[go: up one dir, main page]

WO2019004347A1 - 歯周炎の判定方法及びバイオマーカー - Google Patents

歯周炎の判定方法及びバイオマーカー Download PDF

Info

Publication number
WO2019004347A1
WO2019004347A1 PCT/JP2018/024551 JP2018024551W WO2019004347A1 WO 2019004347 A1 WO2019004347 A1 WO 2019004347A1 JP 2018024551 W JP2018024551 W JP 2018024551W WO 2019004347 A1 WO2019004347 A1 WO 2019004347A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
bacteria
abundance ratio
periodontitis
marker
risk
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2018/024551
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
丸山　真達
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lion Corp
Original Assignee
Lion Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lion Corp filed Critical Lion Corp
Publication of WO2019004347A1 publication Critical patent/WO2019004347A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Definitions

  • the present invention relates to a method and biomarker for determining the morbidity or risk of periodontitis.
  • Periodontal disease is roughly classified into gingivitis in which inflammation is localized to the gums (gum) and periodontitis in which inflammation progresses from gum to alveolar bone to form a periodontal pocket.
  • Periodontal disease is generally referred to as lifestyle-related disease, and more than half of adults are referred to as periodontitis. Since periodontal disease is a disease with few subjective symptoms, it is a disease which is often left without receiving appropriate treatment and is progressing without being recognized as periodontal disease. Therefore, it is important to check the condition of gum regularly and to take appropriate measures in case of periodontal disease.
  • Probing using a dental probe is common as a test for periodontal disease.
  • Probing is a method of examining the condition of gum by measuring the presence or absence of bleeding from gum and the depth of periodontal pocket by a probe.
  • probing by probing involves psychological anxiety because the thin tip of the tip is inserted between the gums and the teeth.
  • examination by probing is essential for examination by a dentist or a dental hygienist, and since it takes time for examination, it is unsuitable for screening of a patient suffering from periodontal disease by mass examination. Therefore, a method that can easily evaluate the condition of the gum is desired.
  • saliva can be collected easily without being invasive to the collection. Therefore, it is noted that saliva can be used as a method for measuring pathogen ratio in blood, occult blood, biomarkers such as cytokines and alkaline phosphatase, and the like.
  • Patent Document 1 discloses a method of simultaneously measuring the risk of periodontal disease and the risk of dental caries.
  • Periodontal disease is a multimicrobial infection, and the presence of pathogens does not necessarily lead to the onset of periodontal disease. Therefore, it is considered that it is insufficient to estimate the condition of the gum by measuring the pathogen ratio alone.
  • biomarkers and the like largely reflect factors other than periodontal disease such as food and stomatitis.
  • An object of the present invention is to provide a method which can be used for mass screening and can easily determine the morbidity or risk of periodontitis.
  • a method for measuring the abundance ratio or amount of marker bacteria to total bacteria in a biological sample collected from a subject, in order to determine the morbidity or risk of periodontitis, the marker bacteria comprising A method which is at least one selected from the group consisting of a bacillus bacterium, an orybacterium bacterium, an actinobacillus bacterium, a lautropia bacterium, a philifactor bacterium, an SR1 bacterium, and a synergistes bacterium.
  • the number of said Arthrobacter bacteria, said Lautropia bacteria, or said SR1 microbes is less than the abundance ratio or amount of marker bacteria to total bacteria in a biological sample collected from a healthy subject, or The method according to the above-mentioned [1], wherein it is determined that periodontitis is afflicted or the risk thereof is high when there is a large amount of Orybacterium bacteria, Actinobacillus bacteria, Filifactor bacteria, or Synergystes bacteria.
  • the marker bacteria is at least one selected from the group consisting of Arthrobacter bacteria, Orybacterium bacteria, Actinobacillus bacteria, and Lauropia bacteria. Method described.
  • Condition (1) the abundance ratio of the Arthrobacter bacteria is 0.03% or less, the abundance ratio of the Orybacterium bacteria is 0.15% or greater, and the abundance ratio of the Actinobacillus bacteria is 0.1%
  • the abundance ratio of the lautropia bacteria is 1% or less
  • the abundance ratio of the filifactor bacteria is 0.03% or more
  • the abundance ratio of the SR1 phylum bacteria is 0.15% or less
  • the presence of the cynergistes bacteria At least one with a ratio of 0.03% or more.
  • a method of measuring the abundance ratio or amount of marker bacteria to total bacteria in a biological sample collected from a subject to determine the morbidity or risk of periodontitis said marker bacteria comprising Bacteria of the genus Bacteria, bacteria of the genus Orybacterium, bacteria of the genus Actinobacillus, bacteria of the genus Laurotropia, bacteria of the genus Filifactor, bacteria of the genus Sylphistia, bacteria of the genus Synergystes, bacteria of the genus Mycoplasma, bacteria of the genus Capnocytophaga, bacteria of the genus Treponema, and Eikenella A method which is a combination of two or more selected from the group consisting of genus bacteria.
  • the abundance ratio of the lautropia bacteria is 1% or less
  • the abundance ratio of the filifactor bacteria is 0.03% or more
  • the abundance ratio of the SR1 phylum bacteria is 0.15% or less
  • the abundance ratio of the Mycoplasma genus bacteria is 0.03% or more
  • the abundance ratio of the Capnocytophaga bacteria is 0.7% or less
  • the abundance ratio of the Treponema bacteria is 0.03 % Or more, and at least two of which the abundance ratio of the Eikenella bacteria is 0.03% or more.
  • a biomarker for determining periodontal disease in a subject or risk thereof which is Arthrobacter bacteria, Orybacterium bacteria, Actinobacillus bacteria, Lautropia bacteria, Filifactor bacteria, SR1 bacteria And a biomarker comprising at least one marker bacterium selected from the group consisting of Synergysis bacteria, or a component derived from the marker bacterium.
  • a biomarker for determining periodontal disease in a subject or risk thereof which is Arthrobacter bacteria, Orybacterium bacteria, Actinobacillus bacteria, Lautropia bacteria, Filifactor bacteria, SR1 bacteria
  • a marker bacterium which is a combination of two or more selected from the group consisting of Synergystes spp., Mycoplasma spp., Capnocytophaga spp., Treponema spp. Bacteria, and Eikenera spp. Containing biomarkers.
  • biomarker according to any one of the above [12] to [14], wherein the subject is a subject having periodontitis or a risk of developing thereof.
  • Arthrobacter bacteria Arthrobacter bacteria, Orybacterium bacteria, Actinobacillus bacteria, Lautropia bacteria, Filaufactor bacteria, SR1 spp.
  • Bacteria which are biomarkers for determining the risk of periodontitis in a subject or the risk thereof And one or more selected from the group consisting of a primer pair, a probe, and a microarray on which the probe is immobilized, which is capable of detecting the 16S rRNA gene of at least one marker bacterium selected from the group consisting of Detection kit.
  • Bacteria which are biomarkers for determining the periodontal disease of a subject or the risk thereof
  • Two or more primer pairs capable of detecting the 16S rRNA gene of two or more marker bacteria selected from the group consisting of Synergistes bacteria, Mycoplasma bacteria, Capnocytophaga bacteria, Treponema bacteria, and Eikenella bacteria
  • a detection kit comprising one or more selected from the group consisting of: a probe; and a microarray on which the probe is immobilized.
  • the "sensitivity” refers to a ratio in which a patient with periodontitis determined by dentist diagnosis is determined to be periodontitis.
  • specificity refers to the proportion of patients with non-periodontitis determined by dentist diagnosis as non-periodontitis.
  • the “bacterial abundance ratio” refers to the abundance ratio (number basis number / number) of bacteria to be evaluated relative to all bacteria contained in a biological sample.
  • the method of the present invention is a method of measuring the abundance ratio or amount of marker bacteria in a biological sample collected from a subject for determination of periodontal disease or risk thereof.
  • the method of the present invention also measures the abundance ratio or amount of marker bacteria to total bacteria in a biological sample collected from a subject, and the ratio or amount of marker bacteria to total bacteria in a biological sample collected from a healthy subject It is also a method of determining the morbidity or risk of periodontitis in comparison with The method of the present invention can be used as a method for determining the morbidity or risk of periodontitis performed by a dentist or dental hygienist prior to examination by probing using a dental probe.
  • the time required for screening of periodontitis patients in mass screening is performed by a dentist and a dental hygienist performing examination by probing afterward for subjects determined to have periodontitis It can be shortened.
  • psychological anxiety can be alleviated.
  • Periodontitis is an active periodontitis (hereinafter also referred to as “active periodontitis”) which causes bleeding in an examination of probing while inflammation is in progress, and a periodontitis which does not cause bleeding (hereinafter referred to as “active periodontitis” , "Periodontitis not active period”.
  • active periodontitis a periodontitis which does not cause bleeding
  • Periodontitis not active period The method of the present invention can determine whether or not it is applicable to periodontitis in any state. However, from the viewpoint of early detection of periodontitis and appropriate treatment, it is preferable to be able to determine periodontitis in the active period with high sensitivity.
  • the subject is not gender-distinct and may be either a minor or an adult. However, it is preferable to be an adult who is likely to progress to periodontitis. In the present specification, an adult is usually a person of 20 years or more and a minor is a person of usually less than 20 years of age.
  • the biological sample is preferably a sample collected from the oral cavity, more preferably saliva, plaque, tartar, tongue or gum exudate, and even more preferably saliva.
  • the saliva includes non-stimulatory saliva and stimulating saliva, either of which may be used. However, non-stimulating saliva is preferred in view of performing a mass examination.
  • non-stimulated saliva for example, there is a method of collecting saliva as it is, a method of containing distilled water or the like in the mouth, lightly rinsing, and collecting it as a discharge liquid containing saliva.
  • a method of collecting stimulated saliva for example, there is a method of promoting secretion of saliva by collecting paraffin gum or the like to collect it. After taking a biological sample, if it is not used immediately for analysis, it needs to be stored at low temperature (eg, ice temperature). If left at room temperature, bacteria grow and it becomes impossible to analyze the proportion and amount of bacteria correctly.
  • the abundance ratio or amount of marker bacteria to total bacteria in a biological sample can be relatively determined using the abundance ratio or amount of components specific to each bacterium.
  • the specific component is not particularly limited, and examples thereof include genes, proteins and peptides, with genes being preferred.
  • Examples of the gene include DNA and RNA, DNA is preferable, and ribosomal RNA (rRNA) gene is more preferable.
  • rRNA 16SrRNA, 5SrRNA, 26SrRNA is mentioned, for example.
  • rRNA is a small subunit of ribosome, this ribosome is a vital organ for protein synthesis, so it is resistant to evolutionary mutation and has a gene sequence common to all bacteria.
  • rRNA also contains a sequence more specific to bacteria, not only the total number of bacteria but also bacteria-specific quantification and identification of bacterial species can be performed by using the 16S rRNA gene. Sequence information of the 16S rRNA gene of each marker bacterium can be obtained from public databases such as DDBJ, NCBI, and Ribosomal Database Project.
  • the number of marker bacteria in the biological sample and the number of total bacteria is more specific than 16 S rRNA genes Measurement by quantitative PCR of a region (target region) including a dynamic region (V1 to V9 region, preferably V1 or V2 region), or using a gene amplification product of the target region (preferably V1 or V2 region), There are a method of analyzing and measuring by a microarray and a next-generation sequencer, and a method of hybridizing a probe to 16S rRNA specific to each marker bacteria and measuring the amount thereof.
  • any primer designed from a conserved region of 16S rRNA for example, a primer set comprising a combination of a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 1 and a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 2
  • a method of analyzing and measuring a gene amplification product of a region including a target region (for example, V1, V2 region) with a next-generation sequencer is preferable.
  • the method of extracting DNA is not particularly limited, and may be a chemical or biochemical lysis method or a method of physically disrupting the cell wall, or a combination thereof.
  • saliva is collected as a spouted liquid which has been rinsed for about 10 seconds with 3 mL of distilled water.
  • the collected saliva is immediately ice-cooled.
  • bacteria contained in saliva are centrifuged at 10000 G for 10 minutes and collected as a centrifugal sedimentation.
  • Bacterial DNA is extracted from the collected bacteria using a DNA extraction kit (next tec 1- Step DNA Isolation Kit for Bacteria, manufactured by Toho).
  • the collected DNA is stored at -80.degree. C. as required.
  • the sequence of the amplified gene was analyzed targeting the V1 to V2 regions of the 16S ribosomal RNA gene of the extracted bacterial DNA using the GS junior bench top system (manufactured by Roche Life Science), and 3000 bacterial DNA Sequences can be analyzed to identify the type of bacteria and to determine their abundance.
  • marker bacteria that can be used as biomarkers of periodontitis are Arthrobacter bacteria, Orybacterium bacteria, Actinobacillus bacteria, Lautropia bacteria, Filifactor bacteria, SR1 spp. Bacteria, and Synergistes bacteria And at least one selected from the group consisting of The method of the present invention measures the abundance ratio or amount of marker bacteria to total bacteria in a biological sample collected from a subject, and compares it to the abundance ratio or amount of marker bacteria to total bacteria in a biological sample collected from a healthy subject.
  • the method of the present invention can be used as a method for determining periodontal disease or the risk thereof, it is preferable to reduce oversight of a subject who suffers from periodontitis. Therefore, at least one marker selected from the group consisting of Arthrobacter bacteria, Orybacterium bacteria, Actinobacillus bacteria, and Lautropia bacteria, whose sensitivity values are found to be high in Examples described later, is a marker. It is preferable to use as bacteria.
  • the above marker bacteria are used as a biomarker for periodontitis, for example, it can be determined that periodontal inflammation or risk thereof is high as follows. First, the abundance ratio of marker bacteria to all bacteria (individuals / individual, the same applies hereinafter) is measured. Next, the threshold value set for each marker bacterium is compared with the measured ratio of marker bacteria. Then, when the measured presence ratio of marker bacteria satisfies the condition below or above the threshold value set for each marker bacteria, it is determined as “positive”. Finally, depending on the number of marker bacteria that became positive, it can be determined that the morbidity or risk of periodontitis is high. In addition, the number of marker bacteria which corresponded to positive can be arbitrarily changed according to sensitivity or specificity.
  • the threshold value of the abundance ratio of marker bacteria set for each marker bacterium is, for example, the presence of marker bacteria of a healthy person who has been measured in advance (for example, a person who has been previously confirmed to be a non- periodontitis patient) It can be specified by ratio or amount (normal control). More specifically, examples of the range of the threshold include the following condition (1A).
  • the threshold value is set in the following range; the abundance ratio of Arthrobacter bacteria is 0.01 to 0.1%, the abundance ratio of Orybacterium bacteria is 0.1 to 0.2%, The abundance ratio of Actinobacillus bacteria is 0.05 to 0.3%, the abundance ratio of Lautropia bacteria is 0.5 to 1.7%, and the abundance ratio of Filifactor bacteria is 0.01 to 0.1%, The abundance ratio of SR1 Phyllobacteria is 0.1 to 0.25%, and the abundance ratio of Synergistes bacteria is 0.01 to 0.1%. If the range of the threshold is outside the range of the condition (1A), the sensitivity and specificity may be lowered, which may affect the reliability of the test.
  • the marker bacteria for the bacteria of the genus Orybacterium, Actinobacillus, Filifactor, and Synergystes, the case of the presence ratio of the threshold or more is judged as “positive”, and the Arthrobacter bacteria, Lautropia are determined.
  • the case of the abundance ratio below the threshold value is determined as "positive”.
  • the control may be a periodontit instead of a healthy person (periodontic control). In that case, positive and negative criteria will be exchanged.
  • the abundance ratio of Arthrobacter bacteria is 0.03% or less
  • the abundance ratio of Orybacterium bacteria is 0.15% or more
  • the abundance ratio of Lauropia bacteria is 1.0% or less
  • the abundance ratio of Filifactor bacteria is 0.03% or more
  • the abundance ratio of SR1 Phyllobacteria is 0.15% or less
  • Synergistes The presence ratio of is 0.03% or more.
  • the number of marker bacteria corresponding to positive may be at least one, and when two or more, three or more, four or more, etc., it may be set to determine periodontitis.
  • the method of the present invention can be used as a method for determining the morbidity or risk of periodontitis, it is preferable to reduce the oversight of a subject who suffers from periodontitis. Therefore, it is preferable to set the number of marker bacteria corresponding to positive so that the sensitivity value can be increased.
  • marker bacteria that can be used as biomarkers of periodontitis are Arthrobacter bacteria, Orybacterium bacteria, Actinobacillus bacteria, Lauropia bacteria, Filifactor bacteria, SR1 bacteria, Synergystes sp. It is a combination of two or more selected from the group consisting of bacteria, Mycoplasma bacteria, Capnocytophaga bacteria, Treponema bacteria, and Eikenella bacteria.
  • the method of the present invention measures the abundance ratio or amount of marker bacteria to total bacteria in a biological sample collected from a subject, and compares it to the abundance ratio or amount of marker bacteria to total bacteria in a biological sample collected from a healthy subject.
  • the marker bacteria of the other example above are used as a biomarker for periodontitis, for example, it can be determined that periodontal inflammation or risk thereof is high as follows. First, the abundance ratio of marker bacteria to total bacteria is measured. Next, the threshold value set for each marker bacterium is compared with the measured ratio of marker bacteria. Then, when the measured presence ratio of marker bacteria satisfies the condition below or above the threshold value set for each marker bacteria, it is determined as “positive”. Finally, depending on the number of marker bacteria that became positive, it can be determined that the morbidity or risk of periodontitis is high. In addition, the number of marker bacteria which corresponded to positive can be arbitrarily changed according to sensitivity or specificity.
  • the threshold value set for each marker bacterium is, for example, the abundance ratio or amount of marker bacteria of a healthy person (for example, a person who has previously been confirmed to be a non- periodontitis patient) who has been measured in advance Control). More specifically, the range of the threshold includes, for example, the following condition (2A).
  • the threshold value is set in the following range; the abundance ratio of Arthrobacter bacteria is 0.01 to 0.1%, the abundance ratio of Orybacterium bacteria is 0.1 to 0.2%, The abundance ratio of Actinobacillus bacteria is 0.05 to 0.3%, the abundance ratio of Lautropia bacteria is 0.5 to 1.7%, and the abundance ratio of Filifactor bacteria is 0.01 to 0.1%, The abundance ratio of SR1 Phyllobacteria is 0.1 to 0.25%, the abundance ratio of Synergistes bacteria is 0.01 to 0.1%, the abundance ratio of Mycoplasma bacteria is 0.01 to 0.1%, Capno The abundance ratio of Cytophaga genus bacteria is 0.5 to 1.0%, the abundance ratio of Treponema bacteria is 0.01 to 0.1%, and the abundance ratio of Aikenera bacteria is 0.01 to 0.1% .
  • the range of the threshold is out of the range of the condition (2A)
  • the sensitivity and specificity may be low, which may affect the reliability of the test.
  • the above marker bacteria for the case of Orybacterium bacteria, Actinobacillus bacteria, Filifactor bacteria, Synergystes bacteria, Mycoplasma bacteria, Treponema bacteria, Eikenera bacteria, the case where the abundance ratio is higher than the threshold value is “positive In the case of Arthrobacter bacteria, Lautropia bacteria, SR1 bacteria, and Capnocytophaga bacteria, the case where the abundance ratio is lower than or equal to the threshold value is determined as “positive”.
  • the control may be a subject with periodontitis instead of a healthy subject (a control with periodontitis). In that case, positive and negative criteria will be exchanged.
  • the abundance ratio of Arthrobacter bacteria is 0.03% or less
  • the abundance ratio of Orybacterium bacteria is 0.15% or more
  • the abundance ratio of Lauropia bacteria is 1.0% or less
  • the abundance ratio of Filifactor bacteria is 0.03% or more
  • the abundance ratio of SR1 Phyllobacteria is 0.15% or less
  • the abundance ratio of Eikenella bacteria is 0.03% or more.
  • the number of marker bacteria corresponding to positive may be at least two, and when three or more, four or more, five or more, etc., it may be set to determine periodontitis.
  • the method of the present invention can be used as a method for determining the morbidity or risk of periodontitis, it is preferable to reduce the oversight of a subject who suffers from periodontitis. Therefore, it is preferable to set the number of marker bacteria corresponding to positive so that the sensitivity value can be increased. From the results of the examples described later, when increasing the numerical value of the sensitivity, for example, a setting in which it is determined that periodontitis can be mentioned when satisfying the following settings (1) to (5).
  • Setting (1) A combination of bacteria selected from the group consisting of Arthrobacter bacteria, Orybacterium bacteria, Actinobacillus bacteria, and Lautropia bacteria, and the number of marker bacteria that are positive is two. that's all.
  • Setting (2) A combination of bacteria selected from the group consisting of Arthrobacter bacteria, Orybacterium bacteria, Actinobacillus bacteria, Lautropia bacteria, Filifactor bacteria, Synergystes bacteria, and Mycoplasma bacteria There are three or more marker bacteria that are positive.
  • Setting (3) Arthrobacter bacteria, Orybacterium bacteria, Actinobacillus bacteria, Lautropia bacteria, Filifactor bacteria, SR1 bacteria, Synergystes bacteria, Mycoplasma bacteria, Capnocytophaga bacteria Or a combination of bacteria selected from the group consisting of Treponema bacteria and Eikenella bacteria, wherein the number of positively-marking marker bacteria is 5 or more.
  • Setting (4) A combination of bacteria selected from the group consisting of Orybacterium bacteria, Actinobacillus bacteria, Lauropia bacteria, Synergystes bacteria, and Mycoplasma bacteria, and the number of marker bacteria that are positively positive is 2 or more.
  • Orybacterium bacteria Actinobacillus bacteria, Lauropia bacteria, Filifactor bacteria, SR1 bacteria, Synergystes bacteria, Mycoplasma bacteria, Capnocytophaga bacteria, Treponema bacteria, and It is a combination of bacteria selected from the group consisting of Eikenella bacteria, and the number of marker bacteria corresponding to positive is five or more.
  • the biomarker of the present invention is a marker bacterium or a component derived therefrom, which is used to determine the periodontal disease or the risk of the subject. By measuring the abundance ratio or amount of the biomarker of the present invention in a biological sample collected from a subject, it is possible to determine the subject's gingivitis or its risk. [1. Methods] are preferably used. For example, DNA specific to each bacterium is extracted, and rRNA gene is analyzed, and artificial manipulation is added to measure the identification of bacteria and the abundance ratio or amount of bacteria in a biological sample.
  • the biomarker of the present invention may be used as an indicator for determining periodontitis using the measurement results as compared to the abundance ratio or amount of marker bacteria to total bacteria in a biological sample collected from a healthy subject Is found.
  • the subject may also be a subject who is at risk for periodontitis or its development.
  • One embodiment of the biomarker is at least selected from the group consisting of Arthrobacter bacteria, Orybacterium bacteria, Actinobacillus bacteria, Lautropia bacteria, Filifactor bacteria, SR1 bacteria, and Synergistes bacteria It contains one marker bacterium or a component derived therefrom.
  • Other embodiments of the biomarker include Arthrobacter bacteria, Orybacterium bacteria, Actinobacillus bacteria, Lautropia bacteria, Filifactor bacteria, SR1 bacteria, Synergystes bacteria, Mycoplasma bacteria, Capnocytes
  • a marker bacterium which is a combination of two or more selected from the group consisting of Ferga bacteria, Treponema bacteria, and Eikenera bacteria, or a component derived therefrom. The details of each bacterium are described below.
  • Arthrobacter bacteria examples of the bacteria species of Arthrobacter bacteria include Arthrobacter davidaneri, Arthrobacter spy, Arthrobacter ureafaciens, and Arthrobacter citreus.
  • Orybacterium bacteria examples of species of Orybacterium bacteria include, for example, Orybacterium sinus.
  • Actinobacillus genus bacteria examples include Actinobacillus minar, Actinobacillus succinogenes, and Actinobacillus actinomycetemcommitans.
  • Lautropia bacteria examples include Lautropia mirabilis.
  • Filifactor bacteria examples of the species of Filifactor bacteria include, for example, Filifactor Alokis.
  • SR1 bacteria Bacterial species of SR1 open-loop bacteria are those which are not separately cultured but classified according to gene sequence, and examples thereof include SR1 DQ639513, SR1 AF125207.
  • Synergeria bacteria Bacterial species of Synergeria bacteria are classified in many geneous sequences, and examples thereof include Synergistes oral taxon 363 and Synergistes oral taxon 361.
  • Mycoplasma bacteria examples of bacterial species of Mycoplasma genus bacteria include Mycoplasma salicylarum, Mycoplasma lipophilium, and Mycoplasma genitalium.
  • Capnocytophaga bacteria examples of the species of Capnocytophaga spp. Include Capnocytophaga sputiga, Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga, Capnocytophaga ochracea.
  • Treponema bacteria examples include Treponema denticola, Treponema sokranski, Treponema pectininoram.
  • Eikenella bacteria examples of species of Eikenera bacteria include, for example, Eikenella collodes.
  • the component derived from the marker bacterium is a component specific to each marker bacterium, and may be a component capable of measuring the type, presence ratio, and amount of the marker bacterium from the amount thereof, for example, nucleic acid (eg, DNA or RNA), proteins, peptides, DNA is preferred, and ribosomal RNA (rRNA) gene is more preferred.
  • nucleic acid eg, DNA or RNA
  • proteins e.g., proteins, peptides, DNA
  • rRNA ribosomal RNA
  • rRNA ribosomal RNA
  • 16SrRNA, 5SrRNA, 26SrRNA etc. are mentioned, for example.
  • the 16S rRNA gene is preferable, at least one of the V1 to V9 regions of the 16S rRNA gene is more preferable, and either or both of the V1 and V2 regions are more preferable because analysis is easy.
  • a detection kit is a group consisting of a primer pair, a probe, and a microarray on which the probe is immobilized, which can detect 16S rRNA of each marker bacterium which is a biomarker for periodontal disease or risk determination. It is a kit or means containing one or more selected.
  • the primer pair may be at least one and is preferably designed from a conserved region of 16S rRNA of bacteria. The base length and the sequence may be appropriately determined according to the gene amplification method such as PCR used for detection.
  • the probe may be an oligonucleotide complementary to the base sequence of at least a part of the specific region (V1 to V9) of the 16S rRNA of each marker bacterium, and may be modified with a fluorescent substance or the like as necessary. .
  • the probes may be immobilized on a substrate (the material is not limited).
  • the detection kit may contain other reagents for use in detection of marker bacteria. For example, reagents (eg, DNA polymerase, enzymes such as restriction enzymes, fluorescent reagents, substrates such as dNTPs, coenzymes such as ATP), positive / negative control (eg, housekeeping gene) used according to amplification methods are mentioned.
  • reagents eg, DNA polymerase, enzymes such as restriction enzymes, fluorescent reagents, substrates such as dNTPs, coenzymes such as ATP
  • positive / negative control eg, housekeeping gene
  • composition ratio of bacteria was performed using "GS Junior bench top system” (manufactured by Roche Life Science). Analyze the sequence of the amplified gene targeting the V1 to V2 region of the 16S ribosomal RNA gene of the extracted bacterial DNA according to the manual of the instrument, analyze the sequence of 3000 bacterial DNA to identify the bacterial type, and its composition The ratio (%) was determined.
  • CCATCTCCATCCCTGCGTGTTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNNNANNGT TYGTGGTCTCAG (SEQ ID NO: 1) as a forward primer (wherein N means A, C, G or T, M means A or C) , R means G or A, Y means T or C), and CCTATCCCCTGTGTCCTTGGCAGTCTCAGTGCTGCCTCCCGTAGGAGT (SEQ ID NO: 2) was used as a reverse primer.
  • public databases CORE and RDP
  • the difference between the mean values of the component ratio between the two groups of periodontitis patients and non-periodontitis patients was tested for significant difference by Welch's t test. The results are shown in Table 2.
  • the composition ratio of bacteria between groups was compared and analyzed, and Mycoplasma bacteria, Oribacterium bacteria, Arthrobacter bacteria, Capnocytophaga bacteria, Actinobacillus bacteria, SR1 spp. Bacteria, Treponema, as bacteria which differ in the composition ratio of bacteria depending on the condition of gingiva.
  • the genus bacteria, the bacteria of the genus Filifactor, the bacteria of the genus Eikenella, the bacteria of the genus Synergistes, and the bacteria of the Lautropia genus (the bacteria having a p value of less than 0.1 in Table 2) were selected as biomarkers of periodontitis.
  • bacteria with a composition ratio of bacteria less than 0.01% were judged to be unreliable in data, and were not included in the analysis.
  • non periodontitis For Oribacterium bacteria and Actinobacillus bacteria, a case where the component ratio was equal to or higher than the threshold was determined as “periodontitis”, and a case smaller than the threshold was determined as “non-periodontitis”.
  • the sensitivity and specificity of the evaluation of the condition of gingiva estimated from the bacterial composition ratio of each bacterium become values shown in Table 3, and the condition of gingiva can be estimated, and Arthrobacter bacteria, Oribacterium bacteria, Actinobacillus bacteria, Lautropia bacteria. Bacteria have been found to be useful as biomarkers of periodontitis.
  • the sensitivity and specificity are indexes indicating how accurate the test is.
  • the sensitivity is an index for determining periodontitis patients as periodontitis, and is the ratio of the number of people who are determined to have periodontitis among the periodontitis patients diagnosed with periodontitis by the dentist.
  • the specificity is an index for determining non-periodontitis patients as non-periodontitis, and is the ratio of the number of persons who are determined as non-periodontitis among the subjects diagnosed by the dentist as non-periodontitis.
  • the purpose of determining periodontitis is to know the condition of the gum and keep the gum healthy.
  • Arthrobacter bacteria and Lautropia bacteria are preferable as bacteria targeted for biomarkers, and Arthrobacter bacteria having high specificity may be more preferable.
  • Periodontitis is roughly classified into active periodontitis which causes bleeding from gums due to ongoing inflammation and probing, and resting periodontitis which does not cause bleeding. As the examination of the condition of the gums, it is more preferable to detect periodontitis early and to take appropriate measures, so it is more preferable to be able to detect periodontitis in the active stage with high sensitivity. Therefore, the above-mentioned 57 subjects are a group of 19 and 38 others (non-active periodontitis; resting periodontitis + non-periodontitis) diagnosed with active periodontitis by the dentist. The data on bacterial composition ratio were used to evaluate the periodontitis in the active period as well. The results are shown in Table 4.
  • the threshold value of the bacterial component ratio of each bacterium is set to the value shown in Table 4, and for Arthrobacter bacteria, Lautropia bacteria, and SR1 genus bacteria, "active periodontitis" when the component ratio is less than or equal to the threshold. It was determined that the value was larger than the threshold value as “non-active periodontitis”. For other bacteria, the case where the composition ratio was equal to or higher than the threshold was determined as “active periodontitis”, and the case where the composition ratio was smaller than the threshold was determined as "nonactive periodontitis”.
  • the threshold value of the bacterial composition ratio of each bacterium is 0.03% for Arthrobacter bacteria, 0.15% for Oribacterium bacteria, 0.1% for Actinobacillus bacteria, 0.03% for Mycoplasma bacteria, and Treponema gene.
  • the bacteria were set at 0.03%, the Synergistes bacteria at 0.03%, the Eikenella bacteria at 0.03%, and the Filifactor bacteria at 0.03%.
  • the bacteria composition ratio of each bacterium is 0.03% for Arthrobacter bacteria, 0.15% for Oribacterium bacteria, 0.1% for Actinobacillus bacteria, and 1% or less for Lautropia bacteria. 0.03% Filifactor bacteria, 0.15% SR1 sp.
  • Bacteria, 0.03% Synergistes bacteria, 0.03% Mycoplasma bacteria, 0.7% Capnocytophaga bacteria, 0% Treponema bacteria .03% and Eikenella genus bacteria were set as 0.03%.
  • Arthrobacter bacteria, Lautropia bacteria, SR1 bacteria, and Capnocytophaga bacteria when the bacterial composition ratio is below the threshold value, it is judged as "periodontitis", and when it is larger than the threshold value, it is "non-periodontitis” It was judged.
  • the bacterial component ratio was equal to or higher than the threshold, it was determined as “periodontitis”, and when smaller than the threshold, it was determined as "non-periodontitis”.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

集団検診に利用でき、歯周炎の罹患又はそのリスクを簡易に判定し得る方法を提供することを課題とし、歯周炎の罹患又はそのリスクを判定するために、被験者から採取した生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量を測定する方法であって、マーカー細菌が、アルスロバクター属細菌、オリバクテリウム属細菌、アクチノバチルス属細菌、ラウトロピア属細菌、フィリファクター属細菌、ＳＲ１門細菌、及びシネルギステス属細菌からなる群から選択される少なくとも１種である方法である。

Description

歯周炎の判定方法及びバイオマーカー
　本発明は、歯周炎の罹患又はそのリスクの判定方法及びバイオマーカーに関する。
　歯周病は、歯肉（歯茎）に炎症が限局している歯肉炎と、炎症が歯肉から歯槽骨へと進展して歯周ポケットを形成している歯周炎と、に大別される。歯周病は、一般に、生活習慣病とも言われ、成人の半数以上が歯周炎といわれている。歯周病は、自覚症状の少ない疾患なので、適切な処理を受けることなく放置され、歯周病と認識せずに進行していることが多い疾患である。そのため、定期的に歯肉の状態を検査し、歯周病の場合は適切な処置を行うことが重要である。
　歯周病の検査として、歯科用プローブを用いたプロービングが一般的である。プロービングは、プローブにより、歯肉からの出血の有無や歯周ポケットの深さを測定して、歯肉の状態を検査する方法である。しかしながら、プロービングによる検査は、歯肉の痛みを伴うことに加えて、先端の細いプローブを歯肉と歯の間に挿入するため、心理的な不安を伴う。また、プロービングによる検査は、歯科医師や歯科衛生士が検査することが必須であり、検査に所要の時間を必要とするので集団検診による歯周病罹患者のスクリーニングに不向きである。そこで、簡易に歯肉の状態を評価できる方法が望まれている。
　ところで、唾液は、その採取に侵襲性を伴わず、簡易に採取できる。そのため、唾液は、唾液中の病原菌比率や潜血、サイトカインやアルカリホスファターゼ等の生体マーカー等を測定する方法に利用できるとして注目されている。例えば、特許文献１では、歯周病になるリスクと齲蝕になるリスクを同時に測定する方法が開示されている。
特開２０１７－２３０９３号公報
　歯周病は、複数菌感染症であり、病原菌の存在が確実に歯周病の発症に至るわけではない。そのため、病原菌比率の測定だけで歯肉の状態を推定するのは不十分であると考えられている。
　また、生体マーカー等は、食事や口内炎等の歯周病以外の要因も大きく反映されるという課題がある。
　本発明の課題は、集団検診に利用でき、歯周炎の罹患又はそのリスクを簡易に判定し得る方法を提供することである。
　本発明者らは、上記課題について鋭意検討した結果、生体試料中に含まれる所定の細菌の存在比率又は量を測定することにより、上記の課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明者は、下記の〔１〕～〔１７〕を提供する。
〔１〕歯周炎の罹患又はそのリスクを判定するために、被験者から採取した生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量を測定する方法であって、前記マーカー細菌が、アルスロバクター属細菌、オリバクテリウム属細菌、アクチノバチルス属細菌、ラウトロピア属細菌、フィリファクター属細菌、ＳＲ１門細菌、及びシネルギステス属細菌からなる群から選択される少なくとも１種である方法。
〔２〕健常者から採取した生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量と比較して、前記アルスロバクター属細菌、前記ラウトロピア属細菌、又は前記ＳＲ１門細菌が少ないか、或いは前記オリバクテリウム属細菌、前記アクチノバチルス属細菌、前記フィリファクター属細菌、又は前記シネルギステス属細菌が多いときに、歯周炎の罹患又はそのリスクが高いと判定する上記〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記マーカー細菌が、アルスロバクター属細菌、オリバクテリウム属細菌、アクチノバチルス属細菌、及びラウトロピア属細菌からなる群から選択される少なくとも１種である上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕下記条件（１）を満たすときに、歯周炎の罹患又はそのリスクが高いと判定する上記〔１〕～３のいずれかに記載の方法。
　条件（１）：前記アルスロバクター属細菌の存在比率が０．０３％以下、前記オリバクテリウム属細菌の存在比率が０．１５％以上、前記アクチノバチルス属細菌の存在比率が０．１％以上、前記ラウトロピア属細菌の存在比率が１％以下、前記フィリファクター属細菌の存在比率が０．０３％以上、前記ＳＲ１門細菌の存在比率が０．１５％以下、及び前記シネルギステス属細菌の存在比率が０．０３％以上の少なくとも１つ。
〔５〕活動期歯周炎の罹患又はそのリスクが高いと判定する上記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕歯周炎の罹患又はそのリスクを判定するために、被験者から採取した生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量を測定する方法であって、前記マーカー細菌が、アルスロバクター属細菌、オリバクテリウム属細菌、アクチノバチルス属細菌、ラウトロピア属細菌、フィリファクター属細菌、ＳＲ１門細菌、シネルギステス属細菌、マイコプラズマ属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、トレポネーマ属細菌、及びエイケネラ属細菌からなる群から選択される２種以上の組み合わせである方法。
〔７〕健常者から採取した生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量と比較して、前記アルスロバクター属細菌、前記ラウトロピア属細菌、前記ＳＲ１門細菌、又は前記カプノサイトファーガ属細菌が少ないか、或いは前記オリバクテリウム属細菌、前記アクチノバチルス属細菌、前記フィリファクター属細菌、前記シネルギステス属細菌、前記マイコプラズマ属細菌、前記トレポネーマ属細菌、又は前記エイケネラ属細菌が多いときに、歯周炎の罹患又はそのリスクが高いと判定する上記〔６〕に記載の方法。
〔８〕下記条件（２）を満たすときに、歯周炎の罹患又はそのリスクが高いと判定する上記〔６〕又は〔７〕に記載の方法。
　条件（２）：前記アルスロバクター属細菌の存在比率が０．０３％以下、前記オリバクテリウム属細菌の存在比率が０．１５％以上、前記アクチノバチルス属細菌の存在比率が０．１％以上、前記ラウトロピア属細菌の存在比率が１％以下、前記フィリファクター属細菌の存在比率が０．０３％以上、前記ＳＲ１門細菌の存在比率が０．１５％以下、前記シネルギステス属細菌の存在比率が０．０３％以上、前記マイコプラズマ属細菌の存在比率が０．０３％以上、前記カプノサイトファーガ属細菌の存在比率が０．７％以下、前記トレポネーマ属細菌の存在比率が０．０３％以上、及び前記エイケネラ属細菌の存在比率が０．０３％以上の少なくとも２つ。
〔９〕前記生体試料が、口腔内から採取した試料である上記〔１〕～〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕前記試料が、唾液、歯垢、歯石、舌苔又は歯肉滲出液である上記〔９〕に記載の方法。
〔１１〕被験者が、成年者である上記〔１〕～〔１０〕のいずれかに記載の方法。
〔１２〕被験者の歯周炎の罹患又はそのリスク判定用バイオマーカーであって、アルスロバクター属細菌、オリバクテリウム属細菌、アクチノバチルス属細菌、ラウトロピア属細菌、フィリファクター属細菌、ＳＲ１門細菌、及びシネルギステス属細菌からなる群から選択される少なくとも１種のマーカー細菌、又は該マーカー細菌の由来成分を含むバイオマーカー。
〔１３〕被験者の歯周炎の罹患又はそのリスク判定用バイオマーカーであって、アルスロバクター属細菌、オリバクテリウム属細菌、アクチノバチルス属細菌、ラウトロピア属細菌、フィリファクター属細菌、ＳＲ１門細菌、シネルギステス属細菌、マイコプラズマ属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、トレポネーマ属細菌、及びエイケネラ属細菌からなる群から選択される２種以上の組み合わせであるマーカー細菌、又は該マーカー細菌の由来成分を含むバイオマーカー。
〔１４〕被験者が、成年者である上記〔１２〕又は〔１３〕に記載のバイオマーカー。
〔１５〕前記被験者が、歯周炎又はその発症のリスクを有する被験者である上記〔１２〕～〔１４〕のいずれかに記載のバイオマーカー。
〔１６〕被験者の歯周炎の罹患又はそのリスク判定用バイオマーカーである、アルスロバクター属細菌、オリバクテリウム属細菌、アクチノバチルス属細菌、ラウトロピア属細菌、フィリファクター属細菌、ＳＲ１門細菌、及びシネルギステス属細菌からなる群から選択される少なくとも１種のマーカー細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出し得る、プライマーペア、プローブ、及び前記プローブが固定されているマイクロアレイからなる群より選ばれる１以上を含む、検出キット。
〔１７〕被験者の歯周炎の罹患又はそのリスク判定用バイオマーカーである、アルスロバクター属細菌、オリバクテリウム属細菌、アクチノバチルス属細菌、ラウトロピア属細菌、フィリファクター属細菌、ＳＲ１門細菌、シネルギステス属細菌、マイコプラズマ属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、トレポネーマ属細菌、及びエイケネラ属細菌からなる群から選択される２種以上のマーカー細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出し得る、２以上のプライマーペア、プローブ、及び前記プローブが固定されているマイクロアレイからなる群より選ばれる１以上を含む、検出キット。
　本発明によれば、集団検診に利用でき、歯周炎の罹患又はそのリスクを簡易に判定し得る方法を提供することができる。
　以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。
　本明細書中、「感度」とは、歯科医師診断による歯周炎患者を歯周炎と判定する割合をいう。また、「特異度」とは、歯科医師診断による非歯周炎患者を非歯周炎と判定する割合をいう。「細菌の存在比率」とは、生体試料中に含まれる全細菌に対する評価対象の細菌の存在比率（個数基準　個／個）をいう。
［１．方法］
　本発明の方法は、歯周炎の罹患又はそのリスクの判定のために、被験者から採取した生体試料中のマーカー細菌の存在比率又は量を測定する方法である。また、本発明の方法は、被験者から採取した生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量を測定して、健常者から採取した生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量と比較して、歯周炎の罹患又はそのリスクを判定する方法でもある。本発明の方法は、歯科医師や歯科衛生士が歯科用プローブを用いたプロービングによる検査に先だって行う、歯周炎の罹患又はそのリスクを判定する方法として利用し得る。本発明の方法により、歯周炎と判定された被験者を対象として、歯科医師や歯科衛生士が事後的にプロービングによる検査を行うことで、集団検診での歯周病患者のスクリーニングに要する時間を短くし得る。
　また、歯周炎ではないと判定された被験者については、歯科医師や歯科衛生士が事後的にプロービングによる検査を行わなくてもよいので、心理的な不安を緩和し得る。
　歯周炎は、炎症が進行中でプロービングの検査で出血を生じる活動期の歯周炎（以下、「活動期歯周炎」ともいう）と、出血を生じない休止期の歯周炎（以下、「活動期ではない歯周炎」ともいう。）に大別される。本発明の方法は、いずれの状態でも、歯周炎に該当するか否かを判定し得る。但し、歯周炎を早期に発見し、適切な処置をする観点から、活動期の歯周炎を感度良く判定できることが好ましい。
　また、被験者は、性別の区別はなく、未成年者と成年者のいずれであってもよい。但し、歯周炎に進行している可能性が高い成年者であることが好ましい。なお、本明細書中、成年者というときは、通常満２０歳以上の者であり、未成年者というときは、通常満２０歳未満の者である。
　生体試料は、口腔内から採取した試料であることが好ましく、唾液、歯垢、歯石、舌苔又は歯肉滲出液であることがより好ましく、唾液であることがさらに好ましい。唾液は、非刺激唾液と刺激唾液とがあり、どちらを用いてもよい。但し、集団検診を行うことを鑑みると、非刺激唾液が好ましい。
　非刺激唾液の採取方法としては、例えば、唾液をそのまま採取する方法や蒸留水等を口に含み、軽く濯いだ後、唾液を含む吐出液として採取する方法がある。刺激唾液の採取方法としては、例えば、パラフィンガムなどを咀嚼することで唾液の分泌を促進させて採取する方法がある。
　生体試料を採取した後、すぐに解析に利用しない場合、低温（例えば、氷温）で保存する必要がある。常温で放置すると、細菌が増殖して正確な細菌の存在比率や量を解析できなくなるからである。
　生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量は、各細菌に特異的な成分の存在比率又は量を利用して相対的に決定することができる。特異的な成分は特に限定されず、例えば、遺伝子、タンパク質、ペプチドが挙げられるが、遺伝子が好ましい。遺伝子としては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡが挙げられ、ＤＮＡが好ましく、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子がより好ましい。ｒＲＮＡとしては、例えば、１６ＳｒＲＮＡ、５ＳｒＲＮＡ、２６ＳｒＲＮＡが挙げられる。ｒＲＮＡは、リボソームの小サブユニットであるが、このリボソームはタンパク質合成という生命維持に不可欠な器官であるため、進化による変異が生じにくく、全ての細菌で共通の遺伝子配列を有する。また、ｒＲＮＡは、菌により特異的な配列も含むため、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を用いることで、全菌数だけでなく、菌特異的な定量や菌種の同定などを行うことが出来る。各マーカー細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の配列情報は、ＤＤＢＪ、ＮＣＢＩ，Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　Ｄａｔａｂａｓｅ　Ｐｒｏｊｅｃｔ等の公開データベースから取得可能である。
　生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量の測定を、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を利用して行う方法として、例えば、生体試料中のマーカー細菌および全細菌の細菌数を１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のうち細菌により特異的な領域（Ｖ１～Ｖ９領域、好ましくはＶ１、Ｖ２領域）を含む領域（ターゲット領域）の定量ＰＣＲにより測定する方法や、ターゲット領域（好ましくは、Ｖ１、Ｖ２領域）の遺伝子増幅産物を用い、マイクロアレーや次世代シークエンサーにより解析、測定する方法、各マーカー細菌に特異的な１６ＳｒＲＮＡにプローブをハイブリダイズさせ、その量を測定する方法等がある。ＰＣＲ等の遺伝子増幅法においては、１６ＳｒＲＮＡのうち保存的領域から設計される任意のプライマー（例えば、配列番号１の塩基配列を有するプライマー及び配列番号２の塩基配列を有するプライマーの組み合わせを含むプライマーセット）を用いることが好ましい。これらのなかでも、ターゲット領域（例えば、Ｖ１、Ｖ２領域）を含む領域の遺伝子増幅産物を次世代シークエンサーで解析、測定する方法が好ましい。
　ＤＮＡの抽出方法は、特に限定されず、化学的、生化学的な溶菌による方法や物理的に細胞壁を破砕する方法のいずれでもよく、これらを組合せてもよい。
　本発明の方法の例を、後述する実施例の方法に即してより詳細に説明する。
　まず、３ｍＬの蒸留水で約１０秒間濯いだ吐出液として唾液を採取する。採取した唾液は、直ぐに氷冷する。採取当日に、唾液中に含まれる細菌を１００００Ｇで１０分間遠心分離し、遠心沈査として回収する。回収した細菌からＤＮＡ抽出キット（ｎｅｘｔｔｅｃ　１－Ｓｔｅｐ　ＤＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ｆｏｒ　Ｂａｃｔｅｒｉａ、トーホー社製）を用いて、細菌ＤＮＡを抽出する。採取したＤＮＡは、必要に応じて－８０℃にて保存する。
　ＧＳジュニアベンチトップシステム（ロッシュ・ライフサイエンス社製）を用いて、抽出した細菌ＤＮＡの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のＶ１～Ｖ２領域をターゲットに増幅した遺伝子の配列の解析を行い、３０００個の細菌ＤＮＡの配列を解析して細菌の種類を特定し、その存在比率を求めることができる。
　歯周炎のバイオマーカーとして利用し得るマーカー細菌の一例は、アルスロバクター属細菌、オリバクテリウム属細菌、アクチノバチルス属細菌、ラウトロピア属細菌、フィリファクター属細菌、ＳＲ１門細菌、及びシネルギステス属細菌からなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。本発明の方法は、被験者から採取した生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量を測定し、健常者から採取した生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量と比較して、アルスロバクター属細菌、ラウトロピア属細菌、又はＳＲ１門細菌が少ないか、或いはオリバクテリウム属細菌、アクチノバチルス属細菌、フィリファクター属細菌、又はシネルギステス属細菌が多いときに、歯周炎の罹患又はそのリスクが高いと判定し得る。
　なお、これらのマーカー細菌は、後述する実施例の方法により、歯周炎陽性と認識された被験者と、歯周炎陰性と認識された被験者の間で、その存在比率に有意差が認められたものである。
　本発明の方法は、歯周炎の罹患又はそのリスクを判定する方法として利用し得ることを考慮すると、歯周炎に該当する被験者の見落としを少なくすることが好ましい。そのため、後述の実施例で感度の数値が高いことが認められる、アルスロバクター属細菌、オリバクテリウム属細菌、アクチノバチルス属細菌、及びラウトロピア属細菌からなる群から選択される少なくとも１種をマーカー細菌として利用することが好ましい。
　歯周炎のバイオマーカーとして上記マーカー細菌を用いるとき、例えば、次のようにして歯周炎の罹患又はそのリスクが高いと判定し得る。まず、全細菌に対するマーカー細菌の存在比率（個／個、以下同）を測定する。次に、マーカー細菌毎に設定した閾値と、測定したマーカー細菌の存在比率を比較する。そして、測定したマーカー細菌の存在比率が、マーカー細菌毎に設定した閾値以下或いは以上の条件を満たすときに「陽性」と判定する。最後に、陽性に該当したマーカー細菌の数に応じて歯周炎の罹患又はそのリスクが高いと判定し得る。なお、陽性に該当したマーカー細菌の数は、感度や特異度に応じて任意に変更し得る。ここで、マーカー細菌毎に設定するマーカー細菌の存在比率の閾値は、例えば、予め測定済みの健常者（例、非歯周炎患者であることが予め確認されている者）のマーカー細菌の存在比率又は量（健常者対照）で特定し得る。より詳細には、閾値の範囲としては、例えば、下記条件（１Ａ）が挙げられる。
　条件（１Ａ）：閾値は以下の範囲で設定する；アルスロバクター属細菌の存在比率が０．０１～０．１％、オリバクテリウム属細菌の存在比率が０．１～０．２％、アクチノバチルス属細菌の存在比率が０．０５～０．３％、ラウトロピア属細菌の存在比率が０．５～１．７％、フィリファクター属細菌の存在比率が０．０１～０．１％、ＳＲ１門細菌の存在比率が０．１～０．２５％、及びシネルギステス属細菌の存在比率が０．０１～０．１％。
　閾値の範囲を条件（１Ａ）の範囲外とすると、感度や特異度が低くなり、検査の信頼性に影響する場合がある。
　前記マーカー細菌のうち、オリバクテリウム属細菌、アクチノバチルス属細菌、フィリファクター属細菌、シネルギステス属細菌については、閾値以上の存在比率の場合を「陽性」と判定し、アルスロバクター属細菌、ラウトロピア属細菌、ＳＲ１門細菌については、閾値以下の存在比率の場合を「陽性」と判定する。
　なお、比較対照を健常者の代わりに歯周炎者としてもよい（歯周炎者対照）。その場合、陽性と陰性の判定基準が入れ替わることになる。
　マーカー細菌毎に設定した閾値の好適例としては、アルスロバクター属細菌の存在比率が０．０３％以下、オリバクテリウム属細菌の存在比率が０．１５％以上、アクチノバチルス属細菌の存在比率が０．１％以上、ラウトロピア属細菌の存在比率が１．０％以下、フィリファクター属細菌の存在比率が０．０３％以上、ＳＲ１門細菌の存在比率が０．１５％以下、シネルギステス属細菌の存在比率が０．０３％以上、が挙げられる。
　陽性に該当するマーカー細菌の数は少なくとも１つであればよく、２つ以上、３つ以上、４つ以上等のときに、歯周炎と判定するように設定してもよい。但し、本発明の方法が、歯周炎の罹患又はそのリスクを判定する方法として利用し得ることを考慮すると、歯周炎に該当する被験者の見落としを少なくすることが好ましい。そのため、感度の数値を高くできるように、陽性に該当するマーカー細菌の数を設定することが好ましい。
　歯周炎のバイオマーカーとして利用し得るマーカー細菌の他の例は、アルスロバクター属細菌、オリバクテリウム属細菌、アクチノバチルス属細菌、ラウトロピア属細菌、フィリファクター属細菌、ＳＲ１門細菌、シネルギステス属細菌、マイコプラズマ属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、トレポネーマ属細菌、及びエイケネラ属細菌からなる群から選択される２種以上の組み合わせである。本発明の方法は、被験者から採取した生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量を測定し、健常者から採取した生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量と比較して、アルスロバクター属細菌、ラウトロピア属細菌、ＳＲ１門細菌、又はカプノサイトファーガ属細菌が少ないか、或いはオリバクテリウム属細菌、アクチノバチルス属細菌、フィリファクター属細菌、シネルギステス属細菌、マイコプラズマ属細菌、トレポネーマ属細菌、又はエイケネラ属細菌が多いときに、歯周炎の罹患又はそのリスクが高いと判定し得る。
　他の例は、一例で規定するマーカー細菌を含み得る。但し、他の例は、マーカー細菌として、マイコプラズマ属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、トレポネーマ属細菌、及びエイケネラ属細菌を含み得ることと、必ず２種以上のマーカー細菌の組み合わせで判定することが異なる。
　歯周炎のバイオマーカーとして上記他の例のマーカー細菌を用いるとき、例えば、次のようにして歯周炎の罹患又はそのリスクが高いと判定し得る。まず、全細菌に対するマーカー細菌の存在比率を測定する。次に、マーカー細菌毎に設定した閾値と、測定したマーカー細菌の存在比率を比較する。そして、測定したマーカー細菌の存在比率が、マーカー細菌毎に設定した閾値以下或いは以上の条件を満たすときに「陽性」と判定する。最後に、陽性に該当したマーカー細菌の数に応じて歯周炎の罹患又はそのリスクが高いと判定し得る。なお、陽性に該当したマーカー細菌の数は、感度や特異度に応じて任意に変更し得る。ここで、マーカー細菌毎に設定する閾値は、例えば、予め測定済みの健常者（例、非歯周炎患者であることが予め確認されている者）のマーカー細菌の存在比率又は量（健常者対照）で特定し得る。より詳細には、閾値の範囲としては、例えば、下記条件（２Ａ）が挙げられる。
　条件（２Ａ）：閾値は以下の範囲で設定する；アルスロバクター属細菌の存在比率が０．０１～０．１％、オリバクテリウム属細菌の存在比率が０．１～０．２％、アクチノバチルス属細菌の存在比率が０．０５～０．３％、ラウトロピア属細菌の存在比率が０．５～１．７％、フィリファクター属細菌の存在比率が０．０１～０．１％、ＳＲ１門細菌の存在比率が０．１～０．２５％、シネルギステス属細菌の存在比率が０．０１～０．１％、マイコプラズマ属細菌の存在比率が０．０１～０．１％、カプノサイトファーガ属細菌の存在比率が０．５～１．０％、トレポネーマ属細菌の存在比率が０．０１～０．１％、及びエイケネラ属細菌の存在比率が０．０１～０．１％。
　閾値の範囲を条件（２Ａ）の範囲外とすると、感度や特異度が低くなり、検査の信頼性に影響する場合がある。
　前記マーカー細菌のうち、オリバクテリウム属細菌、アクチノバチルス属細菌、フィリファクター属細菌、シネルギステス属細菌、マイコプラズマ属細菌、トレポネーマ属細菌、エイケネラ属細菌については、閾値以上の存在比率の場合を「陽性」と判定し、アルスロバクター属細菌、ラウトロピア属細菌、ＳＲ１門細菌、カプノサイトファーガ属細菌については、閾値以下の存在比率の場合を「陽性」と判定する。
　なお、比較対照を健常者の代わりに歯周炎罹患者としてもよい（歯周炎罹患者対照）。その場合、陽性と陰性の判定基準が入れ替わることになる。
　マーカー細菌毎に設定した閾値の好適例としては、アルスロバクター属細菌の存在比率が０．０３％以下、オリバクテリウム属細菌の存在比率が０．１５％以上、アクチノバチルス属細菌の存在比率が０．１％以上、ラウトロピア属細菌の存在比率が１．０％以下、フィリファクター属細菌の存在比率が０．０３％以上、ＳＲ１門細菌の存在比率が０．１５％以下、シネルギステス属細菌の存在比率が０．０３％以上、マイコプラズマ属細菌の存在比率が０．０３％以上、カプノサイトファーガ属細菌の存在比率が０．７％以下、トレポネーマ属細菌の存在比率が０．０３％以上、及びエイケネラ属細菌の存在比率が０．０３％以上、が挙げられる。
　陽性に該当するマーカー細菌の数は少なくとも２つであればよく、３つ以上、４つ以上、５つ以上等のときに、歯周炎と判定するように設定してもよい。但し、本発明の方法が、歯周炎の罹患又はそのリスクを判定する方法として利用し得ることを考慮すると、歯周炎に該当する被験者の見落としを少なくすることが好ましい。そのため、感度の数値を高くできるよう、陽性に該当するマーカー細菌の数を設定することが好ましい。
　後述する実施例の結果から、感度の数値を高くする場合、例えば、下記の設定（１）～（５）を満たす場合に歯周炎と判定する設定が挙げられる。
　設定（１）：アルスロバクター属細菌、オリバクテリウム属細菌、アクチノバチルス属細菌、及びラウトロピア属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、陽性に該当するマーカー細菌の数が２つ以上。
　設定（２）：アルスロバクター属細菌、オリバクテリウム属細菌、アクチノバチルス属細菌、ラウトロピア属細菌、フィリファクター属細菌、シネルギステス属細菌、及びマイコプラズマ属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、陽性に該当するマーカー細菌の数が３つ以上。
　設定（３）：アルスロバクター属細菌、オリバクテリウム属細菌、アクチノバチルス属細菌、ラウトロピア属細菌、フィリファクター属細菌、ＳＲ１門細菌、シネルギステス属細菌、マイコプラズマ属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、トレポネーマ属細菌、及びエイケネラ属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、陽性に該当するマーカー細菌の数が５つ以上。
　設定（４）：オリバクテリウム属細菌、アクチノバチルス属細菌、ラウトロピア属細菌、シネルギステス属細菌、及びマイコプラズマ属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、陽性に該当するマーカー細菌の数が２つ以上。
　設定（５）：オリバクテリウム属細菌、アクチノバチルス属細菌、ラウトロピア属細菌、フィリファクター属細菌、ＳＲ１門細菌、シネルギステス属細菌、マイコプラズマ属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、トレポネーマ属細菌、及びエイケネラ属細菌からなる群から選択される細菌の組み合わせであり、陽性に該当するマーカー細菌の数が５つ以上。
［２．バイオマーカー］
　本発明のバイオマーカーは、被験者の歯周炎の罹患又はそのリスクを判定用に利用される、マーカー細菌又はその由来成分である。被験者から採取した生体試料中の本発明のバイオマーカーの存在比率又は量を測定することにより、被験者の歯肉炎の罹患又はそのリスクを判定できる。判定の際には、［１．方法］に記載された方法を用いることが好ましい。例えば、各細菌に特異的なＤＮＡを抽出し、ｒＲＮＡ遺伝子を解析する等、人為的な操作を加えることで、細菌の特定と生体試料における細菌の存在比率又は量を測定する。本発明のバイオマーカーは、測定結果を利用して、健常者から採取した生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量と比較して、歯周炎と判定する指標としての利用可能性が見出されたものである。また、被験者は、歯周炎又はその発症のリスクを有する被験者でもよい。
　バイオマーカーの一実施形態は、アルスロバクター属細菌、オリバクテリウム属細菌、アクチノバチルス属細菌、ラウトロピア属細菌、フィリファクター属細菌、ＳＲ１門細菌、及びシネルギステス属細菌からなる群から選択される少なくとも１種のマーカー細菌又はその由来成分を含む。
　バイオマーカーの他の実施形態は、アルスロバクター属細菌、オリバクテリウム属細菌、アクチノバチルス属細菌、ラウトロピア属細菌、フィリファクター属細菌、ＳＲ１門細菌、シネルギステス属細菌、マイコプラズマ属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、トレポネーマ属細菌、及びエイケネラ属細菌からなる群から選択される２種以上の組み合わせであるマーカー細菌、又はその由来成分を含む。
　以下、各細菌の詳細を記す。
（アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌）
　アルスロバクター属細菌の菌種は、例えば、アルスロバクター　ダビダニエリ、アルスロバクター　エスピー、アルスロバクター　ウレアファシエンス、アルスロバクター　シトレウスが挙げられる。
（オリバクテリウム（Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌）
　オリバクテリウム属細菌の菌種は、例えば、オリバクテリウム　シナスが挙げられる。
（アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌）
　アクチノバチルス属細菌の菌種は、例えば、アクチノバチルス　ミナー、アクチノバチルス　サクシノジェネス、アクチノバチルス　アクチノマイセテムコミタンスが挙げられる。
（ラウトロピア（Ｌａｕｔｒｏｐｉａ）属細菌）
　ラウトロピア属細菌の菌種は、例えば、ラウトロピア　ミラビリスが挙げられる。
（フィリファクター（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）属細菌）
　フィリファクター属細菌の菌種は、例えば、フィリファクター　アロキスが挙げられる。
（ＳＲ１門細菌）
　ＳＲ１門細菌の菌種は分離培養されておらず遺伝子配列上分類されている菌種で、例えば、ＳＲ１　ＤＱ６３９５１３、ＳＲ１　ＡＦ１２５２０７が挙げられる。
（シネルギステス（Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓ）属細菌）
　シネルギステス属細菌の菌種は、遺伝子配列上分類されている菌種が多く、例えば、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓ　ｏｒａｌ　ｔａｘｏｎ　３６３、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓ　ｏｒａｌ　ｔａｘｏｎ　３６１が挙げられる。
（マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属細菌）
　マイコプラズマ属細菌の菌種は、例えば、マイコプラズマ　サリバリウム、マイコプラズマ　リポフィリウム、マイコプラズマ　ジェニタリウムが挙げられる。
（カプノサイトファーガ（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）属細菌）
　カプノサイトファーガ属細菌の菌種は、例えば、カプノサイトファーガ　スプティーガ、カプノサイトファーガ　ギンギバリス、カプノサイトファーガ　、カプノサイトファーガ　オクラセアが挙げられる。
（トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）属細菌）
　トレポネーマ属細菌の菌種は、例えば、トレポネーマ　デンティコラ、トレポネーマ　ソクランスキ、トレポネーマ　ペクチノボラムが挙げられる。
（エイケネラ（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ）属細菌）
　エイケネラ属細菌の菌種は、例えば、エイケネラ　コローデンスが挙げられる。
（由来成分）
　マーカー細菌の由来成分とは、各マーカー細菌に特異的な成分であり、かつその量からマーカー細菌の種類や存在比率、量を測定可能な成分であればよく、例えば、核酸（例、ＤＮＡやＲＮＡ）、タンパク質、ペプチドが挙げられ、ＤＮＡが好ましく、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子がより好ましい。ｒＲＮＡとしては、例えば、１６ＳｒＲＮＡ、５ＳｒＲＮＡ、２６ＳｒＲＮＡ等が挙げられる。中でも、解析が容易であるため、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子が好ましく、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＶ１～Ｖ９領域の少なくとも１つがより好ましく、Ｖ１及びＶ２領域のいずれか又は両方が更に好ましい。
（検出キット（検出手段））
　検出キット（検出手段）とは、歯周炎の罹患又はそのリスク判定用バイオマーカーである各マーカー細菌の１６ＳｒＲＮＡを検出し得る、プライマーペア、プローブ、及び前記プローブが固定されているマイクロアレイからなる群より選ばれる１以上を含む、キット又は手段である。プライマーペアは、少なくとも１つでよく、細菌の１６ＳｒＲＮＡのうち保存的領域から設計されることが好ましい。塩基長、配列は、検出に用いるＰＣＲ等の遺伝子増幅法などに応じて適宜定めればよい。プローブは、各マーカー細菌の１６ＳｒＲＮＡの特異的な領域（Ｖ１～Ｖ９）の少なくとも一部の塩基配列と相補的なオリゴヌクレオチドであればよく、必要に応じて蛍光物質等で修飾されていてもよい。マイクロアレイは、基板（材質は限定されない）にプローブが固定されていればよい。検出キットは、マーカー細菌の検出に用いるための他の試薬を含んでいてもよい。例えば、増幅法に応じて用いられる試薬（例、ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素等の酵素、蛍光試薬、ｄＮＴＰｓ等の基質、ＡＴＰ等の補酵素）、ポジティブ／ネガティブコントロール（例、ハウスキーピング遺伝子）が挙げられる。検出キットは、容器に収められていてもよい。
　以下、本発明を実施例により詳細に説明する。以下の実施例は、本発明を好適に説明するためのものであって、本発明を限定するものではない。
（マーカーの選定）
　３０歳から５９歳の被験者３８名を、歯科医師の診断による歯肉の状態により表１に示すように歯周炎患者と非歯周炎患者により群分けした。なお、各群間での年齢及び齲蝕経験歯数に有意な差は認められず、群間での細菌の存在比率（以下、「構成比率」ともいう）の差に年齢や齲蝕の影響は無いと判断された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　３ｍＬの蒸留水で洗口した後、吐出液として唾液を採取した。採取した唾液は直ぐに氷冷した。採取当日に、唾液を１００００Ｇで１０分間遠心分離し、唾液中に含まれる細菌を遠心沈査として回収した。回収した細菌から細菌ＤＮＡを抽出した。採取したＤＮＡを、－８０℃で保存した。なお、細菌ＤＮＡの抽出は、ＤＮＡ抽出キットである「ｎｅｘｔｔｅｃ　１－Ｓｔｅｐ　ＤＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ｆｏｒ　Ｂａｃｔｅｒｉａ」（トーホー社製）を用い、キットのプロトコルに従って行った。
　細菌の構成比率の測定は、「ＧＳジュニアベンチトップシステム」（ロッシュ・ライフサイエンス社製）を用いて行った。機器のマニュアルに従い、抽出した細菌ＤＮＡの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のＶ１～Ｖ２領域をターゲットに増幅した遺伝子の配列の解析を行い、３０００個の細菌ＤＮＡの配列を解析して細菌種類を特定、その構成比率（％）を求めた。
　１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のＶ１～Ｖ２領域の増幅には、フォワードプライマーとして、ＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＣＧＡＣＴＣＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＲＧＴＴＴＧＡＴＹＭＴＧＧＣＴＣＡＧ（配列番号１）（但し、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴを意味し、Ｍは、Ａ又はＣを意味し、Ｒは、Ｇ又はＡを意味し、Ｙは、Ｔ又はＣを意味する）を、リバースプライマーとして、ＣＣＴＡＴＣＣＣＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＴＧＧＣＡＧＴＣＴＣＡＧＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＧＴＡＧＧＡＧＴ（配列番号２）を用いた。また、得られた配列からの細菌種類の特定には公表データベース（ＣＯＲＥ及びＲＤＰ）を用いた。
　また、歯周炎患者と非歯周炎患者の２群間の構成比率の平均値の差をウェルチのｔ検定により有意差検定した。その結果を表２に記す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　群間の細菌の構成比率を比較解析し、歯肉の状態により細菌の構成比率が異なる細菌として、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属細菌、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ属細菌、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌、ＳＲ１門細菌、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属細菌、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ属細菌、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ属細菌、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓ属細菌、Ｌａｕｔｒｏｐｉａ属細菌を抽出し（表２中、ｐ値が０．１未満の細菌）、歯周炎のバイオマーカーとして選定した。
　なお、細菌の構成比率が０．０１％未満の細菌は、データの信頼性が低いと判断し、解析の対象外とした。
（バイオマーカーによる歯肉の状態の検査）
　２５歳から６４歳の被験者５７名について歯科医師の診断により、歯周炎罹患被験者３３名、非歯周炎被験者２４名に分けた。前記被験者５７名に対して、（マーカーの選定）に記載した方法で、唾液を採取して唾液中の口腔細菌の細菌構成比率を測定した。各被験者の、歯科医師による診断結果による区別と、各細菌の細菌構成比率の閾値からの判定結果を表３に記す。
　なお、各細菌の細菌構成比率の閾値は、表３に示す値に設定し、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌とＬａｕｔｒｏｐｉａ属細菌については、構成比率が閾値以下の場合を「歯周炎」と判定し、閾値より大きい場合を「非歯周炎」と判定した。Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌とＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌については、構成比率が閾値以上の場合を「歯周炎」と判定し、閾値より小さい場合を「非歯周炎」と判定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　各細菌の細菌構成比率から推定した、歯肉の状態の評価の感度と特異度は、表３に示す値となり、歯肉の状態を推定でき、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌、Ｌａｕｔｒｏｐｉａ属細菌が、歯周炎のバイオマーカーとして有用であることが分かった。
　感度、特異度は、その検査がどの程度正確かを示す指標である。感度は、歯周炎患者を歯周炎と判定する指標であり、歯科医師により歯周炎と診断された歯周炎罹患者の中で歯周炎と判定された人数の割合である。特異度は、非歯周炎患者を非歯周炎と判定する指標であり、歯科医師により非歯周炎と診断された被験者の中で非歯周炎と判定された人数の割合である。歯肉の状態を検査する方法として、感度、特異度ともに１に近ければ近いほど正確な評価方法である。
　歯周炎であることを判定する目的は、歯肉の状態を知り、歯肉を健全に保つことにある。そのため、歯肉の状態を検査する方法としては、歯周炎を検出して適切な処置を行うことが重要となるため、感度が高い方が好ましい。そのため、バイオマーカーの対象とする細菌としては、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ｌａｕｔｒｏｐｉａ属細菌が好ましく、特異度も高いＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌がさらに好ましいといえる。
　歯周炎は、炎症が進行中でプロービングにより歯肉から出血を生じる活動期の歯周炎と、出血が生じない休止期の歯周炎に大別される。歯肉の状態の検査としては、歯周炎を早期発見し、適切な処置をすることにあるため、活動期の歯周炎を感度良く検出できることがさらに好ましい。
　そこで、上記の被験者５７名を、歯科医師により活動期歯周炎と診断された１９名と他の３８名（非活動期歯周炎；休止期歯周炎＋非歯周炎）との群に分け、細菌構成比率のデータを用いて活動期の歯周炎について同様に評価した。結果を表４に記す。
　なお、各細菌の細菌構成比率の閾値は表４に示す値に設定し、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ｌａｕｔｒｏｐｉａ属細菌、及びＳＲ１属細菌については、構成比率が閾値以下の場合を「活動期歯周炎」と判定し、閾値より大きい場合を「非活動期歯周炎」と判定した。その他の細菌については、構成比率が閾値以上の場合を「活動期歯周炎」と判定し、閾値より小さい場合を「非活動期歯周炎」と判定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４から、活動期の歯周炎については、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌、Ｌａｕｔｒｏｐｉａ属細菌に加えて、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ属細菌、ＳＲ１門細菌、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓ属細菌が、感度よく評価可能であることがわかる。
　歯周炎評価の感度、特異度を高めるため、上記の被験者５７名のデータを用いてバイオマーカーの対象とする細菌を２種組み合せて判定することを検討した。検討結果を表５に記す。
　なお、表５中、組合せて評価する細菌の１つでも歯周炎と判定される場合、歯周炎と判定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５からわかるように、組合せて評価する細菌の１つでも歯周炎と判定される場合に、歯周炎と判定すると、感度が向上し、歯肉の状態を検査する方法として優れていた。
　なお、各細菌の細菌構成比率の閾値は、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌が０．０３％、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌が０．１５％、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌が０．１％、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属細菌が０．０３％、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属細菌が０．０３％、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓ属細菌が０．０３％、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ属細菌が０．０３％、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ属細菌が０．０３％と設定した。Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌については、細菌の存在比率が閾値以下の場合を「歯周炎」と判定し、閾値より大きい場合を「非歯周炎」と判定した。その他の細菌については、細菌の存在比率が閾値以上の場合を「歯周炎」と判定し、閾値より小さい場合を「非歯周炎」と判定した。
　さらに、有意差を認めた細菌の中で、歯周炎陽性と判定されたマーカー細菌の数から、歯肉の状態を推定して感度、特異度が向上するか、上記の被験者５７名のデータを用いて検討した。結果を表６に記す。
　なお、表６中各細菌の細菌構成比率の閾値は、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌が０．０３％、Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌が０．１５％、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌が０．１％、Ｌａｕｔｒｏｐｉａ属細菌が１％以下、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ属細菌が０．０３％、ＳＲ１門細菌が０．１５％、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｓ属細菌が０．０３％、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属細菌が０．０３％、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ属細菌が０．７％、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属細菌が０．０３％、及びＥｉｋｅｎｅｌｌａ属細菌が０．０３％と設定した。Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌、Ｌａｕｔｒｏｐｉａ属細菌、ＳＲ１属細菌、及びＣａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ属細菌については、細菌の構成比率が閾値以下の場合を「歯周炎」と判定し、閾値より大きい場合を「非歯周炎」と判定した。その他の細菌は、細菌の構成比率が閾値以上の場合を「歯周炎」と判定し、閾値より小さい場合を「非歯周炎」と判定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６からわかるように、歯周炎と判定された菌の個数を表６に示す個数以上あった場合に「歯周炎」と判定すると、感度、特異度が向上することがわかる。

Claims (17)

  1. 　歯周炎の罹患又はそのリスクを判定するために、被験者から採取した生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量を測定する方法であって、
    　前記マーカー細菌が、アルスロバクター属細菌、オリバクテリウム属細菌、アクチノバチルス属細菌、ラウトロピア属細菌、フィリファクター属細菌、ＳＲ１門細菌、及びシネルギステス属細菌からなる群から選択される少なくとも１種である方法。
  2. 　健常者から採取した生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量と比較して、
    　前記アルスロバクター属細菌、前記ラウトロピア属細菌、又は前記ＳＲ１門細菌が少ないか、或いは前記オリバクテリウム属細菌、前記アクチノバチルス属細菌、前記フィリファクター属細菌、又は前記シネルギステス属細菌が多いときに、歯周炎の罹患又はそのリスクが高いと判定する請求項１に記載の方法。
  3. 　前記マーカー細菌が、アルスロバクター属細菌、オリバクテリウム属細菌、アクチノバチルス属細菌、及びラウトロピア属細菌からなる群から選択される少なくとも１種である請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　下記条件（１）を満たすときに、歯周炎の罹患又はそのリスクが高いと判定する請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
    　条件（１）：前記アルスロバクター属細菌の存在比率が０．０３％以下、前記オリバクテリウム属細菌の存在比率が０．１５％以上、前記アクチノバチルス属細菌の存在比率が０．１％以上、前記ラウトロピア属細菌の存在比率が１％以下、前記フィリファクター属細菌の存在比率が０．０３％以上、前記ＳＲ１門細菌の存在比率が０．１５％以下、及び前記シネルギステス属細菌の存在比率が０．０３％以上の少なくとも１つ。
  5. 　活動期歯周炎の罹患又はそのリスクが高いと判定する請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　歯周炎の罹患又はそのリスクを判定するために、被験者から採取した生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量を測定する方法であって、
    　前記マーカー細菌が、アルスロバクター属細菌、オリバクテリウム属細菌、アクチノバチルス属細菌、ラウトロピア属細菌、フィリファクター属細菌、ＳＲ１門細菌、シネルギステス属細菌、マイコプラズマ属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、トレポネーマ属細菌、及びエイケネラ属細菌からなる群から選択される２種以上の組み合わせである方法。
  7. 　健常者から採取した生体試料中の全細菌に対するマーカー細菌の存在比率又は量と比較して、
    　前記アルスロバクター属細菌、前記ラウトロピア属細菌、前記ＳＲ１門細菌、又は前記カプノサイトファーガ属細菌が少ないか、或いは前記オリバクテリウム属細菌、前記アクチノバチルス属細菌、前記フィリファクター属細菌、前記シネルギステス属細菌、前記マイコプラズマ属細菌、前記トレポネーマ属細菌、又は前記エイケネラ属細菌が多いときに、歯周炎の罹患又はそのリスクが高いと判定する請求項６に記載の方法。
  8. 　下記条件（２）を満たすときに、歯周炎の罹患又はそのリスクが高いと判定する請求項６又は７に記載の方法。
    　条件（２）：前記アルスロバクター属細菌の存在比率が０．０３％以下、前記オリバクテリウム属細菌の存在比率が０．１５％以上、前記アクチノバチルス属細菌の存在比率が０．１％以上、前記ラウトロピア属細菌の存在比率が１％以下、前記フィリファクター属細菌の存在比率が０．０３％以上、前記ＳＲ１門細菌の存在比率が０．１５％以下、前記シネルギステス属細菌の存在比率が０．０３％以上、前記マイコプラズマ属細菌の存在比率が０．０３％以上、前記カプノサイトファーガ属細菌の存在比率が０．７％以下、前記トレポネーマ属細菌の存在比率が０．０３％以上、及び前記エイケネラ属細菌の存在比率が０．０３％以上の少なくとも２つ。
  9. 　前記生体試料が、口腔内から採取した試料である請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　前記試料が、唾液、歯垢、歯石、舌苔又は歯肉滲出液である請求項９に記載の方法。
  11. 　被験者が、成年者である請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　被験者の歯周炎の罹患又はそのリスク判定用バイオマーカーであって、
    　アルスロバクター属細菌、オリバクテリウム属細菌、アクチノバチルス属細菌、ラウトロピア属細菌、フィリファクター属細菌、ＳＲ１門細菌、及びシネルギステス属細菌からなる群から選択される少なくとも１種のマーカー細菌、又は該マーカー細菌の由来成分を含むバイオマーカー。
  13. 　被験者の歯周炎の罹患又はそのリスク判定用バイオマーカーであって、
    　アルスロバクター属細菌、オリバクテリウム属細菌、アクチノバチルス属細菌、ラウトロピア属細菌、フィリファクター属細菌、ＳＲ１門細菌、シネルギステス属細菌、マイコプラズマ属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、トレポネーマ属細菌、及びエイケネラ属細菌からなる群から選択される２種以上の組み合わせであるマーカー細菌、又は該マーカー細菌の由来成分を含むバイオマーカー。
  14. 　被験者が、成年者である請求項１２又は１３に記載のバイオマーカー。
  15. 　前記被験者が、歯周炎又はその発症のリスクを有する被験者である請求項１２～１４のいずれか１項に記載のバイオマーカー。
  16. 　被験者の歯周炎の罹患又はそのリスク判定用バイオマーカーである、アルスロバクター属細菌、オリバクテリウム属細菌、アクチノバチルス属細菌、ラウトロピア属細菌、フィリファクター属細菌、ＳＲ１門細菌、及びシネルギステス属細菌からなる群から選択される少なくとも１種のマーカー細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出し得る、プライマーペア、プローブ、及び前記プローブが固定されているマイクロアレイからなる群より選ばれる１以上を含む、検出キット。
  17. 　被験者の歯周炎の罹患又はそのリスク判定用バイオマーカーである、アルスロバクター属細菌、オリバクテリウム属細菌、アクチノバチルス属細菌、ラウトロピア属細菌、フィリファクター属細菌、ＳＲ１門細菌、シネルギステス属細菌、マイコプラズマ属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、トレポネーマ属細菌、及びエイケネラ属細菌からなる群から選択される２種以上のマーカー細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を検出し得る、２以上のプライマーペア、プローブ、及び前記プローブが固定されているマイクロアレイからなる群より選ばれる１以上を含む、検出キット。
PCT/JP2018/024551 2017-06-30 2018-06-28 歯周炎の判定方法及びバイオマーカー Ceased WO2019004347A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017-128349 2017-06-30
JP2017128349 2017-06-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019004347A1 true WO2019004347A1 (ja) 2019-01-03

Family

ID=64741993

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2018/024551 Ceased WO2019004347A1 (ja) 2017-06-30 2018-06-28 歯周炎の判定方法及びバイオマーカー

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2019004347A1 (ja)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63159762A (ja) * 1986-11-20 1988-07-02 ミネソタ　マイニング　アンド　マニユフアクチユアリング　カンパニー 口内微生物の評価方法
JP2017023093A (ja) * 2015-07-27 2017-02-02 三菱レイヨン株式会社 歯周病及び齲蝕のリスクの判定方法
WO2018012011A1 (ja) * 2016-07-11 2018-01-18 三菱ケミカル株式会社 口腔内検査方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63159762A (ja) * 1986-11-20 1988-07-02 ミネソタ　マイニング　アンド　マニユフアクチユアリング　カンパニー 口内微生物の評価方法
JP2017023093A (ja) * 2015-07-27 2017-02-02 三菱レイヨン株式会社 歯周病及び齲蝕のリスクの判定方法
WO2018012011A1 (ja) * 2016-07-11 2018-01-18 三菱ケミカル株式会社 口腔内検査方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GRIFFEN, AL. ET AL.: "Distinct and complex bacterial profiles in human periodontitis and health revealed by 16S pyrosequencing", ISME J., vol. 6, no. 6, 2012, pages 1176 - 1185, XP055569386, ISSN: 1751-7362 *
SHI, B. ET AL.: "Dynamic changes in the subgingival microbiome and their potential for diagnosis and prognosis of periodontitis", MBIO, vol. 6, no. 1, 2015, pages e01926, XP055569390, ISSN: 2150-7511 *
TSAI, CY . ET AL.: "Subgingival microbiota in individuals with severe chronic periodontitis", J. MICROBIOL. IMMUNOL. INFECT., vol. 51, no. 2, May 2016 (2016-05-01), pages 226 - 234, XP055569393, ISSN: 1684-1182 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Galimanas et al. Bacterial community composition of chronic periodontitis and novel oral sampling sites for detecting disease indicators
Kim et al. Salivary biomarkers in the diagnosis of Periodontal Disease
Gomar-Vercher et al. Relationship of children’s salivary microbiota with their caries status: a pyrosequencing study
Yang et al. The impact of caries status on supragingival plaque and salivary microbiome in children with mixed dentition: a cross-sectional survey
EP3483266A1 (en) Intraoral examination method
Shi et al. Metagenomic analysis of the salivary microbiota in patients with caries, periodontitis and comorbid diseases
EP2994753B1 (en) Method and system for assessing health condition
KR102225447B1 (ko) 구강 세균의 군집을 이용한 알츠하이머 진단용 바이오마커 및 이의 용도
Neves et al. Quantitative analysis of biofilm bacteria according to different stages of early childhood caries
JP2017085944A (ja) イヌの歯周病の評価方法
Song et al. Metagenomic analysis of healthy and diseased peri-implant microbiome under different periodontal conditions: a cross-sectional study
Abbate et al. Correlation between un-stimulated salivary flow, pH and streptococcus mutans, analysed
Fernandes et al. Do elderly edentulous patients with a history of periodontitis harbor periodontal pathogens?
Gondo et al. Comparative analysis of microbiome in coronal and root caries
Lee et al. Oral microbiome profiles of gingivitis and periodontitis by next-generation sequencing among a group of hospital patients in Korea: A cross-sectional study
JP5885910B2 (ja) 齲蝕に関連する口腔内細菌の特定方法
WO2019004347A1 (ja) 歯周炎の判定方法及びバイオマーカー
US20250382675A1 (en) Composition for diagnosing periodontal disease using bacterial population in saliva, and use thereof
JP7693380B2 (ja) 被験者を層別化する方法
Childers et al. Potential risk for localized aggressive periodontitis in African American preadolescent children
WO2019004346A1 (ja) 歯肉炎の判定方法及びバイオマーカー
JP6288758B2 (ja) 唾液の細菌叢の解析方法
WO2019004400A1 (ja) 齲蝕の有無又はその発症リスクの判定方法及びバイオマーカー
RU2607046C2 (ru) Способ оценки обсемененности пародонта патогенными бактериями с применением полимеразной цепной реакции в реальном времени
CN114317783A (zh) 龋齿标志微生物及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18823654

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 18823654

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP