[go: up one dir, main page]

WO2019151097A1 - 心筋細胞の製造方法 - Google Patents

心筋細胞の製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2019151097A1
WO2019151097A1 PCT/JP2019/002193 JP2019002193W WO2019151097A1 WO 2019151097 A1 WO2019151097 A1 WO 2019151097A1 JP 2019002193 W JP2019002193 W JP 2019002193W WO 2019151097 A1 WO2019151097 A1 WO 2019151097A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
inhibitor
agonist
cardiomyocytes
cells
somatic cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2019/002193
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
平 戴
行正 武田
義規 原田
松本　潤一
あゆみ 草鹿
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kyoto Prefectural PUC
Kataoka Corp
Original Assignee
Kyoto Prefectural PUC
Kataoka Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyoto Prefectural PUC, Kataoka Corp filed Critical Kyoto Prefectural PUC
Priority to JP2019569055A priority Critical patent/JP7586408B2/ja
Priority to EP19746735.0A priority patent/EP3747993A4/en
Priority to CN201980010936.3A priority patent/CN111684059A/zh
Priority to US16/960,441 priority patent/US11834679B2/en
Publication of WO2019151097A1 publication Critical patent/WO2019151097A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0657—Cardiomyocytes; Heart cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
    • C12N2500/62—DMSO
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/01—Modulators of cAMP or cGMP, e.g. non-hydrolysable analogs, phosphodiesterase inhibitors, cholera toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/405—Cell cycle regulated proteins, e.g. cyclins, cyclin-dependant kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1307—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/99—Enzyme inactivation by chemical treatment

Definitions

  • the present invention belongs to the technical field of regenerative medicine or direct reprogramming from somatic cells.
  • the present invention relates to a method for producing cardiomyocytes directly from somatic cells using a low molecular weight compound in the technical field, and low molecular weight compound induced cardiomyocytes (ciCMs) produced by such a production method. It is.
  • the present invention further relates to the cardiomyocytes and compositions that can be used for the method for producing the cardiomyocytes.
  • Mesenchymal cells form various biological organs such as muscle, bone, cartilage, bone marrow, fat, and connective tissue, and are promising as materials for regenerative medicine.
  • Mesenchymal stem cells are undifferentiated cells present in tissues such as bone marrow, adipose tissue, blood, placenta and umbilical cord. Since it has the ability to differentiate into cells belonging to the mesenchymal system, mesenchymal stem cells are attracting attention as a starting material for producing those cells.
  • regenerative medicine using mesenchymal stem cells themselves for reconstructing bone, cartilage, myocardium and the like is also being studied.
  • Non-patent Document 1 a method for directly converting somatic cells such as fibroblasts into other cells.
  • fibroblasts a chemical substance
  • Non-patent Document 2 Cardiomyocytes are also known to be directly induced from mouse fetal fibroblasts by culturing with certain chemicals including GSK3 inhibitor (CHIR99021) (Non-patent Document 2).
  • GSK3 inhibitor CHOK3 inhibitor
  • HFF human foreskin fibroblasts
  • HVF fetal lung fibroblasts
  • Patent Document 1 discloses a WNT agonist, a GSK3 inhibitor, a TGF- ⁇ inhibitor, an extracellular signal-regulated kinase (ERK1), a Ras GTPase active protein inhibitor (Ras-GAP), an Oct-4 activator, a Rho.
  • a composition comprising at least five of the related coiled-coil forming protein serine / threonine kinase inhibitors, iron chelators, KDM5B inhibitors, histone methyltransferase inhibitors, and PDGF tyrosine kinase inhibitors, Directly derived inventions are described.
  • Patent Document 2 discloses a cAMP activator, an ALK5 inhibitor (TGF- ⁇ inhibitor) and an ERK inhibitor in the presence of at least one inhibitor selected from the group consisting of an ALK6 inhibitor and an AMPK inhibitor.
  • An invention has been described in which cardiomyocytes are directly induced from human fibroblasts by culturing somatic cells in the presence of.
  • a method of directly converting a somatic cell into a desired cell without introducing a gene may be an effective option as a means for obtaining a therapeutic cell.
  • cardiomyocytes are actually induced directly by culturing with a certain chemical substance, but in the invention described in Non-Patent Document 2, direct induction from mouse fibroblasts, It is not direct induction from human fibroblasts.
  • cardiomyocytes are directly induced from human fibroblasts, but for this, the supernatant of cardiomyocytes differentiated from ES cells is essential.
  • cardiomyocytes are directly derived from human fibroblasts.
  • the present invention is a method for directly inducing cardiomyocytes from somatic cells by a combination of low molecular weight compounds different from the inventions described in Patent Documents 1 and 2 without artificial gene transfer, ie, certain low molecules It is a main object to provide a new production method capable of directly producing cardiomyocytes from somatic cells by a compound composition.
  • somatic cells can be directly converted into cardiomyocytes by culturing somatic cells in the presence of certain small molecule inhibitors and the like, and the present invention has been completed. It was.
  • Examples of the present invention include the following.
  • [1] A method for producing cardiomyocytes by directly inducing differentiation from somatic cells, the method comprising culturing somatic cells in the presence of a MEK inhibitor.
  • [2] The method for producing cardiomyocytes according to [1] above, wherein the step is a step of further culturing somatic cells in the presence of a cAMP inducer.
  • [3] The above-mentioned [1] or [3], wherein the step is a step of further culturing somatic cells in the presence of at least one selected from the group consisting of a TGF- ⁇ inhibitor, a PDE4 inhibitor, and a GR agonist.
  • MEK inhibitor, cAMP inducer, and TGF- ⁇ inhibitor (2) MEK inhibitor, cAMP inducer, and PDE4 inhibitor, (3) MEK inhibitor, cAMP inducer, and GR agonist, (4) MEK inhibitor, cAMP inducer, PDE4 inhibitor, and GR agonist, (5) MEK inhibitor, cAMP inducer, TGF- ⁇ inhibitor, PDE4 inhibitor, and GR agonist, (6) MEK inhibitor, cAMP inducer, TGF- ⁇ inhibitor, PDE4 inhibitor, GR agonist, and ERK inhibitor.
  • a method for producing cardiomyocytes comprising a step of culturing.
  • a composition for producing cardiomyocytes from somatic cells which is a composition for producing cardiomyocytes by directly inducing differentiation from somatic cells, comprising a MEK inhibitor.
  • the composition of the above-mentioned [17] further comprising an ERK inhibitor.
  • MEK inhibitor, cAMP inducer, and TGF- ⁇ inhibitor (2) MEK inhibitor, cAMP inducer, and PDE4 inhibitor, (3) MEK inhibitor, cAMP inducer, and GR agonist, (4) MEK inhibitor, cAMP inducer, PDE4 inhibitor, and GR agonist, (5) MEK inhibitor, cAMP inducer, TGF- ⁇ inhibitor, PDE4 inhibitor, and GR agonist, (6) MEK inhibitor, cAMP inducer, TGF- ⁇ inhibitor, PDE4 inhibitor, GR agonist, and ERK inhibitor.
  • the composition according to any one of [15] to [19] above, further comprising at least one selected from the group consisting of RAR agonists, RXR agonists, and PDK1 activators.
  • a composition for producing cardiomyocytes by directly inducing differentiation from somatic cells comprising a cAMP inducer, a TGF- ⁇ inhibitor, a PDE4 inhibitor, a GR agonist, and an ERK inhibitor
  • a composition for producing cardiomyocytes from somatic cells comprising a cAMP inducer, a TGF- ⁇ inhibitor, a PDE4 inhibitor, a GR agonist, and an ERK inhibitor
  • the cAMP inducer is forskolin
  • the TGF- ⁇ inhibitor is lepsox
  • the PDE4 inhibitor is rolipram
  • the GR agonist is dexamethasone
  • the ERK inhibitor is GDC-0994.
  • cardiomyocytes that spontaneously beat from somatic cells can be produced without introducing a gene.
  • the cardiomyocytes obtained by the present invention are useful in regenerative medicine and the like.
  • the left side shows the results on the seventh day of culture, and the right side shows the results on the tenth day after the start of culture.
  • the left side shows the results on the 7th day of culture, and the right side shows the results on the 10th day of culture.
  • the left side shows the results on the 7th day of culture
  • the right side shows the results on the 10th day of culture.
  • the left side shows the results on the 7th day of culture
  • the right side shows the results on the 13th day of culture. It is a culture photograph of a cell.
  • the left side shows the results on the 7th day of culture
  • the right side shows the results on the 13th day of culture.
  • the upper two show the results on day 13 of culture at different locations for Example 7, and the lower two show the results on day 17 of culture at different locations for Example A, respectively.
  • the left figure shows the expression level of the myocardial progenitor cell-specific gene Tbx1 by each combination inhibitor and the right figure shows the expression level of the cardiomyocyte-specific gene Tnnt2 by each combination inhibitor.
  • the vertical axis represents the relative value of the mRNA amount relative to the internal standard gene amount (Tbp). Represents the relative expression level of mRNA.
  • the left figure shows the expression level of a myocardial progenitor cell-specific gene by each combination inhibitor
  • the right figure shows the expression level of a myocardium-specific gene by each combination inhibitor.
  • the vertical axis represents the relative value of the mRNA amount relative to the internal standard gene amount (Tbp).
  • the left is an immunostaining photograph in which cells were stained with Alpha Actinin / DAPI.
  • the right is an immunostained photograph in which a bright field image is superimposed on the left photograph. It is a culture photograph of a cell.
  • the upper three photographs show the results on the 13th day of culture, and the lower three pictures show the results on the 19th day of culture.
  • the upper four photographs show the results on day 7 of culture, and the lower four pictures show the results on day 12 of culture.
  • a method for producing cardiomyocytes according to the present invention (hereinafter referred to as “the method of the present invention”) is a method for producing cardiomyocytes by directly inducing differentiation from somatic cells, and comprises MEK inhibition. A step of culturing somatic cells in the presence of the agent.
  • the production method of the present invention can be mentioned in which the step is a step of further culturing somatic cells in the presence of a cAMP inducer. More preferably, the method according to the present invention, wherein the step is a step of further culturing somatic cells in the presence of at least one selected from the group consisting of a TGF- ⁇ inhibitor, a PDE4 inhibitor, and a GR agonist. Can do. More preferably, the method according to the present invention can be mentioned, wherein the step is a step of further culturing somatic cells in the presence of an ERK inhibitor.
  • the step is a step of culturing somatic cells in the presence of any combination of the following (1) to (6).
  • the present invention also provides a method for producing cardiomyocytes by directly inducing differentiation from somatic cells, in the presence of a cAMP inducer, a TGF- ⁇ inhibitor, a PDE4 inhibitor, a GR agonist, and an ERK inhibitor.
  • a method for producing cardiomyocytes which includes a step of culturing somatic cells, can also be mentioned.
  • this production method is also referred to as the production method of the present invention.
  • somatic cells in the above step, can be cultured in the presence of at least one selected from the group consisting of an RAR agonist, an RXR agonist, and a PDK1 activator.
  • the somatic cells may be cultured in the presence of at least one of the above combinations, and if necessary, the somatic cells are cultured in the presence of other inhibitors, inducers, and the like. Cells can be produced.
  • Each of the inhibitors and inducers may be used alone or in combination of two or more.
  • the specific inhibitor described above may have two or more types of inhibitory action and the like, but in that case, it can be considered that a plurality of inhibitors or the like are present alone.
  • Somatic cells Living cells can be classified into somatic cells and germ cells. Any somatic cell can be used as a starting material for the production method of the present invention.
  • the somatic cell is not particularly limited, and may be either a primary cell collected from a living body or a cell line established.
  • somatic cells in various stages of differentiation for example, terminally differentiated somatic cells (eg, fibroblasts, umbilical vein endothelial cells (HUVEC), hepatocytes (Biary cells), biliary cells), Pancreatic ⁇ cells (Pancreatic ⁇ cells), pancreatic acinar cells (Acinar cells), pancreatic ductal gland cells (Ductal cells), small intestinal crypt cells (Intestinal crypt cells), etc.
  • somatic cells on the way to final differentiation eg, between Leaf stem cells, neural stem cells, endoderm progenitor cells, etc.
  • somatic cells that have been reprogrammed and have acquired pluripotency can be used.
  • somatic cells examples include arbitrary somatic cells such as hematopoietic cells (various lymphocytes, macrophages, dendritic cells, bone marrow cells, etc.), organ-derived cells (hepatocytes, spleen cells, Pancreatic cells, kidney cells, lung cells, etc.), muscle tissue cells (skeletal muscle cells, smooth muscle cells, myoblasts, cardiomyocytes, etc.), fibroblasts, neurons, osteoblasts, chondrocytes, endothelial cells , Stromal cells, fat cells (brown fat cells, white fat cells, etc.) and the like.
  • the production method of the present invention can also be applied to precursor cells and cancer cells of these cells.
  • fibroblasts can be used.
  • somatic cell supply source examples include, but are not limited to, humans, mammals other than humans, and animals other than mammals (birds, reptiles, amphibians, fish, etc.).
  • somatic cells humans and mammals other than humans are preferable, and humans are particularly preferable.
  • somatic cells collected from a donor whose histocompatibility antigen type matches or similar to that of the recipient can be used. Somatic cells collected from the recipient itself may be used for the production of cardiomyocytes.
  • MEK Inhibitor MEK (MAPK / ERK kinase) is a phosphorous that belongs to the MAPK signaling pathway activated by growth factors such as EGF (epidermal growth factor).
  • EGF epidermal growth factor
  • MEK1 and MEK2 which are oxidases and are encoded by two genes in mammals.
  • MEK is phosphorylated by upstream RAF, and MEK activated by this phosphorylates ERK to transmit signals further downstream.
  • the MAPK signaling pathway via MEK is inhibited.
  • MEK inhibitor refers to culture conditions capable of inhibiting MEK, preferably MEK1 or MEK2, and the means thereof is not particularly limited, and a substance that inhibits MEK activity, for example, MEK signal inhibition means such as anti-MEK antibodies and MEK inhibitors can be used.
  • MEK inhibition is also achieved by means of inhibiting proteins involved in MEK activation, for example, cell membrane receptors such as EGFR located upstream of MEK in the MAPK signal transduction pathway, small GTP-binding protein RAS, phosphorylase RAF, and the like. Can be used.
  • the MEK inhibitor for example, the following compounds can be used.
  • PD0325901 and Trametinib can be used.
  • the concentration of the MEK inhibitor may be determined as appropriate, and is not particularly limited. For example, it can be used in the range of 0.1 ⁇ mol / L to 10 ⁇ mol / L, preferably 0.5 ⁇ mol / L to 5 ⁇ mol / L.
  • cAMP inducer cAMP (cyclic adenosine monophosphate) is a substance involved in various intracellular signal transduction as a second messenger. cAMP is produced in cells by adenosine triphosphate (ATP) being cyclized by adenylate cyclase.
  • ATP adenosine triphosphate
  • “In the presence of a cAMP inducer” refers to a culture condition capable of inducing cAMP, and the means thereof is not particularly limited. For example, any means capable of increasing intracellular cAMP concentration. Can be used. Substances that can be induced by acting directly on adenylate cyclase, an enzyme involved in cAMP production, substances that can promote the expression of adenylate cyclase, substances that inhibit phosphodiesterase, an enzyme that degrades cAMP, etc. Can be used as a means of increasing intracellular cAMP concentration.
  • Membrane-permeable cAMP analogs such as dibutyryl cAMP (dibutyryl cAMP) and 8-bromo-cAMP, which are structural analogs of cAMP having the same action as cAMP in cells, can also be used.
  • dibutyryl cAMP dibutyryl cAMP
  • 8-bromo-cAMP which are structural analogs of cAMP having the same action as cAMP in cells
  • examples of cAMP inducers include, for example, forskolin (CAS No .: 66575-29-9) and forskolin derivatives (for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-2002). 348243) and the following compounds.
  • forskolin can be used.
  • Isoproterenol (CAS No .: 7683-59-2) NKH477 (CAS No.:138605-00-2) PACAP1-27 (CAS No .: 127317-03-7) PACAP1-38 (CAS No .: 137061-48-4)
  • the concentration of the cAMP inducer may be appropriately determined and is not particularly limited. For example, it can be used in the range of 0.2 ⁇ mol / L to 50 ⁇ mol / L, preferably 1 ⁇ mol / L to 30 ⁇ mol / L.
  • TGF- ⁇ inhibitors There are three types of TGF- ⁇ (transforming growth factor- ⁇ , transforming growth factor ⁇ ): TGF- ⁇ 1, TGF- ⁇ 2, and TGF- ⁇ 3. It is produced from cells. TGF- ⁇ is involved in various cell functions such as cell growth, transformation, differentiation, development, and control of apoptosis, such as inhibiting the growth of many cells including epithelial cells.
  • TGF- ⁇ inhibitor refers to a culture condition capable of inhibiting TGF- ⁇ , and the means thereof is not particularly limited, and any means capable of inhibiting TGF- ⁇ . Means can be used.
  • a substance that directly acts on TGF- ⁇ and inhibits its function for example, an anti-TGF- ⁇ antibody or other drug
  • a drug that suppresses the production of TGF- ⁇ itself, or the like can be used.
  • TGF- ⁇ can also be inhibited by inhibiting signal transduction involving TGF- ⁇ upstream thereof.
  • the TGF- ⁇ inhibitor for example, the following compounds can be used.
  • repsox can be used.
  • LY364947 (CAS No .: 396129-53-6) SB525334 (CAS No .: 356559-20-1) SD208 (CAS No .: 627536-09-8) Galunisertib (LY2157299) (CAS No .: 7000874-72-2) LY2109761 (CAS No .: 7000877-11-1) SB505124 (CAS No .: 694433-59-5) GW788388 (CAS No .: 452342-67-5) EW-7197 (CAS No.:1352608-82-2)
  • the concentration of the TGF- ⁇ inhibitor may be determined as appropriate and is not particularly limited. For example, it can be used in the range of 0.1 ⁇ mol / L to 30 ⁇ mol / L, preferably 0.5 ⁇ mol / L to 10 ⁇ mol / L. .
  • PDE4 Phosphoesterase-4
  • Phosphoesterase-4 is a member of the phosphodiesterase superfamily. Phosphodiesterase is an enzyme that hydrolyzes phosphodiester bonds. PDE4, in particular, hydrolyzes the cyclic phosphodiester bond of cAMP, the second messenger of the signal transduction pathway, and plays an important role in regulating its intracellular concentration. I'm in charge. PDE4 is present in immune cells, brain and nerve cells.
  • PDE4 inhibitor refers to a culture condition capable of inhibiting PDE4, and the means thereof is not particularly limited, and any means capable of inhibiting PDE4 may be used. it can.
  • a substance that acts directly on PDE4 to inhibit its function for example, an anti-PDE4 antibody or other drug
  • a drug that suppresses the production of PDE4 itself, or the like can be used.
  • PDE4 can also be inhibited by inhibiting the signal transduction which PDE4 involves in the upstream.
  • the PDE4 inhibitor for example, the following compounds can be used.
  • rolipram and optical isomers thereof for example, R ( ⁇ ) isomer, S (+) isomer
  • R ( ⁇ ) isomer, S (+) isomer can be used.
  • Cilomilast CAS No .: 153259-65-5)
  • GSK256066 CAS No .: 801312-28-7
  • Apremilast CC-10004 (CAS No .: 608141-41-9)
  • the concentration of the PDE4 inhibitor may be determined as appropriate and is not particularly limited. For example, it can be used in the range of 0.1 ⁇ mol / L to 20 ⁇ mol / L, preferably 0.5 ⁇ mol / L to 10 ⁇ mol / L.
  • GR Glucocorticoid Receptor, glucocorticoid receptor
  • GR Glucocorticoid Receptor, glucocorticoid receptor
  • GR is widely expressed throughout the human body, and many synthetic agonists such as dexamethasone have been developed because of its functional importance.
  • “In the presence of a GR agonist” means that the culture conditions are such that GR can be activated, and the means thereof is not particularly limited, and any means that can activate GR can be used. .
  • a substance that directly acts on GR to activate its function a drug that promotes the expression of GR itself, and the like can be used.
  • the function of GR can also be controlled by regulating transcription factors or transcription coupling factors that interact with GR, and their expression and post-translational modifications.
  • the following compounds can be used.
  • dexamethasone can be used.
  • Steroidal compounds such as dexamethasone, betamethasone, prednisolone, prednisone, methylprednisolone, triamcinolone, beclomethasone, budesonide, hydrocortisone, cortisone acetate, GSK9027, fluticasone, mometasone.
  • Non-steroidal compounds classified as selective glucocorticoid receptor modulators or selective glucocorticoid receptor agonists.
  • the concentration of the GR agonist may be determined as appropriate, and is not particularly limited. For example, it can be used in the range of 0.01 ⁇ mol / L to 10 ⁇ mol / L, preferably 0.05 ⁇ mol / L to 2 ⁇ mol / L.
  • RXR Agonist RAR Retinoic acid receptor
  • RXR Retinoic acid receptor
  • RAR Retinoic acid receptor
  • RXR retinoid X receptor
  • RXR forms heterodimers with various nuclear receptors, including RAR, and regulates the transcriptional activity of partner nuclear receptors through binding to specific nucleotide sequences and recruitment of transcription coupling factors. It is complexly adjusted.
  • RAR or RXR agonist means that the culture conditions are such that RAR or RXR can be operated, and the means thereof is not particularly limited, and any means capable of operating RAR or RXR. Means can be used.
  • a substance that directly acts on RAR or RXR to activate its function a drug that promotes the expression of RAR or RXR itself, and the like can be used.
  • the functions of RAR and RXR can also be controlled by regulating transcription factors or transcription coupling factors that interact with RAR or RXR, and their expression and post-translational modifications.
  • RAR agonist or RXR agonist for example, the following compounds can be used.
  • TTNPB, retinoic acid, CH55, AM580 can be used.
  • TTNPB arotinoid acid, CAS No .: 71441-28-6)
  • Retinoic acid (CAS No .: 302-79-4) Tretinoin (CAS No .: 302-79-4)
  • Adapalene (CAS No .: 1066885-40-9) Bexarotene (CAS No .: 153559-49-0) Tazarotene (CAS No .: 118292-40-3) Tamibarotene (CAS No .: 94497-51-5) CH55 (CAS No .: 110368-33-7) AM580 (CAS No .: 102121-60-8)
  • the concentration of the RAR agonist or RXR agonist may be appropriately determined and is not particularly limited. For example, it can be used in the range of 0.05 ⁇ mol / L to 10 ⁇ mol / L, preferably 0.5 ⁇ mol / L to 5 ⁇ mol / L. .
  • PDK1 phosphoinoside-dependent protein kinase-1, phosphoinositide-dependent protein kinase 1
  • PDK1 phosphoinoside-dependent protein kinase-1, phosphoinositide-dependent protein kinase 1
  • PS48 a PDK1 activator, binds directly to PDK1, phosphorylates AKT, and activates this signal pathway.
  • PDK1 activator in the presence of a PDK1 activator means that the culture conditions are such that PDK1 can be activated, and the means thereof is not particularly limited. For example, any one that can increase intracellular PDK1 concentration. Can be used.
  • PDK1 is produced by activation of phosphoinositide 3 kinase (PI3K) via various receptors including tyrosine kinase receptor, cytokine receptor, and G protein-coupled receptor. Since it is activated by phosphoric acid, substances that activate these receptors or other stimuli that induce the production of phosphatidylinositol triphosphate can also be a means of activating PDK1.
  • PI3K phosphoinositide 3 kinase
  • the PDK1 activator for example, the following compounds can be used.
  • PS48 can be used.
  • PS48 ((2Z) -5- (4-Chlorophenyl) -3-phenyl-2-pentenoic acid, CAS No .: 1180676-32-7) OSU-03012 (AR-12) (CAS No .: 742112-33-0) BX795 (CAS No .: 702675-74-9) BX912 (CAS No .: 702674-56-4) PHT-427 (CAS No .: 119951-57-1)
  • the concentration of the PDK1 activator may be determined as appropriate and is not particularly limited. For example, it can be used in the range of 0.5 ⁇ mol / L to 30 ⁇ mol / L, preferably 1 ⁇ mol / L to 10 ⁇ mol / L.
  • ERK Extracellular Signal-Regulated Kinase
  • EGF epidermal growth factor
  • ERK7 ERK7
  • ERK8 ERK8 based on the signal transduction pathway involved.
  • a signal flowing through the binding of a ligand to a tyrosine kinase receptor such as epidermal growth factor receptor (EGFR)
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • ERK inhibitor means a culture condition capable of inhibiting ERK, and the means thereof is not particularly limited, and a substance that inhibits the activity of ERK, such as an anti-ERK antibody or ERK.
  • ERK signal inhibition means such as inhibitors can be utilized.
  • means for inhibiting an enzyme involved in ERK activation such as ERK kinase or ERK kinase kinase, can also be used for ERK inhibition.
  • GDC-0994 Rasxertinib
  • ERK inhibitors Preferably, GDC-0994 (Ravoxertinib) can be used.
  • SCH772984 (CAS No .: 942183-80-4) MK-8353 (SCH90033) (CAS No .: 1184173-73-6) Magnolin (CAS No .: 31008-18-1) LY3214996 (CAS No .: 1951483-29-6) FR 180204 (CAS No .: 865362-74-9) AZD0364 (CAS No .: 2097416-76-5)
  • the concentration of the ERK inhibitor may be determined as appropriate, and is not particularly limited. For example, it can be used in the range of 0.1 ⁇ mol / L to 10 ⁇ mol / L, preferably 0.2 ⁇ mol / L to 5 ⁇ mol / L.
  • the somatic cell culture in the production method of the present invention is carried out by selecting the medium, temperature, and other conditions according to the type of somatic cell to be used, and various inhibitors described above (and possibly inducers). Or in the presence of an activator).
  • the medium can be selected from a known medium or a commercially available medium.
  • MEM minimum essential medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • DMEM / F12 or a medium in which these are modified are added to a common medium (serum, protein, amino acid, sugar, vitamins, Fatty acids, antibiotics, etc.) can be added and used.
  • culture conditions general cell culture conditions may be selected.
  • the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 are exemplified.
  • it is preferable to change the medium at an appropriate interval preferably once every 1 to 7 days, more preferably once every 3 to 4 days.
  • cardiomyocytes appear in 5 to 8 days to 3 weeks at 37 ° C. and 5% CO 2 . It is possible to convert somatic cells whose number of cells has been increased in advance into cardiomyocytes by selecting somatic cells that can be easily cultured. Therefore, it is easy to produce scaled-up cardiomyocytes.
  • Cell culture containers such as plates, dishes, cell culture flasks, and cell culture bags can be used for somatic cell culture.
  • a cell culture bag a gas permeable bag is suitable.
  • a large culture tank may be used.
  • the culture can be carried out in either an open system or a closed system, but when the obtained cardiomyocytes are to be administered to humans, the culture is preferably carried out in a closed system.
  • cardiomyocytes can be produced from somatic cells by one-stage culture by culturing somatic cells in a medium containing the various inhibitors described above.
  • cardiomyocytes are produced from somatic cells.
  • 5-Azacytidine, angiotensin II, BMP-2 (Bone Morphogenic Protein 2), dimethyl sulfoxide (DMSO) and the like are known as effective substances for inducing differentiation into cardiomyocytes.
  • a substance effective in inducing differentiation into cardiomyocytes for example, a commercially available product as a differentiation inducer can be used.
  • somatic cells can be cultured in the presence of the aforementioned substances.
  • Cardiomyocytes A cell population containing cardiomyocytes can be obtained by the method of the present invention described above. Cardiomyocytes produced by the production method of the present invention are also within the scope of the present invention.
  • the cardiomyocytes produced by the production method of the present invention may be progenitor cells that are destined to differentiate into cardiomyocytes, in addition to the terminally differentiated cells.
  • the cardiomyocytes produced by the production method of the present invention are so-called low molecular compound-induced cardiomyocytes (ciCMs) that are directly induced from somatic cells by low-molecular compounds, and are cardiomyocytes that are induced to differentiate from ES cells or iPS cells. It is distinguished from Further, it is also distinguished from the low molecular compound-induced cardiomyocytes described in Patent Document 1 or the like depending on the difference in the low molecular compound used.
  • Cardiomyocytes produced by the method of the present invention can be detected, confirmed and separated using, for example, morphological changes of cells, characteristic properties of cardiomyocytes and specific markers.
  • a cardiomyocyte has a characteristic not found in other cells that beats autonomously, and can be distinguished from other cells by observation under a microscope.
  • Specific examples of cardiomyocyte markers include, but are not limited to, cardiac troponin C (cTnT), ⁇ myosin heavy chain, ⁇ actin and the like.
  • quarantine methods detection by antibodies
  • protein molecules may be detected by quantifying their mRNA amounts.
  • An antibody that recognizes a specific marker of cardiomyocytes is also useful for isolating and purifying cardiomyocytes obtained by the method of the present invention.
  • the cardiomyocytes produced by the production method of the present invention can be used for tissue repair, for example.
  • a pharmaceutical composition for tissue repair and the like can be produced.
  • methods for producing myocardial cells and methods for transplanting myocardial cells have been developed.
  • a myocardial sheet formed by laminating myocardial cells and endothelial cells and the like exhibits excellent therapeutic effects and engraftment, and is expected to be used for the treatment of severe heart failure.
  • the cardiomyocytes produced by the production method of the present invention are used as a pharmaceutical composition
  • the cardiomyocytes are in a form suitable for administration to an individual by mixing the cardiomyocytes with a pharmaceutically acceptable carrier by a conventional method.
  • a preparation may be used.
  • the carrier include physiological saline, distilled water for injection made isotonic by adding glucose and other adjuvants (for example, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • the cardiomyocytes produced by the production method of the present invention can also be made into a composition combined with other cells and components effective for exerting the function of cardiomyocytes and improving engraftment.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • the cardiomyocytes produced by the production method of the present invention can also be made into a composition combined with other cells and components effective for exerting the function of cardiomyocytes and improving engraftment.
  • cardiomyocytes produced by the method of the present invention can also be used for screening drug candidate compounds that act on cardiomyocytes and for evaluating the safety of drug candidate compounds. Cardiomyocytes are an important tool for assessing the cardiotoxicity of drug candidate compounds. According to the production method of the present invention, since many cardiomyocytes can be obtained by a single operation, it becomes possible to obtain reproducible research results without being affected by the difference in cell lots.
  • composition of the present invention is a composition for producing cardiomyocytes by directly inducing differentiation from somatic cells, and comprises a MEK inhibitor. It is characterized by that.
  • the composition of the present invention further containing a cAMP inducer can be mentioned.
  • the composition of the present invention may further include at least one selected from the group consisting of a TGF- ⁇ inhibitor, a PDE4 inhibitor, and a GR agonist.
  • the composition of the present invention further containing an ERK inhibitor can be mentioned.
  • Particularly preferred is the composition of the present invention comprising any combination of the following (1) to (6).
  • MEK inhibitor, cAMP inducer, and TGF- ⁇ inhibitor (2) MEK inhibitor, cAMP inducer, and PDE4 inhibitor, (3) MEK inhibitor, cAMP inducer, and GR agonist, (4) MEK inhibitor, cAMP inducer, PDE4 inhibitor, and GR agonist, (5) MEK inhibitor, cAMP inducer, TGF- ⁇ inhibitor, PDE4 inhibitor, and GR agonist, (6) MEK inhibitor, cAMP inducer, TGF- ⁇ inhibitor, PDE4 inhibitor, GR agonist, and ERK inhibitor.
  • the present invention also provides a composition for producing cardiomyocytes by directly inducing differentiation from somatic cells, comprising a cAMP inducer, a TGF- ⁇ inhibitor, a PDE4 inhibitor, a GR agonist, and an ERK inhibitor.
  • a composition for producing cardiomyocytes by directly inducing differentiation from somatic cells comprising a cAMP inducer, a TGF- ⁇ inhibitor, a PDE4 inhibitor, a GR agonist, and an ERK inhibitor.
  • the composition for manufacturing a cardiac muscle cell from a somatic cell characterized by including can also be mentioned.
  • this composition is also referred to as the composition of the present invention.
  • the composition of the present invention can further contain at least one selected from the group consisting of an RAR agonist, an RXR agonist, and a PDK1 activator.
  • the composition of the present invention only needs to contain at least one of the above combinations, and can optionally further contain other inhibitors, inducers, and the like as necessary.
  • Each of the inhibitors and inducers may be used alone or in combination of two or more.
  • Specific examples of the inhibitor may have two or more types of inhibitory action. In that case, it can be considered that one inhibitor contains a plurality of inhibitors.
  • Specific examples and preferred examples of the above-mentioned inhibitors and inducers are as defined above.
  • composition of the present invention can be used as a composition for producing cardiomyocytes from somatic cells.
  • composition of the present invention can also be used as a medium for producing cardiomyocytes from somatic cells.
  • a medium used for the production of cardiomyocytes from somatic cells a medium containing a MEK inhibitor, a cAMP inducer and the like as active ingredients in a basal medium produced by mixing components necessary for cell culture. It can be illustrated.
  • the active ingredient may be contained at a concentration effective for the production of cardiomyocytes, and the concentration can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • the basal medium can be selected from a known medium or a commercially available medium. For example, MEM (minimum essential medium), DMEM (Dulbecco modified Eagle medium), DMEM / F12, or a medium obtained by modifying these can be used as a basal medium.
  • the medium may be further added with known medium components described above in the present specification, such as serum, protein (albumin, transferrin, growth factor, etc.), amino acids, saccharides, vitamins, fatty acids, antibiotics, etc. Good.
  • a substance effective for inducing differentiation into cardiomyocytes described above in the present specification may be added to the medium.
  • cardiomyocytes can also be produced from somatic cells in vivo by administering a MEK inhibitor, a cAMP inducer and the like to the living body. That is, according to the present invention, there is provided a method for producing cardiomyocytes from somatic cells in a living body, comprising administering a MEK inhibitor, a cAMP inducer and the like to the living body.
  • a preferable combination of an inhibitor or the like to be administered to a living body is as described in this specification. Examples of the living body include humans, mammals other than humans, and animals other than mammals (birds, reptiles, amphibians, fish, etc.), and humans are particularly preferable.
  • cardiomyocytes can be produced from somatic cells at the specific site.
  • the human fibroblast dish medium described above was prepared using 20% fetal bovine serum (FBS), 2% B27-supplement (Gibco), 1% N2 (Gibco), non-essential amino acids (NEAA: Non-essential). amino acids; manufactured by Gibco), ⁇ -mercaptoethanol (manufactured by Nacalai Tesque; final concentration 0.1 mmol / L), 2-phospho ascorbic acid (manufactured by Sigma-Aldrich; final concentration 50 ⁇ g / mL), 100 U / mL penicillin, The medium was changed to DMEM (High Glucose) with L-Glutamine Phenol Red, Sodium Pyruvate (Gibco) supplemented with 100 ⁇ g / mL streptomycin and the following low molecular weight compound. Thereafter, while the medium was exchanged to media of the same composition every 3 days, 37 ° C., and cultured under 5% CO 2.
  • FBS fetal bovine serum
  • FIG. 6 Photographs of the cells (FIGS. 1 to 6) are shown after 7 and 10 days of culture (FIGS. 1 to 3), 7 and 13 days (FIGS. 4 and 5), or 13 and 17 days after addition of the low molecular weight compound. (FIG. 6) is taken respectively.
  • the low molecular weight compound was added, total RNA was extracted from cells after 17 days of culture, and myocardial progenitor cell specific gene Tbx1 and myocardial cell specific were extracted by real time PCR
  • the expression level of the gene Tnnt2 was quantified.
  • FIG. Tbp in the figure indicates a gene serving as an internal standard, and the amount of Tbx1 and Tnnt2 mRNA is evaluated based on the relative value of the amount of mRNA.
  • the combination compounds of each symbol in the figure are as follows.
  • Example 12 Control (without the low molecular weight compound) M: Example A F: Comparative example 2 MF: Example 7 MF + Rep: Example 8 MF + Roli: Example 9 MF + Dex: Example 10 MF + Rep + Roli + Dex: Example 12
  • the MEK inhibitor is an important compound for the induction of cardiomyocytes, and is cultured in the presence of at least a MEK inhibitor (eg, PD0325901) or a cAMP inducer (eg, forskolin).
  • a MEK inhibitor eg, PD0325901
  • a cAMP inducer eg, forskolin
  • Test example 1 Gene expression related to cardiomyocytes Four types (4C) of PD0325901 (MEK inhibitor), forskolin (cAMP inducer), repsox (TGF- ⁇ ), and rolipram (PDE4 inhibitor), or dexamethasone About the combination of five kinds of compounds to which (GR agonist) was added, cell culture was performed in the same manner as in the above example, total RNA was extracted from cells after 18 days of culture, and myocardial progenitor cell specific gene was extracted by real-time PCR The expression levels of Hand2 and Tbx1, and cardiomyocyte-specific genes Tnnt2, Nppa, and Nkx2.5 were quantified. The result is shown in FIG.
  • Tbp in the figure indicates a gene serving as an internal standard, and the amount of mRNA of each gene is evaluated based on the relative value of the amount of mRNA.
  • “No compound” indicates a result when no compound is added
  • “4C + Dex” indicates a result when all the five kinds of compounds are added.
  • Alpha Actinin staining is observed in a certain number of cardiomyocyte-like cells, and staining is observed in the cytoplasm rather than in the cell nucleus relatively stained with DAPI. It was done. Since the expression of Alpha Actinin, a marker of cardiomyocytes, was observed in some cells, the results of immunostaining also showed that the compound group was added and cultured directly from human skin fibroblasts to cardiomyocyte-like cells. It was shown that guidance was progressing.
  • Test example 2 About the combination of the following low molecular compound, it added similarly to the said Example and performed cell culture.
  • FIG. 10 shows the state of the cells on the 13th and 19th days after the addition of the compound group and the culture.
  • “5C” represents a combination of five types of compounds other than Trametinib among the following six types of low molecular compounds, and the two photographs on the left show the results of addition culture of the compound group.
  • “5C-M” represents a compound group obtained by removing PD0325901 (MEK inhibitor) from the 5C compound group, and the middle two photographs show the results of addition culture of the compound group.
  • 5C-M + Trametinib represents a compound group obtained by removing PD0325901 (MEK inhibitor) from the 5C compound group and adding another MEK inhibitor Trametinib.
  • the two photographs on the right show the results of addition culture of the compound group. Show.
  • the MEK inhibitor is important for direct induction from human skin fibroblasts into cardiomyocytes.
  • FIG. 11 shows the state of the cells on the 7th and 12th days after the addition of the low molecular weight compound and the culture.
  • “5C” represents a combination of five types of compounds other than GDC-0994 among the following six types of low molecular compounds, and the leftmost two photographs show the results of addition culture of the compound group.
  • “5C-M” represents a compound group obtained by removing PD0325901 (MEK inhibitor) from the 5C compound group, and the second two photographs from the left show the results of addition culture of the compound group.
  • “5C-M + GDC-0994” represents a compound group obtained by removing PD0325901 (MEK inhibitor) from the 5C compound group and adding GDC-0994 (ERK inhibitor) instead. The second two pictures from the right are The addition culture result of the compound group is shown. “5C + GDC-0994” represents a compound group obtained by adding GDC-0994 (ERK inhibitor) to the 5C compound group, and the rightmost two photographs show the results of addition culture of the compound group.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本発明は、人為的な遺伝子導入を行うことなく、体細胞から心筋細胞を製造する方法、当該製造方法から得られる心筋細胞、又は当該製造方法のために使用することができる化学物質の組み合わせを含む組成物を提供することを主な課題とする。　本発明として、例えば、体細胞から直接分化誘導することにより心筋細胞を製造する方法であって、ＭＥＫ阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤の存在下で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする心筋細胞の製造方法や、当該製造方法により得られる心筋細胞、そして体細胞から直接分化誘導することにより心筋細胞を製造するための組成物であって、ＭＥＫ阻害剤、及びｃＡＭＰ誘導剤を含むことを特徴とする、体細胞から心筋細胞を製造するための組成物を挙げることができる。　本発明により得られた心筋細胞は、再生医療などにおいて有用である。

Description

心筋細胞の製造方法
（関連出願の相互参照）
　この出願は、２０１８年１月３０日に出願された日本国出願番号第２０１８－１３３０１号を基礎とする優先権を主張し、その開示内容は全て本明細書の一部に組み込まれる。
　本発明は、再生医療、ないし体細胞からのダイレクトリプログラミング（Ｄｉｒｅｃｔ　Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）の技術分野に属する。本発明は、その技術分野において、低分子化合物により体細胞から心筋細胞を直接製造する方法、及びかかる製造方法によって製造される低分子化合物誘導性心筋細胞（ｃｉＣＭｓ：ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ　ｉｎｄｕｃｅｄ－Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ）に関するものである。本発明はさらに、当該心筋細胞、及び当該心筋細胞を製造する方法のために使用することができる組成物に関するものである。
　近年の細胞関連研究の発展、特に多能性細胞に関する研究の発展により、治療用細胞を個体への移植に利用可能な品質及び量において入手することが可能になりつつある。幾つかの疾患については、治療に有効な細胞を患者に移植する試みが開始されている。
　間葉系の細胞は、筋肉、骨、軟骨、骨髄、脂肪及び結合組織等の生体の各種器官を形成しており、再生医療の材料として有望である。間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ＭＳＣ）は、骨髄、脂肪組織、血液、胎盤及び臍帯等の組織に存在する未分化細胞である。間葉系に属す細胞への分化能を有しているため、間葉系幹細胞は、それらの細胞を製造する際の出発材料として注目されている。また、間葉系幹細胞自体を骨、軟骨、心筋等の再構築に利用する再生医療も検討されている。
　一方、線維芽細胞のような体細胞を直接他の細胞に転換する方法も報告されている。例えば、線維芽細胞を化学物質と共に培養することにより神経細胞を得ることが知られている（非特許文献１）。
　心筋細胞についても、マウス胎児線維芽細胞からＧＳＫ３阻害剤（ＣＨＩＲ９９０２１）などを含む一定の化学物質と共に培養することにより直接誘導されることが知られている（非特許文献２）。同様にして、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）又は胎児肺線維芽細胞（ＨＬＦ）から直接誘導されることが知られている（非特許文献３）。
　また、特許文献１には、ＷＮＴアゴニスト、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ１）、Ｒａｓ　ＧＴＰａｓｅ活性タンパク質阻害剤（Ｒａｓ－ＧＡＰ）、Ｏｃｔ－４活性化剤、Ｒｈｏ関連コイルドコイル形成タンパク質セリン／スレオニンキナーゼ阻害剤、鉄キレーター、ＫＤＭ５Ｂ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、及びＰＤＧＦチロシンキナーゼ阻害剤の中から少なくとも５つを含む組成物により、ヒト線維芽細胞から心筋細胞を直接誘導する発明が記載されている。特許文献２には、ＡＬＫ６阻害剤及びＡＭＰＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも一つの阻害剤の存在下で、かつｃＡＭＰ活性化剤、ＡＬＫ５阻害剤（ＴＧＦ－β阻害剤）及びＥＲＫ阻害剤の存在下で体細胞を培養することにより、ヒト線維芽細胞から心筋細胞を直接誘導する発明が記載されている。
米国特許出願公開第２０１６／０１８６１４１号公報 国際公開第２０１８／０６２２６９号
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，２０１５年，５６巻，３号，１６６－１７０頁 Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１５年，２５巻，１０１３－１０２４頁 Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１６年，３５２巻，１２１６－１２２０頁
　非特許文献１に記載されている方法のように、遺伝子導入を行うことなく体細胞から所望の細胞への転換を直接行う方法は、治療用細胞を取得する手段として有効な選択肢となる場合がある。心筋細胞についても、上記の通り、実際に、一定の化学物質と共に培養することにより直接誘導されているが、非特許文献２に記載の発明では、マウス線維芽細胞からの直接誘導であって、ヒト線維芽細胞からの直接誘導ではない。また、非特許文献３に記載の発明では、ヒト線維芽細胞から心筋細胞が直接誘導されているが、これにはＥＳ細胞から分化させた心筋細胞の上清が必須である。特許文献１や２に記載の発明については、ヒト線維芽細胞から心筋細胞が直接誘導されている。
　本発明は、人為的な遺伝子導入を行うことなく、また特許文献１や２に記載の発明とは異なる低分子化合物の組み合わせにより体細胞から心筋細胞を直接誘導する方法、即ち、一定の低分子化合物の組成物により体細胞から心筋細胞を直接製造することができる新たな製造方法を提供することを主な課題とする。
　本発明者らは、鋭意検討した結果、一定の低分子阻害剤等の存在下で体細胞を培養することによって、体細胞を心筋細胞に直接転換できることを見出し、本発明を完成するに到った。
　本発明として、例えば、下記のものを挙げることができる。
［１］体細胞から直接分化誘導することにより心筋細胞を製造する方法であって、ＭＥＫ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、心筋細胞の製造方法。
［２］前記工程が、さらにｃＡＭＰ誘導剤の存在下で体細胞を培養する工程である、上記［１］に記載の心筋細胞の製造方法。
［３］前記工程が、さらにＴＧＦ－β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＧＲアゴニストからなる群から選択される少なくとも１種の存在下で体細胞を培養する工程である、上記［１］又は［２］に記載の心筋細胞の製造方法。
［４］前記工程が、さらにＥＲＫ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程である、上記［３］に記載の心筋細胞の製造方法。
［５］前記工程が、次の（１）～（６）のいずれかの組み合わせ存在下で体細胞を培養する工程である、上記［１］～［３］のいずれか一項に記載の心筋細胞の製造方法。
（１）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＴＧＦ－β阻害剤、
（２）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＰＤＥ４阻害剤、
（３）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＧＲアゴニスト、
（４）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＧＲアゴニスト、
（５）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＧＲアゴニスト、
（６）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ＧＲアゴニスト、及びＥＲＫ阻害剤。
［６］前記工程が、さらにＲＡＲアゴニスト、ＲＸＲアゴニスト、及びＰＤＫ１活性化剤からなる群から選択される少なくとも１種の存在下で体細胞を培養する工程である、上記［１］～［５］のいずれか一項に記載の心筋細胞の製造方法。
［７］ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１である、上記［１］～［６］のいずれか一項に記載の心筋細胞の製造方法。
［８］ｃＡＭＰ誘導剤がフォルスコリンである、上記［２］～［７］のいずれか一項に記載の心筋細胞の製造方法。
［９］ＴＧＦ－β阻害剤がレプソックス、ＰＤＥ４阻害剤がロリプラム、又はＧＲアゴニストがデキサメタゾンである、上記［３］～［８］のいずれか一項に記載の心筋細胞の製造方法。
［１０］ＥＲＫ阻害剤がＧＤＣ－０９９４である、上記［４］～［９］のいずれか一項に記載の心筋細胞の製造方法。
［１１］体細胞から直接分化誘導することにより心筋細胞を製造する方法であって、ｃＡＭＰ誘導剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ＧＲアゴニスト、及びＥＲＫ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、心筋細胞の製造方法。
［１２］ｃＡＭＰ誘導剤がフォルスコリン、ＴＧＦ－β阻害剤がレプソックス、ＰＤＥ４阻害剤がロリプラム、ＧＲアゴニストがデキサメタゾン、又はＥＲＫ阻害剤がＧＤＣ－０９９４である、上記［１１］に記載の心筋細胞の製造方法。
［１３］前記体細胞が線維芽細胞である、上記［１］～［１２］のいずれか一項に記載の心筋細胞の製造方法。
［１４］上記［１］～［１３］のいずれか一項に記載の心筋細胞の製造方法から製造される、心筋細胞。
［１５］体細胞から直接分化誘導することにより心筋細胞を製造するための組成物であって、ＭＥＫ阻害剤を含むことを特徴とする、体細胞から心筋細胞を製造するための組成物。
［１６］さらにｃＡＭＰ誘導剤を含む、上記［１５］に記載の組成物。
［１７］さらにＴＧＦ－β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＧＲアゴニストからなる群から選択される少なくとも１種を含む、上記［１５］又は［１６］に記載の組成物。
［１８］さらにＥＲＫ阻害剤を含む、上記［１７］に記載の組成物。
［１９］次の（１）～（６）のいずれかの組み合わせを含む、上記［１５］～［１８］のいずれか一項に記載の組成物。
（１）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＴＧＦ－β阻害剤、
（２）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＰＤＥ４阻害剤、
（３）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＧＲアゴニスト、
（４）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＧＲアゴニスト、
（５）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＧＲアゴニスト、
（６）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ＧＲアゴニスト、及びＥＲＫ阻害剤。
［２０］さらにＲＡＲアゴニスト、ＲＸＲアゴニスト、及びＰＤＫ１活性化剤からなる群から選択される少なくとも１種を含む、上記［１５］～［１９］のいずれか一項に記載の組成物。
［２１］ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１である、上記［１５］～［２０］のいずれか一項に記載の組成物。
［２２］ｃＡＭＰ誘導剤がフォルスコリンである、上記［１６］～［２１］のいずれか一項に記載の組成物。
［２３］ＴＧＦ－β阻害剤がレプソックス、ＰＤＥ４阻害剤がロリプラム、又はＧＲアゴニストがデキサメタゾンである、上記［１７］～［２２］のいずれか一項に記載の組成物。
［２４］ＥＲＫ阻害剤がＧＤＣ－０９９４である、上記［１８］～［２３］のいずれか一項に記載の組成物。
［２５］体細胞から直接分化誘導することにより心筋細胞を製造するための組成物であって、ｃＡＭＰ誘導剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ＧＲアゴニスト、及びＥＲＫ阻害剤を含むことを特徴とする、体細胞から心筋細胞を製造するための組成物。
［２６］ｃＡＭＰ誘導剤がフォルスコリン、ＴＧＦ－β阻害剤がレプソックス、ＰＤＥ４阻害剤がロリプラム、ＧＲアゴニストがデキサメタゾン、又はＥＲＫ阻害剤がＧＤＣ－０９９４である、上記［２５］に記載の組成物。
［２７］前記体細胞が線維芽細胞である、上記［１５］～［２６］のいずれか一項に記載の組成物。
　本発明によれば、遺伝子導入を行うことなく、体細胞から自発的に拍動する心筋細胞を製造することができる。本発明により得られた心筋細胞は、再生医療などにおいて有用である。
細胞の培養写真である。各写真において、左側は培養７日目の結果を、右側は培養開始後１０日目の結果を、それぞれ示す。 細胞の培養写真である。各写真において、左側は培養７日目の結果を、右側は培養１０日目の結果を、それぞれ示す。 細胞の培養写真である。各写真において、左側は培養７日目の結果を、右側は培養１０日目の結果を、それぞれ示す。 細胞の培養写真である。各写真において、左側は培養７日目の結果を、右側は培養１３日目の結果を、それぞれ示す。 細胞の培養写真である。各写真において、左側は培養７日目の結果を、右側は培養１３日目の結果を、それぞれ示す。 細胞の培養写真である。上２つは実施例７についての別々の箇所における培養１３日目の結果を、下２つは実施例Ａについての別々の箇所における培養１７日目の結果を、それぞれ示す。 ｍＲＮＡの相対的発現量を表す。左図は、各組み合わせ阻害剤等による心筋前駆細胞特異的遺伝子Ｔｂｘ１の発現量を、右図は、各組み合わせ阻害剤等による心筋細胞特異的遺伝子Ｔｎｎｔ２の発現量を、それぞれ表す。各図において、縦軸は内部標準遺伝子量（Ｔｂｐ）に対する当該ｍＲＮＡ量の相対値を示す。 ｍＲＮＡの相対的発現量を表す。左図は、各組み合わせ阻害剤等による心筋前駆細胞特異的遺伝子の発現量を、右図は、各組み合わせ阻害剤等による心筋特異的遺伝子の発現量を、それぞれ表す。各図において、縦軸は内部標準遺伝子量（Ｔｂｐ）に対する当該ｍＲＮＡ量の相対値を示す。 左は、Ａｌｐｈａ　Ａｃｔｉｎｉｎ／ＤＡＰＩで細胞を染色した免疫染色写真である。右は、左写真に明視野の画像を重ね合わせた免疫染色写真である。 細胞の培養写真である。上段３つの写真は培養１３日目の結果を、下段３つの写真は培養１９日目の結果を、それぞれ示す。 細胞の培養写真である。上段４つの写真は培養７日目の結果を、下段４つの写真は培養１２日目の結果を、それぞれ示す。
　以下、本発明について詳細に説明する。
１　心筋細胞の製造方法
　本発明に係る、心筋細胞の製造方法（以下、「本発明製法」という。）は、体細胞から直接分化誘導することにより心筋細胞を製造する方法であって、ＭＥＫ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする。
　好ましくは、上記工程が、さらにｃＡＭＰ誘導剤の存在下で体細胞を培養する工程である本発明製法を挙げることができる。より好ましくは、上記工程が、さらにＴＧＦ－β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＧＲアゴニストからなる群から選択される少なくとも１種の存在下で体細胞を培養する工程である本発明製法を挙げることができる。また、更に好ましくは、上記工程が、さらにＥＲＫ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程である本発明製法を挙げることができる。特に好ましくは、上記工程が、次の（１）～（６）のいずれかの組み合わせ存在下で体細胞を培養する工程である本発明製法である。
（１）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＴＧＦ－β阻害剤、
（２）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＰＤＥ４阻害剤、
（３）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＧＲアゴニスト、
（４）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＧＲアゴニスト、
（５）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＧＲアゴニスト、
（６）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ＧＲアゴニスト、及びＥＲＫ阻害剤。
　また、本発明として、体細胞から直接分化誘導することにより心筋細胞を製造する方法であって、ｃＡＭＰ誘導剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ＧＲアゴニスト、及びＥＲＫ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、心筋細胞の製造方法も挙げることができる。以下、かかる製造方法も含めて本発明製法という。
　本発明製法は、上記工程において、さらにＲＡＲアゴニスト、ＲＸＲアゴニスト、及びＰＤＫ１活性化剤からなる群から選択される少なくとも１種の存在下で体細胞を培養することができる。
　本発明製法においては、少なくとも上記いずれかの組み合わせの存在下で体細胞を培養すればよく、必要に応じて、任意にさらに他の阻害剤や誘導剤等を存在させて体細胞を培養し心筋細胞を製造することができる。
　上記阻害剤や誘導剤等は、それぞれにおいて、１種を用いても２種以上を併用してもよい。
　具体的な上記阻害剤等においては、２種類以上の阻害作用等を有するものもあり得るが、その場合、一つで複数の阻害剤等が存在しているとみなすことができる。
１．１　体細胞について
　生物の細胞は、体細胞と生殖細胞とに分類できる。本発明製法には、その出発材料として任意の体細胞を使用することができる。体細胞には特に限定はなく、生体から採取された初代細胞、又は株化された細胞の何れでもよい。本発明製法では、分化の種々の段階にある体細胞、例えば、最終分化した体細胞（例、線維芽細胞、臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、肝細胞（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）、胆管細胞（Ｂｉｌｉａｒｙ　ｃｅｌｌｓ）、膵α細胞（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　α　ｃｅｌｌｓ）、膵腺房細胞（Acinar cells）、膵管腺細胞（Ductal cells）、小腸腺窩細胞（Intestinal crypt cells）など）、最終分化への途上にある体細胞（例、間葉系幹細胞、神経幹細胞、内胚葉前駆細胞など）、又は初期化され多能性を獲得した体細胞を使用することができる。本発明製法に使用できる体細胞としては、任意の体細胞、例えば、造血系の細胞（各種のリンパ球、マクロファージ、樹状細胞、骨髄細胞等）、臓器由来の細胞（肝細胞、脾細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞等）、筋組織系の細胞（骨格筋細胞、平滑筋細胞、筋芽細胞、心筋細胞等）、線維芽細胞、神経細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、内皮細胞、間質細胞、脂肪細胞（褐色脂肪細胞、白色脂肪細胞等）等が挙げられる。また、これらの細胞の前駆細胞、癌細胞にも本発明製法を適用できる。好ましくは、線維芽細胞を使用することができる。
　上記の体細胞の供給源としては、ヒト、ヒト以外の哺乳動物、及び哺乳動物以外の動物（鳥類、爬虫類、両生類、魚類等）が例示されるが、これらに限定されるものではない。体細胞の供給源としては、ヒト、及びヒト以外の哺乳動物が好ましく、ヒトが特に好ましい。ヒトへの投与を目的として本発明製法により心筋細胞を製造する場合、好ましくは、レシピエントと組織適合性抗原のタイプが一致又は類似したドナーより採取された体細胞を使用することができる。レシピエント自身より採取された体細胞を心筋細胞の製造に供してもよい。
１．２　本発明に係る阻害剤等について
１．２．１　ＭＥＫ阻害剤
　ＭＥＫ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ）は、ＥＧＦ（上皮増殖因子）などの増殖因子によって活性化されるＭＡＰＫシグナル伝達経路に属するリン酸化酵素であり、哺乳類では２つの遺伝子によってコードされるＭＥＫ１とＭＥＫ２が存在する。ＭＥＫは、上流のＲＡＦによってリン酸化され、これによって活性化されたＭＥＫはＥＲＫをリン酸化することでさらに下流へシグナルを伝達させる。ＭＥＫ阻害剤によってＥＲＫのリン酸化が阻害されることで、ＭＥＫを介したＭＡＰＫシグナル伝達経路が阻害される。
　「ＭＥＫ阻害剤の存在下」とは、ＭＥＫ、好ましくはＭＥＫ１ないしＭＥＫ２を阻害することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ＭＥＫの活性を阻害する物質、例えば、抗ＭＥＫ抗体やＭＥＫ阻害剤のようなＭＥＫシグナル阻害手段を利用することができる。また、ＭＥＫの活性化に関わるタンパク質、例えば、ＭＡＰＫシグナル伝達経路のＭＥＫより上流に位置するＥＧＦＲ等の細胞膜受容体、低分子ＧＴＰ結合タンパク質ＲＡＳ、リン酸化酵素ＲＡＦ等を阻害する手段もＭＥＫ阻害に利用することができる。
　本発明では特に限定されないが、ＭＥＫ阻害剤としては、例えば、以下の化合物を使用することができる。好ましくは、ＰＤ０３２５９０１、Ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂを使用することができる。
ＰＤ０３２５９０１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３９１２１０－１０－９）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
Ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：８７１７００－１７－３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
Ｕ０１２６－ＥｔＯＨ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１１７３０９７－７６－１）
ＴＡＫ－７３３（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１０３５５５５－６３－５）
ＢＩ－８４７３２５（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１２０７２９３－３６－４）
Ｈｏｎｏｋｉｏｌ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３５３５４－７４－６）
Ｍｙｒｉｃｅｔｉｎ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：５２９－４４－２）
ＡＳ７０３０２６（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１２３６６９９－９２－５）
ＡＺＤ８３３０（ＣＡＳ　Ｎｏ．：８６９３５７－６８－６）
ＣＩ－１０４０（ＣＡＳ　Ｎｏ．：２１２６３１－７９－３）
Ｃｏｂｉｍｅｔｉｒｌｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：９３４６６０－９３－２）
ＧＤＣ－０６２３（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１１６８０９１－６８－６）
ＭＥＫ１６２（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６０６１４３－８９－９）
ＰＤ３１８０８８（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３９１２１０－００－７）
ＰＤ９８０５９（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１６７８６９－２１－８）
Ｒｅｆａｍｅｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：９２３０３２－３７－５）
Ｓｅｌｕｍｅｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６０６１４３－５２－６）
ＳＬ３２７（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３０５３５０－８７－２）
　ＭＥＫ阻害剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．１μｍｏｌ／Ｌ～１０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．５μｍｏｌ／Ｌ～５μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。
１．２．２　ｃＡＭＰ誘導剤
　ｃＡＭＰ（環状アデノシン１リン酸）は、セカンドメッセンジャーとして種々の細胞内シグナル伝達に関わっている物質である。ｃＡＭＰは、細胞内ではアデニル酸シクラーゼ（ａｄｅｎｙｌａｔｅ　ｃｙｃｌａｓｅ）によりアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）が環状化されることで生成する。
　「ｃＡＭＰ誘導剤の存在下」とは、ｃＡＭＰを誘導することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、例えば、細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させることができる任意の手段を利用することができる。ｃＡＭＰの生成に関わる酵素であるアデニル酸シクラーゼに直接作用して誘導することができる物質、アデニル酸シクラーゼの発現を促進しうる物質の他、ｃＡＭＰを分解する酵素であるホスホジエステラーゼを阻害する物質等を、細胞内ｃＡＭＰ濃度を増加させる手段として使用することができる。細胞内でｃＡＭＰと同じ作用を持つｃＡＭＰの構造類似体であるジブチリルｃＡＭＰ（ｄｉｂｕｔｙｒｙｌ　ｃＡＭＰ）や８-ｂｒｏｍｏ-ｃＡＭＰ等の膜透過性ｃＡＭＰアナログを使用することもできる。
　本発明では特に限定されないが、ｃＡＭＰ誘導剤（アデニル酸シクラーゼ活性化剤）としては、例えば、フォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ：ＣＡＳ　Ｎｏ．：６６５７５－２９－９）、及びフォルスコリン誘導体（例えば特開２００２－３４８２４３号公報）や以下の化合物などが挙げられる。好ましくは、フォルスコリンを使用することができる。
フォルスコリン（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６６４２８－８９－５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
イソプロテレノール（ＣＡＳ　Ｎｏ．：７６８３－５９－２）
ＮＫＨ４７７（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１３８６０５－００－２）
ＰＡＣＡＰ１－２７（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１２７３１７－０３－７）
ＰＡＣＡＰ１－３８（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１３７０６１－４８－４）
　ｃＡＭＰ誘導剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．２μｍｏｌ／Ｌ～５０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ～３０μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。
１．２．３　ＴＧＦ－β阻害剤
　ＴＧＦ－β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－β、形質転換増殖因子β）には、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３の３種類が存在し、ほぼ全ての細胞から生産されている。ＴＧＦ－βは、上皮細胞をはじめ、多くの細胞の増殖を抑制するなど細胞増殖、形質転換、分化、発生、アポトーシスの制御等の多種多様な細胞機能に関与している。
　「ＴＧＦ－β阻害剤の存在下」とは、ＴＧＦ－βを阻害することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ＴＧＦ－βを阻害することができる任意の手段を利用することができる。本発明には、ＴＧＦ－βに直接作用してその機能を阻害する物質（例えば、抗ＴＧＦ－β抗体やその他の薬剤）、ＴＧＦ－β自体の産生を抑制する薬剤等を利用することができる。また、ＴＧＦ－βが関わるシグナル伝達をその上流で阻害することによってもＴＧＦ－βを阻害することができる。
　本発明では特に限定されないが、ＴＧＦ－β阻害剤としては、例えば、以下の化合物を使用することができる。好ましくは、レプソックスを使用することができる。
Ａ８３－０１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：９０９９１０－４３－６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
レプソックス（ＣＡＳ　Ｎｏ．：４４６８５９－３３－２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
ＳＢ４３１５４２（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３０１８３６－４１－９）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
ＬＹ３６４９４７（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３９６１２９－５３－６）
ＳＢ５２５３３４（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３５６５５９－２０－１）
ＳＤ２０８（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６２７５３６－０９－８）
Ｇａｌｕｎｉｓｅｒｔｉｂ（ＬＹ２１５７２９９）（ＣＡＳ　Ｎｏ．：７００８７４－７２－２）
ＬＹ２１０９７６１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：７００８７４－７１－１）
ＳＢ５０５１２４（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６９４４３３－５９－５）
ＧＷ７８８３８８（ＣＡＳ　Ｎｏ．：４５２３４２－６７－５）
ＥＷ－７１９７（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１３５２６０８－８２－２）
　ＴＧＦ－β阻害剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．１μｍｏｌ／Ｌ～３０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．５μｍｏｌ／Ｌ～１０μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。
１．２．４　ＰＤＥ４阻害剤
　ＰＤＥ４（Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ－４）は、ホスホジエステラーゼスーパーファミリーの一つである。ホスホジエステラーゼは、リン酸ジエステル結合を加水分解する酵素であり、特にＰＤＥ４は、シグナル伝達経路のセカンドメッセンジャーであるｃＡＭＰの環状リン酸ジエステル結合を加水分解し、その細胞内濃度の調節に重要な役割を担っている。ＰＤＥ４は、免疫細胞や脳・神経細胞などに存在する。
　「ＰＤＥ４阻害剤の存在下」とは、ＰＤＥ４を阻害することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ＰＤＥ４を阻害することができる任意の手段を利用することができる。本発明には、ＰＤＥ４に直接作用してその機能を阻害する物質（例えば、抗ＰＤＥ４抗体やその他の薬剤）、ＰＤＥ４自体の産生を抑制する薬剤等を利用することができる。また、ＰＤＥ４が関わるシグナル伝達をその上流で阻害することによってもＰＤＥ４を阻害することができる。
　本発明では特に限定されないが、ＰＤＥ４阻害剤としては、例えば、以下の化合物を使用することができる。好ましくは、ロリプラムやその光学異性体（例えば、Ｒ（－）体、Ｓ（＋）体）を使用することができる。
ロリプラム（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６１４１３－５４－５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
Ｒｏｆｌｕｍｉｌａｓｔ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１６２４０１－３２－３）
Ｃｉｌｏｍｉｌａｓｔ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１５３２５９－６５－５）
ＧＳＫ２５６０６６（ＣＡＳ　Ｎｏ．：８０１３１２－２８－７）
Ａｐｒｅｍｉｌａｓｔ（ＣＣ－１０００４）（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６０８１４１－４１－９）
　ＰＤＥ４阻害剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．１μｍｏｌ／Ｌ～２０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．５μｍｏｌ／Ｌ～１０μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。
１．２．５　ＧＲアゴニスト
　ＧＲ（Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、グルココルチコイド受容体）は、核内受容体スーパーファミリーに属し、ステロイドホルモンであるグルココルチコイドと結合してその転写活性を調節する転写因子として働く。ＧＲは広くヒトの全身に発現しており、その機能的な重要性から、デキサメタゾンなどの合成アゴニストが多数開発されている。
　「ＧＲアゴニストの存在下」とは、ＧＲを作動することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ＧＲを作動することができる任意の手段を利用することができる。本発明には、ＧＲに直接作用してその機能を作動する物質、ＧＲ自体の発現を促進する薬剤等を利用することができる。また、ＧＲと相互作用する転写因子あるいは転写共役因子、またこれらの発現や翻訳後修飾などを調節することによってもＧＲの機能を制御することができる。
　本発明では特に限定されないが、ＧＲアゴニストとしては、例えば、以下の化合物を使用することができる。好ましくは、デキサメタゾンを使用することができる。
デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、ブデソニド、ヒドロコルチゾン、酢酸コルチゾン、ＧＳＫ９０２７、フルチカゾン、モメタゾン等のステロイド化合物。
選択的グルココルチコイド受容体修飾物質あるいは選択的グルココルチコイド受容体アゴニストに分類される非ステロイド化合物。
　ＧＲアゴニストの濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．０１μｍｏｌ／Ｌ～１０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０５μｍｏｌ／Ｌ～２μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。
１．２．６　ＲＡＲアゴニスト、ＲＸＲアゴニスト
　ＲＡＲ（Ｒｅｔｉｎｏｉｃ　ａｃｉｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、レチノイン酸受容体）は、核内受容体スーパーファミリーに属し、レチノイン酸をリガンドとしその転写活性が活性化される。ＲＡＲは、生体内で様々な機能を有しており、特に細胞の分化に密接に関わっていることから、人工の合成アゴニストが多数開発されている。
　ＲＸＲ（ｒｅｔｉｎｏｉｄ　Ｘ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、レチノイドＸ受容体）は、核内受容体スーパーファミリーに属し、ＲＡＲと同様にレチノイン酸などをリガンドとしその転写活性が調節される。ＲＸＲは、ＲＡＲをはじめとする様々な核内受容体とヘテロダイマーを形成し、特定の塩基配列への結合や転写共役因子のリクルートなどを介して、パートナーとなる核内受容体の転写活性を複雑に調節している。
　「ＲＡＲアゴニストないしＲＸＲアゴニストの存在下」とは、ＲＡＲないしＲＸＲを作動することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ＲＡＲないしＲＸＲを作動することができる任意の手段を利用することができる。本発明には、ＲＡＲないしＲＸＲに直接作用してその機能を作動する物質、ＲＡＲないしＲＸＲ自体の発現を促進する薬剤等を利用することができる。また、ＲＡＲないしＲＸＲと相互作用する転写因子あるいは転写共役因子、またこれらの発現および翻訳後修飾などを調節することによってもＲＡＲないしＲＸＲの機能を制御することができる。
　本発明では特に限定されないが、ＲＡＲアゴニストないしＲＸＲアゴニストとしては、例えば、以下の化合物を使用することができる。好ましくは、ＴＴＮＰＢ、レチノイン酸、ＣＨ５５、ＡＭ５８０を使用することができる。
ＴＴＮＰＢ（アロチノイド酸、ＣＡＳ　Ｎｏ．：７１４４１－２８－６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
レチノイン酸（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３０２－７９－４）
Ｔｒｅｔｉｎｏｉｎ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３０２－７９－４）
Ａｄａｐａｌｅｎｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１０６６８５－４０－９）
Ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１５３５５９－４９－０）
Ｔａｚａｒｏｔｅｎｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１１８２９２－４０－３）
Ｔａｍｉｂａｒｏｔｅｎｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：９４４９７－５１－５）
ＣＨ５５（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１１０３６８－３３－７）
ＡＭ５８０（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１０２１２１－６０－８）
　ＲＡＲアゴニストないしＲＸＲアゴニストの濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．０５μｍｏｌ／Ｌ～１０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．５μｍｏｌ／Ｌ～５μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。
１．２．７　ＰＤＫ１活性化剤
　ＰＤＫ１（ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ－１、ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ１）は、ＡＫＴをリン酸化し活性化するリン酸化酵素であり、イノシトールリン脂質を介したシグナル伝達経路の中心として機能している。このＰＤＫ１／ＡＫＴシグナル経路は、細胞の生存、増殖、糖および脂質代謝などに極めて重要な役割を果たしている。ＰＤＫ１活性化剤であるＰＳ４８は、ＰＤＫ１に直接結合しＡＫＴをリン酸化させ、このシグナル経路を活性化する。
　「ＰＤＫ１活性化剤の存在下」とは、ＰＤＫ１を活性化することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、例えば、細胞内ＰＤＫ１濃度を増加させることができる任意の手段を利用することができる。また、ＰＤＫ１はチロシンキナーゼ受容体、サイトカイン受容体、Ｇタンパク質共役型受容体をはじめとする様々な受容体を介して、ホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）が活性化されることにより生産されるホスファチジルイノシトール３リン酸によって活性化されるため、これらの受容体を活性化させる物質、あるいは、ホスファチジルイノシトール３リン酸の生産を誘導する他の刺激もＰＤＫ１を活性化させる手段となりうる。
　本発明では特に限定されないが、ＰＤＫ１活性化剤としては、例えば、以下の化合物を使用することができる。好ましくは、ＰＳ４８を使用することができる。
ＰＳ４８（（２Ｚ）－５－（４－Ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）－３－ｐｈｅｎｙｌ－２－ｐｅｎｔｅｎｏｉｃ　ａｃｉｄ、ＣＡＳ　Ｎｏ．：１１８０６７６－３２－７）
ＯＳＵ－０３０１２（ＡＲ－１２）（ＣＡＳ　Ｎｏ．：７４２１１２－３３－０）
ＢＸ７９５（ＣＡＳ　Ｎｏ．：７０２６７５－７４－９）
ＢＸ９１２（ＣＡＳ　Ｎｏ．：７０２６７４－５６－４）
ＰＨＴ－４２７（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１１９１９５１－５７－１）
　ＰＤＫ１活性化剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．５μｍｏｌ／Ｌ～３０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ～１０μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。
１．２．８　ＥＲＫ阻害剤について
　ＥＲＫ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｓｉｇｎａｌ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　Ｋｉｎａｓｅ、細胞外シグナル調節キナーゼ）は、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、血清刺激又は酸化ストレスなどによって活性化されるＭＡＰＫのサブファミリーで、ＥＲＫはその関わるシグナル伝達経路の違いからＥＲＫ１／２、ＥＲＫ５、ＥＲＫ７、ＥＲＫ８に分けられる。上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）などのチロシンキナーゼ受容体にリガンドが結合することでシグナルが流れた結果、ＥＲＫの活性化ループに存在するＴＥＹモチーフがリン酸化されて活性化する。
　「ＥＲＫ阻害剤の存在下」とは、ＥＲＫを阻害することができる培養条件下であることをいい、その手段は特に限定はなく、ＥＲＫの活性を阻害する物質、例えば、抗ＥＲＫ抗体やＥＲＫ阻害剤のようなＥＲＫシグナル阻害手段を利用することができる。また、ＥＲＫの活性化に関わる酵素、例えば、ＥＲＫキナーゼやＥＲＫキナーゼキナーゼ等を阻害する手段もＥＲＫ阻害に利用することができる。
　本発明では特に限定されないが、ＥＲＫ阻害剤としては、以下の化合物を使用することができる。好ましくは、ＧＤＣ－０９９４（Ｒａｖｏｘｅｒｔｉｎｉｂ）を使用することができる。
ＧＤＣ－０９９４（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１４５３８４８－２６－４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
ＳＣＨ７７２９８４（ＣＡＳ　Ｎｏ．：９４２１８３－８０－４）
ＭＫ－８３５３（ＳＣＨ９００３５３）（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１１８４１７３－７３－６）
Ｍａｇｎｏｌｉｎ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３１００８－１８－１）
ＬＹ３２１４９９６（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１９５１４８３－２９－６）
ＦＲ　１８０２０４（ＣＡＳ　Ｎｏ．：８６５３６２-７４-９）
ＡＺＤ０３６４（ＣＡＳ　Ｎｏ．：２０９７４１６-７６-５）
　ＥＲＫ阻害剤の濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．１μｍｏｌ／Ｌ～１０μｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．２μｍｏｌ／Ｌ～５μｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。
１．３　体細胞の培養
　本発明製法における体細胞の培養は、使用する体細胞の種類に応じた培地、温度、その他の条件を選択し、上記の各種の阻害剤（及び、場合により誘導剤ないし活性化剤）の存在下において実施すればよい。培地は、公知の培地又は市販の培地から選択することができる。例えば、一般的な培地であるＭＥＭ（最少必須培地）、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、又はこれらを改変した培地に、適切な成分（血清、タンパク質、アミノ酸、糖類、ビタミン類、脂肪酸類、抗生物質等）を添加して使用することができる。
　培養条件としては、一般的な細胞培養の条件を選択すればよい。３７℃、５％ＣＯ２の条件などが例示される。培養中は適切な間隔（好ましくは１日から７日に１回、より好ましくは３日から４日に１回）で培地を交換することが好ましい。線維芽細胞を材料として本発明製法を実施する場合、３７℃、５％ＣＯ２の条件では５ないし８日間から３週間で心筋細胞が出現する。使用する体細胞として培養が容易なものを選択することにより、あらかじめ細胞数を増加させた体細胞を心筋細胞に転換することも可能である。従って、スケールアップした心筋細胞の製造も容易である。
　体細胞の培養には、プレート、ディッシュ、細胞培養用フラスコ、細胞培養用バッグ等の細胞培養容器を使用することができる。なお、細胞培養用バッグとしては、ガス透過性を有するものが好適である。大量の細胞を必要とする場合には、大型培養槽を使用してもよい。培養は開放系又は閉鎖系のどちらでも実施することができるが、得られた心筋細胞のヒトへの投与等を目的とする場合には、閉鎖系で培養を行うことが好ましい。
　本発明製法においては、上記した各種の阻害剤等を含む培地において体細胞を培養することにより、一段階の培養によって体細胞から心筋細胞を製造することができる。
　本発明製法においては、体細胞から心筋細胞を製造する。５－アザシチジン、アンジオテンシンＩＩ、ＢＭＰ－２（Ｂｏｎｅ　Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　２）、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）等は、心筋細胞への分化の誘導に有効な物質として知られている。心筋細胞への分化の誘導に有効な物質としては、例えば、分化誘導剤として市販されているものを使用することもできる。本発明においては、上記した物質の存在下において体細胞を培養することができる。
１．４　心筋細胞
　上記した本発明製法により、心筋細胞を含有する細胞集団を得ることができる。本発明製法により製造される心筋細胞も本発明の範囲内である。本発明製法で製造される心筋細胞は、最終分化した細胞の他、心筋細胞に分化することが運命づけられた前駆細胞でもよい。
　本発明製法により製造される心筋細胞は、低分子化合物により体細胞から直接誘導される、いわゆる低分子化合物誘導性心筋細胞（ｃｉＣＭｓ）であって、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞から分化誘導される心筋細胞とは区別される。また、使用する低分子化合物の相違によって、特許文献１等に記載の低分子化合物誘導性心筋細胞とも区別される。
　本発明製法で製造される心筋細胞は、例えば、細胞の形態的変化、心筋細胞の特徴的性質や特異的マーカーを利用して、検出、確認及び分離を行うことができる。
　心筋細胞は、自律的に拍動するという他の細胞にない特徴を有しており、顕微鏡下での観察により他の細胞と区別することができる。また、心筋細胞の特異的マーカーとしては、心筋トロポニンＣ（ｃＴｎＴ）、αミオシン重鎖、αアクチン等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
　特異的マーカーの検出には、検疫的方法（抗体による検出）を利用できるが、タンパク質分子に関してはそのｍＲＮＡ量の定量により検出を実施してもよい。心筋細胞の特異的マーカーを認識する抗体は、本発明製法により得られた心筋細胞を単離及び精製する上でも有用である。
　本発明製法で製造される心筋細胞は、例えば、組織修復等のために使用することができる。本発明製法で製造される心筋細胞を使用して、組織修復等のための医薬用組成物を製造することができる。心不全又は心筋梗塞等の心疾患の治療手段として、心筋細胞の製造方法、及び心筋細胞の移植方法の開発が行なわれている。例えば、心筋細胞と内皮細胞等を積層化することにより形成された心筋シートは、優れた治療効果と生着性を示すことから、重度の心不全の治療への利用が期待されている。
　本発明製法で製造される心筋細胞を医薬用組成物とする場合には、常法により、心筋細胞を医薬的に許容される担体と混合するなどして、個体への投与に適した形態の製剤とすればよい。担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えば、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム等）を加えて等張とした注射用蒸留水を挙げることができる。さらに、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤等を配合してもよい。
　本発明製法で製造される心筋細胞は、さらに、心筋細胞の機能発揮や生着性向上に有効な他の細胞や成分と組み合わせた組成物とすることもできる。
　さらに、本発明製法で製造される心筋細胞は、心筋細胞に作用する医薬候補化合物のスクリーニングや医薬候補化合物の安全性評価のために使用することもできる。心筋細胞は、医薬候補化合物の心毒性を評価するための重要なツールである。本発明製法によれば、一度の操作で多くの心筋細胞を取得することができることから、細胞のロット差の影響を受けずに、再現性のある研究結果を得ることが可能になる。
２　組成物
　本発明に係る組成物（以下、「本発明組成物」という。）は、体細胞から直接分化誘導することにより心筋細胞を製造するための組成物であって、ＭＥＫ阻害剤を含むことを特徴とする。
　好ましくは、さらにｃＡＭＰ誘導剤を含む本発明組成物を挙げることができる。より好ましくは、さらにＴＧＦ－β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＧＲアゴニストからなる群から選択される少なくとも１種を含む本発明組成物を挙げることができる。また、更に好ましくは、さらにＥＲＫ阻害剤を含む本発明組成物を挙げることができる。
　特に好ましくは、次の（１）～（６）のいずれかの組み合わせを含む本発明組成物である。
（１）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＴＧＦ－β阻害剤、
（２）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＰＤＥ４阻害剤、
（３）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＧＲアゴニスト、
（４）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＧＲアゴニスト、
（５）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＧＲアゴニスト、
（６）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ＧＲアゴニスト、及びＥＲＫ阻害剤。
　また、本発明として、体細胞から直接分化誘導することにより心筋細胞を製造するための組成物であって、ｃＡＭＰ誘導剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ＧＲアゴニスト、及びＥＲＫ阻害剤を含むことを特徴とする、体細胞から心筋細胞を製造するための組成物も挙げることができる。以下、かかる組成物も含めて本発明組成物という。
　本発明組成物は、さらにＲＡＲアゴニスト、ＲＸＲアゴニスト、及びＰＤＫ１活性化剤からなる群から選択される少なくとも１種を含むことができる。
　本発明組成物においては、少なくとも上記いずれかの組み合わせを含んでいればよく、必要に応じて、任意にさらに他の阻害剤や誘導剤等を含むことができる。
　上記阻害剤や誘導剤等は、それぞれにおいて、１種を用いても２種以上を併用してもよい。
　具体的な上記阻害剤等においては、２種類以上の阻害作用等を有するものもあり得るが、その場合、一つで複数の阻害剤等を含んでいるとみなすことができる。
　上記した阻害剤や誘導剤等の具体例や好ましい例などは、前記と同義である。
　本発明組成物は、体細胞から心筋細胞を製造するための組成物として使用することができる。本発明組成物は、また、体細胞から心筋細胞を製造するための培地として使用することもできる。
　体細胞から心筋細胞の製造に使用される培地としては、細胞の培養に必要な成分を混合して製造した基礎培地に、有効成分として、ＭＥＫ阻害剤及びｃＡＭＰ誘導剤等を含有させた培地を例示することができる。上記の有効成分は、心筋細胞の製造に有効な濃度で含まれていればよく、濃度は当業者が適宜決定することができる。基礎培地は、公知の培地又は市販の培地から選択することができる。例えば、一般的な培地であるＭＥＭ（最少必須培地）、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、又はこれらを改変した培地を、基礎培地として使用することができる。
　培地にはさらに、本明細書中で上記した公知の培地成分、例えば、血清、タンパク質（アルブミン、トランスフェリン、成長因子等）、アミノ酸、糖類、ビタミン類、脂肪酸類、抗生物質等を添加してもよい。
　培地にはさらに、本明細書中で上記した、心筋細胞への分化の誘導に有効な物質を添加してもよい。
　さらに本発明においては、ＭＥＫ阻害剤及びｃＡＭＰ誘導剤等を生体に投与することによって、生体内において体細胞から心筋細胞を製造することもできる。即ち、本発明によれば、ＭＥＫ阻害剤及びｃＡＭＰ誘導剤等を生体に投与することを含む、生体内において体細胞から心筋細胞を製造する方法が提供される。生体に投与する阻害剤等の好ましい組み合わせは、本明細書中に記載した通りである。また、生体としては、ヒト、ヒト以外の哺乳動物、及び哺乳動物以外の動物（鳥類、爬虫類、両生類、魚類等）が例示されるが、ヒトが特に好ましい。ＭＥＫ阻害剤及びｃＡＭＰ誘導剤等を生体内の特定部位に投与することによって、上記特定部位において、体細胞から心筋細胞を製造することができる。
　以下、実施例や試験例により本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例等に記載の範囲に限定されるものではない。
実施例　心筋細胞の製造
＜ヒト線維芽細胞から心筋細胞への直接誘導＞
（１）ヒト線維芽細胞
　材料としたヒト線維芽細胞はＤＳファーマバイオメディカル株式会社から購入した。３８才のヒト皮膚に由来する線維芽細胞である。
（２）ヒト線維芽細胞から心筋細胞への直接誘導
　ヒト線維芽細胞を、ゼラチン（Ｃａｔ＃：１９０－１５８０５，和光純薬工業社製）でコーティングされた３５ｍｍディッシュに８×１０４個ずつ播種し、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ　ｈｉｇｈ　ｇｌｕｃｏｓｅ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）で、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２日間培養した（８０－９０％以上がコンフルエント）。なおＤＭＥＭは、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ）を示す。
　上記のヒト線維芽細胞のディッシュの培地を、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２％Ｂ２７-ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ社製）、１％Ｎ２（Ｇｉｂｃｏ社製）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ：Ｎｏｎ-ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ；Ｇｉｂｃｏ社製）、βメルカプトエタノール（ナカライテスク社製；終濃度０．１ｍｍｏｌ／Ｌ）、２－ｐｈｏｓｐｈｏ　ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ社製；終濃度５０μｇ／ｍＬ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び下記の低分子化合物を添加したＤＭＥＭ（Ｈｉｇｈ　Ｇｌｕｃｏｓｅ）ｗｉｔｈ　Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ　Ｐｈｅｎｏｌ　Ｒｅｄ，Ｓｏｄｉｕｍ　Ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｇｉｂｃｏ社製）に培地を交換した。その後、３日毎に同組成の培地へ培地交換を行いながら、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
＜低分子化合物＞
２μＭ　ＰＤ０３２５９０１（Ｃａｔ＃：１６２－２５２９３，Ｗａｋｏ）
１５μＭ　フォルスコリン（Ｃａｔ＃：０６３－０２１９３，Ｗａｋｏ）
５μＭ　レプソックス（Ｃａｔ＃：１８９４－２５，ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）
３μＭ　ロリプラム（Ｃａｔ＃：１８０－０１４１１，Ｗａｋｏ）
１μＭ　デキサメタゾン（Ｃａｔ＃：０４７－１８８６３，Ｗａｋｏ）
１μＭ　レチノイン酸（Ｃａｔ＃：１８６－０１１１４，Ｗａｋｏ）
２μＭ　ＴＴＮＰＢ（Ｃａｔ＃：１６１４４，Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）
１０μＭ　ＰＳ４８（Ｃａｔ＃：１６４－２５０１１，Ｗａｋｏ）
（３）結果
　上記（２）に従って培養した結果を表１・表２、及び図１～６に示す。表中、「＋」は培地中に当該化合物が存在することを示し、「－」は培地中に当該化合物が存在しないことを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
（４）心筋細胞の評価
　本実験において、低分子化合物を添加して培養後５日目程度から心筋様の細胞が出現した。これは、顕微鏡下において自発的かつ周期的に収縮する細胞塊を観察することによって評価した。細胞の写真（図１～６）は、当該低分子化合物を添加して培養７日後と１０日後（図１～３）、７日後と１３日後（図４、５）、又は１３日後と１７日後（図６）に、それぞれ撮影したものである。
　また、表２の低分子化合物の組み合わせの一部について、当該低分子化合物を添加して培養１７日後の細胞からｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲによって心筋前駆細胞特異的遺伝子Ｔｂｘ１および心筋細胞特異的遺伝子Ｔｎｎｔ２の発現量を定量した。その結果を図７に示す。図中のＴｂｐとは内部標準となる遺伝子を示し、このｍＲＮＡ量による相対値によりＴｂｘ１およびＴｎｎｔ２のｍＲＮＡ量が評価している。図中の各記号の組み合わせ化合物は下記の通りである。
Ｃ：コントロール（当該低分子化合物なし）
Ｍ：実施例Ａ
Ｆ：比較例２
ＭＦ：実施例７
ＭＦ＋Ｒｅｐ：実施例８
ＭＦ＋Ｒｏｌｉ：実施例９
ＭＦ＋Ｄｅｘ：実施例１０
ＭＦ＋Ｒｅｐ＋Ｒｏｌｉ＋Ｄｅｘ：実施例１２
　表１や図１～３の写真から明らかな通り、特にＰＤ０３２５９０１（ＭＥＫ阻害剤）を化合物の組み合わせから除いた場合、自発的に収縮する細胞塊がほとんど現れないようになった。また表２や図４～６の写真から明らかな通り、頻度は少ないながらＰＤ０３２５９０１（ＭＥＫ阻害剤）とフォルスコリン（ｃＡＭＰ誘導剤）あるいはＰＤ０３２５９０１（ＭＥＫ阻害剤）のみの添加によって、心筋様の細胞塊が出現した。また図６の写真が示すように、一箇所だけでなく、複数箇所において自発的に動く細胞塊を生じたことが確認された。
　図７から、当該低分子化合物を加えていない時の細胞の発現量と比較して、それぞれの化合物の組み合わせによって、これら心筋細胞に特異的な遺伝子が活性化していることがわかった。特に、３種類の化合物（ＰＤ０３２５９０１（ＭＥＫ阻害剤）、フォルスコリン（ｃＡＭＰ誘導剤）、レプソックス（ＴＧＦ－β））および５種類の化合物（ＰＤ０３２５９０１（ＭＥＫ阻害剤）、フォルスコリン（ｃＡＭＰ誘導剤）、レプソックス（ＴＧＦ－β）、ロリプラム（ＰＤＥ４阻害剤）、デキサメタゾン（ＧＲアゴニスト））の組み合わせでは、これら両遺伝子の発現が大きく上昇していた。
　本実験結果から、ＭＥＫ阻害剤は、心筋細胞の誘導に重要な化合物であり、少なくともＭＥＫ阻害剤（例、ＰＤ０３２５９０１）、又はそれとｃＡＭＰ誘導剤（例、フォルスコリン）との存在下で培養することにより、誘導効率の良好な心筋細胞が得られることが分かった。また、ＭＥＫ阻害剤及びｃＡＭＰ誘導剤、並びにＴＧＦ－β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＧＲアゴニストの存在下で培養すると、当該特定的遺伝子の発現は顕著であった。
試験例１
（１）心筋細胞に係る遺伝子発現
　ＰＤ０３２５９０１（ＭＥＫ阻害剤）、フォルスコリン（ｃＡＭＰ誘導剤）、レプソックス（ＴＧＦ－β）、及びロリプラム（ＰＤＥ４阻害剤）の４種類（４Ｃ）、又はこれらにデキサメタゾン（ＧＲアゴニスト）を加えた５種類の化合物の組み合わせについて、前記実施例と同様に添加して細胞培養を行い、培養１８日後の細胞からｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲによって心筋前駆細胞特異的遺伝子Ｈａｎｄ２及びＴｂｘ１、並びに心筋細胞特異的遺伝子Ｔｎｎｔ２、Ｎｐｐａ、及びＮｋｘ２．５の発現量を定量した。その結果を図８に示す。図中のＴｂｐとは内部標準となる遺伝子を示し、このｍＲＮＡ量による相対値により各遺伝子のｍＲＮＡ量が評価している。図中、「Ｎｏ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ」は当該化合物を一つも添加しなかった場合の結果であることを、「４Ｃ＋Ｄｅｘ」は上記５種類の化合物を全て添加した場合の結果であることを示す。
　図８から明らかな通り、４Ｃ又はこれにデキサメタゾン（ＧＲアゴニスト）を加えた化合物群を添加培養することにより、ヒト皮膚線維芽細胞から心筋細胞へ直接誘導が進んでいることが示された。
（２）免疫染色
　上記（１）において、４Ｃにデキサメタゾン（ＧＲアゴニスト）を加えた化合物群を添加培養した細胞について、培養後１８日目に細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、免疫染色を行った。染色には抗Ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ　Ａｌｐｈａ　Ａｃｔｉｎｉｎ抗体（ａｂ９４６５、Ａｂｃａｍ社製；２００倍希釈で使用）を使用した。その結果を図９に示す。図中、赤がＡｌｐｈａ　Ａｃｔｉｎｉｎの染色結果、青がＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）による核染色を示す。なお、図９はグレー表示であるため、赤色と青色等は表示されないが、実際のオリジナル写真では、赤色と青色等が表示されている。
　図９に示すように、当該化合物群を添加して培養後、心筋様細胞のある一定数でＡｌｐｈａ　Ａｃｔｉｎｉｎの染色が見られ、相対的にＤＡＰＩで染色された細胞核ではなく、細胞質で染色が観察された。心筋細胞のマーカーであるＡｌｐｈａ　Ａｃｔｉｎｉｎの発現が一部の細胞で見られたことから、免疫染色の結果からも、当該化合物群を添加培養することにより、ヒト皮膚線維芽細胞から心筋様細胞へ直接誘導が進んでいることが示された。
試験例２
　下記低分子化合物の組み合わせについて、前記実施例と同様に添加して細胞培養を行った。当該化合物群を添加して培養後１３日目と１９日目の細胞の状態を図１０に示す。
　図１０中、「５Ｃ」は、下記６種類の低分子化合物の中、Ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ以外の５種類の化合物の組み合わせを表し、左側２写真は、その化合物群の添加培養結果を示す。「５Ｃ－Ｍ」は、５Ｃの化合物群からＰＤ０３２５９０１（ＭＥＫ阻害剤）を除いた化合物群を表し、中２写真は、その化合物群の添加培養結果を示す。「５Ｃ－Ｍ＋Ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ」は、５Ｃの化合物群からＰＤ０３２５９０１（ＭＥＫ阻害剤）を除き、別のＭＥＫ阻害剤であるＴｒａｍｅｔｉｎｉｂを加えた化合物群を表し、右側２写真は、その化合物群の添加培養結果を示す。
＜低分子化合物＞
２μＭ　ＰＤ０３２５９０１（Ｃａｔ＃：１６２－２５２９３，Ｗａｋｏ）
１５μＭ　フォルスコリン（Ｃａｔ＃：０６３－０２１９３，Ｗａｋｏ）
５μＭ　レプソックス（Ｃａｔ＃：１８９４－２５，ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）
３μＭ　ロリプラム（Ｃａｔ＃：１８０－０１４１１，Ｗａｋｏ）
１μＭ　デキサメタゾン（Ｃａｔ＃：０４７－１８８６３，Ｗａｋｏ）
３μＭ　Ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ（Ｃａｔ＃：ＨＹ-１０９９９，ＭｅｄＣｈｅｍ　Ｅｘｐｒｅｓｓ）
　図１０から明らかな通り、ヒト皮膚線維芽細胞から心筋細胞への直接誘導にはＭＥＫ阻害剤が重要であることが示された。
試験例３
　下記低分子化合物の組み合わせについて、前記実施例と同様に添加して培養を行った。当該低分子化合物を添加して培養後７日目と１２日目の細胞の状態を図１１に示す。
　図１１中、「５Ｃ」は、下記６種類の低分子化合物の中、ＧＤＣ－０９９４以外の５種類の化合物の組み合わせを表し、左端２写真は、その化合物群の添加培養結果を示す。「５Ｃ－Ｍ」は、５Ｃの化合物群からＰＤ０３２５９０１（ＭＥＫ阻害剤）を除いた化合物群を表し、左側から２つ目の２写真は、その化合物群の添加培養結果を示す。「５Ｃ－Ｍ＋ＧＤＣ－０９９４」は、５Ｃの化合物群からＰＤ０３２５９０１（ＭＥＫ阻害剤）を除き、代わりにＧＤＣ－０９９４（ＥＲＫ阻害剤）を加えた化合物群を表し、右側から２つ目の２写真は、その化合物群の添加培養結果を示す。「５Ｃ＋ＧＤＣ－０９９４」は、５Ｃの化合物群にＧＤＣ－０９９４（ＥＲＫ阻害剤）を加えた化合物群を表し、右端２写真は、その化合物群の添加培養結果を示す。
＜低分子化合物＞
２μＭ　ＰＤ０３２５９０１（Ｃａｔ＃：１６２－２５２９３，Ｗａｋｏ）
１５μＭ　フォルスコリン（Ｃａｔ＃：０６３－０２１９３，Ｗａｋｏ）
５μＭ　レプソックス（Ｃａｔ＃：１８９４－２５，ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）
３μＭ　ロリプラム（Ｃａｔ＃：１８０－０１４１１，Ｗａｋｏ）
１μＭ　デキサメタゾン（Ｃａｔ＃：０４７－１８８６３，Ｗａｋｏ）
３μＭ　ＧＤＣ－０９９４（Ｃａｔ＃：２１１０７，Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）
　図１１に示されるように、ＭＥＫ阻害剤が不存在でもＥＲＫ阻害剤が存在すれば、ヒト皮膚線維芽細胞から心筋細胞への直接誘導が可能であった。また、ＭＥＫ阻害剤とＥＲＫ阻害剤の両方が存在すれば、ヒト皮膚線維芽細胞から心筋細胞への直接誘導が促進されることが分かった。

Claims (27)

  1. 体細胞から直接分化誘導することにより心筋細胞を製造する方法であって、ＭＥＫ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、心筋細胞の製造方法。
  2. 前記工程が、さらにｃＡＭＰ誘導剤の存在下で体細胞を培養する工程である、請求項１に記載の心筋細胞の製造方法。
  3. 前記工程が、さらにＴＧＦ－β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＧＲアゴニストからなる群から選択される少なくとも１種の存在下で体細胞を培養する工程である、請求項１又は２に記載の心筋細胞の製造方法。
  4. 前記工程が、さらにＥＲＫ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程である、請求項３に記載の心筋細胞の製造方法。
  5. 前記工程が、次の（１）～（６）のいずれかの組み合わせ存在下で体細胞を培養する工程である、請求項１～３のいずれか一項に記載の心筋細胞の製造方法。
    （１）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＴＧＦ－β阻害剤、
    （２）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＰＤＥ４阻害剤、
    （３）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＧＲアゴニスト、
    （４）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＧＲアゴニスト、
    （５）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＧＲアゴニスト、
    （６）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ＧＲアゴニスト、及びＥＲＫ阻害剤。
  6. 前記工程が、さらにＲＡＲアゴニスト、ＲＸＲアゴニスト、及びＰＤＫ１活性化剤からなる群から選択される少なくとも１種の存在下で体細胞を培養する工程である、請求項１～５のいずれか一項に記載の心筋細胞の製造方法。
  7. ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１である、請求項１～６のいずれか一項に記載の心筋細胞の製造方法。
  8. ｃＡＭＰ誘導剤がフォルスコリンである、請求項２～７のいずれか一項に記載の心筋細胞の製造方法。
  9. ＴＧＦ－β阻害剤がレプソックス、ＰＤＥ４阻害剤がロリプラム、又はＧＲアゴニストがデキサメタゾンである、請求項３～８のいずれか一項に記載の心筋細胞の製造方法。
  10. ＥＲＫ阻害剤がＧＤＣ－０９９４である、請求項４～９のいずれか一項に記載の心筋細胞の製造方法。
  11. 体細胞から直接分化誘導することにより心筋細胞を製造する方法であって、ｃＡＭＰ誘導剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ＧＲアゴニスト、及びＥＲＫ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、心筋細胞の製造方法。
  12. ｃＡＭＰ誘導剤がフォルスコリン、ＴＧＦ－β阻害剤がレプソックス、ＰＤＥ４阻害剤がロリプラム、ＧＲアゴニストがデキサメタゾン、又はＥＲＫ阻害剤がＧＤＣ－０９９４である、請求項１１に記載の心筋細胞の製造方法。
  13. 前記体細胞が線維芽細胞である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の心筋細胞の製造方法。
  14. 請求項１～１３のいずれか一項に記載の心筋細胞の製造方法から製造される、心筋細胞。
  15. 体細胞から直接分化誘導することにより心筋細胞を製造するための組成物であって、ＭＥＫ阻害剤を含むことを特徴とする、体細胞から心筋細胞を製造するための組成物。
  16. さらにｃＡＭＰ誘導剤を含む、請求項１５に記載の組成物。
  17. さらにＴＧＦ－β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ＧＲアゴニスト、及びＥＲＫ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種を含む、請求項１５又は１６に記載の組成物。
  18. 前記工程が、さらにＥＲＫ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程である、請求項１７に記載の心筋細胞の製造方法。
  19. 次の（１）～（６）のいずれかの組み合わせを含む、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の組成物。
    （１）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＴＧＦ－β阻害剤、
    （２）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＰＤＥ４阻害剤、
    （３）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、及びＧＲアゴニスト、
    （４）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＧＲアゴニスト、
    （５）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、及びＧＲアゴニスト、
    （６）ＭＥＫ阻害剤、ｃＡＭＰ誘導剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ＧＲアゴニスト、及びＥＲＫ阻害剤。
  20. さらにＲＡＲアゴニスト、ＲＸＲアゴニスト、及びＰＤＫ１活性化剤からなる群から選択される少なくとも１種を含む、請求項１５～１９のいずれか一項に記載の組成物。
  21. ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１である、請求項１５～２０のいずれか一項に記載の組成物。
  22. ｃＡＭＰ誘導剤がフォルスコリンである、請求項１６～２１のいずれか一項に記載の組成物。
  23. ＴＧＦ－β阻害剤がレプソックス、ＰＤＥ４阻害剤がロリプラム、ＧＲアゴニストがデキサメタゾンである、請求項１７～２２のいずれか一項に記載の組成物。
  24. ＥＲＫ阻害剤がＧＤＣ－０９９４である、請求項１８～２３のいずれか一項に記載の組成物。
  25. 体細胞から直接分化誘導することにより心筋細胞を製造するための組成物であって、ｃＡＭＰ誘導剤、ＴＧＦ－β阻害剤、ＰＤＥ４阻害剤、ＧＲアゴニスト、及びＥＲＫ阻害剤を含むことを特徴とする、体細胞から心筋細胞を製造するための組成物。
  26. ｃＡＭＰ誘導剤がフォルスコリン、ＴＧＦ－β阻害剤がレプソックス、ＰＤＥ４阻害剤がロリプラム、ＧＲアゴニストがデキサメタゾン、又はＥＲＫ阻害剤がＧＤＣ－０９９４である、請求項２５に記載の組成物。
  27. 前記体細胞が線維芽細胞である、請求項１５～２６のいずれか一項に記載の組成物。
PCT/JP2019/002193 2018-01-30 2019-01-24 心筋細胞の製造方法 Ceased WO2019151097A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019569055A JP7586408B2 (ja) 2018-01-30 2019-01-24 心筋細胞の製造方法
EP19746735.0A EP3747993A4 (en) 2018-01-30 2019-01-24 CARDIOMYOCYTE PRODUCTION PROCESS
CN201980010936.3A CN111684059A (zh) 2018-01-30 2019-01-24 心肌细胞的制备方法
US16/960,441 US11834679B2 (en) 2018-01-30 2019-01-24 Method for producing cardiomyocytes

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018-013301 2018-01-30
JP2018013301 2018-01-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019151097A1 true WO2019151097A1 (ja) 2019-08-08

Family

ID=67479671

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2019/002193 Ceased WO2019151097A1 (ja) 2018-01-30 2019-01-24 心筋細胞の製造方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US11834679B2 (ja)
EP (1) EP3747993A4 (ja)
JP (1) JP7586408B2 (ja)
CN (1) CN111684059A (ja)
WO (1) WO2019151097A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112608883A (zh) * 2020-12-25 2021-04-06 武汉睿健医药科技有限公司 一种光感受器神经元细胞的化学诱导方法
JP2021517574A (ja) * 2018-03-23 2021-07-26 サイトーＣｙｔｏｏ 骨格筋肥大誘発剤としてのａｌｋ５阻害剤

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022234586A1 (en) * 2021-05-06 2022-11-10 Yeda Research And Development Co. Ltd. Method for inducing hypertrophic muscle fibers for industrial meat production

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002348243A (ja) 2001-05-28 2002-12-04 Denki Kagaku Kogyo Kk 関節症治療用注入剤
JP2013524837A (ja) * 2010-04-28 2013-06-20 ザ ジェイ． デヴィッド グラッドストーン インスティテューツ 心筋細胞を発生させるための方法
JP2014525268A (ja) * 2011-08-30 2014-09-29 ザ ジェイ． デヴィッド グラッドストーン インスティテューツ 心筋細胞を生成するための方法
JP2015213441A (ja) * 2014-05-08 2015-12-03 学校法人慶應義塾 心筋様細胞の作製方法及びそれに用いる培地
WO2016056438A1 (ja) * 2014-10-06 2016-04-14 学校法人 慶應義塾 心筋様細胞の作製方法及びそれに用いる心筋様細胞の作製用組成物
US20160186141A1 (en) 2013-09-11 2016-06-30 The J. David Gladstone Institutes, a testamentary trust established under the Will of J. David Glad Small molecule cellular reprogramming to generate cardiomyocytes
JP2017104091A (ja) * 2015-11-27 2017-06-15 タカラバイオ株式会社 間葉系細胞の製造方法
WO2017159463A1 (ja) * 2016-03-15 2017-09-21 学校法人慶應義塾 線維芽細胞からの心臓前駆細胞と心筋細胞の直接製造方法
JP2018013301A (ja) 2016-07-21 2018-01-25 株式会社富士通ゼネラル 空気調和装置
US20180062692A1 (en) 2016-08-26 2018-03-01 Samsung Electronics Co., Ltd. Modem and rf chips, application processor including the same and operating method thereof
WO2018062269A1 (ja) * 2016-09-30 2018-04-05 京都府公立大学法人 体細胞を製造する方法、体細胞、及び組成物

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002348243A (ja) 2001-05-28 2002-12-04 Denki Kagaku Kogyo Kk 関節症治療用注入剤
JP2013524837A (ja) * 2010-04-28 2013-06-20 ザ ジェイ． デヴィッド グラッドストーン インスティテューツ 心筋細胞を発生させるための方法
JP2014525268A (ja) * 2011-08-30 2014-09-29 ザ ジェイ． デヴィッド グラッドストーン インスティテューツ 心筋細胞を生成するための方法
US20160186141A1 (en) 2013-09-11 2016-06-30 The J. David Gladstone Institutes, a testamentary trust established under the Will of J. David Glad Small molecule cellular reprogramming to generate cardiomyocytes
JP2015213441A (ja) * 2014-05-08 2015-12-03 学校法人慶應義塾 心筋様細胞の作製方法及びそれに用いる培地
WO2016056438A1 (ja) * 2014-10-06 2016-04-14 学校法人 慶應義塾 心筋様細胞の作製方法及びそれに用いる心筋様細胞の作製用組成物
JP2017104091A (ja) * 2015-11-27 2017-06-15 タカラバイオ株式会社 間葉系細胞の製造方法
WO2017159463A1 (ja) * 2016-03-15 2017-09-21 学校法人慶應義塾 線維芽細胞からの心臓前駆細胞と心筋細胞の直接製造方法
JP2018013301A (ja) 2016-07-21 2018-01-25 株式会社富士通ゼネラル 空気調和装置
US20180062692A1 (en) 2016-08-26 2018-03-01 Samsung Electronics Co., Ltd. Modem and rf chips, application processor including the same and operating method thereof
WO2018062269A1 (ja) * 2016-09-30 2018-04-05 京都府公立大学法人 体細胞を製造する方法、体細胞、及び組成物

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAO, N. ET AL.: "Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules", SCIENCE, vol. 352, no. 6290, 2016, pages 1216 - 1220, XP055366967, DOI: 10.1126/science.aaf1502 *
CELL RESEARCH, vol. 25, 2015, pages 1013 - 1024
CHEMICAL ABSTRACTS, Columbus, Ohio, US; abstract no. 2097416-76-5
FU, Y. ET AL.: "Direct reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocytes with chemical cocktails", CELL RES., vol. 25, no. 9, 2015, pages 1013 - 1024, XP055429604, DOI: 10.1038/cr.2015.99 *
JOURNAL OF CLINICAL BIOCHEMISTRY AND NUTRITION, vol. 56, no. 3, 2015, pages 166 - 170
PING DAI, YUKIMASA TAKEDA: "Direct Reprogramming by Small Molecules for Regenerative Medicine", JOURNAL OF KYOTO PREFECTURAL UNIVERSITY OF MEDICINE, vol. 127, no. 1, 25 January 2018 (2018-01-25), pages 1 - 12, XP009522958, ISSN: 0023-6012 *
SCIENCE, vol. 352, 2016, pages 1216 - 1220
See also references of EP3747993A4

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021517574A (ja) * 2018-03-23 2021-07-26 サイトーＣｙｔｏｏ 骨格筋肥大誘発剤としてのａｌｋ５阻害剤
JP7653257B2 (ja) 2018-03-23 2025-03-28 サイトー 骨格筋肥大誘発剤としてのａｌｋ５阻害剤
CN112608883A (zh) * 2020-12-25 2021-04-06 武汉睿健医药科技有限公司 一种光感受器神经元细胞的化学诱导方法
CN112608883B (zh) * 2020-12-25 2023-02-24 武汉睿健医药科技有限公司 一种光感受器神经元细胞的化学诱导方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3747993A1 (en) 2020-12-09
EP3747993A4 (en) 2021-11-24
JPWO2019151097A1 (ja) 2021-01-14
CN111684059A (zh) 2020-09-18
US11834679B2 (en) 2023-12-05
US20200354680A1 (en) 2020-11-12
JP7586408B2 (ja) 2024-11-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7236114B2 (ja) 体細胞を製造する方法、体細胞、及び組成物
Imamura et al. Three-dimensional spheroids of mesenchymal stem/stromal cells promote osteogenesis by activating stemness and Wnt/β-catenin
AU2017308738B2 (en) Method for generating mesoderm and/or endothelial colony forming cell-like cells having in vivo blood vessel forming capacity
EP3116990B1 (en) Method for generating endothelial colony forming cell-like cells
Cancedda et al. Transit Amplifying Cells (TACs): a still not fully understood cell population
JP7586408B2 (ja) 心筋細胞の製造方法
CN114729312A (zh) 培养基用组合物
US12415986B2 (en) Production method for neuron-like cells
JP2017104091A (ja) 間葉系細胞の製造方法
JP6968347B2 (ja) 肝細胞の製造方法
Tan et al. Generation of clinical‐grade functional cardiomyocytes from human embryonic stem cells in chemically defined conditions
JP6989591B2 (ja) 多能性細胞の誘導及び自己再生並びにその使用
JP7248986B2 (ja) インスリン産生細胞の製造方法
JP7659240B2 (ja) 褐色脂肪細胞の製造方法
CN113015792A (zh) 胰岛素产生细胞的制造方法
WO2025114599A1 (en) Improved kidney organoid culture method by modulating pka
CN113039269A (zh) 胰岛素产生细胞的制造方法和组合物
HK40076615A (en) Brown adipocyte production method
HK40076615B (zh) 褐色脂肪细胞的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19746735

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019569055

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019746735

Country of ref document: EP

Effective date: 20200831