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WO2019016219A1 - Extraits racinaires de polygonum multiflorum et leurs utilisations - Google Patents

Extraits racinaires de polygonum multiflorum et leurs utilisations Download PDF

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Publication number
WO2019016219A1
WO2019016219A1 PCT/EP2018/069415 EP2018069415W WO2019016219A1 WO 2019016219 A1 WO2019016219 A1 WO 2019016219A1 EP 2018069415 W EP2018069415 W EP 2018069415W WO 2019016219 A1 WO2019016219 A1 WO 2019016219A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
extract
skin
roots
polygonum multiflorum
solvent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2018/069415
Other languages
English (en)
Inventor
Simon François DESLIS
Benoît Simon MIGNARD
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Plant Advanced Technologies PAT SAS
Original Assignee
Plant Advanced Technologies PAT SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Plant Advanced Technologies PAT SAS filed Critical Plant Advanced Technologies PAT SAS
Publication of WO2019016219A1 publication Critical patent/WO2019016219A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
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    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
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    • A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
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    • A61K2236/333—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using mixed solvents, e.g. 70% EtOH
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    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/74—Biological properties of particular ingredients
    • A61K2800/75—Anti-irritant

Definitions

  • the present invention is in the field of plant extracts and relates to a root extract of Polygonum multiflorum concentrated in THSG with no or very little emodin, a process for preparing such an extract and a cosmetic composition and a pharmaceutical composition or nutraceutical, said compositions comprising as active agent at least one root extract of Polygonum multiflorum according to the invention.
  • Polygonum multiflorum Thunb. A herbaceous plant of the Polygonaceae family, is one of the most popular plants of traditional Chinese medicine. Its dried root called Polygoni Multiflori Radix (RPM, Heshouwu in Chinese) is used in many preparations. In raw form it is used for many purposes including to help digestion (purgative).
  • RPM Polygoni Multiflori Radix
  • RPMP Radix Polygoni Multiflori Praeparata
  • the extract has immunological, anti-cancer, anti-inflammatory, neuroprotective and anti-hyperlipidemic effects
  • Application KR20150143375 discloses a cosmetic composition containing a Polygonum multiflorum adventitious root extract, exhibiting antioxidant activity, inhibition of collagenase expression, inhibition of elastase activities, and an anti-wrinkle effect.
  • Application KR20160123433 discloses a cosmetic composition containing a dried root extract of Polygonum multiflorum has antioxidant and anti-wrinkle properties as well as skin whitening (tyrorinase inhibiting activity), anti-inflammatory and anti-atopic properties.
  • THSG is supposed to be responsible for the activity of Polygoni Multiflori Radix. It has been identified as having anti-inflammatory and antioxidant activities, prophylactic and therapeutic properties against Alzheimer's disease (Lin et al., 2015). It also acts in the prevention and treatment of hair whitening (WO2016 / 101259).
  • Thunb-induced liver injury a Computational Systems Toxicology Approach "Wang YY, Li J, Wu ZR, Zhang B, HB Yang, Wang Q, Cai YC, Liu GX, WH Li, Tang Y. Acta Pharmacol Sin. 27, 719-732.)
  • anthraquinones like emodin, are considered part of the undesirable compounds of plants.
  • Aloe vera is a plant whose gel is marketed especially for cosmetic purposes.
  • the anthraquinones contained in the gel must be removed.
  • the international application WO2005 / 021018 describes a process using oxidases whose enzymatic activity allows the degradation of aloin and emodin present in the Aloe vera gel.
  • THSG As for other polyhydroxystilbenes, the biological activity is mainly related to its antioxidant powers which are related to its polyphenol groups. These groups are very unstable and the THSG is therefore likely to be oxidized and hydrolysed. It is therefore necessary to make extracts in which the molecule will have increased stability through the use of a solvent and an adequate pH.
  • a plant extract according to the invention has not only cosmetic benefits, such as the prevention or slowing down of skin aging, the stimulation of the renewal of the epidermis or having a soothing effect of the skin or a soothing effect of the skin, but also can be used as a medicine to stimulate the antimicrobial defense of the skin, to reduce or treat inflammation of the skin and / or to promote cutaneous healing, especially in the case of closing a wound.
  • Figure 3 Chromatograms (UV at 288 nm) of the root extract of Polygonum multiflorum obtained according to Example 1 (high) and the emodin standard at 10 mg / L (low).
  • Figure 4 Measurements of the viability of human keratinocytes NHEKs after 24h treatment with five different concentrations (3%, 1%, 0.33%, 0.11% and 0.037%) of an extract of Polygonum multiflorum prepared according to Example 1.4 (shaded dark gray), or its solvent alone at the same concentration (in light gray). The percentages of viability were calculated with respect to the untreated negative control (CTL NT) fixed at 100% and the positive cytotoxicity control (SDS at 0.008%). The histograms represent the average of 3 independent replicates and the error bar is the standard deviation around the mean.
  • CTL NT untreated negative control
  • SDS positive cytotoxicity control
  • THSG preferably at least 1.5%, more preferably at least 2%, expressed relative to the total weight of the dry extract
  • the subject of the present invention is a root extract of Polygonum multiflorum characterized in that:
  • That it comprises less than 0.01%, preferably less than 0.005%, preferably less than 0.001%, more preferably less than 0.0005% and even more preferably less than 0.0001% by weight of expressed emodin. relative to the total weight of the dry extract.
  • root extract of Polygonum multiflorum is meant a product obtained by the extraction of roots of plants of the species Polygonum multiflorum.
  • THSG concentrate is meant a root extract comprising a quantity of THSG that must not be less than 0.8%, expressed relative to the total weight of the dry extract.
  • THSG 2,3,5,4'-tetrahydroxystilbene-2-O-D-glucoside
  • dry extract is meant the extract obtained by the implementation of the process according to the invention followed by a step of desiccating the extract, the desiccation being implemented according to any method well known to those skilled in the art, in particular to place the extract in a hot and dry atmosphere.
  • no emodin is meant a quantity of emodin in the extract below the detection limit and not "very little emodin” is meant an amount of emodin in the extract less than the limit of quantification by supercritical phase chromatography or HPLC / MS.
  • the amount of emodin in the extract is lower than the limit of quantification by supercritical phase chromatography or by high performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry. (HPLC / MS).
  • the subject of the invention is a root extract of Polygonum multiflorum, more particularly chosen from:
  • a mixture of at least one extract obtained by root exudation in a first solvent and at least one extract obtained by root maceration in a second solvent is obtained.
  • the invention in a second aspect, relates to a process for preparing a root extract of Polygonum multiflorum according to the invention, comprising: a) a step of cultivation of Polygonum multiflorum in off-ground conditions, and particularly in aeroponics,
  • step b) optionally a step of stimulating the roots of the plants, c) a step of solid / liquid extraction of the roots optionally stimulated in step b), and
  • the term "cultivation of plants under soil conditions” means any method of cultivation in which the roots of the plant are not in the soil. More specifically, above-ground cultivation is a crop in which the roots of plants rest in a reconstituted environment, detached from the soil. This culture medium is irrigated regularly by nutrient solutions appropriate to the crop plant. There are different soilless cultivation techniques such as non-substrate systems that require an oxygen enriched nutrient solution, and substrate systems.
  • NFT Nutrient Film Technique
  • Substrate systems include the infra-structure in which the nutrient solution enters the substrate at the bottom and the percolation into which the nutrient solution is distributed by discontinuous irrigation to the upper surface of the system and then drowns downwards.
  • substrate mineral or organic, is neutral and inert like sand, clay or rockwool for example. This substrate can also be of industrial origin.
  • the term "cultivation of plants in aeroponics” means an aboveground culture mode for which the roots of the plants are not in contact with a solid medium or even with a liquid medium.
  • the plants are fed with a nutritive mist obtained by misting, via a mist, the nutrient solution in a closed medium.
  • plants can be arranged on trays with the aerial part of the plant above the tray and the root part below, the trays are arranged on tables forming a retention zone for collect the excess of a diffused liquid towards the plants, and one transfers the trays on the tables to different stations.
  • the plants cultivated in aeroponics are fed by root spraying with a nutritive solution of essential mineral salts (N - nitrogen, Phosphorus - P, Potassium - K), in order to obtain maximum root development and a maximum concentration of molecules of interest, without altering the survival of the plant.
  • essential mineral salts N - nitrogen, Phosphorus - P, Potassium - K
  • the skilled person with the help of his general knowledge, knows how to adapt the proportions and concentrations of different mineral salts to optimize the root development and concentration of the molecules of interest.
  • the mineral salt concentrations of the nutrient solutions are in this case included in a range of electroconductivity preferably ranging between 0.8 to 1.6 mS / cm, preferably between 1.0 to 1.2 mS / cm, so to promote a higher content of THSG in the extracts.
  • step c) of a process according to the invention is understood to mean any solvent extraction technique which consists in extracting a chemical species present in a solid and being soluble in said solvent.
  • extraction techniques include maceration, exudation, infusion, decoction, extraction with Soxhlet and Kumagawa extractors, microwave assisted extraction, ultrasound-assisted extraction. , enzymatic extraction, supercritical fluid extraction (CO2 + DPG).
  • the extraction leads to the recovery of the metabolites contained in one or the other part of the plants, and in particular the roots, by means of a leaching liquid, or solvent, brought into contact with the cut roots and / or attached to the plant, in a particular solvent and for a suitable duration.
  • step c) of solid / liquid extraction of the roots potentially stimulated during step b) is carried out by means of a process chosen from: exudation and a maceration.
  • step c) of solid / liquid extraction of the roots potentially stimulated in step b), is carried out by means of a method chosen from: exudation root and root maceration.
  • This step consists in particular of a "soaking" step, during which the roots of the plants are placed in a dipping tank containing a liquid for a predetermined duration.
  • the plants are arranged on a tray with the aerial portion of the plant above the tray and the root portion below, the tray is raised after soaking, and then the liquid in the soaking tray is collected.
  • the soaking step is followed by a cutting step in which the root portion of the plants is partially cut to harvest the cut roots. It is possible to extract the substances from the cut roots, in addition to extracting the substances during soaking.
  • the root exudation is carried out on roots still attached to the plant.
  • the root maceration is carried out on freshly cut roots, that is to say, cut for less than 24 hours, and preferably as soon as possible after cutting, ideally just after cutting, said roots being optionally dried after their section and before maceration.
  • the drying of the roots can be achieved by the implementation of any suitable drying process, known to those skilled in the art, and in particular by placing the roots at a temperature of between 40 ° C. and 60 ° C. for 4 hours, preferably in a dry environment.
  • the drying of the roots can in particular be carried out in a ventilated oven.
  • step c) of solid / liquid extraction of the potentially stimulated roots during step b), therefore comprises a step of drying roots cut before the maceration step.
  • step c) of a process according to the invention comprises bringing the roots into contact with a solvent chosen from: alcohols, glycerine, glycols and eutectic solvents.
  • a solvent chosen from: alcohols, glycerine, glycols and eutectic solvents.
  • Said alcohol is preferably chosen from ethanol and methanol, used pure or in the form of an aqueous solution of alcohol, the latter comprising from 10% to 99.9% of alcohol, more particularly between 40% and 90%, and even more particularly between 50% and 85%.
  • Said glycol is a diol in which the two hydroxyl groups are borne by different carbons, and is chosen from: dipropylene glycol, propane 1,3 diol, propane 1,2 diol and butylene glycol, and is used pure or in the form of an aqueous solution of glycol, the latter comprising from 10% to 99.9% of glycol, more particularly between 40% and 90%, and even more particularly between 50% and 85%.
  • Glycerin is used pure or in the form of an aqueous solution of glycerine, the latter comprising from 10% to 99.9% glycerine, more particularly between 40% and 90%, and even more particularly between 50% and 85%. %.
  • Said eutectic solvent is composed of two or more components, which may be solid or liquid and which, in a particular composition, exhibit a sharp decrease in their melting temperature, thereby rendering the mixture liquid.
  • Natural eutectic solvents are mainly composed of amino acids, organic acids, sugars and choline derivatives. Water may be part of the solvent, but in this case is strongly retained in the liquid and can not be evaporated.
  • choline-glucose chloride ratio 1: 1
  • choline chloride-citric acid ratio 1: 1
  • chloride of choline - citric acid (2: 1 ratio)
  • choline - sucrose chloride (4: 1 ratio)
  • choline - sucrose chloride (1: 1 ratio)
  • choline chloride - tartaric acid 2: 1 ratio
  • choline chloride - xylose 2: 1 ratio
  • butylene glycol is meant butane 1,2 diol, butane 1,3 diol, butane 2,3 diol and butane 1,4 diol.
  • solvents and more particularly glycerin, dipropylene glycol, 1,3-propane diol and 1,2-propane diol make it possible to promote selective extraction; that is, the extraction of a high THSG content, without extracting or extracting at a level very low or lower than the quantization threshold of emodin.
  • said first and second solvents may be identical or different.
  • step c) of a process according to the invention comprises bringing the roots into contact with a solvent chosen from: glycerol, dipropylene glycol, propane 1,3 diol and propane 1, 2 diol.
  • the solvent is characterized by an acidic pH, in particular when it is used during the solid / liquid extraction step.
  • said alcohol or said glycol used during a solid / liquid extraction step is characterized by a pH of between 1.5 and 5, preferably between 2 and 4.5, more preferably between 3 and 4. 5.
  • a plant extract according to the invention is characterized by a pH of between 2.5 and 5 and preferably between 3.5 and 4.5.
  • the use of a solvent at acidic pH that is to say greater than or equal to 1.5 and less than or equal to 5, promotes the solubilization of the compounds of interest in said solvent, limits the chemical or enzymatic degradation of the THSG during the extraction and, in combination with the choice of the solvent, to promote a selective extraction, that is to say the extraction of a high THSG content, without extracting emodin or extracting it at a content very low or lower than the quantization threshold.
  • the acids used for adjusting the pH of the solvent or extract are preferably lactic acid, phosphoric acid, citric acid or hydrochloric acid.
  • said glycol is selected from the following group: dipropylene glycol, propane 1,3 diol, propane 1,2 diol and glycerine.
  • Propane 1,3 diol, or trimethylene glycol can be prepared by chemical synthesis according to techniques known to those skilled in the art and described in the literature, it is also commercially available.
  • Said propane 1,3 diol may also be produced by the implementation of a fermentation process under suitable conditions of a living organism, in particular a genetically modified strain of Escherichia coli.
  • the propane 1,3 diol thus obtained is designated by the term "propane 1,3 diol biosourced", such a product is produced and then purified as described in particular in the international application WO 2004/101479 and marketed under the trademark Zemea®.
  • Said propane 1,3 diol may also have an organic certification, for example of COSMOS type.
  • step c) of solid / liquid extraction comprises bringing the roots into contact with propane 1,2 diol or with propane 1,3 diol, and in particular propane 1,3 diol biosourced and / or Bio certification.
  • step c) of a method according to the invention comprises bringing the roots into contact with a solvent for a period of between 15 minutes and 30 minutes for root exudation and for a period of time between 1 hour and 108 hours, especially between 24 hours and 96 hours, especially between 48 hours and 96 hours for root maceration.
  • the ratio of the amount of fresh roots to the amount of solvent varies between 0.2 kg roots / L solvent to 1 kg roots / L solvent.
  • a method according to the invention comprises a step of sectioning the roots and then drying the severed roots, prior to the step of macerating said roots, the maceration being carried out by placing the roots in contact with a solvent .
  • the ratio of the amount of dry roots to the amount of solvent varies between 0.1 kg roots / L solvent to 0.04 kg roots / L solvent.
  • the method according to the invention may therefore comprise a first root exudation step carried out by immersion in a solvent of the roots still attached to the plant for a period of between 15 minutes. at 30 minutes, followed by a step of root maceration of the cut roots of the plant, and then possibly dried.
  • the durations of root exudation and / or root maceration are chosen so as to favor the extraction of a large quantity of compounds of interest while not affecting the survival of the plant and without leading to the exhaustion of the plants. resources.
  • the plants, after the root exudation step and possibly after the root cutting step are put back into culture for 1 to 8 weeks in aeroponia according to steps a) and optionally submitted for 1 day to 8 weeks at a time.
  • stimulation stage b) in order to restart their root development and favor the production by the roots of secondary metabolites.
  • the subject of the invention is also a method for preparing a Polygonum multiflorum root extract according to the invention comprising:
  • step b) of stimulating plant roots comprises:
  • An elicitation step in which the roots are placed in the presence of a solution comprising at least one agent chosen from: a salt, a surfactant, a solvent, an elicitor of fungal or bacterial origin, a derivative of the acid jasmonic, in particular methyl jasmonate, salicylic acid, an ethylene generator, a chitin, chitosans and / or their mixture, and / or
  • a solution comprising at least one agent chosen from: a salt, a surfactant, a solvent, an elicitor of fungal or bacterial origin, a derivative of the acid jasmonic, in particular methyl jasmonate, salicylic acid, an ethylene generator, a chitin, chitosans and / or their mixture, and / or
  • a step of bringing the roots into contact with a solution deficient in nitrogen that is to say a solution comprising a proportion of nitrogen less than the proportion of nitrogen usually considered optimal for the development of the plant, advantageously less than 15% nitrogen, and advantageously not including nitrogen, said steps being sequential or simultaneous.
  • a solution deficient in nitrogen is a solution comprising less than 15% of nitrogen, preferably less than 10% of nitrogen, advantageously less than 8%, more advantageously less than 6%, less from 5%, less than 4%, less than 3%, less than 2%, less than 1% nitrogen and even more preferably 0% nitrogen.
  • Stage b) of stimulation makes it possible to significantly increase the yields of root biomass.
  • the step of stimulating Polygonum multi forum is carried out in nutrient media of different composition N / P / K.
  • the 0/15/40 medium offers adequate root productivity.
  • Medium 15/10/30 allows limited root growth with very short roots and little branching.
  • step b) of stimulating the roots is carried out by spraying or macerating the plant with a solution of elicitors chosen from jasmonic acid derivatives such as, for example, methyl jasmonate, salicylic acid, ethephon and chitosans or by feeding the plant with a nutrient solution N / P / K deficient in nitrogen vaporized on the roots.
  • a solution of elicitors chosen from jasmonic acid derivatives such as, for example, methyl jasmonate, salicylic acid, ethephon and chitosans
  • step b) is carried out by spraying or macerating the plant with a solution chosen from:
  • a nutrient solution N / P / K comprising less than 6% nitrogen, said solution preferably being sprayed on the roots.
  • step b) of stimulating the roots with a solution of elicitors is advantageously carried out for a period of between 1 day and 21 days, preferably between 1 and 7 days.
  • step b) of stimulating the roots by feeding the plant with a nutrient solution N / P / K deficient nitrogen vaporized on the roots is advantageously carried out for a period of between 7 days and 8 weeks preferably 3 weeks.
  • the mineral salt concentrations of the nutrient solutions are in a range of electroconductivity advantageously ranging between 0.8 to 1.6 mS / cm, preferably between 1.0 to 1.2. mS, to promote a higher THSG content of the extracts.
  • step b) is carried out after step a).
  • step b) and step a) are carried out simultaneously, the stimulation solution is then incorporated into the nutrient solution or administered by any other mode of administration. administration known to those skilled in the art.
  • the "soaking" step is preceded by a washing step in which the liquid diffused towards the plants is clear water. This limits the intake of the elements contained in the nutrient solution or in the possible stimulation solution during the soaking step.
  • the subject of the invention is a method comprising the following steps: a) a step of cultivation of polygonum multiflorum under off-ground conditions, and particularly in aeroponics,
  • step b) a step of solid / liquid extraction of the roots stimulated in step b), comprising:
  • said solvent which is identical or different in the first and second phases, is chosen from alcohols, glycerol, glycols and eutectic solvents, and being used in pure form or in the form of an aqueous solution of alcohol, of glycerine, glycol or eutectic solvent, and
  • the pH of the solvent is between 1.5 and 5, preferably between 2 and 5, preferably between 2 and 4.5, preferably between 3 and 4.5, more preferably between 3.5 and 4.5.
  • a method according to the invention advantageously comprises an additional step of readjusting the solvent content of the extract, to obtain an advantageous content of at least 50%, and / or an adjustment of the pH of the extract, to obtain a pH advantageously between 3 and 5, preferably approximately 4, for the preservation of the extract.
  • a method according to the invention advantageously comprises at least one additional step of purification and / or treatment of the plant extract, such a step is in particular chosen from:
  • At least one filtration in particular nanofiltration and / or sterilizing filtration and / or clarifying filtration,
  • This step makes it possible to obtain the final root extract of Polygonum multiflorum concentrated in THSG and containing no or very little emodin.
  • a chromatogram (FIGS. 2 and 3) of the analysis of a Polygonum multiflorum root extract obtained according to the invention shows that the THSG is predominantly present and that the emodin content is below the limit of quantification.
  • the present invention also relates to an extract that can be obtained by a process according to the invention.
  • the third subject of the present invention is a cosmetic composition comprising, as active agent, at least one root extract of Polygonum multiflorum according to the invention or an extract obtained by a process according to the invention, and at least one excipient.
  • the modes of administration, the dosages and the optimal dosage forms of a cosmetic composition according to the invention can be determined according to the criteria generally taken into account in the establishment of a cosmetic treatment adapted to a subject such as, for example, the type of skin.
  • the cosmetic composition according to the invention is advantageously intended for topical application. It may especially be in the form of a cream, a milk, a lotion, a gel, a serum, a spray, a mousse, a solution, an ointment, an emulsion, a patch or a mask.
  • a cosmetic composition according to the invention comprises at least one cosmetically acceptable excipient chosen according to the type of administration desired.
  • a cosmetic composition according to the present invention may further comprise at least one adjuvant known to those skilled in the art, chosen from thickeners, preservatives, perfumes, dyes, chemical or mineral filters, moisturizers, thermal waters, etc.
  • a cosmetically acceptable excipient may be chosen from polymers, silicone compounds, surfactants, rheology agents, humectants, penetration agents, oily components, waxes, emulsifiers, film-forming agents, perfumes, electrolytes, pH adjusters, antioxidants, preservatives, dyes, nacres, pigments and mixtures thereof.
  • a cosmetic composition according to the invention may further comprise at least one other cosmetically active agent, such as another anti-aging agent, a moisturizing agent, an agent having a calming, soothing or relaxing activity, a skin microcirculation stimulating agent. a sebum-regulating agent for the care of oily skin, a cleaning or purifying agent, an anti-radical agent, an anti-inflammatory agent, a chemical or mineral sunscreen, etc.
  • another cosmetically active agent such as another anti-aging agent, a moisturizing agent, an agent having a calming, soothing or relaxing activity, a skin microcirculation stimulating agent.
  • a sebum-regulating agent for the care of oily skin such as a cleaning or purifying agent, an anti-radical agent, an anti-inflammatory agent, a chemical or mineral sunscreen, etc.
  • a cosmetic composition according to the invention comprises at least one root extract of Polygonum multiflorum according to the invention, in a quantity of between 0.01 and 10%, in particular between 0.05 and 5%, more particularly between 0, 1 and 2%, more particularly between 0.5 and 1%, by weight relative to the total weight of the composition.
  • the fourth subject of the present invention is an extract according to the invention, an extract obtained by a process according to the invention, or a cosmetic composition according to the invention, for preventing or slowing skin aging, and / or for stimulating the renewal of skin aging. the epidermis and / or stimulate the antimicrobial defense of the skin, more particularly the antibacterial defense of the skin and / or have a soothing effect of the skin or a soothing effect of the skin following the sensation of irritation.
  • a cosmetic composition according to the invention may in particular be intended to prevent or slow skin aging.
  • a cosmetic composition according to the invention may also be intended to stimulate the renewal of 1' providedderme.
  • a cosmetic composition according to the invention may especially be intended to have a soothing effect on the skin or a soothing effect of the skin following the sensation of irritation that may develop after shaving, friction, or contact with the skin. allergens
  • the fifth subject of the present invention is a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, as active agent, at least one extract according to the invention or an extract obtained by a process according to the invention, and at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • the present invention also has for sixth object a nutraceutical composition
  • a nutraceutical composition comprising, as active agent, at least one extract according to the invention or an extract obtained by a process according to the invention, and at least one nutraceutically acceptable excipient.
  • the term "pharmaceutically or nutraceutically acceptable” means any ingredient which is useful in the preparation of a pharmaceutical or nutraceutical composition, which is generally safe, non-toxic and neither biologically nor otherwise undesirable and which is acceptable to a pharmaceutical or nutraceutical composition. veterinary use or in humans.
  • salts which are pharmaceutically or nutraceutically acceptable, as defined above, and which possess the desired pharmacological activity of the parent compound.
  • Such salts include:
  • pharmaceutically or nutraceutically acceptable acid addition salts formed with pharmaceutically or nutraceutically acceptable inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid and the like; or formed with pharmaceutically or nutraceutically acceptable organic acids such as acetic acid, benzenesulfonic acid, benzoic acid, camphorsulfonic acid, citric acid, ethanesulfonic acid, fumaric acid, glucoheptonic acid, gluconic acid, glutamic acid, glycolic acid, hydroxynaphthoic acid, 2-hydroxyethanesulphonic acid lactic acid, maleic acid, malic acid, mandelic acid, methanesulfonic acid, muconic acid, 2-naphthalenesulfonic acid, propionic acid, salicylic acid, succinic acid, dibenzoyl-L-tartaric acid, tartaric acid, p-toluenesulfonic acid, trimethyl
  • compositions formed when an acidic proton present in the parent compound is either replaced by a metal ion, for example an alkali metal ion, an alkaline earth metal ion or a aluminum ion; is coordinated with a pharmaceutically or nutraceutically acceptable organic or inorganic base.
  • Acceptable organic bases include diethanolamine, ethanolamine, N-methylglucamine, triethanolamine, tromethamine and the like.
  • Acceptable inorganic bases include aluminum hydroxide, calcium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate and sodium hydroxide.
  • the modes of administration, the dosages and the optimal dosage forms of a pharmaceutical composition according to the invention can be determined according to the criteria generally taken into account in the establishment of a pharmaceutical treatment adapted to a subject such as, for example, age or body weight of the patient, severity of his general condition, tolerance to treatment, side effects noted, skin type.
  • the pharmaceutical composition according to the invention may further comprise at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may further comprise at least one adjuvant pharmaceutically known to a person skilled in the art, chosen from thickeners, preservatives, perfumes, dyes, chemical or mineral filters, moisturizing agents, water thermal baths, etc.
  • said pharmaceutical composition comprises at least one extract according to the invention in an amount of between 0.01 and 10%, in particular between 0.05 and 5%, more particularly between 0.1 and 2%, more particularly between 0. , 5 and 1%, by weight relative to the total weight of the composition.
  • a pharmaceutical composition is particularly suitable for oral, nasal, transdermal, parenteral, topical, rectal and mucosal administration. It may be in dry form, such as for example: soft capsule, capsule, tablet, lyophilisate, powder, granule, or patch, or in liquid form, such as: solution, suspension, spray, cream or gel.
  • the pharmaceutically acceptable excipient is known to those skilled in the art and is chosen according to the method of administration of the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutically acceptable excipient may be chosen from the group consisting of diluents, binders, disintegrants, dyes, lubricants, solubilizing agents, absorption promoters, film-forming agents and gelling agents. , and their mixtures.
  • the pharmaceutical composition according to the invention may further comprise at least one compound chosen from the group consisting of emollients, moisturizing active agents, activators of keratin synthesis, kératorégulateurs, keratolymila, agents restructuring the cutaneous barrier ( skin lipid synthesis activators, PPAR agonists or Peroxysome Proliferator Activated Receptor), activators of keratinocyte differentiation (retinoids, calcidone®, calcium), antibiotics, anti-bacterial agents, antifungal compounds, anti-cancer agents -serials, sebum-regulators, immunomodulators, such as tacrolimus, pimecrolimus, oxazolines, preservatives, anti-irritants, soothing agents, filters and sunscreens, anti-oxidants, growth, healing agents or eutrophic molecules, drugs and anti-inflammatory agents, drugs and anti-Alzheimer's agents.
  • the subject of the present invention is an extract according to the invention or a pharmaceutical composition according to the invention for
  • the subject of the present invention is also an extract according to the invention, an extract obtained by a process according to the invention, or a pharmaceutical composition according to the invention or a nutraceutical composition according to the invention 7 for its use as a as a medicament for stimulating the antimicrobial defense of the skin, and / or for alleviating or treating inflammation of the skin and / or for promoting skin healing, particularly in the case of closure of a wound.
  • the subject of the present invention is also an extract according to the invention, an extract obtained by a process according to the invention, or a pharmaceutical composition according to the invention, for its use as a medicament for preventing or slowing down aging. skin, and / or to stimulate the renewal of the epidermis, and / or to have a soothing effect of the skin or a soothing effect of the skin following the sensation of irritation.
  • said extract will advantageously be associated with a pharmaceutically acceptable excipient and suitable for cutaneous application
  • said pharmaceutical composition will advantageously contain a pharmaceutically acceptable excipient suitable for cutaneous application.
  • the subject of the present invention is also a use of an extract according to the invention, an extract obtained by a process according to the invention for the preparation of a cosmetic composition intended to prevent or delay the appearance of the effects of aging of the skin. skin, and / or to stimulate the renewal of the epidermis and / or to have a soothing effect or a soothing effect of the skin following the sensation of irritation.
  • the present invention thus relates to the application, as a cosmetic product, of an extract according to the invention, or of an extract obtained by a process according to the invention, for preventing or delaying the appearance of effects of aging of the skin, and / or stimulate the renewal of the epidermis and / or have a soothing effect or a soothing effect of the skin following the sensation of irritation.
  • the present invention also relates to a cosmetic skin care method aimed at preventing or delaying the appearance of the effects of aging of the skin, and / or stimulating the renewal of the epidermis, and / or having a soothing effect of the skin or a calming effect of the skin following the sensation of irritation, said method being characterized in that it comprises the application, on at least a part of the skin of the body or the face, of a composition cosmetic according to the invention.
  • the cosmetic composition is applied to a subject in need thereof, in particular in anticipation of or following a single or repeated exposure of the skin to oxidative stress. Indeed, the latter can generate an excess of free radicals that can accelerate the signs of skin aging.
  • the invention relates to a method for preventing or slowing skin aging, for ameliorating inflammation of the skin, for having a soothing effect on the skin or for a soothing effect of the skin following the sensation of irritation, for to stimulate the antimicrobial defense of the skin, more particularly the antibacterial defense of the skin and / or to promote cutaneous cicatrization, in particular in the case of closure of a wound, in a subject in need, including administration to the skin, subject of a therapeutically effective amount of a nutraceutical composition according to the invention or a pharmaceutical composition according to the invention.
  • the plants are initially cultured for 8 weeks with a culture medium 15/10/30 (N / P / K) on 16m 2 pilots.
  • 4 stimulation media were tested, including the initial culture medium. These are ternary fertilizers usually used in horticulture and whose composition differs according to their ratio N / P / K (nitrogen / phosphorus / potassium).
  • the 4 methods are as follows: 0/15/40; 15/10/30; 20/20/20 and 28/14/14. Each category is repeated 3 times according to a random distribution. The plants were grown with different media for 4 weeks.
  • Plants of Polygonum multiflorum are grown in aeroponia with a defined nutrient solution, of composition N / P / K corresponding to 15/10/30 and at an electroconductivity of between 1.0 and 1.2 mS / cm for 8 weeks, then with a defined nutrient solution of composition N / P / K corresponding to 0/15/40 and an electroconductivity of between 1.0 and 1 , 2 mS / cm for 3 weeks.
  • the roots are cut and then 500 g of fresh roots are macerated for 48 hours at room temperature in 1 L of different aqueous solvent solution at 70/30 (solventl / water - v / v) at an acidic pH of 1.6 and at an unadjusted pH, i.e. between 5 and 7.5. After maceration, the roots are removed from the solvent.
  • the four solvents tested are glycerine, dipropylene glycol, propane 1,3 diol biosourced (Zemea ®) and propane 1,2 diol.
  • the content of emodin in the root extracts is analyzed by HPLC-MS (PDA detector, 254 nm).
  • the emodin content in the extracts made with the 4 solvents namely dipropylene glycol, propane 1,2 diol, Zemea® and glycerol at the two pHs tested is below the limit of detection of emodin.
  • the stability test consists of placing a sample of Polygonum multiflorum root extract in the dark at 40 ° C for 6 months. Regular samples are taken to follow the evolution of the THSG content of the extracts by liquid chromatography (HPLC-XR-Prominence, Shimadzu). A standard of 2, 3, 5, 4'-tetrahydroxystilbene-2-0-beta-D-glucoside (THSG) at ⁇ is injected into each analysis sequence in order to normalize the data.
  • THSG 2, 3, 5, 4'-tetrahydroxystilbene-2-0-beta-D-glucoside
  • Plants of Polygonum multiflorum are grown in aeroponia with a defined nutrient solution, composition N / P / K corresponding to 15/10/30 and electroconductivity of between 1.0 and 1.2 mS / cm for 8 weeks, then with a defined nutrient solution, composition N / P / K corresponding to 0/15/40 and electroconductivity of 1.0 and 1.2 mS / cm for 3 weeks.
  • the roots are cut, then a root extract is obtained by maceration for 48 hours of 500 g of fresh roots in 1 L of 70% Propylene glycol whose pH (before maceration) was adjusted to the value of 2.8 using 3 M citric acid.
  • the pH of the root extract after extraction was then readjusted with 3M citric acid or 5M sodium hydroxide at three different pHs: pH 2.8; pH 4.0 and pH 6.8.
  • a root extract of Polygonum multiflorum concentrated in THSG and comprising an amount of emodin lower than the limit of quantification by high performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry (HPLC / MS), is obtained according to the following method:
  • the extract is concentrated by nanofiltration and clarified by clarifying filtration, and
  • THSG 2,3,5,4'-tetrahydroxystilbene-2-O-D-glucoside
  • SML0834 St. Quentin Fallavier, France
  • emodin (6-methyl-1,3,8-trihydroxyanthraquinone) is carried out using a standard range prepared from commercial standards provided by Shanghai Tuto Biotech Co LTD, reference: E-0053 (CHINA) solubilized in the solvent DMSO / water miliQ pH 3.0 (70/30 vol, pH adjusted with 2N HCl).
  • FIG. 2 and FIG. 3 show chromatograms of the Polygonum multiflorum root extract obtained according to Example 1.
  • the apparatus used to analyze the extract is a Shimadzu Nexera X2 HPLC (the LC-30AD pumps, which are the sample SIL-30AC, CTO-20A furnace, SPD-M20A diode array detectors, Kyoto, Japan) operating in reverse phase with a Kinetex biphenyl column (00F-4622-AN, Phenomenex, Torrance, CA, USA) of dimensions 150 mm x 2.1 mm, 2.6 ⁇ m.
  • the mobile phase consists of a solvent A (Mili-Q ultrapure water, Merck Millipore + 0.1% formic acid, Carlo Erba, Val-de-Reuil, France) and a solvent B (Acetonitrile, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Germany) whose gradient was programmed as follows:% B: 5-31.4% (0-6 min), 31.4-90% (6-6.1 min), 90% (6.1-7.9 min), 90-5% (7.9-8.0 min), 5% (8-10 min).
  • the analysis rate is 0.5 mL / min with an oven temperature of 40 ° C.
  • a diode array detector records the UV spectra between 220 and 370 nm.
  • the device is coupled to a mass spectrometer (Shimadzu LCMS-2020) operating with electrospray ionization (4.5 kV) in positive and negative mode in a range of m / z between 100 and 1000.
  • the software LabSolutions (version 5.60 SP2) is used to operate the system.
  • the extract to be analyzed is filtered on a 0.2 ⁇ m filter before injection.
  • the chromatogram shows a majority peak for a retention time around 4.40 min corresponds to the THSH.
  • no peak is detected for a retention time at around 8.9 ( ⁇ 5%) min corresponding to the emodin standard, confirming that the amount of emodin in the extract is below the limit. of quantification.
  • EXAMPLE 2 CHARACTERIZATION OF A ROTARY EXTRACT OF POLYGONUM MULTIFLORUM WITH RESPECT TO A BENEFIT FOR THE SKIN - IDENTIFICATION OF TARGETS BY ANALYZING MODIFICATIONS OF GENE EXPRESSION BY QRT-PCR ON TAQMAN CARDS
  • the study consists in measuring the effects of the Polygonum multiflorum root extract by qRT-PCR on microfluidic TaqMan maps, on the one hand, on the expression of 94 genes involved in the dermal biology, the remodeling of connective tissues and aging ("Dermal Benefits" card defined by the StratiCELL company) and, on the other hand, the expression of 94 genes involved in the key functions of the epidermis, such as the barrier function directly related to hydration , the antioxidant response, or pigmentation by melanocytes ("Epidermal Benefits" card defined by StratiCELL).
  • the protocol consisted in adding Polygonum multiflorum root extract in the monolayer human fibroblasts NHDFs (Normal Human Dermal Fibroblasts) and reconstituted melanized human epidermis (RHE / MEL / 001), and after h, to analyze the different RNA populations to identify genes differentially expressed by qRT-PCR.
  • NHDFs Normal Human Dermal Fibroblasts
  • RHE / MEL / 001 melanized human epidermis
  • a preliminary cytotoxicity study defined the working concentration of the Polygonum multiflorum root extract for the gene expression study.
  • TGF- ⁇ Transforming Growth Factor-beta-1
  • vitamin D3 1 ⁇ , 25-dihydroxyvitamin D3
  • the Polygonum multiflorum plants are cultivated in aeroponics according to Example 1.
  • the fresh roots are cut and macerated at room temperature for 48 hours in a 70/30 ethanol / water-v / v solution at 500 g. of roots for one liter of solvent and at an unadjusted pH.
  • the extract is filtered.
  • the solvent is removed using a rotary evaporator and the powder dried in a desiccator.
  • Cellular culture carried out according to the protocol described in Example 1.4, made it possible to verify that the emodin content is below the limit of quantification and that the THSG is present mainly in the extract.
  • the first part of the study was performed on NHDFs human dermal fibroblasts (ATCC, CRL-2522, origin: foreskin) grown in a monolayer in DMEM medium (Invitrogen, 31885-049) containing antibiotics (Penicillin / Streptomycin, Invitrogen , 15140-122) but not containing serum. These cells were maintained in a humid atmosphere at 37 ° C containing 5% CO 2.
  • the second part of the study was performed on reconstituted epidermis (StratiCELL®, RHE / MEL / 001) with or without primary human NHEMs melanocytes (Normal Human Epidermal Melanocytes) from a dark phototype donor (phototype IV to V) (Invitrogen, C2025C, batch No. 439684).
  • the tissues were cultured at the air-liquid interface for 14 days in a suitable culture medium, and a humid atmosphere at 37 ° C containing 5% CO 2. Determination of the range of study concentrations of Polygonum multiflorum root extract by a preliminary cytotoxicity study
  • NHDFs fibroblasts performed 30.1 and 30.7 population doublings and NHEM melanocytes were seeded in 24-well plates 24 h prior to application of the actives.
  • Reconstituted epidermis (RHE / 001, lot CB0314 / 2) was transferred to a 12-well plate before being treated with the extract.
  • the extract was diluted in the culture medium and then added, without prior filtration, into the culture medium of the human fibroblasts NHDFs containing no serum, in the medium of the primary human melanocytes NHEMs, or in the culture medium of the differentiated epidermis.
  • NHDFs fibroblasts and melanocytes NHEMs: 0.16 Mg / ml, 0.8 Mg / ml, 4 Mg / ml, 20 Mg / ml, 100 Mg / ml;
  • the extract was added, at a selected concentration, in the culture medium of the human fibroblasts NHDFs (having carried out 30.5 and 30.8 doublings of population) in the absence of serum or in the culture medium of the differentiated melanized epidermis ( RHE / MEL / 001, lots CB0314 / 3 and CB0314 / 4), without filtration prior to contacting the cells / epidermis.
  • TGF- ⁇ for NHDF fibroblasts
  • VD3 vitamin D3
  • RNA qualification by Spectrophotometry and Capillary Electrophoresis was performed using the RNeasy Mini kit (Qiagen, 74106). 24 h after the addition of the extract, the cells were rinsed with PBS and lysed in the ad hoc lysis buffer, while the epidermis were directly immersed in this buffer (culture triples were made for each condition ). The extraction and purification of the RNAs were performed according to the instructions of the supplier. Total RNAs were then stored at -80 ° C. RNA Qualification by Spectrophotometry and Capillary Electrophoresis
  • RNA concentration was determined by spectrophotometric measurement. The quality and integrity of the RNAs were then verified by capillary electrophoresis (Agilent Bioanalyzer 2100 Platform - Agilent RNA 6000Nano Kit, 5067-1511).
  • RNA quantification by spectrophotometric measurement an aliquot of each RNA was diluted in RNase-free water and its concentration was determined using an Ultrospec 1100 Pro spectrophotometer (Amersham).
  • RNA Integrity by Capillary Electrophoresis on Agilent Bioanalyzer The Integrity of Total RNA was Evaluated by Peak Visualization electrophoresis corresponding to the ribosomal RNAs.
  • ribosomal band size should be 1.9 kb for 18S-RNA and 4.7 kb for 28S-RNA.
  • the intensity of the band corresponding to the 28S-RNA must be greater than the intensity of the band corresponding to the 18S-RNA.
  • Small diffuse bands representing lower molecular weight RNAs tRNA and 5S ribosomal RNA may be present. When the RNA is degraded, banding of the ribosomal RNA and a background of the higher molecular weight RNAs are observed.
  • RNA-to-cDNA Kit Applied Biosystems, 4387406
  • cDNA synthesis a mix was prepared according to the supplier's instructions, with 2 ⁇ g of total RNA, the ad hoc buffer provided in the kit and the reverse transcriptase enzyme. This reaction was carried out at 37 ° C for 1 hour, then 5 minutes at 95 ° C and finally the cDNA samples were set on ice and stored at -20 ° C.
  • the real-time qPCR method was used to quantify the expression of different specific targets in the NHDF fibroblast populations treated with TGF- ⁇ (20 ng / ml) as well as melanized epidermides treated with vitamin D3. ( ⁇ ) and ethanol solvent (0.1% EtOH), used to solubilize VD3.
  • the target sequences of the genes of interest were amplified by PCR using "TaqMan Gene Expression Assays" (Applied Biosystems). These kits include a TaqMan probe and 2 specific primers, which have been premixed at a concentration of 18 ⁇ for each primer and 5 ⁇ for the probe. This mixture is concentrated 20 times.
  • the TaqMan probes were grafted with a fluorophore (FAM) at the 5 'end of the sequence and with a 3' fluorescence quencher.
  • FAM fluorophore
  • PCRs were performed using the 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems). The reactions were carried out in a volume of 20 ⁇ _. The reaction mixture contains 10 ⁇ l of TaqMan Fast Universal Master Mix (Applied Biosystems), 1 ⁇ l of TaqMan Gene Expression Assay and 5 ⁇ l of RNase-free water.
  • the relative quantitation of the transcripts was carried out by the use of a calculation method which consists in comparing the average of the control values (Ct) obtained for the TGF- ⁇ (20 ng / ml) and VD3 ( ⁇ ) conditions with the respective control conditions (untreated CTL and 0.1% CTL ethanol). These Ct represent the detection threshold at which the amount of DNA is such that the signal differs significantly from the background noise.
  • This average Ct value was normalized to a household gene, namely Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) for NHDF fibroblasts and ⁇ 2-microglobulin (B2M) for reconstituted melanized epidermis.
  • GPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • B2M ⁇ 2-microglobulin
  • PCR reaction mixtures on TaqMan microfluidic cards were prepared following the detailed instructions in the Applied Biosystems Micro Fluidic Card Getting Started Guide.
  • 100 ng of cDNA was added to a specific PCR mix (Taqman Universal Master PCR Mix, 4364338, Applied Biosystems) before being injected into the map and dispersed by capillarity. After centrifugation, the card was sealed prior to performing quantitative PCR and analysis with the Applied Biosystems 7900HT system, using the ABI PRISM® 7900 Sequence Detection System, SDS2.4 software.
  • the threshold cycles (Ct) were obtained for all the genes represented on the maps and expressed by the melanized reconstructed NHDF fibroblasts and epidermis.
  • the results were exported from the real-time qPCR device using the SDS RQ Manager software (v1.2.1, Applied Biosystems) and the analysis of the expression modifications was performed using the Data Assist software ( V3.0., Applied Biosystems) designed to perform the relative quantification of gene expression using the Ct ( ⁇ :) comparison method (Pfaffl, 2001 and Livak and Shmittgen, 2001) described in the paragraph above and a combination of statistical analyzes.
  • the calculation method of ⁇ : consists of comparing the Ct values obtained for the conditions treated by the extract with the reference condition (DMSO control).
  • RNA populations demonstrate the presence of narrow peaks, corresponding to the 18S and 28S ribosomal RNAs, and a balanced ratio between the two peaks.
  • NTRK2 growth 0.57 0.0038
  • Table 2 List of genes that vary significantly 24 hours after the application of the Polygonum multiflorum root extract (at 100 ⁇ g ES / ml) on human dermis fibroblasts NHDFs.
  • the gene symbol, the gene name, the relative expression (RQ) with respect to the 1% DMSO vehicle (RQ> 1: increase) and the p value (p-value) are presented.
  • the root extract of Polygonum multiflorum remarkably induces the expression of the superoxide dismutase 2 (SOD2) gene (X 13.8).
  • SOD2 superoxide dismutase 2
  • This regulation is coupled with the overexpression of other genes involved in the oxidative stress response, such as HMOX1 (heme oxygenase 1 (XI, 8)), TXRND1 (thioredoxin reductase 1 (XI, 5)), NQO1 (NAD (H ) dehydrogenase, quinone 1 (XI, 6)) and G6PD (Glucose-6-phosphate dehydrogenase (X1.2)).
  • HMOX1 heme oxygenase 1 (XI, 8)
  • TXRND1 thioredoxin reductase 1 (XI, 5)
  • NQO1 NAD (H ) dehydrogenase, quinone 1 (XI, 6)
  • G6PD Gluco
  • Superoxide dismutase 2 encoded by the SOD2 gene is a mitochondrial protein implicated in the first line defense against reactive oxygen species (ROS). Indeed, it converts the anion superoxide hydroperoxide which itself is converted into oxygen and water by catalase and peroxypedoxins.
  • ROS reactive oxygen species
  • the HMOX1 gene encoding the HO-1 protein or heme oxygenase is often overexpressed in response to stress, and plays a crucial role in protecting and maintaining cellular homeostasis.
  • the HO-1 protein is involved in the degradation of Theme (having prooxidant properties) in carbon monoxide, ferrous iron and biliverdin. These last 2 components are the precursors of the antioxidants bilirubin and ferritin. HMOX1 is therefore known for its protective role against oxidative stress.
  • the thioredoxin system is one of the major antioxidant defense systems.
  • thioredoxin reductase catalyzes the transfer of electrons from NADPH (Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate) to thioredoxin, which itself has a reducing effect on various target proteins.
  • NADPH Natural Acidamide Adenine Dinucleotide Phosphate
  • the isoform 1 encoded by the TXRND1 gene is the most studied. It is known to be in particular under the transcriptional control of the Nrf-2 transcription factor playing a major role in the antioxidant defense.
  • NAD (H) dehydrogenase, quinone 1 (NQO1) is another detoxifying enzyme that promotes, by reduction, the formation of hydroquinones from quinones, preventing the production of radical species.
  • the NQO1 gene is overexpressed in response to pro-oxidants, heavy metals, UV or ionizing radiation to protect the cell from its harmful effects.
  • Glucose-6-phosphate dehydrogenase encoded by the G6PD gene is the first enzyme in the pentose phosphate pathway. It catalyzes the oxidation of glucose-6-phosphate to 6-phosphoglucono-5-lactone. This reaction is coupled with the reduction of a NADP + molecule to NADPH, necessary for the reduction of glutathione GSSG (oxidized form) to glutathione GSH (reduced form), a powerful antioxidant.
  • the root extract of Polygonum multiflorum induces the expression of the COL3A1 gene (X1.5) which codes for the alpha-1 subunit of type III collagen, and of the CYR61 gene (X1.5) which codes for a MEC CYR 61 protein for "cysteine-rich angiogenic protein 61".
  • the CYR61 protein is expressed at inflammatory sites and cutaneous wounds where it induces the production of new extracellular matrix.
  • Fibrillar collagens are by far the most abundant protein in the skin, constituting more than 90% of its dry weight. Type I collagen accounts for 60 to 80% of collagen in the dermis and hypoderm while collagen type III (COL3A1) accounts for 15 to 25% and type V collagen for 2 to 5%.
  • Collagens of type I, III, and V self-assemble into thicker fibers to form a three-dimensional network throughout the thickness of the dermis.
  • collagen III (COL3A1) plays a structural role at the level of the ECM and therefore in the resistance and elasticity of the dermis.
  • Induction of the COL3A1 gene by the extract may be of interest for an anti-aging strategy to reduce dermal degradation with age ⁇ Neurotrophins and pain perception
  • NTRK2 X0.6
  • NGFR NGFR
  • the latter code for neurotrophin receptors, responsible for the sensation of pain. Under-expression of these genes could promote a soothing effect of the skin or a calming effect of the skin due to an inflammatory condition or irritation that develops after shaving, friction, or contact with allergens.
  • Neurotrophins are part of a family of growth factors controlling the development, maintenance and apoptosis of neuronal cells. Neurotrophins also exert multiple non-neuronal functions: they regulate proliferation and cell differentiation, apoptosis and tissue remodeling, especially in the skin. Dermal fibroblasts and myofibroblasts synthesize and secrete neurotrophins such as Nerve Growth Factor (NGF), Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or neurotrophin-3 (NT- 3). The effects of neurotrophins are mediated by their receptors also expressed by fibroblasts. There are two classes of receptors: receptors of the tyrosine kinase receptor (Trk) family and the p75 neurotrophin receptor (p75 NTR or NGFR).
  • Nrk tyrosine kinase receptor
  • p75 NTR or NGFR neurotrophin receptor
  • TrkB encoded by the NTRK2 gene specifically binds BDNF as well as NT-3 and NT-4.
  • P75 NTR is able to bind all neurotrophins.
  • NGF neurotrophic factor
  • the extract promotes a soothing effect of the skin or a calming effect of the skin due to an inflammatory condition or irritation that develops after shaving, friction, or contact with allergens.
  • the root extract of Polygonum multiflorum induces the expression of the CCL5 gene, encoding the chemokine (C-C motif) ligand 5, also called RANTES.
  • This chemokine has been shown to play an important role in the skin healing process. She is involved in the migration of dermal stem cells (DSC) to the skin lesion site. This process is essential for re-epithelialization, repopulation of fibroblasts in the dermis and angiogenesis.
  • DSC dermal stem cells
  • MMPs are metalloproteinases capable of cleaving most of the components of the ECM and modifying, by proteolysis, many molecules important for skin healing.
  • MMP1 plays a major role in the re-epithelialization of keratinocytes.
  • MMPl facilitates assembly of ECM, cell elongation and migration, actin cytoskeleton reorganization, and induces ERK kinase activation (extracellular signal-regulated kinase) required for motility and ability to invasion of epithelial cells.
  • ERK kinase activation extracellular signal-regulated kinase
  • the overexpression of the MMP-1 gene at the level of the epidermis by the root extract of Polygonum multiflorum makes it possible to position it as an active agent potentially promoting cutaneous cicatrization, in particular at the level of the closure of the wound.
  • the extract by its role in controlling the production of free radicals, could be used as an active ingredient to ameliorate or treat inflammation of the skin.
  • the root extract of Polygonum multiflorum may have a soothing effect on the skin or a soothing effect of the skin due to the sensation of irritation that may develop after shaving, friction, or contact with allergens.
  • the root extract of Polygonum multiflorum is optionally positioned as an asset promoting skin healing, particularly in the case of closure of a wound.
  • Example 3 Effect of Polygonum multiflorum root extracts in propane 1,2 diol on human keratinocytes - "GeneChip Human Gene” microarray study
  • a root extract of polygonum multiflorum was prepared according to Example 1.4.
  • NHEKs Normal Human Epidermal Keratinocytes, Lonza, 0019206, origin: foreskin
  • HKGS Human Keratinocyte Growth Supplement
  • the cells were maintained in a humid atmosphere at 37 ° C containing 5% CO 2.
  • NHEK keratinocytes were inoculated in 24-well plates 24 hours before application of the extract in Epilife medium (INVITROGEN, M-EPI-500 A) containing the HKGS supplement (INVITROGEN, S-001-K) and gentamycin (INVITROGEN, 15710-049).
  • the extract was solubilized in the appropriate culture medium and then placed in contact with NHEK keratinocytes for 24 hours.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • RNA populations were extracted.
  • the extraction was carried out using the RNeasy kit (Qiagen). After 24 hours of treatment, the cells were rinsed with PBS and lysed in ad hoc buffer. The extraction and purification of the RNAs were performed according to the instructions of the supplier. Total RNAs were then stored at -80 ° C for transcriptomic analysis.
  • RNA concentration was determined by spectrophotometric measurement. The quality and integrity of the RNAs were then verified by capillary electrophoresis (Agilent Bioanalyzer 2100 Platform - Agilent RNA 6000Nano Kit, 5067-1511).
  • RNA quantification by spectrophotometric measurement an aliquot of each RNA was diluted in RNAse-free water and its concentration was determined using an Ultrospec 1100 Pro spectrophotometer (Amersham).
  • RNA Integrity by Agilent Bioanalyzer Capillary Electrophoresis Integrity of total RNA was assessed by visualization of peaks corresponding to ribosomal RNAs. For total higher eukaryotic RNAs, ribosomal band size should be 1.9 kb for 18S-RNA and 4.7 kb for 28S-RNA. The intensity of the band corresponding to the 28S-RNA must be greater than the intensity of the band corresponding to the 18S-RNA.
  • RNA and 5S ribosomal RNA Small diffuse bands representing lower molecular weight RNAs (tRNA and 5S ribosomal RNA) may be present. When RNA is degraded, banding of ribosomal RNA and background noise of the higher molecular weight RNAs are observed.
  • the fourth replica serves as a back-up.
  • RNA samples (50ng) were amplified using Ribo-SPIA technology, according to 3 steps (Ovation Pico WTA System V2, NuGEN, 3302-12) and purified with the Agencourt RNA Clean up XP Beads Kit ( Agencourt - Beckam Coulter Genomics, A29168). For each sample, 4.5 ⁇ g was fragmented and labeled with biotin, using the NuGEN Encore Biotin Module (NuGEN, 4200-12). Hybridization was performed on DNA chips of GeneChip Model Human Gene 2.0 ST (Affymetrix, 902112). The hybridization steps on chip, washing and fixation, were carried out according to the protocol defined by Affymetrix.
  • the hybridization solution was prepared using the Affymetrix Genechip Expression 3 'Amplification Reagent Hybridization Controls kits (Affymetrix, 900454) and Hybridization Module for GeneChip Hybridization, Wash and Stain Kit (Affymetrix, 900720), and blended with complementary DNA (CDNA) amplified in the previous steps.
  • Hybridization was carried out for 18 h in the GeneChip Hybridization Oven 640 (Affymetrix, 800139). The washing and revelation were performed using the GeneChip Fluidics Station 450 fluidic station (Affymetrix, 00-0079) and the intensity measurements were scanned with the GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix).
  • the over-representation analysis was performed using the hypergeometric test method in order to characterize the dermo-cosmetic themes / groups of interest factors based on the proportion of their detected and differentially expressed targets.
  • the analysis was carried out from the list of genes detected with a p-value of 0.05 and a difference in expression level (rate of change or fold-change or FC) greater than 1.5 (bi-lateral) .
  • cytotoxicity study was performed on NHEK keratinocytes.
  • the untreated control was arbitrarily set at 100% viability and the cytotoxicity threshold was conventionally set at 80% viability.
  • the SDS condition is the positive control that validates the experience.
  • the ratio of absorbance at 260nm and 280nm is used to assess the purity of the RNA. A ratio close to 2 makes it possible to consider the sample as pure and devoid of contamination by proteins.
  • the 260/230 ratio is used as a secondary measure of purity of the sample.
  • the 260/230 value is generally higher than the 260/280 ratio and is expected to be around 2.2.
  • the ratios obtained for all the samples of the present study are therefore satisfactory (data not shown) and were subsequently qualified by capillary electrophoresis.
  • RNA populations demonstrate the presence of narrow peaks, corresponding to 18S and 28S ribosomal RNAs, and a balanced ratio between the two peaks.
  • the human epidermis is a stratified epithelium constituting a barrier whose layers are defined by the stage of differentiation of the cells that compose them. As they are differentiated, the keratinocytes are loaded into keratin filaments and contain a matrix retaining the water, all surrounded by the horny envelope. Terminal differentiating keratinocytes are isolated by intercorneocyte lipids and are attached to each other by corneodesmosomes.
  • Basal keratinocytes progress through the four layers of the epidermis: basal, thorny, granular and horny.
  • the basal layer is formed by a single layer of cubic or prismatic keratinocytes linked together by desmosomes. In this layer the cells divide, one of the two cells remains in the basal layer while the other migrates to the upper layers. Basal keratinocytes are attached by hemi-desmosomes to a basement membrane that separates the epidermis from the dermis and forms the dermal-epidermal junction.
  • the spinous layer is formed by 5 to 15 layers of polygonal keratinocytes linked together by desmosomes. These cells contain tonofilaments, the precursor filaments of keratin.
  • the granular layer is formed by 3 layers of keratinocytes which contain keratohyaline grains and lamellar granules.
  • the stratum corneum is formed from 5 to 15 layers of corneocytes, that is to say differentiated keratinocytes which no longer have nuclei and organelles, but they are surrounded by a horny envelope. They are loaded with keratin filaments.
  • keratin filaments (called tonofilaments) become more numerous and begin to aggregate in the cells of the spinous layer to form the tonofibrils. At the level of the granular layer, they associate with keratohyaline granules.
  • Desmosomes represent a type of junction between keratinocytes.
  • keratinocytes can produce anti-microbial peptides, responsible for the attraction and activation of immune cells.
  • Calprotectin has been shown to exert its antibacterial activity against Escherichia coli, Klebsiella spp., Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Capnocytophaga spumblea and Borrelia burgdorferi (Lyme disease).
  • This chemokine is constantly produced in the epidermis and dermis in healthy conditions.
  • it has recognized bactericidal activity against Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Finegoldia magna, Streptococcus pyogenes.
  • the root extract of Polygonum multiflorum could potentially stimulate epidermal renewal.
  • it may play a role in the antimicrobial defense of the epidermis by increasing the expression of genes encoding certain antimicrobial peptides or chemokines involved in anti-bacterial defense.
  • the extract, cell culture, determination of the range of study concentrations of the Polygonum multiflorum root extract by a preliminary cytotoxicity study, cell treatment, total RNA extraction as well as the qualification RNA spectrophotometry and capillary electrophoresis are described in 3.1.
  • the real-time qPCR method using TaqMam fluorescent probes is described in section 2.1.
  • it is a question of quantifying the expression of different specific targets in the populations of RNAs derived from NHEK keratinocytes treated with the extract and its solvent.
  • the PCRs were performed using the QuantStudio Flex system (Applied Biosystems).
  • reaction mixtures with probes and primers corresponding to ⁇ 2-microglobulin (B2M) were also prepared with the same cDNA samples.
  • a control without cDNA served as a negative control of amplification.
  • the optimum concentration (in% v / v) selected for the extract and its solvent (propane 1,2 diol) is 0.33%.
  • RNA populations demonstrate the presence of narrow peaks corresponding to 18S and 28S ribosomal RNAs.
  • the expression profiles of 5 genes specific to antibacterial defense were analyzed.

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Abstract

La présente invention concerne un extrait racinaire de Polygonum multiflorum concentré en THSG comprenant pas ou très peu d'émodine, un procédé de préparation d'un tel extrait ainsi qu'une composition cosmétique et une composition pharmaceutique ou nutraceutique, lesdites compositions comprenant en tant qu'agent actif au moins un extrait racinaire de Polygonum multiflorum selon l'invention.

Description

EXTRAITS RACINAIRES DE POLYGONUM MULTIFLORUM
ET LEURS UTILISATIONS
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se situe dans le domaine des extraits végétaux et concerne un extrait racinaire de Polygonum multiflorum concentré en THSG avec pas ou très peu d'émodine, un procédé de préparation d'un tel extrait ainsi qu'une composition cosmétique et une composition pharmaceutique ou nutraceutique, lesdites compositions comprenant en tant qu'agent actif au moins un extrait racinaire de Polygonum multiflorum selon l'invention.
ART ANTERIEUR
Polygonum multiflorum Thunb., plante herbacée de la famille des Polygonaceae, est une des plantes les plus populaires de la médecine traditionnelle chinoise. Sa racine séchée appelée Polygoni Multiflori Radix (RPM, Heshouwu en chinois) est utilisée dans de nombreuses préparations. Sous forme brute elle est utilisée à des fins multiples notamment pour aider à la digestion (purgatif).
Classiquement, les racines de Polygonum multiflorum sont traitées à la vapeur dans du jus de soja noir puis séchées. Sous cette forme ainsi préparée, Radix Polygoni Multiflori Praeparata (RPMP, Zhiheshouwu en chinois) est utilisé notamment pour détoxifier et activer la circulation dans le foie et les reins.
Récemment Polygoni multiflori Radix a été étudié pour son potentiel pharmacologique. L'extrait présente des effets immunologique, anti-cancer, anti-inflammatoire, neuro-protecteur et anti-hyperlipidémie
Dans le domaine cosmétique, des extraits de RPM ou de RPMP présentant un effet protecteur contre le stress oxydatif, sont utilisés pour prévenir la progression du blanchiment des cheveux ou dans des compositions cosmétiques anti-âge. Par exemple la demande KR20150143375 décrit une composition cosmétique contenant un extrait de racines adventices de Polygonum multiflorum, présentant une activité antioxydante, une inhibition de l'expression de la collagénase, une inhibition des activités élastase, et un effet anti-rides. La demande KR20160123433 décrit une composition cosmétique contenant un extrait de racines séchées de Polygonum multiflorum présente des propriétés antioxydantes et antirides mais aussi des fonctionnalités de blanchiment de la peau (activité inhibitrice de la tyrorinase), anti-inflammatoire et anti-atopique.
De nombreux composés ont été identifiés au sein de l'espèce Polygonum multiflorum. Ce sont pour la plupart des anthraquinones, des stilbènes, des flavonoïdes, parmi lesquels se trouvent le 2,3,5,4'-tétrahydroxystilbène-2-0- β-D-glucoside (THSG), l'émodine et le physcion (Traditional usages, botany, phytochemistry, pharmacology and toxicology of Polygonum multiflorum Thunb. : a review ; Lin L, Ni B, Lin H, Zhang M, Li X, Yin X, Qu C, Ni J. J. Ethnopharmacol . 2015 Jan 15; 159 : 158-83).
Le THSG est supposé être responsable de l'activité de Polygoni Multiflori Radix. Il a été identifié comme ayant des activités anti-inflammatoires et antioxydantes, des propriétés prophylactiques et thérapeutiques contre la maladie d'Alzheimer (Lin et al., 2015). Il agit également dans la prévention et le traitement du blanchiment des cheveux (WO2016/101259).
Bien que des extraits de Polygonum multiflorum soient habituellement utilisés pour traiter diverses maladies du foie, un nombre croissant de cas d'hépato- toxicité potentiellement induit par leurs usages a été signalé. Des études ont montré que des quinones et notamment l'émodine peuvent conduire à une hépato-toxicité. Récemment, une étude toxicologique basée sur une approche in silico d'analyse des mécanismes moléculaires d'hépatotoxicité induit par Polygonum multiflorum a montré que l'émodine est associée de façon évidente à cette hépato-toxicité (« Insights into the molecular mechanisms of Polygonum multiflorum Thunb-induced liver injury: a computational Systems toxicology approach »; Wang YY, Li J, Wu ZR, Zhang B, Yang HB, Wang Q, Cai YC, Liu GX, Li WH, Tang Y. ; Acta Pharmacol Sin. 2017 Feb 27, 719-732.)
Selon l'inventaire européen des produits cosmétiques (EU inventory cosmetic ingrédients) les anthraquinones, comme l'émodine, sont considérées comme faisant parties des composés indésirables des plantes.
Les constituants chimiques de Polygonum multiflorum changent lors du traitement de l'extrait. Ainsi, l'hépato-toxicité de Polygoni Multiflori Radix (RPM) est plus forte que celle de Radix Polygoni Multiflori Praeparata (RPMP). Cependant la teneur en émodine augmente avec le traitement de l'extrait de Polygonum multiflorum (Toxicity of raw and processed roots of Polygonum multiflorum ; Wu X, Chen X, Huang Q, Fang D, Li G, Zhang G. ; Fitoterapia. 2012 Apr;83(3) :469-75).
L'émodine étant présente dans la racine de Polygonum multiflorum, il est donc nécessaire de développer un procédé qui permette l'extraction sélective du THSG ou du moins qui permette l'obtention d'un extrait dépourvu d'émodine, ou comprenant de l'émodine en quantité très faible.
Des techniques d'extraction sélective de polyhydroxy stilbène, dont le resvératrol et le THSG font partie, ont été élaborées mais elles restent compliquées et coûteuses.
L'Aloe vera est une plante dont le gel est commercialisé notamment à des fins cosmétiques. Les anthraquinones contenues dans le gel doivent être éliminées. Pour ce faire la demande internationale WO2005/021018 décrit un procédé utilisant des oxydases dont l'activité enzymatique permet la dégradation de l'aloine et l'émodine présentes dans le gel d'Aloe vera.
La demande internationale WO2008/092221 décrit un système qui permet l'extraction sélective de trans-resvératrol et de l'émodine en utilisant le toluène comme solvant. Même si ce procédé présente de nombreux avantages il est encore long et nécessite plusieurs étapes dont notamment le séchage des racines et il ne permet pas l'obtention d'un extrait liquide directement exploitable par l'industrie cosmétique.
Pour le THSG, comme pour d'autres poly hydroxystilbènes, l'activité biologique est principalement liée à ses pouvoirs antioxydants qui sont reliés à ses groupements polyphénols. Ces groupements sont très instables et le THSG est donc susceptible d'être oxydé et hydrolysé. Il est donc nécessaire de réaliser des extraits dans lesquels la molécule aura une stabilité accrue grâce à l'utilisation d'un solvant et d'un pH adéquat.
Les inventeurs ont maintenant développé un procédé permettant de préparer un extrait racinaire de Polygonum multiflorum concentré en THSG avec pas ou très peu d'émodine, stable et directement exploitable par l'industrie cosmétique. Un tel procédé permet la réalisation d'extractions successives sans détruire ni altérer la survie des plantes. Les inventeurs ont également montré qu'un extrait végétal selon l'invention présente non seulement des bénéfices cosmétiques, comme la prévention ou le ralentissement du vieillissement cutané, la stimulation du renouvellement de l'épiderme ou avoir un effet apaisant de la peau ou un effet calmant de la peau, mais aussi peut être utilisé en tant que médicament pour stimuler la défense antimicrobienne de la peau, atténuer ou traiter l'inflammation de la peau et/ou pour favoriser la cicatrisation cutanée, en particulier dans le cas de la fermeture d'une plaie.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1. Evolution de la teneur en THSG dans des extraits racinaires de Polygonum multiflorum à 3 pH différents (pH 2,8 représenté par les histogrammes noirs, pH 4 représenté par les histogrammes gris et pH 6,8 représenté par les histogrammes blancs) après 2, 4 et 6 mois de conservation de l'extrait à 40°C et à l'obscurité.
Figure 2. Chromatogramme (UV à 319 nm) de l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum obtenu selon l'exemple 1.
Figure 3 : Chromatogrammes (UV à 288 nm) de l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum obtenu selon l'exemple 1 (haut) et du standard d'émodine à 10 mg/L (bas).
Figure 4. Mesures de la viabilité de Kératinocytes humains NHEKs après 24h de traitement avec cinq différentes concentrations (3%, 1%, 0,33%, 0,11% et 0,037%) d'un extrait de Polygonum multiflorum préparé selon l'exemple 1.4 (en gris foncé hachuré), ou de son solvant seul à la même concentration (en gris clair). Les pourcentages de viabilité ont été calculés par rapport au contrôle négatif non traité (CTL NT) fixé à 100% et au contrôle positif de cytotoxicité (SDS à 0,008%). Les histogrammes représentent la moyenne de 3 réplicats indépendants et la barre d'erreur correspond à l'écart-type autour de la moyenne.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente invention a pour premier objet un extrait racinaire de Polygonum multiflorum caractérisé en ce
- qu'il comprend au moins 0,8% en poids de THSG, de préférence au moins 1,5%, plus préférentiellement au moins 2%, exprimé par rapport au poids total de l'extrait sec, et
- qu'il comprend moins de 0,01% en poids d'émodine, de préférence moins de 0,001%, plus préférentiellement moins de 0,0005%, exprimé par rapport au poids total de l'extrait sec. Plus particulièrement, la présente invention a pour objet un extrait racinaire de Polygonum multiflorum caractérisé en ce :
• qu'il comprend au moins 0,8%, au moins 1%, au moins 1,2%, au moins 1,5%, au moins 1,7%, au moins 2%, au moins 2,5%, au moins 3%, en poids de THSG, exprimé par rapport au poids total de l'extrait sec,
et
• qu'il comprend moins de 0,01%, de préférence moins de 0,005%, de préférence moins de 0,001%, plus préférentiellement moins de 0,0005% et encore plus préférentiellement moins de 0,0001% en poids d'émodine exprimé par rapport au poids total de l'extrait sec.
Par « extrait racinaire de Polygonum multiflorum » on entend un produit obtenu par l'extraction de racines de plantes de l'espèce Polygonum multiflorum.
Par « concentré en THSG » on entend un extrait racinaire comprenant une quantité de THSG ne devant pas être inférieure à 0,8% exprimé par rapport au poids total de l'extrait sec.
Par «2,3,5,4'-tetrahydroxystilbene-2-0^-D-glucoside» ou « THSG » on entend un composé suivante :
Figure imgf000006_0001
Par « extrait sec » on entend l'extrait obtenu par la mise en œuvre du procédé selon l'invention suivie d'une étape de dessication de l'extrait, la dessication étant mise en œuvre selon toute méthode bien connue de l'homme du métier, notamment de placer l'extrait en atmosphère chaude et sèche.
Par « pas d'émodine » on entend une quantité d'émodine dans l'extrait inférieure au seuil de détection et pas « très peu d'émodine » on entend une quantité d'émodine dans l'extrait inférieure à la limite de quantification par chromatographie en phase supercritique ou par chromatographie en phase liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse (HPLC/MS). Selon un aspect particulier, dans un extrait racinaire selon l'invention, la quantité d'émodine dans l'extrait est inférieure à la limite de quantification par chromatographie en phase supercritique ou par chromatographie en phase liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse (HPLC/MS).
Pour l'obtention d'un extrait racinaire, quand les racines sont jugées suffisamment développées, celles-ci sont mises en contact avec un solvant par immersion ou macération, et ensuite ledit solvant est récupéré et traité pour en extraire les molécules d'intérêts qui ont été libérées par les racines desdites plantes. Ce type de procédé est adapté du procédé développé par la société Plant Advanced Technologies (PAT) sous le nom de « PAT Plantes à Traire® » et décrit dans la demande internationale WO 01/33942.
Selon un aspect particulier, l'invention a pour objet un extrait racinaire de Polygonum multiflorum, plus particulièrement choisi parmi :
Un extrait obtenu par exsudation racinaire dans un solvant,
Un extrait obtenu par macération racinaire dans un solvant, et
Un mélange d'au moins un extrait obtenu par exsudation racinaire dans un premier solvant et d'au moins un extrait obtenu par macération racinaire dans un deuxième solvant.
Dans un deuxième aspect, l'invention a pour objet un procédé de préparation d'un extrait racinaire de Polygonum multiflorum selon l'invention, comprenant : a) une étape de culture de de Polygonum multiflorum en conditions hors- sol, et particulièrement en aéroponie,
b) optionnellement une étape de stimulation des racines des plantes, c) une étape d'extraction solide / liquide des racines optionnellement stimulées lors de l'étape b), et
d) la récupération de l'extrait obtenu lors de l'étape c).
Dans le cadre de l'invention, on entend par « culture des plantes en conditions hors sol », tout mode de culture dans lequel les racines de la plante ne sont pas dans de la terre. Plus précisément, la culture hors sol est une culture dans laquelle les racines des plantes reposent dans un milieu reconstitué, détaché du sol. Ce milieu de culture est irrigué de façon régulière par des solutions nutritives appropriées à la plante cultivée. II existe différentes techniques de culture hors sol tels que les systèmes sans substrat qui nécessitent une solution nutritive enrichie en oxygène, et les systèmes avec substrat. Parmi les systèmes sans substrat, on peut citer l'aquiculture pour laquelle la solution nutritive est non circulante et est contenue dans un bac de culture, la Nutrient Film Technique (N. F.T.) pour laquelle la solution nutritive s'enrichit en oxygène dissous au cours de son déplacement par échange avec l'air, et l'aéroponie pour laquelle les racines des plantes ne sont en contact ni avec un milieu solide, ni même avec un milieu liquide : elles sont alimentées par un brouillard nutritif obtenu par brumisation (via un brumisateur) de la solution nutritive dans un milieu fermé. Parmi les systèmes avec substrat, on retrouve la subirrigation dans laquelle la solution nutritive pénètre dans le substrat au niveau de sa partie inférieure et la percolation dans laquelle la solution nutritive est distribuée par irrigation discontinue à la surface supérieure du système puis percole vers le bas du substrat. Le substrat, minéral ou organique, est neutre et inerte comme du sable, de l'argile ou de la laine de roche par exemple. Ce substrat peut être également d'origine industrielle.
On entend par « culture des plantes en aéroponie » un mode de culture hors sol pour lequel les racines des plantes ne sont en contact ni avec un milieu solide, ni même avec un milieu liquide. Selon un mode de réalisation particulier, les plantes sont alimentées par un brouillard nutritif obtenu par brumisation, via un brumisateur, de la solution nutritive dans un milieu fermé.
Typiquement, dans un procédé selon l'invention, on peut disposer des plantes sur des plateaux avec la partie aérienne de la plante au-dessus du plateau et la partie racinaire en-dessous, on dispose les plateaux sur des tables formant zone de rétention pour collecter l'excédent d'un liquide diffusé vers les plantes, et on transfère les plateaux sur les tables à différents postes. Lors de l'étape a), les plantes cultivées en aéroponie sont alimentées par pulvérisation racinaire d'une solution nutritive de sels minéraux essentiels (Azote - N, Phosphore - P, Potassium - K), afin d'obtenir un développement racinaire maximum et une concentration maximum en molécules d'intérêt, sans altérer la survie de la plante. L'homme du métier, à l'aide de ses connaissances générales, sait comment adapter les proportions et concentrations des différents sels minéraux pour optimiser le développement racinaire et la concentration des molécules d'intérêt. Les concentrations en sels minéraux des solutions nutritives sont dans ce cas comprises dans une gamme d'électroconductivité s'étendant avantageusement entre 0,8 à 1,6 mS/cm, de préférence entre 1,0 à 1,2 mS/cm, afin de favoriser une plus grande teneur en THSG dans les extraits.
Dans l'étape c) d'un procédé selon l'invention, on entend par « extraction solide/liquide » toute technique d'extraction par solvant qui consiste à extraire une espèce chimique se trouvant dans un solide et étant soluble dans ledit solvant. Parmi ces techniques d'extraction, on peut citer la macération, l'exsudation, l'infusion, la décoction, l'extraction par extracteurs de Soxhlet et de Kumagawa, l'extraction assistée par micro-onde, l'extraction assistée par ultrason, l'extraction par voie enzymatique, l'extraction par fluide supercritique (C02 +DPG). L'extraction conduit à la récupération des métabolites contenus dans l'une ou l'autre partie des plantes, et notamment les racines, au moyen d'un liquide de lessivage, ou solvant, mis en contact avec les racines coupées et/ou encore accrochées à la plante, dans un solvant particulier et pendant une durée appropriée. Selon un aspect particulier, dans un procédé selon l'invention, l'étape c) d'extraction solide/liquide des racines potentiellement stimulées lors de l'étape b), est réalisée au moyen d'un procédé choisi parmi : une exsudation et une macération.
Selon un aspect plus particulier, dans un procédé selon l'invention, l'étape c) d'extraction solide/liquide des racines potentiellement stimulées lors de l'étape b), est réalisée au moyen d'un procédé choisi parmi : une exsudation racinaire et une macération racinaire. Cette étape consiste notamment en une étape de « trempage », pendant laquelle on met les racines des plantes dans un bac de trempage contenant un liquide pendant une durée prédéterminée. Typiquement, les plantes sont disposées sur un plateau avec la partie aérienne de la plante au-dessus du plateau et la partie racinaire au- dessous, le plateau est remonté après le trempage, puis le liquide contenu dans le bac de trempage est collecté. Selon un aspect particulier, l'étape de trempage est suivie d'une étape de coupe dans laquelle la partie racinaire des plantes est partiellement coupée pour récolter les racines coupées. Il est possible d'extraire les substances des racines coupées, outre l'extraction des substances lors du trempage.
De préférence, dans un procédé selon l'invention, l'exsudation racinaire est réalisée sur des racines encore attachées à la plante. Selon un autre aspect préféré, la macération racinaire est réalisée sur des racines fraîchement coupées, c'est-à-dire coupées depuis moins de 24 heures, et de préférence le plus tôt possible après coupage, idéalement juste après coupage, lesdites racines étant éventuellement séchées après leur section et avant macération. Le séchage des racines peut être réalisé par la mise en œuvre de tout procédé de séchage adapté, connu de l'homme du métier, et notamment en plaçant les racines à une température comprise entre 40°C et 60°C pendant 4 heures, de préférence dans un environnement sec. Le séchage des racines peut notamment être réalisé dans une étuve ventilée.
Selon un autre aspect plus particulier, dans un procédé selon l'invention, l'étape c) d'extraction solide/liquide des racines potentiellement stimulées lors de l'étape b), comprend donc une étape de séchage des racines coupées préalablement à l'étape de macération.
Plus particulièrement, l'étape c) d'un procédé selon l'invention comprend la mise en présence des racines avec un solvant choisi parmi : les alcools, la glycérine, les glycols et les solvants eutectiques. Ledit alcool est choisi de préférence parmi l'éthanol et le méthanol, utilisés purs ou sous la forme d'une solution aqueuse d'alcool, celle-ci comprenant de 10% à 99,9% d'alcool, plus particulièrement entre 40% et 90%, et encore plus particulièrement entre 50% et 85%. Ledit glycol est un diol dans lequel les deux groupes hydroxyl sont portés par des carbones différents, et est choisi parmi : le dipropylène glycol, le propane 1,3 diol, le propane 1,2 diol et le butylène glycol, et est utilisé pur ou sous la forme d'une solution aqueuse de glycol, celle-ci comprenant de 10% à 99,9% de glycol, plus particulièrement entre 40% et 90%, et encore plus particulièrement entre 50% et 85%. La glycérine est utilisée pure ou sous la forme d'une solution aqueuse de glycérine, celle-ci comprenant de 10% à 99,9% de glycérine, plus particulièrement entre 40% et 90%, et encore plus particulièrement entre 50% et 85%. Ledit solvant eutectique est constitué de deux composants ou plus, qui peuvent être solides ou liquides et qui, dans une composition particulière, présentent une forte diminution de leur température de fusion, rendant ainsi le mélange liquide. Les solvants eutectiques naturels sont principalement constitués d'acides aminés, d'acides organiques, de sucres et de dérivés de la choline. L'eau peut faire partie du solvant, mais est dans ce cas fortement retenu dans le liquide et ne peut être évaporée. Les combinaisons particulières des composants constituant ledit solvant eutectique sont choisies parmi notamment, et de manière non exhaustive, le chlorure de choline - glucose (ratio 1 : 1), le chlorure de choline - acide citrique (ratio 1 : 1), le chlorure de choline - acide citrique (ratio 2 : 1), le chlorure de choline - saccharose (ratio 4: 1), le chlorure de choline - saccharose (ratio 1 : 1), le chlorure de choline - acide tartrique (ratio 2 : 1), le chlorure de choline - xylose (ratio 2 : 1), le chlorure de choline
- xylose (ratio 3 : 1), l'acide citrique - saccharose (ratio 1 : 1), l'acide citrique
- glucose (ratio 1 : 1), le glucose - acide tartrique (ratio 1 : 1), le chlorure de choline - urée (ratio 1 : 2), le chlorure de choline - xylitol - eau (2 : 1 : 3) et l'acide lactique - glucose - eau (5 : 1 : 3). Par « butylène glycol » on entend le butane 1,2 diol, le butane 1,3 diol, le butane 2,3 diol et le butane 1,4 diol.
Ces solvants, et plus particulièrement la glycérine, le dipropylène glycol, le propane 1,3 diol et le propane 1,2 diol permettent de favoriser une extraction sélective ; c'est-à-dire l'extraction d'une forte teneur en THSG, sans extraire ou extraire à une teneur très faible ou inférieure au seuil de quantification de l'émodine. Dans le cas d'un mélange d'extraits racinaires, lesdits premier et deuxième solvants peuvent être identiques ou différents.
Selon un aspect plus particulier, l'étape c) d'un procédé selon l'invention comprend la mise en présence des racines avec un solvant choisi parmi : la glycérine, le dipropylène glycol, le propane 1,3 diol et le propane 1,2 diol. Selon un aspect particulier de l'invention, le solvant est caractérisé par un pH acide, notamment lorsqu'il est utilisé lors de l'étape d'extraction solide/liquide. Selon un aspect particulier, ledit alcool ou ledit glycol utilisé lors d'une étape d'extraction solide/liquide est caractérisé par un pH compris entre 1,5 et 5, de préférence entre 2 et 4,5, plus préférentiellement entre 3 et 4,5. Selon un autre aspect particulier, un extrait végétal selon l'invention est caractérisé par un pH compris entre 2,5 et 5 et de préférence entre 3,5 et 4,5. L'utilisation d'un solvant à pH acide, c'est-à-dire supérieur ou égal à 1,5 et inférieur ou égal à 5, favorise la solubilisation des composés d'intérêt dans ledit solvant, limite la dégradation chimique ou enzymatique du THSG lors de l'extraction et permet en combinaison avec le choix du solvant à favoriser une extraction sélective, c'est-à-dire l'extraction d'une forte teneur en THSG, sans extraire d'émodine ou l'extraire à une teneur très faible ou inférieure au seuil de quantification. Les acides utilisés pour l'ajustement du pH du solvant ou de l'extrait sont de préférence l'acide lactique, l'acide phosphorique, l'acide citrique ou l'acide chlorhydrique.
Plus particulièrement, ledit glycol est choisi dans le groupe suivant : le dipropylène glycol, le propane 1,3 diol, le propane 1, 2 diol et la glycérine. Le propane 1,3 diol, ou triméthylène glycol, peut être préparé par synthèse chimique selon des techniques connues de l'homme du métier et décrites dans la littérature, il est aussi disponible commercialement. Ledit propane 1,3 diol peut également être produit par la mise en œuvre d'un procédé de fermentation en conditions adaptées d'un organisme vivant, notamment une souche génétiquement modifiée d'Escherichia coli. Le propane 1,3 diol ainsi obtenu est désigné par le terme de « propane 1,3 diol biosourcé », un tel produit est produit puis purifié comme décrit notamment dans la demande internationale WO 2004/101479 et commercialisé sous la marque Zéméa®. Ledit propane 1,3 diol peut également avoir une certification Bio, par exemple de type COSMOS.
De façon encore plus particulière, dans un procédé selon l'invention, l'étape c) d'extraction solide/liquide comprend la mise en présence des racines avec du propane 1,2 diol ou avec du propane 1,3 diol, et notamment du propane 1,3 diol biosourcé et/ou de certification Bio.
Selon un aspect particulier, l'étape c) d'un procédé selon l'invention comprend la mise en présence des racines avec un solvant pendant une durée comprise entre 15 minutes et 30 minutes pour l'exsudation racinaire et pendant une durée comprise entre 1 heure et 108 heures, notamment entre 24 heures et 96 heures, plus particulièrement entre 48 heures et 96 heures pour la macération racinaire. Pour la macération racinaire, le ratio de la quantité de racines fraîches sur la quantité de solvant varie entre 0,2 kg de racines / L de solvant à 1 kg de racines / L de solvant. Selon un autre aspect particulier, un procédé selon l'invention comprend une étape de section des racines puis de séchage des racines sectionnées, préalablement à l'étape de macération desdites racines, la macération étant réalisée par la mise en présence des racines avec un solvant. Pour la macération racinaire, le ratio de la quantité de racines sèches sur la quantité de solvant varie entre 0,1 kg de racines / L de solvant à 0,04 kg de racines / L de solvant.
Le procédé selon l'invention peut donc comprendre une première étape d'exsudation racinaire effectuée par immersion dans un solvant des racines encore accrochées à la plante pendant une durée comprise entre 15 minutes à 30 minutes, suivie d'une étape de macération racinaire des racines coupées de la plante, puis éventuellement séchées.
Les durées d'exsudation racinaire et/ou de macération racinaire sont choisies de manière à favoriser l'extraction d'une forte quantité en composés d'intérêt tout en n'altérant pas la survie de la plante et sans mener à l'épuisement des ressources. Ainsi les plantes, après l'étape d'exsudation racinaire et éventuellement après l'étape de coupe des racines, sont remises en culture pendant 1 à 8 semaines en aéroponie selon les étapes a) et optionnellement soumises pendant 1 jour à 8 semaines à une étape de stimulation b) afin de recommencer leur développement racinaire et favoriser la production par les racines de métabolites secondaires.
Selon un mode de réalisation préféré, l'invention a également pour objet un procédé de préparation d'un extrait racinaire de Polygonum multiflorum selon l'invention comprenant :
a) une étape de culture de Polygonum multiflorum en conditions hors- sol, et particulièrement en aéroponie,
b) une étape de stimulation des racines des plantes,
c) une étape d'extraction solide/liquide des racines stimulées lors de l'étape b), et
d) la récupération de l'extrait obtenu lors de l'étape c).
Selon un autre aspect particulier, dans un procédé selon l'invention, l'étape b) de stimulation des racines des plantes comprend :
• une étape d'élicitation dans laquelle les racines sont mises en présence d'une solution comprenant au moins un agent choisi parmi : un sel, un tensioactif, un solvant, un éliciteur d'origine fongique ou bactérienne, un dérivé de l'acide jasmonique, en particulier le méthyl jasmonate, l'acide salicylique, un générateur d'éthylène, une chitine, des chitosans et/ou leur mélange, et/ou
• une étape de mise en présence des racines avec une solution carencée en azote, c'est-à-dire une solution comprenant une proportion d'azote inférieure à la proportion d'azote habituellement considérée comme optimale pour le développement de la plante, avantageusement moins de 15% d'azote, et avantageusement ne comprenant pas d'azote, lesdites étapes étant séquentielles ou simultanées.
Les racines peuvent également être stimulées par la mise en présence des plantes avec une solution nutritive carencée en azote. La mise en présence des plantes avec une solution nutritive carencée en azote provoque un « stress azoté » responsable de la stimulation. Selon un aspect particulier, une solution carencée en azote selon la présente invention est une solution comprenant moins de 15% d'azote, de préférence moins de 10% d'azote, avantageusement moins de 8%, plus avantageusement moins de 6%, moins de 5%, moins de 4%, moins de 3%, moins de 2%, moins de 1% d'azote et encore plus avantageusement 0% d'azote.
L'étape b) de stimulation permet d'augmenter de manière significative les rendements de biomasse racinaire.
Selon un aspect particulier, dans un procédé selon l'invention l'étape de stimulation de Polygonum multiforum est réalisée dans des milieux nutritifs de composition N/P/K différente. Le milieu 0/15/40 offre une productivité racinaire convenable. Le milieu 15/10/30 permet une croissance des racines limitée avec des racines très courtes et peu ramifiées. Des milieux riches en azote, par exemple les milieux 20/20/20 et 28/14/14 n'ont pas permis la production de racines. Avantageusement, l'étape b) de stimulation des racines est réalisée par pulvérisation ou macération de la plante avec une solution d'éliciteurs choisie parmi les dérivés d'acide jasmonique comme par exemple le méthyl jasmonate, l'acide salicylique, l'éthéphon et les chitosans ou par l'alimentation de la plante avec une solution nutritive N/P/K carencée en azote vaporisée sur les racines.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, l'étape b) est mise en œuvre par pulvérisation ou macération de la plante avec une solution choisie parmi :
• une solution de méthyl jasmonate à une concentration comprise entre 0,01 et 200 μΜ, avantageusement entre 0,1 et 100 μΜ, • une solution d'acide salicylique à une concentration comprise entre 1 et 500 μΜ, avantageusement entre 10 et 50 μΜ,
• une solution de chitosans à une concentration de 0,002 à 1 g/L, avantageusement de 0,05 à 0,1 g/L, et
· une solution nutritive N/P/K comprenant moins de 6% d'azote, ladite solution étant de préférence vaporisée sur les racines.
En outre, l'étape b) de stimulation des racines avec une solution d'éliciteurs est avantageusement effectuée pendant une durée comprise entre 1 jour et 21 jours, de préférence entre 1 et 7 jours.
Selon un aspect particulier, l'étape b) de stimulation des racines par l'alimentation de la plante avec une solution nutritive N/P/K carencée en azote vaporisée sur les racines est avantageusement effectuée pendant une durée comprise entre 7 jours et 8 semaines, de préférence 3 semaines.
Lors de l'étape b), les concentrations en sels minéraux des solutions nutritives sont comprises dans une gamme d'électroconductivité s'étendant avantageusement entre 0,8 à 1,6 mS/cm, de préférence entre 1,0 à 1,2 mS, afin de favoriser une plus grande teneur en THSG des extraits.
Selon un aspect particulier d'un procédé selon l'invention, l'étape b) est réalisée après l'étape a). Selon un autre aspect particulier d'un procédé selon l'invention, l'étape b) et l'étape a) sont effectuées de manière simultanée, la solution de stimulation est alors incorporée à la solution nutritive ou administrée par tout autre mode d'administration connu de l'homme du métier.
Selon un perfectionnement, l'étape de « trempage » est précédée d'une étape de lavage dans laquelle le liquide diffusé vers les plantes est de l'eau claire. On limite ainsi l'apport des éléments contenus dans la solution nutritive ou dans l'éventuelle solution de stimulation lors de l'étape de trempage.
Avantageusement, l'invention a pour objet un procédé comprenant les étapes suivantes : a) une étape de culture de polygonum multiflorum en conditions hors- sol, et particulièrement en aéroponie,
b) une étape de stimulation des racines des plantes,
c) une étape d'extraction solide/liquide des racines stimulées lors de l'étape b), comprenant :
- une première phase de mise en présence des racines encore liées à la plante avec un solvant, en particulier pendant une durée comprise entre 15 minutes à 30 minutes,
- suivie d'une seconde phase comprenant la section desdites racines et la macération des racines sectionnées dans un solvant,
ledit solvant, identique ou différent dans la première et la deuxième phase, est choisi parmi les alcools, la glycérine, les glycols et les solvants eutectiques, et étant utilisé pur ou sous la forme d'une solution aqueuse d'alcool, de glycérine, de glycol ou de solvant eutectique, et
d) la récupération des extraits obtenus lors de l'étape c).
Selon un aspect particulier, dans un procédé selon l'invention le pH du solvant est compris entre 1,5 et 5, de préférence entre 2 et 5, de préférence entre 2 et 4,5, de préférence entre 3 et 4,5, plus préférentiellement entre 3,5 et 4,5.
Un procédé selon l'invention comprend avantageusement une étape supplémentaire de réajustement de la teneur en solvant de l'extrait, pour obtenir une teneur avantageuse d'au moins 50%, et/ou un ajustement du pH de l'extrait, pour obtenir un pH avantageusement compris entre 3 et 5, de préférence d'approximativement 4, en vue de la conservation de l'extrait.
Un procédé selon l'invention comprend avantageusement au moins une étape supplémentaire de purification et/ou de traitement de l'extrait végétal, une telle étape est notamment choisie parmi :
au moins une filtration, en particulier une nanofiltration et/ou une filtration stérilisante et/ou une filtration clarifiante,
une extraction liquide/solide,
- une purification, une concentration et
une décoloration de l'extrait racinaire,
de telles méthodes de purification et/ou de traitement sont bien connues de l'homme du métier. Cette étape permet d'obtenir l'extrait racinaire final de Polygonum multiflorum concentré en THSG et contenant pas ou très peu d'émodine.
Un chromatogramme (Figures 2 et 3) de l'analyse d'un extrait racinaire de Polygonum multiflorum obtenu selon l'invention, montre que le THSG est majoritairement présent et que la teneur en émodine est inférieure à la limite de quantification.
La présente invention a également pour objet un extrait susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'invention. La présente invention a pour troisième objet une composition cosmétique comprenant, en tant qu'agent actif, au moins un extrait racinaire de Polygonum multiflorum selon l'invention ou un extrait obtenu par un procédé selon l'invention, et au moins un excipient. Les modes d'administration, les posologies et les formes galéniques optimales d'une composition cosmétique selon l'invention peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement cosmétique adapté à un sujet comme par exemple le type de peau.
La composition cosmétique selon l'invention est avantageusement destinée à une application topique. Elle peut notamment se présenter sous la forme d'une crème, d'un lait, d'une lotion, d'un gel, d'un sérum, d'un spray, d'une mousse, d'une solution, d'une pommade, d'une émulsion, d'un patch ou d'un masque. Une composition cosmétique selon l'invention comprend au moins un excipient cosmétiquement acceptable choisi en fonction du type d'administration souhaitée. Une composition cosmétique selon la présente invention peut en outre comprendre au moins un adjuvant connu de l'homme du métier, choisi parmi les épaississants, les conservateurs, les parfums, les colorants, des filtres chimiques ou minéraux, les agents hydratants, les eaux thermales, etc.
Un excipient cosmétiquement acceptable peut être choisi parmi les polymères, les composés siliconés, les agents tensioactifs, les agents de rhéologie, les agents humectants, les agents de pénétration, les composants huileux, les cires, les émulsifiants, les agents filmogènes, les parfums, les électrolytes, les ajusteurs de pH, les agents antioxydants, les conservateurs, les colorants, les nacres, les pigments et leurs mélanges.
Une composition cosmétique selon l'invention peut en outre comprendre au moins un autre agent cosmétiquement actif, tels qu'un autre agent anti-âge, un agent hydratant, un agent ayant une activité calmante, apaisante ou relaxante, un agent stimulant la microcirculation cutanée, un agent sébo- régulateur pour le soin des peaux grasses, un agent nettoyant ou purifiant, un agent anti-radicalaire, un agent anti-inflammatoire, un filtre solaire chimique ou minéral, etc.
Avantageusement, une composition cosmétique selon l'invention comprend au moins un extrait racinaire de Polygonum multiflorum selon l'invention, en une quantité comprise entre 0,01 et 10%, en particulier entre 0,05 et 5%, plus particulièrement entre 0,1 et 2%, plus particulièrement entre 0,5 et 1%, en poids par rapport au poids total de la composition. La présente invention a pour quatrième objet un extrait selon l'invention, un extrait obtenu par un procédé selon l'invention, ou une composition cosmétique selon l'invention, pour prévenir ou ralentir le vieillissement cutané, et/ou pour stimuler le renouvellement de l'épiderme et/ou stimuler la défense antimicrobienne de la peau, plus particulièrement la défense antibactérienne de la peau et/ou avoir un effet apaisant de la peau ou un effet calmant de la peau suite à la sensation d'irritation.
Une composition cosmétique selon l'invention peut notamment être destinée à prévenir ou ralentir le vieillissement cutané. Une composition cosmétique selon l'invention peut aussi être destinée à stimuler le renouvellement de 1'épiderme. Egalement, une composition cosmétique selon l'invention peut notamment être destinée à avoir un effet apaisant de la peau ou un effet calmant de la peau suite à la sensation d'irritation qui peut se développer après le rasage, la friction, ou le contact avec les allergènes
La présente invention a pour cinquième objet une composition pharmaceutique comprenant, en tant qu'agent actif, au moins un extrait selon l'invention ou un extrait obtenu par un procédé selon l'invention, et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
La présente invention a aussi pour sixième objet une composition nutraceutique comprenant, en tant qu'agent actif, au moins un extrait selon l'invention ou un extrait obtenu par un procédé selon l'invention, et au moins un excipient nutraceutiquement acceptable.
Dans la présente invention, on désigne par « pharmaceutiquement ou nutraceutiquement acceptable » tout ingrédient qui est utile dans la préparation d'une composition pharmaceutique ou nutraceutique, qui est généralement sûr, non toxique et ni biologiquement ni autrement non souhaitable et qui est acceptable pour une utilisation vétérinaire ou chez l'Homme.
On désigne par « sels pharmaceutiquement ou nutraceutiquement acceptables » d'un composé, des sels qui sont pharmaceutiquement ou nutraceutiquement acceptables, comme défini ci-dessus, et qui possèdent l'activité pharmacologique souhaitée du composé parent. De tels sels comprennent :
(1) les hydrates et les solvates,
(2) les sels d'addition d'acide pharmaceutiquement ou nutraceutiquement acceptables formés avec des acides inorganiques pharmaceutiquement ou nutraceutiquement acceptables tels que l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide sulfurique, l'acide nitrique, l'acide phosphorique et similaires ; ou formés avec des acides organiques pharmaceutiquement ou nutraceutiquement acceptables tels que l'acide acétique, l'acide benzènesulfonique, l'acide benzoïque, l'acide camphresulfonique, l'acide citrique, l'acide éthane-sulfonique, l'acide fumarique, l'acide glucoheptonique, l'acide gluconique, l'acide glutamique, l'acide glycolique, l'acide hydroxynaphtoïque, l'acide 2- hydroxyéthanesulfonique, l'acide lactique, l'acide maléique, l'acide malique, l'acide mandélique, l'acide méthanesulfonique, l'acide muconique, l'acide 2- naphtalènesulfonique, l'acide propionique, l'acide salicylique, l'acide succinique, l'acide dibenzoyl-L-tartrique, l'acide tartrique, l'acide p- toluènesulfonique, l'acide triméthylacétique, l'acide trifluoroacétique et similaires, ou
(3) les sels d'addition de base pharmaceutiquement ou nutraceutiquement acceptables formés lorsqu'un proton acide présent dans le composé parent est soit remplacé par un ion métallique, par exemple un ion de métal alcalin, un ion de métal alcalino-terreux ou un ion d'aluminium ; soit coordonné avec une base organique ou inorganique pharmaceutiquement ou nutraceutiquement acceptable. Les bases organiques acceptables comprennent la diéthanolamine, l'éthanolamine, N-méthylglucamine, la triéthanolamine, la trométhamine et similaires. Les bases inorganiques acceptables comprennent l'hydroxyde d'aluminium, l'hydroxyde de calcium, l'hydroxyde de potassium, le carbonate de sodium et l'hydroxyde de sodium.
Les modes d'administration, les posologies et les formes galéniques optimales d'une composition pharmaceutique selon l'invention peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement pharmaceutique adapté à un sujet comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement, les effets secondaires constatés, le type de peau. En fonction du type d'administration souhaitée, la composition pharmaceutique selon l'invention peut en outre comprendre au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. La composition pharmaceutique selon la présente invention peut en outre comprendre au moins un adjuvant pharmaceutiquement connu de l'homme du métier, choisi parmi les épaississants, les conservateurs, les parfums, les colorants, des filtres chimiques ou minéraux, les agents hydratants, les eaux thermales, etc. Avantageusement, ladite composition pharmaceutique comprend au moins un extrait selon l'invention en une quantité comprise entre 0,01 et 10%, en particulier entre 0,05 et 5%, plus particulièrement entre 0,1 et 2%, plus particulièrement entre 0,5 et 1%, en poids par rapport au poids total de la composition.
Une composition pharmaceutique est particulièrement adaptée pour une administration par voie orale, nasale, transdermique, parentérale, topique, rectale et mucosale. Elle peut se présenter sous forme sèche, telle que par exemple : capsule molle, gélule, comprimé, lyophilisât, poudre, granule, ou patch, ou sous forme liquide, telle que : solution, suspension, spray, crème ou gel.
L'excipient pharmaceutiquement acceptable est connu de l'Homme du Métier et est choisi selon le mode d'administration de la composition pharmaceutique. A titre d'exemple, l'excipient pharmaceutiquement acceptable peut être choisi dans le groupe constitué par les agents diluants, liants, désintégrants, les colorants, les lubrifiants, les agents solubilisants, les agents promoteurs d'absorption, les filmogènes, les agents gélifiants, et leurs mélanges.
La composition pharmaceutique selon l'invention peut en outre comprendre au moins un composé choisi dans le groupe constitué par les émollients, les actifs hydratants, les activateurs de la synthèse de kératine, les kératorégulateurs, les kératolytiques, les agents restructurant de la barrière cutanée (activateurs de la synthèse des lipides cutanés, agonistes PPARs ou Peroxysome Proliferator Activated Receptor), les activateurs de la différenciation des kératinocytes (rétinoïdes, calcidone®, le calcium), les antibiotiques, les agents anti-bactériens, les composés antifongiques, les agents anti-viraux, les sébo-régulateurs, les immunomodulateurs, tels que le tacrolimus, le pimécrolimus, les oxazolines, les conservateurs, les agents anti-irritants, les agents apaisants, des filtres et écrans solaires, les agents anti-oxydants, les facteurs de croissance, les agents cicatrisants ou les molécules eutrophiques, les médicaments et les agents anti-inflammatoires, les médicaments et les agents anti-Alzheimer. La présente invention a pour sixième objet un extrait selon l'invention ou une composition pharmaceutique selon l'invention, pour son utilisation en tant que médicament.
Plus particulièrement, la présente invention a également pour objet un extrait selon l'invention, un extrait obtenu par un procédé selon l'invention, ou une composition pharmaceutique selon l'invention ou une composition nutraceutique selon l'invention7 pour son utilisation en tant que médicament pour stimuler la défense antimicrobienne de la peau, et/ou pour atténuer ou traiter l'inflammation de la peau et/ou pour favoriser la cicatrisation cutanée, en particulier dans le cas de la fermeture d'une plaie.
Plus particulièrement, la présente invention a également pour objet un extrait selon l'invention, un extrait obtenu par un procédé selon l'invention, ou une composition pharmaceutique selon l'invention, pour son utilisation en tant que médicament pour prévenir ou ralentir le vieillissement cutané, et/ou pour stimuler le renouvellement de l'épiderme, et/ou pour avoir un effet apaisant de la peau ou un effet calmant de la peau suite à la sensation d'irritation. Dans ce cas, ledit extrait sera avantageusement associé à un excipient pharmaceutiquement acceptable et adapté pour une application cutanée, et ladite composition pharmaceutique contiendra avantageusement un excipient pharmaceutiquement acceptable et adapté pour une application cutanée. La présente invention a également pour objet une utilisation d'un extrait selon l'invention, un extrait obtenu par un procédé selon l'invention pour la préparation d'une composition cosmétique visant à prévenir ou retarder l'apparition des effets du vieillissement de la peau, et/ou à stimuler le renouvellement de l'épiderme et/ou avoir un effet apaisant ou un effet calmant de la peau suite à la sensation d'irritation. Selon cet objet, la présente invention concerne donc l'application, à titre de produit cosmétique, d'un extrait selon l'invention, ou d'un extrait obtenu par un procédé selon l'invention, pour prévenir ou retarder l'apparition des effets du vieillissement de la peau, et/ou stimuler le renouvellement de l'épiderme et/ou avoir un effet apaisant ou un effet calmant de la peau suite à la sensation d'irritation. La présente invention a également pour objet une méthode de soin cosmétique de la peau visant à prévenir ou retarder l'apparition des effets du vieillissement de la peau, et/ou à stimuler le renouvellement de l'épiderme, et/ou avoir un effet apaisant de la peau ou un effet calmant de la peau suite à la sensation d'irritation, ladite méthode étant caractérisée en ce qu'elle comprend l'application, sur au moins une partie de la peau du corps ou du visage, d'une composition cosmétique selon l'invention. Avantageusement, dans la méthode selon l'invention, la composition cosmétique est appliquée chez un sujet en ayant besoin, notamment en prévision de ou consécutivement à une exposition unique ou répétée de la peau à un stress oxydant. En effet, ce dernier peut générer un excès de radicaux libres pouvant accélérer les signes de vieillissement cutané.
En outre, l'invention concerne une méthode pour prévenir ou ralentir le vieillissement cutané, pour atténuer l'inflammation de la peau, pour avoir un effet apaisant de la peau ou un effet calmant de la peau suite à la sensation d'irritation, pour stimuler la défense antimicrobienne de la peau, plus particulièrement la défense antibactérienne de la peau et/ou pour favoriser la cicatrisation cutanée, en particulier dans le cas de la fermeture d'une plaie, chez un sujet en ayant besoin, comprenant l'administration au sujet d'une quantité thérapeutiquement efficace d'une composition nutraceutique selon l'invention ou d'une composition pharmaceutique selon l'invention.
Les exemples 1 à 3 qui suivent et les Figures 1 à 4 visent à illustrer la présente invention, sans toutefois en limiter la portée. EXEMPLES
EXEMPLE 1 : PREPARATION ET CARACTERISATION D'EXTRAITS RACINAIRES DE POLYGONUM MULTIFLORUM SELON L'INVENTION. Les extraits racinaires de Polygonum multiflorum sont préparés à partir de plantes dont les graines ont été achetées auprès d'un fournisseur chinois (Zhong Wei Organic Seeds) en 2012 et en 2013. Depuis 2013, les plantes de Polygonum multiflorum sont conservées et multipliées en serre par la demanderesse.
1.1 Effet de plusieurs milieux de culture comme milieux de
stimulation sur la croissance racinaire
L'étude a été réalisée dans 12 unités expérimentales de 32 plantes chacune reproduisant le système de culture en aéroponie. Les plantes sont initialement cultivées pendant 8 semaines avec un milieu de culture 15/10/30 (N/P/K) sur des pilotes de 16m2.
Pour cette expérience, 4 milieux de stimulation ont été testés, dont le milieu de culture initial. Il s'agit d'engrais ternaires habituellement utilisés en horticulture et dont la composition diffère selon leur rapport N/P/K (azote/phosphore/potassium). Les 4 modalités sont les suivantes : 0/15/40; 15/10/30; 20/20/20 et 28/14/14. Chaque modalité est répétée 3 fois selon une distribution aléatoire. Les plantes ont été cultivées avec les différents milieux pendant 4 semaines.
On observe que les parties aériennes croissent convenablement quel que soit le milieu utilisé. Parmi les 4 modalités testées, le milieu 0/15/40 offre une productivité racinaire convenable. Le milieu 15/10/30 permet une croissance des racines limitée avec des racines très courtes et peu ramifiées. Les autres milieux riches en azote, c'est-à-dire, les milieux 20/20/20 et 28/14/14 n'ont pas permis la production de racines.
1.2 Etude de plusieurs solvants pour la réalisation d'extrait racinaires de Polygonum multiflorum
Des plants de Polygonum multiflorum sont cultivés en aéroponie avec une solution nutritive définie, de composition N/P/K correspondant à 15/10/30 et à une électroconductivité comprise entre 1,0 et 1,2 mS/cm pendant 8 semaines, puis avec une solution nutritive définie, de composition N/P/K correspondant à 0/15/40 et à une électroconductivité comprise 1,0 et 1,2 mS/cm pendant 3 semaines.
Les racines sont coupées puis 500 g de racines fraîches sont mises à macérer pendant 48 heures à température ambiante dans 1 L de différentes solution aqueuse de solvant à 70/30 (solvantl/eau - v/v) à un pH acide de 1,6 et à un pH non ajusté, c'est-à-dire compris entre 5 et 7,5. Après macération, les racines sont retirées du solvant.
Les quatre solvants testés sont la glycérine, le dipropylène glycol, le propane 1,3 diol biosourcé (Zéméa ®) et le propane 1,2 diol.
La teneur en émodine, dans les extraits racinaires, est analysée par HPLC- MS (détecteur PDA, 254 nm). La quantification de l'émodine se fait grâce à un standard commercial d'émodine à 1 mg/L (Fournisseur=Shagai tauto Biotech ; ref= E0053) analysé en HPLC-MS (détecteur PDA, 254 nm). Comme, il a été impossible de quantifier ce composé dans les extraits, l'émodine étant sous le seuil de quantification de cette méthode, le rapport signal sur bruit (S/N) est mesuré afin d'évaluer grossièrement sa teneur dans les extraits. Lorsque le rapport est supérieur à 3, la quantité d'émodine est à la limite de détection. Lorsque le rapport est supérieur à 10, la quantité d'émodine est à la limite de la quantification. Le Tableau 1 résume les informations obtenues.
Solvant S/N (signal/bruit)
Dipropylène glycol 70% pH 1,6 1
Dipropylène glycol 70% pH 5-7,5 5
Zéméa ® 70% pH 1,6 1
Zéméa ® 70% pH 5-7,5 1
Propane 1,2 diol 70% pH 1,6 2
Propane 1,2 diol 70% pH 5-7,5 2
Glycérine 70% pH 1,6 0
Glycérine 70% pH 5-7,5 0 Tableau 1 : Rapport signal sur bruit dans les différents extraits obtenus avec 4 solvants différents à deux pH.
La teneur en émodine dans les extraits réalisés avec les 4 solvants, soit le Dipropylène glycol, le propane 1,2 diol, le Zéméa® et la glycérine aux deux pH testés est inférieure à la limite de détection d'émodine. Ces solvants permettent ainsi une extraction sélective du THSG sans ou avec très peu d'émodine.
1.3 Etude de stabilité d'un extrait racinaire de Polygonum multiflorum à différents pH acide
Le test de stabilité réalisé consiste à placer un échantillon d'extrait racinaire de Polygonum multiflorum à l'obscurité à 40 °C pendant 6 mois. Des prélèvements réguliers sont effectués afin de suivre l'évolution de la teneur en THSG des extraits par chromatographie liquide (HPLC-XR-Prominence, Shimadzu). Un standard de 2, 3, 5, 4'-tetrahydroxystilbene-2-0-beta-D- glucoside (THSG) à ΙΟΟμΜ est injecté au sein de chaque séquence d'analyse afin de normaliser les données.
Des plants de Polygonum multiflorum sont cultivés en aéroponie avec une solution nutritive définie, de composition N/P/K correspondant à 15/10/30 et à une électroconductivité comprise entre 1,0 et 1,2 mS/cm pendant 8 semaines, puis avec une solution nutritive définie, de composition N/P/K correspondant à 0/15/40 et à une électroconductivité comprise 1,0 et 1,2 mS/cm pendant 3 semaines. Les racines sont coupées, puis un extrait racinaire est obtenu par macération pendant 48 heures de 500 g de racines fraîches dans 1 L de du Propylène glycol à 70% dont le pH (avant la macération) a été ajusté à la valeur de 2,8 en utilisant de l'acide citrique à 3 M .
Le pH de l'extrait racinaire après extraction a ensuite été réajusté avec de l'acide citrique à 3M ou de la soude à 5 M à trois pH différents : pH 2,8 ; pH 4,0 et pH 6 ,8.
Les profils phytochimiques des échantillons d'extraits ont été suivis par HPLC au cours du temps pendant six mois. Un prélèvement a été réalisé chaque mois. La Figure 1 montre l'évolution de la teneur en THSG selon les 3 pH à 2, 4 et 6 mois.
On observe une nette décroissance de la concentration en THSG de l'extrait conservé au pH initialement neutre (pH 6,8). A partir du quatrième mois il ne subsiste que des traces de ce dernier au sein de l'extrait. Ce pH ne pourra donc pas être utilisé pour la conservation de l'extrait.
Au sein de l'échantillon conservé au pH initialement de 2,8, on observe que la teneur en THSG diminue progressivement. A partir du quatrième mois on observe un changement significatif de la concentration de l'échantillon, avec une perte de 32% de la quantité de THSG. Ce pH ne semble pas idéal non plus pour la conservation de l'extrait.
L'échantillon réajusté au pH 4,0 avant sa conservation semble plus stable. La teneur THSG diminue de 8% au bout de 6 mois. Ce pH semble être le meilleur candidat pour la conservation de l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum.
1.4 Extrait préparé à partir d'un solvant glycolé
Un extrait racinaire de Polygonum multiflorum concentré en THSG et comprenant une quantité d'émodine inférieure à la limite de quantification par chromatographie en phase liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse (HPLC/MS), est obtenu selon le procédé suivant :
• Culture de Polygonum multiflorum en aéroponie avec une solution nutritive définie, de composition N/P/K correspondant à 15/10/30 et à une électroconductivité comprise entre 1,0 et 1,2 mS/cm,
• Stimulation de la plante pendant une durée de 2 à 4 semaines par un stress azoté par l'utilisation d'une solution nutritive N/P/K comprenant : moins de 6% d'azote, 15% de phosphore et 40% de potassium, et d'une électroconductivité de 1,0 à 1,2 mS/cm,
• Extraction des molécules d'intérêt par immersion des racines encore accrochées à la plante pendant une durée de 15 à 30 minutes dans un mélange propane 1,2 diol/eau, selon un ratio compris entre 85/15 et 70/30, à température ambiante et à un pH compris entre 3,5 et 4,5.
• Extraction des molécules d'intérêt par macération des racines coupées de la plante, pendant une durée de 48 à 96 heures dans un mélange propane 1,2 diol/eau selon un ratio compris entre 85/15 et 70/30, à température ambiante et à un pH compris entre 3,5 et 4,5, • Mélange des extraits obtenus aux deux étapes d'extraction précédentes,
• L'extrait est concentré par nanofiltration et clarifié par filtration clarifiante, et
· Réajustement de la teneur en propane 1,2 diol de l'extrait (au moins 50%) ainsi que du pH (approximativement 4) de l'extrait en vue de sa conservation.
L'extrait racinaire de Polygonum multiflorum ainsi obtenu présente les caractéristiques suivantes :
· Teneur en extrait sec : 10,8 g/L
• Teneur en THSG : 270 mg/L (soit 2,5% de l'extrait sec)
• Teneur en émodine : inférieure à la limite de quantification
• Solvant : 60%
pH : 4,3
La quantification du THSG (2,3,5,4'-tetrahydroxystilbene-2-0^-D-glucoside) se fait grâce à une gamme étalon préparée à partir de standards commerciaux fourni par Sigma-AIdrich, référence : SML0834 (Saint-Quentin Fallavier, France) solubilisé dans le solvant DMSO/eau miliQ pH 3.0 (70/30 vol, pH ajusté par HCI 2N).
La quantification de l'émodine (6-methyl-l,3,8-trihydroxyanthraquinone) se fait grâce à une gamme étalon préparée à partir de standards commerciaux fourni par Shangai Tuto Biotech Co LTD, référence : E-0053 (CHINA) solubilisé dans le solvant DMSO/eau miliQ pH 3.0 (70/30 vol, pH ajusté par HCI 2N).
En Figure 2 et en Figure 3 sont présentés des chromatogrammes de l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum obtenu selon l'exemple 1. L'appareil utilisé pour analyser l'extrait est une HPLC Shimadzu Nexera X2 (les pompes LC-30AD, passeur d'échantillon SIL-30AC, four CTO-20A, détecteurs à barrette de diodes SPD-M20A ; Kyoto, Japon) fonctionnant en phase inverse avec une colonne Kinetex biphenyl (00F-4622-AN, Phenomenex, Torrance, CA, USA) de dimensions 150 mm x 2.1 mm, 2.6 pm. La phase mobile est constituée d'un solvant A (Eau ultrapure Mili-Q, Merck Millipore +0.1% d'acide formique, Carlo Erba, Val-de-Reuil, France) et d'un solvant B (Acetonitrile, Sigma-AIdrich Chemie GmbH, Steinheim, Allemagne) dont le gradient a été programmé de la façon suivante : % B : 5-31,4% (0-6 min), 31,4-90% (6-6,1 min), 90% (6,1-7,9 min), 90-5% (7,9-8,0 min), 5% (8-10 min). Le débit d'analyse est de 0,5 mL/min avec une température de four de 40°C. En sortie de colonne, un détecteur à barrettes de diodes enregistre les spectres UV entre 220 et 370 nm. L'appareil est couplé à un spectromètre de masse (Shimadzu LCMS-2020) fonctionnant avec une ionisation par électrospray (4,5 kV) en mode positif et négatif dans une gamme de m/z entre 100 et 1000. Le logiciel LabSolutions (version 5.60 SP2) est utilisé pour exploiter le système. L'extrait à analyser est filtré sur un filtre 0,2pm avant injection.
En Figure 2, le chromatogramme présente un pic majoritaire pour un temps de rétention aux environs de 4,40 min correspond au THSH. En Figure 3, aucun pic n'est détecté pour un temps de rétention aux environs de 8,9 (±5%) min correspondant au standard d'émodine, confirmant que la quantité d'émodine dans l'extrait est inférieure à la limite de quantification.
EXEMPLE 2 : CARACTERISATION D'UN EXTRAIT RACINAIRE DE POLYGONUM MULTIFLORUM VIS-A-VIS D'UN BENEFICE POUR LA PEAU - IDENTIFICATION DE CIBLES PAR ANALYSE DES MODIFICATIONS D'EXPRESSION DE GENES PAR QRT-PCR SUR CARTES TAQMAN
L'étude consiste à mesurer les effets de l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum par qRT-PCR sur cartes TaqMan microfluidiques, d'une part, sur l'expression de 94 gènes impliqués dans la biologie du derme, le remodelage des tissus conjonctifs et le vieillissement (carte « Dermal Benefits » définie par la société StratiCELL) et, d'autre part, sur l'expression de 94 gènes impliqués dans les fonctions clés de l'épiderme, telles que la fonction barrière en lien direct avec l'hydratation, la réponse antioxydante, ou encore la pigmentation par les mélanocytes (carte « Epidermal Benefits » définie par la société StratiCELL).
Le protocole a consisté à ajouter de l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum dans le milieu de culture de fibroblastes humains NHDFs (Normal Human Dermal Fibroblasts) en monocouche et d'épidermes humains mélanisés reconstitués (RHE/MEL/001), et, après 24 h, à analyser les différentes populations d'ARN pour identifier les gènes différentiellement exprimés par qRT-PCR.
Une étude préalable de cytotoxicité a permis de définir la concentration de travail de l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum pour l'étude d'expression génique.
Le TGF-βΙ (Transforming Growth Factor-beta-1) et la vitamine D3 (la, 25- dihydroxyvitamin D3), dont les effets sont documentés dans la littérature, ont été utilisés comme molécules de référence afin de valider les systèmes d'essai et la méthode d'analyse.
2.1. Matériels et méthodes Extrait
Les plantes Polygonum multiflorum sont cultivées en aéroponie selon l'exemple 1. Les racines fraîches sont coupées puis macérées à température ambiante pendant 48 heures dans une solution hydroéthanolique à 70/30 (éthanol/eau - v/v) à un ratio de 500 g de racines pour un litre de solvant et à un pH non ajusté. Ensuite l'extrait est filtré. Le solvant est éliminé en utilisant un évaporateur rotatif et la poudre séchée au dessiccateur. Une analyse par chromatographie en phase liquide couplée à une spectrographie de masse (HPLC/MS), réalisée selon le protocole décrit dans l'exemple 1.4 a permis de vérifier que la teneur en émodine est inférieure à la limite de quantification et que le THSG est présent majoritairement dans l'extrait. Culture Cellulaire
La première partie de l'étude a été réalisée sur des fibroblastes de derme humains NHDFs (ATCC, CRL-2522, origine : prépuce) cultivés en monocouche en milieu DMEM (Invitrogen, 31885-049) contenant des antibiotiques (Pénicilline/Streptomycine, Invitrogen, 15140-122) mais ne contenant pas de sérum. Ces cellules ont été maintenues dans une atmosphère humide à 37°C contenant 5% de C02.
La seconde partie de l'étude a été réalisée sur des épidermes reconstitués (StratiCELL®, RHE/MEL/001) contenant ou non des mélanocytes humains primaires NHEMs (Normal Human Epidermal Mélanocytes) provenant d'un donneur de phototype foncé (phototype IV à V) (Invitrogen, C2025C, lot n°439684). Les tissus ont été cultivés à l'interface air-liquide durant 14 jours dans un milieu de culture approprié, et une atmosphère humide à 37°C contenant 5% de C02. Détermination de la gamme de concentrations d'étude de l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum par une étude préliminaire de cytotoxicité
Afin de déterminer la concentration d'analyse optimale pour l'extrait racianire de Polygonum multiflorum, une expérience préliminaire a été réalisée sur fibroblastes NHDFs, sur mélanocytes humains NHEMs et sur épidermes reconstitués.
Les fibroblastes NHDFs ont effectué 30,1 et 30,7 doublements de population et les mélanocytes NHEMs ont été ensemencés en plaques 24 puits 24 h avant l'application des actifs.
Les épidermes reconstitués (RHE/001 ; lot CB0314/2) ont été transférés dans une plaque 12 puits avant d'être traités avec l'extrait.
L'extrait a été dilué dans le milieu de culture, puis ajouté, sans filtration préalable, dans le milieu de culture des fibroblastes humains NHDFs ne contenant pas de sérum, dans le milieu des mélanocytes humains primaires NHEMs, ou dans le milieu de culture des épidermes différenciés.
Cette étude a consisté à évaluer la viabilité des cellules et des épidermes au MTS (3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-5-(3-carboxy-methoxyphenyl)-2-(4- sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (Promega,G3581), 24 heures après l'ajout d'extrait racinaire de Polygonum multiflorum et ce, à 5 concentrations et 3 répétions (n = 3) pour les fibroblastes NHDFs et les mélanocytes NHEMs, et à 2 concentrations et 3 répétitions (n = 3) pour les épidermes reconstitués. Les 2 concentrations testées pour les épidermes reconstitués ont été choisies sur la base des résultats de cytotoxicité obtenus pour les mélanocytes NHEMs. Le SDS (sodium dodécyl sulfate) est toxique pour les cellules et a été utilisé en tant que contrôle positif afin de valider l'expérience.
Au terme de cette expérience, une concentration non cytotoxique a été définie afin de procéder à la mesure des modifications d'expression des gènes cibles.
Les concentrations suivantes, en pg d'extrait sec/ml, ont été testées : Fibroblastes NHDFs et les mélanocytes NHEMs: 0,16 Mg/ml, 0,8 Mg/ml, 4 Mg/ml, 20 Mg/ml, 100Mg/ml ;
Epidermes reconstitués : 20 pg/ml et 100 Mg/ml . Analyse des modifications d'expression génique
L'extrait a été ajouté, à une concentration choisie, dans le milieu de culture des fibroblastes humains NHDFs (ayant effectué 30,5 et 30,8 doublements de population) en absence de sérum ou dans le milieu de culture des épidermes différenciés mélanisés (RHE/MEL/001, lots CB0314/3 et CB0314/4), sans filtration préalable à la mise en contact des cellules/épidermes.
Des molécules de référence ont été étudiées en parallèle, à savoir, le TGF-βΙ pour les fibroblastes NHDFs et la vitamine D3 (VD3) pour les épidermes reconstitués.
Extraction de l'ARN total
L'extraction des ARNs totaux a été réalisée à l'aide du kit RNeasy Mini (Qiagen, 74106). 24 h après l'ajout de l'extrait, les cellules ont été rincées au PBS et lysées dans le tampon de lyse ad hoc, alors que les épidermes ont été directement plongés dans ce tampon (des triples de culture ont été réalisés pour chaque condition). L'extraction et la purification des ARNs ont été réalisées selon les instructions du fournisseur. Les ARNs totaux ont ensuite été conservés à -80°C. Qualification des ARNs par spectrophotométrie et électrophorèse capillaire
La concentration des ARNs totaux a été déterminée par mesure spectrophotométrique. La qualité et l'intégrité des ARNs ont ensuite été vérifiées par électrophorèse capillaire (plate-forme Agilent Bioanalyzer 2100 - Agilent RNA 6000Nano Kit, 5067-1511).
Quantification des ARN par mesure spectrophotométrique : un aliquot de chaque ARN a été dilué dans de l'eau RNase-free et sa concentration a été déterminée à l'aide d'un spectrophotomètre Ultrospec 1100 Pro (Amersham).
Intégrité des ARN par électrophorèse capillaire sur Bioanalyseur Agilent : l'intégrité de l'ARN total a été évaluée par la visualisation des pics d'électrophorèse correspondant aux ARNs ribosomiaux. Pour les ARN totaux d'eucaryotes supérieurs, la taille des bandes ribosomales doit être de 1,9 kb pour le 18S-ARN et de 4,7 kb pour le 28S-ARN. L'intensité de la bande correspondant au 28S-ARN doit être supérieure à l'intensité de la bande correspondant au 18S-ARN. Des petites bandes diffuses représentant des ARNs de poids moléculaire plus faible (ARNt et l'ARN ribosomique 5S) peuvent être présentes. Lorsque l'ARN est dégradé, on observe un étalement des bandes de l'ARN ribosomal ainsi qu'un bruit de fond des ARN de poids moléculaire plus élevé.
Synthèse des ADNs complémentaires ou ADNc
Les transcriptions inverses (RT) ont été réalisées à l'aide du kit « High Capacity RNA-to-cDNA Kit » (Applied Biosystems, 4387406). Pour la synthèse des ADNc, un mix a été préparé selon les instructions du fournisseur, avec 2 pg d'ARN total, le tampon ad hoc fourni dans le kit et l'enzyme transcriptase inverse. Cette réaction a été réalisée à 37°C pendant 1 heure, puis 5 minutes à 95°C et finalement les échantillons d'ADNc ont mis sur glace et stockés à - 20°C. Validation des systèmes d'essai - qPCR en temps réel à l'aide de sondes fluorescentes de type TaqMan
La méthode de qPCR en temps réel a été utilisée pour quantifier l'expression de différentes cibles spécifiques dans les populations d'ARNs issues des fibroblastes NHDF traités par le TGF-βΙ (20ng/ml) ainsi que des épidermes mélanisés traités par la vitamine D3 (ΙΟΟηΜ) et par le solvant éthanol (EtOH 0,1%), utilisé pour solubiliser la VD3.
Les séquences cibles des gènes d'intérêt ont été amplifiées par PCR en utilisant les « TaqMan Gene Expression Assays » (Applied Biosystems). Ces kits comprennent une sonde TaqMan et 2 amorces spécifiques, qui ont été pré-mélangées à une concentration de 18 μΜ pour chaque amorce et de 5 μΜ pour la sonde. Ce mélange est concentré 20 fois. Les sondes TaqMan ont été greffées avec un fluorophore (FAM) à l'extrémité 5' de la séquence et avec un «quencher» de fluorescence en 3'.
Les PCRs ont été réalisées à l'aide du système 7900HT Fast Real-Time PCR (Applied Biosystems). Les réactions ont été réalisées dans un volume de 20 μΙ_. Le mélange réactionnel contient 10 μΙ_ de TaqMan Fast Universal Master Mix (Applied Biosystems), 1 μΙ_ de TaqMan Gene Expression Assay et 5 pL d'eau RNase-free.
Dans chaque puits d'une microplaque 96 puits, 16 μΙ_ du mélange et 4 μΙ_ d'ADNc (4 ng) ont été ajoutés. A des fins de normalisation, des mélanges réactionnels avec des sondes et amorces correspondant à la glycéraldehyde- 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) pour les fibroblastes et à la β2- microglobuline (B2M) pour les épidermes mélanisés ont également été préparés avec les mêmes échantillons d'ADNc. Un contrôle sans ADNc a servi de contrôle négatif d'amplification. Les cycles thermiques ont été programmés avec une étape d'incubation à 50°C pendant 2 min, suivie d'une première étape de dénaturation à 95°C pendant 10 min. Le protocole d'amplification PCR s'est poursuivi avec 40 cycles de 15 sec à 95°C suivi d'une min à 60°C.
Les niveaux d'expression ont été quantifiés selon la méthode de calcul de l'expression relative par rapport à un gène de ménage (2"Δα), dérivée du calcul des ΔΔΟ: (Pfaffl, A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR, Nucleic Acids Res, 29 (9), 2001, 2002-2007; Livak and Schmittgen, Analysis of relative gene expression data using Real-Time Quantitative PCR and the &a method, Methods, 25 (4), 2001, 402-408) décrite ci-après :
La quantification relative des transcrits a été réalisée par l'utilisation d'une méthode de calcul qui consiste à comparer la moyenne des valeurs de contrôle (Ct) obtenues pour les conditions TGF-βΙ (20ng/ml) et VD3 (ΙΟΟηΜ) avec les conditions témoins respectives (CTL non traité et CTL Ethanol 0,1%). Ces Ct représentent le seuil de détection à partir duquel la quantité d'ADN est telle que le signal se distingue significativement du bruit de fond . Cette valeur moyenne de Ct a été normalisée par rapport à un gène de ménage, à savoir la Glycéraldehyde-3-phosphate déshydrogénase {GAPDH) pour les fibroblastes NHDF et la β2-microglobuline (B2M) pour les épidermes mélanisés reconstitués. Ainsi, la différence de niveau d'expression (RQ) a été obtenue par utilisation de la formule :
2_ (ACt condition traitée - ACt condition de référence)
où ACt = Ct (gène cible) - Ct (gène de ménage) au sein d'un même échantillon d'ADNc. Préparation des cartes microfluidiques Taqman, réalisation de la PCR quantitative et analyse des Ct
Les mélanges réactionnels pour PCR sur cartes microfluidiques TaqMan, produites à façon par Applied Biosystems, ont été préparés en suivant les instructions détaillées du guide Applied Biosystems Micro Fluidic Card Getting Started Guide. En résumé, 100 ng d'ADNc ont été ajoutés à un mélange spécifique pour PCR (Taqman Universal PCR Master Mix, 4364338, Applied Biosystems) avant d'être injectés dans la carte et dispersés par capillarité. Après avoir centrifugé la carte, celle-ci a été scellée avant la réalisation de la PCR quantitative et l'analyse avec le système 7900HT d'Applied Biosystems, à l'aide du software ABI PRISM® 7900 Séquence Détection System, SDS2.4. Les cycles seuil (Ct) ont été obtenus pour tous les gènes représentés sur les cartes et exprimés par les fibroblastes NHDF et par épidermes reconstruits mélanisés.
Les résultats ont été exportés à partir du dispositif de qPCR en temps réel en utilisant le logiciel SDS RQ Manager (vl.2.1, Applied Biosystems) et l'analyse des modifications d'expression a été réalisée à l'aide du logiciel Data Assist (V3.0., Applied Biosystems) conçu pour réaliser la quantification relative de l'expression génique en utilisant la méthode de comparaison des Ct (ΔΔΟ:) (Pfaffl, 2001 et Livak and Shmittgen, 2001) décrite dans le paragraphe ci- dessus et une combinaison d'analyses statistiques. Comme précisé plus haut, la méthode de calcul des ΔΔΟ: consiste en la comparaison des valeurs de Ct obtenues pour les conditions traitées par l'extrait avec la condition de référence (contrôle DMSO). Ces valeurs de Ct ont elles-mêmes été normalisées par rapport au gène de ménage GAPDH (glycéraldéhyde-3- phosphate déshydrogénase) pour les fibroblastes NHDF et B2M (β-2 microglobulin) pour les épidermes reconstruits mélanisés. La valeur de Ct maximale admissible utilisée comme seuil de détection a été fixée à 36 cycles.
2.2. Résultats
2.2.1. Détermination de la concentration d'analyse de l'extrait par une étude de cytotoxicité L'étude préalable de cytotoxicité sur les fibroblastes NHDF, sur les mélanocytes humains NHEM et sur les épidermes reconstitués a permis de définir une concentration de travail (préparé dans du DMSO) pour l'étude d'expression génique. Le solvant présent dans l'extrait a été testé en parallèle. Le SDS à 0,08% (pour NHDF) et à 0,05% (pour NHEM) a été utilisé comme contrôle positif de cytotoxicité afin de valider l'expérience. Sur la base de ces résultats (données non montrées), les concentrations suivantes ont été choisies pour la suite de l'étude : 100 pg d'extrait sec /ml (pour les fibroblastes NHDF) et 100 pg d'extrait sec/ml (pour les épidermes mélanisés reconstitués).
2.2.2. Qualification des ARNs par électrophorèse capillaire
Les différentes populations d'ARN démontrent bien la présence de pics étroits, correspondant aux ARNs ribosomiaux 18S et 28S, et un rapport équilibré entre les deux pics. L'absence de pics intermédiaires et étalés, caractéristiques de produits de dégradation des ARNs témoigne de l'intégrité des différentes populations (données non montrées). La qualité et l'intégrité des ARNs extraits étant démontrée, ceux-ci ont dès lors été utilisés pour la poursuite du protocole et engagés dans les réactions de synthèse des ADNs complémentaires.
2.2.3. Effets de l'extrait sur 94 gènes cibles au sein des fibroblastes NHDF
L'extrait a été ajouté dans le milieu de culture des fibroblastes NHDF (n = 3). Des contrôles traités seulement par le solvant DMSO à 1% (véhicule de l'extrait) ont également été analysés. En parallèle, le TGF-βΙ (20 ng/ml) a été étudié en tant que contrôle de validation. Après 24 heures de culture des fibroblastes NHDF, les populations d'ARNs totaux ont été extraites, leur intégrité a été analysée par électrophorèse capillaire, et les différences d'expression géniques ont été analysées par qRT-PCR à l'aide de cartes TaqMan 96-puits, ciblant les fonctions clés du derme.
Les résultats sont présentés de manière récapitulative sous la forme d'un tableau (Tableau 2) indiquant des gènes représentatifs d'un effet cosmétique bénéfique, variant significativement, 24 heures après l'application de l'extrait sur des fibroblastes de derme humains NHDF. Symbole Nom du gène RQ p-value
SOD2 Superoxyde dismutase 2, mitochondriale 13,80 0,0011
CCL5 Chémokine (C-C motif) ligand 5 3,75 0,0059
NGF Beta-nerve growth factor 1,89 0,0008
HMOXl Hème oxygénase (decycling) 1 1,79 0,0114
NQOl NAD(H) déshydrogénase, quinone 1 1,61 0,0034
COL3A1 Sous-unité alpha-1 du collagène de type III 1,52 0,0433
TXNRD1 - Thiorédoxine réductase 1 1,51 0,0225
CYR61 Protéine CYR61 1,50 0,0277
G6PD Glucose-6-phosphate déshydrogénase 1,24 0,0181
BDNF/NT-3 récepteur de facteurs de
NTRK2 croissance 0,57 0,0038
Tumor necrosis factor receptor superfamily
NGFR member 16 (p75NTR) 0,08 0,0115
Tableau 2 : Liste des gènes qui varient de manière significative 24 heures après l'application de l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum (à 100 pg ES/ml) sur des fibroblastes de derme humains NHDFs. Le symbole des gènes, le nom des gènes, l'expression relative (RQ) par rapport au véhicule DMSO à 1% (RQ > 1 : augmentation) et la valeur p (p-value) sont présentés.
• Défense anti-oxydante (5 gènes surexprimés)
L'extrait racinaire de Polygonum multiflorum induit remarquablement l'expression du gène de la superoxyde dismutase 2 (SOD2) (X 13,8). Cette régulation est couplée à la surexpression d'autres gènes impliqués dans la réponse au stress oxydant, tels que HMOXl (hème oxygénase 1 (XI, 8)), TXRND1 (thiorédoxine réductase 1 (XI, 5)), NQOl (NAD(H) déshydrogénase, quinone 1 (XI, 6)) et G6PD (Glucose-6-phosphate déshydrogénase (X 1,2)). La superoxyde dismutase 2 codée par le gène SOD2 est une protéine mitochondriale impliquée en première ligne dans la défense contre les espèces réactives de l'oxygène (ROS). En effet, elle convertit l'anion superoxyde en hydroperoxyde qui, lui-même, est convertit en oxygène et en eau par la catalase et les peroxyrédoxines.
Le gène HMOX1 codant pour la protéine HO-1 ou hème oxygénase est souvent surexprimé en réponse à un stress, et joue un rôle crucial dans la protection et le maintien de l'homéostasie cellulaire. La protéine HO-1 est impliquée dans la dégradation de Thème (ayant des propriétés prooxydantes) en monoxyde de carbone, fer ferreux et biliverdine. Ces 2 derniers composants sont les précurseurs des antioxydants bilirubine et ferritine. HMOX1 est donc connu pour son rôle protecteur contre le stress oxydant. Le système thiorédoxine est un des systèmes majeurs de défense antioxydante. Dans ce système, la thiorédoxine réductase catalyse le transfert d'électrons provenant du NADPH (Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate) vers la thiorédoxine, qui elle-même exerce une action réductrice sur diverses protéines cibles. Parmi les 3 isoformes de la thiorédoxine réductase, l'isoforme 1 codée par le gène TXRND1 est la plus étudiée. Elle est connue pour être notamment sous le contrôle transcriptionnel du facteur de transcription Nrf-2 jouant un rôle majeur dans la défense anti-oxydante. La NAD(H) déshydrogénase, quinone 1 (NQOl) est une autre enzyme détoxifiante qui favorise, par réduction, la formation des hydroquinones à partir des quinones, empêchant la production d'espèces radicalaires. Le gène NQOl est surexprimé en réponse à des agents pro-oxydants, à des métaux lourds, aux UV ou encore à des radiations ionisantes afin de protéger la cellule de leurs effets néfastes.
La glucose-6-phosphate déshydrogénase codée par le gène G6PD est la première enzyme de la voie des pentoses phosphates. Elle catalyse l'oxydation du glucose-6-phosphate en 6-phosphoglucono-5-lactone. Cette réaction est couplée à la réduction d'une molécule de NADP+ en NADPH, nécessaire à la réduction du glutathion GSSG (forme oxydée) en glutathion GSH (forme réduite), un puissant antioxydant.
La surexpression de 5 gènes impliqués dans la défense anti-oxydante témoigne de la capacité de l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum à réduire les effets de stress pro-oxydants générant un excès de radicaux libres, comme les UV accélérant les signes de l'âge au niveau de la peau, ou encore de lutter contre diverses pathologies ou conditions pro-inflammatoires cutanées, également génératrices d'espèces réactives de l'oxygène. Structure et homéostasie de la matrice extracellulaire (MEC)
L'extrait racinaire de Polygonum multiflorum induit l'expression du gène COL3A1 (X 1,5) qui code pour la sous-unité alpha-1 du collagène de type III, et du gène CYR61 (X 1,5) qui code pour une protéine de la MEC CYR 61 pour « cysteine-rich angiogenic protein 61 ». La protéine CYR61 est exprimée au niveau des sites inflammatoires et des plaies cutanées où elle induit la production de nouvelle matrice extracellulaire. Les collagènes fibrillaires sont, de loin, les protéines les plus abondantes dans la peau, constituant plus de 90% de son poids sec. Le collagène de type I représente 60 à 80% des collagènes du derme et de l'hypoderme alors que le collagène de type III (COL3A1) compte pour 15 à 25% et le collagène de type V pour 2 à 5%. Les collagènes de type I, III, et V s'auto-assemblent en fibres plus épaisses pour former un réseau tridimensionnel dans toute l'épaisseur du derme. Ainsi, le collagène III (COL3A1) joue un rôle de structure au niveau de la MEC et donc dans la résistance et l'élasticité du derme. L'induction du gène COL3A1 par l'extrait pourrait se révéler intéressant en vue d'une stratégie anti-âge pour permettre une diminution la dégradation du derme avec l'âge · Neurotrophines et perception de la douleur
Plusieurs gènes sont également réprimés par l'extrait : c'est le cas de NTRK2 (X0,6) et de NGFR (X0,08). Ces derniers codent pour des récepteurs aux neurotrophines, responsables de la sensation de la douleur. La sous- expression de ces gènes pourrait favoriser un effet apaisant de la peau ou un effet calmant de la peau due à une condition inflammatoire ou une sensation d'irritation qui se développe après le rasage, la friction, ou le contact avec les allergènes.
Les neurotrophines font partie d'une famille de facteurs de croissance contrôlant le développement, la maintenance et l'apoptose des cellules neuronales. Les neurotrophines exercent également de multiples fonctions non-neuronales : elles régulent la prolifération et la différenciation cellulaire, l'apoptose et le remodelage des tissus notamment au niveau de la peau. Les fibroblastes de derme ainsi que les myofibroblastes synthétisent et sécrètent des neurotrophines telles que le Nerve Growth Factor (NGF), le Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) ou encore la neurotrophine-3 (NT- 3). Les effets des neurotrophines sont médiés par leurs récepteurs exprimés également par les fibroblastes. On distingue deux classes de récepteurs : les récepteurs de la famille des tyrosine kinase receptors (Trk) et le récepteur aux neurotrophines p75 (p75 NTR ou NGFR). Chaque récepteur a une affinité et spécificité propre vis-à-vis de son ou de ses ligands. TrkB (codé par le gène NTRK2) lie spécifiquement BDNF ainsi que NT-3 et NT-4. P75 NTR est quant à lui capable de lier toutes les neurotrophines.
Les neurotrophines, via leurs récepteurs, stimulent la prolifération et la migration des fibroblastes ainsi que la différenciation des fibroblastes en myofibroblastes. Elles pourraient donc être impliquées dans la régulation du remodelage des tissus lors du processus de cicatrisation des plaies cutanées. Le NGF est un facteur neurotrophique, initialement décrit comme un facteur de survie des neurones dans le système nerveux central, mais également au niveau des neurones sensoriels ou des nocicepteurs de la peau. NGF joue également un rôle dans l'inflammation. En effet, la neutralisation du NGF inhibe la sensibilisation des neurones sensoriels (nocicepteurs), avec pour effet de réduire la perception de la douleur associée à un état inflammatoire. L'extrait favorise un effet apaisant de la peau ou un effet calmant de la peau due à une condition inflammatoire ou une sensation d'irritation qui se développe après le rasage, la friction, ou le contact avec les allergènes.
• Cicatrisation cutanée
L'extrait racinaire de Polygonum multiflorum induit l'expression du gène CCL5, codant pour la chémokine (C-C motif) ligand 5, encore appelée RANTES. Il a été montré que cette chémokine joue un rôle important dans le processus de cicatrisation cutanée. Elle est impliquée dans la migration des cellules souches dérivées du derme (dermal stem cells, DSC) vers le site de lésion cutanée. Ce processus est essentiel pour la ré-épithélialisation, la repopulation des fibroblastes au niveau du derme et l'angiogenèse.
2.2.4 Effets de l'extrait sur 94 gènes cibles au sein des épidermes reconstruits mélanisés (RHE/MEL/OOl)
• Cicatrisation cutanée L'extrait racinaire de Polygonum multiflorum induit d'une amplitude remarquable (d'un facteur 4,1, p-value = 0,0175) l'expression du gène de la métalloprotéinase-1 MMP-1. Les MMPs sont des métalloprotéinases capables de cliver la plupart des composants de la MEC et de modifier, par protéolyse, bon nombre de molécules importantes pour la cicatrisation cutanée. En particulier, MMPl joue un rôle majeur dans la ré-épithélialisation des kératinocytes. MMPl facilite l'assemblage de la MEC, l'élongation et la migration des cellules, la réorganisation du cytosquelette d'actines, et induit l'activation de la kinase ERK (extracellular signal-regulated kinase) nécessaire à la motilité et la capacité d'invasion des cellules épithéliales. En outre, il a été montré que la protéine MMPl est surexprimée au niveau de l'épiderme en réponse aux plaies cutanées.
La surexpression du gène MMP-1 au niveau de l'épiderme par l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum permet de le positionner comme actif favorisant potentiellement la cicatrisation cutanée, en particulier au niveau de la fermeture de la plaie.
2.3 Conclusion En synthèse, l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum se positionne clairement par rapport à une revendication cosmétique dans une optique anti- âge liée à une activité antioxydante et une réduction de la dégradation du derme.
L'extrait, de par son rôle dans le contrôle de la production de radicaux libres, pourrait être utilisé comme actif pour atténuer ou traiter l'inflammation de la peau.
De plus, l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum pourrait avoir un effet apaisant de la peau ou un effet calmant de la peau suite à la sensation d'irritation qui peut se développer après le rasage, la friction, ou le contact avec les allergènes.
Enfin, l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum se positionne éventuellement comme un actif favorisant la cicatrisation cutanée, en particulier dans le cas de la fermeture d'une plaie. Exemple 3 : Effet d'extraits racinaires de Polygonum multiflorum dans du propane 1,2 diol, sur des kératinocytes humains - Etude en puces à ADN "GeneChip Human Gene"
Afin d'analyser la possibilité qu'un extrait selon l'invention possède une action anti-âge, une étude transcriptomique sur puce à ADN a été réalisée à partir de kératinocytes humains (NHEKs) traités durant 24 heures par un extrait racinaire de Polygonum multiflorum. Les variations d'expression des gènes ont été contextualisées et interprétées biologiquement au travers de la base de données propriétaire « StratiCELL Skin Knowledge database ».
Une étude de cytotoxicité préalable réalisée a permis de déterminer la concentration optimale de l'extrait utilisé pour l'étude.
3.1. Matériels et méthodes Extrait
Un extrait racinaire de polygonum multiflorum a été préparé selon l'exemple 1.4.
Culture Cellulaire
L'étude a été réalisée sur des kératinocytes de l'épiderme humains NHEKs (Normal Human Epidermal Kératinocytes ; Lonza, 0019206, origine : prépuce) cultivés en monocouche en milieu Epilife contenant de l'HKGS (Human Keratinocyte Growth Supplément) et de la gentamycine.
Les cellules ont été maintenues dans une atmosphère humide à 37°C contenant 5% de C02.
Détermination de la gamme de concentrations d'étude de l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum par une étude préliminaire de cytotoxicité
Les kératinocytes NHEKs ont été ensemencés en plaques 24 puits 24 heures avant l'application de l'extrait en milieu Epilife (INVITROGEN, M-EPI-500 A) contenant le supplément HKGS (INVITROGEN, S-001-K) et de la gentamycine (INVITROGEN, 15710-049).
L'extrait a été solubilisé dans le milieu de culture approprié, puis placé en contact des kératinocytes NHEKs durant 24 heures. Cette étude a consisté à évaluer la viabilité des cellules au MTS (3-(4,5- dimethythiazol-2-yl)-5-(3-carboxy-methoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H- tetrazolium) (Promega,G3581), 24 heures après l'ajout de l'extrait et de son solvant ou véhicule (propane 1,2 diol 60% pH = 3,5) et ce, à 5 concentrations et 3 répétions (n = 3).
Le SDS (sodium dodécyl sulfate) est toxique pour les cellules et a été utilisé en tant que contrôle positif afin de valider l'expérience.
Au terme de cette expérience, une concentration non cytotoxique a été définie afin de procéder à l'analyse transcriptomique.
Les concentrations suivantes, en pourcentage v/v, ont été testées pour l'extrait et le solvant: 3%, 1%, 0,33% 0,11%, 0,037%
Traitement des cellules
L'extrait ou le solvant ont été appliqués à une concentration choisie, pendant 24h, dans le milieu de culture des kératinocytes NHEKs. Des quadruples de culture ont été réalisés pour chaque condition (n=4).
Extraction de l'ARN total
Au terme des traitements, les populations d'ARNs totaux ont été extraites. L'extraction a été réalisée à l'aide du kit RNeasy (Qiagen). Après 24h de traitement, les cellules ont été rincées avec du PBS et lysées dans du tampon ad hoc. L'extraction et la purification des ARNs ont été réalisées selon les instructions du fournisseur. Les ARNs totaux ont ensuite été conservés à - 80°C en vue de l'analyse transcriptomique.
Qualification des ARNs par spectrophotométrie et électrophorèse capillaire
La concentration des ARNs totaux a été déterminée par mesure spectrophotométrique. La qualité et l'intégrité des ARNs ont ensuite été vérifiées par électrophorèse capillaire (plate-forme Agilent Bioanalyzer 2100 - Agilent RNA 6000Nano Kit, 5067-1511).
Quantification des ARN par mesure spectrophotométrique : un aliquot de chaque ARN a été dilué dans de l'eau RNAse-free et sa concentration a été déterminée à l'aide d'un spectrophotomètre Ultrospec 1100 Pro (Amersham). Intégrité des ARN par électrophorèse capillaire sur Bioanalyseur Agilent : l'intégrité de l'ARN total a été évaluée par la visualisation des pics correspondant aux ARNs ribosomiaux. Pour les ARN totaux d'eucaryotes supérieurs, la taille des bandes ribosomales doit être de 1,9 kb pour le 18S- ARN et de 4,7 kb pour le 28S-ARN . L'intensité de la bande correspondant au 28S-ARN doit être supérieure à l'intensité de la bande correspondant au 18S- ARN. Des petites bandes diffuses représentant des ARNs de poids moléculaire plus faible (ARNt et l'ARN ribosomique 5S) peuvent être présentes. Lorsque l'ARN est dégradé, on observe un étalement des bandes de l'ARN ribosomal ainsi qu'un bruit de fond des ARNs de poids moléculaire plus élevé.
Phase d'hybridation sur puces GeneChip Human Gene 2.0 ST (Affymetrix)
Les ARNs ont ensuite été dilués à 50 ng/μΙ et 50 μΙ de chaque échantillon (n = 3). La quatrième réplique sert de back-up.
Les échantillons d'ARN (50ng) ont été amplifiés par l'utilisation de la technologie Ribo-SPIA, selon 3 étapes (Ovation Pico WTA System V2, NuGEN, 3302-12) et purifiés avec le kit Agencourt RNA Clean up XP Beads (Agencourt - Beckam Coulter Genomics, A29168). Pour chaque échantillon, 4,5 pg ont été fragmentés et marqués à la biotine, grâce au NuGEN Encore Biotin Module (NuGEN, 4200-12). L'hybridation a été effectuée sur des puces à ADN du modèle GeneChip Human Gene 2.0 ST (Affymetrix, 902112). Les étapes d'hybridation sur puce, lavage et fixation, ont été réalisées suivant le protocole défini par Affymetrix. La solution d'hybridation a été préparée par utilisation des kits Affymetrix Genechip Expression 3' Amplification Reagent Hybridization Controls (Affymetrix, 900454) et Hybridization Module for GeneChip Hybridization, Wash and Stain Kit (Affymetrix, 900720), et mélangée avec l'ADN complémentaire (ADNc) amplifié dans les étapes précédentes. L'hybridation a été réalisée durant 18h dans le four GeneChip Hybridization Oven 640 (Affymetrix, 800139). Le lavage et la révélation ont été réalisés à l'aide de la station fluidique GeneChip Fluidics Station 450 (Affymetrix, 00-0079) et les mesures d'intensité ont été scannées avec le GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix). Prétraitement des données d'hybridation Le traitement des données brutes a été réalisé avec les logiciels R (v3.2.3 ; Ihaka R and Gentleman T. Journal Of Computational And Graphical Statistics 1996, 5 (3), 299-314) et le package Oligo' (vl .34.2 ; Benilton S Carvalho And Rafaël A Irizarry. Bioinformatics 2010 (Oxford University Press), 26 : 19, Pp 2363-7, Doi : 10.1093/Bioinformatics/Btq431.) du projet BioConductor (v3.2 ; Gentleman R, Carey Vj, Bâtes Dm, Bolstad B, Dettling M, Dudoit S, Ellis B, Gautier L, Ge Y. Génome Biology 2004, 5, R80). La dernière version des librairies fournies par Affymetrix, construites sur la version 19 du génome humain (UCSC Human génome 19), et la méthode RMA, décrite par Irizarri et al . (Irizarry Ra, Hobbs B, Collin F, Beazer-Barclay Yd, Antonellis Kj, Scherf U, Speed Tp. Biostatistics. 2003b, 4 (2), 249-64 ; Irizarry Ra, Ooi SI, Wu Z, Boeke Jd . Stat Appl Genêt Mol Biol. 2003a, 2, Epub. 2003 Mar 18) ont été utilisées afin de guider et effectuer le prétraitement et l'annotation des séquences.
Analyse des données, annotation et analyse thématique
L'analyse statistique individuelle des gènes/transcrits a été réalisée avec les méthodes "Moderated t" et "Moderated F" implémentées dans le package R Limma 3.26.8 (Smyth Gk. Statistical Applications In Genetics And Molecular Biology 2004, 3 (3)).
L'annotation des gènes et la définition de groupes de gènes pour l'analyse de sur-représentation ont été réalisés au départ de la base de données interne « StratiCELL Skin Knowledge Database » (Salmon M & Berger F. Expression Cosmétique 2014, 30, 91-94).
L'analyse de sur-représentation a été réalisée avec la méthode du test hypergéométrique dans but de caractériser les facteurs thèmes/groupes d'intérêt dermo-cosmétique au départ de la proportion de leurs cibles détectées et différentiellement exprimées. L'analyse a été menée au départ de la liste des gènes détectés avec une p-value de 0.05 et une différence du niveau d'expression (Taux de variation ou fold-change ou FC) supérieur à 1,5 (bi-latéral).
3.2. Résultats Détermination de la concentration d'analyse de l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum par une étude préliminaire de cytotoxicité
Une étude de la cytotoxicité a été réalisée sur des kératinocytes NHEKs. L'extrait et son solvant utilisé pour sa préparation ont été appliqués dans les milieux de culture, durant 24h (n = 3). Le contrôle non traité a été arbitrairement fixé à 100% de viabilité et le seuil de cytotoxicité a été fixé par convention à 80% de viabilité. La condition SDS constitue le contrôle positif qui valide l'expérience.
Sur la base des résultats de l'étude préliminaire de cytotoxicité (Figure 4), les concentrations optimales (en pourcentage v/v) sélectionnées pour l'extrait et son solvant (propane 1,2 diol) sont les suivantes : 0,33%.
Quantification des ARNs par spectrophotométrie
Le rapport de l'absorbance à 260nm et 280nm est utilisé pour évaluer la pureté de l'ARN . Un rapport proche de 2 permet de considérer l'échantillon comme étant pur et dépourvu de contamination par des protéines. Le rapport 260/230 est utilisé en tant que mesure secondaire de la pureté de l'échantillon. La valeur 260/230 est généralement plus élevée que le ratio 260/280 et est attendue aux environs de 2,2. Les ratios obtenus pour l'ensemble des échantillons de la présente étude sont donc satisfaisants (données non montrées) et ont été qualifiés ensuite par électrophorèse capillaire.
Qualification des ARNs par électrophorèse capillaire
Les différentes populations d'ARN démontrent bien la présence de pics étroits, correspondant aux ARN ribosomiaux 18S et 28S, et un rapport équilibré entre les deux pics. L'absence de pics intermédiaires et étalés, caractéristiques de produits de dégradation des ARNs témoigne de l'intégrité des différentes populations (données non montrées).
La qualité et l'intégrité des ARNs extraits étant démontrées, ceux-ci ont dès lors été utilisés pour la poursuite du protocole et engagés dans les réactions d'amplification, de purification, marquage à la biotine puis hybridation sur puces à ADN. Analyse des modifications d'expression de gènes induites par l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum
Au terme de l'étude transcriptomique sur des kératinocytes de l'épiderme humains NHEKs, l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum pourraient joue un rôle potentiel dans la stimulation de la différenciation épidermique et de la défense anti-bactérienne. Ci-après, les régulations observées en lien avec ces hypothèses sont renseignées entre parenthèses, comme suit : nom du gène - Taux de variation p-value.
• Stimulation de la différenciation épidermique
L'épiderme humain est un épithélium stratifié constituant une barrière dont les couches sont définies par le stade de différenciation des cellules qui les composent. Au fur et à mesure de leur différenciation, les kératinocytes se chargent en filaments de kératine et contiennent une matrice retenant l'eau, le tout étant entouré par l'enveloppe cornée. Les kératinocytes en phase terminale de différenciation sont isolés par les lipides intercornéocytaires et sont attachés les uns aux autres par les cornéodesmosomes.
Les kératinocytes basaux progressent à travers les quatre couches de l'épiderme : basale, épineuse, granuleuse et cornée.
La couche basale est formée par une seule assise de kératinocytes cubiques ou prismatiques liés les uns aux autres par les desmosomes. Dans cette couche les cellules se divisent, l'une des deux cellules reste dans la couche basale tandis que l'autre migre vers les couches supérieures. Les kératinocytes basaux sont attachés par les hémi-desmosomes à une membrane basale qui sépare l'épiderme du derme et forme la jonction dermo-épidermique.
La couche épineuse est formée par 5 à 15 assises de kératinocytes polygonaux liés les uns aux autres par les desmosomes. Ces cellules contiennent des tonofilaments, les filaments précurseurs de la kératine.
La couche granuleuse est formée par 3 couches de kératinocytes qui contiennent des grains de kératohyaline et des granules lamellaires.
La couche cornée est formée de 5 à 15 couches de cornéocytes, c'est-à-dire des kératinocytes différenciés qui ne présentent plus de noyaux et d'organites, mais ils sont entourés par une enveloppe cornée. Ils sont chargés en filaments de kératine.
Formation des filaments de kératine :
Au cours de la différenciation épidermique, les filaments de kératine (appelés tonofilaments) se font de plus en plus nombreux et commencent à s'agréger dans les cellules de la couche épineuse pour former les tonofibrilles. Au niveau de la couche granuleuse, ils s'associent aux granules de kératohyaline. Les granules de kératohyaline sont composés de loricrine, d'involucrine (IVL - 2,24 p=0.0002), de trichohyaline et de profilaggrine qui sera transformée en filaggrine par différentes protéases, dont la caspase 14 (CASP14 - 4,76 p=0.00002). La réticulation de la filaggrine avec la kératine accélère le processus d'agrégation et d'alignement des tonofilaments permettant de former les câbles de kératine qui composent 85% du volume des cornéocytes. Ceux-ci sont ensuite associés aux desmosomes lors de la formation de l'enveloppe cornée par les transglutaminases (TGM1 - 1,98 p=0.00025). La kératine joue le rôle de structure mécanique rigide en association avec l'enveloppe cornée pour assurer le maintien de l'intégrité épidermique.
Au niveau de la couche basale, les kératinocytes expriment principalement les kératines 5 (KRT5 - 1,54 p=0.0039) et 14 alors que les couches supérieures comportent plutôt les kératines 1 (KRT1 - 2,65 p=0.000056), 2 et 10 (KRT10 - 7,81 p=0.0000013).
Formation de l'enveloppe cornée :
Au cours de la différenciation des kératinocytes stimulée par divers facteurs de transcription tel que la protéine zinc finger 750 (ZNF750 - 2,59 p=0.00004), la membrane plasmique est progressivement remplacée par une coque rigide appelée enveloppe cornée. L'initiation de ce changement se traduit par un assemblage protéique intracellulaire coordonné par les transglutaminases (TGM1 - 1,98 p=0.00025). La périplakine, l'envoplakine et l'involucrine (IVL - 2,24 p=0.0002) forment une armature qui recouvre progressivement la face interne de la membrane plasmique. Simultanément, la structure protéique est renforcée par d'autres protéines comme la loricrine, l'hornerine, les protéines « small proline rich » (SPRR1A - 2,48 p=0.000011 ; SPRR1B - 2,61 p=0.00037 ; SPRR4 - 1,73 p=0.0084), les protéines S100 (S100A8 - 2,51 p=0.000056 ; S100A9 - 1.57 p=0.014), et les protéines « late-cornified envelope » (LCE1C - 1,53 p=0.031 ; LELP1 - 1,77 p=0.049).
Les jonctions intercellulaires :
Les desmosomes représentent un type de jonctions situées entre les kératinocytes. Parmi les composants de ce type de structures, les desmocollines (DSC1 - 7,9 p=0.000002 ; DSC2 - 2,43 p=0.0000095 ; DSC3 - 1,57 p=0.00046) et desmogléines (DSG1 - 7,62 p=0.0000042 ; DSG3 - 1,84 p=0.00011) sont des glycoprotéines transmembranaires appartenant à la famille des cadhérines. Leurs parties extracellulaires assurent l'adhésion intercellulaire tandis que leurs parties cytoplasmiques s'associent avec des protéines intracellulaires telles que la plakoglobine (JUP - 1,73 p=0.00031), la plakophiline (PKP1 - 2,01 p=0.00014) ou encore la desmoplakine (DSP - 1,64 p=0.00028). La desmoplakine interagit elle-même avec les filaments de kératine permettant ainsi l'attachement du cytosquelette au complexe d'adhésion. Au cours de la cornification, les desmosomes sont modifiés, la plaque desmosomale est incorporée à l'enveloppe cornée et la cornéodesmosine y est intégrée. Ils portent alors le nom de cornéodesmosomes.
• Stimulation de la défense anti-bactérienne
Pour lutter contre les agressions pathogènes, les kératinocytes peuvent produire des peptides anti-microbiens, responsables de l'attraction et de l'activation des cellules immunitaires.
Les peptides anti-microbiens ont une activité à large spectre et détruisent les organismes en perturbant leur intégrité membranaire. Certains d'entre eux sont exprimés de manière constitutive mais la plupart sont inductibles. Les kératinocytes expriment des peptides de ce type notamment la calgranuline A (S100A8 - 2,51 p=0.000056) et la calgranuline B (S100A9 - 1,57 p=0.014) qui forment un complexe hétérodimérique antimicrobien appelé calprotectine. Il a été démontré que la calprotectine exerce son activité antibactérienne contre Escherichia coli, Klebsiella spp., Staphylococcus aureus, Staphylococcus Epidermidis, Capnocytophaga sputigena et Borrelia burgdorferi (Maladie de Lyme). D'autre part, l'étude transcriptomique a permis de mettre en évidence une augmentation très importante de l'expression du gène codant pour la chémokine (C-X-C motif) ligand 14 (CXCL14 - 16,7 p=0.00000013). Cette chémokine est constamment produite dans l'épiderme et le derme en conditions saines. Cependant, en plus de ses effets chémo-attractants, elle possède une activité bactéricide reconnue contre Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Finegoldia magna, Streptococcus pyogenes.
Différents mécanismes sont mis en place pour moduler la prolifération des bactéries, parmi ceux-ci, on distingue le processus de desquamation qui permet d'éliminer les micro-organismes indésirables installés sur les cornéocytes. La desquamation repose sur l'équilibre entre la synthèse de protéines structurales des cornéodesmosomes et leur dégradation par des protéases spécifiques comme les kallikréines (KLK5 - 2,57 p=0.000011 ; KLK7 - 2.17 p=0.000029) et la cathépsine L2 (CTSV - 3,41 p=0.00000083).
3.3 Conclusion
En modulant positivement les gènes codant pour les protéines impliquées dans la différenciation épidermique, l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum pourrait potentiellement stimuler le renouvellement de l'épiderme. De plus, il pourrait jouer un rôle dans la défense antimicrobienne de l'épiderme en augmentant l'expression des gènes codant pour certains peptides antimicrobiens ou pour des chémokines impliquées dans la défense anti-bactérienne.
Exemple 4 : Effet de l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum dans du propane 1,2 diol, sur des kératinocytes humains - Etude en RT-qPCR
Cette étude consiste à confirmer les modifications d'expression des gènes détaillées dans l'exemple 3. La confirmation est réalisée par RT-qPCR à partir de nouvelles cultures de kératinocytes NHEKs mises en présence de l'extrait pendant 24 heures. 4.1. Matériels et méthodes
L'extrait, la culture cellulaire, la détermination de la gamme de concentrations d'étude de l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum par une étude préliminaire de cytotoxicité, le traitement des cellules, l'extraction de l'ARN total ainsi que la qualification des ARN par spectrophotométrie et électrophorèse capillaire sont décrits au point 3.1.
La synthèse des ADNs complémentaire ou ADNc est décrite au point 2.1.
La méthode de qPCR en temps réel à l'aide de sondes fluorescentes de type TaqMam est décrite au point 2.1. Dans cet exemple, il s'agit de quantifier l'expression de différentes cibles spécifiques dans les populations d'ARNs issues des kératinocytes NHEKs traités par l'extrait et son solvant. Les PCR ont été réalisées à l'aide du système QuantStudio Flex (Applied Biosystems).
À des fins de normalisation, des mélanges réactionnels avec des sondes et amorces correspondant à la β2-microglobuline (B2M) ont également été préparés avec les mêmes échantillons d'ADNc. Un contrôle sans ADNc a servi de contrôle négatif d'amplification.
4.2. Résultats
Détermination de la concentration d'analyse de l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum par une étude préliminaire de cytotoxicité
Sur la base des résultats de l'étude préliminaire de cytotoxicité, la concentration optimale (en pourcentage v/v) sélectionnée pour l'extrait et son solvant (propane 1,2 diol) est de 0,33%.
Qualification des ARNs par électrophorèse capillaire
Les différentes populations d'ARN démontrent bien la présence de pics étroits, correspondant aux ARNs ribosomiaux 18S et 28S. L'absence de pics intermédiaires et étalés, caractéristiques de produits de dégradation des ARNs, témoigne de l'intégrité des différentes populations. La qualité et l'intégrité des ARNs extraits étant démontrées, ceux-ci ont dès lors été utilisés dans les réactions de synthèse des ADN complémentaires. Analyse des modifications d'expression de gènes induites par l'extrait sur des kératinocytes NHEKs.
Le traitement des kératinocytes NHEKs avec l'extrait durant 24h a permis de confirmer les modifications d'expression des gènes détaillées dans l'exemple 3. Ci-après, les régulations observées sont renseignées entre parenthèses, comme suit : nom du gène - Taux de variation p-value.
• Allégation « Barrière, cohésion et hydratation »
Les profils d'expression de 5 gènes spécifiques à l'hydratation, la fonction barrière et la cohésion de l'épiderme ont été analysés. Le traitement des kératinocytes NHEKs avec l'extrait augmente l'expression de la desmogléine 1 (DSG1 - 11,6 P=0.00088), de la desmocolline 1 (DSC1 - 9,6 P=0.00027), de la Claudine 1 (CLDN1 - 1,5 p=0.022), de l'aquaporine 3 (AQP3 - 4,7 p = 0.000014) et de ΑΤΡ-binding cassette sous-famille A membre 12 (ABCA12 - 1,8 p = 0.002).
· Allégation « Différenciation de l'épiderme et son renouvellement »
Les profils d'expression de 4 gènes spécifiques à la différenciation de l'épiderme et son renouvellement ont été analysés. Le traitement des kératinocytes NHEKs avec l'extrait augmente l'expression de l'involucrine (IVL - 3,7 p=0.00058), de la transglutaminase-1 (TGM1 - 2,8 p=0.0017), et les deux protéines « small proline rich » (SPRR1A - 4,6 P=0.012 ; SPRR1B
- 5,4 P=0.001).
• Allégation « Défense antibactérienne »
Les profils d'expression de 5 gènes spécifiques à la défense antibactérienne ont été analysés. Le traitement des kératinocytes NHEKs avec l'extrait augmente l'expression de la défensine bêta 1 (DEFB1 - 5,1 p=0.00057), de la calgranuline A (S100A8 - 6,2 p=0.0000018 ), de la calgranuline B (S100A9
- 3 p = 0.00001), de la calgranuline C (S100A12 - 4 p=0.0019) et de la chémokine (C-X-C motif) ligand 14 (CXCL14 - 19,9 P=0.00007).
4.3 Conclusion
Ces résultats appuient donc les pistes proposées à l'exemple 3 et confirment que l'extrait racinaire de Polygonum multiflorum selon l'invention renforce les jonctions intercellulaires et plus particulièrement, les desmosomes, stimule la différenciation de l'épiderme et son renouvellement et stimule la défense antibactérienne.

Claims

REVENDICATIONS
Extrait racinaire de Polygonum multiflorum caractérisé en ce que : il comprend au moins 0,8% en poids de THSG, de préférence au moins 1,5%, plus préférentiellement au moins 2%, exprimé par rapport au poids total de l'extrait sec, et
il comprend moins de 0,01% en poids d'émodine, de préférence moins de 0,001%, plus préférentiellement moins de 0,0005%, exprimé par rapport au poids total de l'extrait sec.
Extrait racinaire de Polygonum multiflorum selon la revendication 1, caractérisé en ce que la quantité d'émodine dans l'extrait est inférieure à la limite de quantification par chromatographie en phase supercritique ou par chromatographie en phase liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse (HPLC/MS).
Procédé de préparation d'un extrait racinaire de Polygonum multiflorum selon la revendication 1 ou 2, comprenant :
a) une étape de culture de Polygonum multiflorum en conditions hors- sol, et particulièrement en aéroponie,
b) optionnellement une étape de stimulation des racines des plantes, c) une étape d'extraction solide/liquide des racines optionnellement stimulées lors de l'étape b), et
d) la récupération de l'extrait obtenu lors de l'étape c).
Procédé selon la revendication 3, dans lequel l'étape c) comprend une première phase de mise en présence des racines encore liées à la plante avec un solvant, en particulier pendant une durée comprise entre 15 minutes et 30 minutes, suivie d'une seconde phase comprenant la section desdites racines et la macération des racines sectionnées dans un solvant, ledit solvant, identique ou différent dans la première et la deuxième phase, étant choisi parmi les alcools, la glycérine, les glycols et les solvants eutectiques, et étant utilisé pur ou sous la forme d'une solution aqueuse d'alcool, de glycérine, de glycol ou de solvant eutectique. Composition cosmétique comprenant, en tant qu'agent actif, au moins un extrait selon la revendication 1 ou 2, ou un extrait obtenu par un procédé selon la revendication 3 ou 4, et au moins un excipient.
Extrait selon la revendication 1 ou 2, extrait obtenu par un procédé selon la revendication 3 ou 4, ou composition cosmétique selon la revendication 5, pour prévenir ou ralentir le vieillissement cutané et/ou pour stimuler le renouvellement de l'épiderme, et/ou avoir un effet apaisant de la peau ou un effet calmant de la peau suite à la sensation d'irritation.
Composition pharmaceutique comprenant, en tant qu'agent actif, au moins un extrait selon la revendication 1 ou 2, ou un extrait obtenu par un procédé selon la revendication 3 ou 4, et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Composition nutraceutique comprenant, en tant qu'agent actif, au moins un extrait selon la revendication 1 ou 2, ou un extrait obtenu par un procédé selon la revendication 3 ou 4, et au moins un excipient nutraceutiquement acceptable.
Extrait selon la revendication 1 ou 2, extrait obtenu par un procédé selon la revendication 3 ou 4, composition pharmaceutique selon la revendication 7 ou composition nutraceutique selon la revendication 8, pour son utilisation en tant que médicament pour stimuler la défense antimicrobienne de la peau et/ou pour atténuer ou traiter l'inflammation de la peau et/ou pour favoriser la cicatrisation cutanée, en particulier dans le cas de la fermeture d'une plaie.
Utilisation d'un extrait selon la revendication 1 ou 2, ou d'un extrait obtenu par un procédé selon la revendication 3 ou 4, pour la préparation d'une composition cosmétique visant à prévenir ou retarder l'apparition des effets du vieillissement de la peau et/ou stimuler le renouvellement de l'épiderme, et/ou avoir un effet apaisant de la peau ou un effet calmant de la peau suite à la sensation d'irritation.
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