生物の細胞の存在を細胞数についての測定値と共に検出する方法も含む。
　測定対象となる微生物の細胞としては、該微生物のＤＮＡを増幅し得る限り特に制限されないが、例えば、細菌、糸状菌、酵母等の細胞を挙げることができる。
　また、本発明の方法は、微生物の生細胞を測定対象とすることが好ましい。
　中でも、本発明の方法は、グラム陽性細菌の細胞を対象とすることが好ましい。グラム陽性細菌としては、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、オルセネラ（Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ）属細菌、カルノバクテリウム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ウェイセラ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）属細菌、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、又はビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌等を挙げることができる。
　特にラクトバチルス属細菌には人体に有利な生理活性を示すものがあることから、本発明の方法は、ラクトバチルス属細菌の細胞数の測定に適用することが好ましい。
　ラクトバチルス属細菌としては、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）等を挙げることができる。
　また、本発明の方法に用いられる被検試料は、例えば熱処理を受けたものである。熱処理としては、加熱、均質化、殺菌などの処理を挙げることができる。なお、当該被検試料は熱処理の有無にかかわらず、本発明の被検試料に採用することができる。
　ここで、本発明の方法に用いることのできる被検試料に特に制限はなく、例えば、食品、生体試料、ワクチン製剤、飲料水、工業用水、環境用水、排水、土壌、又は拭き取り試料等を挙げることができる。
　特に、生体に有利な生理活性を有する微生物の細胞を測定することの有用性の観点から、食品を被検試料とすることが好ましい。食品として、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調製用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；チョコレート、キャラメル、キャンディ、ケーキ、ビスケット、クッキー等の菓子；ミルク、加工乳、乳飲料、発酵乳、バター等の乳製品；経腸栄養食品等の高栄養流動食品、育児用ミルク、スポーツ飲料；特定保健用食品、健康補助食品等の機能性食品を挙げることができる。
　本発明において、被検試料は、前述の食品、生体試料、ワクチン製剤、飲料水、工業用水、環境用水、排水、土壌、又は拭き取り試料等そのものであってもよく、これらを希釈もしくは濃縮したもの、又はその他任意の前処理をしたものであってもよい。前処理としては、加熱処理、濾過、遠心分離等を好ましく挙げることができる。
　また、被検試料中に存在する測定対象の微生物の細胞以外の細胞、タンパク質コロイド粒子、脂肪及び糖質等の夾雑物は、これらを分解する活性を有する酵素による処理等によって除去又は低減させてもよい。被検試料が乳、乳製品、乳又は乳製品を原料とする食品である場合には、被検試料中に存在する微生物の細胞以外の細胞としてウシ白血球及び乳腺上皮細胞等を挙げることができる。
　前記酵素としては、夾雑物を分解することができるものであれば特に制限されないが、例えば、脂質分解酵素、タンパク質分解酵素、及び糖質分解酵素を挙げることができる。酵素は、１種類の酵素を単独で用いてもよいし、２種又はそれ以上の酵素を併用してもよい。中でも、脂質分解酵素及びタンパク質分解酵素の両方、又は脂質分解酵素、タンパク質分解酵素、及び糖質分解酵素の全てを用いることが好ましい。
　脂質分解酵素としては、リパーゼ、フォスファターゼ等を挙げることができる。
　また、タンパク質分解酵素としてはセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、プロテイナーゼＫ、プロナーゼ（登録商標）等を挙げることができる。
　また、糖質分解酵素としてはアミラーゼ、セルラーゼ、Ｎ－アセチルムラミダーゼ等を挙げることができる。
＜２＞　本発明の方法における各工程について
　以下、本発明の方法における各工程について、詳細に説明する。
（１）ＤＮＡ回収工程
　ＤＮＡ回収工程は、微生物の細胞を含む被検試料に対してＤＮＡの抽出操作を行うことにより、被検試料に含まれるＤＮＡを回収する工程である。
　ＤＮＡの抽出操作としては、被検試料に対して冷却遠心分離処理とガラスビーズを用いた細胞の破砕操作を好ましく挙げることができる。なお、ＤＮＡの抽出操作に特に制限はない。また、ＤＮＡの抽出操作には、市販のＤＮＡ抽出キットを用いることもできる。
（２）被検測定用試料の調製工程
　被検測定用試料の調製工程は、被検試料に必要な試薬の添加や処理を行い、ＰＣＲ法を用いた増幅産物の測定に供するための被検測定用試料（核酸増幅反応液）を調製する工程である。
　調製工程では、デジタルＰＣＲ法に通常用いられる試薬を添加する。具体的には、後述するターゲット領域を増幅するためのプライマー、増幅産物を測定するためのプローブのほか、ｄＮＴＰ　混合液、ＤＮＡポリメラーゼ等通常のデジタルＰＣＲに用いられる試薬を添加する。プライマー及びプローブ以外の試薬としては、例えば後述するデジタルＰＣＲ装置を用いる場合には、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標）　３Ｄ　ｄｉｇｉｔａｌ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　ｖ２（×２）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いることができる。
　また、調製工程では、被検試料に核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤を添加することが好ましい。
　被検試料に核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤を添加することで、後述する増幅工程での定量性を向上することができる。
　ここで「核酸増幅阻害物質」とは、核酸増幅反応又は核酸伸張反応を阻害する物質であって、例えば、ＤＮＡの鋳型に吸着する正電荷阻害物質、又は核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼなど）に吸着する負電荷阻害物質等を挙げることができる。正電荷阻害物質としては、カルシウムイオン、ポリアミン、ヘム（ｈｅｍｅ）等を挙げることができる。また、負電荷阻害物質としては、フェノール、フェノール系化合物、ヘパリン、グラム陰性菌の細胞壁外膜等を挙げることができる。食品や臨床検体中には、このような核酸増幅反応を阻害する物質が多く含まれているといわれている。
　前述したような核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤としては、アルブミン、デキストラン、Ｔ４ジーン３２プロテイン、アセトアミド、ベタイン、ジメチルスルホキシド、ホルムアミド、グリセロール、ポリエチレングリコール、大豆トリプシンインヒビター、α２－マクログロブリン、テトラメチルアンモニウムクロライド、リゾチームから、ホスホリラーゼ、及び乳酸脱水素酵素等の親水性薬剤が例示できる。これら親水性薬剤は１種のみを用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。
　前述した親水性薬剤のうち、ポリエチレングリコールとしては、ポリエチレングリコール４００又はポリエチレングリコール４０００が好ましく例示できる。ベタインとしては、トリメチルグリシンやその誘導体等を挙げることができる。また、ホスホリラーゼ及び乳酸脱水素酵素としては、ウサギ筋肉由来のグリコーゲンホスホリラーゼ及び乳酸脱水素酵素を挙げることができる。なお、グリコーゲンホスホリラーゼとしては、グリコーゲンホスホリラーゼｂを好ましく挙げることができる。
　特に、アルブミン、デキストラン、Ｔ４ジーン３２プロテイン、及びリゾチームを使用することが好ましい。
　ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）に代表されるアルブミンは、ヘム（ｈｅｍｅ）のような核酸増幅阻害物質に結合することにより、核酸増幅阻害を低減させている可能性が示唆されている（Abu Al-Soudら）。
　また、Ｔ４ジーン３２プロテインは１本鎖ＤＮＡ結合性タンパク質であり、核酸増幅過程で鋳型となっている１本鎖ＤＮＡに予め結合することにより鋳型が核酸分解酵素によって分解されることを防いでいるか、または、ＢＳＡと同様の核酸増幅阻害物質に結合することにより核酸増幅阻害を低減しているのであろうと考えられている（Abu Al-Soud, W. et al, Journal of Clinical Microbiology, 38:4463-4470, 2000））。
　さらに、ＢＳＡ、Ｔ４ジーン３２プロテイン、及びタンパク質分解酵素阻害剤（proteinase inhibitor）は、タンパク質分解酵素（proteinase）に結合することによりタンパク質分解活性を低減させ、核酸合成酵素の働きを最大限に引き出す可能性が示唆されている。事実、牛乳や血液にはタンパク質分解酵素が残存していることもあり、その際ＢＳＡ又はタンパク質分解酵素阻害剤（大豆トリプシンインヒビターやα２－マクログロブリン）の添加により核酸合成酵素が分解を受けずに核酸増幅反応が良好に進行したケースも紹介されている（Abu Al-Soudら）。
　また、デキストランは一般にグルコースを原料として乳酸菌が合成する多糖類である。
ムチンという同様の多糖類－ペプチド複合体が腸管粘膜に接着することも報告されており（Ruas-Madiedo, P., Applied and Environmental Microbiology, 74:1936-1940, 2008）、デキストランが負電荷阻害物質（核酸合成酵素に吸着）、又は正電荷阻害物質（核酸に吸着）に予め吸着することにより、それら阻害物質に結合する可能性は十分あるものと推察される。
　また、リゾチームは牛乳中に多数含まれていると考えられる核酸増幅阻害物質と吸着しているものと推察される（前記Abu Al-Soudら）。
　以上のことから、アルブミン、Ｔ４ジーン３２プロテイン、デキストラン、及びリゾチームに代表される親水性薬剤は、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤であるといえる。
　アルブミンとしては、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミン、乳アルブミン、ヒト血清アルブミン等を挙げることができる。これらの中ではウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が好ましく例示できる。アルブミンは精製品でもよく、本発明の効果を損なわない限りグロブリン等の他の成分と組み合わせて用いてもよい。また、アルブミンは分画物であってもよい。
　被検測定用試料（核酸増幅反応液）中のアルブミンの濃度は、例えば、通常０．０００１～１質量％であり、好ましくは０．０１～１質量％であり、より好ましくは０．２～０．６質量％である。
　調製工程においては、被検測定用試料におけるアルブミンの濃度が前記範囲となるように、被検試料にアルブミンを添加することが好ましい。
　デキストランとしては、デキストラン４０やデキストラン５００等が挙げられ、特にデキストラン４０を好ましく挙げることができる。
　被検測定用試料（核酸増幅反応液）中のデキストランの濃度は、例えば、通常１～８％であり、好ましくは１～６％であり、より好ましくは１～４％である。
　調製工程においては、被検測定用試料におけるデキストランの濃度が前記範囲となるように、被検試料にデキストランを添加することが好ましい。
　Ｔ４ジーン３２プロテインとしては、市販品（例えば、ロシュ社製：ｇｐ３２とも呼ばれる）を用いてもよい。
　Ｔ４ジーン３２プロテインの被検測定用試料（核酸増幅反応液）中の濃度は、通常０．０１～１％であり、好ましくは０．０１～０．１％であり、より好ましくは０．０１～０．０２％である。
　調製工程においては、被検測定用試料におけるＴ４ジーン３２プロテインの濃度が前記範囲となるように、被検試料にＴ４ジーン３２プロテインを添加することが好ましい。
　リゾチームとしては、卵白由来のリゾチームを好ましく挙げることができる。
　被検測定用試料（核酸増幅反応液）中のリゾチームの濃度は、例えば、通常１～２０μｇ／ｍＬであり、好ましくは６～１５μｇ／ｍＬであり、より好ましくは９～１３μｇ／ｍＬである。
　調製工程においては、被検測定用試料におけるリゾチームの濃度が前記範囲となるように、被検試料にリゾチームを添加することが好ましい。
　調製工程においては、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤として、リゾチーム及びポリエチレングリコールの少なくとも一方を用いることが好ましい。
　リゾチームとポリエチレングリコールは食品に含まれる蛋白質由来の核酸増幅阻害物質を阻害するため、これらを被検試料に添加することにより、微生物の細胞の定量性を向上させることができる。
　また調製工程において、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤として、リゾチーム及びポリエチレングリコールを組み合わせて用いることが特に好ましい。
　リゾチームとポリエチレングリコールが核酸増幅阻害物質に協奏的に作用し核酸増幅阻害物質の表面構造を変質させるため、これらを組み合わせて用いれば、被検試料に含まれる蛋白質由来の核酸増幅阻害物質をより効率的に阻害することができる。
　また、調製工程においては、被検試料又は被検試料より抽出したＤＮＡの溶液にマグネシウム塩、有機酸塩又はリン酸塩等を添加することが好ましい。
　マグネシウム塩としては、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、炭酸マグネシウム等を挙げることができる。
　被検測定用試料（核酸増幅反応液）中のマグネシウム塩の濃度が、例えば、１～１０ｍＭ、好ましくは２～６ｍＭ、より好ましくは２～５ｍＭとなるように、被検試料又は被検試料より抽出したＤＮＡの溶液にマグネシウム塩を添加することが好ましい。
　有機酸塩としては、クエン酸、酒石酸、プロピオン酸、酪酸等の塩を挙げることができる。塩の種類としては、ナトリウム塩、カリウム塩等を挙げることができる。また、リン酸塩として、ピロリン酸等を挙げることができる。これらは１種でもよく、２種又は３種以上の混合物であってもよい。
　被検測定用試料（核酸増幅反応液）中の有機酸塩又はリン酸塩の濃度が、例えば、合計量で０．１～２０ｍＭ、好ましくは１～１０ｍＭ、より好ましくは１～５ｍＭとなるように、被検試料又は被検試料より抽出したＤＮＡの溶液に有機酸塩又はリン酸塩を添加することが好ましい。
　なお、調製工程において、前述したプライマー、プローブを含むデジタルＰＣＲ法を用いた核酸増幅、増幅産物の測定のための試薬、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、マグネシウム塩、機酸塩又はリン酸塩の添加の順序は問わず、また、同時に（あらかじめ混合する形態を含む）添加してもよい。
（３）増幅工程
　増幅工程は、調製工程で調製した被検測定用試料中の細胞のＤＮＡのターゲット領域をデジタルＰＣＲ法により増幅し、増幅産物を測定する工程である。ただし、細胞のＤＮＡのターゲット領域を増幅する手段は、デジタルＰＣＲ法に限られない。
　ここで、デジタルＰＣＲ法は、一般的には、測定対象となるＤＮＡを含む試料を多数のウェルを備えるチップに分配し、ウェルごとに個別に核酸増幅を行い、各ウェルでの「増幅の有無」を検出する方法である。
　デジタルＰＣＲ法には、市販のデジタルＰＣＲ装置を用いることができる。デジタルＰＣＲとして、例えば、２００００ウェルを備える疎水性のチップにより解析を行うＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標）　３Ｄ　ｄｉｇｉｔａｌ　ＰＣＲ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いることが好ましい。
　核酸増幅反応の条件は特に限定されず、ＤＮＡのターゲット領域の長さ、プライマーのＴＭ値などを考慮して適宜設定することができる。
　各ウェルにおける核酸増幅の有無は、蛍光分子などで標識されたプローブを増幅産物にハイブリダイズさせることにより判別することができる。すなわち、核酸増幅反応が起こったウェルではプローブに由来するシグナルが観察される。蛍光分子で標識されたプローブを用いる場合には、ケミルミフォトメータなどの装置によってウェルから発する蛍光を検出することができる。
　本発明において「ＤＮＡのターゲット領域」とは、測定対象である微生物のＤＮＡのうち、デジタルＰＣＲによる増幅の目的とする領域である。例えば、被検試料に測定対象の微生物と異なる種類の細胞が含まれる場合には、ＤＮＡのターゲット領域は、測定対象の微生物に特異的な配列を含むように設定することが好ましい。また、目的によっては複数種の微生物に共通する配列を有するものであってもよい。さらに、ＤＮＡのターゲット領域は単一であっても、複数であってもよい。
　ＤＮＡのターゲット領域の長さとしては、通常５０～５０００塩基、又は５０～３０００塩基を挙げることができる。核酸の増幅に用いるプライマーは核酸増幅法の原理に基づいて適宜設定することが可能であって、上記ＤＮＡのターゲット領域を特異的に増幅することができるものであれば特に制限されない。
　特に、ラクトバチルス・パラカゼイの細胞を測定対象とする場合には、配列番号１及び配列番号２に示すプライマーセット、配列番号３に示すプローブを用いることができる（表４参照）。
　また、複数種の微生物に共通するプライマーを用いると、被検試料中の複数種の微生物の細胞を測定することができる。また、特定の微生物に特異的なプライマーを用いると、被検試料中の特定の微生物の細胞を測定することができる。
（４）細胞数算出工程
　細胞数算出工程は、前述の増幅工程で得た測定結果に基づいて、被検試料中の微生物の細胞数を算出する工程である。
　そして、細胞数算出工程は、前述の増幅工程で得た増幅産物の測定結果を予め用意したＤＮＡ切断係数で割ることにより、被検試料中の微生物の細胞数を測定することを含む。
　このような形態とすることで、微生物中のＤＮＡの切断による測定の誤差を解消することができるため、より精度よく被検試料中の微生物の細胞数を測定することができる。
　また、細胞数算出工程は、さらに、増幅産物の測定結果を予め用意した微生物由来のＤＮＡ回収率で割ることにより、被検試料中の微生物の細胞数を測定することがより好ましい。
　このような形態とすることで、抽出操作による測定の誤差を解消することができるため、より精度よく被検試料中の微生物の細胞数を測定することができる。
　また、細胞数算出工程は、さらに、増幅産物の測定結果を予め算出したＰＣＲマスターミックスの反応率で割ることにより、被験試料中の細胞数を算出することがより好ましい。予め算出したＰＣＲマスターミックスの反応率を用いて被験試料中の細胞数を算出することで、増幅工程で反応しないＰＣＲマスターミックスによる測定の誤差を解消することができるため、より精度の高い測定結果を得ることができる。
　また、細胞数算出工程は、さらに、増幅産物の測定結果に測定用試料調製までの希釈倍率を乗ずることにより、被験試料中の細胞数を算出することがより好ましい。測定用試料調製までの希釈倍率を用いて被験試料中の細胞数を算出することで、希釈による測定の誤差を解消することができるため、より精度の高い測定結果を得ることができる。
　上述のＤＮＡ切断係数、微生物由来のＤＮＡ回収率、ＰＣＲマスターミックスの反応率の三種の係数は、予め算出する。以下、各種係数の算出方法について、説明する。
（Ａ）ＤＮＡ切断係数
　ＤＮＡ切断係数は、基準試料を用いて、被検試料と同一の操作によりＤＮＡを回収し、基準測定用試料を調製する工程と、
　基準測定用試料中の微生物固有のＤＮＡのターゲット領域及び微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域の増幅産物を測定する工程と、
　微生物固有のＤＮＡのターゲット領域の増幅産物の測定結果を、微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域の増幅産物の測定結果で割る工程と、によって算出される。
　「微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域」としては、例えば、耐熱性タンパク質由来の遺伝子、ｐｈｅＳ遺伝子、ｒｐｏＢ遺伝子、及びｔｕｆ遺伝子を好ましく挙げることができる。
　中でも、微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域は、耐熱性タンパク質由来の遺伝子であることが好ましい。微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域が耐熱性タンパク質由来の遺伝子であることで、熱処理の影響を受けることなく、ＤＮＡ切断係数を算出することができる。
　耐熱性タンパク質由来の遺伝子としては、ヒートショックプロテインを好ましく挙げることができる。中でも、ヒートショックプロテイン６０をより好ましく挙げることができる。
　なお、基準測定用試料中の前述の微生物固有のＤＮＡのターゲット領域及び微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域の増幅産物を測定する方法は、前述の増幅工程と同様の方法を採ることができる。
　ラクトバチルス・パラカゼイ由来のヒートショックプロテイン６０を測定対象とする場合には、配列番号４及び配列番号５に示すプライマーセット、配列番号６に示すプローブを用いることができる（表５参照）。
　また、ラクトバチルス・パラカゼイ由来のｐｈｅＳ遺伝子を測定対象とする場合には、配列番号８及び配列番号９に示すプライマーセット、配列番号１０に示すプローブを用いることができる（表９参照）。
　また、ラクトバチルス・パラカゼイ由来のｒｐｏＢ遺伝子を測定対象とする場合には、配列番号１１及び配列番号１２に示すプライマーセット、配列番号１３に示すプローブを用いることができる（表１０参照）。
　また、ラクトバチルス・パラカゼイ由来のｔｕｆ遺伝子を測定対象とする場合には、配列番号１４及び配列番号１５に示すプライマーセット、配列番号１６に示すプローブを用いることができる（表１１参照）。
　ここで、微生物固有のＤＮＡのターゲット領域及び微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域の増幅産物を同時に測定することがより好ましい。このような形態とすることで、ＤＮＡ切断係数を精度よく算出することができるため、被検試料中の微生物の細胞をより精度よく測定することができる。
　微生物固有のＤＮＡのターゲット領域及び微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域の増幅産物を同時に測定する方法としては、二種の蛍光標識（例えば、ＦＡＭ標識とＨＥＸ標識）の検出を同時に行う方法を特に好ましく挙げることができる。
（Ｂ）微生物由来のＤＮＡ回収率
　微生物由来のＤＮＡ回収率は、
　被検試料と同一の処理を受けた基準試料、及び、微生物の細胞を含まない対照試料中のＤＮＡを、被検試料と同一の操作により回収する工程と、
　基準試料、及び、対照試料中の総ＤＮＡ量を測定する総ＤＮＡ量測定工程と、
　基準試料中の総ＤＮＡ量から対照試料の総ＤＮＡ量を引くことにより、基準試料中の微生物由来のＤＮＡ回収量を算出する工程と、
　算出した微生物由来のＤＮＡ回収量を、基準試料に添加した微生物の理論添加量で割る工程と、によって算出される。
　ここで、ＤＮＡ量測定工程は、分光光度計を用いて基準試料、及び、対照試料中の総ＤＮＡ量を測定することが、より好ましい。このような形態とすることで、より精度よく被検試料中の微生物の細胞数を測定することができる。
　また、基準試料に添加した微生物の理論添加量としては、微生物１セルあたりの重量の理論値を好ましく挙げることができる。
（Ｃ）ＰＣＲマスターミックスの反応率
　ＰＣＲマスターミックスの反応率は、測定対象となる細胞のＤＮＡのターゲット領域を有する人工合成遺伝子を含む試験試料を用いて、被検試料と同一の操作により反応率算出の対象となるＰＣＲマスターミックスを用いてＰＣＲ法による増幅を行う工程と、
　増幅産物の結果をＰＣＲマスターミックスの反応率を算出する方法と、によって算出される。
　また、増幅産物の結果からＰＣＲマスターミックスの反応率を算出する方法としては、増幅産物の測定結果を、試験試料中の人工合成遺伝子濃度で割る方法を好ましく挙げることができる。このような形態とすることで、より精度よく被検試料中の微生物の細胞数を測定することができる。
　以下、実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
　本実施例では、熱処理を受けた被検試料中の微生物の細胞数の測定を行った。
（１）ＤＮＡ回収率の算出
（１－１）ＤＮＡ回収量算出用試料（基準試料）の調製
　表１に示すクリニカル食品と同一の条件で製造したクリニカル食品に、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｃａｓｅｉ）菌体をその菌体濃度が２．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（１．０ｎｇ／μｌ（ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｃａｓｅｉ）１ｃｅｌｌ＝５ｆｇ　での換算　））となるよう添加し、菌体の添加後０．１％Ｔｗｅｅｎ８０－ＰＢＳを用いて３倍希釈し、ＤＮＡ回収量算出用試料（基準試料）（菌体濃度５．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（２．５ｎｇ／μｌ））を調製した。
　また、菌体を含まないクリニカル食品を対照試料とした。
　そして、ＤＮＡ回収量算出用試料（基準試料）及び対照試料に対し、同一の条件での加熱処理を施した。
（１－２）ＤＮＡの回収
　まず、ＤＮＡ回収量算出用試料（基準試料）１．５ｍＬに対し、冷却遠心処理（８０００×Ｇ、１０分、４℃）を施すことにより上清を除去した。
　次に、ジルコニアビーズ（Ｚｒ－ｂｅａｄｓ）９００ｍｇ（直径０．５ｍｍジルコニアビーズ４５０ｍｇ、直径３．０ｍｍジルコニアビーズ４５０ｍｇ）を加え、激しく１分間撹拌することにより、菌体破砕処理を行った。菌体破砕処理後の破砕物から、ＫＵＲＡＢＯ　ＤＮＡ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（倉敷紡績社）を用いてＤＮＡを抽出し、０．２ｍｌのＤＮＡ回収量算出用ＤＮＡ精製溶液を得た。
　また、対照試料に対しても同様の操作を施すことにより、対照ＤＮＡ精製溶液を得た。
（１－３）ＤＮＡ回収率の算出
　分光光度計を用いて、ＤＮＡ回収量算出用試料及び対照ＤＮＡ精製溶液のＯＤ２６０ｎｍ吸光度を測定した。その後、ＤＮＡ回収量算出用試料のＯＤ２６０ｎｍ吸光度から対照ＤＮＡ精製溶液のＯＤ２６０ｎｍ吸光度を引くことにより、試料中のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｃａｓｅｉ）のＤＮＡ回収量を算出した。
　併せて、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｃａｓｅｉ）のＤＮＡ回収量を理論添加量（２．５ｎｇ／μｌ）で割ることにより、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｃａｓｅｉ）由来のＤＮＡの回収率を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（２）ＤＮＡ切断係数の算出
（２－１）ＤＮＡ切断係数算出用測定用試料（基準測定用試料）の調製
　ＤＮＡ回収工程後のＤＮＡ精製溶液２μｌを表２に示すＰＣＲマスターミックスに加えることで、ＤＮＡ切断係数算出用測定用試料（基準測定用試料）を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ここで、表２中のｃＤＢＣ（濃縮ダイレクトコンポーネントの略）は核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤である。そしてｃＤＢＣは、ウシ血清アルブミン（シグマ社、以下、ＢＳＡと表記）、クエン酸三ナトリウム２水和物（関東化学社、以下、ＴＳＣと表記）、塩化マグネシウム６水和物（ナカライテスク社、以下、ＭｇＣｌ２と表記）、卵白リゾチーム（和光純薬、以下、単にリゾチームと表記）、Ｂｒｉｊ５８（登録商標：シグマ社）を、表３に示す濃度となるように混合することにより、調製することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　また、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｃａｓｅｉ）１６ＳｒＤＮＡ遺伝子（微生物固有のＤＮＡのターゲット領域）を測定するために使用したフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びにＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの配列を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　また、ヒートショックプロテイン６０遺伝子（微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域）を測定するために使用したフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びにＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの配列を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（２－２）微生物固有のＤＮＡのターゲット領域、及び微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域の増幅
　調製したＤＮＡ切断係数算出用測定用試料（基準測定用試料）を、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標）３Ｄ　Ｄｉｇｉｔａｌ　ＰＣＲ　２０Ｋ　Ｃｈｉｐ　Ｋｉｔ　ｖ２（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）のチップ中の各ウェル（およそ１８，０００ウェル）に、専用のローダーを用いて８６５ｐＬずつ分注した。分注後、デジタルＰＣＲ装置（ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標）　３Ｄ　Ｄｉｇｉｔａｌ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、表６に示すＰＣＲサーマルサイクル条件により、デジタルＰＣＲを実施した。二種の蛍光標識（ＦＡＭ標識とＨＥＸ標識）の検出を同時に行うことにより、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｃａｓｅｉ）１６ＳｒＤＮＡ遺伝子（微生物固有のＤＮＡのターゲット領域）及び、ヒートショックプロテイン６０遺伝子（微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域）の増幅産物の有無の確認を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　測定結果を表７に示す。また、測定したラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｃａｓｅｉ）１６ＳｒＤＮＡ量をｈｓｐ６０遺伝子量で割ることにより、ＤＮＡ切断係数を算出した。ＤＮＡ切断係数を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７のとおり、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｃａｓｅｉ）１６ＳｒＤＮＡ遺伝子（微生物固有のＤＮＡのターゲット領域）の測定結果をヒートショックプロテイン６０遺伝子（微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域）の測定結果を割ることで、ＤＮＡ切断係数を算出した。
（３）ｃＤＢＣを含むＰＣＲマスターミックスの反応率の算出
　次に、ｃＤＢＣを含むＰＣＲマスターミックスを用いてＰＣＲを行った場合の、該ＰＣＲマスターミックスの反応率の算出を行った。
（３－１）試験溶液の調製
　（ｈｓｐ６０遺伝子）ＴＴＴＴＴ（ｐｈｅｓＳ遺伝子）ＴＴＴＴＴ（ｒｐｏＢ遺伝子）ＴＴＴＴＴ（ｔｕｆ遺伝子）ＴＴＴＴＴ（ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｃａｓｅｉ）１６ＳｒＤＮＡ特異領域）を人工的に連結した人工合成遺伝子連結体ｇＢｌｏｃｋｓ (Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｅｓ　製　配列番号７、及び、表８　参照）をＴＥバッファーを用いて表１２に示す濃度となるよう希釈し、試験溶液を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
（３－２）ｃＤＢＣを含むＰＣＲマスターミックスの反応率の算出
　前述の増幅産物の測定と同様の方法により、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｃａｓｅｉ）１６ＳｒＤＮＡ量及びｈｓｐ６０遺伝子量を測定した。測定した値を基に、表２のＰＣＲマスターミックスの反応率を算出した。
　結果を表１２に示す。なお、対照として、ｃＤＢＣを含むＰＣＲマスターミックス中（表２　参照）のｃＤＢＣを蒸留水に置換したＰＣＲマスターミックス（ｃＤＢＣ非含有ＰＣＲマスターミックス）についても測定を行った。
　なお、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｃａｓｅｉ）ｐｈｅＳ遺伝子（微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域）を測定する場合に使用することのできるフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びにプローブの配列を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　また、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｃａｓｅｉ）ｒｐｏＢ遺伝子（微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域）を測定する場合に使用することのできるフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びにプローブの配列を表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　また、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｃａｓｅｉ）ｔｕｆ遺伝子（微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域）を測定する場合に使用することのできるフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びにプローブの配列を表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　表１２の反応率の結果から、ｃＤＢＣを含むＰＣＲマスターミックスは、その反応率が高いことがわかった。そして、ｃＤＢＣを含むＰＣＲマスターミックスを用いることで、ＰＣＲによる測定（検出）限界が優れるものとなるため、より精度よく細胞数の測定をすることができることがわかった。
（４）細胞数の測定
　次に、上述の結果を用いて被験試料中の細胞数の測定を行った。
（４－１）被検試料の調製
　表２に示すクリニカル食品と同一の条件で製造したクリニカル食品に、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｃａｓｅｉ）菌体をその菌体濃度が２．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（１．０ｎｇ／μｌ（ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｃａｓｅｉ）１ｃｅｌｌ＝５ｆｇ　での換算　））となるよう添加し、菌体の添加後０．１％Ｔｗｅｅｎ８０－ＰＢＳを用いて３倍希釈し、被検試料を調製した。
　その後、ＤＮＡ回収量算出用試料（基準試料）と同一の条件での加熱処理を施した。
（４－２）ＤＮＡの回収
　まず、被検試料（１．５ｍＬ）に対してＤＮＡの抽出操作を行うことにより、被験試料中のＤＮＡ（０．２ｍＬ）の回収を行った。ここで、ＤＮＡの抽出は、前述の（１－２）と同様の方法により行った。
（４－３）被検測定用試料の調製
　次に、回収したＤＮＡを含む被検測定用試料の調製を行った。ここで、被検測定用試料の調製は、前述の（２－１）と同様の方法により行った。
（４－４）微生物固有のＤＮＡのターゲット領域の増幅及び、細胞数の算出
　被検測定用試料を用いて、微生物固有のＤＮＡのターゲット領域の増幅を行った。微生物固有のＤＮＡのターゲット領域の増幅は、前述の（２－２）と同様の方法により行った。
（４－５）細胞数の算出
　増幅産物の測定結果から得たラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｃａｓｅｉ）固有のＤＮＡのターゲット領域の測定結果を、測定したＤＮＡ切断係数と、測定したラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｃａｓｅｉ）由来のＤＮＡの回収率と、ｃＤＢＣを含むＰＣＲマスターミックスの反応率とで割り、かつ測定用試料調製までの希釈倍率を乗じることで、微生物中のＤＮＡの切断による測定の誤差と、抽出操作による測定の誤差と、増幅工程で反応しないＰＣＲマスターミックスによる測定の誤差と、希釈による測定の誤差と、を解消させ、被検試料中のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｃａｓｅｉ）の高精度な細胞数の値を算出した。
　本発明は、出荷、受け入れ、検査の過程でのさまざまな処理、例えば熱処理等を受けた被検試料中の微生物の細胞数の測定に応用することができる。

Claims (7)

  1. 　被検試料中の微生物の細胞数を測定する方法であって、
    　前記微生物の細胞を含む前記被検試料に対してＤＮＡの抽出操作を行うことにより、当該被検試料に含まれるＤＮＡを回収するＤＮＡ回収工程と、
    　前記ＤＮＡ回収工程で回収したＤＮＡを含む被検測定用試料を調製する調製工程と、
    　前記被検測定用試料中の前記微生物固有のＤＮＡのターゲット領域をデジタルＰＣＲ法により増幅させる増幅工程と、
    　前記増幅工程で得た測定結果に基づいて、前記被検試料中の前記微生物の細胞数を算出する細胞数算出工程と、
    　を有し、
    　前記細胞数算出工程は、
    　前記増幅産物の測定結果を予め用意したＤＮＡ切断係数で割ることにより、前記被検試料中の前記微生物の細胞数を測定することを含み、
    　前記ＤＮＡ切断係数は以下の工程によって算出されることを特徴とする、方法：
    　　被検試料と同一の処理を受けた基準試料を用いて、被検試料と同一の操作によりＤＮＡを回収し、基準測定用試料を調製する工程と、
    　　基準測定用試料中の前記微生物固有のＤＮＡのターゲット領域及び前記微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域の増幅産物を測定する工程と、
    　　前記微生物固有のＤＮＡのターゲット領域の増幅産物の測定結果を、前記微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域の増幅産物の測定結果で割る工程。
  2. 　前記細胞数算出工程は、さらに、前記増幅産物の測定結果を予め用意した前記微生物由来のＤＮＡ回収率で割ることにより、前記被検試料中の前記微生物の細胞数を測定することを含み、
    　前記ＤＮＡ回収率は以下の工程によって算出されることを特徴とする、請求項１に記載の方法：
    　　被検試料と同一の処理を受けた基準試料、及び、微生物の細胞を含まない対照試料中のＤＮＡを、被検試料と同一の操作により回収する工程と、
    　　前記基準試料、及び、前記対照試料中の総ＤＮＡ量を測定する総ＤＮＡ量測定工程と、
    　　前記基準試料中の総ＤＮＡ量から前記対照試料の総ＤＮＡ量を引くことにより、前記基準試料中の前記微生物由来のＤＮＡ回収量を算出する工程と、
    　　算出した前記微生物由来のＤＮＡ回収量を、前記基準試料に添加した前記微生物の理論添加量で割る工程。
  3. 　前記総ＤＮＡ量測定工程は、分光光度計を用いて前記基準試料、及び、前記対照試料中の総ＤＮＡ量を測定することを含む、請求項２に記載の方法。
  4. 　前記細胞が生細胞である、請求項１～３の何れか１項に記載の方法。
  5. 　前記微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域は、耐熱性タンパク質由来の遺伝子、ｐｈｅＳ遺伝子、ｒｐｏＢ遺伝子、及びｔｕｆ遺伝子からなる群から選択されるいずれかの遺伝子のターゲット領域であることを特徴とする、請求項１～４の何れか１項に記載の方法。
  6. 　前記耐熱性タンパク質は、ヒートショックプロテインであることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記ヒートショックプロテインは、ヒートショックプロテイン６０であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。

     
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