WO2019033248A1

WO2019033248A1 - 沉默人 miR-148a 、 miR-152 和 miR-424 表达的 Tud RNA 及其应用

Info

Publication number: WO2019033248A1
Application number: PCT/CN2017/097431
Authority: WO
Inventors: 毛吉炎
Original assignee: Shenzhen Biocan Technologies Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Biocan Technologies Co Ltd
Priority date: 2017-08-14
Filing date: 2017-08-14
Publication date: 2019-02-21
Anticipated expiration: 2020-02-14

Abstract

提供了一种沉默人mir-148a、miR-152和miR-424表达的Tud RNA及其应用。编码所述Tud RNA的DNA序列，如下所示：5'-ggcgctaggatcatcaacgttttgcactcatctcgcgacgatacaaagtcacgtactatctgtcttgaacccaaagtcacgtgatgatcttcttgaaacacaagtattctggtcacagaatacaacgttttgcactcatctcgcgacgatacaaagtcacgtactatctgtcttgaacccaaagtcacgtgatgatcttcttgaaacacaagatgatcctagcgccaccttttt-3'。沉默人mir-148a、mir-152和miR-424表达的Tud RNA的应用包括将Tud RNA构建于慢病毒载体上，得到含有Tud RNA的重组载体；将含有Tud RNA的重组载体作用于人源细胞，达到抑制人mir-148a、mir-152和miR-424的目的。

Description

说明书

发明名称：沉默人 miR-148a、 miR-152和 miR-424表达的 Tud RNA及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种 Tud RNA, 特别涉及一种沉默人 miR-148a、 miR-152和 miR-424 表达的 Tud RNA及其应用。

背景技术

[0002] MicroRNA (miRNA) 是在真核生物中发现的一类内源性的非编码 RNA，大小一般在 22-25 nt之间， miRNA广泛分布于植物、动物和多细胞生物中，并且能发挥重要的调节作用，而在人类 miRNA的研究中，发现 miRNA在正常组织和肿瘤组织中的表达有着显著差异，有些 miRNA会在肿瘤组织中有低表达，有些则在肿瘤组织中有高表达，这说明 miRNA在肿瘤发生过程中起了至关重要的作用。

[0003] miR- 148a是近几年研究得较多的一种 microRNA。据报道， miR-148a与外源性物质代谢、细胞凋亡、多种癌症的发生、发展和表观遗传等都密切有关； miR-1 52是一种具有多功能的 miRNA, 研究发现 miR- 152与甲基化相关，如与甲基转移酶 DNMT1含量和酶活性相关， miR-152可被子宫内膜癌 DNA甲基化变为沉默基因，并且其与多种癌症的发生发展相关，它是一种肿瘤抑制 microRNA, 与子痫前期、滋养细胞肿瘤、膀胱癌、胃肠癌、卵巢癌等诸多疾病相关； miR-424是一个长度为 22nt的 miRNA, 定位于人染色体 22ql l.21，在结肠癌、胃癌、食管癌、肺癌、肝癌等肿瘤的发生和侵袭等方面作为一个抑癌基因发挥重要作用，另外它一种甲基化相关的抑瘤性 miRNA, 可通过直接靶向 DNMT1的表达而影响全基因组的甲基化水平，进而调控某些基因的甲基化修饰状态，影响基因表达。通过控制 miR-148a、 miR- 152和 miR-424的表达，同吋与其他药物协同作用，能为治疗癌症提供新的表观遗传思路。

技术问题

[0004] MiRNA的功能研究主要通过 miRNA干扰和过表达技术完成。现有 miRNA干扰技术中， anti-miR和 antagomiR为瞬吋转染技术，其干扰效果不能稳定保持，而 m iRNA sponge效果远未达到最优，现有技术缺乏一种干扰效果好且能实现长期稳定干扰的技术。

[0005] Tough Decoy RNA (Tud RNA) 是一种新幵发出的 miRNA抑制手段，其通过引入双链 RNA对目标 miRNA进行吸附，达到抑制 miRNA的目的。由于弓 |入的 RNA 为双链并且带有茎环的二级结构，因此其够抵抗胞内核酸酶的降解，能长期、稳定和高效地抑制 miRNA

问题的解决方案

技术解决方案

[0006] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种沉默人 miR-148a

、 miR-152和 miR-424表达的 Tud RNA。

[0007] 本发明的另一目的在于提供上述沉默人 miR-148a、 miR-152和 miR-424表达的 Tu d RNA的应用。

[0008] 本发明的再一目的在于提供一种含有上述 Tud RNA的重组载体。

[0009] 本发明的目的通过下述技术方案实现：

[0010] 一种沉默人 miR-148a、 miR-152和 miR-424表达的 Tud

RNA, 编码所述的抑制人 miR-148a、 miR-152和 miR-424表达的 Tud RNA的 DNA 序列如下所示：

[0011] 5'- ggcgctaggatcatcaacgttttgcactcatctcgcgacgatacaaagtcacgtactatctgtcttgaacccaaagtcacgtga tgatcttcttgaaacacaagtattctggtcacagaatacaacgttttgcactcatctcgcgacgatacaaagtcacgtactatctg tcttgaacccaaagtcacgtgatgatcttcttgaaacacaagatgatcctagcgccaccttttt -3'°

[0012] 所述的沉默人 miR- 148a、 miR-152和 miR-424表达的 Tud RNA的应用，该应用包括将所述的 Tud RNA构建于慢病毒载体上，得到含有所述 Tud RNA的重组载体；将含有所述 Tud

RNA的重组载体作用于 HPC-Y5细胞，达到抑制 miR-148a、 miR- 152和 miR-424表达的目的；

[0013] 所述慢病毒载体为 pGLV3/Hl/GFP+Puro (pGLV3) 慢病毒穿梭载体；

[0014] 所述的含有所述 Tud RNA的重组载体的制备方法，包含以下步骤： [0015] ( 1) 设计含有抑制人 miR-148a、 miR-152和 miR-424表达的 Tud RNA的 DNA序歹 |J，如下所示：

[0016] 5，- ggcgctaggatcatcaacgttttgcactcatctcgcgacgatacaaagtcacgtactatctgtcttgaacccaaagtcacgtga tgatcttcttgaaacacaagtattctggtcacagaatacaacgttttgcactcatctcgcgacgatacaaagtcacgtactatctg tcttgaacccaaagtcacgtgatgatcttcttgaaacacaagatgatcctagcgccaccttttt -3'；

[0017] 为将其克隆到 pGLV3慢病毒穿梭载体上，合成以下正义链（F) 及反义链（R ) DNA序歹 'J :

[0018] Tud-148a-152-424正义链：

[0019] 5'-

GATCCggcgctaggatcatcaacgttttgcactcatctcgcgacgatacaaagtcacgtactatctgtcttgaacccaaag tcacgtgatgatcttcttgaaacacaagtattctggtcacagaatacaacgttttgcactcatctcgcgacgatacaaagtcacg tactatctgtcttgaacccaaagtcacgtgatgatcttcttgaaacacaagatgatcctagcgccacctttttG -3'；

[0020] Tud-148a-152-424反义链：

[0021] 5，-

AATTCaaaaaggtggcgctaggatcatcttgtgtttcaagaagatcatcacgtgactttgggttcaagacagatagtacgt gactttgtatcgtcgcgagatgagtgcaaaacgttgtattctgtgaccagaatacttgtgtttcaagaagatcatcacgtgacttt gggttcaagacagatagtacgtgactttgtatcgtcgcgagatgagtgcaaaacgttgatgatcctagcgccG -3，。

[0022] 上述正义链模板的 5'端添加了 GATCC , 与 BamHI酶切后形成的粘端互补；反义链模板的 5'端添加了 AATTC, 与 EcoRI酶切后形成的粘端互补；

[0023] (2) 将等量的正义链和反义链 DNA混合，进行退火，以形成 DNA双链，得到 Tud RNA模板；

[0024] (3) 将 pGLV3载体用 BamHI和 EcoRI双酶切，得到线性化的 pGLV3载体；

[0025] (4) 将步骤 (2)中的 Tud RNA模版和步骤 (3)中线性化的 pGLV3载体进行连接，得到重组载体 pGLV3-Tud-148a-152-424;

[0026] (5) 将重组载体 pGLV3-Tud-148a-152-424与包装载体 pGag/Pol、 pRev、 pVSV

-G共转染至 293T细胞，收集培养上清获得含有目的 Tud RNA的病毒颗粒，可用于转染目的细胞。发明的有益效果

有益效果

[0027] 本发明所述抑制人 miR-148a、 miR-152和 miR-424表达的 Tud RNA

能沉默人 miR-148a、 miR-152和 miR-424的表达。将所述抑制人 miR-148a、 miR-1 52和 miR-424表达的 Tud RNA构建于慢病毒载体上，不仅可有效作用于分裂及非分裂状态的细胞，也适用于体内及体外研究。

对附图的简要说明

附图说明

[0028] 图 1为 pGLV3载体的结构图；图 2各组细胞的 miRNA表达水平，其中， a.

miR- 148a的表达情况， b. miR-152的表达情况， c. miR-424的表达情况。

实施该发明的最佳实施例

本发明的最佳实施方式

[0029] 实施例一沉默人 miR-148a、 miR-152和 miR-424表达的 Tud RNA的设计与合成

[0030] 根据 TuD RNA设计序列和 miRBase中提供的 miR-148a、 miR- 152和 miR-424的序列信息，设计出同吋针对 miR- 148a、 miR- 152和 miR-424的 TuD RNA寡核苷酸序歹 |J，其序列为 5' - ggcgctaggatcatcaacgttttgcactcatctcgcgacgatacaaagtcacgtactatctgtcttgaacccaaagtcacgtga tgatcttcttgaaacacaagtattctggtcacagaatacaacgttttgcactcatctcgcgacgatacaaagtcacgtactatctg tcttgaacccaaagtcacgtgatgatcttcttgaaacacaagatgatcctagcgccaccttttt -3，。委托上海生工合成。

[0031] 为将其克隆到 pGLV3慢病毒穿梭载体上，设计以下正义链（F) 及反义链（R

) DNA序歹 'J :

[0032] Tud-148a-152-424正义链：

[0033] 5'-

GATCCggcgctaggatcatcaacgttttgcactcatctcgcgacgatacaaagtcacgtactatctgtcttgaacccaaag tcacgtgatgatcttcttgaaacacaagtattctggtcacagaatacaacgttttgcactcatctcgcgacgatacaaagtcacg tactatctgtcttgaacccaaagtcacgtgatgatcttcttgaaacacaagatgatcctagcgccacctttttG -3'； [0034] Tud-148a-152-424反义链:

[0035] 5'-

CGAGATGAGTGCAAAACGTTGATGATCCTAGCGCCG -3，。

[0036] 上述正义链模板的 5'端添加了 GATCC, 与 BamHI酶切后形成的粘端互补；反义链模板的 5'端添加了 AATTC, 与 EcoRI酶切后形成的粘端互补。

[0037] (2) 将等量的正义链（10 μΜ， 5 μΐ) 和反义链（10 μΜ， 5 μΐ) DNA混合，加入 90 μ1 (1(1Η2Ο，在 PCR仪上按照如下程序进行退火处理： 95°C 5 min，然后以每秒下降 O.rC的速率降至 25°C进行退火，最后 4°C保存备用。将退火后所得 Tud RNA模板溶液稀释 5倍，使其终浓度为 200 nM，用于连接反应。

[0038] (3) 将 pGLV3载体（吉玛基因股份有限公司）用 BamH I和 EcoR I双酶切，进行载体的线性化处理，酶切条件如下所述：将 pGLV3载体（10μ 、 BamH I内切酶（5 L， Fermentas)、 EcoR I内切酶（5 L， Fermentas)、 FastDigest buffer(8(VL ， TOYOBO)混匀，置于 37°C反应 1小吋，用凝胶回试剂盒（Axygen)回收线性载体片段，将其浓度稀释至 50ng^L。

[0039] (4) 将线性化的 pGLV3载体 1 μ1、经退火处理的 Tud RNA模版 1μ1、 Τ4 DNA 连接酶（NEB) 、 1μ1、 10xT4连接缓冲液（NEB) 2μ1、去离子水 15 μΓ混匀，于 4°C连接过夜。取连接产物 5 μ1转化大肠杆菌 ToplO感受态细胞，在含有 10(Vg/ml氨苄青霉素的 LB平板上于 30°C培养过夜。挑选长出的单克隆在含有 100 μ_§/ηι1氨苄青霉素的 LB液体培养基中于 30°C培养过夜，用质粒抽提试剂盒 (Omega

bio-tek) 纯化质粒，经测序验证后大量制备重组质粒 pGLV3-Tud-148a-152-424。

[0040] (5) 将重组载体 pGLV3-Tud-148a-152-424与包装载体 pGag/Pol、 pRev、 pVSV- G共转染至 293T细胞，收集培养上清获得含有目的 Tud RNA的病毒颗粒，可用于转染目的细胞。 [0041] 实施例二慢病毒转导 HPC-Y5细胞

[0042] 接种 HPC-Y5细胞于 6孔板中，每孔 1000000个细胞， 12h后细胞密度约为 50% ，分别取病毒液，用 DMEM完全培养基 10倍稀释病毒，再加入聚凝胺

(polybrene)至终浓度为 8 g/mL。去除 6孔板中的培养基，加入含病毒的 DMEM 完全培养基（含 10%胎牛血清)， 24h后弃去含病毒的 DMEM完全培养基，更换新鲜的 DMEM完全培养基， 24h后用 0.5 g/ml浓度的嘌呤霉素筛选细胞。筛选 10d, 每隔 3d更换培养基一次，并不断的增加嘌呤霉素的浓度至 1.0 g/ml。筛选获得的细胞株命名为 TuD-148a-152-424细胞株。

[0043] 实施例三荧光定量 PCR检测 miRNA的表达水平变化

[0044] 分别接种正常 HPC-Y5细胞、 TuD-148a-152-424细胞至 6孔板（每孔约 300000个 ) ，培养细胞约 24 h后至融合度 80%。用 miRcute miRNA提取分离试剂盒提取这些细胞的 miRNA，然后用 S-Poly(T) hsa-miR-148a qPCR-assay primer

set、 S-Poly(T) hsa-miR-152 qPCR-assay primer set和 S-Poly(T) hsa-miR-424 qPCR-assay primer

set试剂盒对 miRNA进行逆转录和加尾，得到相应的 cDNA。取 2种细胞的 cDNA 各 2 μί为模板，荧光定量 PCR检测 miR-148a、 miR-152和 miR-424表达水平的变化，实验重复 3次，每孔设置 3个平行样，以 snord 44作为内参。结果如图 2所示，可以看到与 TuD-148a-152-424细胞的 miR-148a的表达水平比 HPC-Y5细胞低 60<¾， m iR-152的表达水平比 HPC-Y5细胞低 62%， miR-424的表达水平比 HPC-Y5细胞低 5 9%。差异有统计学意义（/?<0.01) ，说明 TuD-148a-152-424细胞株构建成功。工业实用性

[0045] 本发明所述抑制人 miR-148a、 miR-152和 miR-424表达的 Tud RNA

Claims

权利要求书一种沉默人 miR-148a、 miR-152和 miR-424表达的 Tud RNA，其特征在于：编码所述 Tud RNA的 DNA序列如下所示： 5'- ggcgctaggatcatcaacgttttgcactcatctcgcgacgatacaaagtcacgtactatctgtcttgaaccca aagtcacgtgatgatcttcttgaaacacaagtattctggtcacagaatacaacgttttgcactcatctcgcgac gatacaaagtcacgtactatctgtcttgaacccaaagtcacgtgatgatcttcttgaaacacaagatgatcct agcgccaccttttt -3' ° 权利要求 1所述的 Tud RNA在制备 miR-148a、 miR-152和 miR-424功能研究的产品以及在制备 miR-148a、 miR-152和 miR-424有关疾病的靶向治疗药物中的应用。根据权利要求 2所述的 Tud RNA在制备 miR-148a、 miR-152和 miR-424 功能研究的产品以及在制备 miR-148a、 miR-152和 miR-424有关疾病的靶向治疗药物中的应用，其特征在于该应用包括将权利要求 1中所述的 DNA序列构建于慢病毒载体上，得到含有权利要求 1中所述 DNA 序列的重组载体。根据权利要求 3所述的 Tud RNA在制备 miR-148a、 miR-152和 miR-424 功能研究的产品以及在制备 miR-148a、 miR-152和 miR-424有关疾病的靶向治疗药物中的应用，其特征在于：所述慢病毒载体为 PGLV3慢病毒穿梭载体。根据权利要求 4所述的 Tud RNA在制备 miR-148a、 miR-152和 miR-424 功能研究的产品以及在制备 miR-148a、 miR-152和 miR-424有关疾病的靶向治疗药物中的应用，其特征在于：所述的含有权利要求 1中所述 DNA序列的重组载体的制备方法，包含以下步骤：

( 1) 设计含有抑制人 miR-148a、 miR-152和 miR-424表达的 Tud RNA 的 DNA序歹 ij，如下所示：

5，- ggcgctaggatcatcaacgttttgcactcatctcgcgacgatacaaagtcacgtactatctgtcttgaaccca aagtcacgtgatgatcttcttgaaacacaagtattctggtcacagaatacaacgttttgcactcatctcgcgac gatacaaagtcacgtactatctgtcttgaacccaaagtcacgtgatgatcttcttgaaacacaagatgatcct agcgccaccttttt -3'；

为将其克隆到 pGLV3慢病毒穿梭载体上，合成以下正义链及反义链 D NA序列：

Tud-148a- 152- 424正义链：

5，-

GATCCggcgctaggatcatcaacgttttgcactcatctcgcgacgatacaaagtcacgtactatctgtct tgaacccaaagtcacgtgatgatcttcttgaaacacaagtattctggtcacagaatacaacgttttgcactcat ctcgcgacgatacaaagtcacgtactatctgtcttgaacccaaagtcacgtgatgatcttcttgaaacacaa gatgatcctagcgccacctttttG -3'；

Tud-148a- 152- 424反义链：

5，-

AATTCaaaaaggtggcgctaggatcatcttgtgtttcaagaagatcatcacgtgactttgggttcaaga cagatagtacgtgactttgtatcgtcgcgagatgagtgcaaaacgttgtattctgtgaccagaatacttgtgtt tcaagaagatcatcacgtgactttgggttcaagacagatagtacgtgactttgtatcgtcgcgagatgagtg caaaacgttgatgatcctagcgccG -3'°

上述正义链模板的 5'端添加了 GATCC, 与 BamHI酶切后形成的粘端互补；反义链模板的 5'端添加了 AATTC, 与 EcoRI酶切后形成的粘端互补；

(2) 将等量的正义链和反义链 DNA混合，进行退火，以形成 DNA双链，得到 Tud RNA模板；

(3) 将 pGLV3载体用 BamHI和 EcoRI双酶切，得到线性化的 pGLV3 载体；

(4) 将步骤（2) 中的 Tud RNA模版和步骤 (3)中线性化的 pGLV3载体进行连接，得到重组载体 pGLV3-Tud-148a-152-424。