[go: up one dir, main page]

WO2019156032A1 - 毛包上皮幹細胞の培養方法及び培養キット - Google Patents

毛包上皮幹細胞の培養方法及び培養キット Download PDF

Info

Publication number
WO2019156032A1
WO2019156032A1 PCT/JP2019/003903 JP2019003903W WO2019156032A1 WO 2019156032 A1 WO2019156032 A1 WO 2019156032A1 JP 2019003903 W JP2019003903 W JP 2019003903W WO 2019156032 A1 WO2019156032 A1 WO 2019156032A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hair follicle
epithelial stem
stem cells
culture
follicle epithelial
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2019/003903
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
福田　淳二
達斗 景山
杉 平野
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yokohama National University NUC
Kanagawa Institute of Industrial Science and Technology
Original Assignee
Yokohama National University NUC
Kanagawa Institute of Industrial Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yokohama National University NUC, Kanagawa Institute of Industrial Science and Technology filed Critical Yokohama National University NUC
Priority to EP19751917.6A priority Critical patent/EP3750986A4/en
Priority to US16/968,323 priority patent/US20210079345A1/en
Publication of WO2019156032A1 publication Critical patent/WO2019156032A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/24—Gas permeable parts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C12N5/0627—Hair cells
    • C12N5/0628—Hair stem cells; Hair progenitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L83/00—Compositions of macromolecular compounds obtained by reactions forming in the main chain of the macromolecule a linkage containing silicon with or without sulfur, nitrogen, oxygen or carbon only; Compositions of derivatives of such polymers
    • C08L83/04—Polysiloxanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/02—Atmosphere, e.g. low oxygen conditions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Definitions

  • the present invention relates to a method for culturing hair follicle epithelial stem cells and a culture kit.
  • hair follicle epithelial stem cells are stem cells for making hair, and adhere to and spread on normal culture substrates, and differentiate into cells that do not have the ability to regenerate hair by turning on an intense growth switch. It has been.
  • a method of culturing hair follicle epithelial stem cells by adding a growth factor or various inhibitors to a culture solution for example, see Patent Document 1
  • a method of culturing hair follicle epithelial stem cells by embedding them in Matrigel for example, See Non-Patent Document 1
  • a device for maintaining the hair regeneration ability of hair follicle epithelial stem cells has been studied.
  • the present inventors have so far developed a method for producing an aggregate of regenerated hair follicle primordia (see, for example, Patent Document 2). Specifically, a step of seeding mesenchymal cells and epithelial cells on a micro intaglio plate having regularly arranged micro-recesses and co-culturing while supplying oxygen to form a hair follicle primordium. It is a method to prepare.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a hair follicle epithelial stem cell culturing method and culture kit capable of proliferating a large amount of hair follicle epithelial stem cells while maintaining hair regeneration ability.
  • the method for culturing hair follicle epithelial stem cells according to the first aspect of the present invention includes an accumulation step of seeding hair follicle epithelial stem cells in a cell culture container to form an aggregate, and an extracellular body of the aggregate of hair follicle epithelial stem cells.
  • the extracellular matrix component may be type I collagen.
  • the cell culture vessel may be made of a material having oxygen permeability.
  • the material having oxygen permeability may be polydimethylsiloxane.
  • the culture kit for hair follicle epithelial stem cells comprises a cell culture container made of a material having oxygen permeability, an extracellular matrix component, and a medium.
  • hair follicle epithelial stem cells can be proliferated in large quantities while maintaining the hair regeneration ability.
  • FIG. 3 is a schematic process diagram showing a method for preparing hair follicle epithelial stem cells in Example 1.
  • 2 is a graph and a table showing the abundance of hair follicle epithelial stem cells in epidermal cells collected from adult mice in Example 1.
  • FIG. It is a graph which shows the result of having analyzed the cell F in Example 1 (CD34 positive cell isolate
  • FIG. 3 is a schematic process chart comparing hair follicle epithelial stem cell culture methods in Example 1 and Comparative Example 1.
  • 2 is a microscopic image of hair follicle epithelial stem cells from day 1 to day 14 of culture in Example 1.
  • FIG. Each scale bar represents 1 mm. It is a graph which shows the expression level of CD34 gene in the hair follicle epithelial stem cell of the culture
  • FIG. 6 is a schematic process diagram showing a method for producing an oxygen permeable cell culture vessel (polydimethylsiloxane (PDMS) spheroid chip) in Example 2.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • FIG. 2 is a microscopic image of hair follicle epithelial stem cells from day 1 to day 14 of culture in Example 2.
  • FIG. Each scale bar represents 1 mm. It is a graph which shows the expression level of CD34 gene in the hair follicle epithelial stem cell of the culture
  • FIG. It is a microscope image of the hair follicle epithelial stem cell from the culture
  • Each scale bar represents 1 mm.
  • the method for culturing hair follicle epithelial stem cells of the present embodiment is a method comprising an accumulation step, a mixing step, and a culturing step.
  • the accumulation step hair follicle epithelial stem cells are seeded in a cell culture container to form an aggregate.
  • an extracellular matrix component is added to the hair follicle epithelial stem cell aggregate to produce a mixture of the extracellular matrix component and the hair follicle epithelial stem cell aggregate.
  • a medium is added to the mixture and cultured.
  • hair follicle epithelial stem cells can be proliferated in large quantities while maintaining the hair regeneration ability.
  • the hair follicle epithelial stem cells and extracellular matrix components such as matrigel are mixed and cultured in a state where the hair follicle epithelial stem cells are dispersed.
  • hair follicle epithelial stem cells exist in an environment in which cells are densely packed in a living body, and further, extracellular matrix components exist between the cells.
  • the hair follicle epithelial stem cell which has the hair reproducibility superior to the conventional culture method of a hair follicle epithelial stem cell can be obtained.
  • the “cell aggregate” here means a collection of cells seeded in a cell culture container stacked on the bottom surface by gravity or the like. Details of each step of the culture method of the present embodiment will be described below.
  • hair follicle epithelial stem cells are seeded in a cell culture container and statically cultured. Cells are precipitated by gravity to form an aggregate of cells. The number of cells to be seeded can be appropriately adjusted according to the size of the cell culture vessel.
  • the origin of hair follicle epithelial stem cells used in the culture method of the present embodiment is an animal, preferably a vertebrate, and more preferably a mammal. Mammals include, for example, humans, chimpanzees and other primates; dogs, cats, rabbits, horses, sheep, goats, cows, pigs, rats (including nude rats), mice (including nude mice and skid mice) ), Domestic animals such as guinea pigs, pets, laboratory animals, and the like, but are not limited thereto. Among these, the origin of cells is preferably human.
  • the hair follicle epithelial stem cells may be isolated from the skin tissue of the subject animal or may be derived from universal cells. Examples of universal cells include embryonic stem (ES) cells, embryonic germ (EG) cells, induced pluripotent (iPS) stem cells, and the like.
  • the hair follicle epithelial stem cells used in the culture method of the present embodiment may be single cells, and cells (for example, pigment stem cells, epidermal cells, etc.) existing around the hair follicle epithelial stem cells in the skin tissue. It may be a mixed cell containing. It can be confirmed that the hair follicle epithelial stem cell is expressing a marker protein (for example, CD34) of the hair follicle epithelial stem cell.
  • a marker protein for example, CD34
  • cells expressing CD34 can be obtained by known methods (for example, Fluorescence activated cell sorting (FACS) analysis using anti-CD34 antibody, Magnetic cell sorting (MACS) analysis, and immunostaining method). Etc.) can be confirmed.
  • FACS Fluorescence activated cell sorting
  • MCS Magnetic cell sorting
  • Etc. can be confirmed.
  • the culture time can be 10 minutes or more and 24 hours or less (preferably 1 hour or more and 2 hours or less), and the culture temperature is 25 ° C. or more and less than 40 ° C. (preferably 37 ° C. ). For example, it may be about 5% CO 2 condition.
  • the cell culture container is preferably one in which a plurality of wells are regularly arranged on one substrate from the viewpoint of ease of observation and screening efficiency.
  • individual wells arranged on a substrate are cell culture containers.
  • patent document 3 International Publication No. 2017/073625.
  • the density of wells in the substrate can be, for example, 20 pieces / cm 2 or more and 500 pieces / cm 2 or less, for example, 50 pieces / cm 2 or more and 250 pieces / cm 2 or less, for example, 100 pieces. / Cm 2 or more and 200 pieces / cm 2 or less.
  • the density can be cultured in a state where the hair follicle epithelial stem cells are arranged at a density similar to the density of mammalian pores (particularly, primate pores including humans).
  • the diameter and depth of the well opening are not particularly limited as long as they can accommodate and cultivate hair follicle epithelial stem cell aggregates, but the diameter is about the same size as a mammalian pore. For example, it can be 20 ⁇ m or more and 1 mm or less. The depth can be set to 1 mm or less, for example.
  • the material of the cell culture vessel can be suitable for cell culture and is not particularly limited.
  • transparent glass, a polymer material, etc. are mentioned.
  • a polymer material having oxygen permeability is preferable.
  • Specific examples of the polymer material having oxygen permeability include a fluororesin and silicon rubber (for example, polydimethylsiloxane (PDMS)). These materials may be used alone or in combination.
  • oxygen permeability refers to the property of allowing molecular oxygen to permeate and reach the well of a cell culture container.
  • Specific oxygen transmission rate may be less than or equal to about 100cm 3 / m 2 ⁇ 24h ⁇ atm or more 5000cm 3 / m 2 ⁇ 24h ⁇ atm, about 1100cm 3 / m 2 ⁇ 24h ⁇ atm or 3000 cm 3 / m may be less 2 ⁇ 24h ⁇ atm, about 1250cm 3 / m 2 ⁇ 24h ⁇ atm or more 2750cm 3 / m 2 ⁇ 24h ⁇ atm may be less.
  • 24h means 24 hours
  • atm means a unit of atmospheric pressure. That is, the unit “cm 3 / m 2 ⁇ 24 h ⁇ atm” represents the capacity (cm 3 ) per 1 m 2 of oxygen permeated in 24 hours under an environment of 1 atm.
  • a commercially available cell culture container may be used, or a template may be prepared and the cell culture container may be prepared from scratch using PDMS as a raw material.
  • Examples of commercially available cell culture containers include Prime Surface (registered trademark) 96U plate manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.
  • the medium is not particularly limited, and can be a basic medium containing components (inorganic salts, carbohydrates, hormones, essential amino acids, non-essential amino acids, vitamins) necessary for viable cell growth.
  • the inorganic salt contained in the medium is to help maintain the osmotic balance of the cells and to help regulate the membrane potential.
  • an inorganic salt For example, salts, such as calcium, copper, iron, magnesium, potassium, sodium, zinc, are mentioned. Salts are usually used in the form of chlorides, phosphates, sulfates, nitrates and bicarbonates.
  • the osmolality of the inorganic salt in the medium can be, for example, 200 mOsm / kg or more and 400 mOsm / kg or less, for example, 280 mOsm / kg or more and 350 mOsm / kg or less, for example, 280 mOsm / kg or more. It can be 310 mOsm / kg or less, for example, 280 mOsm / kg or more and less than 300 mOsm / kg, for example, 280 mOsm / kg.
  • the carbohydrate is not particularly limited, and examples thereof include glucose, galactose, maltose, and fructose.
  • the concentration of carbohydrate (preferably D-glucose) in the medium is preferably 0.5 g / L or more and 2 g / L or less.
  • the amino acid is not particularly limited.
  • the concentration of glutamine contained in the medium can be 0.05 g / L or more and 1 g / L or less (usually 0.1 g / L or more and 0.75 g / L or less).
  • Each amino acid other than glutamine contained in the medium can be 0.001 g / L or more and 1 g / L or less (usually 0.01 g / L or more and 0.15 g / L or less).
  • Amino acids may be synthetically derived.
  • the vitamin is not particularly limited.
  • thiamine vitamin B1
  • riboflavin vitamin B2
  • niacinamide vitamin B3
  • hemi-calcium D-pantothenate vitamin B5
  • pyridoxal / pyridoxamine / pyridoxine vitamin B6
  • Folic acid vitamin B9
  • cyanocobalamin vitamin B12
  • ascorbic acid vitamin C
  • calciferol vitamin D2
  • DL- ⁇ tocopherol vitamin E
  • biotin vitamin H
  • menadione vitamin K
  • chloride examples thereof include choline and myo-inositol.
  • the medium may further contain antibiotics, serum, growth factors, hormones, ROCK inhibitors or the like.
  • Antibiotics include, for example, gentamicin, amphotericin, ampicillin, minomycin, kanamycin, penicillin, streptomycin, gentacin, tylosin, aureomycin, and the like used for normal animal cell culture. These antibiotics may be contained alone or in combination of two or more. In general, the concentration of the antibiotic contained in the medium is not particularly limited, and can be, for example, 0.1 ⁇ g / mL or more and 100 ⁇ g / mL or less.
  • serum examples include, but are not limited to, FBS / FCS (Fetal Bovine / Calf Serum), NCS (Newborn Calf Serum), CS (Calf Serum), HS (Horse Serum), and the like.
  • concentration of serum contained in the medium can be, for example, 2% by mass or more and 10% by mass or less.
  • the growth factor examples include, but are not limited to, a cell growth factor and a cell adhesion factor. More specifically, examples of the growth factor include epidermal growth factor (EGF), acidic fibroblast growth factor (aFGF), and basic fibroblast growth factor (basic fibroblast growth factor). bFGF), insulin-like growth factor-1 (IGF-1), macrophage-derived growth factor (MDGF), platelet-derived growth factor (GF) Tumor angiogenesis factor (TAF), Examples thereof include vascular endothelial growth factor (VEGF). These growth factors may be included singly or in combination. Generally, the concentration of the growth factor contained in the medium is not particularly limited, and can be, for example, 1 ng / mL or more and 10 ⁇ g / mL or less.
  • the hormone examples include insulin, glucagon, triiodothyronine, adrenocortical hormone (hydrocortisone, etc.) and the like. These hormones may be included singly or in combination.
  • the concentration of the hormone contained in the medium is not particularly limited, and can be, for example, 1 ng / mL or more and 10 ⁇ g / mL or less.
  • bovine pituitary extract may be used as a medium additive containing growth factors and hormones.
  • ROCK inhibitors examples include HA-1077, Y-27632, Thiazovivin, GSK429286A, RKI-1447, GSK1807936A, HA-1100, Y-39983, AR-13324, GSK269996, AT13148, K-115, KD025, ZINC00881524, And salts thereof.
  • the medium should be a known basic medium for epithelial cells that contains calcium chloride, is serum-free, and is supplemented with epidermal growth factor and, if necessary, any antibiotics and any hormones. Can do.
  • the known basic medium for epithelial cells include HuMedia-KB2 (manufactured by Kurabo Industries), keratinocyte basic medium 2 (Keratinocyte Basal Medium 2) (manufactured by Promo Cell), EpiLife (registered trademark) Medium (Thermo). Fisher SCIENTIFIC).
  • epithelial cell growth medium containing epidermal growth factor, any antibiotic, and any hormone examples include HuMedia-KG2 (manufactured by Kurabo Industries), keratinocyte growth medium 2 (Keratinocyte Growth Medium 2). (Promo Cell). Further, an optional growth factor, an optional ROCK inhibitor, and the like may be added to the epithelial cell growth medium containing these epidermal growth factor, an optional antibiotic, and an optional hormone.
  • an extracellular matrix component is added to the hair follicle epithelial stem cell aggregate to prepare a mixture of the extracellular matrix component and the hair follicle epithelial stem cell aggregate.
  • the hair follicle epithelial stem cells can be cultured in an environment close to that in the living body.
  • the extracellular matrix component may or may not be gelled.
  • the concentration of the extracellular matrix component in the solution can be appropriately adjusted according to the presence or absence of gelation and the hardness of the gel.
  • the gelation time can also be appropriately adjusted according to the required gel hardness.
  • Various conditions such as gelation temperature are not particularly limited, and examples thereof include a method of culturing in a 37 ° C. CO 2 incubator.
  • Examples of the cell culture vessel used in the mixing step include the same ones as exemplified in the above “[Accumulation step]”.
  • Extracellular matrix component examples include collagen (type I, type II, type III, type IV, type V, type XI, type XVII, etc.), mouse EHS tumor extract (type IV collagen, laminin, heparan sulfate proteoglycan, etc.
  • Base membrane components trade name: Matrigel
  • fibrin glycosaminoglycan, hyaluronic acid, proteoglycan, etc.
  • gelatin, agar, agarose, etc. can be used as the polymer derived from natural products. It is possible to prepare hydrogels by selecting components such as salt, concentration, pH and the like that are optimal for each gelation.
  • these polymers derived from natural products may be used alone or in combination of two or more.
  • the extracellular matrix component is preferably collagen (particularly type I collagen).
  • collagen particularly type I collagen.
  • the extracellular matrix component may be suspended in a solvent.
  • a solvent for suspending extracellular matrix components for example, a serum-free medium such as Ham's Nutrient Mixtures F-10 or Ham's Nutrient Mixtures F-12, or a buffer solution for reconstitution of extracellular matrix components (for example, Sodium hydroxide, sodium hydrogen carbonate, a buffer solution comprising HEPES-Buffer, etc.).
  • a medium is added to the mixture prepared in the mixing step and cultured.
  • the cell culture vessel and the medium used in the culturing step include the same as those exemplified in the above “[Accumulating step]”.
  • the culture time can be 3 days or more and 21 days or less (preferably 10 days or more and 14 days or less), and the culture temperature is 25 ° C. or more and less than 40 ° C. (preferably 37 ° C.). be able to. For example, it may be about 5% CO 2 condition.
  • the follicular epithelial stem cells adhere and aggregate with each other as the number of culture days elapses to form one aggregate. Through this culturing step, a large amount of hair follicle epithelial stem cells having excellent hair regeneration ability can be obtained.
  • the culture method of the present embodiment may further include a confirmation step for confirming the expression of marker protein of hair follicle epithelial stem cells after the culture step.
  • a confirmation step for confirming the expression of the marker protein of hair follicle epithelial stem cells include the same methods as those exemplified in the above “(hair follicle epithelial stem cells)”.
  • the culture method of the present embodiment may further include an isolation step of isolating the obtained hair follicle epithelial stem cells one by one after the culture step.
  • the isolation method include a method of performing an enzyme treatment such as trypsin.
  • the culture kit for hair follicle epithelial stem cells of this embodiment comprises a cell culture vessel made of a material having oxygen permeability, an extracellular matrix component, and a medium.
  • hair follicle epithelial stem cells can be proliferated in large quantities while maintaining the hair regeneration ability.
  • the cell culture container, extracellular matrix component, and culture medium made of a material having oxygen permeability provided in the culture kit of the present embodiment are the same as those exemplified in the above “ ⁇ Follicle epithelial stem cell culture method>”. Is mentioned.
  • the culture kit of this embodiment further comprises an antibody against a marker protein of hair follicle epithelial stem cells (for example, an anti-CD34 antibody). ) Etc. may be provided. Thereby, it can be confirmed whether the cell obtained by culture
  • the culture method of this embodiment may further comprise an enzyme such as trypsin in addition to the cell culture vessel made of the oxygen-permeable material, the extracellular matrix component, and the medium. Thereby, the hair follicle epithelial stem cell obtained using the culture kit of this embodiment can be isolated for every cell.
  • Hair follicle epithelial stem cells obtained using the culture method and culture kit of this embodiment can construct a hair follicle primordium by co-culturing with mesenchymal cells such as hair papilla cells. By transplanting this hair follicle primordium, hair can be regenerated.
  • the hair follicle epithelial stem cells obtained using the culture method and culture kit of the present embodiment can regenerate the skin, for example, by transplanting into the wound part of the subject animal.
  • Example 1 Culture of hair follicle epithelial stem cells 1 First, skin cells were collected from adult mice, and after evaluating the presence rate of hair follicle epithelial stem cells, they were isolated and used in subsequent tests (see FIG. 1).
  • the dermal layer was then surgically removed using tweezers.
  • the skin tissue was added to a 50 mL centrifuge tube together with the enzyme-treated solution, and the cells were separated by pipetting.
  • the 70 ⁇ m cell strainer manufactured by BD falcon
  • the 40 ⁇ m cell strainer manufactured by BD falcon
  • the cells were collected by centrifugation at 1000 rpm for 3 minutes.
  • the collected cells were suspended in Humedia-KG2 medium (manufactured by KURABO).
  • FITC-labeled anti-CD34 antibody manufactured by BD
  • PE-labeled anti-CD49f antibody manufactured by R & D Systems
  • FACS Fluorescence activated cell sorting
  • CD34-positive (+) cells were collected by the following procedure. All operations were performed on ice. (3-1) The collected cell suspension containing mouse epithelial cells 1.0 to 1.5 ⁇ 10 7 cells was centrifuged at 1000 rpm for 3 minutes, and then the supernatant was removed. Subsequently, 300 ⁇ L of MACS (Magnetic cell sorting) / FACS buffer (manufactured by Miltenyl Biotec) was added. (3-2) Three 5 mL tubes were prepared, and 10 to 15 ⁇ L each of the cell suspension prepared in (3-1) was dispensed. Each tube was designated as tube 1, tube 2, and tube 3, and the operation described in “(4) Procedure for each tube” was performed.
  • MACS Magnetic cell sorting
  • FACS buffer manufactured by Miltenyl Biotec
  • the tube containing the unlabeled cell suspension may be referred to as “tube 5”. is there).
  • the operation described in “(4) Procedure for each tube)” was performed.
  • (3-9) 400 ⁇ L of the labeled cell suspension was collected in a 15 mL tube and stored at 4 ° C. (hereinafter, the tube containing the labeled cell suspension may be referred to as “tube 6”) .
  • the operation described in “(4) Procedure for each tube)” was performed.
  • Tube 1 (Preparation of unstained control) 600 ⁇ L of MACS / FACS buffer was added to tube 1 and stored at 4 ° C.
  • Tube 2 (Preparation of background control) (4-2-1) Add MACS / FACS buffer so that the cell suspension in tube 2 is 50 ⁇ L, add 5 ⁇ L of FITC-labeled anti-rat IgG antibody, and let stand at 4 ° C. for 30 minutes in the dark. did. (4-2-2) 5 mL of MACS / FACS buffer was added, followed by centrifugation at 1000 rpm for 3 minutes. After removing the supernatant and resuspending in 50 ⁇ L of MACS / FACS buffer, 5 ⁇ L of anti-FITC antibody-coupled microbeads were added and allowed to stand at 4 ° C. for 30 minutes in the dark.
  • Tube 3 (Preparation of isotype control) (4-3-1) Add MACS / FACS buffer so that the cell suspension in tube 3 is 50 ⁇ L, and then add 5 ⁇ L of rat IgG isotype antibody (PE-labeled rat IgG antibody) (manufactured by R & D Systems). It left still for 30 minutes at 4 degreeC in the dark place. (4-3-2) 5 mL of MACS / FACS buffer was added, followed by centrifugation at 1000 rpm for 3 minutes.
  • rat IgG isotype antibody PE-labeled rat IgG antibody
  • the supernatant was removed and resuspended in 50 ⁇ L of MACS / FACS buffer, 5 ⁇ L of FITC-labeled anti-rat IgG antibody was added, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 30 minutes in the dark. (4-3-3) 5 mL of MACS / FACS buffer was added, followed by centrifugation at 1000 rpm for 3 minutes. After removing the supernatant and resuspending in 50 ⁇ L of MACS / FACS buffer, 5 ⁇ L of anti-FITC antibody-coupled microbeads were added and allowed to stand at 4 ° C. for 30 minutes in the dark.
  • Tube 4 (Presort sample preparation) 600 ⁇ L of MACS / FACS buffer was added to tube 4 and stored at 4 ° C.
  • Tube 5 (Preparation of unlabeled cells) 400 ⁇ L of MACS / FACS buffer was added to tube 5 and stored at 4 ° C.
  • Tube 6 (Preparation of labeled cells) 600 ⁇ L of MACS / FACS buffer was added to tube 6 and stored at 4 ° C.
  • Humedia-KG2 medium (hereinafter sometimes referred to as “epithelial cell culture medium”) containing 20 ng / mL FGF2, 20 ng / mL VEGF-A, and 5 ⁇ M Y-27632. Prepared.
  • the cell follicle epithelial stem cells of 8.0 ⁇ 10 4 cells obtained in “1.” were suspended in 100 ⁇ L of the epithelial cell culture medium prepared in (1) to prepare a cell suspension. .
  • the cell suspension is dispensed into each well of a non-adherent 96 U well plate (Sumitomo Bakelite, curvature radius: 4.5 mm), incubated at 37 ° C. for 30 minutes to 24 hours, and the cells are separated by gravity. It settled on the bottom face of the culture container and it was confirmed that a cell aggregate was formed (see FIG. 4).
  • the epithelial cell culture medium is added to the mixture of matrigel and hair follicle epithelial stem cells and cultured for 14 days, so that the cell density is useful for maintaining the regeneration efficiency of hair follicle epithelial stem cells. It was evaluated whether it is.
  • the morphological changes of the cells over time were observed using an inverted phase contrast fluorescence microscope (IX-71, manufactured by Olympus). The results are shown in FIG.
  • FIG. 5 shows that the cells were crowded on the first day of culture, but the cells were separated from each other. However, cells began to adhere and aggregate from the fourth day of culture, and almost all cells formed one aggregate on the seventh day of culture.
  • FIG. 6 shows the relative CD34 gene expression level in Example 1 (high density) when the CD34 gene expression level in Comparative Example 1 (low density) described later is 1. The consideration of the gene expression level of CD34 in Example 1 shown in FIG. 6 is described in Comparative Example 1 described later.
  • hair follicle epithelial stem cells were seeded in a 24-well plate (manufactured by BD falcon) without being embedded in Matrigel, and cultured in the same manner for 14 days (hereinafter sometimes referred to as “planar culture method”).
  • the morphological changes of the cells over time were observed using an inverted phase contrast fluorescence microscope (IX-71, manufactured by Olympus). The results are shown in FIG. 7A (planar culture method) and FIG. 7B (conventional matrigel embedded culture method).
  • hair follicle epithelial stem cells cultured by the conventional Matrigel embedded culture method were dispersed on the first to fourth days of culture, but began to form small aggregates on the seventh day of culture. The aggregate gradually increased and became about 100 to 150 ⁇ m on the 14th day of culture.
  • the hair follicle epithelial stem cells cultured by the planar culture method grew faster than the hair follicle epithelial stem cells cultured by the conventional matrigel embedded culture method.
  • hair follicle epithelial stem cells cultured by the conventional Matrigel embedding culture method showed almost the same gene expression level of CD34 as the hair follicle epithelial stem cells before culturing.
  • hair follicle epithelial stem cells cultured by the planar culture method were found to have considerably reduced hair regeneration ability.
  • hair follicle epithelial stem cells are known to have a strong proliferation switch when contact with adjacent cells is cut off due to a wound or the like, and to proliferate until they cover the surface, thereby preventing bacterial invasion from the outside world.
  • the cells having the ability to form hair follicles differentiate into cells for simply covering the surface.
  • the hair regeneration ability was reduced, and in the conventional matrigel embedded culture method, it was able to grow at a relatively mild rate, so the hair regeneration It is thought that it was able to culture while maintaining the ability.
  • the gene expression level of CD34 is about 2.9 times higher in the hair follicle epithelial stem cells cultured by the culture method of this embodiment than in the hair follicle epithelial stem cells cultured by the conventional matrigel embedded culture method. It turns out that it improves. From the above, when culturing epithelial stem cells using Matrigel, rather than using Matrigel with cells uniformly dispersed, cells were accumulated using Matrigel after being accumulated in one place. It became clear that this is more effective in maintaining the function.
  • Example 2 Culture of hair follicle epithelial stem cells using an oxygen permeable cell culture vessel 1 1. Preparation of hair follicle epithelial stem cells Hair follicle epithelial stem cells were prepared using the same method as “1.” in Example 1.
  • FIG. 9 is a schematic process diagram showing a production method of an oxygen-permeable cell culture container (polydimethylsiloxane (PDMS) spheroid chip).
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • FIG. 9 the details of the method for producing the oxygen-permeable cell culture vessel will be described below.
  • the pattern of the produced spheroid container was designed with a computer using CAD software, V Carve Pro 6.5.
  • a concave mold having a pattern was produced by cutting the olefin-based substrate according to the designed pattern using a cutting machine.
  • An epoxy resin (crystal lysine: manufactured by Nissin Resin Co., Ltd.) was poured into the concave mold and cured for 1 day. Next, the concave mold was released to form a convex mold having a pattern. Subsequently, the formed convex mold was fixed to the bottom surface of a 24-well plate (manufactured by BD falcon), and polydimethylsiloxane (PDMS) was poured and solidified. Next, the convex mold was released to prepare a PDMS spheroid chip in which a regular pattern was formed on the PDMS as an oxygen permeable cell culture vessel. In the obtained PDMS spheroid chip, the depth of the well (“H” in FIG.
  • the hair follicle epithelial stem cells are precipitated on the bottom of the well on the first day of culture, and gradually start to aggregate from the fourth day of culture, and form one aggregate on the seventh day of culture. The shape was maintained until.
  • Example 2 Production of oxygen-permeable cell culture vessel An oxygen-permeable cell culture vessel (PDMS spheroid chip) was produced using the same method as “2.” in Example 2. 3. Culture of hair follicle epithelial stem cells (1) Preparation of epithelial cell culture medium An epithelial cell culture medium was prepared in the same manner as “2. (1)” in Example 1.
  • the hair follicle epithelial stem cells were dispersed on the 1st to 4th day of culture, but formed a small aggregate on the 7th day of culture and became about 100 to 150 ⁇ m on the 14th day of culture. It was.
  • hair follicle epithelial stem cells (Example 2) cultured by the culture method of the present embodiment using a PDMS spheroid chip are hair follicle epithelial stem cells (Comparative Example 1) cultured by the conventional Matrigel embedded culture method.
  • the gene expression level of CD34 was about 4.2 times that of). From the above, it was shown that the PDMS spheroid chip may be useful for culturing hair follicle epithelial stem cells.
  • hair follicle epithelial stem cells can be proliferated in large quantities while maintaining the hair regeneration ability.
  • a regenerated hair follicle primordium having excellent hair regeneration ability can be produced.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

毛髪再生能を維持しながら、毛包上皮幹細胞を大量に増殖させることができる毛包上皮幹細胞の培養方法及び培養キットを提供する。毛包上皮幹細胞の培養方法は、細胞培養容器に、毛包上皮幹細胞を播種し、集積体を形成させる集積工程と、前記毛包上皮幹細胞の集積体に細胞外マトリックス成分を加え、前記細胞外マトリックス成分と前記毛包上皮幹細胞の集積体との混合物を作製する混合工程と、前記混合物に培地を加えて培養する培養工程と、を備える。毛包上皮幹細胞の培養キットは、酸素透過性を有する材質からなる細胞培養容器と、細胞外マトリックス成分と、培地と、を備える。

Description

毛包上皮幹細胞の培養方法及び培養キット
　本発明は、毛包上皮幹細胞の培養方法及び培養キットに関する。
　毛包上皮幹細胞は、毛髪をつくるための幹細胞であり、通常の培養基板上では、強く接着及び伸展し、強烈な増殖スイッチが入ることで、毛髪再生能を有しない細胞に分化することが知られている。従来では、培養液に成長因子や各種阻害剤を添加して毛包上皮幹細胞を培養する方法（例えば、特許文献１参照）や、毛包上皮幹細胞をマトリゲルで包埋して培養する方法（例えば、非特許文献１参照）により、毛包上皮幹細胞の毛髪再生能を維持する工夫が検討されてきた。
　一方、本発明者らはこれまで、再生毛包原基の集合体の製造方法を開発してきた（例えば、特許文献２参照）。具体的には、規則的な配置の微小凹部を備えるマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を播種し、酸素を供給しながら共培養することで、毛包原基を形成させる工程を備える方法である。
特開２０１２－２４９５５６号公報 国際公開第２０１７／０７３６２５号
Chacon-Martinez C A et al., "Hair follicle stem cell cultures reveal self-organizing plasticity of stem cells and their progeny.", EMBO, Vol. 36, No. 2, p151-164, 2017.
　しかしながら、毛髪再生能を維持しながら、毛包上皮幹細胞を大量に増殖させることができる、よりよい培養方法が求められていた。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、毛髪再生能を維持しながら、毛包上皮幹細胞を大量に増殖させることができる毛包上皮幹細胞の培養方法及び培養キットを提供する。
　すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
　本発明の第１態様に係る毛包上皮幹細胞の培養方法は、細胞培養容器に、毛包上皮幹細胞を播種し、集積体を形成させる集積工程と、前記毛包上皮幹細胞の集積体に細胞外マトリックス成分を加え、前記細胞外マトリックス成分と前記毛包上皮幹細胞の集積体との混合物を作製する混合工程と、前記混合物に培地を加えて培養する培養工程と、を備える方法である。
　上記第１態様に係る毛包上皮幹細胞の培養方法において、前記細胞外マトリックス成分がＩ型コラーゲンであってもよい。
　上記第１態様に係る毛包上皮幹細胞の培養方法において、前記細胞培養容器が酸素透過性を有する材質からなってもよい。
　上記第１態様に係る毛包上皮幹細胞の培養方法において、前記酸素透過性を有する材質がポリジメチルシロキサンであってもよい。
　本発明の第２態様に係る毛包上皮幹細胞の培養キットは、酸素透過性を有する材質からなる細胞培養容器と、細胞外マトリックス成分と、培地と、を備える。
　上記態様の毛包上皮幹細胞の培養方法及び培養キットによれば、毛髪再生能を維持しながら、毛包上皮幹細胞を大量に増殖させることができる。
実施例１における毛包上皮幹細胞の調製方法を示す概略工程図である。 実施例１における成体マウスから採取された表皮細胞中の毛包上皮幹細胞の存在率を示すグラフ及び表である。 実施例１における細胞Ｆ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ（ＭＡＣＳ）法で分離されたＣＤ３４陽性細胞）をＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）法により解析した結果を示すグラフである。 実施例１における免疫染色した細胞Ｆ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ（ＭＡＣＳ）法で分離されたＣＤ３４陽性細胞）の位相差顕微鏡像及び蛍光顕微鏡像（上：核染色像、下：ＣＤ３４染色像）である。各スケールバーは２５０μｍを示す。 実施例１及び比較例１における毛包上皮幹細胞の培養方法を比較した概略工程図である。 実施例１における培養１日目から１４日目までの毛包上皮幹細胞の顕微鏡像である。各スケールバーは１ｍｍを示す。 実施例１及び比較例１における培養１４日目の毛包上皮幹細胞でのＣＤ３４遺伝子の発現量を示すグラフである。 比較例１における平面培養法で培養した培養１日目から１４日目までの毛包上皮幹細胞の顕微鏡像である。各スケールバーは１ｍｍを示す。 比較例１における従来のマトリゲル包埋培養法で培養した培養１日目から１４日目までの毛包上皮幹細胞の顕微鏡像である。各スケールバーは１ｍｍを示す。 比較例１における培養前及び培養１４日目の毛包上皮幹細胞（平面培養及びマトリゲル包埋培養）でのＣＤ３４遺伝子の発現量を示すグラフである。 実施例２における酸素透過性細胞培養容器（ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）スフェロイドチップ）の作製方法を示す概略工程図である。 実施例２における培養１日目から１４日目までの毛包上皮幹細胞の顕微鏡像である。各スケールバーは１ｍｍを示す。 実施例１、２及び比較例１、２における培養１４日目の毛包上皮幹細胞でのＣＤ３４遺伝子の発現量を示すグラフである。 比較例１及び比較例２における細胞培養容器（培養条件）を比較した概略構成図である。 比較例２における培養１日目から１４日目までの毛包上皮幹細胞の顕微鏡像である。各スケールバーは１ｍｍを示す。
＜毛包上皮幹細胞の培養方法＞
　本実施形態の毛包上皮幹細胞の培養方法は、集積工程と、混合工程と、培養工程と、を備える方法である。
　前記集積工程では、細胞培養容器に、毛包上皮幹細胞を播種し、集積体を形成させる。
　前記混合工程では、前記毛包上皮幹細胞の集積体に細胞外マトリックス成分を加え、前記細胞外マトリックス成分と前記毛包上皮幹細胞の集積体との混合物を作製する。
　前記培養工程では、前記混合物に培地を加えて培養する。
　本実施形態の培養方法によれば、後述の実施例に示すように、毛髪再生能を維持しながら、毛包上皮幹細胞を大量に増殖させることができる。
　従来の毛包上皮幹細胞の培養方法では、細胞を播種する時点から、毛包上皮幹細胞とマトリゲル等の細胞外マトリックス成分とを混合し、毛包上皮幹細胞を分散させた状態で培養を行う。
　一方、毛包上皮幹細胞は、生体内において細胞が密集した環境で存在しており、さらに、細胞間には細胞外マトリックス成分が存在している。そのため、本実施形態の培養方法における集積工程で、細胞集積体を形成させた後に、続く混合工程において、細胞集積体に細胞外マトリックス成分を混合することで、生体内に近しい環境を再現することができる。これにより、後述の実施例に示すように、従来の毛包上皮幹細胞の培養方法よりも、優れた毛髪再生能を有する毛包上皮幹細胞を得ることができる。
　なお、ここでいう「細胞集積体」とは、細胞培養容器内に播種された細胞が、重力等により底面に積み重なって集まったものを意味する。
　本実施形態の培養方法の各工程について、以下に詳細を説明する。
［集積工程］
　まず、毛包上皮幹細胞を細胞培養容器に播種し、静置培養する。細胞を重力で沈殿させることで、細胞の集積体を形成させる。播種する細胞数は細胞培養容器の大きさに応じて適宜調整することができる。
（毛包上皮幹細胞）
　本実施形態の培養方法で用いられる毛包上皮幹細胞の由来としては、動物であり、脊椎動物が好ましく、哺乳動物がより好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、チンパンジー及びその他の霊長類；イヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、ラット（ヌードラットも包含する）、マウス（ヌードマウス及びスキッドマウスも包含する）、モルモット等の家畜動物、愛玩動物及び実験用動物等が挙げられ、これらに限定されない。中でも、細胞の由来としては、ヒトであることが好ましい。
　毛包上皮幹細胞は、被検動物の皮膚組織から単離されたものであってもよく、万能細胞から誘導されたものであってもよい。万能細胞としては、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、人工多能性（ｉＰＳ）幹細胞等が挙げられる。
　また、本実施形態の培養方法で用いられる毛包上皮幹細胞は、単一細胞であってもよく、皮膚組織において毛包上皮幹細胞の周囲に存在する細胞（例えば、色素幹細胞、表皮細胞等）を含む混合細胞であってもよい。
　毛包上皮幹細胞であることは、毛包上皮幹細胞のマーカータンパク質（例えば、ＣＤ３４等）を発現しているか否かで確認することができる。具体的には、例えば、ＣＤ３４を発現している細胞は、公知の方法（例えば、抗ＣＤ３４抗体を用いたＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）分析、Ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ（ＭＡＣＳ）分析、及び、免疫染色法等）を用いて、確認することができる。
　集積工程における培養条件としては、培養時間は、１０分間以上２４時間以下（好ましくは、１時間以上２時間以下）とすることができ、培養温度は２５℃以上４０℃未満（好ましくは、３７℃）とすることができる。また、例えば約５％のＣＯ２条件下であってもよい。
（細胞培養容器）
　細胞培養容器は、観察のしやすさ、スクリーニング効率から、複数のウェルが規則的に１つの基板に配置されているものが好ましい。本明細書においては、基板に配置された個々のウェルを細胞培養容器と想定する。このようなものとしては、市販のものを用いてもよいし、特許文献３（国際公開第２０１７／０７３６２５号）に記載の方法等で作製してもよい。
　また、基板におけるウェルの密度は、例えば２０個／ｃｍ２以上５００個／ｃｍ２以下とすることができ、例えば５０個／ｃｍ２以上２５０個／ｃｍ２以下とすることができ、例えば１００個／ｃｍ２以上２００個／ｃｍ２以下とすることができる。密度が上記範囲であることにより、哺乳動物の毛穴（特に、ヒトを含む霊長類の毛穴）の密度と同程度の密度で毛包上皮幹細胞が配置された状態で培養することができる。
　ウェルの開口部の直径及び深さについて、毛包上皮幹細胞の集積体を収容し培養できる大きさであれば特別な限定はないが、直径については、哺乳動物の毛穴と同程度の大きさとすることができ、例えば、２０μｍ以上１ｍｍ以下とすることができる。また、深さについては、例えば１ｍｍ以下とすることができる。
　細胞培養容器の材質は、細胞培養に適したものとすることができ、特別な限定はない。例えば、透明なガラス、ポリマー材等が挙げられる。中でも、酸素透過性を有するポリマー材が好ましい。酸素透過性を有するポリマー材として具体的には、例えば、フッ素樹脂、シリコンゴム（例えば、ポリジメチルシロキサン（ｐｏｌｙ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）：ＰＤＭＳ）等）等が挙げられる。これらの材質を単独で使用してもよいし、組み合わせて使用してもよい。
　本明細書において、「酸素透過性」とは、分子状の酸素を透過し、細胞培養容器のウェル内まで到達させる性質を表している。具体的な酸素透過率としては、約１００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ以上５０００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ以下であってよく、約１１００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ以上３０００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ以下であってよく、約１２５０ｃｍ３／ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ以上２７５０ｃｍ３／ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ以下であってよい。なお、「２４ｈ」は２４時間を意味し、「ａｔｍ」とは、気圧をの単位を意味する。すなわち、上記単位「ｃｍ３／ｍ２・２４ｈ・ａｔｍ」は、１気圧の環境下において、２４時間で透過する酸素の１ｍ２あたりの容量（ｃｍ３）を表している。酸素透過率が上記範囲である材質からなる細胞培養容器を使用することにより、十分な量の酸素を毛包上皮幹細胞に供給でき、毛髪再生能がより優れる毛包上皮幹細胞が得られる。
　また、細胞培養容器は、後述の実施例に示すように、市販の細胞培養容器を用いてもよく、鋳型を作製し、ＰＤＭＳを原料として細胞培養容器を一から作製してもよい。市販の細胞培養容器としては、例えば、住友ベークライト社製のＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標） ９６Ｕプレート等が挙げられる。
（培地）
　培地としては、特別な限定はなく、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン）等を含む基本培地とすることができる。
　培地に含まれる無機塩は、細胞の浸透圧平衡の維持を助けるために、及び、膜電位の調節を助けるためのものである。
　無機塩としては、特別な限定はなく、例えば、カルシウム、銅、鉄、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛等の塩が挙げられる。塩は、通常、塩化物、リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩、及び、重炭酸塩の形で用いられる。
　一般的に、培地中の無機塩の重量オスモル濃度は、例えば２００ｍＯｓｍ／ｋｇ以上４００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下とすることができ、例えば２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下とすることができ、例えば２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上３１０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下とすることができ、例えば２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上３００ｍＯｓｍ／ｋｇ未満とすることができ、例えば２８０ｍＯｓｍ／ｋｇとすることができる。
　炭水化物としては、特別な限定はなく、例えば、グルコース、ガラクトース、マルトース、フルクトース等が挙げられる。
　一般的に、培地中の炭水化物（好ましくは、Ｄ－グルコース）の濃度としては、０．５ｇ／Ｌ以上２ｇ／Ｌ以下であることが好ましい。
　アミノ酸としては、特別な限定はなく、例えば、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システイン、Ｌ－シスチン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、及び、それらの組み合わせ等が挙げられる。
　一般的に、培地に含まれるグルタミンの濃度は０．０５ｇ／Ｌ以上１ｇ／Ｌ以下（通常、０．１ｇ／Ｌ以上０．７５ｇ／Ｌ以下) とすることができる。培地に含まれるグルタミン以外の各アミノ酸は、０．００１ｇ／Ｌ以上１ｇ／Ｌ以下(通常、０．０１ｇ／Ｌ以上０．１５ｇ／Ｌ以下) とすることができる。アミノ酸は合成由来でもよい。
　ビタミンとしては、特別な限定はなく、例えば、チアミン（ビタミンＢ１）、リボフラビン（ビタミンＢ２）、ナイアシンアミド（ビタミンＢ３）、Ｄ－パントテン酸ヘミカルシウム（ビタミンＢ５）、ピリドキサール／ピリドキサミン／ピリドキシン（ビタミンＢ６）、葉酸（ビタミンＢ９）、シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、カルシフェロール（ビタミンＤ２）、ＤＬ－αトコフェロール（ビタミンＥ）、ビオチン（ビタミンＨ）、メナジオン（ビタミンＫ）、塩化コリン、ｍｙｏ－イノシトール等が挙げられる。
　培地は、さらに抗生物質、血清、成長因子、ホルモン、又は、ＲＯＣＫ阻害剤等を含んでいてもよい。
　抗生物質としては、例えば、ゲンタマイシン、アンフォテリシン、アンピシリン、ミノマイシン、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタシン、タイロシン、オーレオマイシン等、通常の動物細胞の培養に用いられるものが挙げられる。これらの抗生物質を単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。
　一般的に、培地に含まれる抗生物質の濃度は、特別な限定はなく、例えば０．１μｇ／ｍＬ以上１００μｇ／ｍＬ以下とすることができる。
　血清としては、例えば、ＦＢＳ／ＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ／Ｃａｌｆ　Ｓｅｒｕｍ）、ＮＣＳ（Ｎｅｗｂｏｒｎ　Ｃａｌｆ　ｓｅｒｕｍ）、ＣＳ（Ｃａｌｆ　Ｓｅｒｕｍ）、ＨＳ（Ｈｏｒｓｅ　Ｓｅｒｕｍ）等が挙げられ、これらに限定されない。
　一般的に、培地に含まれる血清の濃度は、例えば２質量％以上１０質量％以下とすることができる。
　成長因子としては、例えば、細胞増殖因子、細胞接着因子等が挙げられ、これらに限定されない。
　成長因子としてより具体的には、例えば、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）、酸性繊維芽細胞成長因子（ａｃｉｄｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ａＦＧＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦ）、インスリン様成長因子－１（Ｉｎｓｕｌｉｎ―ｌｉｋｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－１：ＩＧＦ－１）、マクロファージ由来成長因子（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ＭＤＧＦ）、血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ＰＤＧＦ）、腫瘍血管新生因子（Ｔｕｍｏｒ　ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ：ＴＡＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）等が挙げられる。これらの成長因子を単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。
　一般的に、培地に含まれる成長因子の濃度は、特別な限定はなく、例えば１ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下とすることができる。
　ホルモンとしては、例えば、インスリン、グルカゴン、トリヨードチロニン、副腎皮質ホルモン（ハイドロコーチゾン等）等が挙げられる。これらのホルモンを単独で含んでいてもよく、複数組み合わせて含んでいてもよい。
　一般的に、培地に含まれるホルモンの濃度は、特別な限定はなく、例えば１ｎｇ／ｍＬ以上１０μｇ／ｍＬ以下とすることができる。
　また、成長因子及びホルモンを含む培地添加剤として、ウシ脳下垂体抽出物（Ｂｏｖｉｎｅ　Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ　Ｅｘｔｒａｃｔ：ＢＰＥ）を用いてもよい。
　ＲＯＣＫ阻害剤としては、例えば、ＨＡ－１０７７、Ｙ－２７６３２、Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ、ＧＳＫ４２９２８６Ａ、ＲＫＩ－１４４７、ＧＳＫ１８０７３６Ａ、ＨＡ－１１００、Ｙ－３９９８３、ＡＲ－１３３２４、ＧＳＫ２６９９６２、ＡＴ１３１４８、Ｋ－１１５、ＫＤ０２５、ＺＩＮＣ００８８１５２４、及び、それらの塩が挙げられる。
　培地として具体的には、塩化カルシウムを含み、無血清であって、上皮成長因子、並びに、必要に応じて任意の抗生物質及び任意のホルモンを添加した公知の上皮系細胞用基本培地を用いることができる。
　前記公知の上皮系細胞用基本培地としては、例えば、ＨｕＭｅｄｉａ－ＫＢ２（クラボウ社製）、角化細胞基本培地２（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ　Ｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　２）（Ｐｒｏｍｏ　Ｃｅｌｌ社製）、ＥｐｉＬｉｆｅ（登録商標）　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）等が挙げられる。
　また、上皮成長因子、任意の抗生物質、及び、任意のホルモンを含む上皮系細胞増殖用培地としては、例えば、ＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２（クラボウ社製）、角化細胞増殖培地２（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　２）（Ｐｒｏｍｏ　Ｃｅｌｌ社製）等が挙げられる。また、これら上皮成長因子、任意の抗生物質、及び、任意のホルモンを含む上皮系細胞増殖用培地に、さらに、任意の成長因子及び任意のＲＯＣＫ阻害剤等を添加してもよい。
［混合工程］
　次いで、毛包上皮幹細胞の集積体に、細胞外マトリックス成分を加えて、前記細胞外マトリックス成分と前記毛包上皮幹細胞の集積体との混合物を作製する。これにより、続く培養工程において、毛包上皮幹細胞を生体内と近しい環境で培養することができる。混合工程において、細胞外マトリックス成分をゲル化させてもよく、ゲル化させなくてもよい。
　溶液中の細胞外マトリックス成分の濃度は、ゲル化の有無及びゲルの硬さに応じて、適宜調整することができる。また、細胞外マトリックス成分をゲル化させる場合、ゲル化時間についても、必要とするゲルの硬さに応じて、適宜調整することができる。ゲル化温度等の各種条件については、特別な限定はなく、例えば、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で培養する方法等が挙げられる。また、混合工程で用いられる細胞培養容器としては、上記「［集積工程］」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
（細胞外マトリックス成分）
　細胞外マトリックス成分としては、例えば、コラーゲン（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＸＩ型、ＸＶＩＩ型等）、マウスＥＨＳ腫瘍抽出物（ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン等を含む）より再構成された基底膜成分（商品名：マトリゲル）、フィブリン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン等が挙げられる。その他天然物由来の高分子として、ゼラチン、寒天、アガロース等を使用することもできる。それぞれのゲル化に至適な塩等の成分、その濃度、ｐＨ等を選択しハイドロゲルを作製することが可能である。また、これらの天然物由来の高分子を単独で用いてもよく、２種以上組み合わせて用いてもよい。
　中でも、細胞外マトリックス成分は、コラーゲン（特に、Ｉ型コラーゲン）が好ましい。コラーゲンを含有することにより、より皮膚に近しい組成となり、高い毛包再生効率を実現できる。
　細胞外マトリックス成分は溶媒に懸濁して用いてもよい。細胞外マトリックス成分を懸濁する溶媒としては、例えば、Ｈａｍ’ｓ　Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｍｉｘｔｕｒｅｓ　Ｆ－１０又はＨａｍ’ｓ　Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｍｉｘｔｕｒｅｓ　Ｆ－１２等の無血清培地や、細胞外マトリックス成分再構成用の緩衝液（例えば、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ－Ｂｕｆｆｅｒからなる緩衝液等）等が挙げられる。
［培養工程］
　次いで、混合工程で作製された混合物に培地を加えて培養する。培養工程で用いられる細胞培養容器及び培地としては、上記「［集積工程］」において例示されたものと同様のものが挙げられる。培養条件としては、培養時間は、３日間以上２１日間以下（好ましくは、１０日間以上１４日間以下）とすることができ、培養温度は２５℃以上４０℃未満（好ましくは、３７℃）とすることができる。また、例えば約５％のＣＯ２条件下であってもよい。
　培養工程において、後述の実施例に示すように、培養日数を経るにつれて、毛包上皮幹細胞同士が接着及び凝集し、一つの凝集体を形成する。
　この培養工程を経ることで、毛髪再生能に優れる毛包上皮幹細胞を大量に得ることができる。
［その他の工程］
　また、本実施形態の培養方法は、培養工程の後に、さらに、毛包上皮幹細胞のマーカータンパク質の発現を確認する確認工程等を備えてもよい。
　毛包上皮幹細胞のマーカータンパク質の発現の確認方法としては、上記「（毛包上皮幹細胞）」において例示された方法と同様の方法が挙げられる。
　また、本実施形態の培養方法は、培養工程の後に、さらに、得られた毛包上皮幹細胞を１細胞ずつに単離する単離工程等を備えてもよい。単離方法としては、例えば、トリプシン等の酵素処理を行う方法等が挙げられる。
＜毛包上皮幹細胞の培養キット＞
　本実施形態の毛包上皮幹細胞の培養キットは、酸素透過性を有する材質からなる細胞培養容器と、細胞外マトリックス成分と、培地と、を備える。
　本実施形態の培養キットによれば、毛髪再生能を維持しながら、毛包上皮幹細胞を大量に増殖させることができる。
　本実施形態の培養キットが備える、酸素透過性を有する材質からなる細胞培養容器、細胞外マトリックス成分及び培地は、上記「＜毛包上皮幹細胞の培養方法＞」において例示されたものと同様のものが挙げられる。
［その他構成］
　本実施形態の培養キットは、上記酸素透過性を有する材質からなる細胞培養容器、上記細胞外マトリックス成分及び上記培地に加えて、さらに、毛包上皮幹細胞のマーカータンパク質に対する抗体（例えば、抗ＣＤ３４抗体）等を備えていてもよい。これにより、培養して得られた細胞が毛包上皮幹細胞であるか否か（毛髪再生能を維持しているか否か）を確認することができる。
　また、本実施形態の培養方法は、上記酸素透過性を有する材質からなる細胞培養容器、上記細胞外マトリックス成分及び上記培地に加えて、さらに、トリプシン等の酵素を備えてもよい。これにより、本実施形態の培養キットを用いて得られた毛包上皮幹細胞を１細胞ずつに単離することができる。
＜毛包上皮幹細胞の使用用途＞
　本実施形態の培養方法及び培養キットを用いて得られた毛包上皮幹細胞は、例えば、毛乳頭細胞等の間葉系細胞と共培養することで毛包原基を構築することができる。この毛包原基を移植することで、毛髪を再生できる。
　本実施形態の培養方法及び培養キットを用いて得られた毛包上皮幹細胞は、例えば、被検動物の創傷部に移植することで、皮膚を再生することができる。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］毛包上皮幹細胞の培養１
　まず、成体マウスから皮膚細胞を採取し、毛包上皮幹細胞の存在率を評価した後に、単離して続く試験に用いた（図１参照）。
１．毛包上皮幹細胞の調製
（１）マウス上皮細胞の採取
　６～８週齢の雄の成体マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ｊｊｃｌ、チャールズリバー社より購入）より背部皮膚を採取し、１００ｍｇ／Ｌのペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ：Ｐ／Ｓ）（ＧＩＢＣＯ社製）を含むダルベッコりん酸緩衝生理食塩水（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ：ＤＰＢＳ）（ＧＩＢＣＯ社製）で洗浄した。次いで、脂肪組織をメスで外科的に除去し、皮膚組織を得た。この皮膚組織を１～１．５ｃｍ角に細断し、真皮側を下にして０．２５％トリプシン（ＧＩＢＣＯ社製）を用いて、３７℃で７０分間インキュベートした。次いで、ピンセットを用いて真皮層を外科的に除去した。５０ｍＬ遠心管に皮膚組織を酵素処理した溶液とともに加え、ピペッティングすることで細胞をバラバラにした。次いで、細胞を含む溶液ごと、７０μｍセルストレイナー（ＢＤ　ｆａｌｃｏｎ社製）を通し、さらに４０μｍセルストレイナーを通した（ＢＤ　ｆａｌｃｏｎ社製）。次いで、１０００ｒｐｍで３分間遠心することで、細胞を回収した。回収した細胞はＨｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２培地（ＫＵＲＡＢＯ社製）に懸濁した。
（２）ＣＤ３４陽性細胞の存在率の確認
　（１）で調製した細胞懸濁液を１０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を取り除いた。次いで、５ｍＬのＰＢＳに懸濁し、１０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を取り除く操作を２回行うことで培地を完全に除去した。ここにＰＢＳを加え、１×１０６ｃｅｌｌｓ／５００ｍＬになるように１．５ｍＬチューブに分注した。次いで、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）用抗体としてＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３４抗体（ＢＤ社製）及びＰＥ標識抗ＣＤ４９ｆ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加し、暗所、ｏｎ　ｉｃｅで３０分間染色した。染色後、１０００ｒｐｍで、３分間遠心し上清を取り除いた。次いで、５ｍＬのＰＢＳに懸濁し、１０００ｒｐｍ、３分間遠心し、上清を取り除く操作を２回行うことでＦＡＣＳ用抗体を含む溶液を完全に除去した。死細胞の核染色を行うために、７－Ａｍｉｎｏ－Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ　Ｄ（７－ＡＡＤ）を添加した。次いで、３０μｍフィルター付きの試験管に通した後、自動細胞解析分離装置（ＦＡＣＳ装置）（ベックマン・コールター社製）を用いて分析を行った。結果を図２示す。
　図２から、ＣＤ３４及びＣＤ４９ｆの両方発現している細胞は、マウス皮膚から採取した表皮系細胞群において６．９４％存在することが分かった。また、先行研究（上記非特許文献１参照）において、使用した系統のマウスの表皮細胞群中のＣＤ３４及びＣＤ４９ｆの両方発現している細胞の存在率は約５～１０％程度であることが報告されており、今回の結果は、この値の範囲であった。
　また、図２の「４」の範囲にあたるＣＤ３４（＋）、ＣＤ４９ｆ（－）細胞の存在率は０．６６％であり、無視できるほど小さいと判断した。そのため、以降の実験において、ＣＤ３４陽性（＋）細胞（図２中の「１」及び「４」の範囲に分類された細胞）を用いるとした。
（３）ＣＤ３４陽性細胞の単離
　次いで、以下の手順でＣＤ３４陽性（＋）細胞の回収を行った。全ての操作は氷上で行った。
（３－１）採取したマウス上皮細胞１．０～１．５×１０７ｃｅｌｌｓを含む細胞懸濁液を１０００ｒｐｍで、３分間遠心した後、上清を除去した。次いで、３００μＬのＭＡＣＳ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ）／ＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ　Ｂｉｏｔｅｃ社製）を加えた。
（３－２）５ｍＬチューブを３つ用意し、（３－１）で調製した細胞懸濁液をそれぞれに１０～１５μＬずつ分注した。各チューブをチューブ１、チューブ２及びチューブ３とし、以下、「（４）各チューブに関する手順）」に記載の操作を行った。
（３－３）次いで、（３－２）の分注後、残った細胞懸濁液に３ｍＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒを加え、１０００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を取り除いた。次いで、３００μＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒを加えた。その後、抗マウスＣＤ３４抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を３０μＬ加え、暗所にて４℃で３０分間静置した。
（３－４）５ｍＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒを加えた後、１０００ｒｐｍで３分間遠心した。上清を取り除き、３００μＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒに再懸濁した後、３０μＬのＦＩＴＣ標識抗ラットＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を加え、暗所にて４℃で３０分間静置した。
（３－５）５ｍＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒを加えた後、１０００ｒｐｍで、３分間遠心し、上清を取り除く操作を２回行うことでＦＩＴＣ標識抗ラット抗体を完全に除去した。次いで、３００μＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒに再懸濁した後、３０μＬの抗ＦＩＴＣ抗体結合マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ　Ｂｉｏｔｅｃ社製）を加え、暗所にて４℃で３０分間静置した。
（３－６）５ｍＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒを加えた後、１０００ｒｐｍで３分間遠心した。上清を取り除き、５００μＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒに再懸濁した後、４℃で保管した。磁気細胞分離装置（ＭＡＣＳ装置）（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ　Ｂｉｏｔｅｃ社製）でサンプルを流す前に、１５μＬのサンプルを１５ｍＬチューブに移動し、６００μＬまでＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒを加えてメスアップした（以下、このサンプルを含むチューブを「チューブ４」と称する場合がある）。以下、「（４）各チューブに関する手順）」に記載の操作を行った。
（３－７）Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社の手順書に従って、（３－６）で調製したサンプルからラベリングした細胞とラベリングされなかった細胞とに分離した。
（３－８）ラベリングされなかった細胞懸濁液６００μＬを１５ｍＬチューブに回収し、４℃で保存した（以下、このラベリングされなかった細胞懸濁液を含むチューブを「チューブ５」と称する場合がある）。以下、「（４）各チューブに関する手順）」に記載の操作を行った。
（３－９）ラベリングされた細胞懸濁液４００μＬを１５ｍＬチューブに回収し、４℃で保存した（以下、このラベリングされた細胞懸濁液を含むチューブを「チューブ６」と称する場合がある）。以下、「（４）各チューブに関する手順）」に記載の操作を行った。
（４）各チューブに関する手順（ＦＡＣＳ用サンプルの調製）
（４－１）チューブ１（未染色コントロールの調製）
　チューブ１に６００μＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒを加えて、４℃で保存した。
（４－２）チューブ２（バックグラウンドコントロールの調製）
（４－２－１）チューブ２の細胞懸濁液が５０μＬになるようにＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒを加え、さらに５μＬのＦＩＴＣ標識抗ラットＩｇＧ抗体を加え、暗所にて４℃で３０分間静置した。
（４－２－２）５ｍＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒを加えた後、１０００ｒｐｍで３分間遠心した。上清を取り除き、５０μＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒに再懸濁した後、５μＬの抗ＦＩＴＣ抗体結合マイクロビーズを加え、暗所にて４℃で３０分間静置した。
（４－２－３）５ｍＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒを加えた後、１０００ｒｐｍで３分間遠心した。上清を取り除き、６００μＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒを加えて、４℃で保存した。
（４－３）チューブ３（アイソタイプコントロールの調製）
（４－３－１）チューブ３の細胞懸濁液が５０μＬになるようにＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒを加え、さらに５μＬのラットＩｇＧアイソタイプ抗体（ＰＥ標識ラットＩｇＧ抗体）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を加え、暗所にて４℃で３０分間静置した。
（４－３－２）５ｍＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒを加えた後、１０００ｒｐｍで３分間遠心した。上清を取り除き、５０μＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒに再懸濁した後、５μＬのＦＩＴＣ標識抗ラットＩｇＧ抗体を加え、暗所にて４℃で３０分間静置した。
（４－３－３）５ｍＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒを加えた後、１０００ｒｐｍで３分間遠心した。上清を取り除き、５０μＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒに再懸濁した後、５μＬの抗ＦＩＴＣ抗体結合マイクロビーズを加え、暗所にて４℃で３０分間静置した。
（４－３－４）５ｍＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒを加えた後、１０００ｒｐｍで３分間遠心した。上清を取り除き、６００μＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒを加えて、４℃で保存した。
（４－４）チューブ４（プレソートサンプルの調製）
　チューブ４に６００μＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒを加えて、４℃で保存した。
（４－５）チューブ５（ラベリングされなかった細胞の調製）
　チューブ５に４００μＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒを加えて、４℃で保存した。
（４－６）チューブ６（ラベリングされた細胞の調製）
　チューブ６に６００μＬのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒを加えて、４℃で保存した。
（５）ＦＡＣＳ分析
　次いで、（４）で調製したチューブ１～６のＦＡＣＳ分析用の各サンプルを用いて、ＦＡＣＳ装置を用いて分析し、蛍光強度ごとの細胞数をカウントした。結果を以下の表１及び図３Ａ（ラベリングされた細胞のＦＡＣＳ解析結果のグラフ）に示す。
（６）免疫蛍光染色
　また、チューブ６の細胞懸濁液を用いて、ＣＤ３４の免疫蛍光染色を行い、倒立型位相差蛍光顕微鏡（オリンパス社製、ＩＸ－７１）を用いて観察した。結果を図３Ｂに示す。
［表１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
　表１及び図３Ａから、ＣＤ３４陽性（＋）細胞の純度は、９８．２６％であることが分かった。
　また、図３Ｂから、細胞は培養皿上で接着し生存しており、細胞接着後もＣＤ３４の発現を維持していた。
　以上のことから、マウス皮膚組織からＣＤ３４の発現が維持された毛包上皮幹細胞が単離できたことが確認された。
２．毛包上皮幹細胞の培養
（１）上皮系細胞培養培地の調製
　Ｈｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２培地（ＫＵＲＡＢＯ社製）に、ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）（ＳＩＧＭＡ社製）を５ｍＬ、Ｌ－グルタミン（和光純薬工業社製）を１６ｍｇ、１０ｎｇ／μＬの組換えマウス繊維芽細胞成長因子２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　２：ＦＧＦ２）（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を１００μＬ、１００μｇ／ｍＬの血管内皮細胞成長因子Ａ（Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ－Ａ：ＶＥＧＦ－Ａ）（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を１０μＬ及び１ｍＭのＹ－２７６３２（和光純薬工業社製）を２７５μＬ加え、よく攪拌した。次いで、滅菌フィルターに通して、２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２、２０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ－Ａ及び５μＭのＹ－２７６３２を含むＨｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２培地（以下、「上皮系細胞培養培地」と称する場合がある）を調製した。
（２）集積工程
　「１．」で得られた８．０×１０４ｃｅｌｌｓの毛包上皮幹細胞を１００μＬの（１）で調製した上皮系細胞培養培地に懸濁して細胞懸濁液を調製した。次いで、細胞懸濁液を非接着９６Ｕウェルプレート（住友ベークライト社製、曲率半径：４．５ｍｍ）の各ウェルに分注し、３７℃で３０分間以上２４時間以下程度インキュベートし、重力によって細胞が培養容器の底面に沈殿し、細胞の集積体が形成されたのを確認した（図４参照）。
（３）混合工程
　次いで、培地のみを静かに除去し、細胞の集積体の上からマトリゲル（登録商標）（なお、以下、「登録商標」との記載を省略する）（ＣＯＲＮＩＮＧ社製）を静かに加え、３７℃で３０分間インキュベートすることでゲルを硬化させてマトリゲルと毛包上皮幹細胞の集積体との混合物を得た。
（４）培養工程
　次いで、マトリゲルと毛包上皮幹細胞の集積体との混合物に上皮系細胞培養培地を加え、１４日間培養することで、細胞の密度が毛包上皮幹細胞の再生効率の維持に有用であるかどうかを評価した。経時的な（培養１、４、７、１１及び１４日目の）細胞の形態変化は倒立型位相差蛍光顕微鏡（オリンパス社製、ＩＸ－７１）を用いて観察した。結果を図５に示す。
　図５から、細胞は培養１日目では密集こそしていたが、細胞同士は離れた状態でいた。しかし、培養４日目から細胞同士が接着及び凝集し始め、培養７日目にはほとんど全ての細胞が一つの凝集体を形成した。
（５）ＣＤ３４の遺伝子発現量の解析
　次いで、培養１４日目の細胞を回収し、ＣＤ３４の遺伝子発現量をＲＴ－ＰＣＲ法により、リアルタイムＰＣＲシステムＳｔｅｐ　ＯｎｅＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）及びＳＹＢＲ（登録商標）　Ｇｒｅｅｎ　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、測定した。手順は、ＳＹＢＲ（登録商標）　Ｇｒｅｅｎ　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘｅｓのプロトコルに従って行った。また、以下の表２に示すプライマーを用いた。結果を図６に示す。図６において、後述の比較例１（低密度）でのＣＤ３４の遺伝子発現量を１としたときの、実施例１（高密度）での相対的なＣＤ３４の遺伝子発現量を示している。なお、図６に示す実施例１でのＣＤ３４の遺伝子発現量の考察は、後述する比較例１に記載する。
［表２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
［比較例１］毛包上皮幹細胞の培養２
１．毛包上皮幹細胞の調製
　実施例１の「１．」と同様の方法を用いて、毛包上皮幹細胞を調製した。
２．毛包上皮幹細胞の培養
（１）上皮系細胞培養培地の調製
　実施例１の「２．（１）」と同様の方法を用いて、上皮系細胞培養培地を調製した。
（２）従来法による毛包上皮幹細胞の培養
　「１．」で得られた８．０×１０４ｃｅｌｌｓの毛包上皮幹細胞を２０μＬの（１）で調製した上皮系細胞培養培地に懸濁し、さらにマトリゲル２０μＬを加えて、合計４０μＬの細胞－ゲル混合液を調製した。次いで、細胞－ゲル混合液を２４ウェルプレート（ＢＤ　ｆａｌｃｏｎ社製）に滴下し、３７℃で３０分間インキュベートすることでマトリゲルを硬化させた（図４参照）。次いで、上皮系細胞培養培地を５００μＬ加えて、１４日間培養した（以下、「従来のマトリゲル包埋培養法」と称する場合がある）。対象として、マトリゲルで包埋せずに２４ウェルプレート（ＢＤ　ｆａｌｃｏｎ社製）に毛包上皮幹細胞を播種して、同様に１４日間培養した（以下、「平面培養法」と称する場合がある）。経時的な（培養１、４、７、１１及び１４日目の）細胞の形態変化は倒立型位相差蛍光顕微鏡（オリンパス社製、ＩＸ－７１）を用いて観察した。結果を図７Ａ（平面培養法）及び図７Ｂ（従来のマトリゲル包埋培養法）に示す。
　図７Ｂから、従来のマトリゲル包埋培養法で培養した毛包上皮幹細胞は培養１～４日目では分散しているが、培養７日目には小さな凝集体を形成し始めた。その凝集体は徐々に大きくなり、培養１４日目には１００～１５０μｍ程度の大きさになった。
　一方、図７Ａ及び図７Ｂから、平面培養法で培養した毛包上皮幹細胞は、従来のマトリゲル包埋培養法で培養した毛包上皮幹細胞と比較して、細胞増殖が早かった。
（３）ＣＤ３４の遺伝子発現量の解析
　試料として、培養前の毛包上皮幹細胞、並びに、従来のマトリゲル包埋培養法及び平面培養法で培養した培養１４日目の毛包上皮幹細胞を用いた以外は、実施例１の「２．（５）」と同様の方法を用いて、ＣＤ３４の遺伝子発現量を解析した。結果を図６及び図８に示す。図６において、比較例１（低密度）は、マトリゲル包埋培養法で培養した培養１４日目の毛包上皮幹細胞でのＣＤ３４の遺伝子発現量を示す。また、図８において、平面培養法で培養した培養１４日目の毛包上皮幹細胞でのＣＤ３４の遺伝子発現量を１としたときの、マトリゲル包埋培養法で培養した培養１４日目の毛包上皮幹細胞及び培養前の毛包上皮幹細胞の相対的なＣＤ３４の遺伝子発現量を示している。
　図８から、従来のマトリゲル包埋培養法で培養した毛包上皮幹細胞は、培養１４日目でも、培養前の毛包上皮幹細胞とほぼ同様のＣＤ３４の遺伝子発現量を示すことがわかった。一方で、平面培養法で培養した毛包上皮幹細胞は、かなり毛髪再生能が低下することがわかった。
　一般に、毛包上皮幹細胞は、傷等で隣接する細胞との接触が切れると強烈な増殖スイッチが入り、表面を覆うまで増殖することで外界からの細菌侵入を防ぐことが知られている。ただし、この場合、毛包形成能を有していた細胞は単に表面を覆うための細胞へと分化する。平面培養法では、このような環境を意図せず再現していたために、毛髪再生能が低下し、従来のマトリゲル包埋培養法では、比較的温和な速度で増殖させることができたため、毛髪再生能を維持しながら培養できたと考えられる。
　また、図６から、従来のマトリゲル包埋培養法で培養した毛包上皮幹細胞よりも、本実施形態の培養方法で培養した毛包上皮幹細胞では、ＣＤ３４の遺伝子発現量がおよそ２．９倍も向上することが分かった。
　以上のことから、マトリゲルを用いて、上皮幹細胞を培養する場合には、細胞を均一に分散させた状態でマトリゲルを用いるよりも、細胞を一か所に集積させた後にマトリゲルを用いて培養したほうが機能維持に有効であることが明らかとなった。
［実施例２］酸素透過性細胞培養容器を用いた毛包上皮幹細胞の培養１
１．毛包上皮幹細胞の調製
　実施例１の「１．」と同様の方法を用いて、毛包上皮幹細胞を調製した。
２．酸素透過性細胞培養容器の作製
　図９は、酸素透過性細胞培養容器（ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）スフェロイドチップ）の作製方法を示す概略工程図である。図９を参照しながら、酸素透過性細胞培養容器の作製方法について、以下に詳細を説明する。
　まず、ＣＡＤソフト、Ｖ　Ｃａｒｖｅ　Ｐｒｏ　６．５を用いて、作製するスフェロイド容器のパターンをコンピューターで設計した。次いで、切削機を用いて、設計したパターンどおりにオレフィン系基板を切削することで、パターンをもつ凹鋳型を作製した。この凹鋳型にエポキシ樹脂（クリスタルリジン：日新レジン社製）を流しこみ、１日硬化させた。次いで、凹鋳型を離型することで、パターンをもつ凸鋳型を形成した。次いで、形成した凸鋳型を２４ウェルプレート（ＢＤ　ｆａｌｃｏｎ社製）の底面に固定し、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を流し込み、固化した。次いで、凸鋳型を離型することで、酸素透過性細胞培養容器として、ＰＤＭＳに規則的なパターンが形成されたＰＤＭＳスフェロイドチップを作製した。得られたＰＤＭＳスフェロイドチップにおいて、ウェルの深さ（図９中の「Ｈ」）は０．５ｍｍ、ウェル開口部の直径（図９中の「Φ」）は１．０ｍｍ、ウェル開口部の中心部から隣接するウェル開口部の中心部までの距離（図９中の「Ｐ」）は１．５ｍｍ、曲率半径（図示せず）は０．５ｍｍであった。
３．毛包上皮幹細胞の培養
（１）上皮系細胞培養培地の調製
　実施例１の「２．（１）」と同様の方法を用いて、上皮系細胞培養培地を調製した。
（２）毛包上皮幹細胞の培養
　細胞培養容器として、「２．」で作製した酸素透過性細胞培養容器（ＰＤＭＳスフェロイドチップ）を用いた以外は、実施例１の「２．（２）～（４）」と同様の方法を用いて、毛包上皮幹細胞を１４日間培養した。経時的な（培養１、４、７、１１及び１４日目の）細胞の形態変化は倒立型位相差蛍光顕微鏡（オリンパス社製、ＩＸ－７１）を用いて観察した。結果を図１０に示す。
　図１０から、毛包上皮幹細胞は培養１日目ではウェル底面に沈殿しており、培養４日目から次第に凝集しはじめ、培養７日目には一つの凝集体を形成し、培養１４日目までその形状を維持していた。
（３）ＣＤ３４の遺伝子発現量の解析
　試料として、上記（２）で培養した培養１４日目の毛包上皮幹細胞を用いた以外は、実施例１の「２．（５）」と同様の方法を用いて、ＣＤ３４の遺伝子発現量を解析した。結果を図１１に示す。図１１において、上述の比較例１（低密度）でのＣＤ３４の遺伝子発現量を１としたときの、実施例１、実施例２及び後述する比較例２での相対的なＣＤ３４の遺伝子発現量を示している。なお、図１１に示す実施例２でのＣＤ３４の遺伝子発現量の考察は、後述する比較例２に記載する。
［比較例２］酸素透過性細胞培養容器を用いた毛包上皮幹細胞の培養２
１．毛包上皮幹細胞の調製
　実施例１の「１．」と同様の方法を用いて、毛包上皮幹細胞を調製した。
２．酸素透過性細胞培養容器の作製
　実施例２の「２．」と同様の方法を用いて、酸素透過性細胞培養容器（ＰＤＭＳスフェロイドチップ）を作製した。
３．毛包上皮幹細胞の培養
（１）上皮系細胞培養培地の調製
　実施例１の「２．（１）」と同様の方法を用いて、上皮系細胞培養培地を調製した。
（２）毛包上皮幹細胞の培養
　細胞培養容器として、「２．」で作製した酸素透過性細胞培養容器（ＰＤＭＳスフェロイドチップ）を用いた以外は、比較例１の「２．（２）」に記載の従来のマトリゲル包埋培養法と同様の方法を用いて、毛包上皮幹細胞を１４日間培養した（図１２参照）。経時的な（培養１、４、７、１１及び１４日目の）細胞の形態変化は倒立型位相差蛍光顕微鏡（オリンパス社製、ＩＸ－７１）を用いて観察した。結果を図１３に示す。
　図１３から、毛包上皮幹細胞は、培養１～４日目では分散していたが、培養７日目に小さな凝集体を形成し、培養１４日目には１００～１５０μｍ程度の大きさになった。
（３）ＣＤ３４の遺伝子発現量の解析
　試料として、上記（２）で培養した培養１４日目の毛包上皮幹細胞を用いた以外は、実施例１の「２．（５）」と同様の方法を用いて、ＣＤ３４の遺伝子発現量を解析した。結果を図１１に示す。図１１において、上述の比較例１（低密度）でのＣＤ３４の遺伝子発現量を１としたときの、実施例１、実施例２及び比較例２での相対的なＣＤ３４の遺伝子発現量を示している。
　図７Ｂ及び図１３の顕微鏡像の比較から、酸素透過性細胞培養容器（ＰＤＭＳスフェロイドチップ）での培養結果と、２４ウェルプレートでの培養結果との差は確認できなかった。
　しかしながら、図１１に示す比較例１及び比較例２でのＣＤ３４の遺伝子発現量の比較から、ＣＤ３４の遺伝子発現量に大きな差が出ることが分かった。このことから、より酸素が豊富に供給される高酸素環境の方が、毛包上皮幹細胞の機能維持に有効であることが分かった。
　我々は、呼吸により酸素を取り込み、その酸素は、赤血球と人体に張り巡らされた血管によって体中を巡り細胞まで運搬される。細胞は、この酸素を消費し、ミトコンドリアのクエン酸回路と電子伝達系によって、グルコースからＡＴＰを産生する。このエネルギー効率は熱力学的に概算すると約４３％となる。一方で、酸素がない嫌気環境下においては、細胞の解糖系のみが働くため、エネルギー効率は急激に減少し２％程度と概算できる。したがって、酸素がうすい状態が続けば、細胞は増殖や機能維持するためのエネルギーを得ることができなくなることが予想される。
　一方、通常の培養環境下では、細胞は培地から酸素を受け取るが、その培地への酸素供給は培養上面の気液界面からのみであるため、物質収支が間に合わず酸素は培養とともに消費される。実施例２及び比較例２で用いられたＰＤＭＳスフェロイドチップは酸素透過性材料であるため、培養器全体から培地への酸素供給が可能となる。そのため、毛包上皮幹細胞を酸素透過性の高いＰＤＭＳスフェロイドチップで培養することで、培養培地への酸素供給を増加させ、細胞の増殖や機能維持に必要な十分なエネルギーを細胞が産生できるようになったのではないかと考えられる。
　また、図１１から、ＰＤＭＳスフェロイドチップを用いた本実施形態の培養方法で培養した毛包上皮幹細胞（実施例２）は、従来のマトリゲル包埋培養法で培養した毛包上皮幹細胞（比較例１）よりも約４．２倍のＣＤ３４の遺伝子発現量を示した。
　以上のことから、ＰＤＭＳスフェロイドチップは毛包上皮幹細胞の培養に有用である可能性が示された。
　本実施形態の培養方法及び培養キットによれば、毛髪再生能を維持しながら、毛包上皮幹細胞を大量に増殖させることができる。本実施形態の培養方法及び培養キットにより得られた毛包上皮幹細胞を用いて、優れた毛髪再生能を有する再生毛包原基を作製することができる。

Claims (5)

  1. 　細胞培養容器に、毛包上皮幹細胞を播種し、集積体を形成させる集積工程と、
    　前記毛包上皮幹細胞の集積体に細胞外マトリックス成分を加え、前記細胞外マトリックス成分と前記毛包上皮幹細胞の集積体との混合物を作製する混合工程と、
    　前記混合物に培地を加えて培養する培養工程と、
    　を備える毛包上皮幹細胞の培養方法。
  2. 　前記細胞外マトリックス成分がＩ型コラーゲンである請求項１に記載の毛包上皮幹細胞の培養方法。
  3. 　前記細胞培養容器が酸素透過性を有する材質からなる請求項１又は２に記載の毛包上皮幹細胞の培養方法。
  4. 　前記酸素透過性を有する材質がポリジメチルシロキサンである請求項３に記載の毛包上皮幹細胞の培養方法。
  5. 　酸素透過性を有する材質からなる細胞培養容器と、
    　細胞外マトリックス成分と、
    　培地と、
    　を備える毛包上皮幹細胞の培養キット。

     
PCT/JP2019/003903 2018-02-07 2019-02-04 毛包上皮幹細胞の培養方法及び培養キット Ceased WO2019156032A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP19751917.6A EP3750986A4 (en) 2018-02-07 2019-02-04 PROCESS AND KIT FOR CULTURE OF EPITHELIAL STEM CELLS OF THE PILEOUS FOLLICLE
US16/968,323 US20210079345A1 (en) 2018-02-07 2019-02-04 Method and Kit for Culturing Hair Follicle's Epithelial Stem Cells

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018020376A JP7078925B2 (ja) 2018-02-07 2018-02-07 毛包上皮幹細胞の培養方法及び培養キット
JP2018-020376 2018-02-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019156032A1 true WO2019156032A1 (ja) 2019-08-15

Family

ID=67549419

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2019/003903 Ceased WO2019156032A1 (ja) 2018-02-07 2019-02-04 毛包上皮幹細胞の培養方法及び培養キット

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20210079345A1 (ja)
EP (1) EP3750986A4 (ja)
JP (1) JP7078925B2 (ja)
WO (1) WO2019156032A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022191812A1 (en) * 2021-03-08 2022-09-15 National Cheng Kung University Method of facilitating wound-induced hair follicle neogenesis, tissue regeneration and reducing wound stiffness

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3865570B1 (en) * 2018-09-26 2025-06-25 Organ Technologies, Inc. In vitro growth method for hair follicular epithelial stem cells
WO2021065831A1 (ja) * 2019-09-30 2021-04-08 京セラ株式会社 容器
WO2021162206A1 (ko) * 2020-02-10 2021-08-19 주식회사 마이크로바이오틱스 모낭조직 배양액을 포함하는 탈모의 예방 또는 치료용 조성물

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10118103A (ja) * 1996-10-22 1998-05-12 Toyobo Co Ltd 皮膚付属器官様構造体を含む人工皮膚及びその製造方法
JP2005218445A (ja) * 2004-01-09 2005-08-18 Technology Seed Incubation Co Ltd 培養皮膚細胞とこれを原料として用いた移植用材及び遺伝子解析用材並びに培養皮膚細胞の製造方法
JP2008125540A (ja) * 2006-11-16 2008-06-05 Lion Corp 人工皮膚
JP2009529886A (ja) * 2006-03-17 2009-08-27 インターサイテックス リミティド 毛嚢生成のための細胞同時培養
JP2012249556A (ja) 2011-06-01 2012-12-20 Nara Medical Univ 毛包幹細胞の培養方法
WO2017070506A1 (en) * 2015-10-21 2017-04-27 Indiana University Research And Technology Corporation Derivation of human skin organoids from pluripotent stem cells
WO2017073625A1 (ja) 2015-10-30 2017-05-04 国立大学法人横浜国立大学 再生毛包原基の集合体の製造方法、毛包組織含有シート、及び毛包組織含有シートの製造方法
WO2017217393A1 (ja) * 2016-06-17 2017-12-21 国立大学法人横浜国立大学 毛髪再生用細胞包埋ビーズ及びその製造方法、並びに毛髪再生用キット

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10118103A (ja) * 1996-10-22 1998-05-12 Toyobo Co Ltd 皮膚付属器官様構造体を含む人工皮膚及びその製造方法
JP2005218445A (ja) * 2004-01-09 2005-08-18 Technology Seed Incubation Co Ltd 培養皮膚細胞とこれを原料として用いた移植用材及び遺伝子解析用材並びに培養皮膚細胞の製造方法
JP2009529886A (ja) * 2006-03-17 2009-08-27 インターサイテックス リミティド 毛嚢生成のための細胞同時培養
JP2008125540A (ja) * 2006-11-16 2008-06-05 Lion Corp 人工皮膚
JP2012249556A (ja) 2011-06-01 2012-12-20 Nara Medical Univ 毛包幹細胞の培養方法
WO2017070506A1 (en) * 2015-10-21 2017-04-27 Indiana University Research And Technology Corporation Derivation of human skin organoids from pluripotent stem cells
WO2017073625A1 (ja) 2015-10-30 2017-05-04 国立大学法人横浜国立大学 再生毛包原基の集合体の製造方法、毛包組織含有シート、及び毛包組織含有シートの製造方法
WO2017217393A1 (ja) * 2016-06-17 2017-12-21 国立大学法人横浜国立大学 毛髪再生用細胞包埋ビーズ及びその製造方法、並びに毛髪再生用キット

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHACON-MARTINEZ C A ET AL.: "Hair follicle stem cell cultures reveal self-organizing plasticity of stem cells and their progeny", EMBO, vol. 36, no. 2, 2017, pages 151 - 164
CHACON-MARTINEZ, CARLOS ANDRES ET AL.: "Hair follicle stem cell cultures reveal self-organizing plasticity of stem cells and their progeny", THE EMBO JOURNAL, vol. 36, no. 2, 2017, pages 151 - 164, XP055629614, ISSN: 0261-4189, DOI: 10.15252/embj.201694902 *
See also references of EP3750986A4

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022191812A1 (en) * 2021-03-08 2022-09-15 National Cheng Kung University Method of facilitating wound-induced hair follicle neogenesis, tissue regeneration and reducing wound stiffness

Also Published As

Publication number Publication date
EP3750986A1 (en) 2020-12-16
EP3750986A4 (en) 2021-11-10
US20210079345A1 (en) 2021-03-18
JP2019135947A (ja) 2019-08-22
JP7078925B2 (ja) 2022-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11155782B2 (en) Method for preparing pluripotent stem cells
AU2010266016B2 (en) Differentiated pluripotent stem cell progeny depleted of extraneous phenotypes
WO2016123474A1 (en) Methods to generate gastrointestinal epithelial tissue constructs
KR102316007B1 (ko) 피부 유래 전구 세포의 제작 방법
WO2010065239A1 (en) Stem cells from urine and methods for using the same
CN101978047A (zh) 干细胞聚集体及制备和使用方法
US20210189351A1 (en) Epithelial cell spheroids
WO2019156032A1 (ja) 毛包上皮幹細胞の培養方法及び培養キット
JP7660899B2 (ja) ナイーブ型多能性幹細胞からの栄養外胚葉誘導方法
KR20160136447A (ko) Cd82 양성 심근 전구세포
US20240052313A1 (en) Chondrogenic human mesenchymal stem cell (msc) sheets
Eder et al. Selective culture conditions for different types of primary human bladder cells.
RU2631005C1 (ru) Способ культивирования клеток слюнной железы человека
JP2022528737A (ja) Ａｂｃｇ２陽性角膜輪部幹細胞を得る又は維持する方法
HK40013193A (en) Method for preparing pluripotent stem cells
JP2019122286A (ja) 色素の蓄積を制御する候補化合物をスクリーニングする方法及びキット
HK1182135A (en) Chondrogenic progenitor cells, protocol for derivation of cells and uses thereof
HK1178568B (en) Differentiated pluripotent stem cell progeny depleted of extraneous phenotypes

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19751917

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019751917

Country of ref document: EP

Effective date: 20200907