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WO2019187603A1 - 免疫グロブリンｇ結合性ペプチド - Google Patents

免疫グロブリンｇ結合性ペプチド Download PDF

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Publication number
WO2019187603A1
WO2019187603A1 PCT/JP2019/002954 JP2019002954W WO2019187603A1 WO 2019187603 A1 WO2019187603 A1 WO 2019187603A1 JP 2019002954 W JP2019002954 W JP 2019002954W WO 2019187603 A1 WO2019187603 A1 WO 2019187603A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
xaa
immunoglobulin
ala
binding peptide
thr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2019/002954
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
吉田　慎一
大 村田
史憲 鴻池
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kaneka Corp
Original Assignee
Kaneka Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kaneka Corp filed Critical Kaneka Corp
Priority to JP2020509745A priority Critical patent/JPWO2019187603A1/ja
Publication of WO2019187603A1 publication Critical patent/WO2019187603A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 and B01D15/30 - B01D15/36, e.g. affinity, ligand exchange or chiral chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B01J20/24—Naturally occurring macromolecular compounds, e.g. humic acids or their derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to an immunoglobulin G-binding peptide having improved chemical stability against alkali or the like, an affinity separation matrix having the peptide as a ligand, a method for producing immunoglobulin G or a fragment thereof using the affinity separation matrix,
  • the present invention relates to a coding DNA, a vector containing the DNA, and a transformant transformed with the vector.
  • proteins One of the important functions of proteins is the function of specifically binding to specific molecules. This function plays an important role in immune responses and signal transduction in vivo. Technological development using this function has been made for various uses such as treatment and examination.
  • One of the most industrially used proteins that specifically bind to a specific molecule is an antibody. Since proteins that specifically bind to various antibodies in a manner different from the antigen-antibody reaction can also be used for antibody detection and separation / purification, the industrial value is extremely high.
  • Immunoglobulin G As an IgG binding protein, bacterial cell wall proteins called protein A, protein G, protein H, and protein L are well known (Non-patent Document 1).
  • protein A an antibody Protein A affinity separation matrix (hereinafter, protein A may be abbreviated as “SpA”) used to capture and purify pharmaceuticals from animal cell cultures with high purity at once (non-patent) References 2, 3).
  • Non-patent Documents 1 and 4, Patent Documents 1 to 6 protein engineering research has been actively conducted to introduce site-specific mutations and improve the function as a ligand for affinity separation matrix.
  • studies have been conducted for the purpose of improving chemical stability against sodium hydroxide solutions widely used for washing SpA affinity separation matrices.
  • amino acid substitution mutations to asparagine residues known to be susceptible to deamidation reactions under alkaline conditions and glycine residues after asparagine residues are effective in improving chemical stability. is there.
  • Non-patent Document 4 modified protein G exhibiting binding properties to both the Fc region and the Fab region has been developed (Patent Document 7), but protein G having high chemical stability is also required.
  • An object of the present invention is to provide a peptide having improved chemical stability against alkali or the like.
  • the present invention also relates to an affinity separation matrix having the peptide as a ligand, a method for producing immunoglobulin G or a fragment thereof using the affinity separation matrix, a DNA encoding the peptide, a vector containing the DNA, and a characteristic of the vector. It is also an object to provide a transformed transformant.
  • the present inventor designed a peptide in which a new mutation was introduced into the immunoglobulin G-binding peptide described in Patent Document 2, and used the protein engineering technique and the genetic engineering technique to design the peptide. Mutant peptides were obtained from transformed cells, and studies were conducted to compare the physical properties of the obtained mutant peptides.
  • An immunoglobulin G-binding peptide having the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) or an amino acid sequence showing 95% or more sequence identity with the following amino acid sequence.
  • SEQ ID NO: 1 amino acid sequence
  • Xaa 1 -Xaa 2 -Tyr-Xaa 4 Leu-Xaa 6 -Xaa 7 -Xaa 8 -Gly-Xaa 10 -Thr-Leu-Thr-Gly-Tyr-Thr-Thr-Xaa 18 -Ile-Ala-Xaa 21 -Asp-Ala-Xaa 24 -Thr-Ala-Glu-Xaa 28 -Xaa 29 -Leu-Xaa 31 -Gln-Phe-Ala-Xaa 35 -Asp-Asn-Gly-Xaa 39 -Xaa 40 -Gly-Xaa 42 -Trp-Thr-Tyr-Asp-Xaa 47 -A
  • a method for producing immunoglobulin G or a fragment thereof Contacting the affinity separation matrix according to the above [18] with a liquid sample containing immunoglobulin G or a fragment thereof; and Separating the immunoglobulin G or fragment thereof bound to the affinity separation matrix from the affinity separation matrix.
  • the affinity purification chromatographic carrier on which the immunoglobulin G-binding peptide obtained in the present invention is immobilized has a small decrease in immunoglobulin binding activity due to alkali treatment damage. Therefore, during repeated use, cleaning with a sodium hydroxide aqueous solution at a high concentration or for a long time is possible.
  • peptide includes any molecule having a peptide structure.
  • the immunoglobulin G-binding peptide according to the present invention may be generally referred to as “protein” or “(protein) domain” because of the number of amino acids constituting its essential structure.
  • Immunoglobulin is a glycoprotein produced by B cells of lymphocytes, and has the function of recognizing and binding molecules such as specific proteins. In addition to the function of specifically binding to such specific molecules (antigens), the immunoglobulin has a function of detoxifying and removing factors including antigens in cooperation with other biomolecules and cells. Immunoglobulin is generally called “antibody”, which is a name that focuses on such a function. All immunoglobulins have basically the same molecular structure, and are based on a “Y” -shaped four-chain structure consisting of two light chain and two heavy chain polypeptide chains. There are two types of light chains (L chains), ⁇ chains and ⁇ chains, and all immunoglobulins have either.
  • Immunoglobulin G is a monomeric immunoglobulin and is composed of two heavy chains ( ⁇ chains) and two light chains, and has two antigen-binding sites.
  • the place corresponding to the vertical bar of the lower half of the “Y” of immunoglobulin is called the Fc region, and the “V” of the upper half is called the Fab region.
  • the Fc region has an effector function that induces a reaction after the antibody binds to the antigen, and the Fab region has a function of binding to the antigen.
  • the heavy chain Fab region and the Fc region are connected by a hinge part, and the proteolytic enzyme papain contained in papaya decomposes this hinge part and cleaves it into two Fab regions and one Fc region.
  • the portion near the tip of the “Y” in the Fab region is called a variable region (V region) because various changes in the amino acid sequence are seen so that it can bind to various antigens.
  • variable region of the light chain is called the VL region
  • variable region of the heavy chain is called the VH region
  • the Fab region and the Fc region other than the V region are regions with relatively little change, and are called constant regions (C regions).
  • the constant region of the light chain is referred to as the CL region
  • the constant region of the heavy chain is referred to as the CH region.
  • the CH region is further divided into three, CH1 to CH3.
  • the heavy chain Fab region consists of a VH region and CH1, and the heavy chain Fc region consists of CH2 and CH3.
  • the hinge part is located between CH1 and CH2.
  • the IgG-binding peptide according to the present invention is characterized by having the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) or an amino acid sequence showing 95% or more sequence identity with the following amino acid sequence.
  • Xaa 1 -Xaa 2 -Tyr-Xaa 4 -Leu-Xaa 6 -Xaa 7 -Xaa 8 -Gly-Xaa 10 -Thr-Leu-Thr-Gly-Tyr-Thr-Thr-Xaa 18 -Ile-Ala-Xaa 21 -Asp-Ala-Xaa 24 -Thr-Ala-Glu-Xaa 28 -Xaa 29 -Leu-Xaa 31 -Gln-Phe-Ala-Xaa 35 -Asp-Asn-Gly-Xaa 39 -Xaa 40 -Gly-Xaa 42 -Trp-Thr-Tyr-Asp-Xaa 47 -Ala-Thr-Xaa 50 -Thr-Phe-Thr-Val-Thr-Xaa 56 (SEQ ID NO: 1) Where Xaa 1 Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile,
  • the amino acid sequence of the immunoglobulin G-binding peptide according to the present invention may be the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence showing 95% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Other amino acid sequences may be included in addition to the amino acid sequence, or other compounds may be bound thereto. Examples of other amino acid sequences include linker peptides that bind domains in the peptide multimer described later, other peptides having different functions, and linker peptides for binding the peptide of the present invention to a water-insoluble carrier. .
  • the immunoglobulin G-binding peptide according to the present invention exhibits high binding ability to immunoglobulin G (IgG) and can exhibit high binding ability to both Fc region and Fab region of immunoglobulin G.
  • the binding force (affinity) of the IgG-binding peptide according to the present invention to the Fc region and Fab region of immunoglobulin G is, for example, Biacore system (GE Healthcare Bioscience) using the surface plasmon resonance principle. It can be tested with a biosensor, but is not limited thereto.
  • the conditions for measuring the binding ability of immunoglobulin G to the Fc region and Fab region are only required to detect binding signals when bound to each of the Fc region and Fab region of immunoglobulin G, and pH 6 at a constant temperature of 20 to 40 ° C. It can be easily evaluated by measuring under neutral conditions of ⁇ 8.
  • the binding partner immunoglobulin G molecule is not particularly limited as long as the binding to the Fc region or Fab region can be detected.
  • an immunoglobulin G molecule containing both it is difficult to distinguish and detect the binding to the two regions. Therefore, it is necessary to use a fragmented IgG containing only either the Fc region or the Fab region. preferable.
  • an affinity constant (K A ) or a dissociation constant (K D ) can be used (Nagata et al., “Real-time analysis experiment method of biological substance interaction”, Springer Fairlark Tokyo, 1998, 41).
  • the affinity constant between the peptide of the present invention and the Fc fragment or Fab fragment is obtained by immobilizing the Fc fragment or Fab fragment on the sensor chip using the Biacore system, under the conditions of a temperature of 25 ° C. and a pH of 7.4. It can be determined by an experimental system in which the peptide obtained in the present invention is added to the flow path.
  • the IgG-binding peptide according to the present invention has a binding constant K A for Fc fragments of order 10 6 or more, a binding constant K A for Fab fragments of order 10 6 or more, and Preferably, the binding constant for the Fc fragment and the binding constant for the Fab fragment are in the same order. From another aspect, it is even more preferred that the binding constant for the Fab fragment is so strong that it does not exceed 10 times that of the Fc fragment.
  • sequence identity is preferably 95% or more or 96% or more, more preferably 97% or more or 98% or more, and even more preferably 99% or more or 99.5% or more. 99.8% or more is particularly preferable.
  • Sequence identity can be measured using Clustal (http://www.clustal.org/omega/), which is a program for multiple alignment of amino acid sequences. Even if a part of the amino acid sequence is mutated within the above range, those skilled in the art can easily obtain the amino acid residue corresponding to the specific position of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 using alignment analysis software. it can.
  • the second position is Thr
  • the sixth position is Ile
  • the seventh position is Leu
  • the 18th position is Ala
  • the 24th position from the viewpoint of binding to the Fab region and Fc region.
  • the position is Ala
  • the 29th position is Val
  • the 40th position is Asp and / or the 42nd position is Glu.
  • the 13th position is Thr
  • the 15th position is Tyr
  • the 19th position is Ile
  • the 30th position is Leu
  • / or the 33rd position is Phe.
  • the 35th position is preferably Asn or Phe, more preferably Phe.
  • the IgG-binding peptide obtained by the present invention is less damaged by alkali after being treated (infiltrated) with an alkaline aqueous solution, and the binding performance is maintained at a high level, as confirmed in the examples below. Yes.
  • Alkaline aqueous solution refers to alkalinity that can achieve the purpose of cleaning or sterilization. More specifically, an aqueous solution of sodium hydroxide of 0.01M or more, 1.0M or less, or 0.01N or more and 1.0N or less is applicable, but it is not limited thereto.
  • the lower limit of the concentration is preferably 0.01M, more preferably 0.02M, and even more preferably 0.05M.
  • the upper limit of the concentration of sodium hydroxide is preferably 1.0M, more preferably 0.5M, even more preferably 0.3M, still more preferably 0.2M, and even more preferably 0.1M.
  • the alkaline aqueous solution is not necessarily a sodium hydroxide aqueous solution, but the pH is preferably 12 or more and 14 or less.
  • the pH is preferably 12 or more and 14 or less.
  • pH 12.0 or more is preferable, and pH 12.5 or more is more preferable.
  • pH of 14 or less is preferable, pH of 13.5 or less is more preferable, and pH of 13.0 or less is even more preferable.
  • “Chemical stability” refers to the property that a protein retains its function against chemical modifications such as chemical changes of amino acid residues and chemical modifications such as amide bond transfer and cleavage.
  • maintaining the function of a protein refers to maintaining the binding activity to IgG (the ratio of the polypeptide that retains affinity without undergoing chemical denaturation).
  • the binding activity to VL- ⁇ refers to the proportion of the polypeptide that retains affinity for VL- ⁇ without undergoing chemical denaturation.
  • alkali resistance is also synonymous with “chemical stability under alkaline conditions”.
  • the time for immersion in alkali is not particularly limited because the damage to the peptide varies greatly depending on the concentration of alkali and temperature at the time of immersion.
  • the concentration of sodium hydroxide is 0.05M and the temperature during immersion is room temperature
  • the lower limit of the time for immersion in alkali is preferably 1 hour, more preferably 2 hours, more preferably 4 hours, and more preferably 10 hours. Is more preferable, and 20 hours is more preferable, but there is no particular limitation.
  • the upper limit of the said time is not specifically limited, For example, it can be set as 50 hours.
  • the affinity for IgG can be tested by a biosensor such as Biacore system (GE Healthcare) using surface plasmon resonance principle or Octet (Paul) using biolayer interferometry, but is not limited to this. Is not to be done.
  • a biosensor such as Biacore system (GE Healthcare) using surface plasmon resonance principle or Octet (Paul) using biolayer interferometry, but is not limited to this. Is not to be done.
  • the temperature is a constant temperature of 20 to 40 ° C.
  • the pH when the binding state is observed is a neutral condition of pH 5 to 8.
  • the buffer component include, but are not limited to, phosphoric acid, tris, bistris, and the like when neutral.
  • the concentration of sodium chloride in the buffer solution is not particularly limited, but is preferably about 0 to 0.15M.
  • the affinity constant (K A ) or dissociation constant (K D ) can be used as a parameter indicating that it is bound to IgG (Nagata et al., “Real-time analysis experiment method of biological substance interaction”, Springer Fairlark Tokyo, 1998, page 41).
  • the affinity constant for IgG of the protein of the present invention is determined by immobilizing human IgG on the sensor chip using the Biacore system and adding each domain variant to the channel under conditions of a temperature of 25 ° C. and a pH of 7.4. It can be obtained in an experimental system.
  • a protein having an affinity constant (K A ) for human IgG of preferably 1 ⁇ 10 5 (M ⁇ 1 ) or more, more preferably 1 ⁇ 10 6 (M ⁇ 1 ) or more is suitable.
  • K A affinity constant
  • the affinity constant varies depending on the type of IgG-binding peptide and the number of domains, and is not limited to this.
  • K A and the K D is inappropriate. This is because, even if the ratio of molecules capable of binding to IgG changes due to alkali treatment, if the binding ability of one peptide molecule to IgG does not change, no change is seen as a parameter.
  • the residual binding activity of a peptide for example, when the peptide is immobilized on a sensor chip (Biacore) or a biosensor (Octet), and before and after chemical treatment of the peptide, the same concentration of IgG is added. It is better to use the magnitude of the combined response as an index.
  • the unit indicating the magnitude of the binding response is a resonance unit (RU) in Biacore and nanometer (nm) in Octet, but is not limited thereto.
  • the size of the binding response may be compared by adding an alkali-treated peptide and an alkali-treated peptide at the same concentration to the IgG-immobilized system.
  • the residual binding activity is a comparison before and after alkali treatment, it can be basically expressed as a ratio (percentage) with the binding activity before alkali treatment as the denominator and the binding activity after alkali treatment as the numerator.
  • the numerical value is not particularly limited as long as it is higher than that of the peptide in which the mutation of the present invention treated with alkali under the same conditions is not introduced, but the ratio is preferably 5% or more, and preferably 10% or more. It is preferably 20% or more, more preferably 30% or more, even more preferably 40% or more, and even more preferably 50% or more. Of course, the upper limit of the ratio is preferably 100%.
  • the chemical stability against alkali may be based on the stability of the polypeptide substance itself in addition to the binding property to IgG.
  • the 4th, 10th, 31st and / or 50th positions are preferably Arg. More preferably, two or more of the amino acid residues are Arg, even more preferably three or more are Arg, and most preferably all are Arg.
  • the eighth position is preferably Lys, Leu or Asn, and more preferably Lys or Leu.
  • the IgG-binding peptide according to the present invention is included in the present invention even if one or several amino acids are added to the amino acid sequence as one embodiment.
  • the site to be added is preferably N-terminal and / or C-terminal.
  • the range of the “one or several” may be, for example, 1 or more and 30 or less, preferably 1 or more, 20 or less, more preferably 1 or more and 10 or less, and still more preferably The number may be 1 or more, 7 or less, more preferably 1 or more, 5 or less, particularly preferably 1 or more, 3 or less, 1 or 2 or about 1.
  • the amino acid sequence of the present invention is contained, it is included in the present invention.
  • the IgG-binding peptide according to the present invention has two or more, preferably three or more, more preferably four or more, and still more preferably five single domains with the peptide as a single domain. It may be a multimer of multiple domains linked as described above. The upper limit of the number of domains to be linked is preferably 10 or less, more preferably 8 or less, and even more preferably 6 or less. These multimers may be a homopolymer such as a homodimer or homotrimer that is a conjugate of a single IgG-binding peptide, or a heterodimer or heterotrimer that is a conjugate of a plurality of types of IgG-binding peptides. Heteropolymers such as
  • Examples of how the monomeric peptides obtained by the present invention are linked include a method of linking by one or a plurality of amino acid residues, and a method of directly linking without interposing amino acid residues. It is not limited.
  • the number of amino acid residues for linking is not particularly limited, but is preferably 20 residues or less, more preferably 15 residues or less, still more preferably 10 residues or less, and even more preferably 5 There are no more than residues, even more preferably no more than 2 residues. From another viewpoint, those that do not destabilize the three-dimensional structure of the monomeric peptide are preferable.
  • fusion peptide characterized in that the IgG-binding peptide according to the present invention is fused with another peptide having different functions as one component.
  • fusion peptides include, but are not limited to, peptides fused with albumin or GST (glutathione S-transferase).
  • a nucleic acid such as a DNA aptamer, a drug such as an antibiotic, and a polymer such as PEG (polyethylene glycol) are fused, if the utility of the peptide obtained in the present invention is utilized, Included in the invention.
  • the present invention includes the use of the above-mentioned peptide of the present invention as an affinity ligand characterized by having affinity for immunoglobulin G or a fragment thereof as one of the embodiments.
  • an affinity separation matrix characterized in that the ligand is immobilized on a water-insoluble carrier is also included as one embodiment.
  • affinity ligand refers to a substance or function that selectively binds and collects a target molecule from a set of molecules based on the affinity between specific molecules typified by the binding of an antigen and an antibody. It is a term indicating a group, and in the present invention, it refers to a peptide that specifically binds to immunoglobulin G or a fragment thereof.
  • the expression “ligand” is also synonymous with “affinity ligand”.
  • Examples of the water-insoluble carrier used in the present invention include an inorganic carrier, an organic carrier, and a composite carrier such as an organic carrier-organic carrier or an organic carrier-inorganic carrier obtained by a combination thereof.
  • Examples of the inorganic carrier material include glass beads and silica gel.
  • Examples of organic carrier materials include synthetic polymers and polysaccharides. Synthetic polymers include crosslinked polyvinyl alcohol, crosslinked polyacrylate, crosslinked polyacrylamide, and crosslinked polystyrene. Polysaccharides include crystalline cellulose and crosslinked polymers. Cellulose, cross-linked agarose, cross-linked dextran and the like can be mentioned.
  • GCL2000 a porous cellulose gel
  • Sephacryl (registered trademark) S-1000 obtained by covalently crosslinking allyldextran and methylenebisacrylamide
  • Toyopearl registered trademark
  • an acrylate-based carrier an acrylate-based carrier
  • agarose-based crosslinking examples include Sepharose (registered trademark) CL4B, which is a carrier, and Cellufine (registered trademark), which is a cellulose-based crosslinked carrier.
  • the water-insoluble carrier in the present invention is not limited to these exemplified carriers.
  • the water-insoluble carrier used in the present invention desirably has a large surface area in view of the purpose and method of use of the affinity separation matrix of the present invention, and is preferably a porous material having a large number of pores of an appropriate size.
  • the form of the carrier can be any of beads, monoliths, fibers, membranes (including hollow fibers), and any form can be selected.
  • the ligand may be bound to the carrier by a conventional coupling method using an amino group, a carboxy group or a thiol group present in the ligand.
  • the carrier is activated by reacting the carrier with cyanogen bromide, epichlorohydrin, diglycidyl ether, tosyl chloride, tresyl chloride, hydrazine or sodium periodate, or the surface of the carrier.
  • the immobilization method include addition of a reagent having a plurality of functional groups in the molecule such as glutaraldehyde, condensation, and crosslinking.
  • a spacer molecule composed of a plurality of atoms may be introduced between the ligand and the carrier, or the ligand may be directly immobilized on the carrier. Therefore, the IgG-binding peptide according to the present invention may be chemically modified for immobilization, or an amino acid residue useful for immobilization may be added.
  • amino acids useful for immobilization include amino acids having functional groups useful for immobilization chemical reactions in the side chain, such as Lys containing an amino group in the side chain, and thiol groups in the side chain. Cys containing is mentioned.
  • the essence of the present invention is that the IgG binding property imparted to a peptide in the present invention is similarly imparted to a matrix in which the peptide is immobilized as a ligand, and how it is modified and altered for immobilization. However, it is included in the scope of the present invention.
  • Non-patent Document 1 Non-patent Document 1
  • the solution is passed through an affinity column packed with the affinity separation matrix of the present invention, and immunoglobulin G or a fragment thereof is passed through.
  • Adsorb Next, an appropriate amount of pure buffer is passed through the affinity column, and the inside of the column is washed.
  • the desired immunoglobulin G or fragment thereof is adsorbed to the affinity separation matrix of the present invention in the column.
  • the affinity separation matrix in which the peptide obtained in the present invention is immobilized as a ligand is excellent in the ability to adsorb and retain the target immunoglobulin G or a fragment thereof from the sample addition step to the matrix washing step.
  • an acidic buffer adjusted to an appropriate pH is passed through the column to elute the desired immunoglobulin G or a fragment thereof, thereby achieving high purity purification.
  • a substance that promotes dissociation from the matrix may be added to the acidic buffer used for elution.
  • the affinity separation matrix of the present invention can be reused by passing it through an appropriate strong acid or strongly alkaline pure buffer solution that does not completely impair the function of the ligand compound or the carrier substrate. It is.
  • an appropriate strong acid or strongly alkaline pure buffer solution that does not completely impair the function of the ligand compound or the carrier substrate. It is.
  • a solution containing an appropriate modifier and an organic solvent can also be used.
  • the present invention also relates to DNA encoding the above peptide.
  • the base sequence of such DNA can be determined, for example, by back-translating the amino acid sequence of the peptide.
  • the DNA encoding the peptide of the present invention may be any one as long as the amino acid sequence obtained by translating the base sequence constitutes the peptide.
  • Such a base sequence can be obtained by using a commonly used known method, for example, a polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as “PCR”) method. It can also be synthesized by a known chemical synthesis method, and can also be obtained from a DNA library.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the base sequence may not be the same as the original base sequence as long as the codon may be substituted with a degenerate codon and it encodes the same amino acid when translated.
  • Recombinant DNA having one or more of the base sequences, vectors such as plasmids and phages containing the recombinant DNA, and transformants transformed with the vector having the DNA, the DNA The introduced genetically modified organism or a cell-free protein synthesis system using the DNA as a template DNA for transcription can be obtained.
  • the IgG-binding peptide according to the present invention can be obtained as a fusion peptide with a known protein that has an advantage of assisting protein expression or facilitating purification. That is, a microorganism or cell containing at least one recombinant DNA encoding a fusion peptide containing the IgG-binding peptide according to the present invention can be obtained.
  • the protein include maltose binding protein (MBP) and glutathione-S-transferase (GST), but are not limited to these proteins.
  • site-specific mutations for modifying the DNA encoding the peptide of the present invention can be carried out using recombinant DNA techniques, PCR methods and the like as follows.
  • the introduction of mutations by recombinant DNA technology is performed, for example, when there are appropriate restriction enzyme recognition sequences on both sides of the target site where mutations are desired in the gene encoding the peptide of the present invention.
  • the recognition sequence can be cleaved with the restriction enzyme, and after removing the region containing the site desired to be mutated, the cassette mutation method can be used in which a DNA fragment mutated only at the desired site is inserted by chemical synthesis or the like. .
  • site-specific mutation by PCR for example, using a double-stranded plasmid encoding the peptide of the present invention as a template and two synthetic oligo primers containing mutations complementary to the + strand and the ⁇ strand.
  • the double primer method can be used.
  • a DNA encoding a multimeric peptide can also be prepared by linking a desired number of DNAs encoding the monomer peptide (one domain) in series.
  • an appropriate restriction enzyme site is introduced into the DNA sequence, and double-stranded DNA fragmented with the restriction enzyme can be ligated with DNA ligase.
  • the DNA encoding a multimeric peptide if the base sequences encoding each monomer peptide are the same, homologous recombination may be induced in the host.
  • sequence identity between the nucleotide sequences of DNA encoding the peptide is 90% or less, preferably 85% or less, more preferably 80% or less, and even more preferably 75% or less.
  • identity of the base sequence can be determined by a conventional method as in the case of the amino acid sequence.
  • the “expression vector” of the present invention includes a base sequence encoding the aforementioned peptide of the present invention or a partial amino acid sequence thereof, and a promoter operable in a host operably linked to the base sequence.
  • the gene encoding the peptide of the present invention can be obtained by linking or inserting into a suitable vector, and the vector for inserting the gene is not particularly limited as long as it can autonomously replicate in the host.
  • plasmid DNA or phage DNA can be used as a vector.
  • vectors such as pQE vectors (Qiagen), pET vectors (Merck), and pGEX vectors (GE Healthcare Bioscience) may be mentioned.
  • the transformed cell of the present invention can be obtained by introducing the recombinant vector of the present invention into a host cell.
  • methods for introducing recombinant DNA into a host include a method using calcium ions, an electroporation method, a spheroplast method, a lithium acetate method, an Agrobacterium infection method, a particle gun method, and a polyethylene glycol method.
  • examples of a method for expressing the function of the obtained gene in a host include a method for incorporating the gene obtained in the present invention into a genome (chromosome).
  • the host cell is not particularly limited, but for mass production at low cost, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Brevibacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Coryne Bacteria (eubacteria) such as Corynebacterium can be preferably used.
  • the IgG-binding peptide according to the present invention is obtained by culturing the above-described transformed cells in a medium and in the cultured cells (including the cell periplasm region) or in the culture solution (outside the cells). It can be produced by producing and accumulating protein and collecting the desired protein from the culture.
  • the peptide of the present invention comprises the peptide of the present invention in the cultured cells (including the periplasm region) or in the culture solution (outside the cells) by culturing the above-described transformed cells in a medium. It can be produced by producing and accumulating a fusion peptide, collecting the fusion peptide from the culture, cleaving the fusion peptide with an appropriate protease, and collecting the desired peptide.
  • the method of culturing the transformed cell of the present invention in a medium is performed according to a usual method used for host culture.
  • the medium used for culturing the obtained transformant is not particularly limited as long as it can produce the peptide of the present invention with high efficiency and high yield.
  • carbon sources and nitrogen sources such as glucose, sucrose, glycerol, polypeptone, meat extract, yeast extract, and casamino acid can be used.
  • inorganic salts such as potassium salt, sodium salt, phosphate, magnesium salt, manganese salt, zinc salt, iron salt and the like are added as necessary.
  • an auxotrophic host cell a nutrient substance required for growth may be added. If necessary, antibiotics such as penicillin, erythromycin, chloramphenicol, neomycin may be added.
  • protease inhibitors ie, phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF), benzamideline, 4- (2-aminoethyl) -benzonesulfonyl. Fluoride (AEBSF), Antipain, Chymostatin, Leupeptin, Pepstatin A, Phosphoramidon, Aprotinin, Ethylenediaminetic acid acid (EDTA) and / or other commercially available protease inhibitors may be used.
  • molecular chaperones such as GroEL / ES, Hsp70 / DnaK, Hsp90, Hsp104 / ClpB may be used.
  • Such a molecular chaperone is allowed to coexist with the peptide of the present invention by a technique such as co-expression or fusion proteinization.
  • there are techniques such as adding an additive that promotes correct folding to the medium and culturing at a low temperature, but it is not limited thereto. Absent.
  • LB medium tryptone 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 1%) or 2xYT medium (tryptone 1.6%, yeast extract 1. 0%, NaCl 0.5%) and the like.
  • the culture temperature is, for example, 15 to 42 ° C., preferably 20 to 37 ° C.
  • the peptide of the present invention is cultured aerobically under aeration and stirring conditions for several hours to several days. Or accumulated in a culture solution (extracellular) and collected. In some cases, the culture may be performed anaerobically by blocking aeration.
  • the assembly produced by separating the cultured cell and the supernatant containing the secreted peptide by a general separation method such as centrifugation or filtration after the completion of the culture. The replacement peptide can be recovered.
  • the cells when accumulated in cultured cells (including in the periplasm region), for example, the cells are collected from the culture solution by a method such as centrifugation or filtration, and then the cells are sonicated.
  • the peptide accumulated and produced in the cells can be recovered by crushing by a French press method and / or solubilizing by adding a surfactant or the like.
  • the peptide according to the present invention can be purified by affinity chromatography, cation or anion exchange chromatography, gel filtration chromatography or the like alone or in appropriate combination. Confirmation that the obtained purified substance is the target peptide can be carried out by usual methods such as SDS polyacrylamide gel electrophoresis, N-terminal amino acid sequence analysis, Western blotting and the like.
  • Example 1 Preparation of IgG-binding peptide (1) Preparation of expression plasmid for IgG-binding peptide Peptides (SEQ ID NOs: 5 to 7) in which two amino acid sequences of IgG-binding peptides shown in SEQ ID NOs: 2 to 4 were linked were evaluated. Used for. The purpose of linking the two amino acid sequences is to increase the molecular weight of the peptide so that the expression in E. coli is good and the analysis by SDS-PAGE is facilitated.
  • the synthesized and extracted double-stranded DNA was cleaved with restriction enzymes SpeI and XhoI (both from Takara Bio Inc.).
  • double-stranded DNA treated with restriction enzymes was subcloned into the SpeI / XhoI sites in the multicloning site of the plasmid vector pET-49b (+) (Merck Millipore).
  • the ligation reaction in subcloning was performed using Ligation High Ver. 2 (TOYOBO) was used in accordance with the protocol attached to the product.
  • transformation of competent cells DH5 ⁇ was performed according to the protocol attached to this competent cell product.
  • a plasmid purification kit (“Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System” manufactured by Promega) according to the standard protocol attached to the kit, the transformed cells were cultured, and plasmid DNA was amplified and extracted. Confirmation of the base sequence of the coding DNA of the expression plasmid was carried out using a DNA sequencer (“3130xl Genetic Analyzer” manufactured by Applied Biosystems).
  • a sequencing PCR reaction was performed using a gene analysis kit ("BigDye Terminator v.1.1 Cycle Sequencing Kit” manufactured by Applied Biosystems) and a DNA primer for sequencing (SEQ ID NO: 13) according to the attached protocol.
  • the sequencing product was purified using a plasmid purification kit Applied Biosystems "BigDye XTerminator Purification Kit") according to the attached protocol, and used for base sequence analysis.
  • Competent cells BL21 (DE3) (Biodynamics) were transformed with the expression plasmid whose base sequence of the coding DNA was confirmed, and transformed cells for expression of various IgG binding peptides were prepared.
  • the GST fusion peptide was roughly purified from each cell-free extract containing the GST fusion peptide by affinity chromatography using a GSTrap HP column (GE Healthcare Bioscience) having affinity for GST. Each cell-free extract is added to the GSTRap HP column, and the column is washed with a standard buffer (20 mM NaH 2 PO 4 -Na 2 HPO 4 , 150 mM NaCl, pH 7.4), followed by an elution buffer ( The target GST fusion peptide was eluted with 50 mM Tris-HCl, 20 mM glutathione, pH 8.0).
  • an amino acid sequence of Ile-Glu-Gly-Arg is added between the N-terminus of the target peptide sequence and GST.
  • This amino acid sequence is a recognition sequence for the sequence-specific protease Factor Xa (Merck Millipore). When this protease is acted on, it is cleaved after Arg. Therefore, the N-terminal vector-derived sequence containing GST is cleaved. Can be removed.
  • the eluate containing the GST fusion peptide was dialyzed against Factor Xa digestion buffer (20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl 2 , pH 8.0), and an enzyme reaction was performed according to the attached protocol.
  • the target peptide was purified from this reaction solution by gel filtration chromatography using a Superdex 75 10/300 GL column (GE Healthcare Bioscience). Each reaction solution was added to a Superdex 75 10/300 GL column equilibrated with a standard buffer, and the target peptide was separated and purified from the cleaved GST-containing vector-derived sequence and Factor Xa. In addition, the peptide purification by chromatography using the above columns was all performed using the AKTAprime plus system (GE Healthcare Bioscience).
  • Comparative Example 1 IgG binding peptide described in Patent Document 7
  • a peptide (SEQ ID NO: 15) in which two amino acid sequences of IgG binding peptide represented by SEQ ID NO: 14 were linked was used for evaluation.
  • the base sequence (SEQ ID NO: 16) of the coding DNA was designed in the same manner as in Example 1, and expression / purification was carried out from plasmid preparation, whereby the IgG-binding peptide described in Patent Document 7 was obtained.
  • Example 2 Alkali tolerance evaluation of IgG-binding peptides (1) Alkaline treatment of IgG-binding peptides Each peptide purified in Example 1 or Comparative Example 1 was diluted with ultrapure water and adjusted to a concentration of 10 mg / mL. did. 10 ⁇ L of the peptide solution and 10 ⁇ L of 30 mM NaOH were mixed and incubated at 25 ° C. for 14 hours (the final concentration was 5 mg / mL of each peptide treated with 15 mM NaOH). Thereafter, 50 mM acetate buffer (pH 3.0, 6 ⁇ L) was added for neutralization.
  • 50 mM acetate buffer pH 3.0, 6 ⁇ L
  • lanes 1 and 2 were SEQ ID NO: 15 of Comparative Example 1
  • lanes 3 and 4 were SEQ ID NO: 5
  • lanes 5 and 6 were SEQ ID NO: 6
  • lanes 7 and 8 were SEQ ID NO: 7.
  • the odd number is a sample before alkali treatment and the even number is a sample after alkali treatment.
  • the band of the peptide of Comparative Example 1 was almost entirely smeared and shifted upward after the alkali treatment, and the band at the same position was not visible.
  • a band remained at the same position even after the alkali treatment.
  • the peptides of SEQ ID NOs: 6 to 7 are considered to be at a level where only a part of the peptide is smeared and a band exists at almost the same intensity at the same position and can be treated with alkali.

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Abstract

本発明は、アルカリなどに対する化学安定性が高いペプチドを提供することを目的とする。また、本発明は、当該ペプチドをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、および当該ベクターにより形質転換された形質転換体を提供することも目的とする。免疫グロブリンＧ結合性ペプチドに対して、適切な部位に変異を導入したペプチドをアフィニティ・リガンドとして利用することで、上記課題を解決する。

Description

免疫グロブリンＧ結合性ペプチド
　本発明は、アルカリなどに対する化学的安定性が向上した免疫グロブリンＧ結合性ペプチド、当該ペプチドをリガンドとして有するアフィニティ分離マトリックス、当該アフィニティ分離マトリックスを用いる免疫グロブリンＧまたはその断片の製造方法、当該ペプチドをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、および当該ベクターにより形質転換された形質転換体に関するものである。
　タンパク質の重要な機能の一つとして、特定の分子に特異的に結合する機能が挙げられる。この機能は、生体内における免疫反応やシグナル伝達に重要な役割を果たす。治療・検査などの様々な用途で、この機能を利用した技術開発がなされている。特定の分子に特異的に結合するタンパク質として最も産業利用されているものの１つに抗体が挙げられる。そして、抗原抗体反応とは別の様式で様々な抗体に特異的に結合するタンパク質も、抗体の検出や分離精製に利用できるため、産業的価値は極めて高い。
　産業的に利用される抗体は、基本的に免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である。ＩｇＧ結合性タンパク質としては、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＨおよびプロテインＬと呼ばれる細菌の細胞壁タンパク質がよく知られており（非特許文献１）、実際に産業的に利用されている一例として、抗体医薬を動物細胞培養物から一度に高い純度でキャプチャリングして精製するために利用されるプロテインＡアフィニティ分離マトリックス（以下、プロテインＡを「ＳｐＡ」と略記する場合がある）が挙げられる（非特許文献２，３）。
　プロテインＡの場合には、部位特異的に変異を導入し、アフィニティ分離マトリックス用リガンドとしての機能を改良するタンパク工学研究が盛んに進められており（非特許文献１，４，特許文献１～６）、例えば、ＳｐＡアフィニティ分離マトリックスの洗浄に広く用いられる水酸化ナトリウム溶液に対する化学的安定性の向上を目的とした研究行われている。具体的には、アルカリ性条件下で脱アミド化反応を受け易いことが知られるアスパラギン残基、および、アスパラギン残基の後ろのグリシン残基へのアミノ酸置換変異が化学的安定性の向上に効果がある。しかし、ＳｐＡ中の全てのアスパラギン残基に関し、このような変異がアルカリ耐性向上効果を示すわけではない（非特許文献４）。
　プロテインＧでも、Ｆｃ領域とＦａｂ領域の両方に結合性を示す改変型プロテインＧが開発されているが（特許文献７）、更に、化学的安定性が高いプロテインＧも求められている。
米国特許第５１４３８４４号公報 特表２００６－３０４６３３号公報 欧州特許第１１２３３８９号公報 国際公開第０３／０８０６５５号パンフレット 米国公開第２００６／０１９４９５０号公報 国際公開第２０１１／１１８６９９号パンフレット 国際公開第２０１６／０３１９０９号パンフレット
Nezlin R．ら，Adv．Immunol．，2004，vol．82，pp．155-215 Hober S．ら，J．Chromatogr．B，2007，848巻，40-47頁 Shukla A．A．ら，Trends Biotechnol．，2010，28巻，253-261頁 Linhult M. ら, PROTEINS, 2004, 55巻, 407-416頁
　本発明は、アルカリなどに対する化学的安定性が向上したペプチドを提供することを目的とする。また、本発明は、当該ペプチドをリガンドとして有するアフィニティ分離マトリックス、当該アフィニティ分離マトリックスを用いる免疫グロブリンＧまたはその断片の製造方法、当該ペプチドをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、および当該ベクターにより形質転換された形質転換体を提供することも目的とする。
　本発明者は、上記課題を解決するために、特許文献２に記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチドに新たな変異を導入したペプチドを設計し、タンパク質工学的手法および遺伝子工学的手法を用いて該変異ペプチドを形質転換細胞から取得し、取得した該変異ペプチドの物性を比較する検討を行った。
　以下、その結果として完成した本発明を示す。
　［１］　下記アミノ酸配列（配列番号１）、または、下記アミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有することを特徴とする免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
　Ｘａａ1－Ｘａａ2－Ｔｙｒ－Ｘａａ4－Ｌｅｕ－Ｘａａ6－Ｘａａ7－Ｘａａ8－Ｇｌｙ－Ｘａａ10－Ｔｈｒ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ｘａａ18－Ｉｌｅ－Ａｌａ－Ｘａａ21－Ａｓｐ－Ａｌａ－Ｘａａ24－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｘａａ28－Ｘａａ29－Ｌｅｕ－Ｘａａ31－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ａｌａ－Ｘａａ35－Ａｓｐ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｘａａ39－Ｘａａ40－Ｇｌｙ－Ｘａａ42－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ａｓｐ－Ｘａａ47－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｘａａ50－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｖａｌ－Ｔｈｒ－Ｘａａ56（配列番号１）
　式中、
　Ｘａａ1＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
　Ｘａａ2＝Ｌｙｓ、ＴｈｒまたはＡｒｇ
　Ｘａａ4＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
　Ｘａａ6＝ＩｌｅまたはＶａｌ
　Ｘａａ7＝ＬｅｕまたはＩｌｅ
　Ｘａａ8＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、ＧｌｎまたはＶａｌ
　Ｘａａ10＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
　Ｘａａ18＝ＴｈｒまたはＡｌａ
　Ｘａａ21＝Ａｓｐ、ＡｌａまたはＰｒｏ
　Ｘａａ24＝ＡｌａまたはＧｌｕ
　Ｘａａ28＝Ｌｙｓ、ＩｌｅまたはＡｒｇ
　Ｘａａ29＝ＶａｌまたはＡｌａ
　Ｘａａ31＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
　Ｘａａ35＝Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＴｙｒ
　Ｘａａ39＝ＶａｌまたはＩｌｅ
　Ｘａａ40＝ＡｓｐまたはＧｌｕ
　Ｘａａ42＝Ｇｌｕ、ＶａｌまたはＭｅｔ
　Ｘａａ47＝Ａｓｐ、ＡｌａまたはＰｒｏ
　Ｘａａ50＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
　Ｘａａ56＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
　［２］　Ｘａａ2がＴｈｒである上記［１］に記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
　［３］　Ｘａａ4がＡｒｇである上記［１］または［２］に記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
　［４］　Ｘａａ6がＩｌｅである上記［１］～［３］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
　［５］　Ｘａａ7がＬｅｕである上記［１］～［４］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
　［６］　Ｘａａ8がＬｙｓ、ＬｅｕまたはＡｓｎである上記［１］～［５］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
　［７］　Ｘａａ10がＡｒｇである上記［１］～［６］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
　［８］　Ｘａａ18がＡｌａである上記［１］～［７］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
　［９］　Ｘａａ24がＡｌａである上記［１］～［８］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
　［１０］　Ｘａａ29がＶａｌである上記［１］～［９］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
　［１１］　Ｘａａ31がＡｒｇである上記［１］～［１０］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
　［１２］　Ｘａａ35がＰｈｅまたはＡｓｎである上記［１］～［１１］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
　［１３］　Ｘａａ40がＡｓｐである上記［１］～［１２］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
　［１４］　Ｘａａ42がＧｌｕである上記［１］～［１３］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
　［１５］　Ｘａａ50がＡｒｇである上記［１］～［１４］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
　［１６］　Ｘａａ4、Ｘａａ10、Ｘａａ31およびＸａａ50がＡｒｇである上記［１］～［１５］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
　［１７］　上記［１］～［１６］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチドを２個以上有することを特徴とする免疫グロブリンＧ結合性ペプチド多量体。
　［１８］　上記［１］～［１６］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド、または上記［１７］に記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド多量体、および水不溶性担体を有し、免疫グロブリンＧ結合性ペプチドまたは免疫グロブリンＧ結合性ペプチド多量体がリガンドとして水不溶性担体に固定化されたものであることを特徴とするアフィニティ分離マトリックス。
　［１９］　免疫グロブリンＧまたはその断片を製造する方法であって、
　上記［１８］に記載のアフィニティ分離マトリックスと、免疫グロブリンＧまたはその断片を含む液体試料とを接触させる工程、および、
　アフィニティ分離マトリックスに結合した免疫グロブリンＧまたはその断片を、アフィニティ分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。
　［２０］　上記［１］～［１６］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド、または上記［１７］に記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド多量体をコードすることを特徴とするＤＮＡ。
　［２１］　上記［２０］に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。
　［２２］　上記［２１］に記載のベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
　本発明で得られた免疫グロブリンＧ結合性ペプチドを固定化したアフィニティ精製用クロマトグラフィ担体は、アルカリ処理のダメージによる免疫グロブリン結合活性の低下が少ない。よって、繰返し使用に際して、高濃度または長時間での水酸化ナトリウム水溶液を用いた洗浄が可能となる。
各種ペプチドのアルカリ処理前後のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を示した図である。
　本発明において「ペプチド」という用語は、ペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものとする。本発明に係る免疫グロブリンＧ結合性ペプチドは、その必須構造を構成するアミノ酸の数から、一般的には「タンパク質」または「（タンパク質の）ドメイン」と呼ばれることもある。
　「免疫グロブリン」は、リンパ球のＢ細胞が産生する糖タンパク質であり、特定のタンパク質などの分子を認識して結合する働きを持つ。免疫グロブリンは、かかる特定の分子（抗原）に特異的に結合する機能に加えて、他の生体分子や細胞と協同して抗原を含む因子を無毒化・除去する機能も有する。免疫グロブリンは、一般的に「抗体」と呼ばれるが、それはこのような機能に着目した名称である。全ての免疫グロブリンは、基本的には同じ分子構造を有し、軽鎖および重鎖のポリペプチド鎖それぞれ２本ずつからなる“Ｙ”字型の４本鎖構造を基本構造としている。軽鎖（Ｌ鎖）にはλ鎖とκ鎖の２種類があり、すべての免疫グロブリンはこのどちらかを持つ。重鎖（Ｈ鎖）には、γ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖、ε鎖という構造の異なる５種類があり、この重鎖の違いによって免疫グロブリンの種類（アイソタイプ）が変わる。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、単量体型の免疫グロブリンで、２本の重鎖（γ鎖）と２本の軽鎖から構成され、２箇所の抗原結合部位を持っている。
　免疫グロブリンの“Ｙ”字の下半分の縦棒部分にあたる場所をＦｃ領域と呼び、上半分の“Ｖ”字の部分をＦａｂ領域と呼ぶ。Ｆｃ領域は抗体が抗原に結合した後の反応を惹起するエフェクター機能を有し、Ｆａｂ領域は抗原と結合する機能を有する。重鎖のＦａｂ領域とＦｃ領域はヒンジ部でつながっており、パパイヤに含まれるタンパク分解酵素パパインは、このヒンジ部を分解して２つのＦａｂ領域と１つのＦｃ領域に切断する。Ｆａｂ領域のうち“Ｙ”字の先端に近い部分は、多様な抗原に結合できるように、アミノ酸配列に多彩な変化が見られるため可変領域（Ｖ領域）と呼ばれている。軽鎖の可変領域をＶＬ領域、重鎖の可変領域をＶＨ領域と呼ぶ。Ｖ領域以外のＦａｂ領域とＦｃ領域は、比較的変化の少ない領域であり定常領域（Ｃ領域）と呼ばれる。軽鎖の定常領域をＣＬ領域と呼び、重鎖の定常領域をＣＨ領域と呼ぶが、ＣＨ領域はさらにＣＨ１～ＣＨ３の３つに分けられる。重鎖のＦａｂ領域はＶＨ領域とＣＨ１からなり、重鎖のＦｃ領域はＣＨ２とＣＨ３からなる。ヒンジ部はＣＨ１とＣＨ２の間に位置する。
　本発明に係るＩｇＧ結合性ペプチドは、下記アミノ酸配列（配列番号１）、または、下記アミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有することを特徴とする。
　Ｘａａ1－Ｘａａ2－Ｔｙｒ－Ｘａａ4－Ｌｅｕ－Ｘａａ6－Ｘａａ7－Ｘａａ8－Ｇｌｙ－Ｘａａ10－Ｔｈｒ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ｘａａ18－Ｉｌｅ－Ａｌａ－Ｘａａ21－Ａｓｐ－Ａｌａ－Ｘａａ24－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｘａａ28－Ｘａａ29－Ｌｅｕ－Ｘａａ31－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ａｌａ－Ｘａａ35－Ａｓｐ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｘａａ39－Ｘａａ40－Ｇｌｙ－Ｘａａ42－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ａｓｐ－Ｘａａ47－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｘａａ50－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｖａｌ－Ｔｈｒ－Ｘａａ56（配列番号１）
　式中、
　Ｘａａ1＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
　Ｘａａ2＝Ｌｙｓ、ＴｈｒまたはＡｒｇ
　Ｘａａ4＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
　Ｘａａ6＝ＩｌｅまたはＶａｌ
　Ｘａａ7＝ＬｅｕまたはＩｌｅ
　Ｘａａ8＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、ＧｌｎまたはＶａｌ
　Ｘａａ10＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
　Ｘａａ18＝ＴｈｒまたはＡｌａ
　Ｘａａ21＝Ａｓｐ、ＡｌａまたはＰｒｏ
　Ｘａａ24＝ＡｌａまたはＧｌｕ
　Ｘａａ28＝Ｌｙｓ、ＩｌｅまたはＡｒｇ
　Ｘａａ29＝ＶａｌまたはＡｌａ
　Ｘａａ31＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
　Ｘａａ35＝Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＴｙｒ
　Ｘａａ39＝ＶａｌまたはＩｌｅ
　Ｘａａ40＝ＡｓｐまたはＧｌｕ
　Ｘａａ42＝Ｇｌｕ、ＶａｌまたはＭｅｔ
　Ｘａａ47＝Ａｓｐ、ＡｌａまたはＰｒｏ
　Ｘａａ50＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
　Ｘａａ56＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
　本発明に係る免疫グロブリンＧ結合性ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列、または、配列番号１のアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列であってもよいし、これらアミノ酸配列に加えて他のアミノ酸配列を含むものであってもよいし、或いは他の化合物が結合しているものであってもよい。他のアミノ酸配列としては、例えば、後述するペプチド多量体において各ドメインを結合するリンカーペプチド、機能の異なる他のペプチド、水不溶性担体に本発明ペプチドを結合させるためのリンカーペプチドなどを挙げることができる。
　本発明に係る免疫グロブリンＧ結合性ペプチドは、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に対して高い結合能を示し、免疫グロブリンＧのＦｃ領域とＦａｂ領域の両方に対して高い結合能を示し得る。具体的には、免疫グロブリンＧのＦｃ領域およびＦａｂ領域に対する各々の結合力が、結合定数（ＫA）にしてＫA＝１０6［１／Ｍ］以上である。
　本発明に係るＩｇＧ結合性ペプチドの、免疫グロブリンＧのＦｃ領域およびＦａｂ領域に対する結合力（親和性）は、例えば、表面プラズモン共鳴原理を用いたＢｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）などのバイオセンサーによって試験することができるが、これに限定されるものではない。
　免疫グロブリンＧのＦｃ領域およびＦａｂ領域に対する結合性の測定条件としては、免疫グロブリンＧのＦｃ領域およびＦａｂ領域それぞれに結合した時の結合シグナルが検出できればよく、２０～４０℃の一定温度にてｐＨ６～８の中性条件にて測定することで簡単に評価することができる。
　結合相手の免疫グロブリンＧ分子は、Ｆｃ領域またはＦａｂ領域への結合が検出できれば特に限定はされない。しかし、両方を含む免疫グロブリンＧ分子を用いた場合には、２つの領域への結合を区別して検出することが難しいので、Ｆｃ領域かＦａｂ領域のどちらかのみを含む断片化ＩｇＧを用いることが好ましい。
　結合パラメータとしては、例えば、親和定数（ＫA）や解離定数（ＫD）を用いることができる（永田ら，「生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法」，シュプリンガー・フェアラーク東京，１９９８年，４１頁）。本発明に係るペプチドとＦｃ断片またはＦａｂ断片との親和定数は、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを利用して、センサーチップにＦｃ断片またはＦａｂ断片を固定化して、温度２５℃、ｐＨ７．４の条件下にて、本発明で得られたペプチドを流路に添加する実験系で求めることができる。
　本発明に係るＩｇＧ結合性ペプチドは、Ｆｃ断片に対する結合定数ＫAがオーダーにして１０の６乗以上で、かつ、Ｆａｂ断片に対する結合定数ＫAもオーダーにして１０の６乗以上であり、さらに好ましくは、Ｆｃ断片に対する結合定数とＦａｂ断片に対する結合定数が同じオーダーである。別の側面からは、Ｆａｂ断片に対する結合定数がＦｃ断片に対する結合定数よりも１０倍を超えない程度に強いことが、さらにより好ましい。
　本発明に係るＩｇＧ結合性ペプチドに関し、配列同一性としては、９５％以上または９６％以上が好ましく、９７％以上または９８％以上がさらに好ましく、９９％以上または９９．５％以上がさらにより好ましく、９９．８％以上が特に好ましい。配列同一性は、アミノ酸配列多重アラインメント用プログラムであるＣｌｕｓｔａｌ（http://www.clustal.org/omega/）などを使って測定することができる。また、上記範囲内でアミノ酸配列の一部が変異しても、配列番号１のアミノ酸配列の特定位置に対応するアミノ酸残基は、当業者であればアライメント解析ソフトを用いて容易に求めることができる。
　本発明に係る配列番号１のアミノ酸配列において、Ｆａｂ領域およびＦｃ領域に対する結合性の観点から、第２位がＴｈｒ、第６位がＩｌｅ、第７位がＬｅｕ、第１８位がＡｌａ、第２４位がＡｌａ、第２９位がＶａｌ、第４０位がＡｓｐおよび／または第４２位がＧｌｕであることが好ましい。また、第１３位がＴｈｒ、第１５位がＴｙｒ、第１９位がＩｌｅ、第３０位がＬｅｕおよび／または第３３位がＰｈｅであることも好ましい。同様の観点から、第３５位はＡｓｎまたはＰｈｅであることが好ましく、Ｐｈｅであることがより好ましい。
　本発明によって得られたＩｇＧ結合性ペプチドは、後記の実施例において確かめられている通り、アルカリ性水溶液で処理（浸潤）した後の、アルカリによるダメージがより少なく、結合性能を高いレベルで維持している。
　「アルカリ性水溶液」とは、洗浄または殺菌の目的を達成し得る程度のアルカリ性を指す。より具体的には、０．０１Ｍ以上、１．０Ｍ以下、または０．０１Ｎ以上、１．０Ｎ以下の水酸化ナトリウム水溶液などが該当するが、これに限定されるものではない。水酸化ナトリウムを例とした場合、その濃度の下限は、０．０１Ｍが好ましく、０．０２Ｍがより好ましく、０．０５Ｍがさらにより好ましい。一方、水酸化ナトリウムの濃度の上限は、１．０Ｍが好ましく、０．５Ｍがより好ましく、０．３Ｍがさらにより好ましく、０．２Ｍがさらにより好ましく、０．１Ｍがさらにより好ましい。アルカリ性水溶液としては、水酸化ナトリウム水溶液である必要はないが、そのｐＨは１２以上、１４以下が好ましい。ｐＨの下限に関し、ｐＨ１２．０以上が好ましく、ｐＨ１２．５以上がより好ましい。ｐＨの上限に関し、ｐＨ１４以下が好ましく、ｐＨ１３．５以下がさらにより好ましく、ｐＨ１３．０以下がさらにより好ましい。
　「化学的安定性」とは、タンパク質がアミノ酸残基の化学変化などの化学修飾、および、アミド結合の転移や切断などの化学変性に対して、タンパク質の機能を保持する性質を指す。本発明においては、タンパク質の機能保持とは、ＩｇＧへの結合活性（化学変性を受けずに親和性を保持しているポリペプチドの割合）の維持を指すものであり、すなわち、「化学的安定性」が高い程、アルカリ性水溶液への浸漬処理の後も、ＩｇＧへの結合活性が低下する度合いが小さい。ＶＬ－κへの結合活性は、具体的には、化学変性を受けずにＶＬ－κへの親和性を保持しているポリペプチドの割合をいう。なお、本明細書中における「アルカリ耐性」という用語も、「アルカリ性条件下における化学的安定性」と同義である。
　アルカリに浸漬する時間は、アルカリの濃度や浸漬時の温度によってペプチドの受けるダメージは大きく異なるので、特に限定はされない。例えば、水酸化ナトリウムの濃度が０．０５Ｍで、浸漬時の温度が室温の場合、アルカリに浸漬する時間の下限は、１時間が好ましく、２時間がより好ましく、４時間がより好ましく、１０時間がより好ましく、２０時間がより好ましいが、特に限定はされない。上記時間の上限も特に限定されないが、例えば５０時間とすることができる。
　ＩｇＧに対する親和性は、表面プラズモン共鳴原理を用いたＢｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥヘルスケア社）や、バイオレイヤー干渉法を用いたＯｃｔｅｔ（ポール社）などのバイオセンサーによって試験することができるが、これに限定されるものではない。測定条件としては、本発明のペプチドがＩｇＧに結合した時の結合シグナルが検出できれば良い。測定条件としては、温度は２０～４０℃の一定温度にし、結合状態を見るときのｐＨはｐＨ５～８の中性条件にすることが好ましい。緩衝液の成分としては、中性の場合には、リン酸、トリス、ビストリスなどが挙げられるが、これらに限定されない。緩衝液の塩化ナトリウム濃度は、特に限定はされないが、０～０．１５Ｍ程度が好ましい。
　ＩｇＧに結合していることを示すパラメータとしては、例えば、親和定数（ＫA）や解離定数（ＫD）を用いることができる（永田他　著，「生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法」，シュプリンガー・フェアラーク東京，１９９８年，４１頁）。本発明のタンパク質のＩｇＧに対する親和定数は、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを利用して、センサーチップにヒトＩｇＧを固定化して、温度２５℃、ｐＨ７．４の条件下にて、各ドメイン変異体を流路添加する実験系で求めることができる。本発明に係るタンパク質について、ヒトＩｇＧへの親和定数（ＫA）が好ましくは１×１０5（Ｍ-1）以上、より好ましくは１×１０6（Ｍ-1）以上であるタンパク質を好適に用いることができる。しかし、親和定数は、ＩｇＧ結合性ペプチドの種類やドメイン数によっても変わるので、これに限定されない。
　ただし、アルカリ処理後の残存結合活性を求める場合には、結合パラメータとして、ＫAやＫDは不適切である。アルカリ処理によって、ＩｇＧに結合できる分子の比率が変化しても、ペプチド１分子のＩｇＧに対する結合能は変化しない場合には、パラメータとしては変化が見られないからである。ペプチドの残存結合活性を求める場合には、例えば、ペプチドを、センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）またはバイオセンサー（Ｏｃｔｅｔ）に固定化し、ペプチドを化学処理する前と後で、同一濃度のＩｇＧを添加したときの、結合レスポンスの大きさを指標とするのが良い。結合レスポンスの大きさを示す単位は、Ｂｉａｃｏｒｅではレゾナンスユニット（ＲＵ）であり、Ｏｃｔｅｔではナノメートル（ｎｍ）であるが、これらに限定されるものではない。例えば、ＩｇＧを固定化した系に対し、同じ濃度のアルカリ処理していないペプチドとアルカリ処理したペプチドを添加して、結合レスポンスの大きさを比較しても良い。
　残存結合活性は、アルカリ処理前後の比較なので、基本的には、アルカリ処理前の結合活性を分母とし、アルカリ処理後の結合活性を分子とする、比率（パーセンテージ）で表すことができる。その数値は、同じ条件でアルカリ処理した本発明の変異が導入されていないペプチドと比較して高ければ、特に限定はされないが、その比率が５％以上であるのが好ましく、１０％以上であるのが好ましく、２０％以上であるのがより好ましく、３０％以上であるのがさらにより好ましく、４０％以上であるのがさらにより好ましく、５０％以上であるのがさらにより好ましい。上記比率の上限は、勿論１００％が好ましい。
　また、アルカリに対する化学的安定性は、ＩｇＧへの結合性以外に、ポリペプチド物質自体の安定性を指標としても良い。例えば、電気泳動法によって、アルカリ処理前後のポリペプチドの泳動バンドを比較することで、アルカリ性条件下における化学的安定性を評価することが可能である。具体的には、ごく一般的なＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、目的のペプチドのバンドがアルカリ処理の前後で変化しないことを目視で確認することによって評価することが可能である。分解によって低分子量側にバンドが現れたり、化学修飾によって高分子量側にバンドがスメア化するなどの変化が、抑えられていれば、化学的な安定性が高いと言える。デンシトメトリーによるバンド解析によって比較することも可能であり、その場合のバンドの濃さを示す数値によって、上述の残存結合活性と同様の評価が可能である。
　本発明に係る配列番号１のアミノ酸配列において、アルカリに対する化学的安定性の観点からは、第４位、第１０位、第３１位および／または第５０位はＡｒｇであることが好ましく、これらのアミノ酸残基の２つ以上がＡｒｇであることがより好ましく、３つ以上がＡｒｇであることがさらにより好ましく、全てがＡｒｇであることが最も好ましい。第８位についてはＬｙｓ、ＬｅｕまたはＡｓｎであることが好ましく、ＬｙｓまたはＬｅｕであることがより好ましい。
　本発明に係るＩｇＧ結合性ペプチドは、実施形態の１つとして、上記アミノ酸配列に対して、１または数個のアミノ酸が付加されても本発明に含まれる。
　付加される部位としては、Ｎ末端および／またはＣ末端が好ましい。前記「１または数個」の範囲は、例えば、１個以上、３０個以下とすることができ、好ましくは１個以上、２０個以下、より好ましくは１個以上、１０個以下、さらに好ましくは１個以上、７個以下、一層好ましくは１個以上、５個以下、特に好ましくは１個以上、３個以下、１個もしくは２個、または１個程度であることができる。いずれにしても、本発明のアミノ酸配列を含有する場合には、本発明に含まれる。実施形態の１つとして、Ｎ末端および／またはＣ末端のアミノ酸（Ｘａａ1またはＸａａ56）が欠失されていても、本発明に含まれる。
　本発明に係るＩｇＧ結合性ペプチドは、実施形態の１つとして、当該ペプチドを単ドメインとして、その単ドメインが２個以上、好ましくは３個以上、より好ましくは４個以上、さらに好ましくは５個以上連結された複数ドメインの多量体であってもよい。連結されるドメイン数の上限としては、１０個以下が好ましく、８個以下がより好ましく、６個以下がさらに好ましい。これらの多量体は、単一のＩｇＧ結合性ペプチドの連結体であるホモダイマー、ホモトリマー等のホモポリマーであってもよいし、複数種類のＩｇＧ結合性ペプチドの連結体であるヘテロダイマー、ヘテロトリマー等のヘテロポリマーであってもよい。
　本発明によって得られる単量体ペプチドの連結のされ方としては、１または複数のアミノ酸残基で連結する方法、および、アミノ酸残基を挟まず直接連結する方法が挙げられるが、これらの方法に限定されるものではない。連結のためのアミノ酸残基数に特に制限は無いが、好ましくは２０残基以下であり、より好ましくは１５残基以下であり、さらにより好ましくは１０残基以下であり、さらにより好ましくは５残基以下であり、さらにより好ましくは２残基以下である。また、別の観点からは、単量体ペプチドの３次元立体構造を不安定化しないものが好ましい。
　また、実施形態の１つとして、本発明に係るＩｇＧ結合性ペプチドが、１つの構成成分として、機能の異なる他のペプチドと融合されていることを特徴とする融合ペプチドが挙げられる。融合ペプチドの例としては、アルブミンやＧＳＴ（グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ）が融合したペプチドを例として挙げることができるが、これに限定されるものではない。また、ＤＮＡアプタマーなどの核酸、抗生物質などの薬物、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などの高分子が融合されている場合も、本発明で得られたペプチドの有用性を利用するものであれば、本発明に包含される。
　本発明は、上記の本発明ペプチドを、免疫グロブリンＧまたはその断片に親和性を有することを特徴とするアフィニティリガンドとして利用することも、実施形態の１つとして包含する。同様に、当該リガンドを水不溶性担体に固定化したことを特徴とするアフィニティ分離マトリックスも、実施形態の１つとして包含する。ここで「アフィニティリガンド」とは、抗原と抗体の結合に代表される特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から目的の分子を選択的に結合して捕集する物質や官能基を指す用語であり、本発明においては、免疫グロブリンＧまたはその断片に対して特異的に結合するペプチドを指す。本発明においては、単に「リガンド」と表記した場合も、「アフィニティリガンド」と同意である。
　本発明に用いる水不溶性担体としては、無機担体、有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機担体－有機担体、有機担体－無機担体などの複合担体などが挙げられる。無機担体の材料としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどが挙げられる。有機担体の材料としては合成高分子や多糖類などが挙げられ、合成高分子としては架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどが挙げられ、多糖類としては結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどが挙げられる。市販品としては、多孔質セルロースゲルであるＧＣＬ２０００、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したＳｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）　Ｓ－１０００、アクリレート系の担体であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）、アガロース系の架橋担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）　ＣＬ４Ｂ、および、セルロース系の架橋担体であるＣｅｌｌｕｆｉｎｅ（登録商標）などを例示することができる。但し、本発明における水不溶性担体は、例示したこれらの担体のみに限定されるものではない。
　また、本発明に用いる水不溶性担体は、本発明のアフィニティ分離マトリックスの使用目的および方法からみて表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、モノリス状、繊維状、膜状（中空糸を含む）などいずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。
　リガンドの固定化方法については、例えば、リガンドに存在するアミノ基、カルボキシ基またはチオール基を利用した従来のカップリング法で担体に結合してよい。カップリング法としては、臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジンまたは過ヨウ素酸ナトリウムなどと担体とを反応させて担体を活性化するか、或いは担体表面に反応性官能基を導入し、リガンドとして固定化する化合物とカップリング反応を行い固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられる。
　また、リガンドと担体の間に複数の原子からなるスペーサー分子を導入してもよいし、担体にリガンドを直接固定化してもよい。従って、固定化のために、本発明に係るＩｇＧ結合性ペプチドを化学修飾してもよいし、固定化に有用なアミノ酸残基を加えてもよい。固定化に有用なアミノ酸としては、側鎖に固定化の化学反応に有用な官能基を有しているアミノ酸が挙げられ、例えば、側鎖にアミノ基を含むＬｙｓや、側鎖にチオール基を含むＣｙｓが挙げられる。本発明の本質は、本発明においてペプチドに付与したＩｇＧ結合性が、当該ペプチドをリガンドとして固定化したマトリックスにおいても同様に付与されることにあり、固定化のためにいかように修飾・改変しても、本発明の範囲に含まれる。
　本発明のアフィニティ分離マトリックスを利用して、免疫グロブリンＧまたはその断片をアフィニティカラム・クロマトグラフィ精製法により分離精製することが可能となる。これらの免疫グロブリンＧまたはその断片の精製法は、免疫グロブリンのアフィニティカラム・クロマトグラフィ精製法、例えばＳｐＡアフィニティ分離マトリックスを利用した精製法に準じる手順により達成することができる（非特許文献１）。即ち、免疫グロブリンＧまたはその断片を含有する緩衝液を調製（ｐＨは中性付近）した後、当該溶液を本発明のアフィニティ分離マトリックスを充填したアフィニティカラムに通過させ、免疫グロブリンＧまたはその断片を吸着させる。次いで、アフィニティカラムに純粋な緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄する。この時点では所望の免疫グロブリンＧまたはその断片はカラム内の本発明のアフィニティ分離マトリックスに吸着されている。そして、本発明で得られたペプチドをリガンドとして固定化したアフィニティ分離マトリックスは、このサンプル添加の工程からマトリックス洗浄の工程において、目的とする免疫グロブリンＧまたはその断片を吸着保持する性能に優れる。次いで、適切なｐＨに調整した酸性緩衝液をカラムに通液し、所望の免疫グロブリンＧまたはその断片を溶出することにより、高純度な精製が達成される。溶出に用いる酸性緩衝液には、マトリックスからの解離を促進する物質を添加してもよい。
　本発明のアフィニティ分離マトリックスは、リガンド化合物や担体の基材が完全に機能を損なわない程度の、適当な強酸性または強アルカリ性の純粋な緩衝液を通過させて洗浄することにより、再利用が可能である。当該洗浄液としては、適当な変性剤や有機溶剤を含む溶液も使用できる。
　本発明は、上記ペプチドをコードするＤＮＡにも関する。かかるＤＮＡの塩基配列は、例えば、上記ペプチドのアミノ酸配列を逆翻訳することにより決定することができる。本発明ペプチドをコードするＤＮＡは、その塩基配列を翻訳したアミノ酸配列が、当該ペプチドを構成するものであればいずれでもよい。そのような塩基配列は、通常用いられる公知の方法、例えば、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（以下、「ＰＣＲ」と略記する）法を利用して取得できる。また、公知の化学合成法で合成することも可能であり、さらに、ＤＮＡライブラリーから得ることもできる。当該塩基配列は、コドンが縮重コドンで置換されていてもよく、翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、本来の塩基配列と同一である必要性は無い。当該塩基配列を一つ又はそれ以上有する組換えＤＮＡ、または、当該組換えＤＮＡを含む、プラスミドおよびファージなどのベクター、さらには、当該ＤＮＡを有するベクターにより形質転換された形質転換体、当該ＤＮＡを導入した遺伝子改変生物、または、当該ＤＮＡを転写の鋳型ＤＮＡとする無細胞タンパク質合成系を得ることができる。
　また、本発明に係るＩｇＧ結合性ペプチドは、タンパク質発現を補助する作用または精製を容易にするという利点がある公知のタンパク質との融合ペプチドとして取得することができる。即ち、本発明に係るＩｇＧ結合性ペプチドを含む融合ペプチドをコードする組換えＤＮＡを少なくとも一つ含有する微生物や細胞を得ることができる。上記タンパク質の例としては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等が挙げられるが、それらのタンパク質に限定されるものではない。
　本発明のペプチドをコードするＤＮＡを改変するための部位特異的な変異の導入は、以下のように、組換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ法等を用いて行うことができる。
　即ち、組換えＤＮＡ技術による変異の導入は、例えば、本発明ペプチドをコードする遺伝子中において、変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列が存在する場合に、それら制限酵素認識配列部分を前記制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む領域を除去した後、化学合成等によって目的の部位のみに変異導入したＤＮＡ断片を挿入するカセット変異法によって行うことができる。
　また、ＰＣＲによる部位特異的変異の導入は、例えば、本発明ペプチドをコードする二本鎖プラスミドを鋳型として、＋鎖および－鎖に相補的な変異を含む２種の合成オリゴプライマーを用いてＰＣＲを行うダブルプライマー法により行うことができる。
　また、本発明の単量体ペプチド（１つのドメイン）をコードするＤＮＡを、意図する数だけ直列に連結することにより、多量体ペプチドをコードするＤＮＡを作製することもできる。例えば、多量体ペプチドをコードするＤＮＡの連結方法は、ＤＮＡ配列に適当な制限酵素部位を導入し、制限酵素で断片化した２本鎖ＤＮＡをＤＮＡリガーゼで連結することができる。制限酵素部位は１種類でもよいが、複数の異なる種類の制限酵素部位を導入することもできる。また、多量体ペプチドをコードするＤＮＡにおいて、各々の単量体ペプチドをコードする塩基配列が同一の場合には、宿主にて相同組み換えを誘発する可能性があるので、連結されている単量体ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列間の配列同一性が９０％以下、好ましくは８５％以下、より好ましくは８０％以下、さらにより好ましくは７５％以下であることが好ましい。なお、塩基配列の同一性も、アミノ酸配列と同様に、常法により決定することが可能である。
　本発明の「発現ベクター」は、前述した本発明ペプチドまたはその部分アミノ酸配列をコードする塩基配列、およびその塩基配列に作動可能に連結された宿主で機能しうるプロモーターを含む。通常は、本発明ペプチドをコードする遺伝子を、適当なベクターに連結もしくは挿入することにより得ることができ、遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｐＱＥ系ベクター（キアゲン社）、ｐＥＴ系ベクター（メルク社）およびｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）のベクターなどが挙げられる。
　本発明の形質転換細胞は、宿主となる細胞へ本発明の組換えベクターを導入することにより得ることができる。宿主への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法およびポリエチレングリコール法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、得られた遺伝子の機能を宿主で発現する方法としては、本発明で得られた遺伝子をゲノム（染色体）に組み込む方法なども挙げられる。宿主となる細胞については、特に限定されるものではないが、安価に大量生産する上では、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等のバクテリア（真正細菌）を好適に使用しうる。
　本発明に係るＩｇＧ結合性ペプチドは、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または、培養液中（菌体外）に本発明のタンパク質を生成蓄積させ、該培養物から所望のタンパク質を採取することにより製造することができる。また、本発明ペプチドは、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または、培養液中（菌体外）に、本発明ペプチドを含む融合ペプチドを生成蓄積させ、当該培養物から当該融合ペプチドを採取し、当該融合ペプチドを適切なプロテアーゼによって切断し、所望のペプチドを採取することにより製造することができる。
　本発明の形質転換細胞を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。得られた形質転換体の培養に用いる培地は、本発明ペプチドを高効率、高収量で生産できるものであれば特に制限は無い。具体的には、グルコース、蔗糖、グリセロール、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸などの炭素源や窒素源を使用することが出来る。その他、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩等の無機塩類が必要に応じて添加される。栄養要求性の宿主細胞を用いる場合は、生育に要求される栄養物質を添加すればよい。また、必要であればペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシンなどの抗生物質が添加されてもよい。
　さらに、菌体内外に存在する宿主由来のプロテアーゼによる当該目的ペプチドの分解を抑えるために、公知の各種プロテアーゼ阻害剤、すなわち、Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ　ｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、４－（２－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）－ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＡＥＢＳＦ）、Ａｎｔｉｐａｉｎ、Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ　Ａ、Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａ　ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）および／またはその他市販されているプロテアーゼ阻害剤を適当な濃度で添加してもよい。
　さらに、本発明に係るＩｇＧ結合性ペプチドを正しくフォールディングさせるために、例えば、ＧｒｏＥＬ／ＥＳ、Ｈｓｐ７０／ＤｎａＫ、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１０４／ＣｌｐＢなどの分子シャペロンを利用してもよい。かかる分子シャペロンは、例えば、共発現、または、融合タンパク質化などの手法で、本発明のペプチドと共存させる。なお、本発明ペプチドの正しいフォールディングを目的とする場合には、正しいフォールディングを助長する添加剤を培地中に加える、および、低温にて培養するなどの手法もあるが、これらに限定されるものではない。
　大腸菌を宿主として得られた形質転換細胞を培養する培地としては、ＬＢ培地（トリプトン１％，酵母エキス０．５％，ＮａＣｌ１％）、または、２ｘＹＴ培地（トリプトン１．６％，酵母エキス１．０％，ＮａＣｌ０．５％）等が挙げられる。
　また、培養温度は、例えば１５～４２℃、好ましくは２０～３７℃で、通気攪拌条件で好気的に数時間～数日培養することにより本発明ペプチドを、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）、または、培養溶液（細胞外）に蓄積させて回収する。場合によっては、通気を遮断し嫌気的に培養してもよい。組換えペプチドが分泌生産される場合には、培養終了後に、遠心分離、ろ過などの一般的な分離方法で、培養細胞と分泌生産されたペプチドを含む上清を分離することにより生産された組換えペプチドを回収することができる。また、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）に蓄積される場合にも、例えば、培養液から遠心分離、ろ過などの方法により菌体を採取し、次いで、この菌体を超音波破砕法、フレンチプレス法などにより破砕し、および／または、界面活性剤等を添加して可溶化することにより、細胞内に蓄積生産されたペプチドを回収することができる。
　本発明に係るペプチドの精製はアフィニティクロマトグラフィ、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ等を単独でまたは適宜組み合わせることによって行うことができる。得られた精製物質が目的のペプチドであることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、Ｎ末端アミノ酸配列分析、ウエスタンブロッティング等により行うことができる。
　本願は、２０１８年３月２９日に出願された日本国特許出願第２０１８－６４８９１号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１８年３月２９日に出願された日本国特許出願第２０１８－６４８９１号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
　以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
　実施例１：　ＩｇＧ結合性ペプチドの調製
　（１）ＩｇＧ結合性ペプチドの発現プラスミド調製
　配列番号２～４で示すＩｇＧ結合性ペプチドのアミノ酸配列を２個連結したペプチド（配列番号５～７）を評価に用いた。２個のアミノ酸配列を連結したのは、ペプチドの分子量を大きくすることで、大腸菌での発現を良好にし、かつ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでの分析を容易にすることが目的である。
　配列番号５～７で示す各々のアミノ酸配列から逆翻訳を行い、コードＤＮＡの塩基配列（配列番号８～１０）を設計し、当該ＤＮＡを汎用ベクターｐＥＸに挿入したプラスミドを購入した（ユーロフィンジェノミクス社）。Ｂｌｅｎｄ　Ｔａｑ　－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、添付のプロトコルに従い、各々のプラスミドを鋳型として、２本のＤＮＡプライマー（配列番号１１，１２）を用いたＰＣＲ反応を行った。
　合成・抽出した二本鎖ＤＮＡを、制限酵素ＳｐｅＩとＸｈｏＩ（いずれもタカラバイオ社）により切断した。次に、プラスミドベクターｐＥＴ－４９ｂ（＋）（メルクミリポア社）のマルチクローニングサイト中のＳｐｅＩ／ＸｈｏＩサイトに制限酵素処理した二本鎖ＤＮＡをサブクローニングした。サブクローニングにおけるライゲーション反応は、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ　Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、製品に添付のプロトコルに準ずる形で実施した。
　上記ライゲーション反応液を用いて、コンピテント細胞ＤＨ５α（タカラバイオ社）の形質転換を、本コンピテント細胞製品に付属のプロトコルに従って行った。次いで、プラスミド精製キット（プロメガ社製「Ｗｉｚａｒｄ　Ｐｌｕｓ　ＳＶ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ」）を用い、キット付属の標準プロトコルに従って、形質転換した細胞を培養し、プラスミドＤＮＡを増幅し、抽出した。発現プラスミドのコードＤＮＡの塩基配列確認は、ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製「３１３０ｘｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ」）を用いて行った。遺伝子解析キット（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製「ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ．１．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ」）と、シークエンシング用ＤＮＡプライマー（配列番号１３）を用いて、添付のプロトコルに従いシークエンシングＰＣＲ反応を行った。そのシークエンシング産物を、プラスミド精製キットＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製「ＢｉｇＤｙｅ　ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ」）を用いて、添付のプロトコルに従い精製し、塩基配列解析に用いた。コードＤＮＡの塩基配列を確認した発現プラスミドを用いて、コンピテント細胞ＢＬ２１（ＤＥ３）（バイオダイナミクス社）の形質転換を行い、各種ＩｇＧ結合性ペプチドの発現用形質転換細胞を調製した。
　（２）ＩｇＧ結合性ペプチドの発現と精製
　上記（１）で得られた各種形質転換細胞を、カナマイシンを３０μｇ／ｍＬの濃度で含有するオート・インダクション培地Ｍａｇｉｃ　Ｍｅｄｉａ（ライフテクノロジーズ社）を用いて、３０℃で２４時間培養した。培養終了後、遠心にて集菌し、ＰＢＳ緩衝液に再懸濁した。超音波破砕にて細胞を破砕し、遠心分離して上清画分（無細胞抽出液）と不溶性画分に分画した。ｐＥＴ－４９ｂ（＋）ベクターのマルチクローニングサイトに目的の遺伝子を導入すると、ＧＳＴがＮ末端に付与した融合ペプチドとして発現される。なお、配列番号５～７のアミノ酸配列に対して、プライマーに起因するアミノ酸がＮ末端に付加されるが、全てに共通であり、その後の実験では特に問題とはならない。
　ＧＳＴ融合ペプチドを含む各々の無細胞抽出液から、ＧＳＴに対して親和性のあるＧＳＴｒａｐ　ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いたアフィニティクロマトグラフィにて、ＧＳＴ融合ペプチドを粗精製した。各々の無細胞抽出液をＧＳＴｒａｐ　ＨＰカラムに添加し、標準緩衝液（２０ｍＭ　ＮａＨ2ＰＯ4－Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）にてカラムを洗浄し、続いて溶出用緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，２０ｍＭグルタチオン，ｐＨ８．０）にて目的のＧＳＴ融合ペプチドを溶出した。
　配列番号１１のプライマーを用いてサブクローニングすると、目的のペプチド配列のＮ末端とＧＳＴとの間に、Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｒｇというアミノ酸配列が付加される。このアミノ酸配列は、配列特異的プロテアーゼＦａｃｔｏｒ　Ｘａ（メルクミリポア社）の認識配列であり、このプロテアーゼを作用させるとＡｒｇの後ろで切断されるため、ＧＳＴを含むＮ末端側のベクター由来配列を切断して除去することが可能である。ＧＳＴ融合ペプチド含有溶出液をＦａｃｔｏｒ　Ｘａ消化用緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１００ｍＭ　ＮａＣｌ，２ｍＭ　ＣａＣｌ2，ｐＨ８．０）にて透析し、添付プロトコルに従い酵素反応を行った。
　本反応液から、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　７５　１０／３００　ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いたゲルろ過クロマトグラフィにて、目的のペプチドを精製した。標準緩衝液にて平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ　７５　１０／３００　ＧＬカラムに、各々の反応溶液を添加し、目的のペプチドを、切断したＧＳＴ含有ベクター由来配列やＦａｃｔｏｒ　Ｘａから分離精製した。なお、以上のカラムを用いたクロマトグラフィによるペプチド精製は、全てＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓシステム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を利用して実施した。
　比較例１：　特許文献７に記載のＩｇＧ結合性ペプチド
　実施例１と同様に、配列番号１４で示すＩｇＧ結合性ペプチドのアミノ酸配列を２個連結したペプチド（配列番号１５）を評価に用いた。実施例１と同様の方法でコードＤＮＡの塩基配列（配列番号１６）を設計し、プラスミド調製から発現・精製を実施することにより、特許文献７に記載のＩｇＧ結合性ペプチドを得た。
　実施例２：　ＩｇＧ結合性ペプチドのアルカリ耐性評価
　（１）ＩｇＧ結合性ペプチドのアルカリ処理
　実施例１または比較例１で精製した各々のペプチドを超純水で希釈し、１０ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した。１０μＬのペプチド溶液と１０μＬの３０ｍＭ　ＮａＯＨを混合し、２５℃で１４時間インキュベートした（最終濃度として、５ｍｇ／ｍＬの各ペプチドを１５ｍＭ　ＮａＯＨで処理したこととなる）。その後、５０ｍＭ　酢酸緩衝液（ｐＨ３．０，６μＬ）を添加して中和した。
　（２）アルカリ処理サンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
　アルカリ処理前のサンプルも、１０μＬのペプチド溶液に１６μＬの超純水を加えて、アルカリ処理後と同じ濃度となるよう調整した。そして、１５％濃度のポリアクリルアミドゲル「ｅ－パジェル」（アトー株式会社）を用いて、添付のプロトコルに従って、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行った。アルカリ処理前と後のサンプルを隣のレーンに並べて添加した。その結果を図１に示す。サンプルを流したレーンとペプチドの対応について、レーン１・２が比較例１の配列番号１５、レーン３・４が配列番号５、レーン５・６が配列番号６、レーン７・８が配列番号７のペプチドであり、奇数がアルカリ処理前、偶数がアルカリ処理後のサンプルである。
　比較例１のペプチドのバンドは、アルカリ処理後に、ほぼ全てがスメア化して上方にシフトし、同じ位置のバンドは見えなくなっていた。一方、本発明で得られたペプチドは、アルカリ処理後も同じ位置にバンドが残っていた。特に、配列番号６～７のペプチドは、ごく一部がスメア化しただけで、同じ位置にほぼ同じ強度でバンドが存在し、アルカリでの処理が可能なレベルであると考えられる。

Claims (22)

  1. 　下記アミノ酸配列（配列番号１）、または、下記アミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有することを特徴とする免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
    　Ｘａａ1－Ｘａａ2－Ｔｙｒ－Ｘａａ4－Ｌｅｕ－Ｘａａ6－Ｘａａ7－Ｘａａ8－Ｇｌｙ－Ｘａａ10－Ｔｈｒ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ｔｈｒ－Ｔｈｒ－Ｘａａ18－Ｉｌｅ－Ａｌａ－Ｘａａ21－Ａｓｐ－Ａｌａ－Ｘａａ24－Ｔｈｒ－Ａｌａ－Ｇｌｕ－Ｘａａ28－Ｘａａ29－Ｌｅｕ－Ｘａａ31－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ａｌａ－Ｘａａ35－Ａｓｐ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ｘａａ39－Ｘａａ40－Ｇｌｙ－Ｘａａ42－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ａｓｐ－Ｘａａ47－Ａｌａ－Ｔｈｒ－Ｘａａ50－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｖａｌ－Ｔｈｒ－Ｘａａ56（配列番号１）
    　式中、
    　Ｘａａ1＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
    　Ｘａａ2＝Ｌｙｓ、ＴｈｒまたはＡｒｇ
    　Ｘａａ4＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
    　Ｘａａ6＝ＩｌｅまたはＶａｌ
    　Ｘａａ7＝ＬｅｕまたはＩｌｅ
    　Ｘａａ8＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、ＧｌｎまたはＶａｌ
    　Ｘａａ10＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
    　Ｘａａ18＝ＴｈｒまたはＡｌａ
    　Ｘａａ21＝Ａｓｐ、ＡｌａまたはＰｒｏ
    　Ｘａａ24＝ＡｌａまたはＧｌｕ
    　Ｘａａ28＝Ｌｙｓ、ＩｌｅまたはＡｒｇ
    　Ｘａａ29＝ＶａｌまたはＡｌａ
    　Ｘａａ31＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
    　Ｘａａ35＝Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＴｙｒ
    　Ｘａａ39＝ＶａｌまたはＩｌｅ
    　Ｘａａ40＝ＡｓｐまたはＧｌｕ
    　Ｘａａ42＝Ｇｌｕ、ＶａｌまたはＭｅｔ
    　Ｘａａ47＝Ａｓｐ、ＡｌａまたはＰｒｏ
    　Ｘａａ50＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
    　Ｘａａ56＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
  2. 　Ｘａａ2がＴｈｒである請求項１に記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  3. 　Ｘａａ4がＡｒｇである請求項１または２に記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  4. 　Ｘａａ6がＩｌｅである請求項１～３のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  5. 　Ｘａａ7がＬｅｕである請求項１～４のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  6. 　Ｘａａ8がＬｙｓ、ＬｅｕまたはＡｓｎである請求項１～５のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  7. 　Ｘａａ10がＡｒｇである請求項１～６のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  8. 　Ｘａａ18がＡｌａである請求項１～７のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  9. 　Ｘａａ24がＡｌａである請求項１～８のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  10. 　Ｘａａ29がＶａｌである請求項１～９のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  11. 　Ｘａａ31がＡｒｇである請求項１～１０のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  12. 　Ｘａａ35がＰｈｅまたはＡｓｎである請求項１～１１のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  13. 　Ｘａａ40がＡｓｐである請求項１～１２のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  14. 　Ｘａａ42がＧｌｕである請求項１～１３のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  15. 　Ｘａａ50がＡｒｇである請求項１～１４のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  16. 　Ｘａａ4、Ｘａａ10、Ｘａａ31およびＸａａ50がＡｒｇである請求項１～１５のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  17. 　請求項１～１６のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチドを２個以上有することを特徴とする免疫グロブリンＧ結合性ペプチド多量体。
  18. 　請求項１～１６のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド、または請求項１７に記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド多量体、および水不溶性担体を有し、免疫グロブリンＧ結合性ペプチドまたは免疫グロブリンＧ結合性ペプチド多量体がリガンドとして水不溶性担体に固定化されたものであることを特徴とするアフィニティ分離マトリックス。
  19. 　免疫グロブリンＧまたはその断片を製造する方法であって、
    　請求項１８に記載のアフィニティ分離マトリックスと、免疫グロブリンＧまたはその断片を含む液体試料とを接触させる工程、および、
    　アフィニティ分離マトリックスに結合した免疫グロブリンＧまたはその断片を、アフィニティ分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。
  20. 　請求項１～１６のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド、または請求項１７に記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド多量体をコードすることを特徴とするＤＮＡ。
  21. 　請求項２０に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。
  22. 　請求項２１に記載のベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
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