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WO2019160099A1 - がん抗原ペプチド - Google Patents

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WO2019160099A1
WO2019160099A1 PCT/JP2019/005623 JP2019005623W WO2019160099A1 WO 2019160099 A1 WO2019160099 A1 WO 2019160099A1 JP 2019005623 W JP2019005623 W JP 2019005623W WO 2019160099 A1 WO2019160099 A1 WO 2019160099A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptide
amino acid
seq
cells
helper
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2019/005623
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
敬幸 大栗
朱 小坂
小林　博也
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Asahikawa Medical University NUC
Original Assignee
Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Asahikawa Medical University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to US16/969,154 priority patent/US20210038703A1/en
Priority to JP2020500589A priority patent/JP6857930B2/ja
Priority to MYPI2020004169A priority patent/MY182816A/en
Priority to MX2020008558A priority patent/MX2020008558A/es
Priority to CN201980016100.4A priority patent/CN111788214B/zh
Priority to SG11202007750PA priority patent/SG11202007750PA/en
Priority to CN202110097214.5A priority patent/CN112812154B/zh
Priority to CN202110096432.7A priority patent/CN112812153B/zh
Priority to EP22156092.3A priority patent/EP4043569A1/en
Priority to EP22156090.7A priority patent/EP4036235A1/en
Priority to EP19754563.5A priority patent/EP3754022A4/en
Application filed by Otsuka Pharmaceutical Co Ltd, Asahikawa Medical University NUC filed Critical Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority to KR1020207026354A priority patent/KR102267463B1/ko
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the immune system recognizes a highly immunogenic cancer antigen protein that is expressed when normal cells become cancerous, and has a mechanism for eliminating cancer cells.
  • effective activation of the immune system is extremely important for controlling cancer growth due to remarkable treatment effects of immune checkpoint inhibitors typified by anti-PD-1 antibodies and the like. Attention has been focused on cancer immuno-vaccine therapy.
  • Non-Patent Document 1 Antigens whose expression is maintained in “grown” cancer tissues are unlikely to be targets of the immune system, and there was no need to reduce their expression levels during the process of cancer tissue “growing” It is suggested to be an antigen. Considering this, the target antigen that has been selected in conventional cancer vaccines may have been insufficient to activate the immune system.
  • Non-patent document 2 As one of the mechanisms by which cancer cells reduce the expression level of antigens that are “unfavorable for cancer cells”, suppression of gene expression by methylation of the promoter region of highly immunogenic cancer antigen genes has been reported ( Non-patent document 2). This is because cancer cells that have escaped the immune surveillance mechanism and formed cancer tissue concealed a highly immunogenic cancer antigen protein that is “unfavorable for cancer cells” by methylating its promoter region. Suggest that
  • the present application aims to provide a novel cancer antigen peptide and use thereof.
  • the present inventors identified a stealth cancer antigen using a DNA methyltransferase inhibitor, and identified a partial peptide thereof having a helper T cell activation ability.
  • the present application The amino acid sequence of KILQQSRIVQX (where X is absent or S); A sequence of 10 or more contiguous amino acids in the amino acid sequence of DVQKIVESQINFHGKKLKLGPAIKQNLCAYHVQPPRPL (SEQ ID NO: 16); or A peptide consisting of 10 to 45 amino acids, including the amino acid sequence of QNLNHYIQVLENLVRSVPS (SEQ ID NO: 9), or Provided is a peptide in which 1 to 3 amino acids are substituted, deleted or added in any of the above peptides and has the ability to activate helper T cells.
  • the present application provides a nucleic acid encoding the peptide.
  • the present application provides an expression vector comprising the nucleic acid.
  • the application provides an HLA multimer having the peptide and an HLA class II molecule.
  • the present application provides an antigen-presenting cell that presents a complex of the peptide and an HLA class II molecule.
  • the present application provides a helper T cell that recognizes a complex of the peptide and an HLA class II molecule.
  • the present application provides a pharmaceutical composition comprising the peptide, the nucleic acid, the expression vector, the antigen-presenting cell, or the helper T cell.
  • the present application provides a helper T cell activator comprising the peptide, the nucleic acid, the expression vector, or the antigen-presenting cell.
  • the peptides disclosed in the present application can activate stealth cancer antigen-specific helper T cells, and are therefore expected to be useful for the treatment or prevention of cancers that can express the stealth cancer antigen.
  • the gene expression level of SYCP3 in 5-AZA treated cancer cell lines EBC1 and Lu65 is shown.
  • the gene expression levels of SYCP3 in 5-AZA-treated cancer cell lines HT-29 and SAS are shown.
  • the gene expression level of SPESP1 in 5-AZA-treated cancer cell lines SW839, 5637, LC2 / Ad, and EBC1 is shown.
  • the gene expression level of SPESP1 in 5-AZA-treated cancer cell lines HT-29, Lu65 and SAS is shown.
  • the gene expression level of DAZL1 in the 5-AZA-treated cancer cell line WEHI-3 is shown.
  • the gene expression level of SYCP3 in tumor tissues collected from immunodeficient mice inoculated with a colon cancer cell line and administered with 5-AZA is shown.
  • FIG. 6 shows the ability of DAZL-1C peptide to activate helper T cells in mice.
  • FIG. 6 shows the reactivity of SYCP3-A specific Th cells to SYCP3-A stimulation.
  • the reactivity of SYCP3-A specific Th cells to the SYCP3-A fragment peptide is shown.
  • the reactivity of SYCP3-A specific Th cells to the SYCP3-A fragment peptide is shown.
  • FIG. 5 shows the reactivity of SPESP1-B specific Th cells to SPES1-B stimulation.
  • FIG. 5 shows the reactivity of DAZL1-specific Th cells to DAZL1 fragment peptides.
  • FIG. 5 shows the reactivity of SYCP3-A specific Th cells to 5-AZA-treated DR53-positive cancer cell lines. The tumor growth inhibitory effect by combined use of 5-AZA and SYCP3-A specific Th cells is shown.
  • the amino acid sequences of human SYCP3 SEQ ID NO: 1
  • human SPESP1 SEQ ID NO: 2
  • human DAZL1 SEQ ID NO: 15
  • stealth cancer antigen a protein whose expression is suppressed by methylation of the promoter region of the gene by the immune escape mechanism of cancer cells.
  • stealth cancer antigens include SYCP3 (synaptonemal complex protein 3), SPESP1 (Sperm Equatorial Segment Protein 1) or DAZL1 (deleted in azoospermia-like 1).
  • SYCP3 is an important component of the synaptonemal complex involved in chromosome pairing, recombination and segregation in meiosis. SYCP3 mutations are associated with azoospermia and infertility.
  • Human SYCP3 may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • SPESP1 is a human alloantigen involved in sperm-egg binding and fusion. Human SPESP1 can have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • DAZL1 is a member of the DAZ family and is an RNA binding protein that is expressed in male and female germ cells before and after birth. Human DAZL1 may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15.
  • helper peptide a peptide having a helper T cell activation ability derived from a cancer antigen protein is referred to as a “helper peptide”.
  • helper peptide derived from SYCP3 examples include a peptide containing the amino acid sequence KILQQSRIVQ (SEQ ID NO: 3) or KILQQSRIVQS (SEQ ID NO: 4).
  • the helper peptide is a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 and consisting of consecutive amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the helper peptide is a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 4.
  • the helper peptide is a peptide comprising any amino acid sequence of KILQQSRIVQSQ (SEQ ID NO: 5), QKILQQSRIVQS (SEQ ID NO: 6), QQKILQQSRIVQ (SEQ ID NO: 7) and QQQKILQQSRIVQSQRLKT (SEQ ID NO: 8), or SEQ ID NO: A peptide consisting of any of the amino acid sequences 5 to 8, particularly a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or 6.
  • Examples of peptides comprising any amino acid sequence of SEQ ID NOs: 5-8 include RQQQKILQQSRIVQSQRLKT (SEQ ID NO: 22), LNMFRQQQKILQQSRIVQSQRLKT (SEQ ID NO: 23), QQQKILQQSRIVQSQRLKTI (SEQ ID NO: 24) or QQQKILQ Examples thereof include a peptide or a peptide consisting of any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 22 to 25.
  • helper peptide derived from SYCP3 includes a peptide containing the amino acid sequence KILQQSRVVQ (SEQ ID NO: 26) or KILQQSRVVQS (SEQ ID NO: 27), or a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26 or 27.
  • the helper peptides are KILQQSRVVQSQ (SEQ ID NO: 28), QKILQQSRVVQS (SEQ ID NO: 29), QQKILQQSRVVQ (SEQ ID NO: 30), QQQKILQQSRVQSQRLKQ (SEQ ID NO: 31), RQQQKILQQQQQQQQQQ , QQQKILQQSRVVQSQRLKTI (SEQ ID NO: 34) and QQQKILQQSRVVQSQRLKTIKQLY (SEQ ID NO: 35), or a peptide consisting of any one of SEQ ID NOs: 28-35.
  • amino acid sequences of SEQ ID NOs: 3 and 4 may be collectively expressed as sequence (I): KILQQSRIVQX, where X does not exist or is S.
  • amino acid sequences of SEQ ID NOs: 26 and 27 may be collectively expressed as the sequence (I ′): KILQQSRVVQX, where X does not exist or is S.
  • helper peptide derived from SPESP1 includes a peptide containing the amino acid sequence QNLNHYIQVLENLVRSVPS (SEQ ID NO: 9).
  • the helper peptide is a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and consisting of consecutive amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the helper peptide is a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.
  • helper peptide derived from DAZL1 is a peptide containing a sequence of 10 or more amino acids in the amino acid sequence of DVQKIVESQINFHGKKLKLGPAIKQNLCAYHVQPRPL (SEQ ID NO: 16).
  • the helper peptide is a peptide comprising a sequence of 20 or more consecutive amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.
  • the helper peptide is a peptide comprising a sequence of 10 or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 or a sequence of amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15. is there.
  • the helper peptides are SEQ ID NO: 16, DVQKIVESQINFHGKKLKLKLG (SEQ ID NO: 17), INFHGKKLKLGPAIRKQNLC (SEQ ID NO: 18), LGPAIKQNLLCYKQLKLCLC (SEQ ID NO: 19), DVQIVESQINFKHLGKLQLGK It is a peptide comprising any amino acid sequence or a peptide consisting of any amino acid sequence of SEQ ID NOs: 16 to 21.
  • the length of the helper peptide is not particularly limited as long as it can bind to MHC class II molecules, and is, for example, 10 to 45, 10 to 40, 10 to 35, 10 to 30, or 10 to 25 amino acids.
  • 10-18, 10-19, 10-20, 11-18, 11-19, 11-20, 12-18, 12-19 or 12-20 amino acid helper peptides may be used.
  • an antigenic peptide presented by binding to an MHC class II molecule has an MHC class II molecule-binding motif consisting of about 9 amino acid residues bound to the peptide-containing groove of the MHC class II molecule, and both ends of the peptide.
  • helper peptides of 10-45, 15-40 or 20-38 amino acids may be used. In many cases, however, long peptides are cleaved with peptidases to a length of 13-17 amino acids (Immunobiology, 5th Edt., 116-117, Garland Publishing (2001)).
  • the helper peptide may be a peptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, or added in the amino acid sequence of any one of the above-mentioned helper peptides.
  • the number and position of amino acid residues to be substituted, deleted or added are arbitrary as long as the helper T cell activation ability is maintained.
  • 1 amino acid sequence of any one of the above helper peptides 1 to 9, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, for example, 1 amino acid is substituted, deleted, or It can be a peptide consisting of an added amino acid sequence.
  • Amino acid substitutions, additions or deletions may be made at the N-terminus or C-terminus in the peptide or within the sequence. From the properties of the above-mentioned helper peptide, the number of amino acids added to the N-terminus or C-terminus of the peptide is not limited, and may be, for example, 1-20, 1-15, or 1-10.
  • the amino acid substitution in the peptide may be performed with any kind of amino acid, and conservative amino acid substitution is preferred.
  • “Conservative amino acid substitution” means substitution of an amino acid residue with an amino acid residue having a side chain of similar properties.
  • a basic side chain for example, lysine, arginine, histidine
  • an acidic side chain for example, aspartic acid, glutamic acid
  • an uncharged polar side chain for example, asparagine, glutamine, serine, threonine
  • Tyrosine, cysteine for example, asparagine, glutamine, serine, threonine
  • cysteine nonpolar side chains
  • ⁇ -branched side chains eg, threonine, valine, isoleucine
  • aliphatic side chains Eg glycine, alanine, valine, leucine, isole
  • a conservative amino acid substitution is preferably a substitution between amino acid residues within the same family.
  • conservative amino acid substitutions include glutamic acid residues as aspartic acid residues, phenylalanine residues as tyrosine residues, leucine residues as isoleucine residues, isoleucine residues as valine residues, and alanine residues. Is substituted with a serine residue, and a histidine residue is substituted with an arginine residue.
  • amino acid residues that make up the large and small pockets in the peptide-containing groove have polymorphisms, and for each MHC class II molecule derived from a different allele, analyze the pattern of amino acid residues common to the binding peptides Thus, the motif of amino acid residues that bind to the pocket portion of the peptide-containing groove of the MHC class II molecule can be estimated.
  • amino acids may be substituted so as to maintain a motif common to peptides having binding properties to the desired MHC class II molecule.
  • a helper peptide derived from SYCP3 or SPESP1 can bind to HLA-DR, particularly HLA-DR53, and activate helper T cells, but is not limited thereto.
  • a DAZL1-derived helper peptide can bind to HLA-DR, particularly HLA-DR4, 8, 9, 15 or 53, and activate helper T cells, but is not limited thereto.
  • a DAZL1-derived helper peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 can bind to HLA-DR4, 9 or 53 to activate helper T cells, but is not limited thereto.
  • a DAZL1-derived helper peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 can bind to HLA-DR15 and activate helper T cells, but is not limited thereto.
  • a DAZL1-derived helper peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 can bind to HLA-DR8 and activate helper T cells, but is not limited thereto.
  • the amino acid residue of the peptide may be modified by a known method. For example, esterification, alkylation, acylation (for example, acetylation), halogenation, phosphorylation, etc. are performed on the functional group in the side chain of an amino acid residue, the amino group of the N-terminal amino acid, or the carboxyl group of the C-terminal amino acid. Can be applied.
  • the N-terminus of the helper peptide is acetylated.
  • various substances can be bound to the N-terminus and / or C-terminus of the helper peptide. For example, amino acids, peptides, analogs thereof and the like may be bound.
  • a histidine tag may be added, and it may be a fusion protein together with a protein such as thioredoxin.
  • a detectable label may be attached to the helper peptide.
  • these substances may be treated with, for example, an in vivo enzyme or a process such as intracellular processing to finally produce a helper peptide.
  • These substances may be those that regulate the solubility of helper peptides, may be those that improve their stability such as protease resistance, and for example, helpers that are specific to a given tissue or organ. It may be one that delivers a peptide, or one that has an effect of enhancing the uptake efficiency of antigen-presenting cells.
  • These substances may also be those that increase the ability to induce CTL, such as other peptides that activate helper T cells.
  • Peptides can be synthesized using methods commonly used in the art or variations thereof. Such synthetic methods include, for example, Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976; Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd., 1975; Maruzen Co., Ltd., 1985; Drug Development, Vol. 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten, 1991, etc. Peptides can also be produced using genetic engineering techniques based on nucleotide sequence information encoding the peptides. Such genetic engineering techniques are well known to those skilled in the art. These techniques can be performed according to the methods described in the literature (for example, Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM.Glover, IRL PRESS (1985) ).
  • helper T cells recognize TCR / CD3 complexes on the surface of T cells through antigen-presenting cell surface MHC class II molecules, and integrin on the surface of antigen-presenting cells is an integrin ligand on the surface of antigen-presenting cells. It is activated by being stimulated with.
  • activation of helper T cells includes induction of helper T cells or promotion of proliferation, and induction of cytokine production from helper T cells.
  • the ability of a peptide to have a helper T cell activation ability can be determined by synthesizing a candidate peptide of the mutant and testing whether it can activate a helper T cell. For the test, for example, the method described in Hassane M. Zarour et al., Cancer Research 62, 213-218, January 1, 2002, the method described in Examples, or the following method can be used.
  • peripheral blood mononuclear cells PBMC
  • dendritic cells adhered cells
  • helper T cells CD4 positive T cells
  • the candidate peptide is added to the dendritic cells and cultured, and then the dendritic cells and the helper T cells are mixed and cultured. Thereafter, helper T cells are collected and similarly stimulated several times with dendritic cells cultured with the candidate peptide.
  • the activation (induction) of helper T cells in response to peptide stimulation is, for example, by measuring the proliferation activity of the helper T cells and (2) cytokine production activity of the helper T cells, You can investigate.
  • the proliferation activity of (1) can be examined, for example, by measuring the amount of [ 3 H] -thymidine incorporated into helper T cells.
  • the cytokine production activity of (2) can be examined, for example, by measuring the amount of cytokine such as IFN- ⁇ produced by activated helper T cells by enzyme immunoassay (ELISA) or the like.
  • the present application provides a polynucleotide encoding the helper peptide.
  • the polynucleotide encoding the peptide may be in the form of any nucleic acid such as DNA or RNA.
  • These polynucleotides can be easily produced based on the amino acid sequence information of the peptide and the sequence information of the DNA encoding the peptide. Specifically, it can be produced by ordinary DNA synthesis or PCR amplification.
  • the polynucleotide encoding a helper peptide includes a polynucleotide that hybridizes with a complementary sequence of the polynucleotide under stringent conditions and encodes a peptide having a helper T cell activation ability.
  • hybridize under stringent conditions the hybridization used here is, for example, a conventional method described in Molecular® Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), etc. It can be performed according to.
  • “Stringent conditions” means, for example, 6 ⁇ SSC (a solution containing 1.5M NaCl, 0.15M trisodium citrate is 10 ⁇ SSC), 45 ° C. in a solution containing 50% formamide. (Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. YY (1989), 6.3.1-6.3.6) be able to.
  • a recombinant expression vector for expressing a helper peptide can be prepared by incorporating the polynucleotide prepared above into an expression vector.
  • the expression vector used here can be appropriately selected according to the host to be used, the purpose and the like, and examples thereof include plasmids, phage vectors, and viral vectors.
  • examples of the vector include plasmid vectors such as pUC118, pUC119, pBR322, and pCR3, and phage vectors such as ⁇ ZAPII and ⁇ gt11.
  • examples of the vector include pYES2, pYEUra3, and the like.
  • plasmid vectors such as pKCR, pCDM8, pGL2, pcDNA3.1, pRc / RSV, and pRc / CMV
  • viral vectors such as retrovirus vectors, adenovirus vectors, and adeno-associated virus vectors are listed. It is done.
  • the vector may appropriately have factors such as a promoter capable of inducing expression, a gene encoding a signal sequence, a selection marker gene, and a terminator.
  • a sequence that provides a fusion protein with thioredoxin, His tag, GST (glutathione S-transferase) or the like may be added so that isolation and purification can be facilitated.
  • a GST fusion protein vector such as pGEX4T
  • an appropriate promoter such as lac, tac, trc, trp, CMV, SV40 early promoter
  • a vector having a tag sequence such as Myc, His, etc.
  • pcDNA3.1 / Myc-His a vector having a tag sequence such as Myc, His, etc.
  • pET32a that expresses a fusion protein with thioredoxin and His tag can be used.
  • a transformed cell containing the expression vector By transforming the host with the expression vector prepared above, a transformed cell containing the expression vector can be prepared.
  • the host used here include Escherichia coli, yeast, insect cells, animal cells and the like.
  • E. coli include HB101 strain, C600 strain, JM109 strain, DH5 ⁇ strain, AD494 (DE3) strain of E. coli K-12 strain.
  • yeast include Saccharomyces cerevisiae.
  • animal cells include L929 cells, BALB / c3T3 cells, C127 cells, CHO cells, COS cells, Vero cells, and HeLa cells. Insect cells include sf9.
  • a normal method suitable for the host cell may be used. Specific examples include a calcium phosphate method, a DEAE-dextran method, an electroporation method, and a method using a lipid for gene introduction (Lipofectamine, Lipofectin; Gibco-BRL).
  • a transformed cell in which the expression vector is introduced into the host cell can be selected by culturing in a normal medium containing a selection marker.
  • a helper peptide can be produced by culturing the transformed cells obtained as described above under suitable conditions.
  • the obtained peptide can be further isolated and purified by general biochemical purification means.
  • the purification means include salting out, ion exchange chromatography, adsorption chromatography, affinity chromatography, gel filtration chromatography and the like.
  • the helper peptide when expressed as a fusion protein with the aforementioned thioredoxin, His tag, GST or the like, it can be isolated and purified by a purification method utilizing the properties of these fusion protein and tag.
  • an antibody that specifically binds to the helper peptide is provided.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. These can be produced according to known production methods (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons., Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H, D. et al. , Cold Spring, Harber Laboratory Press, Publishing, New York, 1989). Polyclonal antibodies can be obtained by immunizing non-human animals such as rabbits using peptides as immunogens, and according to conventional methods from the sera of the immunized animals.
  • a monoclonal antibody can be obtained from hybridoma cells prepared by immunizing a non-human animal such as a mouse with a peptide and fusing the obtained spleen cells and myeloma cells.
  • various adjuvants may be used to enhance the immunological response.
  • the immunological diagnosis can be performed by, for example, immunoblotting, radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (ELISA), fluorescence or luminescence assay.
  • immunological diagnosis includes cancers that express SYCP3, SPESP1 or DAZL1 by inhibiting DNA methylation, for example, blood diseases including leukemia, malignant melanoma, breast cancer, head and neck tumor, urinary system tumor, esophageal cancer It is effective in the diagnosis of liver cancer, lung cancer, colon cancer and the like.
  • the present application provides an HLA multimer having a helper peptide and an HLA class II molecule.
  • the HLA multimer refers to a multimerized complex (HLA monomer) obtained by associating an HLA protein with a peptide by combining two or more using a known technique.
  • the HLA class II molecule complexed with the helper peptide from SYCP3 or SPESPI can be, but is not limited to, HLA-DR53.
  • the HLA class II molecule complexed with the DAZL1-derived helper peptide can be, but is not limited to, HLA-DR4, 8, 9, 15 or 53.
  • the multimer may be fluorescently labeled so that bound helper T cells can be easily selected or detected by a known detection means such as flow cytometry or fluorescence microscope.
  • the HLA multimer may be a tetramer, a pentamer, a dendrimer, etc.
  • it may be an HLA tetramer tetramerized by biotinylation of an HLA monomer and binding to avidin.
  • HLA tetramers those containing various antigen peptides are commercially available, and HLA tetramers containing helper peptides can be easily prepared (Science 279: 2103-2106 (1998), Science 274: 94-96 ( 1996)).
  • the present application provides an antigen-presenting cell that presents a complex of a helper peptide and an HLA class II molecule.
  • the HLA class II molecule complexed with a helper peptide from SYCP3 or SPESP1 can be, but is not limited to, HLA-DR53.
  • the HLA class II molecule complexed with the DAZL1-derived helper peptide can be, but is not limited to, HLA-DR4, 8, 9, 15 or 53.
  • An antigen-presenting cell is a cell that can present a complex of a helper peptide and an HLA class II molecule to a helper T cell, and can be derived from, for example, dendritic cells or peripheral blood mononuclear cells.
  • the antigen-presenting cell can be prepared by adding a peptide to a cell having antigen-presenting ability by a technique well known to those skilled in the art.
  • the addition of a peptide to a cell can be performed directly using the peptide or indirectly using the polynucleotide, the expression vector, or the transformed cell.
  • the peptide can be added to the cell by bringing the peptide into contact with a cell capable of presenting an antigen, or by introducing the polynucleotide or the expression vector into the cell (Cancer Immunol. Immunother. 46:82, 1998, J.
  • the cell having the ability to present an antigen is a cell that expresses an HLA class II molecule on the cell surface, for example, a peripheral blood mononuclear cell or a dendritic cell.
  • Antigen presentation by antigen-presenting cells can be confirmed by the activity of helper T cells, for example, as described in the Examples. Helper T cell activity can be confirmed, for example, by production of cytokines such as interferon ⁇ .
  • the antigen-presenting cell can be used as an active ingredient in cell therapy (for example, dendritic cell therapy), for example.
  • a cell comprising the helper peptide, the polynucleotide, the vector, the multimer, or any one thereof for preparing an antigen-presenting cell.
  • a cell comprising the helper peptide, the polynucleotide, the vector, the multimer, or any of these for preparing an antigen presenting cell.
  • the antigen-presenting cell can activate a helper T cell that recognizes a complex of a helper peptide and an HLA class II molecule. Accordingly, in one aspect, the present application provides an activator for helper T cells, including the helper peptide, the polynucleotide, the vector, the multimer, a cell containing any of these, or the antigen-presenting cell.
  • Activated helper T cells have a function of activating the immune system by promoting induction, proliferation, and activation of B cells and cytotoxic T cells.
  • the helper T cell activator or the activated helper T cell can be used to promote the induction, proliferation and activation of B cells and / or cytotoxic T cells, or thereby Can be used to activate.
  • the activator may contain, for example, an appropriate carrier, excipient, additive and the like in addition to the active ingredient.
  • the activator can be used in vitro or in vivo, and can be used in vivo according to the pharmaceutical composition described below.
  • the application method of the activator can be appropriately selected depending on conditions such as the desired degree of activation of helper T cells and the state of antigen-presenting cells. For example, intradermal administration, subcutaneous administration, intramuscular administration , Intravenous administration, nasal administration, oral administration, and the like, or addition to a cell culture solution, and the like.
  • the amount of the active ingredient contained in the activator, the form of the composition, the number of applications, etc. can be appropriately selected depending on conditions such as the desired degree of activation of helper T cells and the state of antigen-presenting cells. .
  • helper peptide, the polynucleotide, the vector, the multimer, a cell containing any of these, or the antigen-presenting cell for activating a helper T cell there is provided use of the helper peptide, the polynucleotide, the vector, the multimer, a cell containing any of these, or the antigen-presenting cell for producing an activator for helper T cells.
  • a method for activating helper T cells comprising administering the helper peptide, the polynucleotide, the vector, the multimer, a cell containing any of these, or the antigen-presenting cell to a subject.
  • the helper T cell is activated, comprising adding the helper peptide, the polynucleotide, the vector, the multimer, a cell containing any of these, or the antigen-presenting cell to the helper T cell in vitro.
  • a method is provided.
  • helper T cell that recognizes a complex of the helper peptide and an HLA class II molecule.
  • the HLA class II molecule complexed with the helper peptide from SYCP3 or SPESPI can be, but is not limited to, HLA-DR53.
  • the HLA class II molecule complexed with the DAZL1-derived helper peptide can be, but is not limited to, HLA-DR4, 8, 9, 15 or 53.
  • the helper T cells can be easily prepared by those skilled in the art using a technique known in the art (Iwata, M. et al., Eur. J. Immunol, 26, 2081 (1996)).
  • the present application includes, as an active ingredient, one or more of the helper peptide, the polynucleotide, the vector, the multimer, a cell containing any of these, the antigen-presenting cell, or the helper T cell.
  • a pharmaceutical composition is provided.
  • the pharmaceutical composition can be used to treat or prevent cancer or to assist it.
  • the pharmaceutical composition is a cancer vaccine.
  • the pharmaceutical composition can treat or prevent cancers that express SYCP3, SPEPS1, or DAZL1 by inhibiting DNA methylation.
  • Cancers that express SYCP3, SPESP1 or DAZL1 by inhibiting DNA methylation can be solid tumors or hematological tumors, such as blood diseases including leukemia, malignant melanoma, breast cancer, head and neck tumors, urinary system tumors, esophagus Cancer, liver cancer, lung cancer or colon cancer.
  • the helper peptide is derived from SYCP3 or SPEPS1
  • the pharmaceutical composition may be administered to a subject having HLA-DR53, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition may be administered to a subject having HLA-DR4, 8, 9, 15 or 53, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition may contain, for example, a carrier, an excipient and the like in addition to the active ingredient.
  • the administration method of the pharmaceutical composition can be appropriately selected according to conditions such as the type of disease, the state of the subject, the target site, and the like. Examples of the administration method include, but are not limited to, intradermal administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, intravenous administration, nasal administration, and oral administration.
  • the amount of the active ingredient contained in the pharmaceutical composition, the dosage form of the pharmaceutical composition, the number of administrations, and the like can be appropriately selected according to conditions such as the type of disease, the state of the subject, and the target site.
  • the pharmaceutical composition may contain one or more additional active ingredients or may be used in combination therewith.
  • Further active ingredients include, for example, antimetabolites, alkylating agents, anticancer antibiotics, microtubule agonists, platinum preparations, topoisomerase inhibitors, molecular targeted therapeutics, cancer vaccines, immunomodulators, immune checks Examples include a point inhibitor, a chemotherapeutic agent such as a DNA methyltransferase inhibitor, or an activator, proliferative agent, or inducer of helper T cells or cytotoxic T cells. Further active ingredients and their therapeutically effective amounts can be determined within the skill and judgment of the ordinary clinician.
  • the pharmaceutical composition may be used in parallel with or before or after other therapies such as chemotherapy, radiation therapy, immunotherapy, hematopoietic stem cell transplantation and surgery.
  • the additional active ingredient is a DNA methyltransferase inhibitor.
  • DNA methyltransferase inhibitors include drugs described in, for example, J. Med. Chem. 2015, 58, 2569-2583, and examples thereof include decitabine, guadecitabine, azacitidine, zebralin, tetrahydrouridine Tetrahydrouridine and its derivatives, especially decitabine and azacitidine.
  • “Combination” of the components is not only used for a dosage form containing all the components and a combination of dosage forms containing each component separately (kit), but they are used to treat the same disease. As far as this is concerned, it also means that each component is administered simultaneously or sequentially, or one of the components is delayed.
  • cancer comprising a step of administering to the subject an effective amount of the helper peptide, the polynucleotide, the vector, the multimer, a cell containing any of these, the antigen-presenting cell, or the helper T cell.
  • a method for treating or preventing is provided.
  • the helper T cell is provided.
  • helper peptide the polynucleotide, the vector, the multimer, a cell containing any of these, the antigen-presenting cell, or the medicament for producing a medicament, for example, a medicament for treating or preventing cancer Use of the helper T cells is provided.
  • the application provides a method for determining the presence or amount of stealth cancer antigen-specific helper T cells in a subject comprising: (A) stimulating a sample obtained from the subject with a helper peptide; and (B) examining the amount of helper T cells or cytokines produced thereby, Wherein the increased amount of helper T cells or cytokines produced thereby is indicative of the presence or amount of stealth cancer antigen-specific helper T cells.
  • the sample may be anything as long as it contains antigen-presenting cells, such as peripheral blood mononuclear cells, infiltrating lymphocytes, tumor cells, ascites cells, pleural fluid cells, cerebrospinal fluid Cell, bone marrow cell, or lymph node cell.
  • the sample may be from a healthy person or from a cancer patient.
  • a sample derived from a healthy person for example, it is possible to diagnose whether or not the patient is suffering from cancer or has a predisposition thereto.
  • a sample derived from a cancer patient for example, it is possible to predict whether or not immunotherapy using a stealth cancer antigen has an effect in the cancer patient.
  • the subject whose amount of helper peptide-specific helper T cells derived from SYCP3 or SPESP1 is determined is HLA-DR positive, particularly HLA-DR53 positive, but is not limited thereto.
  • the subject whose amount of helper peptide-specific helper T cells derived from DAZL1 is determined is HLA-DR positive, especially HLA-DR4, 8, 9, 15 or 53 positive, It is not limited.
  • the obtained sample may be cultured before and after stimulation with a helper peptide, and the culture conditions can be appropriately determined by those skilled in the art. Stimulation of these cells using a helper peptide can be performed using a known technique, and may be performed either in vitro or in vivo.
  • the amount of helper T cells or cytokines produced thereby can be determined by a known method.
  • the peptide of paragraph 1 comprising the amino acid sequence of KILQQSRIVQX (where X is absent or is S).
  • the peptide according to item 1 or 2 consisting of consecutive amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • KILQQSRIVQ (SEQ ID NO: 3), KILQQSRIVQS (SEQ ID NO: 4), KILQQSRIVQSQ (SEQ ID NO: 5), QKILQQSRIVQS (SEQ ID NO: 6) or QQKILQQSRIVQ (SEQ ID NO: 7), QQQKILQQSRIVQSQRLKT (including SEQ ID NO: 8) 4.
  • the peptide according to item 1 comprising the amino acid sequence of QNLNHYIQVLENLVRSVPS (SEQ ID NO: 9). [21] The peptide according to item 1 or 20, consisting of consecutive amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. [22] The peptide according to item 1, 20, or 21 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.
  • a peptide consisting of 10 to 25 amino acids, including the amino acid sequence of KILQQSRIVQX (where X is absent or S) or QNLNHYIQVLENLVRSVPS (SEQ ID NO: 9), or A peptide comprising an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acids are substituted, deleted or added in the amino acid sequence of the peptide and having the ability to activate helper T cells.
  • An expression vector comprising the nucleic acid according to item 24.
  • An HLA multimer comprising the peptide according to any one of items 1 to 23 and an HLA class II molecule.
  • An antigen-presenting cell that presents a complex of the peptide according to any one of items 1 to 23 and an HLA class II molecule.
  • a helper T cell that recognizes a complex of the peptide according to any one of items 1 to 23 and an HLA class II molecule.
  • the pharmaceutical composition according to item 32 or 33, wherein the cancer is lung cancer or colorectal cancer.
  • the present application further provides, for example, the following embodiments.
  • Amino acid sequence of KILQQSRIVQX (where X is absent or S); A sequence of 10 or more contiguous amino acids in the amino acid sequence of DVQKIVESQINFHGKKLKLGPAIKQNLCAYHVQPPRPL (SEQ ID NO: 16); or A peptide consisting of 10 to 45 amino acids, including the amino acid sequence of QNLNHYIQVLENLVRSVPS (SEQ ID NO: 9), or A peptide having 1 to 3 amino acids substituted, deleted or added in any of the above peptides and having the ability to activate helper T cells.
  • the peptide according to item 1 which is a peptide in which one amino acid is substituted, deleted or added in the peptide and has the ability to activate helper T cells.
  • [3] comprising an amino acid sequence of KILQQSRIVQX (where X is absent or S) or KILQQSRVVQX (where X is absent or S), from 10 to 25 amino acids
  • the peptide according to Item 2 [4] The peptide according to Item 2 or 3, comprising any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 5 to 7 and 28 to 30.
  • the peptide according to item 2 comprising an amino acid sequence of KILQQSRIVQX (where X is absent or S) and consists of 10 to 25 amino acids.
  • the peptide according to item 6, consisting of a sequence of consecutive amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • a peptide consisting of 10 to 45 amino acids comprising a sequence of 10 or more consecutive amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, or 2.
  • the peptide according to item 1 which is a peptide in which one amino acid is substituted, deleted or added in the peptide and has the ability to activate helper T cells.
  • the peptide according to item 11 comprising a sequence of 10 or more consecutive amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 and consisting of 10 to 45 amino acids.
  • the peptide according to Item 11 or 12 comprising a sequence of 20 or more consecutive amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, and comprising 20 to 38 amino acids.
  • a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and consisting of 10 to 25 amino acids, or 2.
  • the peptide according to item 1 which is a peptide in which one amino acid is substituted, deleted or added in the peptide and has the ability to activate helper T cells.
  • the peptide according to item 17 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and comprising 19 to 25 amino acids.
  • An expression vector comprising the nucleic acid according to item 21.
  • An HLA multimer comprising the peptide according to any one of items 1 to 20 and an HLA class II molecule.
  • An antigen-presenting cell that presents a complex of the peptide according to any one of items 1 to 20 and an HLA class II molecule.
  • a helper T cell that recognizes a complex of the peptide according to any one of items 1 to 20 and an HLA class II molecule.
  • a pharmaceutical composition comprising an antigen-presenting cell or the helper T cell according to item 25.
  • the pharmaceutical composition according to item 26 further comprising a DNA methyltransferase inhibitor or being used in combination with a DNA methyltransferase inhibitor.
  • the pharmaceutical composition according to item 27, wherein the DNA methyltransferase inhibitor is selected from the group consisting of decitabine, guadecitabine, azacitidine, zebraline, tetrahydrouridine, tetrahydrouridine, and derivatives thereof.
  • the pharmaceutical composition according to item 30 or 31, wherein the cancer is blood cancer, malignant melanoma, breast cancer, head and neck tumor, urological tumor, esophageal cancer, liver cancer, lung cancer or colon cancer object.
  • Test 1 Search for candidate molecules To identify molecules whose gene expression is re-elevated by DNA methyltransferase inhibitors (5-aza-2'-deoxycytidine (decitabine); 5-AZA), lung cancer cell line A549 RNA was extracted after treatment with 5-AZA (10 ⁇ M) for 3 days, and the expression level in cancer cell lines not treated with a DNA microarray was close to 0, and the expression level in 5-AZA-treated cancer cell lines was 30 times We searched for increasing molecules.
  • DNA methyltransferase inhibitors 5-aza-2'-deoxycytidine (decitabine); 5-AZA
  • Test 2 Examination of increased gene expression of SYCP3, SPEPS1 and DAZL1 by 5-AZA treatment
  • Various cancer cell lines lung cancer cell line EBC1, lung cancer cell line Lu65, colon cancer cell line HT-29, oral squamous cell carcinoma cell line SAS
  • complete medium 100 U / mL penicillin (Meiji Seika), 100 ⁇ g / L streptomycin (Meiji Seika) and RPMI 1640 medium (Nacalai Tesque 30264-56) containing 5-AZA (10 ⁇ M) for 30 minutes.
  • fetal bovine serum biologically fetal bovine serum (biosera FB-1365 / 500) added at 10% in a 6-well culture plate (Falcon 353046) at 2 ⁇ 10 5 / well, temperature 37 ° C., CO 2 concentration 5%, humidity
  • the cells were cultured for 3 days in an incubator (SANYO) set at 95% (hereinafter, this incubator was used for all cell cultures).
  • SANYO phosphate buffer solution
  • RNA was extracted from each using RNeasy Mini Kit (Qiagen 74106), and PrimeScript 1 st strand cDNA Syntesis Kit (Takara Bio 6110A) was used.
  • renal cancer cell line SW839 bladder cancer cell line 5637, lung adenocarcinoma cell line LC2 / Ad, lung cancer cell line EBC1, colon cancer cell line HT-29, lung cancer cell line Lu65 and oral squamous cell carcinoma cell line SAS
  • the cells were cultured in the presence of 5-AZA, and the gene expression levels of GAPDH and SPESP1 (Applied Biosystems Hs00377364_m1) were analyzed. The results are shown in FIG. 3 and FIG. In all the cell lines tested, an increase in the expression of SPESP1 by 5-AZA treatment was confirmed.
  • mice leukemia cell line WEHI-3 (Balb / c) was cultured in the presence of 5-AZA, and the gene expression levels of mouse GAPDH (Applied Biosystems Mm99999915_g1) and mouse DAZL1 (Applied Biosystems Mm01273546_m1) were analyzed. The results are shown in FIG. In WEHI-3, increased expression of DAZL1 by 5-AZA treatment was confirmed.
  • SYCP3 protein in EBC1 and Lu65 treated with 5-AZA was analyzed by Western blotting.
  • anti-SYCP3 antibody diluted 200 times (Mouse anti-SCP3, BD Bioscience 611230) was used.
  • the increase in the expression of SYCP3 by 5-AZA treatment was also confirmed at the protein level.
  • Mouse cancer cell lines (E0771: C57BL / 6 mouse breast cancer cell line and C1498: C57BL / 6 mouse acute myeloid leukemia cell line) were treated with 5-AZA (10 ⁇ M), and the protein amount of DAZL1 was analyzed by Western blotting. In both cell lines, increased expression of DAZL1 by 5-AZA was confirmed.
  • Test 3 Confirmation of increased gene expression of SYCP3 and SPEPS1 by 5-AZA using immunodeficient mice BALB / c nude mice ( 10-14 weeks old, Charles River, Japan) were tested for HT-29 (5 ⁇ 10 5), a colon cancer cell line. 5 ) or WiDr (5 ⁇ 10 5 ) inoculated intradermally with Myjector (TERUMO SS — 05M2913) and contain 5-AZA (1.6 ⁇ g / mouse body weight g) on days 5, 10, 15, and 20 after inoculation
  • the PBS solution was intraperitoneally administered 200 ⁇ L with a Myjector. As a control, 200 ⁇ L of PBS was intraperitoneally administered.
  • mice were euthanized by intraperitoneal administration of 500 ⁇ g / mL pentobarbital (Nacalai Tesque 02095-04), and the tumor tissue was excised with dissection scissors (Nonaka Rika Seisakusho 11301) and bio-masher. After crushing the tumor tissue using II (Nippi Corporation 320103), the gene expression levels of SYCP3 and GAPDH were analyzed by the real-time PCR method as in Test 2. The results are shown in FIG. Increased expression of the SYCP3 gene was confirmed in tumor tissues collected from mice administered with 5-AZA compared to mice administered with PBS alone.
  • nude mice were inoculated intradermally with lung cancer cell lines EBC1 (5 ⁇ 10 5 cells) or Lu65 (5 ⁇ 10 5 cells) and intraperitoneally administered 5-AZA or PBS (control).
  • RNA was extracted from the tumor tissue collected on the 25th day, and the gene expression levels of SPESP1 and GAPDH were analyzed by a real-time PCR method. The results are shown in FIG. Increased expression of SPESP1 gene was confirmed in tumor tissues collected from mice administered with 5-AZA, compared to mice administered with PBS alone.
  • Test 4 Search for HLA-binding amino acid sequence region in candidate molecule
  • expression frequency in Japanese and Westerners HLA-DRB1 * 01: 01 (about 10%), HLA-DRB1 * 04: 05 (about 25%), HLA-DRB1 * 09: 01 (about 26%), HLA-DRB1 * 15: 01 (about 15%), HLA-DR53 (60% or more) were analyzed for binding potential, and SYCP3-A (SEQ ID NO: 8), SPESP1-B (SEQ ID NO: 9) and DAZL-1C (SEQ ID NO: 20) were analyzed. The containing amino acid sequence was selected.
  • Test 5 Examination of immune activation ability of candidate amino acid sequence using HLA transgenic mice HLA-A * 02: 01 / DRB1 * 01: 01 transgenic mice (A2. DR1-Tg mice, 10-16 weeks old) SYCP3-A peptide (synthesized by Genscript) was dissolved in 100 ⁇ L of PBS on day 0 and day 10 and administered intradermally using a myjector. On day 15, 200 ⁇ L of 500 ⁇ g / mL pentobarbital was intraperitoneally administered to euthanize the A2.DR1-Tg mouse, and then the abdomen was opened and the regional lymph node (dLN) and spleen were collected from each lymphocyte. And spleen cells were isolated.
  • dLN regional lymph node
  • ELISPOT was performed using the mouse IFN- ⁇ ELISpot BASIC (ALP) kit (MABTECH 3321-2A).
  • Test 6 Examination of immune activation ability of DAZL1 candidate amino acid peptide using mice Two BALB / cAnNCrlCrlj mice (Balb / c, 10 to 16 weeks old; Charles river) were treated with a phosphate buffer solution (PBS Kanto Chemical Co., Inc.) DAZL-1C peptide (DVQKIVESQINFHGKKLKLGPARKQNLC (SEQ ID NO: 20): synthesized by Genscript) dissolved in company 73111) was administered intradermally at 100 ⁇ g / 50 ⁇ L using Myjector (TERUMO SS_05M2913) on day 0 and day 10. .
  • PBS Kanto Chemical Co., Inc. phosphate buffer solution
  • DAZL-1C peptide (DVQKIVESQINFHGKKLKLGPARKQNLC (SEQ ID NO: 20): synthesized by Genscript) dissolved in company 73111) was administered intradermally at 100 ⁇ g / 50 ⁇ L
  • mice were euthanized by intraperitoneal administration of 200 ⁇ L of 500 ⁇ g / mL pentobarbital (Nacalai Tesque 02095-04), and then opened to collect regional lymph nodes (dLN) and spleen. Lymphocytes and spleen cells were isolated.
  • some culture systems contain anti-mouse CD4 antibody (aCD4; BioLegend 100435) and anti-mouse CD8 antibody (aCD8; BioLegend 100735) at a final concentration of 5 ⁇ g / mL. added.
  • Test 7 Induction of SYCP3-A peptide or SPESP1-B peptide-specific helper T (Th) cells using healthy human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) Using lymphoprep (Alere Technologies AS 1114547) from peripheral blood of healthy persons PBMCs were recovered by the existing density gradient separation method.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • CD14 positive cells were separated from PBMC using a magnetic cell separation system (Miltenyi 130-050-201), and 50 ng / mL GM-CSF (peprotech AF-300-03) and 50 ng / mL IL-4 (peprotech AF -200-04)
  • the cells were differentiated into dendritic cells (DCs) by culturing for 7 days in a 6-well culture plate (Falcon 353046) using 3 mL of human cell medium in the presence.
  • AIM-V medium ThermoFisher SCIENTIFIC 0870112DK
  • human AB serum Innovative RESEARCH IPLA-SERAB
  • CD4 positive T cells (Miltenyi 130-045-101) were separated from PBMC, and 1 ⁇ 10 5 CD4 positive T cells were isolated at 5 ⁇ 10 5 in the presence of SYCP3-A peptide or SPESP1-B peptide (3 ⁇ g / mL). Co-culture was started at 200 ⁇ L with 4 DCs and 96-well flat bottom culture plates (Falcon 353072).
  • CD4-positive T cells using every other week SYCP3-A peptide or SPESP1-B peptide and inactivated PBMC (1x10 6 cells) (1x10 6
  • SYCP3-A peptide or SPESP1-B peptide and inactivated PBMC (1x10 6 cells)
  • Test 8 Examination of HLA restriction of SYCP3-A peptide-specific helper T cell line
  • SYCP3-A peptide 3 ⁇ g / mL
  • 5 ⁇ 10 4 CD4 positive T cells and 1 ⁇ 10 5 PBMC were co-cultured in a 96-well flat-bottom culture plate using 200 ⁇ L of human cell culture medium.
  • anti-DR antibody BioLegend 307612
  • anti-HLA-class I antibody BioLegend 311412
  • 100 ⁇ L of the culture supernatant after 24-48 hours was collected, and the IFN- ⁇ concentration contained therein was measured using an ELISA kit (BD Biosciences 555142) according to the attached instruction manual.
  • FIG. A plurality of SYCP3-A specific Th cell clones were established from the 3 healthy individuals tested. In these clones, peptide-specific IFN- ⁇ production was suppressed when anti-HLA-DR antibody (aDR) was used, so SYCP3-A peptide stimulated Th cells in a HLA-DR-restricted manner. It was confirmed.
  • aDR anti-HLA-DR antibody
  • SYCP3-A peptide (3 ⁇ g / mL) 3x10 4 the presence of 5x10 4 cells under CD4-positive T cells with HLA-DR4, DR8, the DR9 or DR53 gene is introduced
  • Two mouse-derived fibroblast cell lines (L-DR4, L-DR8, L-DR9 and L-DR53) were co-cultured in a 96-well flat-bottom culture plate using 200 ⁇ L of human cell culture medium, and the same as described above. The IFN- ⁇ concentration of the culture supernatant after 24 to 48 hours was measured.
  • SYCP3-A peptide-specific Th cells in the presence of 3 ⁇ g / mL of SYCP3-A peptide fragment peptides T1 to T8 (see Test 5) ( Healthy donor 3 cell line ID number # 14) and 1 ⁇ 10 5 PBMCs derived from the same donor were co-cultured in a 96-well flat-bottom culture plate using 200 ⁇ L of human cell culture medium. The results are shown in FIG. High IFN- ⁇ production was confirmed for T3 and T4 peptides. From this, it is considered that the minimal recognition sequence of this SYCP3-A peptide-specific Th cell is KILQQSRIVQS that is common to T3 and T4 peptides.
  • Test 9 Examination of HLA restriction of SPESP1-B peptide-specific helper T cell line As in Test 8, except that SPESP1-B peptide is used instead of SYCP3-A peptide, and IFN- ⁇ concentration in the culture supernatant was measured. The results are shown in FIG. Two SPES1-B-specific Th cell clones (HK15, HK18) were established from one healthy person tested. In these clones, when the anti-HLA-DR antibody (aDR) was used, peptide-specific IFN- ⁇ production was suppressed, and thus the SPES1-B peptide stimulated Th cells in an HLA-DR-restricted manner. It was confirmed. Similarly to Test 8, an experiment using L-DR53 confirmed that SPESP1-B bound to HLA-DR53 and stimulated Th cells.
  • aDR anti-HLA-DR antibody
  • Th cells were stimulated by serial dilution of the SPESP1-B peptide concentration to 0.0003-30 ⁇ g / mL. As a result, it was confirmed that sufficient IFN- ⁇ production was shown from a low concentration (0.0003 ⁇ g / mL).
  • Test 10 Induction of DAZL-1 peptide-specific Th cells and examination of their HLA restriction As in Test 7, except that instead of SYCP3-A peptide or SPESP1-B peptide, DAZL-1 fragment peptide p11, p12 or p13 (Table 4) was used to induce DAZL-1 peptide-specific Th cells.
  • Test 11 Examination of reactivity of SYCP3-A peptide-specific CD4-positive T cells to cancer cell lines
  • DR53-positive WiDr, Lu65 , Calu1
  • a cancer cell line was selected.
  • Each cancer cell line, together with 10 ⁇ M 5-AZA, 2 mL containing 500 U / mL IFN- ⁇ (Shiono Yoshino Immunomax- ⁇ Note 50) for expressing HLA class II on the cell surface of the cancer cell line was cultured in a 6-well culture plate for 3 days.
  • each cancer cell line was washed thoroughly with PBS, each cell line was released using 1 mL of 5 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid Nacalai Tesque 14347-21), and each cancer cell line was collected.
  • the 1x10 4 cells each cell line and 5x10 4 pieces of CD4-positive T cells were co-cultured in 96-well flat-bottom culture plates using human cell culture medium of 200 [mu] L.
  • an anti-HLA-DR antibody final concentration 5 ⁇ g / mL was added to the culture system. 100 ⁇ L of the culture supernatant after 24 hours was collected, and the concentration of IFN- ⁇ contained therein was measured using an ELISA kit.
  • Test 12 Examination of tumor growth inhibitory effect of DNA methylation inhibitor and SYCP3-specific Th cells in immunodeficient mice BALB / c nude mice (10-14 weeks old, Charles River, Japan) Lu65 (3x10), a lung cancer cell line 6 ) were intradermally inoculated with a MyJector, and PBS solutions containing 5-AZA (150 nmol / mouse body weight g) were intraperitoneally administered with Myjector on days 7, 12, 17, and 22 after the inoculation. As a control, 200 ⁇ L of PBS was intraperitoneally administered.
  • 5-AZA 150 nmol / mouse body weight g
  • the peptide disclosed in the present application activates cancer antigen-specific helper T cells and is expected to be used as a cancer vaccine.
  • the peptide is expected to bind to HLA, including HLA-DR53, which is shared very frequently, and is useful for many cancer patients.

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Abstract

本願は、ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＸ（ここで、Ｘは存在しないか、またはＳである）のアミノ酸配列；ＤＶＱＫＩＶＥＳＱＩＮＦＨＧＫＫＬＫＬＧＰＡＩＲＫＱＮＬＣＡＹＨＶＱＰＲＰＬ（配列番号１６）のアミノ酸配列中の連続する１０個以上のアミノ酸の配列；または、ＱＮＬＮＨＹＩＱＶＬＥＮＬＶＲＳＶＰＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含む、１０個～４５個のアミノ酸からなるペプチド、または、前記のいずれかのペプチドにおいて１個～３個のアミノ酸が置換、欠失または付加され、かつ、ヘルパーＴ細胞活性化能を有するペプチドを提供する。また、それに関連するポリヌクレオチド等を提供する。さらに、当該ペプチドおよびポリヌクレオチド等の医薬またはヘルパーＴ細胞活性化剤としての使用方法を提供する。

Description

がん抗原ペプチド
　本特許出願は、日本国特許出願第２０１８－０２４９７２号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
　本願は、新規がん抗原ペプチドに関する。
　免疫系は、正常細胞ががん化する際に発現される免疫原性の高いがん抗原タンパク質を認識し、がん細胞を排除する機構を備えている。近年、抗ＰＤ－１抗体等に代表される免疫チェックポイント阻害剤による目覚しい処置効果によって、がんの増殖を制御するには免疫系を有効に活性化することがきわめて重要であるということが示され、がん免疫ワクチン療法に注目が集まっている。
　従来のがん免疫ワクチン療法では、標的として選択された抗原分子のほとんどは、正常組織ではほとんど発現されていないか、もしくはある程度発現されているが、「成長した」がん組織にのみ高発現している分子であった。一方、がん細胞は免疫系から逃れるために様々な免疫逃避機構を備えており、正常細胞ががん化する際には、免疫系からの標的になりやすい分子の発現を低下させながら、「成長していく」ことが知られている（非特許文献１）。つまり、「成長した」がん組織において発現が維持されている抗原は免疫系の標的にはなりにくく、がん組織が「成長していく」過程において、その発現量を低下させる必要がなかった抗原であることが示唆される。これを考慮すると、従来のがんワクチンにおいて選択されてきた標的抗原は、免疫系を活性化するには不十分な抗原であった可能性がある。
　がん細胞が「がん細胞にとって不都合な」抗原の発現量を低下させるメカニズムの１つとして、免疫原性の高いがん抗原遺伝子のプロモーター領域のメチル化による遺伝子発現の抑制が報告された（非特許文献２）。これは、免疫監視機構を逃れてがん組織を形成したがん細胞が、「がん細胞にとって不都合な」免疫原性の高いがん抗原タンパク質を、そのプロモーター領域をメチル化することによって隠していることを示唆する。
　より有効ながんワクチン療法を確立するため、がん組織が成長する過程で発現量を低下させた、「がん細胞にとって不都合な」免疫原性の高いがん抗原分子、即ち、ステルスがん抗原の同定が求められている。
Schreiber RD et al. Science 2011, Mar 25;331(6024):1565-70 DuPage et al. Nature 2012 Feb 8;482(7385):405-9
　本願は、新規がん抗原ペプチドおよびその使用を提供することを目的とする。
　本発明者らは、ＤＮＡメチル基転移酵素阻害剤を用いてステルスがん抗原を特定し、その部分ペプチドであって、ヘルパーＴ細胞活性化能を有するペプチドを同定した。
　従って、ある態様では、本願は、
　ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＸ（ここで、Ｘは存在しないか、またはＳである）のアミノ酸配列；
　ＤＶＱＫＩＶＥＳＱＩＮＦＨＧＫＫＬＫＬＧＰＡＩＲＫＱＮＬＣＡＹＨＶＱＰＲＰＬ（配列番号１６）のアミノ酸配列中の連続する１０個以上のアミノ酸の配列；または、
　ＱＮＬＮＨＹＩＱＶＬＥＮＬＶＲＳＶＰＳ（配列番号９）のアミノ酸配列
を含む、１０個～４５個のアミノ酸からなるペプチド、または、
　前記のいずれかのペプチドにおいて１個～３個のアミノ酸が置換、欠失または付加され、かつ、ヘルパーＴ細胞活性化能を有するペプチドを提供する。
　ある態様では、本願は、前記ペプチドをコードする核酸を提供する。
　ある態様では、本願は、前記核酸を含む発現ベクターを提供する。
　ある態様では、本願は、前記ペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子とを有するＨＬＡマルチマーを提供する。
　ある態様では、本願は、前記ペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子との複合体を提示する、抗原提示細胞を提供する。
　ある態様では、本願は、前記ペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子との複合体を認識する、ヘルパーＴ細胞を提供する。
　ある態様では、本願は、前記ペプチド、前記核酸、前記発現ベクター、前記抗原提示細胞、または、前記ヘルパーＴ細胞を含む、医薬組成物を提供する。
　ある態様では、本願は、前記ペプチド、前記核酸、前記発現ベクター、または、前記抗原提示細胞を含む、ヘルパーＴ細胞の活性化剤を提供する。
　本願に開示されるペプチドは、ステルスがん抗原特異的なヘルパーＴ細胞を活性化し得、従って、当該ステルスがん抗原を発現し得るがんの処置または予防に有用であると期待される。
５－ＡＺＡ処理した癌細胞株ＥＢＣ１およびＬｕ６５におけるＳＹＣＰ３の遺伝子発現量を示す。 ５－ＡＺＡ処理した癌細胞株ＨＴ－２９およびＳＡＳにおけるＳＹＣＰ３の遺伝子発現量を示す。 ５－ＡＺＡ処理した癌細胞株ＳＷ８３９、５６３７、ＬＣ２／ＡｄおよびＥＢＣ１におけるＳＰＥＳＰ１の遺伝子発現量を示す。 ５－ＡＺＡ処理した癌細胞株ＨＴ－２９、Ｌｕ６５およびＳＡＳにおけるＳＰＥＳＰ１の遺伝子発現量を示す。 ５－ＡＺＡ処理した癌細胞株ＷＥＨＩ－３におけるＤＡＺＬ１の遺伝子発現量を示す。 大腸癌細胞株を接種し、５－ＡＺＡを投与した免疫不全マウスから回収した腫瘍組織における、ＳＹＣＰ３の遺伝子発現量を示す。 肺癌細胞株を接種し、５－ＡＺＡを投与した免疫不全マウスから回収した腫瘍組織における、ＳＰＥＳＰ１の遺伝子発現量を示す。 ＳＹＣＰ３－Ａ断片ペプチドに対するＣＤ４陽性Ｔ細胞の反応性を示す。 ＤＡＺＬ－１ＣペプチドのマウスにおけるヘルパーＴ細胞活性化能を示す。 ＳＹＣＰ３－Ａ刺激に対するＳＹＣＰ３－Ａ特異的Ｔｈ細胞の反応性を示す。 ＳＹＣＰ３－Ａ断片ペプチドに対するＳＹＣＰ３－Ａ特異的Ｔｈ細胞の反応性を示す。 ＳＹＣＰ３－Ａ断片ペプチドに対するＳＹＣＰ３－Ａ特異的Ｔｈ細胞の反応性を示す。 ＳＰＥＳＰ１－Ｂ刺激に対するＳＰＥＳＰ１－Ｂ特異的Ｔｈ細胞の反応性を示す。 ＤＡＺＬ１断片ペプチドに対するＤＡＺＬ１特異的Ｔｈ細胞の反応性を示す。 ５－ＡＺＡ処理されたＤＲ５３陽性癌細胞株に対するＳＹＣＰ３－Ａ特異的Ｔｈ細胞の反応性を示す。 ５－ＡＺＡおよびＳＹＣＰ３－Ａ特異的Ｔｈ細胞の併用による腫瘍増殖抑制効果を示す。 ヒトＳＹＣＰ３（配列番号１）、ヒトＳＰＥＳＰ１（配列番号２）およびヒトＤＡＺＬ１（配列番号１５）のアミノ酸配列を示す。
　特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。
　本明細書において、がん細胞の免疫逃避機構により、その遺伝子のプロモーター領域がメチル化されることにより発現が抑制されているタンパク質を「ステルスがん抗原」と称する。ステルスがん抗原としては、ＳＹＣＰ３（synaptonemal complex protein 3）、ＳＰＥＳＰ１（Sperm Equatorial Segment Protein 1）またはＤＡＺＬ１（deleted in azoospermia-like 1）が例示される。ＳＹＣＰ３は、減数分裂における染色体の対合、組換えおよび分離に関与するシナプトネマ複合体の重要な構成成分である。ＳＹＣＰ３の変異は、無精子症および不妊症に関連する。ヒトのＳＹＣＰ３は、配列番号１のアミノ酸配列を有し得る。ＳＰＥＳＰ１は、精子と卵子の結合および融合に関与するヒト同種抗原である。ヒトのＳＰＥＳＰ１は、配列番号２のアミノ酸配列を有し得る。ＤＡＺＬ１はＤＡＺファミリーの一員であり、出生前および出生後の雌雄の生殖細胞において発現されるＲＮＡ結合タンパク質である。ヒトのＤＡＺＬ１は、配列番号１５のアミノ酸配列を有し得る。
　本明細書において、がん抗原タンパク質に由来する、ヘルパーＴ細胞活性化能を有するペプチドを、「ヘルパーペプチド」と称する。
　ＳＹＣＰ３由来のヘルパーペプチドの例として、アミノ酸配列ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱ（配列番号３）またはＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＳ（配列番号４）を含むペプチドが挙げられる。ある実施態様では、ヘルパーペプチドは、配列番号３または４のアミノ酸配列を含み、配列番号１のアミノ酸配列中の連続するアミノ酸からなるペプチドである。ある実施態様では、ヘルパーペプチドは、配列番号３または４のアミノ酸配列からなるペプチドである。ある実施態様では、ヘルパーペプチドは、ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＳＱ（配列番号５）、ＱＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＳ（配列番号６）、ＱＱＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱ（配列番号７）およびＱＱＱＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＳＱＲＬＫＴ（配列番号８）のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド、または、配列番号５～８のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチド、特に、配列番号５または６のアミノ酸配列からなるペプチドである。
　配列番号５～８のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドの例として、ＲＱＱＱＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＳＱＲＬＫＴ（配列番号２２）、ＬＮＭＦＲＱＱＱＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＳＱＲＬＫＴ（配列番号２３）、ＱＱＱＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＳＱＲＬＫＴＩ（配列番号２４）またはＱＱＱＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＳＱＲＬＫＴＩＫＱＬＹ（配列番号２５）のアミノ酸配列を含むペプチド、または、配列番号２２～２５のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
　ＳＹＣＰ３由来のヘルパーペプチドの別の例として、アミノ酸配列ＫＩＬＱＱＳＲＶＶＱ（配列番号２６）またはＫＩＬＱＱＳＲＶＶＱＳ（配列番号２７）を含むペプチド、または、配列番号２６または２７のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。ある実施態様では、ヘルパーペプチドは、ＫＩＬＱＱＳＲＶＶＱＳＱ（配列番号２８）、ＱＫＩＬＱＱＳＲＶＶＱＳ（配列番号２９）、ＱＱＫＩＬＱＱＳＲＶＶＱ（配列番号３０）、ＱＱＱＫＩＬＱＱＳＲＶＶＱＳＱＲＬＫＴ（配列番号３１）、ＲＱＱＱＫＩＬＱＱＳＲＶＶＱＳＱＲＬＫＴ（配列番号３２）、ＬＮＭＦＲＱＱＱＫＩＬＱＱＳＲＶＶＱＳＱＲＬＫＴ（配列番号３３）、ＱＱＱＫＩＬＱＱＳＲＶＶＱＳＱＲＬＫＴＩ（配列番号３４）およびＱＱＱＫＩＬＱＱＳＲＶＶＱＳＱＲＬＫＴＩＫＱＬＹ（配列番号３５）のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド、または、配列番号２８～３５のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである。
　本明細書において、配列番号３および４のアミノ酸配列をまとめて、配列（Ｉ）：ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＸと表す場合があり、ここで、Ｘは存在しないか、またはＳである。本明細書において、配列番号２６および２７のアミノ酸配列をまとめて、配列（Ｉ’）：ＫＩＬＱＱＳＲＶＶＱＸと表す場合があり、ここで、Ｘは存在しないか、またはＳである。
　ＳＰＥＳＰ１由来のヘルパーペプチドの例として、アミノ酸配列ＱＮＬＮＨＹＩＱＶＬＥＮＬＶＲＳＶＰＳ（配列番号９）を含むペプチドが挙げられる。ある実施態様では、ヘルパーペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列を含み、配列番号２のアミノ酸配列中の連続するアミノ酸からなるペプチドである。ある実施態様では、ヘルパーペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列からなるペプチドである。
　ＤＡＺＬ１由来のヘルパーペプチドの例として、ＤＶＱＫＩＶＥＳＱＩＮＦＨＧＫＫＬＫＬＧＰＡＩＲＫＱＮＬＣＡＹＨＶＱＰＲＰＬ（配列番号１６）のアミノ酸配列中の連続する１０個以上のアミノ酸の配列を含むペプチドが挙げられる。ある実施態様では、ヘルパーペプチドは、配列番号１６のアミノ酸配列中の連続する２０個以上のアミノ酸の配列を含むペプチドである。ある実施態様では、ヘルパーペプチドは、配列番号１６のアミノ酸配列中の連続する１０個以上または２０個以上のアミノ酸の配列を含み、配列番号１５のアミノ酸配列中の連続するアミノ酸の配列からなるペプチドである。ある実施態様では、ヘルパーペプチドは、配列番号１６、ＤＶＱＫＩＶＥＳＱＩＮＦＨＧＫＫＬＫＬＧ（配列番号１７）、ＩＮＦＨＧＫＫＬＫＬＧＰＡＩＲＫＱＮＬＣ（配列番号１８）、ＬＧＰＡＩＲＫＱＮＬＣＡＹＨＶＱＰＲＰＬ（配列番号１９）、ＤＶＱＫＩＶＥＳＱＩＮＦＨＧＫＫＬＫＬＧＰＡＩＲＫＱＮＬＣ（配列番号２０）、および、ＩＮＦＨＧＫＫＬＫＬＧＰＡＩＲＫＱＮＬＣＡＹＨＶＱＰＲＰＬ（配列番号２１）のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド、または、配列番号１６～２１のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである。
　ヘルパーペプチドの長さは、ＭＨＣクラスＩＩ分子との結合が可能なものであればよく、例えば、１０～４５、１０～４０、１０～３５、１０～３０または１０～２５アミノ酸である。例えば、１０～１８、１０～１９、１０～２０、１１～１８、１１～１９、１１～２０、１２～１８、１２～１９または１２～２０アミノ酸のヘルパーペプチドを使用し得る。一般的に、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合して提示される抗原ペプチドは、約９個のアミノ酸残基からなるＭＨＣクラスＩＩ分子結合モチーフがＭＨＣクラスＩＩ分子のペプチド収容溝に結合し、ペプチドの両端は溝の両端からはみ出すことができるために、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合できるペプチドの長さには原則的に制限はないと考えられている。例えば、１０～４５、１５～４０または２０～３８アミノ酸のヘルパーペプチドも使用し得る。しかし多くの場合、長いペプチドはペプチダーゼで切られ、１３～１７個のアミノ酸の長さになっている（Immunobiology, 5th Edt., 116-117, Garland Publishing (2001)）。
　ヘルパーペプチドは、前記いずれかのヘルパーペプチドのアミノ酸配列において、１個またはそれ以上のアミノ酸が、置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。置換、欠失または付加されるアミノ酸残基の数および位置は、ヘルパーＴ細胞活性化能が維持される限り、任意である。例えば、前記いずれかのヘルパーペプチドのアミノ酸配列において、１～９個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、例えば１個のアミノ酸が、置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであり得る。アミノ酸の置換、付加または欠失は、ペプチド中のＮ末端またはＣ末端で行われても、配列内部で行われてもよい。上記のヘルパーペプチドの性質から、ペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加されるアミノ酸の数に制限はなく、例えば、１～２０個、１～１５個または１～１０個であり得る。
　ペプチド中のアミノ酸の置換はいずれの種類のアミノ酸との間で行われてもよく、保存的なアミノ酸置換が好ましい。「保存的なアミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することを意味する。アミノ酸残基はその側鎖によって、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、脂肪族側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン）芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）、アミド側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン）、含硫側鎖（例えば、システイン、メチオニン）のように、いくつかのファミリーに分類できる。保存的なアミノ酸置換は、好ましくは、同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。保存的なアミノ酸置換の例としては、グルタミン酸残基をアスパラギン酸残基に、フェニルアラニン残基をチロシン残基に、ロイシン残基をイソロイシン残基に、イソロイシン残基をバリン残基に、アラニン残基をセリン残基に、ヒスチジン残基をアルギニン残基に置換することなどが挙げられる。
　ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合して提示される抗原ペプチドの配列には規則性（モチーフ）がある。ペプチドはＭＨＣクラスＩＩ分子のペプチド収容溝に沿ってはまり込み、固定される。ペプチド収容溝にペプチド上のアミノ酸残基の側鎖が結合することと、すべてのＭＨＣクラスＩＩ分子のペプチド収容溝によく保存されているアミノ酸残基の側鎖とペプチド主鎖とが結合することにより、ペプチドがペプチド収容溝の中に固定される。ペプチド収容溝にある大小のポケットを構成するアミノ酸残基には多型性があり、異なる対立遺伝子由来のＭＨＣクラスＩＩ分子のそれぞれについて、結合するペプチドに共通するアミノ酸残基のパターンを解析することにより、ＭＨＣクラスＩＩ分子のペプチド収容溝のポケット部分に結合するアミノ酸残基のモチーフを推定できる。従って、所望のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合性を有するペプチドに共通するモチーフを維持するように、アミノ酸を置換してもよい。
　ある実施態様において、ＳＹＣＰ３またはＳＰＥＳＰ１由来のヘルパーペプチドは、ＨＬＡ－ＤＲ、特にはＨＬＡ－ＤＲ５３に結合してヘルパーＴ細胞を活性化し得るが、これに限定されない。ある実施態様において、ＤＡＺＬ１由来のヘルパーペプチドは、ＨＬＡ－ＤＲ、特にはＨＬＡ－ＤＲ４、８、９、１５または５３に結合してヘルパーＴ細胞を活性化し得るが、これに限定されない。ある実施態様において、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＤＡＺＬ１由来のヘルパーペプチドは、ＨＬＡ－ＤＲ４、９または５３に結合してヘルパーＴ細胞を活性化し得るが、これに限定されない。ある実施態様において、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＤＡＺＬ１由来のヘルパーペプチドは、ＨＬＡ－ＤＲ１５に結合してヘルパーＴ細胞を活性化し得るが、これに限定されない。ある実施態様において、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＤＡＺＬ１由来のヘルパーペプチドは、ＨＬＡ－ＤＲ８に結合してヘルパーＴ細胞を活性化し得るが、これに限定されない。
　ペプチドのアミノ酸残基は、公知の方法で修飾されていてもよい。例えば、アミノ酸残基の側鎖中の官能基、Ｎ末端アミノ酸のアミノ基、またはＣ末端アミノ酸のカルボキシル基に、エステル化、アルキル化、アシル化（例えばアセチル化）、ハロゲン化、リン酸化などを施し得る。ある実施態様では、ヘルパーペプチドのＮ末端はアセチル化されている。また、ヘルパーペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に、種々の物質を結合させることができる。例えば、アミノ酸、ペプチド、それらのアナログ等を結合させてもよい。例えば、ヒスチジンタグを付加してもよく、チオレドキシン等のタンパク質とともに融合タンパク質となっていてもよい。あるいは、ヘルパーペプチドに検出可能な標識を結合させてもよい。ヘルパーペプチドにこれらの物質が結合している場合、これらの物質が例えば、生体内酵素などにより、あるいは細胞内プロセッシングなどの過程により処理され、最終的にヘルパーペプチドを生じるものであってもよい。これらの物質は、ヘルパーペプチドの溶解性を調節するものであってもよく、耐プロテアーゼ作用等その安定性を向上させるものであってもよく、また例えば、所定の組織・器官に特異的にヘルパーペプチドをデリバリーするようなものであってもよく、あるいはまた抗原提示細胞の取込み効率を増強させる作用などを有するものであってもよい。これらの物質はまた、ＣＴＬ誘導能を増大させるもの、例えば、ヘルパーＴ細胞を活性化する他のペプチドであってもよい。
　ペプチドは、当該技術分野において通常用いられる方法またはそれらの変法を用いて合成することができる。かかる合成方法は、例えば、Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966；The Proteins, Vol 2, Academic Press Inc., New York, 1976；ペプチド合成、丸善（株），1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株），1985；医薬品の開発  続  第１４巻・ペプチド合成、広川書店，1991などに記載されている。ペプチドはまた、当該ペプチドをコードするヌクレオチド配列情報に基づき、遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。かかる遺伝子工学的手法は、当業者に周知のものである。これらの手法は、文献に記載される方法などに準じて行うことができる（例えば、Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983)、DNA Cloning, DM.Glover, IRL PRESS (1985)）。
　一般的に、ヘルパーＴ細胞は、Ｔ細胞表面のＴＣＲ・ＣＤ３複合体が抗原提示細胞表面のＭＨＣクラスＩＩ分子を介して抗原ペプチドを認識し、Ｔ細胞表面のインテグリンが抗原提示細胞表面のインテグリンリガンドで刺激されることにより、活性化される。本明細書において、ヘルパーＴ細胞の活性化には、ヘルパーＴ細胞の誘導または増殖促進、およびヘルパーＴ細胞からのサイトカイン産生の誘導が含まれる。
　ペプチドがヘルパーＴ細胞活性化能を有することは、当該変異体の候補ペプチドを合成し、それがヘルパーＴ細胞を活性化できるか否かを試験することにより、決定し得る。試験には、例えば、Hassane M. Zarour et al., Cancer Research 62, 213-218, January 1, 2002 に記載の方法、実施例記載の方法、または、下記の方法を用い得る。
　まず、ヒトから末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を回収し、浮遊細胞を除去することにより樹状細胞（付着細胞）を調製する。また別途、同一のヒトから Ficoll-Paque の密度勾配遠心法または磁気細胞分離システム等によりヘルパーＴ細胞（ＣＤ４陽性Ｔ細胞）を調製する。次に、前記樹状細胞に候補ペプチドを添加して培養した後、この樹状細胞と前記ヘルパーＴ細胞とを混合培養する。その後ヘルパーＴ細胞を回収し、候補ペプチドと培養した樹状細胞で同様に何回か刺激する。ペプチド刺激に反応してヘルパーＴ細胞が活性化（誘導）されたことは、例えば（１）当該ヘルパーＴ細胞の増殖活性や、（２）ヘルパーＴ細胞によるサイトカイン産生活性を測定することにより、調べることができる。ここで（１）の増殖活性は、例えば、ヘルパーＴ細胞内に取り込まれる［３Ｈ］－チミジン量を測定することにより調べることができる。また（２）のサイトカイン産生活性は、例えば、活性化ヘルパーＴ細胞が産生するＩＦＮ－γなどのサイトカインの量を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等により測定することによって調べることができる。
　ある態様では、本願は、前記ヘルパーペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのいかなる核酸の形態であっても良い。これらのポリヌクレオチドは、ペプチドのアミノ酸配列情報およびそれをコードするＤＮＡの配列情報に基づき容易に製造することができる。具体的には、通常のＤＮＡ合成やＰＣＲによる増幅などによって、製造することができる。
　ヘルパーペプチドをコードするポリヌクレオチドには、当該ポリヌクレオチドの相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、ヘルパーＴ細胞活性化能を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。ここに、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983) 等に記載される通常の方法に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×ＳＳＣ（１.５Ｍ ＮａＣｌ、０.１５Ｍ クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×ＳＳＣとする）、５０％ホルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、２×ＳＳＣで５０℃にて洗浄するような条件（Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6）等を挙げることができる。
　前記で作製されたポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込むことにより、ヘルパーペプチドを発現するための組換え発現ベクターを作製することができる。ここで用いる発現ベクターは、用いる宿主や目的等に応じて適宜選択することができ、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。例えば、宿主が大腸菌の場合、ベクターとしては、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２、ｐＣＲ３等のプラスミドベクター、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１１などのファージベクターが挙げられる。宿主が酵母の場合、ベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＥＵｒａ３などが挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合には、ｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ－Ａなどが挙げられる。宿主が動物細胞の場合には、ｐＫＣＲ、ｐＣＤＭ８、ｐＧＬ２、ｐｃＤＮＡ３.１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶなどのプラスミドベクターや、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。
　前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、シグナル配列をコードする遺伝子、選択用マーカー遺伝子、ターミネーターなどの因子を適宜有していても良い。
　また、単離精製が容易になるように、チオレドキシン、Ｈｉｓタグ、あるいはＧＳＴ（グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ）等との融合タンパク質をもたらす配列が付加されていても良い。この場合、宿主細胞内で機能する適切なプロモーター（ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ＣＭＶ、ＳＶ４０初期プロモーターなど）を有するＧＳＴ融合タンパクベクター（ｐＧＥＸ４Ｔなど）や、Ｍｙｃ、Ｈｉｓなどのタグ配列を有するベクター（ｐｃＤＮＡ３.１／Ｍｙｃ－Ｈｉｓなど）、さらにはチオレドキシンおよびＨｉｓタグとの融合タンパク質を発現するベクター（ｐＥＴ３２ａ）などを用いることができる。
　前記で作製された発現ベクターで宿主を形質転換することにより、当該発現ベクターを含有する形質転換細胞を作製することができる。ここで用いられる宿主としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。大腸菌としては、E.coli K-12系統のＨＢ１０１株、Ｃ６００株、ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＡＤ４９４（ＤＥ３）株などが挙げられる。また酵母としては、サッカロミセス・セルビジエなどが挙げられる。動物細胞としては、Ｌ９２９細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞などが挙げられる。昆虫細胞としてはｓｆ９などが挙げられる。
　宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、前記宿主細胞に適合した通常の導入方法を用いれば良い。具体的にはリン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子導入用リピッド（Lipofectamine、Lipofectin; Gibco-BRL社）を用いる方法などが挙げられる。導入後、選択マーカーを含む通常の培地にて培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形質転換細胞を選択することができる。
　以上のようにして得られた形質転換細胞を好適な条件下で培養することにより、ヘルパーペプチドを製造することができる。得られたペプチドは、一般的な生化学的精製手段により、さらに単離・精製することができる。ここで精製手段としては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。またヘルパーペプチドを、前述のチオレドキシンやＨｉｓタグ、ＧＳＴ等との融合タンパク質として発現させた場合は、これら融合タンパク質やタグの性質を利用した精製法により単離・精製することができる。
　ある態様では、前記ヘルパーペプチドに特異的に結合する抗体が提供される。抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。これらは、周知の製造方法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons.、Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H, D.ら編, Cold Spring Harber Laboratory Press 出版 New York 1989）。ポリクローナル抗体は、ペプチドを免疫原として用い、ウサギ等の非ヒト動物を免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることができる。一方、モノクローナル抗体は、ペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる。宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めてもよい。
　これらの抗体は、前記ヘルパーペプチドを認識し、さらにはその活性を中和し得る。従って、これらの抗体を、アフィニティークロマトグラフィー、免疫学的診断等に使用し得る。免疫学的診断は、例えば、イムノブロット法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光あるいは発光測定法等より実施し得る。このような免疫学的診断は、ＤＮＡメチル化の阻害によりＳＹＣＰ３、ＳＰＥＳＰ１またはＤＡＺＬ１を発現するがん、例えば、白血病を含む血液疾患、悪性黒色腫、乳癌、頭頸部腫瘍、泌尿器系腫瘍、食道癌、肝臓癌、肺癌または大腸癌等の診断において有効である。
　ある態様では、本願は、ヘルパーペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子とを有するＨＬＡマルチマーを提供する。本明細書において、ＨＬＡマルチマーとは、ＨＬＡタンパク質をペプチドと会合させた複合体（ＨＬＡモノマー）を、公知の手法を用いて２つまたはそれ以上結合させることにより多量体化したものをいう。ＳＹＣＰ３またはＳＰＥＳＰ１由来のヘルパーペプチドと複合体化するＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ－ＤＲ５３であり得るが、これに限定されない。ＤＡＺＬ１由来のヘルパーペプチドと複合体化するＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ－ＤＲ４、８、９、１５または５３であり得るが、これに限定されない。マルチマーは、結合したヘルパーＴ細胞を、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡等の公知の検出手段により容易に選別または検出できるように、蛍光標識されていてもよい。ＨＬＡマルチマーは、テトラマー、ペンタマー、デンドリマーなどであり得、例えば、ＨＬＡモノマーをビオチン化し、アビジンに結合させることにより４量体化したＨＬＡテトラマーであり得る。ＨＬＡテトラマーとして、種々の抗原ペプチドを含有するものが市販されており、ヘルパーペプチドを含むＨＬＡテトラマーを容易に作製することができる（Science 279: 2103-2106(1998)、Science 274: 94-96 (1996)）。
　ある態様では、本願は、ヘルパーペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子との複合体を提示する、抗原提示細胞を提供する。ある実施形態において、ＳＹＣＰ３またはＳＰＥＳＰ１由来のヘルパーペプチドと複合体化するＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ－ＤＲ５３であり得るが、これに限定されない。ＤＡＺＬ１由来のヘルパーペプチドと複合体化するＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ－ＤＲ４、８、９、１５または５３であり得るが、これに限定されない。抗原提示細胞は、ヘルパーペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子との複合体をヘルパーＴ細胞に提示することができる細胞であって、例えば、樹状細胞、末梢血単核球に由来し得る。
　当該抗原提示細胞は、当業者に周知の手法で抗原提示能を有する細胞にペプチドを添加することにより、調製され得る。ペプチドの細胞への添加は、当該ペプチドを用いて直接的に、あるいは前記ポリヌクレオチド、前記発現ベクターまたは前記形質転換細胞を用いて間接的に、行われ得る。具体的には、ペプチドの細胞への添加は、ペプチドと抗原提示能を有する細胞とを接触させることにより、または前記ポリヌクレオチドもしくは前記発現ベクターを細胞に導入することにより、行うことができる（Cancer Immunol. Immunother. 46:82, 1998、J. Immunol., 158: p1796,1997、Cancer Res., 59: p1184, 1999 Cancer Res., 56: p5672, 1996、J.Immunol., 161: p5607, 1998、J. Exp. Med., 184: p465, 1996）。本明細書において、抗原提示能を有する細胞とは、ＨＬＡクラスＩＩ分子を細胞表面に発現する細胞であり、例えば、末梢血単核球または樹状細胞である。抗原提示細胞による抗原提示は、例えば、実施例に記載の通り、ヘルパーＴ細胞の活性により確認することができる。ヘルパーＴ細胞の活性は、例えば、インターフェロンγなどのサイトカインの産生により確認し得る。当該抗原提示細胞は、例えば、細胞療法（例えば、樹状細胞療法）において有効成分として用いられ得る。
　さらなる態様では、抗原提示細胞を調製するための、前記ヘルパーペプチド、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記マルチマー、またはこれらのいずれかを含む細胞が提供される。さらなる態様では、抗原提示細胞を調製するための、前記ヘルパーペプチド、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記マルチマー、またはこれらのいずれかを含む細胞の使用が提供される。
　前記抗原提示細胞は、ヘルパーペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子との複合体を認識するヘルパーＴ細胞を活性化し得る。従って、本願は、ある態様では、前記ヘルパーペプチド、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記マルチマー、これらのいずれかを含む細胞または前記抗原提示細胞を含む、ヘルパーＴ細胞の活性化剤を提供する。
　活性化されたヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞の誘導・増殖・活性化を促進することにより免疫系を活性化する機能を有する。従って、前記ヘルパーＴ細胞の活性化剤または活性化されたヘルパーＴ細胞を、Ｂ細胞および／または細胞傷害性Ｔ細胞の誘導・増殖・活性化を促進するために、または、それにより免疫系を活性化するために、用いることができる。
　当該活性化剤は、前記有効成分以外に、例えば、適当な担体、賦形剤、添加剤などを含んでいてもよい。当該活性化剤は、インビトロでもインビボでも使用でき、インビボでは、後述する医薬組成物に準じて使用し得る。当該活性化剤の適用方法は、所望のヘルパーＴ細胞の活性化の程度、抗原提示細胞の状態などの条件に応じて適宜選択することができ、例えば、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、経鼻投与、経口投与などにより対象に投与すること、あるいは細胞培養液に添加することなどが挙げられるが、これらに限定されない。当該活性化剤に含まれる有効成分の量、組成物の形態、適用回数などは、所望のヘルパーＴ細胞の活性化の程度、抗原提示細胞の状態などの条件に応じて適宜選択することができる。
　ある態様では、ヘルパーＴ細胞を活性化するための、前記ヘルパーペプチド、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記マルチマー、これらのいずれかを含む細胞または前記抗原提示細胞が提供される。ある態様では、ヘルパーＴ細胞の活性化剤を製造するための、前記ヘルパーペプチド、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記マルチマー、これらのいずれかを含む細胞または前記抗原提示細胞の使用が提供される。ある態様では、前記ヘルパーペプチド、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記マルチマー、これらのいずれかを含む細胞または前記抗原提示細胞を対象に投与することを含む、ヘルパーＴ細胞を活性化する方法が提供される。ある態様では、前記ヘルパーペプチド、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記マルチマー、これらのいずれかを含む細胞または前記抗原提示細胞をインビトロでヘルパーＴ細胞に添加することを含む、ヘルパーＴ細胞を活性化する方法が提供される。
　ある態様では、前記ヘルパーペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子との複合体を認識するヘルパーＴ細胞が提供される。ＳＹＣＰ３またはＳＰＥＳＰ１由来のヘルパーペプチドと複合体化するＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ－ＤＲ５３であり得るが、これに限定されない。ＤＡＺＬ１由来のヘルパーペプチドと複合体化するＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ－ＤＲ４、８、９、１５または５３であり得るが、これに限定されない。当該ヘルパーＴ細胞は、当該技術分野における公知の手法を用いて当業者が容易に調製することができる（Iwata, M. et al., Eur. J. Immunol, 26, 2081(1996)）。
　本願は、別の態様において、１つまたはそれ以上の前記ヘルパーペプチド、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記マルチマー、これらのいずれかを含む細胞、前記抗原提示細胞または前記ヘルパーＴ細胞を有効成分として含む、医薬組成物を提供する。当該医薬組成物は、がんを処置または予防するために、あるいは、それを補助するために、用いることができる。ある実施態様では、当該医薬組成物はがんワクチンである。
　当該医薬組成物により、ＤＮＡメチル化の阻害によりＳＹＣＰ３、ＳＰＥＳＰ１またはＤＡＺＬ１を発現するがんを処置または予防し得る。ＤＮＡメチル化の阻害によりＳＹＣＰ３、ＳＰＥＳＰ１またはＤＡＺＬ１を発現するがんは、固形腫瘍または血液腫瘍であり得、例えば、白血病を含む血液疾患、悪性黒色腫、乳癌、頭頸部腫瘍、泌尿器系腫瘍、食道癌、肝臓癌、肺癌または大腸癌である。また、ある実施態様では、ヘルパーペプチドがＳＹＣＰ３またはＳＰＥＳＰ１由来である場合、当該医薬組成物は、ＨＬＡ－ＤＲ５３を有する対象に投与し得るが、これに限定されない。ある実施態様では、ヘルパーペプチドがＤＡＺＬ１由来である場合、当該医薬組成物は、ＨＬＡ－ＤＲ４、８、９、１５または５３を有する対象に投与し得るが、これに限定されない。
　当該医薬組成物は、有効成分以外に、例えば、担体、賦形剤などを含んでいてもよい。前記医薬組成物の投与方法は、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて適宜選択することができる。投与方法として、例えば、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、経鼻投与、経口投与などが挙げられるが、これらに限定されない。当該医薬組成物に含まれる前記有効成分の量、医薬組成物の剤形、投与回数などは、疾患の種類、対象の状態、標的部位などの条件に応じて適宜選択することができる。
　当該医薬組成物は、１種またはそれ以上のさらなる有効成分を含有してもよく、それと併用してもよい。さらなる有効成分としては、例えば、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗がん性抗生物質、微小管作用薬、白金製剤、トポイソメラーゼ阻害剤、分子標的治療薬、がんワクチン、免疫調節薬、免疫チェックポイント阻害薬、ＤＮＡメチル基転移酵素阻害剤などの化学療法剤、または、ヘルパーＴ細胞もしくは細胞傷害性Ｔ細胞の活性化剤、増殖剤もしくは誘導剤などが挙げられる。さらなる有効成分およびその治療上有効量は、通常の臨床医の技術および判断の範囲内で決定され得る。当該医薬組成物は、化学療法、放射線療法、免疫療法、造血幹細胞移植および外科手術等の他の療法と並行して、または、それらの前または後に、使用してもよい。
　ある実施態様では、さらなる有効成分は、ＤＮＡメチル基転移酵素阻害剤である。ＤＮＡメチル基転移酵素阻害剤の例としては、例えば、J. Med. Chem. 2015, 58, 2569-2583に記載される薬剤であり、その一例としては、デシタビン、グアデシタビン、アザシチジン、ゼブラリン、テトラヒドロウリジン、テトラヒドロウリジンおよびその誘導体であって、特にデシタビンやアザシチジンが挙げられる。
　成分を「併用する」ことは、全成分を含有する投与形の使用および各成分を別個に含有する投与形の組合せ（キット）の使用のみならず、それらが同一の疾患の処置に使用される限り、各成分を同時もしくは連続的に、または、いずれかの成分を遅延して投与することも意味する。
　ある態様では、前記ヘルパーペプチド、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記マルチマー、これらのいずれかを含む細胞、前記抗原提示細胞または前記ヘルパーＴ細胞の有効量を対象に投与する工程を含む、がんを処置または予防するための方法が提供される。
　ある態様では、医薬、例えばがんの処置または予防のための医薬として使用するための、前記ヘルパーペプチド、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記マルチマー、これらのいずれかを含む細胞、前記抗原提示細胞または前記ヘルパーＴ細胞が提供される。
　ある態様では、医薬、例えばがんの処置または予防のための医薬を製造するための、前記ヘルパーペプチド、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、前記マルチマー、これらのいずれかを含む細胞、前記抗原提示細胞または前記ヘルパーＴ細胞の使用が提供される。
　本願は、なお別の態様において、対象におけるステルスがん抗原特異的ヘルパーＴ細胞の存在または量を決定する方法であって、
（ａ）前記対象から取得した試料をヘルパーペプチドで刺激する工程、および、
（ｂ）ヘルパーＴ細胞またはそれにより産生されるサイトカインの量を調べる工程、
を含み、ヘルパーＴ細胞またはそれにより産生されるサイトカインの量の増加がステルスがん抗原特異的ヘルパーＴ細胞の存在または量を示すものである方法を提供する。試料は、抗原提示細胞を含むものであればいかなるものであってもよく、例えば、末梢血単核球、浸潤性リンパ球、腫瘍細胞、腹水中の細胞、胸水中の細胞、脳脊髄液中の細胞、骨髄細胞、またはリンパ節細胞などが挙げられる。試料は、健常人由来であっても、がん患者由来であってもよい。健常人由来の試料を用いることにより、例えば、がんに罹患しているかどうか、あるいはその素因を有するかどうかを診断することなどが可能になる。がん患者由来の試料を用いることにより、例えば、当該がん患者においてステルスがん抗原を用いる免疫療法が効果を有するかどうかを予測することなどが可能になる。ある実施形態において、ＳＹＣＰ３またはＳＰＥＳＰ１に由来するヘルパーペプチド特異的ヘルパーＴ細胞の量を決定される対象は、ＨＬＡ－ＤＲ陽性、特にはＨＬＡ－ＤＲ５３陽性であるが、これに限定されない。ある実施形態において、ＤＡＺＬ１に由来するヘルパーペプチド特異的ヘルパーＴ細胞の量を決定される対象は、ＨＬＡ－ＤＲ陽性、特にはＨＬＡ－ＤＲ４、８、９、１５または５３陽性であるが、これに限定されない。取得した試料は、ヘルパーペプチドによる刺激の前後に培養されてもよく、前記培養条件は当業者が適宜決定することができる。ヘルパーペプチドを用いたこれらの細胞の刺激は、公知の手法を用いて行うことができ、インビトロまたはインビボのいずれにおいて行われてもよい。ヘルパーＴ細胞またはそれにより産生されるサイトカインの量は、公知の方法により調べることができる。
　本願は、例えば、下記の実施態様を提供する。
［１］ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＸ（ここで、Ｘは存在しないか、またはＳである）またはＱＮＬＮＨＹＩＱＶＬＥＮＬＶＲＳＶＰＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含む、１０個～２５個のアミノ酸からなるペプチド。
［２］ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＸ（ここで、Ｘは存在しないか、またはＳである）のアミノ酸配列を含む、第１項に記載のペプチド。
［３］配列番号１のアミノ酸配列中の連続するアミノ酸からなる、第１項または第２項に記載のペプチド。
［４］ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱ（配列番号３）、ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＳ（配列番号４）、ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＳＱ（配列番号５）、ＱＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＳ（配列番号６）またはＱＱＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱ（配列番号７）、ＱＱＱＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＳＱＲＬＫＴ（配列番号８）のアミノ酸配列を含む、第１項～第３項のいずれかに記載のペプチド。
［５］配列番号３～８のいずれかのアミノ酸配列からなる、第１項～第４項のいずれかに記載のペプチド。
［６］配列番号３または４のアミノ酸配列を含む、第１項～第３項のいずれかに記載のペプチド。
［７］配列番号３または４のアミノ酸配列からなる、第１項～第３項および第６項のいずれかに記載のペプチド。
［８］配列番号３のアミノ酸配列を含む、第１項～第３項のいずれかに記載のペプチド。
［９］配列番号３のアミノ酸配列からなる、第１項～第３項および第８項のいずれかに記載のペプチド。
［１０］配列番号４のアミノ酸配列を含む、第１項～第３項のいずれかに記載のペプチド。
［１１］配列番号４のアミノ酸配列からなる、第１項～第３項および第１０項のいずれかに記載のペプチド。
［１２］配列番号５～８のいずれかのアミノ酸配列を含む、第１項～第３項のいずれかに記載のペプチド。
［１３］配列番号５～８のいずれかのアミノ酸配列からなる、第１項～第３項および第１２項のいずれかに記載のペプチド。
［１４］配列番号５～７のいずれかのアミノ酸配列を含む、第１項～第３項のいずれかに記載のペプチド。
［１５］配列番号５～７のいずれかのアミノ酸配列からなる、第１項～第３項および第１４項のいずれかに記載のペプチド。
［１６］配列番号５または６のアミノ酸配列を含む、第１項～第３項のいずれかに記載のペプチド。
［１７］配列番号５または６のアミノ酸配列からなる、第１項～第３項および第１６項のいずれかに記載のペプチド。
［１８］配列番号５のアミノ酸配列を含む、第１項～第３項のいずれかに記載のペプチド。
［１９］配列番号５のアミノ酸配列からなる、第１項～第３項および第１８項のいずれかに記載のペプチド。
［２０］ＱＮＬＮＨＹＩＱＶＬＥＮＬＶＲＳＶＰＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含む、第１項に記載のペプチド。
［２１］配列番号２のアミノ酸配列中の連続するアミノ酸からなる、第１項または第２０項に記載のペプチド。
［２２］配列番号９のアミノ酸配列からなる、第１項、第２０項または第２１項に記載のペプチド。
［２３］ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＸ（ここで、Ｘは存在しないか、またはＳである）またはＱＮＬＮＨＹＩＱＶＬＥＮＬＶＲＳＶＰＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含む、１０個～２５個のアミノ酸からなるペプチド、または、
前記ペプチドのアミノ酸配列において１個～３個のアミノ酸が置換、欠失または付加されたアミノ酸配列からなり、ヘルパーＴ細胞活性化能を有するペプチド。
［２４］第１項～第２３項のいずれかに記載のペプチドをコードする核酸。
［２５］第２４項に記載の核酸を含む発現ベクター。
［２６］第２５項に記載の発現ベクターを含有する形質転換細胞。
［２７］第１項～第２３項のいずれかに記載のペプチドに特異的に結合する抗体。
［２８］第１項～第２３項のいずれかに記載のペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子とを有するＨＬＡマルチマー。
［２９］第１項～第２３項のいずれかに記載のペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子との複合体を提示する、抗原提示細胞。
［３０］第１項～第２３項のいずれかに記載のペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子との複合体を認識する、ヘルパーＴ細胞。
［３１］第１項～第２３項のいずれかに記載のペプチド、第２４項に記載の核酸、第２５項に記載の発現ベクター、第２８項に記載のＨＬＡマルチマー、第２９項に記載の抗原提示細胞、または、第３０項に記載のヘルパーＴ細胞を含む、医薬組成物。
［３２］がんの治療または予防のための、第３１項に記載の医薬組成物。
［３３］がんワクチンである、第３１項または第３２項に記載の医薬組成物。
［３４］がんが肺癌または大腸癌である、第３２項または第３３項に記載の医薬組成物。
［３５］第１項～第２３項のいずれかに記載のペプチド、第２４項に記載の核酸、第２５項に記載の発現ベクター、第２８項に記載のＨＬＡマルチマー、または、第２９項に記載の抗原提示細胞を含む、ヘルパーＴ細胞の活性化剤。
　本願は、例えば、さらに下記の実施態様を提供する。
［１］ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＸ（ここで、Ｘは存在しないか、またはＳである）のアミノ酸配列；
　ＤＶＱＫＩＶＥＳＱＩＮＦＨＧＫＫＬＫＬＧＰＡＩＲＫＱＮＬＣＡＹＨＶＱＰＲＰＬ（配列番号１６）のアミノ酸配列中の連続する１０個以上のアミノ酸の配列；または、
　ＱＮＬＮＨＹＩＱＶＬＥＮＬＶＲＳＶＰＳ（配列番号９）のアミノ酸配列
を含む、１０個～４５個のアミノ酸からなるペプチド、または、
　前記のいずれかのペプチドにおいて１個～３個のアミノ酸が置換、欠失または付加され、かつ、ヘルパーＴ細胞活性化能を有するペプチド。
［２］ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＸ（ここで、Ｘは存在しないか、またはＳである）のアミノ酸配列を含み、１０個～２５個のアミノ酸からなるペプチド、または、
　当該ペプチドにおいて１個のアミノ酸が置換、欠失または付加され、かつ、ヘルパーＴ細胞活性化能を有するペプチド
である、第１項に記載のペプチド。
［３］ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＸ（ここで、Ｘは存在しないか、またはＳである）またはＫＩＬＱＱＳＲＶＶＱＸ（ここで、Ｘは存在しないか、またはＳである）のアミノ酸配列を含み、１０個～２５個のアミノ酸からなる、第２項に記載のペプチド。
［４］配列番号５～７および２８～３０のいずれかのアミノ酸配列を含む、第２項または第３項に記載のペプチド。
［５］配列番号３～８および２２～３５のいずれかのアミノ酸配列からなる、第２項または第３項に記載のペプチド。
［６］ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＸ（ここで、Ｘは存在しないか、またはＳである）のアミノ酸配列を含み、１０個～２５個のアミノ酸からなる、第２項に記載のペプチド。
［７］配列番号１のアミノ酸配列中の連続するアミノ酸の配列からなる、第６項に記載のペプチド。
［８］配列番号５～７のいずれかのアミノ酸配列を含む、第６項または第７項に記載のペプチド。
［９］配列番号３～８および２２～２５のいずれかのアミノ酸配列からなる、第６項または第７項に記載のペプチド。
［１０］配列番号３～８のいずれかのアミノ酸配列からなる、第６項、第７項または第９項に記載のペプチド。
［１１］配列番号１６のアミノ酸配列中の連続する１０個以上のアミノ酸の配列を含み、１０個～４５個のアミノ酸からなるペプチド、または、
　当該ペプチドにおいて１個のアミノ酸が置換、欠失または付加され、かつ、ヘルパーＴ細胞活性化能を有するペプチド
である、第１項に記載のペプチド。
［１２］配列番号１６のアミノ酸配列中の連続する１０個以上のアミノ酸の配列を含み、１０個～４５個のアミノ酸からなる、第１１項に記載のペプチド。
［１３］配列番号１６のアミノ酸配列中の連続する２０個以上のアミノ酸の配列を含み、２０個～３８個のアミノ酸からなる、第１１項または第１２項に記載のペプチド。
［１４］配列番号１５のアミノ酸配列中の連続するアミノ酸の配列からなる、第１１項～第１３項のいずれかに記載のペプチド。
［１５］配列番号１６～２１のいずれかのアミノ酸配列を含む、第１１項～第１４項のいずれかに記載のペプチド。
［１６］配列番号１６～２１のいずれかのアミノ酸配列からなる、第１１項～第１５項のいずれかに記載のペプチド。
［１７］配列番号９のアミノ酸配列を含み、１０個～２５個のアミノ酸からなるペプチド、または、
　当該ペプチドにおいて１個のアミノ酸が置換、欠失または付加され、かつ、ヘルパーＴ細胞活性化能を有するペプチド
である、第１項に記載のペプチド。
［１８］配列番号９のアミノ酸配列を含み、１９個～２５個のアミノ酸からなる、第１７項に記載のペプチド。
［１９］配列番号２のアミノ酸配列中の連続するアミノ酸の配列からなる、第１７項または第１８項に記載のペプチド。
［２０］配列番号９のアミノ酸配列からなる、第１７項～第１９項のいずれかに記載のペプチド。
［２１］第１項～第２０項のいずれかに記載のペプチドをコードする核酸。
［２２］第２１項に記載の核酸を含む発現ベクター。
［２３］第１項～第２０項のいずれかに記載のペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子とを有するＨＬＡマルチマー。
［２４］第１項～第２０項のいずれかに記載のペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子との複合体を提示する、抗原提示細胞。
［２５］第１項～第２０項のいずれかに記載のペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子との複合体を認識する、ヘルパーＴ細胞。
［２６］第１項～第２０項のいずれかに記載のペプチド、第２１項に記載の核酸、第２２項に記載の発現ベクター、第２３項に記載のＨＬＡマルチマー、第２４項に記載の抗原提示細胞、または、第２５項に記載のヘルパーＴ細胞を含む、医薬組成物。
［２７］ＤＮＡメチル基転移酵素阻害剤をさらに含むか、または、ＤＮＡメチル基転移酵素阻害剤と併用される、第２６項に記載の医薬組成物。
［２８］ＤＮＡメチル基転移酵素阻害剤が、デシタビン、グアデシタビン、アザシチジン、ゼブラリン、テトラヒドロウリジン、テトラヒドロウリジンおよびその誘導体からなる群から選択される、第２７項に記載の医薬組成物。
［２９］ＤＮＡメチル基転移酵素阻害剤が、デシタビンおよびアザシチジンからなる群から選択される、第２７項または第２９項に記載の医薬組成物。［３０］がんの治療または予防のための、第２６項～第２９項のいずれかに記載の医薬組成物。
［３１］がんワクチンである、第２６項～第３０項のいずれかに記載の医薬組成物。
［３２］がんが、血液がん、悪性黒色腫、乳癌、頭頸部腫瘍、泌尿器系腫瘍、食道癌、肝臓癌、肺癌または大腸癌である、第３０項または第３１項に記載の医薬組成物。
［３３］がんが肺癌または大腸癌である、第３０項～第３２項のいずれかに記載の医薬組成物。
［３４］第１項～第２０項のいずれかに記載のペプチド、第２１項に記載の核酸、第２２項に記載の発現ベクター、第２３項に記載のＨＬＡマルチマー、または、第２４項に記載の抗原提示細胞を含む、ヘルパーＴ細胞の活性化剤。
　本明細書で引用するすべての文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
　上記の説明は、すべて非限定的なものであり、添付の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲から逸脱せずに、変更することができる。さらに、下記の実施例は、すべて非限定的な実施例であり、本発明を説明するためだけに供されるものである。
試験１：候補分子の探索
　ＤＮＡメチル基転移酵素阻害剤（５－アザ－２'－デオキシシチジン（デシタビン）；５－ＡＺＡ）によって遺伝子発現が再上昇する分子を同定するために、肺癌細胞株Ａ５４９を５－ＡＺＡ（１０μＭ）にて３日間処理後にＲＮＡを抽出し、ＤＮＡマイクロアレイにて未処理の癌細胞株において発現量が０に近く、かつ５－ＡＺＡ処理癌細胞株における発現量が３０倍以上増加している分子を探索した。その結果、ＳＹＣＰ３（未処理：３.０、５－ＡＺＡ処理後：３４０.９、発現上昇率：１１２.３）、ＳＰＥＳＰ１（未処理：１.７、５－ＡＺＡ処理後：６５.３、発現上昇率：３８.８）およびＤＡＺＬ１（未処理２.８、５－ＡＺＡ処理後：３４１.３、発現上昇率：１２３.６）を含む候補分子を同定した。
試験２：５－ＡＺＡ処理によるＳＹＣＰ３、ＳＰＥＳＰ１およびＤＡＺＬ１の遺伝子発現上昇の検討
　各種の癌細胞株（肺癌細胞株ＥＢＣ１、肺癌細胞株Ｌｕ６５、大腸癌細胞株ＨＴ－２９、口腔扁平上皮癌細胞株ＳＡＳ）を、５－ＡＺＡ（１０μＭ）を含む完全培地（１００Ｕ／ｍＬペニシリン（明治製菓）、１００μｇ／Ｌストレプトマイシン（明治製菓）加ＲＰＭＩ１６４０培地（ナカライテスク 30264-56）に５６℃、３０分非働化した牛胎児血清（biosera FB-1365/500）を１０％添加したもの）を用いて２ｘ１０５／ウェルの条件で６穴培養プレート（Falcon 353046）にて、温度３７℃、ＣＯ２濃度５％、湿度９５％に設定したインキュベーター（SANYO）内で３日間培養した（以下、全ての細胞培養はこのインキュベーターを用いた）。２ｍＬのリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、関東化学株式会社 73111）で洗浄後、それぞれからRNeasy Mini Kit（Qiagen 74106）を用いてＲＮＡを抽出し、PrimeScript 1st strand cDNA Syntesis Kit（タカラバイオ 6110A）を用いてｃＤＮＡを合成し、LightCycler480（Roche）を用いてリアルタイムＰＣＲ法にてＧＡＰＤＨ（Applied Biosystems Hs02786624_g1）およびＳＹＣＰ３（Applied Biosystems Hs00538146_m1）の遺伝子発現量を解析した。各手順はそれぞれの試薬に付属する取扱説明書に従って行った。結果を図１および図２に示す。試験した全ての細胞株において、５－ＡＺＡ処理によるＳＹＣＰ３の発現上昇が確認された。
　同様に、腎癌細胞株ＳＷ８３９、膀胱癌細胞株５６３７、肺腺癌細胞株ＬＣ２／Ａｄ、肺癌細胞株ＥＢＣ１、大腸癌細胞株ＨＴ－２９、肺癌細胞株Ｌｕ６５および口腔扁平上皮癌細胞株ＳＡＳを５－ＡＺＡ存在下で培養し、ＧＡＰＤＨおよびＳＰＥＳＰ１（Applied Biosystems Hs00377364_m1）の遺伝子発現量を解析した。結果を図３および図４に示す。試験した全ての細胞株において、５－ＡＺＡ処理によるＳＰＥＳＰ１の発現上昇が確認された。
　同様に、マウス白血病細胞株ＷＥＨＩ－３（Ｂａｌｂ／ｃ）を５－ＡＺＡ存在下で培養し、マウスＧＡＰＤＨ（Applied Biosystems Mm99999915_g1）およびマウスＤＡＺＬ１（Applied Biosystems Mm01273546_m1）の遺伝子発現量を解析した。結果を図５に示す。ＷＥＨＩ－３において、５－ＡＺＡ処理によるＤＡＺＬ１の発現上昇が確認された。
　また、同様に５－ＡＺＡ処理したＥＢＣ１およびＬｕ６５におけるＳＹＣＰ３のタンパク質量をウェスタンブロッティングにより解析した。一次抗体として、２００倍希釈した抗ＳＹＣＰ３抗体（Mouse anti-SCP3、BD Bioscience 611230）を用いた。５－ＡＺＡ処理によるＳＹＣＰ３の発現上昇がタンパク質レベルにおいても確認された。
　マウス癌細胞株（Ｅ０７７１：Ｃ５７ＢＬ／６マウス乳がん細胞株およびＣ１４９８：Ｃ５７ＢＬ／６マウス急性骨髄性白血病細胞株）を５－ＡＺＡ（１０μＭ）で処理し、ＤＡＺＬ１のタンパク質量をウェスタンブロッティングにより解析した。両細胞株において、５－ＡＺＡによるＤＡＺＬ１の発現上昇が確認された。
　一方、癌細胞株ＥＢＣ１、Ｌｕ６５およびＨＴ－２９を、ＤＮＡ合成阻害剤であるゲムシタビンの存在下で培養し、ＳＹＣＰ３、ＳＰＥＳＰ１およびＤＡＺＬ１の遺伝子発現量を解析すると、コントロールと同等の発現しか確認されなかった。従って、試験２で見られた各遺伝子の発現上昇は、ＤＮＡメチル基転移酵素阻害剤に特有の効果であることが示唆される。
試験３：免疫不全マウスを用いた５－ＡＺＡによるＳＹＣＰ３およびＳＰＥＳＰ１の遺伝子発現上昇の確認
　ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（１０～１４週齢、日本チャールズリバー）に大腸癌細胞株であるＨＴ－２９（５ｘ１０５個）またはＷｉＤｒ（５ｘ１０５個）をマイジェクター（TERUMO SS_05M2913）にて皮内接種し、接種後５、１０、１５、および２０日目に５－ＡＺＡ（１.６μｇ／マウス体重ｇ）を含むＰＢＳ溶液をマイジェクターにて２００μＬ腹腔内投与した。コントロールには２００μＬのＰＢＳを腹腔内投与した。２５日目に５００μｇ／ｍＬのペントバルビタール（ナカライテスク 02095-04）を２００μＬ腹腔内投与することによってマウスを安楽死させ、腫瘍組織を解剖用ハサミ（野中理化器製作所　11301）にて切除しバイオマッシャーＩＩ（（株）ニッピ　320103）を用いて腫瘍組織を破砕後、試験２と同様にリアルタイムＰＣＲ法にてＳＹＣＰ３およびＧＡＰＤＨの遺伝子発現量を解析した。結果を図６に示す。ＰＢＳのみを投与したマウスに比べて、５－ＡＺＡを投与したマウスから回収した腫瘍組織においてＳＹＣＰ３遺伝子の発現上昇が確認された。
　同様に、ヌードマウスに肺癌細胞株であるＥＢＣ１（５ｘ１０５個）またはＬｕ６５（５ｘ１０５個）を皮内接種し、５－ＡＺＡまたはＰＢＳ（コントロール）を腹腔内投与した。２５日目に回収した腫瘍組織からＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲ法にてＳＰＥＳＰ１およびＧＡＰＤＨの遺伝子発現量を解析した。結果を図７に示す。ＰＢＳのみを投与したマウスに比べて、５－ＡＺＡを投与したマウスから回収した腫瘍組織においてＳＰＥＳＰ１遺伝子の発現上昇が確認された。
試験４：候補分子におけるＨＬＡ結合性アミノ酸配列領域の探索
　試験１で選別されたタンパク質においてＨＬＡに対する結合能の高いアミノ酸配列を同定するために、コンピューターアルゴリズムを用いて、日本人および欧米人において発現頻度の高いHLA-DRB1*01:01（約１０％）、HLA-DRB1*04:05（約２５％）、HLA-DRB1*09:01（約２６％）、HLA-DRB1*15:01（約１５％）、HLA-DR53（６０％以上）の５種類に対する結合可能性について解析し、ＳＹＣＰ３－Ａ（配列番号８）、ＳＰＥＳＰ１－Ｂ（配列番号９）およびＤＡＺＬ－１Ｃ（配列番号２０）を含むアミノ酸配列を選別した。
試験５：ＨＬＡ遺伝子組換えマウスを用いた候補アミノ酸配列の免疫活性化能の検討
　HLA-A*02:01/DRB1*01:01遺伝子組み換えマウス（Ａ２.ＤＲ１－Ｔｇマウス、１０～１６週齢；フランスパスツール研究所）にＳＹＣＰ３－Ａペプチド（Genscript社にて合成）を０日目と１０日目に１００μｇをＰＢＳ１００μＬに溶解させてマイジェクターを用いて皮内投与した。１５日目に５００μｇ／ｍＬのペントバルビタールを２００μＬ腹腔内投与することによってＡ２.ＤＲ１－Ｔｇマウスを安楽死させた後、開腹して所属リンパ節（ｄＬＮ）および脾臓を採取し、それぞれからリンパ球および脾臓細胞を分離した。
　３ｘ１０５個のリンパ球と５ｘ１０５個の脾臓細胞をELISPOTプレート（EMD Millipore、MAHAS4510）に加え、コントロールペプチド（ＳＹＣＰ３に含まれない配列を有する１５アミノ酸残基のペプチド）もしくは試験４で選別したＳＹＣＰ３－Ａペプチド存在下（３μｇ／ｍＬ）のもと、完全培地中、１５０μＬ／ウェルにて２４時間共培養した。ＳＹＣＰ３－Ａペプチド特異的なＩＦＮ－γ産生細胞を検出するために、mouse IFN-γ ELISpot BASIC (ALP) キット（MABTECH 3321-2A）を用いてELISPOT法を行った。手順は付属の取扱説明書に従い、発色基質はBCIP-NBT-plus substrate for ELISpot（MABTECH 3650-10）を、各段階における洗浄はＰＢＳ－Ｔを用いた。また、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の反応であることを確認するために、一部の培養系には抗マウスＣＤ４抗体（BioLegend 100435）および抗マウスＣＤ８抗体（BioLegend 100735）を終濃度５μｇ／ｍＬとなるように加えた。
　結果を下表に示す。ＳＹＣＰ３－Ａペプチド刺激による特異的Ｔ細胞応答が確認された。この反応はＣＤ４に対する抗体によって阻害されたことから、ＣＤ４陽性Ｔ細胞による反応であることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　さらに、ＳＹＣＰ３－ＡペプチドにおけるＣＤ４陽性Ｔ細胞の反応領域を同定するために、ＳＹＣＰ３－Ａペプチド配列内において１アミノ酸ずつずらした１２アミノ酸長の断片ペプチドを、Sigma-aldrichのPepscreenで合成した（下表）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　上記と同様、これらの断片ペプチドをワクチンしたＡ２.ＤＲ１－Ｔｇマウス由来のｄＬＮと脾臓から回収したリンパ球および脾臓細胞を２４時間刺激し、各断片ペプチド（３μｇ／ｍＬ）に対するＴ細胞応答をELISPOT法によって評価した。結果を図８に示す。ＣＤ４陽性Ｔ細胞は断片ペプチドＴ２、Ｔ３、Ｔ４に対して反応することが確認された。このことから、ＳＹＣＰ３－Ａペプチド内のＣＤ４陽性Ｔ細胞の反応領域は、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４に共通するアミノ酸配列ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱであることが示唆される。
試験６：マウスを用いたＤＡＺＬ１候補アミノ酸ペプチドの免疫活性化能の検討
　２匹のＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌＣｒｌｊマウス（Ｂａｌｂ／ｃ、１０から１６週齢；Charles river）に、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ 関東化学株式会社 73111）に溶解したＤＡＺＬ－１Ｃペプチド（ＤＶＱＫＩＶＥＳＱＩＮＦＨＧＫＫＬＫＬＧＰＡＩＲＫＱＮＬＣ（配列番号２０）：Genscript社にて合成）を、０日目と１０日目にマイジェクター（TERUMO SS_05M2913）を用いて１００μｇ／５０μＬで皮内投与した。１２日目に５００μｇ／ｍＬのペントバルビタール（ナカライテスク 02095-04）を２００μＬ腹腔内投与することによってマウスを安楽死させた後、開腹して所属リンパ節（ｄＬＮ）および脾臓を採取し、それぞれからリンパ球および脾臓細胞を分離した。
　３ｘ１０５個のリンパ球と５ｘ１０５個の脾臓細胞を９６穴平底培養プレート（Falcon 353072）に加え、コントロールペプチドもしくはＤＡＺＬ１－Ｃペプチド存在下（２．５μｇ／ｍＬ）のもと、完全培地中、２００μＬ／ウェルにて２４時間共培養した。ＤＡＺＬ１－Ｃペプチド特異的なＩＦＮ－γ産生を検出するために、２４時間後の培養上清を１００μＬ回収し、それに含まれるＩＦＮ－γ濃度をＥＬＩＳＡセット（BD Biosciences 551866）を用いて付属の取扱説明書に従って測定した。ＣＤ４陽性Ｔ細胞の反応であることを確認するために、一部の培養系には抗マウスＣＤ４抗体（aCD4; BioLegend 100435）および抗マウスＣＤ８抗体（aCD8; BioLegend 100735）を終濃度５μｇ／ｍＬで加えた。
　結果を図９に示す。ＤＡＺＬ－１Ｃペプチド特異的なＩＦＮ－γ産生が抗ＣＤ４抗体によって阻害されたことから、ＤＡＺＬ－１ＣペプチドはマウスにおいてヘルパーＴ細胞活性化能を有することが明らかになった。
試験７：健常人末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いたＳＹＣＰ３－ＡペプチドまたはＳＰＥＳＰ１－Ｂペプチド特異的ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞の誘導
　健常人の末梢血からリンホプレップ（Alere Technologies AS　1114547）を用いた密度勾配分離法によってＰＢＭＣを回収した。ＰＢＭＣから磁気細胞分離システム（Miltenyi 130-050-201）を用いてＣＤ１４陽性細胞を分離し、５０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ（peprotech AF-300-03）および５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４（peprotech AF-200-04）存在下で３ｍＬのヒト細胞用培地を用いて６穴培養プレート（Falcon 353046）にて７日間培養することによって樹状細胞（Dendritic Cells;ＤＣｓ）に分化させた。ヒト細胞用培地には、ＡＩＭ－Ｖ培地（ThermoFisher SCIENTIFIC 0870112DK）に５６℃、３０分非働化したヒトＡＢ型血清（Innovative RESEARCH IPLA-SERAB）を３％添加したものを用いた。また、ＰＢＭＣから同様にしてＣＤ４陽性Ｔ細胞（Miltenyi 130-045-101）を分離し、１ｘ１０５個のＣＤ４陽性Ｔ細胞をＳＹＣＰ３－ＡペプチドまたはＳＰＥＳＰ１－Ｂペプチド（３μｇ／ｍＬ）存在下で５ｘ１０４個のＤＣｓと９６穴平底培養プレート（Falcon 353072）にて２００μＬにて共培養を始めた。７日後、ＣＤ４陽性Ｔ細胞をペプチド刺激するために、１００μＬの培養上清を取り除いた後、ＳＹＣＰ３－ＡペプチドまたはＳＰＥＳＰ１－Ｂペプチド（３μｇ／ｍＬ）とガンマ線照射（４０Ｇｙ）した不活化ＰＢＭＣ（２ｘ１０５個）を１００μＬにて培養プレートに追加した。その２日後に５０μＬの培養上清を取り除き、５０μＬのＩＬ－２（塩野義製薬 イムネース注35）を最終濃度が１０Ｕ／ｍＬになるように添加した。以後、活性化したＣＤ４陽性Ｔ細胞を持続的に増殖させるために、１週間おきにＳＹＣＰ３－ＡペプチドまたはＳＰＥＳＰ１－Ｂペプチドと不活化ＰＢＭＣ（１ｘ１０６個）を用いてＣＤ４陽性Ｔ細胞（１ｘ１０６個）を刺激し、以降に述べる各種実験を行った。
試験８：ＳＹＣＰ３－Ａペプチド特異的ヘルパーＴ細胞株のＨＬＡ拘束性の検討
　増殖してきたＣＤ４陽性Ｔ細胞のＳＹＣＰ３－Ａペプチドに対する特異的反応性を調べるために、ＳＹＣＰ３－Ａペプチド（３μｇ／ｍＬ）存在下で５ｘ１０４個のＣＤ４陽性Ｔ細胞と１ｘ１０５個のＰＢＭＣを２００μＬのヒト細胞用培地を用いて９６穴平底培養プレートにて共培養した。また、ＣＤ４陽性Ｔ細胞のＨＬＡ拘束性を調べるために、一部の培養系には抗ＤＲ抗体（BioLegend 307612）を、もしくは対照群として抗HLA-class I抗体（BioLegend 311412）を終濃度５μｇ／ｍＬになるように添加した。２４～４８時間後の培養上清を１００μＬ回収し、それに含まれるＩＦＮ－γ濃度をＥＬＩＳＡキット（BD Biosciences　555142）を用いて付属の取扱説明書に従って測定した。
　結果を図１０に示す。試験した３名の健常人から複数のＳＹＣＰ３－Ａ特異的Ｔｈ細胞クローンが樹立された。これらのクローンにおいて、抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体（ａＤＲ）を用いた場合にペプチド特異的ＩＦＮ－γ産生が抑制されたことから、ＳＹＣＰ３－ＡペプチドはＨＬＡ－ＤＲ拘束的にＴｈ細胞を刺激していることが確認された。
　さらに、拘束されるＨＬＡ型を調べるために、ＳＹＣＰ３－Ａペプチド（３μｇ／ｍＬ）存在下で５ｘ１０４個のＣＤ４陽性Ｔ細胞とＨＬＡ－ＤＲ４、ＤＲ８、ＤＲ９もしくはＤＲ５３の遺伝子が導入された３ｘ１０４個のマウス由来線維芽細胞株（Ｌ－ＤＲ４、Ｌ－ＤＲ８、Ｌ－ＤＲ９およびＬ－ＤＲ５３）を２００μＬのヒト細胞用培地を用いて９６穴平底培養プレートにて共培養し、上記と同様に２４～４８時間後の培養上清のＩＦＮ－γ濃度を測定した。
　その結果、試験したすべてのＳＹＣＰ３－Ａペプチド特異的Ｔｈ細胞が特にＬ－ＤＲ５３細胞に強いペプチド特異的反応（ＩＮＦ－γの高い発現）を示すことが確認された。一方、ＳＹＣＰ３－Ａペプチドは、ＤＲ５３アレルを持たない検体でもある程度の反応性を示した。従って、ＤＲ５３以外のアレルにも効果があることが示唆される。
　さらに、ＳＹＣＰ３－Ａペプチドに対する最小認識配列を調べるために、３μｇ／ｍＬのＳＹＣＰ３－Ａペプチドの断片ペプチドＴ１～Ｔ８（試験５参照）存在下で５ｘ１０４個のＳＹＣＰ３－Ａペプチド特異的Ｔｈ細胞（Healthy donor ３の細胞株ＩＤ番号＃１４）と、同一のドナーに由来する１ｘ１０５個のＰＢＭＣを２００μＬのヒト細胞用培地を用いて９６穴平底培養プレートにて共培養した。結果を図１１に示す。Ｔ３およびＴ４ペプチドに対して高いＩＦＮ－γ産生が確認された。このことから、このＳＹＣＰ３－Ａペプチド特異的Ｔｈ細胞の最小認識配列は、Ｔ３およびＴ４ペプチドに共通するＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＳであると考えられる。
　同様の試験を、下表のペプチドを用いて行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　結果を図１２に示す。いずれのペプチドでも高いＩＦＮ－γ産生が確認された。この結果は、最小認識配列のペプチドのＮ末端、Ｃ末端のどちらにアミノ酸が付加されていても、反応性が維持されることを示す。また、アセチル基の付加は反応性に影響を与えず、ペプチドが修飾されていてもよいことが示唆される。両クローンに反応性の差異は見られなかった。
　さらに、ＳＹＣＰ３－Ａの１１番目のＩをＶに置換したペプチド（配列番号３１）を用いて同様の実験を行ったところ、反応性に低下が認められなかった。ＳＹＣＰ３－Ａペプチド内のＣＤ４陽性Ｔ細胞の反応領域に、ある程度のアミノ酸の変異が許容されることが示唆される。
試験９：ＳＰＥＳＰ１－Ｂペプチド特異的ヘルパーＴ細胞株のＨＬＡ拘束性の検討
　試験８と同様に、但し、ＳＹＣＰ３－Ａペプチドの代わりにＳＰＥＳＰ１－Ｂペプチドを用いて、培養上清のＩＦＮ－γ濃度を測定した。結果を図１３に示す。試験した１名の健常人から２種類のＳＰＥＳＰ１－Ｂ特異的Ｔｈ細胞クローン（ＨＫ１５、ＨＫ１８）が樹立された。これらのクローンにおいて、抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体（ａＤＲ）を用いた場合にペプチド特異的ＩＦＮ－γ産生が抑制されたことから、ＳＰＥＳＰ１－ＢペプチドはＨＬＡ－ＤＲ拘束的にＴｈ細胞を刺激していることが確認された。また、試験８と同様にＬ－ＤＲ５３を用いた実験により、ＳＰＥＳＰ１－ＢはＨＬＡ－ＤＲ５３に結合し、Ｔｈ細胞を刺激していることが確認された。
　また、これらのＳＰＥＳＰ１－Ｂペプチド特異的Ｔｈ細胞のペプチドに対する反応性を調べるために、ＳＰＥＳＰ１－Ｂペプチドの濃度を０.０００３～３０μｇ／ｍＬに段階希釈してＴｈ細胞を刺激した。その結果、低濃度（０.０００３μｇ／ｍＬ）から十分なＩＦＮ－γ産生が示されることが確認された。
試験１０：ＤＡＺＬ－１ペプチド特異的Ｔｈ細胞の誘導およびそのＨＬＡ拘束性の検討
　試験７と同様に、但し、ＳＹＣＰ３－ＡペプチドまたはＳＰＥＳＰ１－Ｂペプチドの代わりにＤＡＺＬ－１断片ペプチドｐ１１、ｐ１２またはｐ１３（表４）を用いて、ＤＡＺＬ－１ペプチド特異的Ｔｈ細胞を誘導した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　試験８と同様に、但し、ＳＹＣＰ３－Ａペプチドの代わりに、ＤＡＺＬ－１断片ペプチドｐ１１、ｐ１２またはｐ１３を用いて、培養上清のＩＦＮ－γ濃度を測定した。ＨＬＡ拘束性を調べるために、抗ＨＬＡ－ＤＰ抗体、抗ＨＬＡ－ＤＱ抗体（SPV-L3：Abcam ab85614）および抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体（BRAFB6：Santa Cluz sc-33719）を用いた。結果を図１４に示す。抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体を用いた場合にペプチド特異的ＩＦＮ－γ産生が抑制されたことから、これらのＤＡＺＬ－１断片ペプチドはＨＬＡ－ＤＲ拘束的にＴｈ細胞を刺激していることが確認された。ｐ１３によるＩＦＮ－γ産生は抗ＨＬＡ－ＤＱ抗体によっても抑制されたので、ＤＡＺＬ－１に由来するペプチドは幅広いＨＬＡに対して有効であると考えられる。
　また、試験８と同様に、Ｌ－ＤＲ４、Ｌ－ＤＲ８、Ｌ－ＤＲ９、Ｌ－ＤＲ１５およびＬ－ＤＲ５３を用いた実験により、ｐ１１はＨＬＡ－ＤＲ４／９／５３に結合し、ｐ１２はＨＬＡ－ＤＲ１５に結合し、ｐ１３はＨＬＡ－ＤＲ８に結合し、Ｔｈ細胞を刺激していることが確認された。
試験１１：ＳＹＣＰ３－Ａペプチド特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞の癌細胞株に対する反応性の検討
　ＳＹＣＰ３－Ａペプチド特異的ＣＤ４陽性Ｔ細胞の癌細胞株に対する反応性を調べるために、ＤＲ５３陽性（ＷｉＤｒ、Ｌｕ６５、Ｃａｌｕ１）癌細胞株を選別した。各癌細胞株を、１０μＭの５－ＡＺＡとともに、癌細胞株の細胞表面上にＨＬＡクラスＩＩを発現させるための５００Ｕ／ｍＬのＩＦＮ－γ（塩野義製薬 イムノマックス－γ注５０）を含む２ｍＬの完全培地を用いて、６穴培養プレートにて３日間培養した。各癌細胞株の培養プレートをＰＢＳでよく洗浄し、５ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸 ナカライテスク 14347-21）を１ｍＬ用いて各細胞株を遊離させ、各癌細胞株を回収した。試験８と同様に、１ｘ１０４個の各細胞株と５ｘ１０４個のＣＤ４陽性Ｔ細胞を２００μＬのヒト細胞用培地を用いて９６穴平底培養プレートにて共培養した。また、ＨＬＡ－ＤＲ依存的な反応性であることを調べるために培養系に抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体（終濃度５μｇ／ｍＬ）を添加した。２４時間後の培養上清を１００μＬ回収し、それに含まれるＩＦＮ－γ濃度をＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。
　結果を図１５に示す。その結果、５－ＡＺＡ処理することによってＩＦＮ－γ産生の増強が認められた。このことから、ＳＹＣＰ３－Ａペプチドを用いて活性化されたＴｈ細胞は５－ＡＺＡ処理されたＤＲ５３陽性癌細胞株に対して効率的に反応することが確認された。
試験１２：免疫不全マウスにおけるＤＮＡメチル化阻害剤とＳＹＣＰ３特異的Ｔｈ細胞の腫瘍増殖抑制効果の検討
　ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（１０～１４週齢、日本チャールズリバー）に肺癌細胞株であるＬｕ６５（３ｘ１０６個）をマイジェクターにて皮内接種し、接種後７、１２、１７、および２２日目に５－ＡＺＡ（１５０ｎｍｏｌ／マウス体重ｇ）を含むＰＢＳ溶液をマイジェクターにて２００μＬ腹腔内投与した。コントロールには２００μＬのＰＢＳを腹腔内投与した。一方、接種後１３、２０、２７日目にＳＹＣＰ３特異的ヒトＴｈ細胞（３～５ｘ１０６個）を２００μＬで尾静脈投与し、コントロールには２００μＬのＰＢＳを尾静脈投与した。腫瘍の表面積を継時的に測定した。結果を図１６に示す。５－ＡＺＡの単剤投与では効果は認められなかったが、ＳＹＣＰ３特異的ヒトＴｈ細胞との併用投与によって腫瘍増殖抑制効果が認められた。
　本願で開示されるペプチドは、がん抗原特異的なヘルパーＴ細胞を活性化するので、がんワクチンとしての使用が期待される。当該ペプチドは、非常に高頻度に共有されているＨＬＡ－ＤＲ５３を含むＨＬＡに結合し、多くのがん患者に有用であると期待される。

Claims (15)

  1. 　ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＸ（ここで、Ｘは存在しないか、またはＳである）のアミノ酸配列；
    　ＤＶＱＫＩＶＥＳＱＩＮＦＨＧＫＫＬＫＬＧＰＡＩＲＫＱＮＬＣＡＹＨＶＱＰＲＰＬ（配列番号１６）のアミノ酸配列中の連続する１０個以上のアミノ酸の配列；または、
    　ＱＮＬＮＨＹＩＱＶＬＥＮＬＶＲＳＶＰＳ（配列番号９）のアミノ酸配列
    を含む、１０個～４５個のアミノ酸からなるペプチド、または、
    　前記のいずれかのペプチドにおいて１個～３個のアミノ酸が置換、欠失または付加され、かつ、ヘルパーＴ細胞活性化能を有するペプチド。
  2. 　ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＸ（ここで、Ｘは存在しないか、またはＳである）のアミノ酸配列を含み、１０個～２５個のアミノ酸からなるペプチド、または、
    　当該ペプチドにおいて１個のアミノ酸が置換、欠失または付加され、かつ、ヘルパーＴ細胞活性化能を有するペプチド
    である、請求項１に記載のペプチド。
  3. 　ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＸ（ここで、Ｘは存在しないか、またはＳである）のアミノ酸配列を含み、１０個～２５個のアミノ酸からなる、請求項２に記載のペプチド。
  4. 　配列番号１のアミノ酸配列中の連続するアミノ酸の配列からなる、請求項３に記載のペプチド。
  5. 　ＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＳＱ（配列番号５）、ＱＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱＳ（配列番号６）またはＱＱＫＩＬＱＱＳＲＩＶＱ（配列番号７）のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項３または４に記載のペプチド。
  6. 　ＤＶＱＫＩＶＥＳＱＩＮＦＨＧＫＫＬＫＬＧＰＡＩＲＫＱＮＬＣＡＹＨＶＱＰＲＰＬ（配列番号１６）のアミノ酸配列中の連続する１０個以上のアミノ酸の配列を含み、１０個～４５個のアミノ酸からなる、請求項１に記載のペプチド。
  7. 　ＤＶＱＫＩＶＥＳＱＩＮＦＨＧＫＫＬＫＬＧ（配列番号１７）、ＩＮＦＨＧＫＫＬＫＬＧＰＡＩＲＫＱＮＬＣ（配列番号１８）、ＬＧＰＡＩＲＫＱＮＬＣＡＹＨＶＱＰＲＰＬ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含む、請求項１または６に記載のペプチド。
  8. 　ＤＶＱＫＩＶＥＳＱＩＮＦＨＧＫＫＬＫＬＧ（配列番号１７）、ＩＮＦＨＧＫＫＬＫＬＧＰＡＩＲＫＱＮＬＣ（配列番号１８）、ＬＧＰＡＩＲＫＱＮＬＣＡＹＨＶＱＰＲＰＬ（配列番号１９）のアミノ酸配列からなる、請求項１、６および７のいずれかに記載のペプチド。
  9. 　ＱＮＬＮＨＹＩＱＶＬＥＮＬＶＲＳＶＰＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含み、１９個～２５個のアミノ酸からなる、請求項１に記載のペプチド。
  10. 　ＱＮＬＮＨＹＩＱＶＬＥＮＬＶＲＳＶＰＳ（配列番号９）のアミノ酸配列からなる、請求項１または９に記載のペプチド。
  11. 　請求項１～１０のいずれかに記載のペプチドをコードする核酸。
  12. 　請求項１～１０のいずれかに記載のペプチド、請求項１１に記載の核酸、請求項１１に記載の核酸を含む発現ベクター、請求項１～１０のいずれかに記載のペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子とを有するＨＬＡマルチマー、請求項１～１０のいずれかに記載のペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子との複合体を提示する抗原提示細胞、または、請求項１～１０のいずれかに記載のペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子との複合体を認識するヘルパーＴ細胞を含む、医薬組成物。
  13. 　ＤＮＡメチル基転移酵素阻害剤をさらに含むか、または、ＤＮＡメチル基転移酵素阻害剤と併用される、請求項１２に記載の医薬組成物。
  14. 　がんの治療または予防のための、請求項１２または１３に記載の医薬組成物。
  15. 　がんワクチンである、請求項１２または１３に記載の医薬組成物。
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