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WO2019008868A1 - 脂質膜小胞の形成方法およびマイクロリアクタチップ - Google Patents

脂質膜小胞の形成方法およびマイクロリアクタチップ Download PDF

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WO2019008868A1
WO2019008868A1 PCT/JP2018/016069 JP2018016069W WO2019008868A1 WO 2019008868 A1 WO2019008868 A1 WO 2019008868A1 JP 2018016069 W JP2018016069 W JP 2018016069W WO 2019008868 A1 WO2019008868 A1 WO 2019008868A1
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WO
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lipid
aqueous solution
chamber
monolayer film
layer
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PCT/JP2018/016069
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English (en)
French (fr)
Inventor
力也 渡邉
直樹 曽我
博行 野地
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University of Tokyo NUC
Original Assignee
University of Tokyo NUC
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Filing date
Publication date
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    • B81B—MICROSTRUCTURAL DEVICES OR SYSTEMS, e.g. MICROMECHANICAL DEVICES
    • B81B1/00—Devices without movable or flexible elements, e.g. microcapillary devices

Definitions

  • the present invention relates to a method of forming lipid membrane vesicles and a microreactor chip.
  • JP-A-2015-040754 (patent document 1) has a flat substrate and a capacity of 4000 ⁇ 10 -18 m 3 formed on the surface of the substrate so as to be regularly arranged in high density by a hydrophobic substance.
  • a high-density micro-chamber array comprising the following plurality of micro-chambers and a lipid bilayer membrane formed to liquid-seal the test aqueous solution at the openings of the plurality of micro-chambers filled with the test aqueous solution Do.
  • a method of forming lipid membrane vesicles according to one aspect of the present disclosure is A substrate, and a hydrophobic layer formed of a hydrophobic substance provided on the substrate, wherein openings of a plurality of chambers are formed to be regularly arranged on the major surface of the layer; Introducing a first aqueous solution into a liquid flow path facing the main surface of the hydrophobic layer of a microreactor chip comprising the step of filling the chamber with the first aqueous solution; An organic solvent containing lipid is introduced into the liquid channel, and the first aqueous solution is washed away from the liquid channel other than the chamber, and the first lipid monolayer is formed at the opening of the chamber filled with the first aqueous solution.
  • Forming a film Introducing a second aqueous solution into the liquid channel to form a second lipid monolayer film at the interface of the layer of the organic solvent formed on the main surface of the hydrophobic layer with the second aqueous solution; Transforming the first aqueous solution in the chamber into spherical droplets covered with the first lipid monolayer film; A physical action is given to the microreactor chip to move a droplet covered with the first lipid monolayer film to a position of the second lipid monolayer film, and a first lipid monolayer film covering the droplet Dipping the second lipid monolayer membrane to form lipid membrane vesicles; Equipped with
  • FIG. 1 is a plan view showing an example of a schematic configuration of a microreactor chip used in the method of forming lipid membrane vesicles according to the first embodiment.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view of the microreactor chip shown in FIG. 1 taken along the line AA.
  • FIG. 3 is a flowchart showing an example of a method of manufacturing the microreactor chip shown in FIG.
  • FIG. 4A is a view for explaining the manufacturing method of the microreactor chip shown in FIG. 1 and showing the step of preparing a substrate.
  • FIG. 4B is a view for explaining the manufacturing method of the microreactor chip shown in FIG. 1 and showing the step of forming a material film on the substrate.
  • FIG. 4A is a view for explaining the manufacturing method of the microreactor chip shown in FIG. 1 and showing the step of forming a material film on the substrate.
  • FIG. 4B is a view for explaining the manufacturing method of the microreactor chip shown in FIG. 1 and showing the step of
  • FIG. 4C is a drawing for explaining the manufacturing method of the microreactor chip shown in FIG. 1 and showing the step of forming a resist on a material film.
  • FIG. 4D is a view for explaining the manufacturing method of the microreactor chip shown in FIG. 1 and showing the step of patterning a resist.
  • FIG. 4E is a view for explaining the manufacturing method of the microreactor chip shown in FIG. 1 and showing the step of etching the material film using the patterned resist as a mask.
  • FIG. 4F is a view for explaining the manufacturing method of the microreactor chip shown in FIG. 1 and showing the step of removing the resist.
  • FIG. 5 is a flowchart showing an example of a method of forming lipid membrane vesicles according to the first embodiment.
  • FIG. 5 is a flowchart showing an example of a method of forming lipid membrane vesicles according to the first embodiment.
  • FIG. 6 is a view for explaining an example of a method of forming lipid membrane vesicles according to the first embodiment, and showing a step (step S11) of introducing a first aqueous solution into a liquid flow path.
  • FIG. 7 is a view for explaining an example of the method of forming lipid membrane vesicles according to the first embodiment, wherein a step of introducing an organic solvent into a liquid flow path to form a first lipid monolayer membrane ( It is a figure which shows step S12).
  • FIG. 8 is a view for explaining an example of the method for forming lipid membrane vesicles according to the first embodiment, which is a step of introducing a second aqueous solution into a liquid channel to form a second lipid monolayer membrane It is a figure which shows (step S13).
  • FIG. 9 is a view for explaining an example of the method of forming lipid membrane vesicles according to the first embodiment, and showing an enlarged view of one of the chambers after the formation of the second lipid monolayer membrane.
  • FIG. 10 is a view for explaining an example of the method for forming lipid membrane vesicles according to the first embodiment, wherein the first aqueous solution in the chamber is formed into droplets covered with the first lipid monolayer membrane.
  • FIG. 11 is a view for explaining an example of the method of forming lipid membrane vesicles according to the first embodiment, wherein the droplets covered with the first lipid monolayer membrane are floated to form lipid membrane vesicles. It is a figure which shows the process (step S15) to form.
  • FIG. 12 is a flowchart showing an example of a method of forming lipid membrane vesicles according to the second embodiment.
  • FIG. 13 is a view for explaining an example of the method for forming lipid membrane vesicles according to the second embodiment, wherein the step of lowering the second lipid monolayer membrane to form lipid membrane vesicles (Step S16).
  • FIG. 14 is a fluorescence image of lipid membrane vesicles.
  • FIG. 15 is a graph showing the particle size distribution of lipid membrane vesicles divided by chamber volume.
  • FIG. 16 is a graph showing the relationship between the volume of lipid membrane vesicles and the volume of the chamber.
  • FIG. 17 is a diagram for explaining a method of measuring substrate transport activity using a lipid membrane vesicle model protein.
  • FIG. 18 is a graph showing the measurement results of substrate transport activity measurement using a lipid membrane vesicle model protein.
  • the inventors diligently studied to find the application technology of the conventional high density micro chamber array. As a result, the following findings were obtained.
  • the following findings are only the trigger for the present invention, and do not limit the present invention.
  • lipid membrane vesicles (sometimes called liposomes) with uniform particle size have been considered as the technical basis of basic research that contributes to medical treatment and drug discovery, but in recent years, medical treatment and drug discovery from the viewpoint of biocompatibility Application development to the market is also strongly expected.
  • the inventor has newly developed a uniform particle size lipid membrane vesicle array and a method for producing the same, which are developed from the conventional high density micro chamber array.
  • the same microreactor chip as the conventional high-density micro-chamber array is used, but “the mass production and arraying of spherical microdroplets with uniform size are achieved by newly developing a lipid membrane formation protocol.
  • the size of the micro chamber of the microreactor chip matches the size of the lipid membrane vesicle to be formed. Therefore, it is possible to quantitatively control the size of lipid membrane vesicles to a submicrometer size by strictly defining the volume of the microchamber using a semiconductor manufacturing process.
  • a method of forming lipid membrane vesicles according to the first aspect of the embodiment is A substrate, and a hydrophobic layer formed of a hydrophobic substance provided on the substrate, wherein openings of a plurality of chambers are formed to be regularly arranged on the major surface of the layer; Introducing a first aqueous solution into a liquid flow path facing the main surface of the hydrophobic layer of a microreactor chip comprising the step of filling the chamber with the first aqueous solution; An organic solvent containing lipid is introduced into the liquid channel, and the first aqueous solution is washed away from the liquid channel other than the chamber, and the first lipid monolayer is formed at the opening of the chamber filled with the first aqueous solution.
  • the size of the lipid membrane vesicles is quantified quantitatively according to the volume of the chamber. It can be controlled, which allows the size of lipid membrane vesicles to be significantly miniaturized and homogenized.
  • the concentration change of the reaction product or reaction substrate in the lipid membrane vesicle due to the reaction of one biomolecule can be increased, and the detection sensitivity at the time of detection as the concentration change can be increased. Even if it is very late, the reaction of biomolecules can be detected with high sensitivity.
  • two-layer membrane organelles and bacterial cell membranes are artificially constructed in vitro, and functional analysis of membrane proteins present in two-layer membrane organelles and bacterial cell membranes, which has conventionally been difficult to measure, can be performed.
  • functional analysis of membrane proteins present in two-layer membrane organelles and bacterial cell membranes which has conventionally been difficult to measure, can be performed.
  • a method of forming lipid membrane vesicles according to a second aspect of the embodiment is a method of forming lipid membrane vesicles according to the first aspect,
  • the physical action is any of vibration, heat, electricity, and light.
  • a method of forming lipid membrane vesicles according to the third aspect of the embodiment is A substrate, and a hydrophobic layer formed of a hydrophobic substance provided on the substrate, wherein openings of a plurality of chambers are formed to be regularly arranged on the major surface of the layer; Introducing a first aqueous solution into a liquid flow path facing the main surface of the hydrophobic layer of a microreactor chip comprising the step of filling the chamber with the first aqueous solution; An organic solvent containing lipid is introduced into the liquid channel, and the first aqueous solution is washed away from the liquid channel other than the chamber, and the first lipid monolayer is formed at the opening of the chamber filled with the first aqueous solution.
  • the size of the lipid membrane vesicle is quantitatively controlled according to the volume of the chamber.
  • the size of the lipid membrane vesicles can be greatly miniaturized and homogenized.
  • the concentration change of the reaction product or reaction substrate in the lipid membrane vesicle due to the reaction of one biomolecule can be increased, and the detection sensitivity at the time of detection as the concentration change can be increased. Even if it is very late, the reaction of biomolecules can be detected with high sensitivity.
  • two-layer membrane organelles and bacterial cell membranes are artificially constructed in vitro, and functional analysis of membrane proteins present in two-layer membrane organelles and bacterial cell membranes, which has conventionally been difficult to measure, can be performed.
  • functional analysis of membrane proteins present in two-layer membrane organelles and bacterial cell membranes which has conventionally been difficult to measure, can be performed.
  • a method of forming lipid membrane vesicles according to a fourth aspect of the embodiment is a method of forming lipid membrane vesicles according to any one of the first to third aspects,
  • the volume of each chamber is 4000 ⁇ 10 -18 m 3 or less.
  • a method of forming lipid membrane vesicles according to a fifth aspect of the embodiment is a method of forming lipid membrane vesicles according to any one of the aspects 1-4,
  • the size of the lipid membrane vesicles corresponds to the volume of the chamber.
  • a method of forming lipid membrane vesicles according to a sixth aspect of the embodiment is a method of forming lipid membrane vesicles according to any one of the aspects 1 to 5,
  • the diameter of the lipid membrane vesicles is 5 ⁇ m or less.
  • the microreactor chip according to the seventh aspect of the embodiment is A substrate, A layer made of a hydrophobic substance provided on the substrate, wherein openings of a plurality of chambers are formed to be regularly arranged on the main surface of the layer; Equipped with A plurality of lipid membrane vesicles are formed at the interface of the organic solvent layer provided on the main surface of the hydrophobic layer on the opposite side to the hydrophobic layer.
  • the microreactor chip according to the eighth aspect of the embodiment is A substrate, A layer made of a hydrophobic substance provided on the substrate, wherein openings of a plurality of chambers are formed to be regularly arranged on the main surface of the layer; Equipped with In each chamber, one lipid membrane vesicle is formed.
  • a microreactor chip according to a ninth aspect of the embodiment is the method for forming a lipid membrane vesicle according to the seventh or eighth aspect,
  • the volume of each chamber is 4000 ⁇ 10 -18 m 3 or less.
  • a microreactor chip is a method of forming a lipid membrane vesicle according to any one of the seventh to ninth aspects,
  • the size of the lipid membrane vesicles corresponds to the volume of the chamber.
  • a microreactor chip according to an eleventh aspect of the embodiment is a method for forming a lipid membrane vesicle according to any one of the seventh to tenth aspects,
  • the diameter of the lipid membrane vesicles is 5 ⁇ m or less.
  • a method of incorporating an inclusion of a cell membrane vesicle according to a twelfth aspect of the embodiment A substrate, and a hydrophobic layer formed of a hydrophobic substance provided on the substrate, wherein openings of a plurality of chambers are formed to be regularly arranged on the major surface of the layer; Introducing a first aqueous solution containing a drug into a liquid flow path facing the main surface of the hydrophobic layer of a microreactor chip comprising the step of filling the chamber with the first aqueous solution; An organic solvent containing lipid is introduced into the liquid channel, and the first aqueous solution is washed away from the liquid channel other than the chamber, and the first lipid monolayer is formed at the opening of the chamber filled with the first aqueous solution.
  • Forming a film Introducing a second aqueous solution into the liquid channel to form a second lipid monolayer film on the upper surface of the organic solvent layer formed on the main surface of the hydrophobic layer; Transforming the first aqueous solution in the chamber into spherical droplets covered with the first lipid monolayer film; A physical action is given to the microreactor chip to move a droplet covered with the first lipid monolayer film to a position of the second lipid monolayer film, and a first lipid monolayer film covering the droplet Dipping the second lipid monolayer membrane to form lipid membrane vesicles; Equipped with
  • a method of incorporating an inclusion of a cell membrane vesicle according to a thirteenth aspect of the embodiment A substrate, and a hydrophobic layer formed of a hydrophobic substance provided on the substrate, wherein openings of a plurality of chambers are formed to be regularly arranged on the major surface of the layer; Introducing a first aqueous solution containing a drug into a liquid flow path facing the main surface of the hydrophobic layer of a microreactor chip comprising the step of filling the chamber with the first aqueous solution; An organic solvent containing lipid is introduced into the liquid channel, and the first aqueous solution is washed away from the liquid channel other than the chamber, and the first lipid monolayer is formed at the opening of the chamber filled with the first aqueous solution.
  • FIG. 1 is a view showing an example of a schematic configuration of a microreactor chip used in the method of forming lipid membrane vesicles according to the first embodiment.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view of the microreactor chip shown in FIG. 1 taken along the line AA.
  • the microreactor chip 20 includes a substrate 22 and a hydrophobic layer 24 provided on the substrate 22.
  • the substrate 22 has translucency and is flat.
  • the substrate 22 may be made of, for example, glass, acrylic resin or the like.
  • the material, thickness, shape and the like of the substrate 22 are such that light incident on the substrate 22 from below the substrate 22 penetrates the substrate 22 and enters the interior of the chamber 26 and from the inside of the chamber 26 to the substrate 22 There is no particular limitation as long as the incident light is transmitted through the substrate 22 and escapes below the substrate 22.
  • the thickness of the substrate 22 may be 0.1 mm or more and 5 mm or less, may be 0.3 mm or more and 3 mm or less, and may be 0.7 mm or more and 1.5 mm or less. Good.
  • the size of the substrate 22 in plan view is not particularly limited.
  • the hydrophobic layer 24 is a layer made of a hydrophobic substance.
  • the hydrophobic substance includes, for example, a hydrophobic resin such as a fluorocarbon resin and a substance other than a resin such as glass.
  • the thickness of the hydrophobic layer 24 may be appropriately adjusted in accordance with the volume of the chamber 26 described later. Specifically, for example, it may be 10 nm or more and 100 ⁇ m or less, 100 nm or more and 5 ⁇ m or less, or 250 nm or more and 1 ⁇ m or less.
  • openings of a plurality of minute chambers 26 are provided on the main surface of the hydrophobic layer 24 so as to be regularly and densely arranged.
  • the volume of the chamber 26 is 4000 ⁇ 10 ⁇ 18 m 3 or less (4000 ⁇ m 3 or less).
  • the volume of the chamber 26 may be, for example, 0.1 ⁇ 10 ⁇ 18 m 3 or more and 4000 ⁇ 10 ⁇ 18 m 3 or less, or 0.5 ⁇ 10 ⁇ 18 m 3 or more and 400 ⁇ 10 ⁇ 18 m 3 Or less, or 1 ⁇ 10 ⁇ 18 m 3 or more and 40 ⁇ 10 ⁇ 18 m 3 or less.
  • the depth of the chamber 26 may be, for example, 10 nm or more and 100 ⁇ m or less, 100 nm or more and 5 ⁇ m or less, or 250 nm or more and 1 ⁇ m or less.
  • the opening of the chamber 26 can be, for example, circular.
  • the diameter of the circle when it is circular may be, for example, 0.1 ⁇ m to 100 ⁇ m, may be 0.5 ⁇ m to 5 ⁇ m, or may be 1 ⁇ m to 10 ⁇ m.
  • the term “regular” means that, for example, the chambers are arranged in a lattice, matrix, zigzag, or the like on the substrate as viewed in the thickness direction of the substrate.
  • the “regular” may mean, for example, that the chambers are arranged at regular intervals in a plurality of rows.
  • the “high density” means, for example, that the number of chambers per 1 square mm (1 mm 2 ) may be 0.1 ⁇ 10 3 or more and 2000 ⁇ 10 3 or less, or 1 ⁇ 10 3 or more. It may be 1000 ⁇ 10 3 or less, or 5 ⁇ 10 3 or more and 100 ⁇ 10 3 or less. When converted to 1 cm 2 (1 ⁇ 10 -4 m 2 ), it may be 10 ⁇ 10 3 or more and 200 ⁇ 10 6 or less, or 100 ⁇ 10 3 or more and 100 ⁇ 10 6 or less. It may be 0.5 ⁇ 10 6 or more and 10 ⁇ 10 6 or less.
  • the plurality of chambers 26 are formed so that the depth is 100 ⁇ m or less and the diameter is 100 ⁇ m or less when converted to a circle, or the depth is 2 ⁇ m or less converted to a circle It may be formed to have a diameter of 10 ⁇ m or less, or may be formed to a depth of 1 ⁇ m or less and a diameter of 5 ⁇ m or less when converted to a circle. In this way, a thin film of a hydrophobic substance is formed on the surface of the substrate 22, and the microreactor chip 20 before lipid bilayer film formation is relatively easily formed using the method of forming a plurality of minute chambers 26 in the thin film. It can be manufactured.
  • diameter in "when converted to a circle” means a diameter of a circle having the same area as the shape of the cross section perpendicular to the depth direction, and, for example, when the cross section is a 1 ⁇ m square Becomes 2 / ⁇ ⁇ ⁇ 1.1 ⁇ m when converted to a circular shape.
  • the chamber 26 may be formed on a thin film of a hydrophobic substance in a predetermined thickness range including 500 nm in thickness, so as to have a predetermined diameter range including 1 ⁇ m in diameter when converted to a circle.
  • the depth and diameter of the chamber 26 is preferably several hundred nm to several ⁇ m.
  • the “predetermined thickness range” is, for example, a range of 50 nm or more, which is 0.1 times 500 nm, or 5 ⁇ m or less of 10 times 500 nm, or 1 ⁇ m, which is 0.5 times 500 nm or more and 250 nm or more
  • the “predetermined diameter range” is, for example, a range of 100 nm or more, 0.1 times 1 ⁇ m, 10 ⁇ m or less of 10 times 1 ⁇ m, or a range of 0.5 ⁇ m or more of 500 ⁇ m or 2 times 1 ⁇ m or less can do.
  • an electrode may be provided inside each chamber 26 (for example, the inner side surface or the bottom surface of the chamber 26). Each electrode may be electrically connected to each other.
  • the electrodes may be made of metal, such as copper, silver, gold, aluminum, chromium or the like.
  • the electrodes are made of materials other than metal, such as ITO (indium tin oxide), IZO (material consisting of indium tin oxide and zinc oxide), ZnO, IGZO (material consisting of indium, gallium, zinc, oxygen), etc. It may be configured.
  • the thickness of the electrode may be, for example, 10 nm or more and 100 ⁇ m or less, 100 nm or more and 5 ⁇ m or less, or 250 nm or more and 1 ⁇ m or less.
  • FIG. 3 is a flowchart showing an example of a method of manufacturing the microreactor chip 20.
  • 4A to 4F are diagrams showing steps in the method of manufacturing the microreactor chip 20.
  • FIG. 3 is a flowchart showing an example of a method of manufacturing the microreactor chip 20.
  • the glass substrate 22 is dipped for about 24 hours in a 10 M potassium hydroxide (KOH) solution (step S111). Thereby, the surface of the glass substrate 22 becomes hydrophilic.
  • KOH potassium hydroxide
  • the surface of the glass substrate 22 is spin-coated with a hydrophobic substance (for example, fluororesin (CYTOP) manufactured by Asahi Glass Co., Ltd.) to form a substance film 24a, and a substance film 24a is formed.
  • a hydrophobic substance for example, fluororesin (CYTOP) manufactured by Asahi Glass Co., Ltd.
  • CYTOP fluororesin
  • the conditions for spin coating for example, conditions of 2000 rps and 30 seconds can be used, and in this case, the film thickness of the material film 24 a is about 1 ⁇ m.
  • the adhesion of the substance film 24 a to the surface of the glass substrate 22 can be performed, for example, by baking at a temperature of 180 ° C. for 1 hour.
  • a resist 25a is formed on the surface of the material film 24a by spin coating, and the resist 25a is adhered to the surface of the material film 24a (step S113).
  • the resist 25a AZ-4903 manufactured by AZ Electronic Materials or the like can be used.
  • the conditions for spin coating for example, conditions of 4000 rps and 60 seconds can be used.
  • the adhesion of the resist 25a to the surface of the material film 24a can be performed, for example, by baking for 5 minutes on a hot plate at 110 ° C. to evaporate the organic solvent in the resist 25a.
  • the resist 25a is exposed using the mask of the pattern of the chamber 26, and the resist 25b is developed by immersing in a developer dedicated to the resist and developing to remove the portion forming the chamber 26. It forms (step S114).
  • the conditions for exposure may be, for example, irradiation with UV power 250 W for 7 seconds using an exposure machine manufactured by SAN-EI.
  • the conditions for development for example, the conditions of immersion for 5 minutes in AZ developer manufactured by AZ Electronic Materials can be used.
  • the material film 24a masked by the resist 25b is dry etched to form a material film 24b from which the portion to be the chamber 26 has been removed from the material film 24a (step S115).
  • the resist 25b is removed (step S116).
  • a reactive ion etching apparatus manufactured by Samco may be used, and conditions such as O 2 50 sccm, Pressure 10 Pa, Power 50 W, and Time 30 min can be used as etching conditions.
  • the removal of the resist 25 b can be performed by immersion in acetone, washing with isopropanol, and washing with pure water.
  • the plurality of chambers 26 may be formed in the thin film of the hydrophobic substance using a method other than dry etching, for example, a method such as nanoimprinting.
  • a method such as nanoimprinting.
  • the inner surface of the chamber 26 is made hydrophilic by the action of the O 2 plasma, which is preferable because the aqueous solution can be easily filled into the chamber 26.
  • FIG. 5 is a flowchart showing an example of a method of forming lipid membrane vesicles according to the first embodiment.
  • 6 to 11 show steps in the method of forming lipid membrane vesicles according to the first embodiment.
  • the glass plate 44 in which the liquid introduction hole 46 is formed is placed. Thereby, the liquid flow path 48 in which the main surface of the hydrophobic layer 24 is a substantially horizontal bottom surface is formed.
  • a first aqueous solution containing a surfactant is introduced from the liquid introduction hole 46 into the liquid flow channel 48, and the liquid flow channel 48 and the chamber 26 are filled with the first aqueous solution (step S11).
  • the first aqueous solution specifically, for example, a liquid containing 1 mM HEPES and 10 mM potassium chloride (hereinafter sometimes referred to as “buffer A”) and a fluorescent dye (final concentration 10 ⁇ M)
  • buffer A a liquid containing 1 mM HEPES and 10 mM potassium chloride
  • fluorescent dye final concentration 10 ⁇ M
  • Alexa 488 green
  • the first aqueous solution may contain an agent to be contained in lipid membrane vesicles.
  • the lipid 35 having a specific gravity greater than that of the first aqueous solution flows from the liquid introduction hole 46 to the liquid flow path
  • An organic solvent to be contained is introduced (step S12).
  • the lipid natural lipids such as those derived from soybean and E. coli, and artificial lipids such as DOPE (dioleoylphosphatidyl ethanolamine) and DOPG (dioleoylphosphatidyl glycerol) can be used.
  • Chloroform can be used as the organic solvent.
  • one containing 1 mg / ml DOPC and 0.045 mg / ml fluorescent lipid eg, NBD-PS (green)
  • NBD-PS green
  • the hydrophilic group of the lipid 35 on the first aqueous solution side of the chamber 26 is filled with the first aqueous solution.
  • a first lipid monolayer film 31 a in a facing state is formed to liquid seal the opening of the chamber 26.
  • the first aqueous solution is washed away from the liquid flow path 48 other than the chamber 26.
  • a second aqueous solution having a specific gravity smaller than that of the organic solvent is introduced from the liquid introduction hole 46 into the liquid passage 48 (step S13).
  • buffer solution A can be used as the second aqueous solution.
  • the layer 36 of the organic solvent is formed on the main surface of the hydrophobic layer 24, and the interface between the layer 36 of the organic solvent and the second aqueous solution is
  • the second lipid monolayer film 31b is formed with the hydrophilic group of the lipid 35 facing the second aqueous solution side.
  • the first aqueous solution in the chamber 26 sealed with the first lipid monolayer film 31a is spontaneously covered with the first lipid monolayer film 31a by surface tension.
  • the shape is changed to a spherical droplet (step S14). Since the first aqueous solution contains a surfactant, it is easily detached from the wall surface of the hydrophilic chamber 26 and can be easily rounded spontaneously.
  • the droplet covered with the first lipid monolayer film 31 a is physically released to be released from the wall surface of the chamber 26 and floated to the upper surface of the organic solvent layer 36.
  • the physical action is not particularly limited as long as the droplet covered with the first lipid monolayer film 31a can be released from the wall surface of the chamber 26.
  • vibration, heat, electricity, It is one of the light.
  • the first lipid monolayer film 31a and the second lipid monolayer film 31b covering the droplets are zipped, ie,
  • the second lipid monolayer film 31b is formed so as to overlap the outside of the first lipid monolayer film 31a, and the lipid membrane vesicle 31 covered with the lipid bilayer membrane is formed.
  • the first aqueous solution contains a drug
  • the lipid membrane vesicles 31 contain the drug.
  • a step of reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer membrane of the lipid membrane vesicle 31 can also be provided.
  • a cell membrane fragment containing a membrane protein, a lipid bilayer membrane in which a protein is embedded, a water-soluble protein, or a protein solubilized with a surfactant is applied to the lipid bilayer membrane of the lipid membrane vesicle 31.
  • It may be a step of introducing the protein into a lipid bilayer membrane to form a membrane protein.
  • thermal swinging can be used as a method of incorporating a protein into a lipid bilayer membrane.
  • the microreactor chip 20 in which a plurality of lipid membrane vesicles 31 are formed on the upper surface of the organic solvent layer 36 provided on the main surface of the hydrophobic layer 24 can be obtained.
  • the light incident on the substrate 22 from below the substrate 22 passes through the substrate 22 and enters the inside of the chamber 26, and the light incident on the substrate 22 from the inside of the chamber 26 is the substrate 22. And escape below the substrate 22.
  • the function of the membrane protein is determined by using a confocal laser microscope to detect the fluorescent substance contained in the first aqueous solution contained inside the lipid membrane vesicle. The analysis can be performed by detecting the emitted light. An epi-confocal microscope may be used as the microscope.
  • Example 1 As an example according to the first embodiment, the inventor prepared five types of microreactor chips A to E having different sizes of the chamber 26 as shown in Table 1 below.
  • FIG. 14 shows a fluorescence image of lipid membrane vesicles 31 actually formed by the inventor.
  • FIG. 15 is a graph showing the particle size distribution of lipid membrane vesicles 31 actually formed by the inventors, divided by the size of the chamber 26.
  • FIG. 16 is a graph showing the relationship between the volume of lipid membrane vesicles 31 actually formed by the inventor and the volume of the chamber 26.
  • the method of forming lipid membrane vesicles according to the first embodiment it is possible to form ultrafine lipid membrane vesicles 31 having a diameter of 5 ⁇ m or less.
  • the particle diameter distribution of lipid membrane vesicles 31 obtained by dividing the size of chamber 26 has a standard deviation of about 50 nm (10% or less uniformity), and can achieve extremely high uniformity. is there.
  • the volume of lipid membrane vesicles 31 corresponds to the volume of the chamber 26. Therefore, by precisely defining the volume of the chamber 26 using the semiconductor manufacturing process, it is possible to quantitatively control the size of the lipid membrane vesicle 31 to a submicrometer size.
  • FIG. 12 is a flowchart showing an example of a method of forming lipid membrane vesicles according to the second embodiment.
  • FIG. 13 is a view showing a step (step S16) of forming lipid membrane vesicles in the method of forming lipid membrane vesicles according to the second embodiment.
  • the steps (steps S11 to S14) for changing the shape of the first aqueous solution in each chamber 26 into droplets covered with the first lipid monolayer film 31a are the first embodiment described above. And the description is omitted.
  • the process is performed for a predetermined time (for example, about 15 minutes)
  • the organic solvent is dissolved in the second aqueous solution.
  • the organic solvent layer 36 is thinned, and the second lipid monolayer film 31b located on the upper surface of the organic solvent layer 36 is lowered (step S15).
  • the first lipid monolayer film 31a covering the droplets of the chamber 26 and the falling second lipid monolayer film 31b are zipped, that is, the second lipid monolayer film 31a overlaps the outside of the first lipid monolayer film 31a.
  • the lipid monolayer film 31 b is formed, and the lipid membrane vesicle 31 covered with the lipid bilayer membrane is formed.
  • the first aqueous solution contains a drug
  • the lipid membrane vesicles 31 contain the drug.
  • a step of reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer membrane of the lipid membrane vesicle 31 can also be provided.
  • a cell membrane fragment containing a membrane protein, a lipid bilayer membrane in which a protein is embedded, a water-soluble protein, or a protein solubilized with a surfactant is applied to the lipid bilayer membrane of the lipid membrane vesicle 31.
  • It may be a step of introducing the protein into a lipid bilayer membrane to form a membrane protein.
  • thermal swinging can be used as a method of incorporating a protein into a lipid bilayer membrane.
  • the microreactor chip 20 in which one lipid membrane vesicle 31 is formed in each chamber 26 can be obtained.
  • Example As an example according to the second embodiment, the inventor performs one lipid membrane vesicle 31 in each chamber 26 of the microreactor chip 20 by performing the lipid membrane vesicle formation method according to the second embodiment. It formed.
  • FIG. 17 is a graph showing measurement results.
  • ⁇ -hemolysin which is a membrane transporter, is reconstituted in lipid membrane vesicles 31, that is, the inventor It can be confirmed that the formed lipid membrane vesicle is covered with a lipid bilayer membrane.
  • the lipid membrane vesicles are formed.
  • the size of 31 can be quantitatively controlled to sub-micrometer size depending on the volume of chamber 26.
  • High-throughput functional measurement by using small lipid membrane vesicles in parallel Contributes to a drug screening system based on functional analysis of membrane proteins by high throughput.
  • (2) Construction of artificial cells mimicking cells (basic research) The size of cells and subcellular organelles varies from 10 ⁇ m to several hundreds of nm depending on the species, and in order to artificially reconstruct them, it is necessary to strictly control the size of lipid membrane vesicles. By using the technique according to the above-described embodiment, the following effects can be obtained. 1. Control of Lipid Membrane Vesicles to the Same Size as Cells It is possible to create lipid membrane vesicles that mimic intracellular organelles, bacteria, etc. that were difficult with conventional methods.
  • the lipid membrane vesicles 31 are formed in a mode in which the liquid flow path 48 is disposed above the microreactor chip 20.
  • the lipid membrane vesicles 31 may be formed in an aspect in which FIGS. 6 to 11 and FIG. 13 are upside down, that is, an aspect in which the liquid flow channel 48 is disposed below the microreactor chip 20.
  • the first aqueous solution is introduced into the liquid flow path 48 facing the main surface of the hydrophobic layer 24 of the microreactor chip 20 when viewing FIGS. Fill the liquid flow path 48 and the chamber 26 with the first aqueous solution, and (2) introduce an organic solvent containing a lipid and having a specific gravity lower than that of the first aqueous solution into the liquid flow path 48.
  • the first aqueous solution is washed away from 48 to form the first lipid monolayer film 31a at the opening of the chamber 26 filled with the first aqueous solution, and (3) the second aqueous solution having a specific gravity greater than that of the organic solvent in the liquid channel 48
  • a spherical type covered with the first lipid monolayer film 31a It is released from the wall surface of the chamber 26 by giving a physical action to the droplet covered with the first lipid monolayer film 31a until the position of the second lipid monolayer film 31b
  • the lipid membrane vesicles 31 may be formed by dipping the first lipid monolayer film 31a and the second lipid monolayer film 31b covering the droplets.
  • the first aqueous solution is applied to the liquid flow path 48 facing the main surface of the hydrophobic layer 24 of the microreactor chip 20 by looking up FIGS.
  • To fill the liquid flow path 48 and the chamber 26 with the first aqueous solution and (2) introduce a lipid-containing organic solvent having a specific gravity lower than that of the first aqueous solution into the liquid flow path 48;
  • the first aqueous solution is washed away from the flow path 48, and the first lipid monolayer film 31a is formed at the opening of the chamber 26 filled with the first aqueous solution.
  • the lipid membrane vesicle 31 may be formed by zipping the first lipid monolayer film 31 a and the second lipid monolayer film 31 b covering the droplets.

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Abstract

脂質膜小胞の形成方法は、マイクロリアクタチップの疎水層の主面に面する液体流路に、第１水溶液を導入し、チャンバーを第１水溶液で満たすステップと、液体流路に脂質を含有する有機溶媒を導入し、第１水溶液で満たされたチャンバーの開口部に第１脂質単層膜を形成するステップと、液体流路に第２水溶液を導入し、疎水層の主面上に形成される有機溶媒の層の第２水溶液との界面に第２脂質単層膜を形成するステップと、チャンバー内の第１水溶液を、第１脂質単層膜で覆われた球状の液滴へと形状変化させるステップと、第１脂質単層膜で覆われた液滴に物理的作用を与えることにより第２脂質単層膜の位置まで移動させ、液滴を覆う第１脂質単層膜と第２脂質単層膜とをジッピングさせ、脂質膜小胞を形成するステップと、を備える。

Description

脂質膜小胞の形成方法およびマイクロリアクタチップ
　本発明は、脂質膜小胞の形成方法およびマイクロリアクタチップに関する。
　特開第２０１５－０４０７５４号（特許文献１）は、平坦な基板と、基板の表面に疎水性の物質により規則的に高密度に配列するように形成された容量が４０００×１０－１８ｍ３以下の複数の微小チャンバーと、試験用水溶液が満たされた状態の複数の微小チャンバーの開口部に試験用水溶液を液封するよう形成された脂質二重膜とを備える高密度微小チャンバーアレイを開示する。
　上記従来の高密度微小チャンバーアレイを基礎として、その応用技術の開発が望まれていた。
　本開示の一側面に係る脂質膜小胞の形成方法は、
　基板と、前記基板上に設けられた疎水性物質からなる層であって、複数のチャンバーの開口部が該層の主面上に規則的に配列するように形成されている、疎水層と、を備えたマイクロリアクタチップの、前記疎水層の主面に面する液体流路に第１水溶液を導入し、前記チャンバーを前記第１水溶液で満たすステップと、
　前記液体流路に脂質を含有する有機溶媒を導入し、前記チャンバー以外の前記液体流路から前記第１水溶液を洗い流し、前記第１水溶液で満たされた前記チャンバーの開口部に第１脂質単層膜を形成するステップと、
　前記液体流路に第２水溶液を導入し、前記疎水層の主面上に形成される前記有機溶媒の層の前記第２水溶液との界面に第２脂質単層膜を形成するステップと、
　前記チャンバー内の前記第１水溶液を、前記第１脂質単層膜で覆われた球状の液滴へと形状変化させるステップと、
　前記マイクロリアクタチップに物理的作用を与えることにより前記第１脂質単層膜で覆われた液滴を前記第２脂質単層膜の位置まで移動させ、前記液滴を覆う第１脂質単層膜と前記第２脂質単層膜とをジッピングさせ、脂質膜小胞を形成するステップと、
を備える。
図１は、第１実施形態に係る脂質膜小胞の形成方法に用いるマイクロリアクタチップの概略構成の一例を示す平面図である。 図２は、図１に示すマイクロリアクタチップをＡ－Ａ線に沿って切断した断面を示す図である。 図３は、図１に示すマイクロリアクタチップの製造方法の一例を示すフローチャートである。 図４Ａは、図１に示すマイクロリアクタチップの製造方法を説明するための図であって、基板を用意する工程を示す図である。 図４Ｂは、図１に示すマイクロリアクタチップの製造方法を説明するための図であって、基板上に物質膜を形成する工程を示す図である。 図４Ｃは、図１に示すマイクロリアクタチップの製造方法を説明するための図であって、物質膜上にレジストを形成する工程を示す図である。 図４Ｄは、図１に示すマイクロリアクタチップの製造方法を説明するための図であって、レジストをパターニングする工程を示す図である。 図４Ｅは、図１に示すマイクロリアクタチップの製造方法を説明するための図であって、パターニングされたレジストをマスクとして物質膜をエッチングする工程を示す図である。 図４Ｆは、図１に示すマイクロリアクタチップの製造方法を説明するための図であって、レジストを除去する工程を示す図である。 図５は、第１実施形態に係る脂質膜小胞の形成方法の一例を示すフローチャートである。 図６は、第１実施形態に係る脂質膜小胞の形成方法の一例を説明するための図であって、液体流路に第１水溶液を導入する工程（ステップＳ１１）を示す図である。 図７は、第１実施形態に係る脂質膜小胞の形成方法の一例を説明するための図であって、液体流路に有機溶媒を導入して第１脂質単層膜を形成する工程（ステップＳ１２）を示す図である。 図８は、第１実施形態に係る脂質膜小胞の形成方法の一例を説明するための図であって、液体流路に第２水溶液を導入して第２脂質単層膜を形成する工程（ステップＳ１３）を示す図である。 図９は、第１実施形態に係る脂質膜小胞の形成方法の一例を説明するための図であって、第２脂質単層膜形成後のチャンバーの１つを拡大して示す図である。 図１０は、第１実施形態に係る脂質膜小胞の形成方法の一例を説明するための図であって、チャンバー内の第１水溶液を第１脂質単層膜で覆われた液滴へと形状変化させる工程（ステップＳ１４）を示す図である。 図１１は、第１実施形態に係る脂質膜小胞の形成方法の一例を説明するための図であって、第１脂質単層膜で覆われた液滴を浮上させて脂質膜小胞を形成する工程（ステップＳ１５）を示す図である。 図１２は、第２実施形態に係る脂質膜小胞の形成方法の一例を示すフローチャートである。 図１３は、第２実施形態に係る脂質膜小胞の形成方法の一例を説明するための図であって、第２脂質単層膜を降下させて脂質膜小胞を形成する工程（ステップＳ１６）を示す図である。 図１４は、脂質膜小胞の蛍光画像である。 図１５は、脂質膜小胞の粒径分布をチャンバーの容量毎に分けて示すグラフである。 図１６は、脂質膜小胞の体積とチャンバーの容量との関係を示すグラフである。 図１７は、脂質膜小胞のモデルタンパク質を用いた基質輸送活性計測の方法を説明するための図である。 図１８は、脂質膜小胞のモデルタンパク質を用いた基質輸送活性計測の計測結果を示すグラフである。
　脂質二重膜を介して生じる様々の生体分子反応、例えば膜輸送過程や膜透過反応、膜表面での酵素反応などでは、反応生成物の拡散に長時間かかることや、酵素活性に伴った物質濃度の変化が極めて緩やかであることなどから、脂質二重膜を介して生じる様々な生体分子反応を高感度に検出することが困難となりやすい。チャンバーの容量が大きいと、チャンバー内の濃度変化が小さくなり、濃度変化としての検出が困難となる。チャンバー数が少ない場合は、計測のスループットが悪くなる。したがって、脂質二重膜により液封された極めて容量が小さな多数の微小チャンバーが高密度に形成された高密度微小チャンバーアレイが必要となる。上記特許文献１は、かかる高密度微小チャンバーアレイを開示する。しかしながら、その応用技術については未検討の部分があった。
　発明者は、従来の高密度微小チャンバーアレイの応用技術を見出すべく、鋭意検討した。その結果、以下の知見を得た。なお、以下の知見はあくまで本発明をなすきっかけとなったものであり、本発明を限定するものではない。
　すなわち、上記高密度微小チャンバーアレイが開発されたことにより、膜タンパク質による膜横断型の物質輸送などの計測が効率的に実施可能となった。ところで、均一粒径を有する脂質膜小胞（リポソームと呼ばれることもある）は、医療および創薬に資する基礎研究の技術基盤とされてきたが、近年、生体適合性の観点から医療および創薬への応用展開も強く期待されている。
　従来の脂質膜小胞の形成方法としては、逆エマルジョン法（Ｓ．Ｐａｕｔｏｔ　ｅｔ　ａｌ．，２００３　Ｌａｎｇｍｕｉｒ）やＨｙｄｒａｔｉｏｎ／Ｅｌｅｃｔｒｏｆｏｒｍａｔｉｏｎ法（Ｇ．Ｇｉｒａｒｄ　ｅｔ　ａｌ．，２００４　Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ）が知られているが、これらの方法では、均一な大きさの脂質膜小胞を形成することができない。
　Ｋ．Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，２００７　ＪＡＣＳでは、均一な大きさの脂質膜小胞を形成する方法が提案されているものの、この方法では、直径が１００μｍ～３００μｍの巨大な小胞のみ形成可能である。その大きさ故に、脂質膜小胞を用いた膜タンパク質の機能評価または薬物を人体の細部まで運搬するドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）など医療および創薬への応用は困難とされている。したがって、毛細血管の内径（＜５μｍ）より小さい、小型かつ均一粒径の脂質膜小胞の形成方法の開発が強く望まれていた。
　かかる洞察に基づき、発明者は、従来の高密度微小チャンバーアレイを発展させた、均一粒径の脂質膜小胞アレイとその製造方法を新規開発した。具体的には、従来の高密度微小チャンバーアレイと同じマイクロリアクタチップを利用するが、脂質膜の形成プロトコルを新規開発することにより、「均一な大きさを有する球状の微小液滴を量産・アレイ化する技術」および「微小液滴の表面を脂質膜で覆う技術」を確立し、すなわち、脂質膜で覆われた均一粒径を有する脂質膜小胞を量産することに成功した。
　また、当該技術においては、マイクロリアクタチップが有する微小チャンバーの大きさと、形成される脂質膜小胞の大きさとが一致する。そのため、半導体製造プロセスを利用して微小チャンバーの容積を厳密に定義することにより、脂質膜小胞の大きさをサブマイクロメートルの大きさまで定量的に制御することが可能である。
　当該技術を利用すると、脂質膜小胞の大きさの均一性と大幅な小型化に伴い、医療・創薬に資する「ｉ）高感度かつ定量的な膜タンパク質の機能解析」および「ｉｉ）細胞を模倣したｉｎ　ｖｉｔｒｏ人工再構成系の構築」を可能にするだけでなく、従来困難とされていた「ｉｉｉ）ＤＤＳの定量的な薬効評価およびその実用化」への道筋が拓かれる。すなわち、当該技術の開発により、人工膜小胞の汎用性を創薬・医療分野において大幅に拡張することが可能となる。
　以下で説明する実施形態は、このような知見に基づいて創案されたものである。
　実施形態の第１の態様に係る脂質膜小胞の形成方法は、
　基板と、前記基板上に設けられた疎水性物質からなる層であって、複数のチャンバーの開口部が該層の主面上に規則的に配列するように形成されている、疎水層と、を備えたマイクロリアクタチップの、前記疎水層の主面に面する液体流路に第１水溶液を導入し、前記チャンバーを前記第１水溶液で満たすステップと、
　前記液体流路に脂質を含有する有機溶媒を導入し、前記チャンバー以外の前記液体流路から前記第１水溶液を洗い流し、前記第１水溶液で満たされた前記チャンバーの開口部に第１脂質単層膜を形成するステップと、
　前記液体流路に第２水溶液を導入し、前記疎水層の主面上に形成される前記有機溶媒の層の前記第２水溶液との界面に第２脂質単層膜を形成するステップと、
　前記チャンバー内の前記第１水溶液を、前記第１脂質単層膜で覆われた球状の液滴へと形状変化させるステップと、
　前記第１脂質単層膜で覆われた液滴に物理的作用を与えることにより前記第２脂質単層膜の位置まで移動させ、前記液滴を覆う第１脂質単層膜と前記第２脂質単層膜とをジッピングさせ、脂質膜小胞を形成するステップと、
を備える。
　このような態様によれば、各チャンバー内に満たされた水溶液がそれぞれ脂質膜で覆われて脂質膜小胞が形成されたため、脂質膜小胞の大きさをチャンバーの容積に応じて定量的に制御することができ、これにより、脂質膜小胞の大きさを大幅に小型化かつ均一化することができる。この結果、生体分子１個の反応による脂質膜小胞内の反応生成物や反応基質などの濃度変化を大きくし、濃度変化として検出する際の検出感度を高くすることができ、生体分子の反応が極めて遅くても、生体分子の反応を高感度で検出することができる。また、２層膜オルガネラや細菌細胞膜がｉｎ　ｖｉｔｒｏで人工的に構築されていることになり、従来計測困難であった２層膜オルガネラや細菌細胞膜に存在する膜タンパク質の機能解析が可能となる。また、脂質膜小胞の小型化および均一性に加えて、薬剤を小胞内部に簡便に内包することが可能であり、ＤＤＳのキャリアとして利用することで定量的な薬効評価およびその実用化を期待できる。
　実施形態の第２の態様に係る脂質膜小胞の形成方法は、第１の態様に係る脂質膜小胞の形成方法であって、
　前記物理的作用は、振動、熱、電気、光のいずれかである。
　実施形態の第３の態様に係る脂質膜小胞の形成方法は、
　基板と、前記基板上に設けられた疎水性物質からなる層であって、複数のチャンバーの開口部が該層の主面上に規則的に配列するように形成されている、疎水層と、を備えたマイクロリアクタチップの、前記疎水層の主面に面する液体流路に第１水溶液を導入し、前記チャンバーを前記第１水溶液で満たすステップと、
　前記液体流路に脂質を含有する有機溶媒を導入し、前記チャンバー以外の前記液体流路から前記第１水溶液を洗い流し、前記第１水溶液で満たされた前記チャンバーの開口部に第１脂質単層膜を形成するステップと、
　前記液体流路に第２水溶液を導入し、前記疎水層の主面上に形成される前記有機溶媒の層の前記第２水溶液との界面に第２脂質単層膜を形成するステップと、
　前記チャンバー内の前記第１水溶液を、前記第１脂質単層膜で覆われた球状の液滴へと形状変化させるステップと、
　前記有機溶媒を前記第２水溶液へと溶解させることにより前記第２脂質単層膜を前記液滴の位置まで移動させ、前記液滴を覆う第１脂質単層膜と前記第２脂質単層膜とをジッピングさせ、脂質膜小胞を形成するステップと、
を備える。
　このような態様によっても、各チャンバー内に満たされた水溶液がそれぞれ脂質膜で覆われて脂質膜小胞が形成されたため、脂質膜小胞の大きさをチャンバーの容積に応じて定量的に制御することができ、これにより、脂質膜小胞の大きさを大幅に小型化かつ均一化することができる。この結果、生体分子１個の反応による脂質膜小胞内の反応生成物や反応基質などの濃度変化を大きくし、濃度変化として検出する際の検出感度を高くすることができ、生体分子の反応が極めて遅くても、生体分子の反応を高感度で検出することができる。また、２層膜オルガネラや細菌細胞膜がｉｎ　ｖｉｔｒｏで人工的に構築されていることになり、従来計測困難であった２層膜オルガネラや細菌細胞膜に存在する膜タンパク質の機能解析が可能となる。また、脂質膜小胞の小型化および均一性に加えて、薬剤を小胞内部に簡便に内包することが可能であり、ＤＤＳのキャリアとして利用することで定量的な薬効評価およびその実用化を期待できる。
　実施形態の第４の態様に係る脂質膜小胞の形成方法は、第１～３のいずれかの態様に係る脂質膜小胞の形成方法であって、
　各チャンバーの容量は、４０００×１０－１８ｍ３以下である。
　実施形態の第５の態様に係る脂質膜小胞の形成方法は、第１～４のいずれかの態様に係る脂質膜小胞の形成方法であって、
　前記脂質膜小胞の大きさは、前記チャンバーの容量に対応している。
　実施形態の第６の態様に係る脂質膜小胞の形成方法は、第１～５のいずれかの態様に係る脂質膜小胞の形成方法であって、
　前記脂質膜小胞の直径は、５μｍ以下である。
　実施形態の第７の態様に係るマイクロリアクタチップは、
　基板と、
　前記基板上に設けられた疎水性物質からなる層であって、複数のチャンバーの開口部が該層の主面上に規則的に配列するように形成されている、疎水層と、
を備え、
　前記疎水層の主面上に設けられた有機溶媒の層の前記疎水層とは逆側の界面には、複数の脂質膜小胞が形成されている。
　実施形態の第８の態様に係るマイクロリアクタチップは、
　基板と、
　前記基板上に設けられた疎水性物質からなる層であって、複数のチャンバーの開口部が該層の主面上に規則的に配列するように形成されている、疎水層と、
を備え、
　各チャンバー内には、脂質膜小胞が１つずつ形成されている。
　実施形態の第９の態様に係るマイクロリアクタチップは、第７または８の態様に係る脂質膜小胞の形成方法であって、
　各チャンバーの容量は、４０００×１０－１８ｍ３以下である。
　実施形態の第１０の態様に係るマイクロリアクタチップは、第７～９のいずれかの態様に係る脂質膜小胞の形成方法であって、
　前記脂質膜小胞の大きさは、前記チャンバーの容量に対応している。
　実施形態の第１１の態様に係るマイクロリアクタチップは、第７～１０のいずれかの態様に係る脂質膜小胞の形成方法であって、
　前記脂質膜小胞の直径は、５μｍ以下である。
　実施形態の第１２の態様に係る細胞膜小胞の内包物の組み込み方法は、
　基板と、前記基板上に設けられた疎水性物質からなる層であって、複数のチャンバーの開口部が該層の主面上に規則的に配列するように形成されている、疎水層と、を備えたマイクロリアクタチップの、前記疎水層の主面に面する液体流路に薬剤を含む第１水溶液を導入し、前記チャンバーを前記第１水溶液で満たすステップと、
　前記液体流路に脂質を含有する有機溶媒を導入し、前記チャンバー以外の前記液体流路から前記第１水溶液を洗い流し、前記第１水溶液で満たされた前記チャンバーの開口部に第１脂質単層膜を形成するステップと、
　前記液体流路に第２水溶液を導入し、前記疎水層の主面上に形成される前記有機溶媒の層の上面に第２脂質単層膜を形成するステップと、
　前記チャンバー内の前記第１水溶液を、前記第１脂質単層膜で覆われた球状の液滴へと形状変化させるステップと、
　前記マイクロリアクタチップに物理的作用を与えることにより前記第１脂質単層膜で覆われた液滴を前記第２脂質単層膜の位置まで移動させ、前記液滴を覆う第１脂質単層膜と前記第２脂質単層膜とをジッピングさせ、脂質膜小胞を形成するステップと、
を備える。
　実施形態の第１３の態様に係る細胞膜小胞の内包物の組み込み方法は、
　基板と、前記基板上に設けられた疎水性物質からなる層であって、複数のチャンバーの開口部が該層の主面上に規則的に配列するように形成されている、疎水層と、を備えたマイクロリアクタチップの、前記疎水層の主面に面する液体流路に薬剤を含む第１水溶液を導入し、前記チャンバーを前記第１水溶液で満たすステップと、
　前記液体流路に脂質を含有する有機溶媒を導入し、前記チャンバー以外の前記液体流路から前記第１水溶液を洗い流し、前記第１水溶液で満たされた前記チャンバーの開口部に第１脂質単層膜を形成するステップと、
　前記液体流路に第２水溶液を導入し、前記疎水層の主面上に形成される前記有機溶媒の層の上面に第２脂質単層膜を形成するステップと、
　前記チャンバー内の前記第１水溶液を、前記第１脂質単層膜で覆われた球状の液滴へと形状変化させるステップと、
　前記有機溶媒を前記第２水溶液へと溶解させることにより前記第２脂質単層膜を前記液滴の位置まで移動させ、前記液滴を覆う第１脂質単層膜と前記第２脂質単層膜とをジッピングさせ、脂質膜小胞を形成するステップと、
を備える。
　以下に、添付の図面を参照して、実施の形態の具体例を詳細に説明する。なお、各図において同等の機能を有する構成要素には同一の符号を付し、同一符号の構成要素の詳しい説明は繰り返さない。
（第１実施形態）
　図１は、第１実施形態に係る脂質膜小胞の形成方法に用いるマイクロリアクタチップの概略構成の一例を示す図である。図２は、図１に示すマイクロリアクタチップをＡ－Ａ線に沿って切断した断面を示す図である。
　図１および図２に示すように、マイクロリアクタチップ２０は、基板２２と、基板２２上に設けられた疎水層２４とを備えている。
　基板２２は、透光性を有しており、平坦である。基板２２は、たとえばガラス、アクリル樹脂などで構成され得る。基板２２の材料、厚み、および形状などは、基板２２の下方から基板２２へと入射した光が基板２２を透過してチャンバー２６の内部へと進入し、かつ、チャンバー２６の内部から基板２２へと入射した光が基板２２を透過して基板２２の下方へと脱出可能であれば特に限定されない。具体的には、たとえば、基板２２の厚みは０．１ｍｍ以上５ｍｍ以下であってもよいし、０．３ｍｍ以上３ｍｍ以下であってもよいし、０．７ｍｍ以上１．５ｍｍ以下であってもよい。平面視における基板２２の大きさは特に限定されない。
　疎水層２４は、疎水性物質からなる層である。疎水性物質としては、たとえばフッ素樹脂などの疎水性の樹脂、およびガラスなどの樹脂以外の物質が含まれる。疎水層２４の厚みは、後述するチャンバー２６の容量に応じて適宜に調整され得る。具体的には、たとえば、１０ｎｍ以上１００μｍ以下であってもよいし、１００ｎｍ以上５μｍ以下であってもよいし、２５０ｎｍ以上１μｍ以下であってもよい。
　疎水層２４には、複数の微小なチャンバー２６の開口部が、疎水層２４の主面上に規則的かつ高密度に配列するように設けられている。チャンバー２６の容量は４０００×１０－１８ｍ３以下（４０００μｍ３以下）である。チャンバー２６の容量は、たとえば、０．１×１０－１８ｍ３以上４０００×１０－１８ｍ３以下であってもよいし、０．５×１０－１８ｍ３以上４００×１０－１８ｍ３以下であってもよいし、１×１０－１８ｍ３以上４０×１０－１８ｍ３以下であってもよい。
　チャンバー２６の深さは、たとえば、１０ｎｍ以上１００μｍ以下であってもよいし、１００ｎｍ以上５μｍ以下であってもよいし、２５０ｎｍ以上１μｍ以下であってもよい。
　チャンバー２６の開口部は、たとえば円形とすることができる。円形とする場合の円の直径は、たとえば、０．１μｍ以上１００μｍ以下であってもよいし、０．５μｍ以上５μｍ以下であってもよいし、１μｍ以上１０μｍ以下であってもよい。
　「規則的」とは、たとえば、基板の厚み方向から見て、各チャンバーが基板上に、格子状、マトリクス状、千鳥状などに配列されていることを言う。「規則的」とは、たとえば、各チャンバーが複数の列をなすように一定間隔で配列されていることを意味し得る。
　「高密度」とは、たとえば、１平方ｍｍ（１ｍｍ２）あたりのチャンバーの数が、０．１×１０３個以上２０００×１０３個以下であってもよいし、１×１０３個以上１０００×１０３以下であってもよいし、５×１０３個以上１００×１０３以下であってもよい。１ｃｍ２（１×１０－４ｍ２）あたりに換算すると、１０×１０３個以上２００×１０６個以下であってもよいし、１００×１０３個以上１００×１０６個以下であってもよいし、０．５×１０６個以上１０×１０６個以下であってもよい。
　マイクロリアクタチップ２０において、複数のチャンバー２６は、深さが１００μｍ以下で、円形に換算したときに直径が１００μｍ以下となるよう形成されているものとしたり、深さが２μｍ以下で、円形に換算したときも直径が１０μｍ以下となるよう形成されているものとしたり、深さが１μｍ以下で、円形に換算したときに直径が５μｍ以下となるよう形成されているものとしたりすることもできる。こうすれば、基板２２の表面に疎水性物質による薄膜を形成し、該薄膜に複数の微小なチャンバー２６を形成する手法を用いて、脂質二重膜形成前のマイクロリアクタチップ２０を比較的容易に製造することができる。なお、「円形に換算したとき」の「直径」とは、深さ方向に対して垂直な断面の形状と同じ面積を有する円形の直径を言い、たとえば、該断面が１μｍ四方の正方形の場合には、円形に換算したときの直径は２／√π≒１．１μｍとなる。
　チャンバー２６は、それぞれ厚さが５００ｎｍを含む所定厚範囲の疎水性物質による薄膜に、円形に換算したときに直径が１μｍを含む所定直径範囲となるよう形成されているものとすることもできる。試験対象の生体分子の反応速度の大きさや生体分子の含有率を考慮するとともに製造の容易さも考慮すると、チャンバー２６の深さや直径は数百ｎｍ～数μｍが好適であると考えられる。ここで、「所定厚範囲」は、たとえば、５００ｎｍの０．１倍の５０ｎｍ以上で５００ｎｍの１０倍の５μｍ以下の範囲としたり、５００ｎｍの０．５倍の２５０ｎｍ以上で５００ｎｍの２倍の１μｍ以下の範囲としたりすることができる。「所定直径範囲」は、たとえば、１μｍの０．１倍の１００ｎｍ以上で１μｍの１０倍の１０μｍ以下としたり、１μｍの０．５倍の５００ｎｍ以上で１μｍの２倍の２μｍ以下の範囲としたりすることができる。
　一例において、それぞれのチャンバー２６は、厚さＤが１μｍの疎水層２４に、直径Ｒが５μｍとなるよう形成されている。したがって、それぞれのチャンバー２６の容量Ｌは、Ｌ＝π（２．５×１０－６）２×１×１０－６ｍ３≒１９．６×１０－１８ｍ３となる。仮に平面視においてチャンバー２６を縦横２μｍの間隔で配列したものとすると、１つのチャンバー２６に必要な面積Ｓは一辺が７μｍの正方形となり、Ｓ＝（７×１０－６）２ｍ２＝４９×１０－１２ｍ２と計算される。したがって、ガラス基板２２には、１ｃｍ２（１×１０－４ｍ２）あたり約２×１０６個（１平方ｍｍあたり２０×１０３個）のチャンバー２６が形成されることになる。
　図示は省略するが、各チャンバー２６の内部（たとえばチャンバー２６の内側面または底面）には電極が設けられていてもよい。各電極は互いに電気的に接続されていてもよい。電極は、金属、たとえば、銅、銀、金、アルミ、クロムなどで構成されていてもよい。電極は、金属以外の材料、たとえば、ＩＴＯ（酸化インジウムスズ）、ＩＺＯ（酸化インジウムスズと酸化亜鉛とからなる材料）、ＺｎＯ、ＩＧＺＯ（インジウム、ガリウム、亜鉛、酸素から構成される材料）などで構成されていてもよい。
　電極の厚みは、たとえば、１０ｎｍ以上１００μｍ以下であってもよいし、１００ｎｍ以上５μｍ以下であってもよいし、２５０ｎｍ以上１μｍ以下であってもよい。
　かかる構成において、基板２２の下方から基板２２へと入射した光は、基板２２を透過してチャンバー２６の内部へと進入し、かつ、チャンバー２６の内部から基板２２へと入射した光は、基板２２を透過して基板２２の下方へと脱出する。
［マイクロリアクタチップの製造方法］
　次に、図３および図４Ａ～図４Ｆを参照し、マイクロリアクタチップ２０の製造方法を説明する。図３は、マイクロリアクタチップ２０の製造方法の一例を示すフローチャートである。図４Ａ～図４Ｆは、マイクロリアクタチップ２０の製造方法における各工程を示す図である。
　まず、図３および図４Ａに示すように、ガラス基板２２のガラス表面を洗浄するための洗浄処理として、１０Ｍの水酸化カリウム（ＫＯＨ）溶液にガラス基板２２を２４時間程度浸す（ステップＳ１１１）。これにより、ガラス基板２２の表面は親水性を帯びる。
　次に、図４Ｂに示すように、ガラス基板２２の表面に、疎水性の物質（たとえば、旭硝子株式会社製のフッ素樹脂（ＣＹＴＯＰ））をスピンコートして物質膜２４ａを形成し、物質膜２４ａをガラス基板２２の表面に密着させる（ステップＳ１１２）。スピンコートの条件としては、たとえば、２０００ｒｐｓ、３０秒という条件を用いることができ、この場合、物質膜２４ａの膜厚は約１μｍとなる。物質膜２４ａのガラス基板２２表面への密着は、たとえば、１８０℃のホットプレートで１時間ベークすることにより行うことができる。
　次に、図４Ｃに示すように、物質膜２４ａの表面にレジスト２５ａをスピンコートにより形成し、レジスト２５ａを物質膜２４ａの表面に密着させる（ステップＳ１１３）。レジスト２５ａとしては、ＡＺ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ製のＡＺ－４９０３などを用いることができる。スピンコートの条件としては、たとえば、４０００ｒｐｓ、６０秒という条件を用いることができる。レジスト２５ａの物質膜２４ａ表面への密着は、たとえば、１１０℃のホットプレートで５分間ベークして、レジスト２５ａ内の有機溶媒を蒸発させることにより行うことができる。
　次に、図４Ｄに示すように、チャンバー２６のパターンのマスクを用いてレジスト２５ａを露光し、レジスト専用の現像液に浸して現像して、チャンバー２６を形成する部分が除かれたレジスト２５ｂを形成する（ステップＳ１１４）。露光の条件は、たとえば、ＳＡＮ－ＥＩ製の露光機によりＵＶ　ｐｏｗｅｒ　２５０Ｗで７秒照射する条件を用いることができる。現像の条件としては、たとえば、ＡＺ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ製のＡＺ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｒに５分浸す条件を用いることができる。
　次に、図４Ｅに示すように、レジスト２５ｂによりマスクされた物質膜２４ａをドライエッチングすることにより、物質膜２４ａからチャンバー２６となる部分を取り除いた物質膜２４ｂとし（ステップＳ１１５）、その後、図５Ｆに示すように、レジスト２５ｂを除去する（ステップＳ１１６）。ドライエッチングは、たとえば、Ｓａｍｃｏ製のＲｅａｃｔｉｖｅ　ｉｏｎ　ｅｔｃｈｉｎｇ装置を使用し、エッチング条件として、Ｏ２　５０ｓｃｃｍ、Ｐｒｅｓｓｕｒｅ　１０Ｐａ、Ｐｏｗｅｒ　５０Ｗ、Ｔｉｍｅ　３０ｍｉｎという条件を用いることができる。レジスト２５ｂの除去は、アセトンに浸し、イソプロパノールで洗浄した後に純水で洗浄することにより行うことができる。
　なお、ドライエッチング以外の手法、たとえばナノインプリンティングなどの手法を用いて疎水性物質の薄膜に複数のチャンバー２６を形成するものとしてもよい。ドライエッチングの場合には、Ｏ２プラズマの作用によりチャンバー２６の内側面が親水性を帯び、チャンバー２６内に水溶液を充填しやすくなるため好ましい。
［脂質膜小胞の形成方法］
　次に、図５～図１１を参照し、第１実施形態に係る脂質膜小胞の形成方法について説明する。図５は、第１実施形態に係る脂質膜小胞の形成方法の一例を示すフローチャートである。図６～図１１は、第１実施形態に係る脂質膜小胞の形成方法における各工程を示す図である。
　まず、図５および図６に示すように、マイクロリアクタチップにスペーサ４２を介在させつつ、液体導入孔４６が形成されたガラス板４４を載せる。これにより、疎水層２４の主面が略水平な底面となる液体流路４８が形成される。次いで、液体導入孔４６から液体流路４８に、界面活性剤を含む第１水溶液を導入し、液体流路４８およびチャンバー２６を第１水溶液で満たしておく（ステップＳ１１）。ここで、第１水溶液としては、具体的には、たとえば、１ｍＭのＨＥＰＥＳと１０ｍＭの塩化カリウムとを含有する液体（以下「緩衝液Ａ」と呼ぶことがある）に終濃度１０μＭの蛍光色素（たとえばＡｌｅｘａ４８８（緑色））を添加したものを用いることができる。第１水溶液は、脂質膜小胞に包含させるべき薬剤を含有するものであってもよい。
　次に、図７に示すように、液体流路４８およびチャンバー２６が第１水溶液で満たされた状態で、液体導入孔４６から液体流路４８に、第１水溶液より比重が重い、脂質３５を含有する有機溶媒を導入する（ステップＳ１２）。ここで、脂質としては、大豆や大腸菌由来などの天然脂質、ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）やＤＯＰＧ（ジオレオイルホスファチジルグリセロール）などの人工脂質を用いることができる。有機溶媒としては、クロロホルムを用いることができる。具体的な一例としては、１ｍｇ／ｍｌのＤＯＰＣと０．０４５ｍｇ／ｍｌの蛍光脂質（たとえばＮＢＤ－ＰＳ（緑色））とを含有するものを用いることができる。
　液体導入孔４６から液体流路４８に脂質３５を含有する有機溶媒が導入されると、チャンバー２６が第１水溶液で満たされた状態で、脂質３５の親水基がチャンバー２６の第１水溶液側を向いた状態の第１脂質単層膜３１ａが、チャンバー２６の開口部を液封するように形成される。チャンバー２６以外の液体流路４８からは第１水溶液が洗い流される。
　次に、図８に示すように、液体導入孔４６から液体流路４８に、有機溶媒より比重が軽い、第２水溶液を導入する（ステップＳ１３）。第２水溶液としては、具体的には、たとえば、緩衝液Ａを用いることができる。
　液体導入孔４６から液体流路４８に第２水溶液が導入されると、疎水層２４の主面上に有機溶媒の層３６が形成され、有機溶媒の層３６と第２水溶液との界面に、脂質３５の親水基が第２水溶液側を向いた状態の第２脂質単層膜３１ｂが形成される。
　次に、図９および図１０に示すように、第１脂質単層膜３１ａにより液封されたチャンバー２６内の第１水溶液を、表面張力により自発的に、第１脂質単層膜３１ａで覆われた球状の液滴へと形状変化させる（ステップＳ１４）。第１水溶液は界面活性剤を含んでいることから、親水性を帯びたチャンバー２６の壁面に対して外れやすくなっており、自発的に容易に丸くなることができる。
　次に、図１１に示すように、第１脂質単層膜３１ａで覆われた液滴に物理的作用を与えることにより、チャンバー２６の壁面から遊離させ、有機溶媒の層３６の上面まで浮上させる（ステップＳ１５）。物理的作用は、第１脂質単層膜３１ａで覆われた液滴をチャンバー２６の壁面から遊離させることができるものであれば、特に限定されるものではなく、たとえば、振動、熱、電気、光のいずれかである。
　第１脂質単層膜３１ａで覆われた液滴が有機溶媒の層３６の上面に到達すると、液滴を覆う第１脂質単層膜３１ａと第２脂質単層膜３１ｂとがジッピングされ、すなわち第１脂質単層膜３１ａの外側に重なるように第２脂質単層膜３１ｂが形成され、脂質二重膜で覆われた脂質膜小胞３１が形成される。ここで、第１水溶液が薬剤を含有している場合には、脂質膜小胞３１は当該薬剤を包含したものとなる。
　脂質膜小胞３１の形成後に、脂質膜小胞３１の脂質二重膜に膜タンパク質を再構成させる工程を備えるものとすることもできる。再構成させる工程は、膜タンパク質を含む細胞膜断片、タンパク質を埋め込んだ脂質二重膜、水溶性タンパク質、界面活性剤により可溶化させたタンパク質のいずれかを脂質膜小胞３１の脂質二重膜に導入し、脂質二重膜にタンパク質を組み込んで膜タンパク質とする工程であってもよい。脂質二重膜にタンパク質を組み込む手法としては、界面活性剤により可溶化させたタンパク質の場合には熱揺動などを用いることができる。
　以上のような方法により、疎水層２４の主面上に設けられた有機溶媒の層３６の上面に、複数の脂質膜小胞３１が形成されているマイクロリアクタチップ２０を得ることができる。
　ここで、基板２２の下方から基板２２へと入射した光は、基板２２を透過してチャンバー２６の内部へと進入し、かつ、チャンバー２６の内部から基板２２へと入射した光は、基板２２を透過して基板２２の下方へと脱出する。脂質膜小胞に膜タンパク質が再構成されている場合、該膜タンパク質の機能は、共焦点レーザー顕微鏡を用いて、脂質膜小胞の内部に収容されている第１水溶液に含まれる蛍光物質が発する光を検出することなどにより解析することができる。顕微鏡として、落射型共焦点顕微鏡が用いられてもよい。
［実施例］
　第１実施形態に係る実施例として、発明者は、下表１に示すように、チャンバー２６のサイズがそれぞれ異なる５種類のマイクロリアクタチップＡ～Ｅを用意した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　次に、発明者は、マイクロリアクタチップ毎に、第１実施形態に係る脂質膜小胞の形成方法を行うことにより、脂質膜小胞３１を形成した。図１４は、発明者によって実際に形成された脂質膜小胞３１の蛍光画像を示している。
　そして、発明者は、マイクロリアクタチップ毎に、形成された脂質膜小胞３１の粒径を、蛍光画像を用いて測定した。図１５は、発明者によって実際に形成された脂質膜小胞３１の粒径分布をチャンバー２６のサイズ毎に分けて示すグラフである。また、図１６は、発明者によって実際に形成された脂質膜小胞３１の体積とチャンバー２６の容量との関係を示すグラフである。
　図１５に示すように、第１実施形態に係る脂質膜小胞の形成方法によれば、直径が５μｍ以下の超微小な脂質膜小胞３１を形成することが可能である。また、チャンバー２６のサイズ毎に分けて得られる脂質膜小胞３１の粒径分布は、標準偏差が５０ｎｍ程度（１０％以下の均一性）であり、極めて高い均一性を達成することが可能である。
　さらに、図１６に示すように、脂質膜小胞３１の体積は、チャンバー２６の容量に対応している。したがって、半導体製造プロセスを利用してチャンバー２６の容積を厳密に定義することにより、脂質膜小胞３１の大きさをサブマイクロメートルの大きさまで定量的に制御することが可能である。
（第２実施形態）
　次に、図１２および図１３を参照し、第２実施形態に係る脂質膜小胞の形成方法について説明する。図１２は、第２実施形態に係る脂質膜小胞の形成方法の一例を示すフローチャートである。図１３は、第２実施形態に係る脂質膜小胞の形成方法において、脂質膜小胞を形成する工程（ステップＳ１６）を示す図である。
　第２実施形態において、各チャンバー２６内の第１水溶液を第１脂質単層膜３１ａで覆われた液滴へと形状変化させるまでの工程（ステップＳ１１～Ｓ１４）は、上述の第１実施形態と同様であり、説明を省略する。
　第２実施形態では、各チャンバー２６内の第１水溶液を第１脂質単層膜３１ａで覆われた液滴へと形状変化させる工程（ステップＳ１４）の後、所定時間（たとえば１５分程度）静置させて、有機溶媒を第２水溶液へと溶解させる。有機溶媒が第２水溶液へと溶解するに従って、有機溶媒の層３６は薄膜化してゆき、有機溶媒の層３６の上面に位置する第２脂質単層膜３１ｂは降下する（ステップＳ１５）。
　そして、チャンバー２６の液滴を覆う第１脂質単層膜３１ａと、降下してくる第２脂質単層膜３１ｂとがジッピングされ、すなわち第１脂質単層膜３１ａの外側に重なるように第２脂質単層膜３１ｂが形成され、脂質二重膜で覆われた脂質膜小胞３１が形成される。ここで、第１水溶液が薬剤を含有している場合には、脂質膜小胞３１は当該薬剤を包含したものとなる。
　脂質膜小胞３１の形成後に、脂質膜小胞３１の脂質二重膜に膜タンパク質を再構成させる工程を備えるものとすることもできる。再構成させる工程は、膜タンパク質を含む細胞膜断片、タンパク質を埋め込んだ脂質二重膜、水溶性タンパク質、界面活性剤により可溶化させたタンパク質のいずれかを脂質膜小胞３１の脂質二重膜に導入し、脂質二重膜にタンパク質を組み込んで膜タンパク質とする工程であってもよい。脂質二重膜にタンパク質を組み込む手法としては、界面活性剤により可溶化させたタンパク質の場合には熱揺動などを用いることができる。
　以上のような方法により、各チャンバー２６内に脂質膜小胞３１が１つずつ形成されているマイクロリアクタチップ２０を得ることができる。
［実施例］
　第２実施形態に係る実施例として、発明者は、第２実施形態に係る脂質膜小胞の形成方法を行うことにより、マイクロリアクタチップ２０の各チャンバー２６内に１つずつ脂質膜小胞３１を形成した。
　次に、発明者は、図１７に示すように、形成された脂質膜小胞３１の脂質二重膜に、膜輸送体であるα－ヘモリシンを再構成し、蛍光顕微鏡を用いて、脂質膜小胞３１の内部に収容されている蛍光物質が発する光の強度変化から、α－ヘモリシンの基質輸送活性を計測した。図１８は、計測結果を示すグラフである。
　図１８に示すように、蛍光強度が時間とともに徐々に低下していることから、脂質膜小胞３１に膜輸送体であるα－ヘモリシンが再構成されていることを確認でき、すなわち発明者により形成された脂質膜小胞が脂質二重膜で覆われたものであることを確認できる。
　以上のような第１実施形態および第２実施形態によれば、各チャンバー２６内に満たされた第１水溶液がそれぞれ脂質膜で覆われて脂質膜小胞３１が形成されたため、脂質膜小胞３１の大きさを、チャンバー２６の容積に応じてサブマイクロメートルの大きさまで定量的に制御することができる。
　均一な大きさの超微小な脂質膜小胞の基礎研究、医療、創薬における有用性を以下に示す。
（１）膜タンパク質の高感度・定量機能解析（基礎研究）
　脂質膜小胞を利用した膜タンパク質の高感度・定量機能解析においては、脂質膜小胞の容積の均一性および小型化が必要不可欠であるところ、上述した実施形態に係る技術を利用することにより、以下の効果が得られる。
　１．均一な微小脂質膜小胞を試験管として利用することによる膜タンパク質の高感度かつ定量的な機能計測
　　従来の方法では感度・定量性不足のため計測が不可能であった膜タンパク質（例えば膜輸送体）の機能解析が実現する。
　２．微小脂質膜小胞を並列利用することによるハイスループットな機能計測
　　ハイスループット化により膜タンパク質の機能解析を基盤とした薬剤スクリーニングシステムに資する。
（２）細胞を模倣した人工細胞の構築（基礎研究）
　細胞や細胞内小器官の大きさは種によって十μｍ～数百ｎｍと多様であり、これらを人工的に再構築するには、脂質膜小胞の大きさを厳密に制御することが必要であるところ、上述した実施形態に係る技術を利用することにより、以下の効果が得られる。
　１．脂質膜小胞を細胞と同サイズに制御可能
　　従来の方法では困難であった、細胞内小器官や細菌などを模倣した脂質膜小胞を作成することができる。
（３）ＤＤＳシステムの担体（医療・創薬などの応用研究）
　薬剤を運搬するＤＤＳでは、その担体に生体適合性を持たせること、および、人体の細部まで運搬し、かつ効用を安定化させるため、その粒径は小型および均一であることが、必要不可欠である。さらに、薬剤を脂質膜小胞の内部に簡便に内包させる必要がある。このような課題に対し、上述した実施形態に係る技術を利用することにより、以下の効果が得られる。
　１．毛細血管まで輸送できる担体の小型化
　　直径が５μｍ以下の毛細血管を伝って人体の細部まで薬剤を運搬することが可能である。
　２．薬剤を内包したリン脂質で構成された膜小胞の簡便な作成が可能
　　大きさの不均一性や内包効率が悪いために従来ＤＤＳで困難とされていた膜小胞を簡便に作成することができる。
　なお、上述した実施の形態では、図６～１１及び図１３に示すように、マイクロリアクタチップ２０の上方に液体流路４８が配置された態様にて脂質膜小胞３１が形成されたが、これに限定されず、図６～１１及び図１３を上下逆さまにした態様、すなわちマイクロリアクタチップ２０の下方に液体流路４８が配置された態様にて脂質膜小胞３１が形成されてもよい。
　たとえば、第１実施例の一変形例として、図６～１１を上下逆さまに見て、（１）マイクロリアクタチップ２０の疎水層２４の主面に面する液体流路４８に、第１水溶液を導入し、液体流路４８およびチャンバー２６を第１水溶液で満たし、（２）液体流路４８に、第１水溶液より比重が軽い、脂質を含有する有機溶媒を導入し、チャンバー２６以外の液体流路４８から第１水溶液を洗い流し、第１水溶液で満たされたチャンバー２６の開口部に第１脂質単層膜３１ａを形成し、（３）液体流路４８に、有機溶媒より比重が重い第２水溶液を導入し、疎水層２４の主面上に形成される有機溶媒の層３６の第２水溶液との界面に第２脂質単層膜３１ｂを形成し、（４）チャンバー２６内の第１水溶液を第１脂質単層膜３１ａで覆われた球状の液滴へと形状変化させ、（５）第１脂質単層膜３１ａで覆われた液滴に物理的作用を与えることにより、チャンバー２６の壁面から遊離させ、第２脂質単層膜３１ｂの位置まで沈降させ、液滴を覆う第１脂質単層膜３１ａと第２脂質単層膜３１ｂとをジッピングさせ、脂質膜小胞３１を形成してもよい。
　また、第２実施例の一変形例として、図６～１０、１３を上下逆さまに見て、（１）マイクロリアクタチップ２０の疎水層２４の主面に面する液体流路４８に、第１水溶液を導入し、液体流路４８およびチャンバー２６を第１水溶液で満たし、（２）液体流路４８に、第１水溶液より比重が軽い、脂質を含有する有機溶媒を導入し、チャンバー２６以外の液体流路４８から第１水溶液を洗い流し、第１水溶液で満たされたチャンバー２６の開口部に第１脂質単層膜３１ａを形成し、（３）液体流路４８に、有機溶媒より比重が重い第２水溶液を導入し、疎水層２４の主面上に形成される有機溶媒の層３６の第２水溶液との界面に第２脂質単層膜３１ｂを形成し、（４）チャンバー２６内の第１水溶液を第１脂質単層膜３１ａで覆われた球状の液滴へと形状変化させ、（５）有機溶媒を第２水溶液へと溶解させ、有機溶媒の層３６を薄膜化させることにより第２脂質単層膜３１ｂを液滴の位置まで上昇させ、液滴を覆う第１脂質単層膜３１ａと第２脂質単層膜３１ｂとをジッピングさせ、脂質膜小胞３１を形成してもよい。
　なお、上述した実施の形態および個々の変形例の記載ならびに図面の開示は、特許請求の範囲に記載された発明を説明するための一例に過ぎず、上述した実施の形態および個々の変形例の記載または図面の開示によって特許請求の範囲に記載された発明が限定されることはない。上述した実施の形態および個々の変形例の構成要素は、発明の主旨を逸脱しない範囲で任意に組み合わせることが可能である。

Claims (13)

  1. 　基板と、前記基板上に設けられた疎水性物質からなる層であって、複数のチャンバーの開口部が該層の主面上に規則的に配列するように形成されている、疎水層と、を備えたマイクロリアクタチップの、前記疎水層の主面に面する液体流路に第１水溶液を導入し、前記チャンバーを前記第１水溶液で満たすステップと、
    　前記液体流路に脂質を含有する有機溶媒を導入し、前記チャンバー以外の前記液体流路から前記第１水溶液を洗い流し、前記第１水溶液で満たされた前記チャンバーの開口部に第１脂質単層膜を形成するステップと、
    　前記液体流路に第２水溶液を導入し、前記疎水層の主面上に形成される前記有機溶媒の層の前記第２水溶液との界面に第２脂質単層膜を形成するステップと、
    　前記チャンバー内の前記第１水溶液を、前記第１脂質単層膜で覆われた球状の液滴へと形状変化させるステップと、
    　前記第１脂質単層膜で覆われた液滴に物理的作用を与えることにより前記第２脂質単層膜の位置まで移動させ、前記液滴を覆う第１脂質単層膜と前記第２脂質単層膜とをジッピングさせ、脂質膜小胞を形成するステップと、
    を備えた脂質膜小胞の形成方法。
  2. 　前記物理的作用は、振動、熱、電気、光のいずれかである
    請求項１に記載の脂質膜小胞の形成方法。
  3. 　基板と、前記基板上に設けられた疎水性物質からなる層であって、複数のチャンバーの開口部が該層の主面上に規則的に配列するように形成されている、疎水層と、を備えたマイクロリアクタチップの、前記疎水層の主面に面する液体流路に第１水溶液を導入し、前記チャンバーを前記第１水溶液で満たすステップと、
    　前記液体流路に脂質を含有する有機溶媒を導入し、前記チャンバー以外の前記液体流路から前記第１水溶液を洗い流し、前記第１水溶液で満たされた前記チャンバーの開口部に第１脂質単層膜を形成するステップと、
    　前記液体流路に第２水溶液を導入し、前記疎水層の主面上に形成される前記有機溶媒の層の前記第２水溶液との界面に第２脂質単層膜を形成するステップと、
    　前記チャンバー内の前記第１水溶液を、前記第１脂質単層膜で覆われた球状の液滴へと形状変化させるステップと、
    　前記有機溶媒を前記第２水溶液へと溶解させることにより前記第２脂質単層膜を前記液滴の位置まで移動させ、前記液滴を覆う第１脂質単層膜と前記第２脂質単層膜とをジッピングさせ、脂質膜小胞を形成するステップと、
    を備えた脂質膜小胞の形成方法。
  4. 　各チャンバーの容量は、４０００×１０－１８ｍ３以下である、
    請求項１～３のいずれかに記載の脂質膜小胞の形成方法。
  5. 　前記脂質膜小胞の大きさは、前記チャンバーの容量に対応している
    請求項１～４のいずれかに記載の脂質膜小胞の形成方法。
  6. 　前記脂質膜小胞の直径は、５μｍ以下である
    請求項１～５のいずれかに記載の脂質膜小胞の形成方法。
  7. 　基板と、
    　前記基板上に設けられた疎水性物質からなる層であって、複数のチャンバーの開口部が該層の主面上に規則的に配列するように形成されている、疎水層と、
    を備え、
    　前記疎水層の主面上に設けられた有機溶媒の層の前記疎水層とは逆側の界面には、複数の脂質膜小胞が形成されている
    マクロリアクタチップ。
  8. 　基板と、
    　前記基板上に設けられた疎水性物質からなる層であって、複数のチャンバーの開口部が該層の主面上に規則的に配列するように形成されている、疎水層と、
    を備え、
    　各チャンバー内には、脂質膜小胞が１つずつ形成されている
    マイクロリアクタチップ。
  9. 　各チャンバーの容量は、４０００×１０－１８ｍ３以下である、
    請求項７または８に記載のマイクロリアクタチップ。
  10. 　前記脂質膜小胞の大きさは、前記チャンバーの容量に対応している
    請求項７～９のいずれかに記載のマイクロリアクタチップ。
  11. 　前記脂質膜小胞の直径は、５μｍ以下である
    請求項７～１０のいずれかに記載のマイクロリアクタチップ。
  12. 　基板と、前記基板上に設けられた疎水性物質からなる層であって、複数のチャンバーの開口部が該層の主面上に規則的に配列するように形成されている、疎水層と、を備えたマイクロリアクタチップの、前記疎水層の主面に面する液体流路に薬剤を含む第１水溶液を導入し、前記チャンバーを前記第１水溶液で満たすステップと、
    　前記液体流路に脂質を含有する有機溶媒を導入し、前記チャンバー以外の前記液体流路から前記第１水溶液を洗い流し、前記第１水溶液で満たされた前記チャンバーの開口部に第１脂質単層膜を形成するステップと、
    　前記液体流路に第２水溶液を導入し、前記疎水層の主面上に形成される前記有機溶媒の層の上面に第２脂質単層膜を形成するステップと、
    　前記チャンバー内の前記第１水溶液を、前記第１脂質単層膜で覆われた球状の液滴へと形状変化させるステップと、
    　前記マイクロリアクタチップに物理的作用を与えることにより前記第１脂質単層膜で覆われた液滴を前記第２脂質単層膜の位置まで移動させ、前記液滴を覆う第１脂質単層膜と前記第２脂質単層膜とをジッピングさせ、脂質膜小胞を形成するステップと、
    を備えた細胞膜小胞の内包物の組み込み方法。
  13. 　基板と、前記基板上に設けられた疎水性物質からなる層であって、複数のチャンバーの開口部が該層の主面上に規則的に配列するように形成されている、疎水層と、を備えたマイクロリアクタチップの、前記疎水層の主面に面する液体流路に薬剤を含む第１水溶液を導入し、前記チャンバーを前記第１水溶液で満たすステップと、
    　前記液体流路に脂質を含有する有機溶媒を導入し、前記チャンバー以外の前記液体流路から前記第１水溶液を洗い流し、前記第１水溶液で満たされた前記チャンバーの開口部に第１脂質単層膜を形成するステップと、
    　前記液体流路に第２水溶液を導入し、前記疎水層の主面上に形成される前記有機溶媒の層の上面に第２脂質単層膜を形成するステップと、
    　前記チャンバー内の前記第１水溶液を、前記第１脂質単層膜で覆われた球状の液滴へと形状変化させるステップと、
    　前記有機溶媒を前記第２水溶液へと溶解させることにより前記第２脂質単層膜を前記液滴の位置まで移動させ、前記液滴を覆う第１脂質単層膜と前記第２脂質単層膜とをジッピングさせ、脂質膜小胞を形成するステップと、
    を備えた脂質膜小胞の内包物の組み込み方法。
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