[go: up one dir, main page]

WO2019098349A1 - 尿管芽様組織誘導方法 - Google Patents

尿管芽様組織誘導方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2019098349A1
WO2019098349A1 PCT/JP2018/042567 JP2018042567W WO2019098349A1 WO 2019098349 A1 WO2019098349 A1 WO 2019098349A1 JP 2018042567 W JP2018042567 W JP 2018042567W WO 2019098349 A1 WO2019098349 A1 WO 2019098349A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
inhibitor
wolff
tissue
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2018/042567
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
健二 長船
伸一 前
誠 兩坂
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kyoto University NUC
Original Assignee
Kyoto University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyoto University NUC filed Critical Kyoto University NUC
Priority to US16/763,875 priority Critical patent/US20210009960A1/en
Priority to JP2019554327A priority patent/JP7162349B2/ja
Publication of WO2019098349A1 publication Critical patent/WO2019098349A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0687—Renal stem cells; Renal progenitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/22—Urine; Urinary tract, e.g. kidney or bladder; Intraglomerular mesangial cells; Renal mesenchymal cells; Adrenal gland
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/113—Acidic fibroblast growth factor (aFGF, FGF-1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/119—Other fibroblast growth factors, e.g. FGF-4, FGF-8, FGF-10
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/13—Nerve growth factor [NGF]; Brain-derived neurotrophic factor [BDNF]; Cilliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial-derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins [NT]; Neuregulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture

Definitions

  • the present application relates to methods of inducing ureteral bud-like tissue. More particularly, it relates to a method of inducing ureteral-like tissue from pluripotent stem cells, in particular human pluripotent stem cells.
  • kidney disease chronic kidney disease
  • CKD chronic kidney disease
  • dialysis treatment As a root treatment for chronic kidney disease including end-stage chronic renal failure, kidney transplantation can be mentioned, but it is in a condition where supply has not kept up with demand due to serious donor organ shortage.
  • the kidney is derived from intermediate mesoderm, which is a tissue in the early embryonic stage, and in vertebrates, three kidneys, that is, an anterior mesoderm, a median, and a posterior kidney, are formed, and in mammals, the posterior kidney becomes an adult kidney.
  • the metanephric tissue is a tissue that will differentiate into the nephron and stroma of adult kidney, which is called mesenchyme, and a tissue that will differentiate into a part of the lower renal pelvis, ureter, part of the bladder from the collecting duct of adult kidney that is called ureteral bud. It occurs in the interaction of two tissues (Non-patent Documents 1 and 2).
  • Ureteral buds first appear as projections from the caudal end of Wolff's duct cells, then repeat branching and differentiate into renal collecting ducts and urothelium.
  • the ability to generate ureteral bud tissue that forms a branched structure is expected to be useful for elucidating the mechanisms of kidney development and kidney disease.
  • the present inventors have established methods for inducing differentiation from pluripotent stem cells into various cells such as pancreatic hormone producing cells, pancreatic blast cells, biliary epithelial progenitor cells, hepatocytes and the like (Patent Documents 1 to 5). So far, methods for selectively differentiating ureteroblasts from human iPS cells and human ES cells have not been known so far.
  • the present application aims to provide a method for inducing differentiation of pluripotent stem cells, particularly iPS cells and ES cells, into ureteroblasts.
  • Another object of the present application is a system for producing ureteral bud-like tissue via each differentiation stage of pluripotent stem cells to ureteral bud-like tissue, anterior primitive streak cell, anterior intermediate mesodermal cell, and Wolff's duct cell. It is to provide.
  • Yet another object of the present application is to provide a method of maintaining ureteral bud-like organoid.
  • Another object of the present invention is to provide a method for expanding and culturing ureteral bud-like organoid.
  • Another object of the present invention is to provide a method for inducing differentiation of collecting duct precursor cells from pluripotent stem cells.
  • This application is (1) two-dimensional culture of anterior primitive streak cells in the presence of fibroblast growth factor, retinoic acid receptor agonist, TGF ⁇ inhibitor, and BMP inhibitor to obtain an anterior intermediate mesodermal cell culture, And (2) two-dimensional culturing the anterior intermediate mesodermal cell culture in the presence of a GSK3 ⁇ inhibitor, a BMP inhibitor, a fibroblast growth factor and a glial cell line-derived neurotrophic factor.
  • the medium may further contain a retinoic acid receptor agonist.
  • the method further comprises the step of two-dimensionally culturing pluripotent stem cells in the presence of an activator of activin receptor kinase 4, 7, a GSK3 ⁇ inhibitor, and BMP4 to obtain anterior primitive streak cells.
  • anterior primitive streak cells may be obtained by other known methods. That is, the present embodiment provides a method for inducing primary Wolff cells from pluripotent stem cells.
  • the present application also provides a method of cryopreserving induced primary Wolff cell cells.
  • Initial Wolff cells that have been cryopreserved and made to sleep in the methods of the present application can be used as initial Wolff cells in the following embodiments.
  • the present application is also (3) Suspension culture of initial Wolff cells in the presence of glial cell line-derived neurotrophic factor, fibroblast growth factor, retinoic acid receptor agonist, GSK3 ⁇ inhibitor and Yes-associated protein (YAP) activity inhibitor Obtaining mature Wolff cell aggregates, and (4) mature Wolff cell aggregates, the glial cell line-derived neurotrophic factor, fibroblast growth factor, retinoic acid receptor agonist, GSK3 ⁇ inhibitor and Yes- Provided is a method of inducing ureteral bud-like tissue comprising the step of three-dimensional culture in the presence of an associated protein (YAP) activity inhibitor.
  • YAP associated protein
  • the initial Wolff cells may be those induced by the method of the present application or those that have been made to sleep after cryopreservation by the method of the present application. That is, the present embodiment provides a method for inducing ureteral bud-like tissue from pluripotent stem cells.
  • (3 ′) Mature Wolff cell cells are obtained by suspending primary Wolff cells in the presence of GSK3 ⁇ inhibitor, BMP inhibitor, fibroblast growth factor, retinoic acid receptor agonist and glial cell line-derived neurotrophic factor Obtaining an aggregate, and (4 ') mature Wolff cell aggregates in the presence of a GSK3 ⁇ inhibitor, a BMP inhibitor, a fibroblast growth factor, a retinoic acid receptor agonist and a glial cell line-derived neurotrophic factor
  • a method of inducing ureteral bud-like tissue comprising the step of suspension culture.
  • the initial Wolff cells may be those induced by the method of the present application or those that have been made to sleep after cryopreservation by the method of the present application.
  • the present application also provides a ureteral bud-like tissue culture by the method of the present application, and further (5-1) isolating ureteral bud-like tissue, and (5-2) isolating the isolated ureteral bud-like tissue.
  • a method for inducing ureteral-like organoid comprising the step of suspension culture in the presence of a GSK3 ⁇ inhibitor, a BMP inhibitor, a fibroblast growth factor, a retinoic acid receptor agonist and a glial cell line-derived neurotrophic factor Do.
  • a ureteral bud-like organoid culture is obtained by the method of the present application, and (6-1) a step of cutting out the tip region of the ureteral bud-like organoid to obtain a ureteral bud-like tip tissue, (6-2) Ureteral bud-like apical tissue is suspended in the presence of GSK3 ⁇ inhibitor, BMP inhibitor, fibroblast growth factor, retinoic acid receptor agonist and glial cell line-derived neurotrophic factor, and There is provided a method of maintaining a urethra bud-like organoid comprising the steps of: inducing a tube-like organoid, and (6-3) repeating steps (6-1) and (6-2).
  • the present application also provides a ureteral bud-like tissue culture by the method of the present application, and further separating the tissue in the (5'-1) ureteral bud-like tissue culture into single cells; And c) three-dimensionally culturing the single cell in the presence of glial cell line-derived neurotrophic factor, fibroblast growth factor, retinoic acid receptor agonist, GSK3 ⁇ inhibitor and Yes-associated protein (YAP) activity inhibitor.
  • YAP Yes-associated protein
  • the present application also obtains ureteral bud-like apical tissue by the method of the present application, and (6 ') ureteral bud-like apical tissue as a GSK3 ⁇ inhibitor, BMP inhibitor, fibroblast growth factor, retinoic acid receptor agonist and glia.
  • a method of inducing a ureteral bud-like organoid comprising the step of suspension culture in the presence of a cell line-derived neurotrophic factor.
  • the present application also provides a method of obtaining ureteral bud-like tip tissue by the method of the present application, and further separating (6 ′ ′-1) ureteral bud-like tip tissue into single cells, and (6 ′ ′-2)
  • a method of inducing collecting duct precursor cells comprising the step of adherent culture of one cell in the presence of a Wnt signal inhibitor and a TGF ⁇ signal inhibitor. That is, according to this aspect, a method for inducing collecting duct precursor cells from pluripotent stem cells is provided.
  • the present application provides the method as set forth in the claims.
  • the method of the present application makes it possible to produce ureteral bud-like tissue relatively easily and efficiently.
  • APS anterior primordial streak cells
  • UB ureteral buds
  • NP nephron progenitor cells
  • Treatment with FGF8 and TTNPB induces anterior primitive streak cells (APS) to anterior intermediate mesoderm-like cells (Anterior IM) but not anterior segmental mesoderm cells (PSM).
  • the scale bar is 100 ⁇ m.
  • the scale bar is 100 ⁇ m. Quantification of differentiation into cells expressing anterior intermediate mesoderm markers (OSR1, GATA3, LHX1 and HOXB4) by flow cytometry analysis.
  • the induction rate of GATA3 + cells was 69.1 ⁇ 13.9% by treatment with BMP4 in the anterior primitive streak stage and LDN193189 in the anterior middle mesoderm stage.
  • the induction rate of GATA3 + cells was 69.6 ⁇ 5.7% by the treatment that included BMP4 in the anterior primitive streak stage and LDN193189 in the anterior middle mesoderm stage.
  • E A diagram of concentration gradients of Wnt and BMP signals along the dorsal-ventral axis in mouse embryos.
  • Wnt and BMP proteins are secreted from superficial ectoderm (dorsal), and BMP is also secreted from lateral lamina mesoderm (ventral).
  • Wolff's tube (WD; OSR1 - GATA3 + ) is formed dorsal to the anterior intermediate mesoderm (IM; OSR1 + GATA3 + ).
  • the total number of cells before treatment, the total number of cells after treatment with FGF8 alone, the total number of cells after treatment with GDNF alone, and the total number of cells after treatment with a combination of FGF8 and GDNF are respectively 1.44 ⁇ 0.29 ⁇ 10 5 / cm 2 , 4.69 ⁇ 0.65 ⁇ 10 5 / cm 2 , 2.37 ⁇ 0.56 ⁇ 10 5 / cm 2 and 5.44 ⁇ 0.54 ⁇ 10 5 / cm 2 .
  • 3D45 cells were used. Immunostaining analysis of Ki67 and GATA3. The scale bar is 100 ⁇ m. KhES3 cells were used. Immunostaining analysis of Ki67, GATA3 and RET. The scale bar is 100 ⁇ m. 3D45 cells were used. Immunostaining analysis of Wolff's canal markers. The scale bar is 100 ⁇ m. 3D45 cells were used.
  • the scale bar is 300 ⁇ m. 511-3E cells were used. Immunostaining analysis of aggregates GATA3 (red) and E-CADHERIN (green) on day 2. Cells negative for mature Wolff cell markers are separated from Wolff cells in aggregates. The scale bar is 300 ⁇ m. 511-3E cells were used. Morphology of day 2 aggregates before and after pipetting to remove non-Wolf tube cells. Arrows and arrowheads in the middle panel indicate isolated Wolff and non-Wolf duct cells, respectively. The scale bar is 300 ⁇ m. 511-3E cells were used.
  • the scale bar is 100 ⁇ m. 511-3E cells were used. The first 7 days of morphological changes in mature Wolff tube aggregates after pipetting and embedding in Matrigel. The scale bar is 300 ⁇ m. 511-3E cells were used. Three-dimensional image of a 7-day construct made from 511-3E cells. 511-3E cells were used. Immunostaining analysis of ureteral bud markers in day 9 constructs. The scale bar is 100 ⁇ m. 3D45 cells were used.
  • CK19 red which is a marker of the trunk of the ureteral bud
  • RET green which is a marker of the tip of UP
  • PAX2 and GATA3 blue which are common ureteral bud markers Immunostaining analysis.
  • the scale bar is 100 ⁇ m. 3D45 cells were used.
  • Protocol to induce differentiation of hPSCs into branching ureteral bud tissue APS, anterior primordial streak; Anterior IM, anterior intermediate mesoderm; WD, Wolff's tube; UB, ureteral buds.
  • Y 10 ⁇ M Y-27632; A, 100 ng / ml activin A; C3, 3 ⁇ M CHIR99021; B, 10 ng / ml BMP4; F8, 200 ng / ml FGF8; TT, 0.1 ⁇ M TTNPB; A83, 1 ⁇ M A83-01; ⁇ M LDN 193189; C1, 1 ⁇ M CHIR99021; G, 100 ng / ml GDNF; F1, 200 ng / ml FGF1; Tzv, 10 ⁇ M Thiazovivin.
  • the scale bar is 100 ⁇ m.
  • OSR1-GFP knock-in hiPSC strain (3D45) (OSR1-GFP, green; GATA3, red; PAX2, purple), hiPSC strain (511-3E) (GATA3, green; mCherry, red; PAX2, which constitutively expresses mCherry) Purple), forward intermediate to the day 4 differentiated cells from hiPSC strain (CiRA00009) (GATA3, green; PAX2, purple) and hESC strain (KhES3) (GATA3, red; PAX2, green) established from ADPKD patients Immunostaining analysis of mesodermal markers.
  • Protocol to induce differentiation of hPSCs into primary Wolff cells Anterior PS, anterior primordial streak; Anterior IM, anterior intermediate mesoderm; ND, Wolff canal. Immunostaining analysis of RET (green) and GATA3 (red) upon addition of TTNPB (left) or AGN 193109 (right) to anterior intermediate mesodermal cells. The addition of AGN 193109 reduced the expression of RET, a marker of Wolff's ductal cells.
  • the scale bar is 100 ⁇ m.
  • the scale bar is 100 ⁇ m. Improved differentiation induction protocol from hPSCs to mature Wolff tube aggregates. Anterior PS, anterior primordial streak; Anterior IM, anterior intermediate mesoderm; ND, Wolff canal. Immunostaining analysis of Wolff cell marker in day 2 aggregates before and after removal of non-Wolf cells.
  • the scale bar is 300 ⁇ m.
  • Anterior PS anterior primordial streak
  • Anterior IM anterior intermediate mesoderm
  • ND Wolff's tube
  • UB ureteral buds. Budding of polarized ureteral buds from Wolff's epithelial cell mass. The first 4 days of morphological changes in mature Wolff cell aggregates in Matrigel-containing medium. Immunostaining analysis of PAX2 (green), LAMININ (red), EZRIN (white) showing the production of polar ureteral buds.
  • Protocol for differentiating ureteral bud tissue from hPSC and producing ureteral organoid from isolated ureteral bud tissue Anterior PS, anterior primordial streak; Anterior IM, anterior intermediate mesoderm; ND, Wolff's tube; UB, ureteral buds. Schematic diagram showing the progression of branching of the ureteral bud tissue isolated from mature Wolff cell aggregates. First 10 days of morphological change in ureteral bud tissue mechanically isolated from mature Wolff cell aggregates and suspended in Matrigel-containing medium. Immunostaining analysis of PAX2 (green) and CK8 (red) in day 14 constructs.
  • Protocol for differentiating ureteral bud tissue from hPSC and maintaining ureteral organoid Anterior PS, anterior primordial streak; Anterior IM, anterior intermediate mesoderm; ND, Wolff's tube; UB, ureteral buds.
  • the schematic diagram which shows that the ureteral organoid can be maintained by cutting out the tip region of the ureteral organoid and further culturing it.
  • the first 7-day morphological change in the tip area of the ureteral bud tissue (uricular tip tissue) cut once, twice or three times from the produced ureteral organoids.
  • Protocol for expanding culture of ureteral bud tip tissue using ureteral bud tissue differentiated from hPSC Anterior PS, anterior primordial streak; Anterior IM, anterior intermediate mesoderm; ND, Wolff's tube; UB, ureteral buds. Schematic diagram showing that ureteral bud tissue is separated into single cells together with mature Wolff cell aggregate and three-dimensional culture on hydrogel. Microscopic image of the 7th day structure. Immunostaining analysis of RET (green) and GATA3 (red) in day 7 constructs.
  • Protocol for producing ureteral organoids from expanded cultured ureteral bud tip tissue Anterior PS, anterior primordial streak; Anterior IM, anterior intermediate mesoderm; ND, Wolff's tube; UB, ureteral buds. Schematic diagram showing that ureteral bud tissue is separated into single cells together with mature Wolff cell aggregate, three-dimensional culture on hydrogel, and then suspension culture in Matrigel-containing medium. The microscope image of the produced structure in the 14th day. Immunostaining analysis of EZRIN (green), LAMININ (red), CK8 (green), GATA3 (red) on day 14 constructs.
  • Protocol for inducing differentiation of collecting duct precursor cells Immunostaining analysis of aquaporin 2 (AQP2; red) showing differentiation to collecting duct precursor cells.
  • a specific type of cell means a cell group including the cell of the type unless otherwise specified, and the cell group is a type of cell identified. Cell types other than cells may be included.
  • a culture of a certain type of cell means a culture of a cell group in which the cell of the type is included, and cells other than the specified type of cell may be included.
  • a certain type of cell aggregate means a cell aggregate containing the cell of the type unless otherwise specified, and the cell aggregate is other than cells of the specified type. Cells may be included.
  • pluripotency capable of differentiating into all cells present in a living body, and also having proliferation ability
  • ES embryonic stem
  • JA Thomson et al. (1998), Science 282: 1145-1147; JA Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 7844-7848.
  • JA Thomson et al. (1996), Biol. Reprod., 55: 254-259; JA Thomson and VS Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38: 133-165)
  • ntES nuclear transfer Embryonic stem
  • iPS induced pluripotent stem
  • iPS induced pluripotent stem cells
  • ES cells and iPS cells are preferably used.
  • the “ROCK inhibitor” is not particularly limited as long as it can suppress the function of Rho-kinase (ROCK).
  • ROCK Rho-kinase
  • Y-27632 eg, Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983.
  • (2000) Narumiya et al., Methods Enzymol. 325, 273-284
  • Fasudil / HA 1077 e.g. see Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)
  • SR3677 e.g. Feng Y.
  • ROCK inhibitors for example, US Patent Application Publication Nos. 2005/0209261, 2005/0192304, 2004/0014755, and 2004/0002508,. 2004/0002507, 2003/0125344, 2003/0087919, and WO 2003/062227, 2003/059913, 2003/062225, 2002/076976. No. 2004/039796).
  • a ROCK inhibitor one or more ROCK inhibitors may be used.
  • Preferred ROCK inhibitors include Y-27632, Fasudil / HA1077, SR3677, GSK269962 and H-1152.
  • the “activator of activin receptor-like kinase-4, 7” is a substance having an activating effect on ALK-4 and / or ALK-7, and preferably activin, particularly activin A is used.
  • GSK3 ⁇ inhibitor is defined as a substance that inhibits the kinase activity of GSK3 ⁇ protein (eg, the ability to phosphorylate ⁇ -catenin), and many substances are already known, for example, BIO (indirubin derivative) Also known as GSK-3 ⁇ inhibitor IX; 6-bromoindirubin 3'-oxime), maleimide derivative SB216763 (3- (2,4-dichlorophenyl) -4- (1-methyl-1H-indol-3-yl) ) -1H-pyrrole-2,5-dione), SB 415 286 (3-[(3-chloro-4-hydroxyphenyl) amino] -4- (2-nitrophenyl) -1H-pyrrole-2,5-dione) GSK-3 ⁇ inhibitor VII (4-dibromoacetophenone), which is a phenyl ⁇ -bromomethyl ketone compound, L803-mts (aliased as GSK-3 ⁇ peptide inhibitor; Myr-mt
  • FGF1 to FGF23 are known and may be appropriately selected from these known substances.
  • FGF8 matures or induces aggregation of Wolf's duct and ureter after induction of Wolf's duct cells.
  • FGF1 is preferably used in the fourth, fifth and sixth 'stages, which are the stages of induction into bud tissue.
  • retinoic acid receptor (RAR) agonist chemically synthesized retinoid even with naturally occurring retinoid, retinoic acid receptor agonist compound having no retinoid skeleton and retinoic acid receptor agonist activity It may be a natural product.
  • natural retinoids having activity as RAR agonists include retinoic acid (the stereoisomers all-trans-retinoic acid (all-trans-RA) and 9-cis-retinoic acid (9-cis-RA) are known) Can be mentioned.
  • Chemically synthesized retinoids are known in the art (US Pat. Nos. 5,234,926, 4,326,055, etc.).
  • retinoic acid receptor agonist compounds having no retinoid skeleton include Am80, AM580, TTNPB, AC55649.
  • natural products having retinoic acid receptor agonist activity include honokiol and magnolol (Bulletin of the Institute of Biofunction Development 9: 55-61, 2009).
  • the RAR agonist used in step 2 is preferably retinoic acid, AM 580 (4-[[5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl] carboxamide] benzoic acid ), TTNPB (4-[[E] -2- [5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl] -1-propenyl] benzoic acid), AC55649 (4'-octyl- [1,1'-biphenyl] -4-carboxylic acid), more preferably TTNPB.
  • TGF ⁇ inhibitor is a substance that inhibits signal transduction from TGF ⁇ receptor binding to SMAD, and a substance that inhibits binding to receptor ALK family or phosphorylation of SMAD by ALK family
  • the agent is not particularly limited as long as it is a substance that inhibits lysozyme, and for example, Lefty-1 (NCBI Accession No. includes mouse: NM — 010094, human: NM — 020997 is exemplified), SB431542, SB202190 (above, RKLindemann et al., Mol.
  • A-83-01 ((3- (6-Methyl) -2-pyridinyl) -N-phenyl-4- (4-quinolinyl) -1H-pyrazole-1-carbothioamide), WO 2009146408)
  • ALK5 inhibitor II (2- [3- [6-methylpyridin-2-yl] -1H-pyrazol-4-yl] -1,5-naphthyridine), TGF ⁇ RI kinase inhibitor VIII (6- [2-te t- butyl-5- [6-methyl - pyridin-2-yl]-1H-imidazol-4-yl] - quinoxaline) and their derivatives are exemplified.
  • it may be A-83
  • BMP inhibitors are proteinaceous inhibitors such as Chordin, Noggin, Follistatin, Dorsomorphin 6- [4- (2-piperidin-1-yl-ethoxy) phenyl] -3-pyridin-4-yl-pyrazolo [ 1,5-a] pyrimidine, its derivative (P. B. Yu et al. (2007), Circulation, 116: II_60; PB Yu et al. (2008), Nat. Chem. Biol., 4: 33-41 J. Hao et al.
  • LDN-193189 (4- (6- (4- (piperazin-1-yl) phenyl) pyrazolo [1,5-a pyrimidin-3-yl) quinoline) is exemplified, and preferably LDN-193189 is used.
  • the “Wnt signal inhibitor” is not particularly limited as long as it is a substance that inhibits the signal transduction pathway mediated by Wnt, and examples thereof include IWR-1, IWP-2, IWP-3, IWP-4, 2- (4- (4-) Trifluoromethylphenyl) -7,8-dihydro-5H-thiopyrano [4,3-d] pyrimidin-4 (3H) -one (XAV939), G-CSF, IGFBP4, Dkk1, Cerberus, anti-Wnt antibody, Wnt agonist (Wnt receptor inhibitors), soluble Wnt receptor proteins (Frzb-1 etc.), dominant negatives, etc. are exemplified, and IWR-1 is preferably used.
  • the culture temperature is, but not limited to, about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C.
  • the culture is performed under an atmosphere of CO 2 -containing air, and the CO 2 concentration is Preferably, it is about 2 to 5%.
  • Pluripotent stem cells were preferably added with a coating for pluripotent stem cell culture, such as laminin coating, commercially available in a culture vessel coated with iMatrix silk, ROCK inhibitor, before being provided to the method of the present application.
  • the culture is carried out for 12 to 48 hours, for example, about 24 hours, in the pluripotent stem cell maintenance medium.
  • the pluripotent stem cells for maintenance media can be used commercially available ones as appropriate, for example StemFit (TM) AK02N medium (Ajinomoto Co.) is exemplified.
  • the concentration in the medium is 0.1 ⁇ M to 1 mM, preferably 1 ⁇ M to 100 ⁇ M, more preferably 5 ⁇ M to 20 ⁇ M, for example about 10 ⁇ M.
  • the culture medium can be prepared by appropriately adding a factor necessary for each stage to a basal culture medium used for culturing animal cells.
  • a basal medium for example, MEM Zinc Option medium, IMEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, DMEM / F12 medium, Ham's F12 medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, and a mixed medium thereof are included.
  • the basal medium may contain serum (eg, fetal bovine serum (FBS)) or may be serum free.
  • FBS fetal bovine serum
  • albumin transferrin, KnockOut Serum Replacement (KSR) (serum replacement in ES cell culture) (Thermo Fisher Scientific), N2 supplement (Thermo Fisher Scientific), B27 supplement (Thermo Fisher Scientific), fatty acid , Insulin, collagen precursor, trace elements, one or more serum substitutes such as 2-mercaptoethanol, 3'-thiolglycerol etc., lipid, amino acid, L-glutamine, GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific), One or more substances such as non-essential amino acids (NEAA), vitamins, growth factors, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts, and the like, or other common animal culture media It may contain one or more substances added.
  • KSR KnockOut Serum Replacement
  • the DMEM / F12 medium as basal medium L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium, sodium selenium, insulin, serum-free medium NaHCO 3 and transferrin were added It is exemplified that the method of the present application is carried out using Essential 6 (TM) medium (Thermo Fisher Scientific Inc), which is In one embodiment, at stage 6 ', it is exemplified that the method of the present application is performed using DMEM / F12 B27 vitA free medium as a basal medium.
  • TM Essential 6
  • the method of the present application is performed using DMEM / F12 B27 vitA free medium as a basal medium.
  • the induction of the target cell can be confirmed by the expression of the marker on the cell.
  • the expression of the marker can be confirmed by known methods such as immunostaining and FACS.
  • the first stage of the present application is the step of inducing anterior primordial streak cells from pluripotent stem cells.
  • pluripotent stem cells are two-dimensionally cultured in the presence of an activator of activin receptor kinase 4, 7 and a GSK3 inhibitor.
  • BMP4 is further present.
  • the concentration of activin A in the medium is usually 1 ng / ml to 10 ⁇ g / ml, preferably 10 ng / ml to 1 ⁇ g / ml, more preferably 50 ng / Ml to 200 ng / ml, for example about 100 ng / ml.
  • the concentration in the medium is usually 0.03 ⁇ M to 300 ⁇ M, preferably 0.3 ⁇ M to 30 ⁇ M, more preferably 1.5 ⁇ M to 6 ⁇ M, for example about 3 ⁇ M.
  • the concentration of BMP4 in the medium is 0.1 ng / ml to 1 ⁇ g / ml, preferably 1 ng / ml to 100 ng / ml, more preferably 5 ng / ml to 20 ng / ml, for example about 10 ng / ml.
  • culture may be carried out by changing only the medium on a pluripotent stem cell culture plate.
  • the culture period is from 12 hours to 48 hours, for example, about 24 hours.
  • Generation of anterior primordial streak (APS) cells can be confirmed by expression of BRACH YURY in the cells.
  • the second stage of the present application is the step of inducing Anterior Intermediate Mesoderm (Anterior IM) from anterior primitive streak cells.
  • the anterior primitive streak cells may be cells obtained at the first stage, or cells obtained by another known method may be used.
  • anterior primitive streak cells are cultured in two dimensions in the presence of fibroblast growth factor, retinoic acid receptor agonist, TGF ⁇ inhibitor, and BMP inhibitor.
  • the concentration in the medium is usually 2 ng / ml to 20 ⁇ g / ml, preferably 20 ng / ml to 2 ⁇ g / ml, more preferably 100 ng / ml to 400 ng / ml, for example about 200 ng / ml. It is ml.
  • TTNPB retinoic acid receptor agonist
  • its concentration in the medium is usually 0.001 ⁇ M to 10 ⁇ M, preferably 0.01 ⁇ M to 1 ⁇ M, more preferably 0.05 ⁇ M to 0.2 ⁇ M, for example about 0.1 ⁇ M is there.
  • A83-01 When used as a TGF ⁇ inhibitor, its concentration in the medium is usually 0.01 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 0.1 ⁇ M to 10 ⁇ M, more preferably 0.5 ⁇ M to 2 ⁇ M, for example about 1 ⁇ M.
  • LDN193189 When LDN193189 is used as a BMP inhibitor, its concentration in the culture medium is usually 0.001 ⁇ M to 10 ⁇ M, preferably 0.01 ⁇ M to 1 ⁇ M, more preferably 0.05 ⁇ M to 0.2 ⁇ M, for example about 0.1 ⁇ M.
  • cultivation is carried out for a total of 2 days to 6 days, preferably about 3 days to about 4 days.
  • the culture medium of the cell culture obtained by the first stage in the first half of the second stage for example, about 2 days, or by another method may be exchanged with a culture medium for the second stage and cultured.
  • the culture plate is transferred to a cell culture plate coated with an extracellular matrix protein such as Matrigel and cultured.
  • culture is continued preferably by further adding a ROCK inhibitor such as Y-27632 to the medium.
  • the concentration of Y-27632 in the culture medium may be the same as the concentration when culturing pluripotent stem cells before the start of the first stage.
  • anterior intermediate mesodermal cells can be confirmed, for example, by the expression of OSR1 and GATA3 in the cells.
  • the expression of other intermediate mesodermal cell markers PAX2, LHX1 and HOXB4 may be confirmed alone or in combination.
  • the third stage of the present application is the step of deriving early Wolff cell cells from anterior intermediate mesodermal cells.
  • the anterior intermediate mesodermal cells are cells obtained at the second stage.
  • anterior intermediate mesodermal cells are cultured in two dimensions in the presence of GSK3 ⁇ inhibitor, BMP inhibitor, fibroblast growth factor and glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF).
  • the medium may further contain a retinoic acid receptor agonist.
  • CHIR 99021 When CHIR 99021 is used as a GSK3 ⁇ inhibitor, its concentration in the culture medium is 0.01 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 0.1 ⁇ M to 10 ⁇ M, more preferably 0.5 ⁇ M to 2 ⁇ M, for example about 1 ⁇ M.
  • LDN193189 When LDN193189 is used as a BMP inhibitor, its concentration in the culture medium is usually 0.001 ⁇ M to 10 ⁇ M, preferably 0.01 ⁇ M to 1 ⁇ M, more preferably 0.05 ⁇ M to 0.2 ⁇ M, for example about 0.1 ⁇ M.
  • the concentration in the medium is usually 2 ng / ml to 20 ⁇ g / ml, preferably 20 ng / ml to 2 ⁇ g / ml, more preferably 100 ng / ml to 400 ng / ml, for example about 200 ng It is / ml.
  • the concentration of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) in the medium is usually 1 ng / ml to 10 ⁇ g / ml, preferably 10 ng / ml to 1 ⁇ g / ml, for example about 100 ng / ml.
  • GDNF glial cell line-derived neurotrophic factor
  • TTNPB retinoic acid receptor agonist
  • its concentration in the culture medium is usually 0.001 ⁇ M to 10 ⁇ M, preferably 0.01 ⁇ M to 1 ⁇ M, more preferably 0.05 ⁇ M to 0.2 ⁇ M, for example about 0.1 ⁇ M .
  • cells may be prepared using a cell culture plate coated with an extracellular matrix protein such as Matrigel (TM) as in the second half of the second stage.
  • the culture period may be 24 hours to about 4 days, for example about 48 hours.
  • the generation of early Wolff cells can be confirmed by cells expressing GATA3 and not expressing OSR1.
  • the expression of other Wolffian markers PAX2, LHX1 and Cytokeratin 8 may be further examined.
  • the initial Wolff cells obtained in this step can be cryopreserved.
  • Known methods can be used for freezing and sleeping of cells.
  • the initial Wolff cells obtained in the third stage are washed with PBS, dissociated from the cell culture plate with a cell separation solution (eg Accutase), and centrifuged to remove the supernatant.
  • a cell separation solution eg Accutase
  • a cryopreservation solution eg, stem cell banker
  • a cryopreservation solution containing DMSO can be used as the cryopreservation solution.
  • examples include selvan cars (Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.), bang bang cars (Nippon Genetics Co., Ltd.), TC protectors (DS Pharma Biomedical Co., Ltd.), CP-1 (Far East Pharmaceutical Industries Co., Ltd.), etc. Ru.
  • a method of allowing the frozen cells to sleep a method of rapidly thawing frozen initial Wolff cells in a 37 ° C. water bath or the like, centrifuging a cryopreservation solution, and suspending it in a culture medium is exemplified.
  • Initial Wolff cells that have been cryopreserved and made to sleep in the methods of the present application can be used as initial Wolff cells in the following embodiments.
  • the fourth stage is a step of inducing mature Wolff cell aggregates from the initial Wolff cells obtained in the third stage.
  • the initial Wolff cells may be cryopreserved by the method of the present application and then wake up.
  • the initial Wolff cells in the presence of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), fibroblast growth factor, retinoic acid receptor agonist, GSK3 ⁇ inhibitor and Yes-associated protein (YAP) activity inhibitor Incubate in suspension.
  • GDNF glial cell line-derived neurotrophic factor
  • fibroblast growth factor fibroblast growth factor
  • retinoic acid receptor agonist retinoic acid receptor agonist
  • GSK3 ⁇ inhibitor Yes-associated protein
  • the concentration of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) at the fourth stage is usually 1 ng / ml to 10 ⁇ g / ml, preferably 10 ng / ml to 1 ⁇ g / ml, more preferably 50 ng / ml to 200 ng / ml, for example about 100 ng It is / ml.
  • GDNF glial cell line-derived neurotrophic factor
  • the fibroblast growth factor is FGF1
  • its concentration in the medium is usually 2 ng / ml to 20 ⁇ g / ml, preferably 20 ng / ml to 1 ⁇ g / ml, more preferably 100 ng / ml to 400 ng / ml, for example about 200 ng It is / ml.
  • TTNPB retinoic acid receptor agonist
  • its concentration in the medium is usually 0.001 ⁇ M to 10 ⁇ M, preferably 0.01 ⁇ M to 1 ⁇ M, more preferably 0.05 ⁇ M to 0.2 ⁇ M, for example about 0.1 ⁇ M is there.
  • the concentration in the medium is usually 0.03 ⁇ M to 300 ⁇ M, preferably 0.3 ⁇ M to 30 ⁇ M, more preferably 1.5 ⁇ M to 6 ⁇ M, for example about 3 ⁇ M.
  • YAP activity inhibitor As a Yes-associated protein (YAP) activity inhibitor, a known one may be used as appropriate, and examples thereof include Thiazovivin having both YAP inhibitory activity and ROCK inhibitory activity. When Thiazovivin is used, its concentration in the culture medium is 0.1 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 1 ⁇ M to 50 ⁇ M, more preferably 5 ⁇ M to 20 ⁇ M, for example about 10 ⁇ M.
  • a cell non-adherent cell culture plate is one that has not been artificially treated (eg, coated with an extracellular matrix etc.) for the purpose of improving the adhesion between the cell culture plate and the cells, or artificially It can be carried out using a treatment that suppresses adhesion (for example, a coating treatment with polyhydroxyethyl methacrylate (poly-HEMA)).
  • a treatment that suppresses adhesion for example, a coating treatment with polyhydroxyethyl methacrylate (poly-HEMA)).
  • the culture period of the fourth stage may be 24 hours to 72 hours, for example, about 48 hours.
  • aggregates of mature Wolff cell cells are induced.
  • the size of the mature Wolff cell aggregate is usually 100 to 1000 ⁇ m, preferably about 300 ⁇ m.
  • the generation of mature Wolff cells can be confirmed by the expression of CK8, PAX2 and E-CADHERIN.
  • the total of the obtained cells is about 50% or more, preferably about 60%. %, For example, about 70% or so, mature Wolff cells can be obtained.
  • mature Wolff cells form aggregates in which only mature Wolff cells are mainly accumulated in suspension culture, the mature Wolff cell mass can be easily physically isolated using a pipetman or the like under a microscope be able to.
  • Stage 4 ' The stage 4' is a step of inducing mature Wolff cell aggregates from the initial Wolff cells obtained in Stage 3.
  • the initial Wolff cells may be cryopreserved by the method of the present application and then wake up.
  • the initial Wolff cells are in the presence of GSK3 beta inhibitor, BMP inhibitor, fibroblast growth factor, retinoic acid receptor agonist, glial cell line derived neurotrophic factor (GDNF) and preferably ROCK inhibitor Incubate in suspension.
  • the medium used is the medium used in the third stage, or the medium used in the third stage to which a ROCK inhibitor is added. ROCK inhibitors are used to suppress apoptosis.
  • the concentration in the medium is 0.1 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 1 ⁇ M to 50 ⁇ M, more preferably 5 ⁇ M to 20 ⁇ M, for example about 10 ⁇ M.
  • the initial Wolff cells are cultured in a cell non-adherent culture plate as in the fourth stage.
  • the culture period of the 4 'stage may be 24 hours to 72 hours, for example, about 48 hours.
  • aggregates of mature Wolff cell cells are induced.
  • the generation of mature Wolff cells can be confirmed by the expression of CK8, PAX2 and E-CADHERIN.
  • the generated mature Wolf tube cells mainly form aggregates in which only mature Wolf tube cells are accumulated in suspension culture, the mature Wolf tube cell mass can be easily physically isolated using a pipetman or the like under a microscope be able to.
  • the fifth stage is a step of inducing the mature Wolff cell aggregate obtained in the fourth stage into ureteral bud-like tissue.
  • mature Wolff cell aggregates are derived from glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), fibroblast growth factor, retinoic acid receptor agonist, GSK3 ⁇ inhibitor and Yes-associated protein (YAP) activity inhibitor
  • GDNF glial cell line-derived neurotrophic factor
  • fibroblast growth factor fibroblast growth factor
  • retinoic acid receptor agonist retinoic acid receptor agonist
  • GSK3 ⁇ inhibitor Yes-associated protein
  • a three-dimensional scaffold material various things for three-dimensional three-dimensional structure construction of cultured cells are known, and are also marketed, and it is not particularly limited.
  • collagen-based materials, polymer-based materials such as polycaprolactone and polyglycolic acid, or complexes thereof can be used.
  • the form thereof is not particularly limited, and examples thereof include a sponge-like structure.
  • the three-dimensional scaffold material may use a sample derived from a living body as a material (for example, extracellular matrix, basement membrane, etc.).
  • Matrigel TM Becton Dickinson
  • type I collagen gel and the like typeIV collagen gel.
  • Matrigel TM basement membrane matrix is solubilized basement membrane preparation extracted from Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma rich in extracellular matrix proteins, primarily of laminin, collagen IV, entactin, and heparan sulfate proteoglycan Configured In addition, other growth factors such as TGF- ⁇ , fibroblast growth factor, tissue plasminogen activator, EHS and the like.
  • EHS Engelbreth-Holm-Swarm
  • the three-dimensional scaffolds used in the fifth stage of the present application, Matrigel TM basement membrane matrix (Matrigel) are preferably used.
  • Matrigel When using Matrigel as a three-dimensional scaffold material, Matrigel is usually diluted 1: 0.5 to 1: 2, for example, about 1: 1 with the culture medium.
  • the culture period of the fifth stage may be 5 to 30 days, preferably 7 to 20 days, for example, about 15 days.
  • the induction of ureteral bud-like cells can be confirmed by expression of markers such as GATA3, RET, PAX, CALB1.
  • the size of the obtained ureteral bud-like tissue is usually 30 to 200 ⁇ m, preferably about 50 ⁇ m.
  • one ureteral bud-like tissue usually branches 2-3 times. The formation of a ureteral bud-like tissue having a branched structure can be confirmed under a microscope.
  • the 5'th stage is a step of inducing the mature Wolff cell aggregate obtained in the 4'th stage into ureteral bud-like tissue.
  • mature Wolff cell aggregates are suspended in culture in the presence of GSK3 ⁇ inhibitor, BMP inhibitor, fibroblast growth factor, retinoic acid receptor agonist and glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) .
  • GDNF glial cell line-derived neurotrophic factor
  • aggregates of mature Wolff cell cells obtained in the 4 'stage are isolated and suspended and cultured in a medium containing a low concentration of three-dimensional scaffold.
  • the culture medium used is the one used in the third stage to which a three-dimensional scaffold material is added.
  • the three-dimensional scaffold material used is the same as that used in the fifth stage.
  • the concentration of Matrigel in the culture medium is usually 1 to 5%, for example about 2%.
  • the culture period of the 5 'stage may be 1 to 15 days, preferably 3 to 10 days, for example, about 6 days.
  • induction of ureteral bud-like cells can be confirmed by expression of markers such as GATA3, RET, PAX, CALB1.
  • markers such as GATA3, RET, PAX, CALB1.
  • the formation of a ureteral bud-like tissue having a branched structure can be confirmed under a microscope.
  • the sixth stage is a step of inducing ureteral bud-like organoid from ureteral bud-like tissue.
  • the ureteral bud-like tissue may be obtained by the method of the present application or may be obtained by another known method.
  • the culture medium and three-dimensional scaffolds used are the same as those used in the fifth stage.
  • uricular bud-like organoid means a ureteral-bud-like self-assembled structure having a branched structure obtained by isolation and culture.
  • the size of the ureteral bud-like organoid is usually about 100 to about 1000 ⁇ m.
  • one ureteral bud-like organoid usually branches 3-5 times.
  • the induction of ureteral bud-like tissue can be confirmed by the expression of markers such as GATA3, RET, PAX, CALB1. That the ureteral bud-like tissue has a branched structure can be confirmed under a microscope.
  • the concentration of Matrigel in the culture medium is usually 1 to 5%, for example about 2%.
  • Culturing is carried out for 5 to 30 days, preferably 7 to 20 days, for example about 14 days.
  • the formation of ureteral bud-like organoid can be confirmed under a microscope.
  • the polarity of the ureteral bud-like organoid can be confirmed by the expression of LAMININ and EZRIN.
  • the seventh stage is the step of maintaining the ureteral bud-like organoid. Cutting out the tip region of ureteral bud-like organoid to obtain ureteral bud-like apical tissue, and obtaining the obtained ureteral bud-like apical tissue with GSK3 ⁇ inhibitor, BMP inhibitor, fibroblast growth factor, retinoic acid receptor
  • the ureteral bud-like organoid is maintained by repeating the process of suspension culture in medium containing low concentrations of three-dimensional scaffold in the presence of agonist and glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF).
  • the ureteral bud-like organoid may be obtained by the method of the present application or may be obtained by another known method.
  • the step of the seventh stage can be repeated at least three times or more, and the number of repetitions is not particularly limited, and the desired number of times may be repeated.
  • the culture medium and three-dimensional scaffolds used are the same as those used in the fifth stage.
  • uricular bud-like tip tissue means a tissue obtained by cutting off the tip portion of the branch of a ureteric bud-like organoid.
  • the size of the ureteral bud tip tissue is usually 30 to 200 ⁇ m, preferably about 50 ⁇ m.
  • Culturing is performed in one step, for 1 to 15 days, preferably 3 to 10 days, for example, about 7 days.
  • the formation of branched ureteral bud-like tissue can be confirmed under a microscope.
  • the polarity of the ureteral bud-like tissue can be confirmed by the expression of LAMININ and EZRIN.
  • the sixth stage is a process of expanding and culturing the ureteral bud-like tip tissue.
  • YAP Yes-associated protein 3.
  • the ureteral bud-like tissue culture is separated into single cells, seeded on a hydrogel obtained by diluting a three-dimensional scaffold with a culture medium, and cultured three-dimensionally.
  • the ureteral bud-like tissue culture may be obtained by the method of the present application or obtained by another known method.
  • the culture medium used is the same as that used in the fourth stage.
  • a conventionally known method of separating cell aggregates may be adopted as appropriate, for example, a method of mechanically separating, a separation solution having protease activity and collagenase activity (eg Accutase and Accumax etc.) or A separation method using a separation solution having only collagenase activity can be mentioned.
  • a method is used in which cell aggregates are dissociated using a separation solution (particularly preferably Accutase) having protease activity and collagenase activity, and the solution is mechanically finely dispersed into single cells.
  • the concentration of Matrigel in the hydrogel is usually 30% to 70%, for example about 50%.
  • Culturing is performed for 1 to 15 days, preferably 3 to 10 days, for example, about 6 days or about 7 days.
  • the induction of the ureteral bud tip tissue can be confirmed by the expression of markers such as CK8, GATA3 and RET.
  • Stage 7 ' is a step of inducing a ureteral bud-like organoid from the ureteral bud-like tip tissue obtained in the stage 6 '.
  • the ureteral bud-like apical tissue obtained at stage 6 ' is low in the presence of GSK3 beta inhibitor, BMP inhibitor, fibroblast growth factor, retinoic acid receptor agonist and glial cell line derived neurotrophic factor (GDNF)
  • Suspension culture is carried out in a medium containing a concentration of three-dimensional scaffold material.
  • the culture medium and three-dimensional scaffolds used are the same as those used in the fifth stage.
  • Culturing is carried out for 5 to 30 days, preferably 7 to 20 days, for example about 14 days.
  • the formation of ureteral bud-like organoid can be confirmed under a microscope.
  • the polarity of the ureteral bud-like organoid can be confirmed by the expression of LAMININ and EZRIN.
  • Stage 7 ′ ′ is a process for inducing ureteral bud-like tip tissue to collecting duct precursor cells.
  • the ureteral bud tip tissue obtained at stage 6 ' is isolated and adherent cultured in the presence of a Wnt signal inhibitor and a TGF ⁇ signal inhibitor.
  • the concentration in the medium is 0.01 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 0.1 ⁇ M to 10 ⁇ M, more preferably 0.5 ⁇ M to 2 ⁇ M, for example, about 1 ⁇ M.
  • A83-01 When used as a TGF ⁇ inhibitor, its concentration in the medium is usually 0.01 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 0.1 ⁇ M to 10 ⁇ M, more preferably 0.5 ⁇ M to 2 ⁇ M, for example about 1 ⁇ M.
  • the ureteral bud-like tissue is cultured in a cell culture plate coated with extracellular matrix protein, such as laminin. Culturing is performed for 1 to 15 days, preferably 3 to 10 days, for example, about 7 days. Generation of collecting duct precursor cells can be confirmed by expression of aquaporin 2 (AQP2) in the cells.
  • AQP2 aquaporin 2
  • hiPSCs human induced pluripotent stem cells
  • hESCs human embryonic stem cells
  • hiPSC / ESCs were maintained on iMatrix-511 silk (Nippi) coated cell culture plates by feeder free culture using Stem Fit AK02N medium (Takara). Cells were passaged every 4 days with 0.5 mM EDTA / PBS (Thermo Fisher Scientific) and regularly checked for mycoplasma contamination.
  • APS Forward primitive streak
  • hiPSC / ESC were seeded at a density of 2.5 ⁇ 10 4 cells / cm 2 in maintenance medium containing 10 ⁇ M Y-27632 and iMatrix-511 silk on tissue culture plates.
  • Cells are washed with PBS after 24 hours and Essential 6 medium with 100 ng / ml activin A (R & D Systems) and 3 ⁇ M CHIR99021 (Stem RD) with or without 10 ng / ml bone morphogenetic protein (BMP) 4 (PeproTech) Treated with (Thermo Fisher Scientific) for 24 hours.
  • BMP bone morphogenetic protein
  • anterior primordial streak cells were treated with 200 ng / ml fibroblast growth factor (FGF) 8 (Peprotech), 0.1 ⁇ M 4-[(E) -2- (5, 6, 7 , 8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl) -1-propenyl] -benzoic acid (TTNPB; Santa Cruz Biotechnology), 1 ⁇ M A83-01 and 0.1 ⁇ M LDN 193189 for 2 days. The cells were then replated at a density of 1 ⁇ 10 5 cells / cm 2 in anterior intermediate mesoderm induction medium containing 10 ⁇ M Y-27632 on Matrigel coated plates and incubated for an additional 24 hours.
  • FGF fibroblast growth factor 8
  • the cells were diluted 1 x 10 4 in Essential 6 medium containing 100 ng / ml GDNF, 200 ng / ml FGF1 (R & D Systems), 0.1 ⁇ M TTNPB, 3 ⁇ M CHIR99021 and 10 ⁇ M Thiazovivin (Santa Cruz Biotechnology) on low adhesion 96 well plates (Sumitomo Bakelite)
  • the cells were seeded at a density of cells / well and incubated for 2 days to induce mature Wolff tube aggregates.
  • the tip region of the prepared construct was mechanically excised and suspended in Essential 6 medium containing 1 ⁇ M CHIR99021, 0.1 ⁇ M LDN193189, 200 ng / ml FGF8, 100 ng / ml GDNF, 0.1 ⁇ M TTNPB and 2% Matrigel.
  • Expansion culture method of ureteral bud organoid The ureteral bud tissue was isolated by mechanical treatment at 37 ° C. for 3 minutes without mechanical isolation. The medium was suspended in DMEM / F12 + B27 (vit A free) and each factor (3 ⁇ M CHIR99021, 10 ⁇ M Thiazovivin, 200 ng / ml FGF1, 0.1 ⁇ M TTNPB, and 100 ng / ml GDNF). Single cells obtained from 5-6 aggregates were seeded on a hydrogel prepared on a 48-well plate and cultured. The hydrogel was prepared by incubating a DMEM / F12 + B27 (vit A free) medium containing 50% Matrigel for 30 minutes at 37 ° C. for coagulation.
  • Immunostained cells were fixed with 4% PFA / PBS for 20 minutes at 4 ° C. After washing with PBS, cells were blocked with 1% normal donkey serum (Millipore) and 3% bovine serum albumin (BSA; Nacalai Tesque) / PBST (PBS / 0.25% Triton X100) for 1 hour at room temperature. Primary antibodies were diluted in blocking solution and incubated with the samples overnight at 4 ° C. The secondary antibody was incubated for 1 hour at room temperature.
  • BSA bovine serum albumin
  • Flow Cytometry Cells were separated with Accutase and then fixed, permeabilized and blocked with BD Cytofix / Cytoperm kit (Becton Dickinson). The cells were then incubated for 30 minutes at room temperature with the primary antibody diluted 1: 100 in blocking solution. The cells were washed twice and then incubated for 30 minutes at room temperature with the secondary antibody diluted 1: 500 in blocking solution. Cells were then analyzed using a FACS Aria II cell sorter (Becton Dickinson).
  • OSR-GFP knock-in hiPSC strain (3D45) (SI Mae et al, Nat. Commun. 4 (2013) 1367) previously prepared was treated under a feeder-free culture containing 100 ng / ml activin A and 3 ⁇ M CHIR99021, Two-dimensional serum cultures induced BRACHYURY + cells (FIG. 5B). Modified the previously reported method (KM Loh et al, Cell 166 (2016) 451-467) to derive the anterior segmental mesoderm from the anterior primitive streak, and express the marker for the anterior segmental mesoderm, TBX6 Was observed (FIG. 5C).
  • anterior primitive streak cells differentiated into OSR1 + GATA3 + anterior intermediate mesoderm-like cells in the same treatment (FIG. 1B).
  • Previous reports have shown that anterior segmental mesoderm exposed to Wnt stimulation longer than anterior primitive streak can differentiate into nephron precursor (NP) cells after being induced to posterior intermediate mesoderm ( M. Takasato et al, Nature 526 (2015) 564-568).
  • NP nephron precursor
  • Previously reported protocol for inducing nephron progenitors from presegmental segment mesoderm A. Taguchi et al, Cell Stem Cell 14 (2014) 53-67; M. Takasato et al, Nature 526 (2015) 564- 568;.. R.
  • BMP signaling plays an important role in various aspects of kidney development (L. Oxburgh et al, Pediatr. Nephrol. 29 (2014) 531-536), the effects of BMP signaling on anterior primordial streak induction and forward Each stage of intermediate mesoderm induction was examined.
  • BMP4 was added at the stage of anterior primitive streak induction, the proportion of OSR1 + GATA3 + cells was increased to about 70% of the total number of cells obtained (FIGS. 1E, F and H).
  • addition of the BMP signal inhibitor LDN193189 at the anterior intermediate mesoderm induction stage did not change the induction efficiency of OSR1 + GATA3 + cells, and addition of BMP4 inhibited differentiation.
  • the anterior intermediate mesodermal cell differentiation protocol of the present application in addition to 3D45, hiPSC strain constitutively expressing mCherry (511-3E; F. Oceguera-Yanez et al, Methods 101 (2016) 43-55) HiPSC strains (CiRA00009; T. Ameku et al, Sci. Rep. 6 (2016) 30013) and human embryonic stem cell (hESC) strains (KhES3) established from patients with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) H. Suemori et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 345 (2006) 926-932) have been identified as being applicable to multiple hPSC strains. This result supports the robustness of the method of differentiation from hPSCs to anterior intermediate mesodermal cells in the present application (FIG. 6).
  • Inducible Wolff cells are formed from the anterior intermediate mesoderm to the dorsal side under the influence of Wnt proteins secreted from surface ectoderm (T. Obara-Ishihara et al, Development 126 (1999) 1103-1108) 2.), it is envisioned that exogenous WNT may be required for differentiation of anterior intermediate mesodermal cells into Wolff's cans (FIG. 2A).
  • Addition of CHIR 99021 to anterior intermediate mesodermal cells enhanced differentiation of OSR - GATA3 + PAX2 + cells ( Figure 2B). This finding suggests the onset of Wolff's tube differentiation, as the decrease in Osr1 expression is an important marker of Wolff's tube induction (F. Costantini et al, Dev. Cell 18 (2010) 698-712).
  • supplementation with the WNT signaling inhibitor IWR-1 prolonged OSR1 expression and decreased GATA3 and PAX2 expression (FIG. 2B).
  • the GATA3 + Wolff cells did not express E-CADHERIN, but did express other Wolff markers including PAX2, LHX1 and Cytokeratin 8 (CK8) (FIG. 2H). This result indicates that the cells are differentiated at the leading edge of Wolff's duct.
  • the differentiation protocol in the present application also efficiently generated Wolff's ductal cells while extending from hESC-derived forward intermediate mesodermal cells (FIG. 7A), and cells that did not differentiate into Wolff's ductal cells are markers of neural progenitor cells. It expressed certain PAX6 or OSR1 (FIG. 7B).
  • the upstream of the Wolff cell cell marker RET is a retinoic acid signal.
  • TTNPB to anterior intermediate mesodermal cells resulted in stable generation of initial Wolff cells (data not shown), and addition of AGN 193109, a retinoic acid signaling inhibitor, reduced RET expression (Fig. 8A, B) .
  • ureteral bud-like sprouting structures (FIG. 3G) expressing GATA3, PAX2, RET and CALB1 were formed (FIGS. 3E and F). Further culture induced expansion of these ureteral bud-like structures and formation of branching tissue (FIG. 3H). Apical cells expressed RET (FIG. 3H) and stem cells were positive for CK19 staining (FIG. 3H). This result indicates the development of branched ureteral bud-like tissue with polarity.
  • E-CADHERIN-positive cells were increased by extending the culture time for inducing Wolff's ductal cells from anterior intermediate mesodermal cells (Fig. 9A and B). It was envisioned that Wolff's ductal epithelial aggregates could be generated using factors that induce Wolff's ductal cells (CHIR99021, LDN 193189, FGF8, TTNPB and GDNF). When Wolff cells are suspended in culture for 2 days in the presence of these factors and Y-27632, GATA3 + cells become the other cells as well as culture in the above five factors (Gdnf, Fgf1, TTNPB, CHIR99021 and Thiazovivin). It spontaneously separated from the species and assembled to form E-CAD HENRIN + epithelial structures (FIG. 9C left). It was also possible to mechanically remove unnecessary cells by pipetting (FIG. 9C right).
  • Polarized ureteral bud tissue obtained by an improved method of advanced ureteral bud tissue preparation of branches of ureteral bud tissue is mechanically isolated from mature Wolff cell aggregates under a microscope, and medium containing low concentration of Matrigel Suspension culture.
  • ureteral organoids were produced (FIGS. 12A-C).
  • the ureteral organoids remained polar (FIG. 12F) and contained RET-positive tip cells and CK8-positive stem cells (FIGS. 12D and E).
  • the tip area of the branch of this ureteral bud organoid was mechanically cut off, and the isolated ureteral bud tip tissue was suspended and cultured in a medium containing a low concentration of Matrigel.
  • a medium containing a low concentration of Matrigel As a result, it was found that it is possible to produce ureteral organoids which again form a branched structure (FIG. 13A-C). It has been shown that the ureteric tip tissue can be maintained by cutting off the prepared tip region of the ureteral bud organoid and repeating the preparation of the ureteral bud organoid by suspension culture of the cut ureter tip tissue.
  • Expanded culture method of ureteral bud organoid Polarized ureteral bud-like tissue obtained by the modified method of preparation of ureteral bud tissue was separated into single cells by Accutase treatment together with mature Wolff cell aggregate.
  • many GATA3 / RET co-positive ureteral bud tip tissues were produced (FIG. 14A to D).
  • ureteral bud organoids were prepared (FIGS. 15A to D).

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本願は、多能性幹細胞、特にｉＰＳ細胞やＥＳ細胞から尿管芽細胞へ分化誘導する方法を提供することを目的とする。本願の別の目的は、多能性幹細胞から尿管芽様組織への各分化段階、前方原始線条細胞、前方中間中胚葉細胞、ウォルフ管細胞を経て尿管芽様組織を作成する系を提供することである。本願のさらに別の目的は、尿管芽様オルガノイドを維持する方法を提供することである。また本願は、尿管芽様先端組織を拡大培養する方法を提供することを目的とする。

Description

尿管芽様組織誘導方法
　本願は尿管芽様組織を誘導する方法に関する。より詳細には、多能性幹細胞、特にヒト多能性幹細胞から尿管芽様組織を誘導する方法に関する。
　現在本邦において慢性腎臓病(CKD)の患者数は、約1,300万人と推計されており、新たな国民病と呼ばれている。慢性腎臓病に対する根治的治療法は少なく、その進行によって透析療法を必要とする末期慢性腎不全患者は32万人以上であり、医学的のみならず医療経済的にも大きな問題となっている。末期慢性腎不全を含む慢性腎臓病の根治療法として腎移植が挙げられるが、深刻なドナー臓器不足のため需要に対し供給が全く追いついていない状態である。
　腎移植におけるドナー臓器不足の解決や慢性腎臓病に対する新規の細胞療法を開発するために、iPS細胞から高効率に腎細胞や腎組織を作製する方法の確立が必要とされている。
　腎臓は、胎生初期の組織である中間中胚葉に由来し、脊椎動物では中間中胚葉から前腎、中腎、後腎の3つの腎臓が形成され、哺乳類では後腎が成体の腎臓となる。後腎は、間葉と呼ばれる成体腎のネフロンと間質に将来分化する組織と、尿管芽と呼ばれる成体腎の集合管から下部の腎盂、尿管、膀胱の一部に将来分化する組織の2つの組織の相互作用で発生する（非特許文献１および２）。さらに、近年、中間中胚葉は、前方と後方の2つの部位に分かれており、前方中間中胚葉から尿管芽、後方中間中胚葉から間葉が発生することが報告された(非特許文献３)。
　ヒトiPS細胞やヒトES細胞から尿管芽細胞・組織を高効率に分化誘導する方法が確立されれば、将来的に三次元の腎臓の再構築による腎移植のドナー不足の解決や集合管細胞や下部尿路細胞の供給源として細胞療法に使用することが期待される。さらに、集合管細胞や下部尿路細胞やそれらを含む腎組織を用いた薬剤腎毒性評価系や疾患特異的iPS細胞から作製される腎細胞と腎組織を用いた疾患モデル作製や治療薬開発などの研究への発展が期待される。
　また尿管芽は、最初にウォルフ管細胞の尾方端から突起として出現し、その後分枝を繰り返し、腎集合管および尿路上皮に分化する。分枝構造を形成する尿管芽組織を作製できれば、腎臓発生および腎臓疾患の機構を解明するのに有用となることが期待される。
　本発明者らは、多能性幹細胞から膵ホルモン産生細胞、膵芽細胞、胆管上皮前駆細胞、肝細胞等、様々な細胞への分化誘導方法を確立した（特許文献１～５）。ヒトiPS細胞やヒトES細胞から尿管芽細胞を選択的に分化誘導する方法は、現在までのところ知られていない。
WO2015/020113 WO2015/178431 WO2017/047797 WO2018/097127 WO2016/104717
Osafune K., et al., Development 2006; 133: 151-61. Kobayashi A., et al., Cell Stem Cell 2008; 3: 169-81. Taguchi A., et al., Cell Stem Cell. 2014; 14: 53-67.
　本願は、多能性幹細胞、特にｉＰＳ細胞やＥＳ細胞から尿管芽細胞へ分化誘導する方法を提供することを目的とする。本願の別の目的は、多能性幹細胞から尿管芽様組織への各分化段階、前方原始線条細胞、前方中間中胚葉細胞、ウォルフ管細胞を経て尿管芽様組織を作成する系を提供することである。本願のさらに別の目的は、尿管芽様オルガノイドを維持する方法を提供することである。また本願は、尿管芽様オルガノイドを拡大培養する方法を提供することを目的とする。本願はまた、多能性幹細胞から集合管前駆細胞を分化誘導する方法を提供することを目的とする。
　本願は、
　（１）前方原始線条細胞を線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニスト、TGFβ阻害剤、およびBMP阻害剤の存在下で二次元培養して、前方中間中胚葉細胞培養物を得る工程、および
　（２）前方中間中胚葉細胞培養物をGSK3β阻害剤、BMP阻害剤、線維芽細胞増殖因子およびグリア細胞株由来神経栄養因子の存在下で二次元培養する工程を含む、初期ウォルフ管細胞を誘導する方法を提供する。本態様の（２）の工程において、培地にはさらにレチノイン酸受容体アゴニストを含んでもよい。
　本態様において、多能性幹細胞を、アクチビン受容体キナーゼ４，７の活性化剤、GSK3β阻害剤、およびBMP4の存在下で二次元培養して、前方原始線条細胞を得る工程をさらに含んでもよい。また、前方原始線条細胞は他の公知の方法で得られたものであってもよい。すなわち本態様によって、多能性幹細胞から初期ウォルフ管細胞を誘導する方法が提供される。
　本願はまた、誘導された初期ウォルフ管細胞を凍結保存する方法を提供する。本願の方法で凍結保存させ、起眠させた初期ウォルフ管細胞は、以下の態様における初期ウォルフ管細胞として使用され得る。
　本願はまた、
　（３）初期ウォルフ管細胞を、グリア細胞株由来神経栄養因子、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニスト、GSK３β阻害剤およびYes-associated protein(YAP)活性阻害剤の存在下で浮遊培養して、成熟ウォルフ管細胞凝集体を得る工程、および
　（４）成熟ウォルフ管細胞凝集体を、グリア細胞株由来神経栄養因子、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニスト、GSK３β阻害剤およびYes-associated protein(YAP)活性阻害剤の存在下で三次元培養する工程を含む、尿管芽様組織を誘導する方法を提供する。本態様において、初期ウォルフ管細胞は本願の方法により誘導されたものであっても、本願の方法による凍結保存後に起眠させたものであってもよい。すなわち本態様によって、多能性幹細胞から尿管芽様組織を誘導する方法が提供される。
　本願の別の態様において、
　（３’）初期ウォルフ管細胞を、GSK3β阻害剤、BMP阻害剤、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニストおよびグリア細胞株由来神経栄養因子の存在下で浮遊培養して、成熟ウォルフ管細胞凝集体を得る工程、および
　（４’）成熟ウォルフ管細胞凝集体を、GSK3β阻害剤、BMP阻害剤、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニストおよびグリア細胞株由来神経栄養因子の存在下で浮遊培養する工程を含む、尿管芽様組織を誘導する方法を提供する。本態様において、初期ウォルフ管細胞は本願の方法により誘導されたものであっても、本願の方法による凍結保存後に起眠させたものであってもよい。
　本願はまた、本願の方法で尿管芽様組織培養物を得、さらに
　（５－１）尿管芽様組織を単離する工程、および
　（５－２）単離した尿管芽様組織を、GSK3β阻害剤、BMP阻害剤、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニストおよびグリア細胞株由来神経栄養因子の存在下で浮遊培養する工程を含む、尿管芽様オルガノイドを誘導する方法を提供する。
　本願はまた、本願の方法で尿管芽様オルガノイド培養物を得、さらに
　（６－１）尿管芽様オルガノイドの先端領域を切り取り、尿管芽様先端組織を得る工程、
　（６－２）尿管芽様先端組織を、GSK3β阻害剤、BMP阻害剤、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニストおよびグリア細胞株由来神経栄養因子の存在下で浮遊培養して、尿管芽様オルガノイドを誘導する工程、および
　（６－３）工程（６－１）および工程（６－２）を繰り返す工程を含む、尿管芽様オルガノイドを維持する方法を提供する。
　本願はまた、本願の方法で尿管芽様組織培養物を得、さらに
　（５’－１）尿管芽様組織培養物中の組織を単一細胞に分離する工程、および
　（５’－２）前記単一細胞をグリア細胞株由来神経栄養因子、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニスト、GSK３β阻害剤およびYes-associated protein(YAP)活性阻害剤の存在下で三次元培養する工程を含む、尿管芽様先端組織を拡大培養する方法を提供する。
　本願はまた、本願の方法で尿管芽様先端組織を得、さらに
　（６’）尿管芽様先端組織をGSK3β阻害剤、BMP阻害剤、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニストおよびグリア細胞株由来神経栄養因子の存在下で浮遊培養する工程を含む、尿管芽様オルガノイドを誘導する方法を提供する。
　本願はまた、本願の方法で尿管芽様先端組織を得、さらに
　（６’’－１）尿管芽様先端組織を単一細胞に分離する工程、および
　（６’’－２）前記単一細胞をWntシグナル阻害剤およびTGFβシグナル阻害剤の存在下で接着培養する工程を含む、集合管前駆細胞を誘導する方法を提供する。すなわち本態様によって、多能性幹細胞から集合管前駆細胞を誘導する方法が提供される。
　本願は特許請求の範囲に記載した方法を提供する。本願の方法によって、比較的簡便かつ高効率で尿管芽様組織を製造することが可能となる。
前方原始線条細胞（APS）から尿管芽（UB）およびネフロン前駆細胞（NP）への分化の図。 OSR1（GFP、緑色）およびGATA3（赤色）の免疫染色分析。FGF8とTTNPBでの処理は前方原始線条細胞（APS）を前方中間中胚葉様細胞（Anterior IM）に誘導するが、前体節中胚葉細胞（PSM）を誘導しない。スケールバーは100μmである。 前方中間中胚葉マーカーの免疫染色分析。スケールバーは100μmである。 フローサイトメトリー分析による、前方中間中胚葉マーカー（OSR1、GATA3、LHX1およびHOXB4）を発現する細胞への分化の定量化。4回の独立した実験から得たデータを平均値±s.d.（n=4）として表す。 BMP4およびLDN193189を前方原始線条（APS）および前方中間中胚葉（Anterior IM）の誘導段階に添加することによる、OSR1＋GATA3＋細胞の分化への効果。hiPSCを10ng/ml BMP4を含む、または含まない100ng/mlアクチビンAおよび3μM CHIR99021で処理した。前方原始線条細胞を10ng/ml BMP4または0.1μM LDN193189を含む、0.1μM TTNPB、1μM A83-01および200ng/ml FGF8で処理した。 BMP4およびLDN193189を前方原始線条（APS）および前方中間中胚葉（Anterior IM）の誘導段階に添加することによる、OSR1＋GATA3＋細胞の分化への効果。OSR1（GFP、緑色）およびGATA3（赤色）の免疫染色分析。BMP4を前方原始線条誘導段階に添加すると、OSR1＋GATA3＋細胞誘導が促進された。スケールバーは100μmである。 BMP4およびLDN193189を前方原始線条（APS）および前方中間中胚葉（Anterior IM）の誘導段階に添加することによる、OSR1＋GATA3＋細胞の分化への効果。OSR1（GFP、緑色）およびGATA3（赤色）の免疫染色分析。LDN193189を前方中間中胚葉誘導段階に添加してもOSR1＋GATA3＋細胞の誘導効率は変化せず、BMP4の添加は分化を阻害した。スケールバーは100μmである。 BMP4およびLDN193189を前方原始線条（APS）および前方中間中胚葉（Anterior IM）の誘導段階に添加することによる、OSR1＋GATA3＋細胞の分化への効果。前方原始線条誘導段階にBMP4を含まず、または中間中胚葉誘導段階にLDN193189を含まない処理によるGATA3＋細胞の誘導率は46.3±14.8%であった。前方原始線条段階にBMP4を含み、前方中間中胚葉段階にLDN193189を含まない処理によるGATA3＋細胞の誘導率は69.1±13.9%であった。前方原始線条段階にBMP4を含み、前方中間中胚葉段階にLDN193189を含む処理によるGATA3＋細胞の誘導率は69.6±5.7%であった。4回の独立した実験から得たデータを平均値±s.d.（n=4）として表す。
E8.5-9マウス胚における背腹軸に沿ったWntシグナルおよびBMPシグナルの濃度勾配の図。WntおよびBMPタンパク質は表層外胚葉（背側）から分泌され、BMPは側板中胚葉（腹側）からも分泌される。ウォルフ管（WD；OSR1－GATA3＋）は前方中間中胚葉（IM；OSR1＋GATA3＋）に対して背側に形成される。 OSR1（GFP、緑色）、GATA3（赤色）およびPAX2（紫色）の免疫染色分析。CHIR99021を前方中間中胚葉細胞に添加することでOSR1－GATA3＋PAX2＋ウォルフ管細胞の分化は増強されたが（左）、IWR-1の添加によってウォルフ管誘導は阻害された（右）。スケールバーは100μmである。3D45細胞を使用した。 OSR1（GFP、緑色）、GATA3（赤色）およびPAX2（紫色）の免疫染色分析。BMP4を前方中間中胚葉細胞に添加することでウォルフ管細胞の分化は阻害されたが（左）、LDN193189の添加によってウォルフ管誘導は増強された（右）。スケールバーは100μmである。3D45細胞を使用した。 OSR1（GFP、緑色）、GATA3（赤色）およびPAX2（紫色）の免疫染色分析。前方中間中胚葉細胞をCHIR99021およびLDN193189で処理することで、ウォルフ管細胞が誘導された（左）。この処理にFGF8を追加すると、ウォルフ管誘導が増強した（右）。スケールバーは100μmである。3D45細胞を使用した。 処理前の全細胞数、FGF8単独での処理後の全細胞数、GDNF単独での処理後の全細胞数、およびFGF8とGDNFの併用での処理後の全細胞数は、それぞれ1.44±0.29×105/cm2、4.69±0.65×105/cm2、2.37±0.56×105/cm2および5.44±0.54×105/cm2である。3回の独立した実験から得たデータを平均値±s.d.（n=3）として表す。3D45細胞を使用した。 Ki67およびGATA3の免疫染色分析。スケールバーは100μmである。KhES3細胞を使用した。 Ki67、GATA3およびRETの免疫染色分析。スケールバーは100μmである。3D45細胞を使用した。 ウォルフ管マーカーの免疫染色分析。スケールバーは100μmである。3D45細胞を使用した。
1×104個の分離された細胞から形成された凝集体の最初の2日間における形態変化。スケールバーは300μｍである。511-3E細胞を使用した。 2日目における凝集体のGATA3（赤色）およびE-CADHERIN（緑色）の免疫染色分析。成熟ウォルフ管マーカーに陰性の細胞は、凝集体においてウォルフ管細胞から分離されている。スケールバーは300μｍである。511-3E細胞を使用した。 非ウォルフ管細胞を除去するピペット操作をする前および後における2日目の凝集体の形態。中央のパネルにおける矢および矢頭は、それぞれ分離されたウォルフ管細胞および非ウォルフ管細胞を示す。スケールバーは300μｍである。511-3E細胞を使用した。 非ウォルフ管細胞を除去した後の2日目の凝集体におけるウォルフ管マーカーの免疫染色分析。スケールバーは100μmである。511-3E細胞を使用した。 ピペット操作し、マトリゲルに埋め込んだ後の成熟ウォルフ管凝集体における最初の7日間の形態変化。スケールバーは300μｍである。511-3E細胞を使用した。 511-3E細胞から作製された7日目の構造体の三次元画像。511-3E細胞を使用した。 9日目の構造体における尿管芽マーカーの免疫染色分析。スケールバーは100μmである。3D45細胞を使用した。 15日目の構造体における、尿管芽の幹のマーカーであるCK19（赤色）、UPの先端のマーカーであるRET（緑色）、ならびに共通の尿管芽マーカーであるPAX2およびGATA3（青色）の免疫染色分析。スケールバーは100μmである。3D45細胞を使用した。
hPSCから、分枝する尿管芽組織への分化誘導プロトコル。APS、前方原始線条；Anterior IM、前方中間中胚葉；WD、ウォルフ管；UB、尿管芽。Y、10μM Y-27632；A、100ng/mlアクチビンA；C3、3μM CHIR99021；B、10ng/ml BMP4；F8、200ng/ml FGF8；TT、0.1μM TTNPB；A83、1μM A83-01；LDN、0.1μM LDN193189；C1、1μM CHIR99021；G、100ng/ml GDNF；F1、200ng/ml FGF1；Tzv、10μM Thiazovivin。
hiPSCから前方原始線条（APS）および前体節中胚葉細胞（PSM）を介した初期体節（Early somite）への分化の図。 hiPSCから前方原始線条細胞（APS）への分化を示すBRACHYURY（赤色）の免疫染色分析。スケールバーは100μmである。 前方原始線条（APS）から前体節中胚葉細胞（PSM）への分化を示すTBX6（赤色）の免疫染色分析。スケールバーは100μmである。 前体節中胚葉（PSM）から初期体節細胞（Early somite）への分化を示すPAX3（赤色）の免疫染色分析。スケールバーは100μmである。 10ng/mlアクチビンA、3ng/ml BMP4、3μM CHIR99021、0.1μM TTNPBおよび10μM Y-27632での処理、ならびにその後の5ng/ml FGF9、1μM CHIR99021および10μM Y-27632での処理を用いた、前体節中胚葉（PSM）のネフロン前駆細胞（NP）への誘導。前体節中胚葉からネフロン前駆細胞への分化を示す、OSR1（GFP、緑色）およびSIX2（赤色）の免疫染色分析。スケールバーは100μmである。 1μM A83-01での処理が前方中間中胚葉様細胞の誘導を阻害することなく、胚体内胚葉細胞への分化を減少させることを示す、OSR1（GFP、緑色）およびSOX17（紫色）の二重免疫染色分析。スケールバーは100μmである。
複数のhiPSC/ESC株からの前方中間中胚葉細胞の誘導。OSR1-GFPノックインhiPSC株（3D45）（OSR1-GFP、緑色；GATA3、赤色；PAX2、紫色）、mCherryを構成的に発現するhiPSC株（511-3E）（GATA3、緑色；mCherry、赤色；PAX2、紫色）、ADPKD患者から確立されたhiPSC株（CiRA00009）（GATA3、緑色；PAX2、紫色）およびhESC株（KhES3）（GATA3、赤色；PAX2、緑色）由来の4日目の分化細胞に対する、前方中間中胚葉マーカーの免疫染色分析。
KhES3細胞由来の7日目の分化細胞に対するウォルフ管マーカー（LHX1、GATA3、RET、CK8およびPAX2）の免疫染色分析。スケールバーは100μｍである。 3D45細胞由来の7日目の分化細胞に対する、FOXF1＋側板中胚葉、OSR1＋PAX2－後方中間中胚葉、PAX3＋初期体節およびPAX6＋神経外胚葉細胞の免疫染色分析は、前方中間中胚葉以外の後方中間中胚葉および神経外胚葉の部分的な分化を示した。スケールバーは100μｍである。
hPSCから初期ウォルフ管細胞への分化誘導プロトコル。Anterior PS、前方原始線条；Anterior IM、前方中間中胚葉；ND、ウォルフ管。 前方中間中胚葉細胞にTTNPB（左）またはAGN193109（右）を添加した場合におけるRET（緑色）およびGATA3（赤色）の免疫染色分析。AGN193109の添加によってウォルフ管細胞のマーカーであるRET発現が低下した。スケールバーは100μmである。
前方中間中胚葉細胞からウォルフ管細胞への誘導の開始後、6日目、8日目および10日目におけるウォルフ管細胞マーカーの免疫染色分析。スケールバーは100μmである。 hPSCから成熟ウォルフ管凝集体への改良された分化誘導プロトコル。Anterior PS、前方原始線条；Anterior IM、前方中間中胚葉；ND、ウォルフ管。 非ウォルフ管細胞を除去する前および後の2日目の凝集体におけるウォルフ管細胞マーカーの免疫染色分析。スケールバーは300μmである。
hPSCから尿管芽組織への改良された分化誘導プロトコル。Anterior PS、前方原始線条；Anterior IM、前方中間中胚葉；ND、ウォルフ管；UB、尿管芽。 ウォルフ管上皮細胞塊からの、極性を有する尿管芽の出芽。 マトリゲル含有培地中の成熟ウォルフ管細胞凝集体における最初の4日間の形態変化。 極性を有する尿管芽の作製を示す、PAX2（緑色）、LAMININ（赤色）、EZRIN（白色）の免疫染色分析。
hPSCから分化誘導した初期ウォルフ管細胞を凍結保存するプロトコル。Anterior PS、前方原始線条；Anterior IM、前方中間中胚葉；ND、ウォルフ管。 凍結保存した後、起眠し、細胞塊を作製し、非ウォルフ管細胞を除去した凝集体におけるウォルフ管細胞マーカーの免疫染色分析。スケールバーは300μmである。
hPSCから尿管芽組織を分化誘導し、単離した尿管芽組織から尿管芽オルガノイドを作製するプロトコル。Anterior PS、前方原始線条；Anterior IM、前方中間中胚葉；ND、ウォルフ管；UB、尿管芽。 成熟ウォルフ管細胞凝集体から単離された尿管芽組織の分枝の進行を示す模式図。 成熟ウォルフ管細胞凝集体から機械的に単離し、マトリゲル含有培地で浮遊培養した尿管芽組織における最初の10日間の形態変化。 14日目の構造体における、PAX2（緑色）およびCK8（赤色）の免疫染色分析。 14日目の構造体における、PAX2（青色）、RET（緑色）およびCK8（赤色）の免疫染色分析。 14日目の構造体における、PAX2（紫色）、EZRIN（緑色）、およびLAMININ（赤色）の免疫染色分析。
hPSCから尿管芽組織を分化誘導し、尿管芽オルガノイドを維持するためのプロトコル。Anterior PS、前方原始線条；Anterior IM、前方中間中胚葉；ND、ウォルフ管；UB、尿管芽。 尿管芽オルガノイドの先端領域を切り取り、さらに培養することによって尿管芽オルガノイドを維持できることを示す模式図。 作製された尿管芽オルガノイドから1回、2回または3回切り取られた、尿管芽組織の先端領域（尿管芽先端組織）における最初の7日間の形態変化。
hPSCから分化誘導した尿管芽組織を用いて、尿管芽先端組織を拡大培養するためのプロトコル。Anterior PS、前方原始線条；Anterior IM、前方中間中胚葉；ND、ウォルフ管；UB、尿管芽。 尿管芽組織を成熟ウォルフ管細胞凝集体と共に単一の細胞に分離し、ハイドロゲル上で三次元培養することを示す模式図。 7日目の構造体の顕微鏡画像。 7日目の構造体におけるRET（緑色）およびGATA3（赤色）の免疫染色分析。
拡大培養した尿管芽先端組織から尿管芽オルガノイドを作製するためのプロトコル。Anterior PS、前方原始線条；Anterior IM、前方中間中胚葉；ND、ウォルフ管；UB、尿管芽。 尿管芽組織を成熟ウォルフ管細胞凝集体と共に単一の細胞に分離してハイドロゲル上で三次元培養し、その後マトリゲル含有培地中で浮遊培養することを示す模式図。 14日目における作製された構造体の顕微鏡画像。 14日目の構造体における、EZRIN（緑色）、LAMININ（赤色）、CK8（緑色）、GATA3（赤色）の免疫染色分析。
集合管前駆細胞を分化誘導するためのプロトコル。 集合管前駆細胞への分化を示す、アクアポリン2（AQP2；赤色）の免疫染色分析。
　本願明細書および請求の範囲において、数値に付随して「約」という場合、数値の±３０％、または±２０％、もしくは±１０％の値まで含むものとする。
　本願明細書および請求の範囲において、「ある特定種類の細胞」の表現は、特に断りがなければ当該種類の細胞が含まれている細胞群を意味し、当該細胞群には特定された種類の細胞以外の種類の細胞が含まれていてもよい。例えば「ある特定種類の細胞の培養物」は、当該種類の細胞が含まれる細胞群の培養物を意味し、特定された種類の細胞以外の細胞が含まれていても良い。同様に、「ある特定種類の細胞凝集体」の表現は、特に断りがなければ当該種類の細胞が含まれている細胞凝集体を意味し、当該細胞凝集体には特定された種類の細胞以外の細胞が含まれていても良い。
　本願明細書および請求の範囲において「多能性幹細胞」とは、生体に存在する全ての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、それには、例えば胚性幹（ES）細胞（J.A. Thomson et al. （1998）, Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al. （1995）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848;J.A. Thomson et al. （1996）, Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall （1998）, Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165）、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ntES）細胞（T. Wakayama et al. （2001）, Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. （2005）, Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al. （2007）, Nature, 450:497-502）、精子幹細胞（「GS細胞」）（M. Kanatsu-Shinohara et al. （2003） Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. （2004）, Cell, 119:1001-1012）、胚性生殖細胞（「EG細胞」）（Y. Matsui et al. （1992）, Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. （1992）, Nature, 359:550-551）、人工多能性幹（iPS）細胞（K. Takahashi and S. Yamanaka （2006） Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. （2007）, Cell, 131:861-872; J. Yu et al. （2007）, Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら、Nat. Biotechnol. 26:101-106 （2008）；WO2007/069666）、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）（WO2011/007900）などが含まれる。特にマウスやヒトの多能性幹細胞、特にＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞が好適に用いられる。
　「ROCK阻害剤」とは、Rho-キナーゼ（ROCK）の機能を抑制できるものである限り特に限定されず、例えば、Y-27632（例、Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000)；Narumiya et al., Methods Enzymol. 325,273-284 (2000)参照）、Fasudil/HA1077（例、Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)参照）、SR3677（例、Feng Y et al., J Med Chem. 51: 6642-6645(2008)参照）、GSK269962（例、Stavenger RA et al., J Med Chem. 50: 2-5 (2007)またはWO2005/037197参照）、H-1152（例、Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93: 225-232 (2002)参照）、Wf-536（例、Nakajima et al., Cancer Chemother Pharmacol. 52(4): 319-324 (2003)参照）およびそれらの誘導体、ならびにROCKに対するアンチセンス核酸、RNA干渉誘導性核酸（例、siRNA）、ドミナントネガティブ変異体、およびそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ROCK阻害剤としては他の公知の低分子化合物も使用できる（例えば、米国特許出願公開第2005/0209261号、同第2005/0192304号、同第2004/0014755号、同第2004/0002508号、同第2004/0002507号、同第2003/0125344号、同第2003/0087919号、及び国際公開第2003/062227号、同第2003/059913号、同第2003/062225号、同第2002/076976号、同第2004/039796号参照）。本願でROCK阻害剤という場合、１種または２種以上のROCK阻害剤が使用され得る。好ましいROCK阻害剤としては、Y-27632、Fasudil/HA1077、SR3677、GSK269962およびH-1152が挙げられる。
　「アクチビン受容体様キナーゼ－４，７の活性化剤」とは、ＡＬＫ－４および／又はＡＬＫ－７に対し活性化作用を有する物質であり、好ましくは、アクチビン、特にアクチビンＡが用いられる。
　「GSK3β阻害剤」とは、GSK3βタンパク質のキナーゼ活性（例えば、βカテニンに対するリン酸化能）を阻害する物質として定義され、既に多数のものが知られているが、例えば、インジルビン誘導体であるBIO（別名、GSK－3β阻害剤IX；6-ブロモインジルビン3'-オキシム）、マレイミド誘導体であるSB216763（3-（2,4-ジクロロフェニル）-4-（1-メチル-1H-インドール-3-イル）-1H-ピロール-2,5-ジオン）、SB415286（３－［（３－クロロ－４－ヒドロキシフェニル）アミノ］－４－（２－ニトロフェニル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるGSK－3β阻害剤VII（4-ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるL803-mts（別名、GSK－3βペプチド阻害剤；Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2）および高い選択性を有するCHIR99021 （6-[2-[4-（2,4-Dichlorophenyl）-5-（4-methyl-1H-imidazol-2-yl）pyrimidin-2-ylamino]ethylamino]pyridine-3-carbonitrile） が挙げられる。これらの化合物は、例えばCalbiochem社やBiomol社等から市販されており容易に利用することが可能である。本発明で使用されるGSK3β阻害剤は、好ましくは、CHIR99021であり得る。
　「線維芽細胞増殖因子」としては、ＦＧＦ１から２３までが知られており、これら公知のものから適宜選択すればよい。以下に述べる第２、第３、第４’、第５’、第６、第７および第７’ステージではＦＧＦ８が、ウォルフ管細胞誘導後、ウォルフ管の成熟化あるいは凝集物の誘導並びに尿管芽組織への誘導段階である第４、第５および第６’ステージではＦＧＦ１が好適に用いられる。
　「レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニスト」としては、天然に存在するレチノイドであっても、化学的に合成されたレチノイド、レチノイド骨格を持たないレチノイン酸受容体アゴニスト化合物やレチノイン酸受容体アゴニスト活性を有する天然物であってもよい。ＲＡＲアゴニストとしての活性をもつ天然レチノイドの例としては、レチノイン酸（立体異性体の全トランス－レチノイン酸（全トランスＲＡ）と９－シス－レチノイン酸（９－シスＲＡ）が知られている）が挙げられる。化学的に合成されたレチノイドは当技術分野で公知である（米国特許第５，２３４，９２６号、米国特許第４，３２６，０５５号等）。レチノイド骨格を持たないレチノイン酸受容体アゴニスト化合物の例としては、Ａｍ８０、ＡＭ５８０、ＴＴＮＰＢ、ＡＣ５５６４９が挙げられる。レチノイン酸受容体アゴニスト活性を有する天然物の例としては、ホノキオール、マグノロールが挙げられる（生物機能開発研究所紀要　９：５５－６１、２００９年）。工程２で用いるＲＡＲアゴニストは、好ましくはレチノイン酸、ＡＭ５８０（４－［［５，６，７，８－テトラヒドロ－５，５，８，８－テトラメチル－２－ナフタレニル］カルボキシアミド］ベンゾイックアシッド）、ＴＴＮＰＢ（４－［［Ｅ］－２－［５，６，７，８－テトラヒドロ－５，５，８，８－テトラメチル－２－ナフタレニル］－１－プロペニル］ベンゾイックアシッド）、ＡＣ５５６４９（４’－オクチル－［１，１’－ビフェニル］－４－カルボキシリックアシッド）であり、さらに好ましくはＴＴＮＰＢである。
　「TGFβ阻害剤」は、TGFβの受容体への結合からSMADへと続くシグナル伝達を阻害する物質であり、受容体であるALKファミリーへの結合を阻害する物質、またはALKファミリーによるSMADのリン酸化を阻害する物質である限り特に限定されず、例えば、Lefty-1（NCBI Accession No.として、マウス：NM_010094、ヒト：NM_020997が例示される）、SB431542、SB202190(以上、R.K.Lindemann et al., Mol. Cancer, 2003, 2:20)、SB505124 (GlaxoSmithKline)、 NPC30345 、SD093、 SD908、SD208 (Scios)、LY2109761、LY364947、 LY580276 (Lilly Research Laboratories)、A-83-01((3-(6-Methyl-2-pyridinyl)-N-phenyl-4-(4-quinolinyl)-1H-pyrazole-1-carbothioamide), WO 2009146408) ALK5阻害剤II（２－［３－［６－メチルピリジン－２－イル］－１Ｈ－ピラゾル－４－イル］－１，５－ナフチリジン）、TGFβRIキナーゼ阻害剤VIII（６－［２－ｔｅｒｔ－ブチル－５－［６－メチル－ピリジン－２－イル］－１Ｈ－イミダゾル－４－イル］－キノキサリン）およびこれらの誘導体などが例示される。好ましくは、A-83-01であり得る。
　「BMP阻害剤」は、Chordin、Noggin、Follistatin、などのタンパク質性阻害剤、Dorsomorphin 6-[4-（2-piperidin-1-yl-ethoxy）phenyl]-3-pyridin-4-yl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine、その誘導体 （P. B. Yu et al. （2007）, Circulation, 116:II_60; P.B. Yu et al. （2008）, Nat. Chem. Biol., 4:33-41; J. Hao et al. （2008）, PLoS ONE, 3（8）:e2904）およびLDN-193189（4-（6-（4-（piperazin-1-yl）phenyl）pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl）quinoline）が例示され、好適にはLDN-193189が用いられる。
　「Ｗｎｔシグナル阻害剤」は、Ｗｎｔを介したシグナル伝達経路を阻害する物質であれば特に限定されず、例えば、ＩＷＲ－１、ＩＷＰ－２、ＩＷＰ－３、ＩＷＰ－４、２－（４－トリフルオロメチルフェニル）－７，８－ジヒドロ－５Ｈ－チオピラノ［４，３－ｄ］ピリミジン－４（３Ｈ）－オン（ＸＡＶ９３９）、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＧＦＢＰ４、Ｄｋｋ１、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、抗Ｗｎｔ抗体、Ｗｎｔアゴニスト（Ｗｎｔ受容体阻害剤）、可溶型Ｗｎｔ受容体タンパク（Ｆｒｚｂ－１等）、ドミナントネガティブ体などが例示され、好適にはIWR-1が用いられる。
　本願の方法の各工程において、培養温度は、以下に限定されないが、約30から40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは約2から5％である。
　多能性幹細胞は、本願の方法に提供する前に、好適には多能性幹細胞培養用コーティング、例えばラミニンコーティング、市販品ではｉＭaｔｒｉｘ　ｓｉｌｋのコーティングを施した培養容器内、ＲＯＣＫ阻害剤を添加した多能性幹細胞用維持培地中で１２時間から４８時間、例えば約２４時間培養する。多能性幹細胞用維持培地としては、市販のものを適宜用いることができ、例えばＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標） ＡＫ０２Ｎ培地（味の素（株））が例示される。ＲＯＣＫ阻害剤としてＹ－２７６３２を用いる場合の培地中の濃度は、０．１μＭから１ｍＭ、好ましくは、１μＭから１００μＭ、さらに好ましくは、５μＭから２０μＭ、例えば約１０μＭである。
　次いで、本願の方法により多能性幹細胞の分化誘導を行う。培地は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地へそれぞれのステージに必要な因子を適宜添加して調製することができる。基礎培地としては、例えば、MEM Zinc Option培地、IMEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）培地、DMEM/F12培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、およびこれらの混合培地などが包含される。基礎培地には、血清（例えば、ウシ胎児血清（FBS））が含有されていてもよいし、または無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、KnockOut Serum Replacement（KSR）（ES細胞培養時の血清代替物）（Thermo Fisher Scientific）、N2サプリメント（Thermo Fisher Scientific）、B27サプリメント（Thermo Fisher Scientific）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3’－チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、GlutaMAX（Thermo Fisher Scientific）、非必須アミノ酸（NEAA）、ビタミン、増殖因子、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、およびこれらの同等物などの１つ以上の物質、あるいはその他の通常動物培養用培地に添加される１つ以上の物質を含有しうる。
　１つの実施形態において、第６’ステージを除く各態様では、基礎培地としてDMEM/F12培地にL-ascorbic acid-2-phosphate magnesium、sodium selenium、insulin、NaHCO3およびトランスフェリンが添加された無血清培地であるEssential 6(TM)培地（Thermo Fisher Scientific Inc）を用いて本願の方法を実施することが例示される。１つの実施形態において、第６’ステージでは、基礎培地としてDMEM/F12 B27 vitA free培地を用いて本願の方法を実施することが例示される。
　以下、本願の方法の各ステージを説明する。各ステージにおいて、目的とする細胞が誘導されていることは、細胞上のマーカーの発現により確認することができる。マーカーの発現は、免疫染色法やＦＡＣＳなど公知の方法で確認することができる。
第1ステージ
　本願の第1ステージは、多能性幹細胞から前方原始線条細胞を誘導する工程である。本工程では、多能性幹細胞をアクチビン受容体キナーゼ４，７の活性化剤、GSK3阻害剤の存在下、二次元培養する。好ましくはさらに、ＢＭＰ４を存在させる。
　アクチビン受容体キナーゼ４，７の活性化剤としてアクチビンＡを用いる場合、アクチビンＡの培地中の濃度は、通常１ｎｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍｌ、例えば約１００ｎｇ／ｍｌである。
　ＧＳＫ３β阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１を用いる場合、培地中の濃度は、通常０．０３μＭから３００μＭ、好ましくは０．３μＭから３０μＭ、より好ましくは１．５μＭから６μＭ、例えば約３μＭである。
　ＢＭＰ４の培地中の濃度は、０．１ｎｇ/ｍｌから１μｇ／ｍｌ、好ましくは１ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは５ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌ、例えば約１０ｎｇ／ｍｌである。
　本願の第１ステージは、好適には多能性幹細胞培養用のプレートにて、培地のみ交換して培養を行えば良い。培養期間は１２時間から４８時間、例えば約２４時間培養する。前方原始線条（APS)細胞の生成は、細胞へのBRACHYURYの発現にて確認できる。
第２ステージ
　本願の第２ステージは、前方原始線条細胞から前方中間中胚葉（Anterior Intermediate Mesoderm, Anterior IM）を誘導する工程である。前方原始線条細胞は、第１ステージで得られた細胞でも良いし、公知の別の方法によって得られた細胞を用いてもよい。
　本工程では、前方原始線条細胞を、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニスト、TGFβ阻害剤、およびBMP阻害剤の存在下、二次元培養する。
　線維芽細胞増殖因子としてFGF8を用いる場合、その培地中の濃度は通常２ｎｇ／ｍｌから２０μｇ／ｍｌ、好ましくは２０ｎｇ／ｍｌから２μｇ／ｍｌ、より好ましく１００ｎｇ／ｍｌから４００ｎｇ／ｍｌ、例えば約２００ｎｇ／ｍｌである。
　レチノイン酸受容体アゴニストとして、ＴＴＮＰＢを用いる場合、その培地中の濃度は通常０．００１μＭから１０μＭ、好ましくは０．０１μＭから１μＭ、より好ましくは０．０５μＭから０．２μＭ、例えば約０．１μＭである。
　ＴＧＦβ阻害剤としてＡ８３－０１を用いる場合、その培地中の濃度は通常０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは０．１μＭから１０μＭ、より好ましくは０．５μＭから２μＭ、例えば約１μＭである。
　ＢＭＰ阻害剤としてＬＤＮ１９３１８９を用いる場合、その培地中の濃度は通常０．００１μＭから１０μＭ、好ましくは０．０１μＭから１μＭ、より好ましくは０．０５μＭから０．２μＭ、例えば約０．１μＭである。
　第２ステージでは、合計で２日間から６日間、好ましくは約３日間から約４日間培養を行う。第２ステージの前半、例えば約２日間は第１ステージ、または他の方法で得られた細胞培養物の培地を第２ステージ用培地に交換して培養すればよい。第２ステージの後半、例えば約１日間は、培養プレートを細胞外マトリックスタンパク質、例えばマトリゲルを薄層コーティングした細胞培養用プレートへ移して培養する。細胞培養用プレートを交換した後は、好ましくは培地中に更にROCK阻害剤、例えばY-27632を添加して培養を続ける。Y-27632の培地中の濃度は、第１ステージ開始前に多能性幹細胞を培養する際の濃度と同じでよい。
　前方中間中胚葉細胞の生成は、例えば細胞へのＯＳＲ１とＧＡＴＡ３の発現により確認できる。その他の中間中胚葉細胞のマーカーであるＰＡＸ２、ＬＨＸ１およびＨＯＸＢ４の発現を単独で、あるいは組み合わせて確認してもよい。
第３ステージ
　本願の第３ステージは、前方中間中胚葉細胞から初期ウォルフ管細胞を誘導する工程である。前方中間中胚葉細胞は、第２ステージで得られた細胞である。
　本工程では、前方中間中胚葉細胞を、ＧＳＫ３β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、線維芽細胞増殖因子およびグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）の存在下で二次元培養する。本工程において、培地にはさらにレチノイン酸受容体アゴニストを含んでもよい。
　ＧＳＫ３β阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１を用いる場合、その培地中の濃度は、０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは０．１μＭから１０μＭ、より好ましくは０．５μＭから２μＭ、例えば約１μＭである。
　ＢＭＰ阻害剤としてＬＤＮ１９３１８９を用いる場合、その培地中の濃度は通常０．００１μＭから１０μＭ、好ましくは０．０１μＭから１μＭ、より好ましくは０．０５μＭから０．２μＭ、例えば約０．１μＭである。
　線維芽細胞増殖因子としてＦＧＦ８を用いる場合、その培地中の濃度は通常２ｎｇ／ｍｌから２０μｇ／ｍｌ、好ましくは２０ｎｇ／ｍｌから２μｇ／ｍｌ、より好ましくは１００ｎｇ／ｍｌから４００ｎｇ／ｍｌ、例えば約２００ｎｇ／ｍｌである。
　グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）の培地中の濃度は通常１ｎｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌ、例えば約１００ｎｇ／ｍｌである。
　レチノイン酸受容体アゴニストとしてＴＴＮＰＢを用いる場合、その培地中の濃度は通常０．００１μＭから１０μＭ、好ましくは０．０１μＭから１μＭ、より好ましくは０．０５μＭから０．２μＭ、例えば約０．１μＭである。
　第３ステージにおいて、細胞は第２ステージの後半と同じく細胞外マトリックスタンパク質、例えばマトリゲル（ＴＭ）でコートされた細胞培養用プレートを用いて行えば良い。培養期間は２４時間から約４日、例えば約４８時間とすればよい。
　初期ウォルフ管細胞の生成は、細胞がＧＡＴＡ３を発現し、ＯＳＲ１を発現しないことにより確認することができる。その他のウォルフ管のマーカーであるＰＡＸ２、ＬＨＸ１およびCytokeratin 8の発現を更に調べてもよい。
　本工程で得られた初期ウォルフ管細胞は凍結保存することができる。細胞の凍結および起眠方法は公知の方法を使用することができる。例えば細胞を凍結する方法として、第3ステージで得られた初期ウォルフ管細胞をPBSで洗浄後、細胞分離溶液（例えばAccutase）により細胞培養用プレートから解離させ、遠心分離により上清を除去した後、凍結保存液（例えばstem cell banker）に懸濁し、-80℃で24時間緩慢凍結後、-196℃（液体窒素中）で保存することができる。凍結保存液としてはＤＭＳＯ入りの凍結液などを利用できる。具体的にはセルバンカー（日本全薬工業株式会社）やバンバンカー（日本ジェネティクス株式会社）、ＴＣプロテクター（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）、ＣＰ－１（極東製薬工業株式会社）などが例示される。凍結細胞を起眠する方法として、凍結初期ウォルフ管細胞を37℃の温浴などで迅速に融解し、凍結保存液を遠心洗浄後、培地に懸濁させて用いる方法が例示される。本願の方法で凍結保存させ、起眠させた初期ウォルフ管細胞は、以下の態様における初期ウォルフ管細胞として使用され得る。
第4ステージ
　第4ステージは、第3ステージで得られた初期ウォルフ管細胞から成熟ウォルフ管細胞凝集体を誘導する工程である。初期ウォルフ管細胞は本願の方法により凍結保存し、その後起眠したものであってもよい。第４ステージにおいて、初期ウォルフ管細胞をグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニスト、GSK３β阻害剤およびYes-associated protein(YAP)活性阻害剤の存在下で浮遊培養する。
　第４ステージにおけるグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）の濃度は通常１ｎｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍｌ、例えば約１００ｎｇ／ｍｌである。
　線維芽細胞増殖因子がＦＧＦ１である場合、培地中のその濃度は通常２ｎｇ／ｍｌから２０μｇ／ｍｌ、好ましくは２０ｎｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌ、より好ましくは１００ｎｇ／ｍｌから４００ｎｇ／ｍｌ、例えば約２００ｎｇ／ｍｌである。
　レチノイン酸受容体アゴニストとして、ＴＴＮＰＢを用いる場合、その培地中の濃度は通常０．００１μＭから１０μＭ、好ましくは０．０１μＭから１μＭ、より好ましくは０．０５μＭから０．２μＭ、例えば約０．１μＭである。
　ＧＳＫ３β阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１を用いる場合、培地中の濃度は、通常０．０３μＭから３００μＭ、好ましくは０．３μＭから３０μＭ、より好ましくは１．５μＭから６μＭ、例えば約３μＭである。
　Yes-associated protein(YAP)活性阻害剤としては、公知のものを適宜用いれば良いが、例えばYAP阻害活性とROCK阻害活性の両方の活性を有するThiazovivinが例示される。Thiazovivinを用いる場合、その培地中の濃度は０．１μＭから１００μＭ、好ましくは、１μＭから５０μＭ、さらに好ましくは、５μＭから２０μＭ、例えば約１０μＭである。
　第４ステージにおいて、初期ウォルフ管細胞は細胞非接着性の培養プレート中で培養する。細胞非接着性の細胞培養プレートとは、細胞培養プレートと細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）されていないもの、または、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（poly-HEMA）によるコーティング処理）したものを使用して行うことができる。
　第４ステージの培養期間は２４時間から７２時間、例えば約４８時間とすればよい。第４ステージにおいては、成熟ウォルフ管細胞の凝集体が誘導される。成熟ウォルフ管細胞凝集体のサイズは通常100～1000μm、好ましくは約300μmである。成熟ウォルフ管細胞の生成は、CK8、PAX2およびE-CADHERINの発現により確認できる。
　多能性幹細胞から第１ステージから第３ステージを経て得られた初期ウォルフ管細胞を用いて第４ステージの培養を行った場合、得られる細胞全体に対して約５０％以上、好ましくは約６０％、例えば約７０％程度の割合で、成熟ウォルフ管細胞を得ることができる。また、成熟ウォルフ管細胞は浮遊培養において主に成熟ウォルフ管細胞のみが集積した凝集塊を形成することから、成熟ウォルフ管細胞塊を顕微鏡下でピペットマン等を用いて容易に物理的に単離することができる。
第４’ステージ
　第４’ステージは、第3ステージで得られた初期ウォルフ管細胞から成熟ウォルフ管細胞凝集体を誘導する工程である。初期ウォルフ管細胞は本願の方法により凍結保存し、その後起眠したものであってもよい。第４’ステージにおいて、初期ウォルフ管細胞をＧＳＫ３β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニスト、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）および好ましくはROCK阻害剤の存在下で浮遊培養する。用いる培地は第3ステージで用いた培地、または第3ステージで用いた培地にROCK阻害剤を加えたものである。ROCK阻害剤はアポトーシス抑制のために使用される。
　ROCK阻害剤としてY27632を用いる場合、培地中の濃度は０．１μＭから１００μＭ、好ましくは、１μＭから５０μＭ、さらに好ましくは５μＭから２０μＭ、例えば約１０μＭである。
　第４’ステージにおいて、初期ウォルフ管細胞は第４ステージと同じく細胞非接着性の培養プレート中で培養する。第４’ステージの培養期間は２４時間から７２時間、例えば約４８時間とすればよい。第４’ステージにおいては、成熟ウォルフ管細胞の凝集体が誘導される。成熟ウォルフ管細胞の生成は、CK8、PAX2およびE-CADHERINの発現により確認できる。
　生成した成熟ウォルフ管細胞は浮遊培養において主に成熟ウォルフ管細胞のみが集積した凝集塊を形成することから、成熟ウォルフ管細胞塊を顕微鏡下でピペットマン等を用いて容易に物理的に単離することができる。
第５ステージ
　第５ステージは第4ステージで得られた成熟ウォルフ管細胞凝集塊を尿管芽様組織に誘導する工程である。第5ステージにおいて、成熟ウォルフ管細胞凝集体を、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニスト、GSK３β阻害剤およびYes-associated protein(YAP)活性阻害剤の存在下で三次元培養する。本工程においては、第４ステージで得られる成熟ウォルフ管細胞凝集体を単離し、培地で希釈した三次元スキャホールド材に埋め込み、三次元培養する。用いる培地は第４ステージで用いたものと同じである。
　三次元スキャホールド材としては、培養細胞の三次元立体構造構築用のものが種々知られており、また販売されており、特に限定されない。例えばコラーゲンベースの材料やポリカプロラクトンやポリグリコール酸等のポリマー系の材料、又はそれらの複合体を使用することができる。また、その形態についても特に限定されないが、例えばスポンジ状構造物などが挙げられる。また、三次元スキャホールド材は、生体由来の試料を材料（例えば細胞外マトリックスや基底膜など）とするものであってもよい。具体的には、マトリゲルTM（ベクトン・ディッキンソン社）、typeIコラーゲンゲル、typeIＶコラーゲンゲルなどを挙げることができる。
　マトリゲルTM基底膜マトリックスは、細胞外マトリックスタンパク質を豊富に含むEngelbreth-Holm-Swarm（EHS）マウス肉腫から抽出した可溶性基底膜調製品であり、主にラミニン、コラーゲンIV、エンタクチン、およびヘパラン硫酸プロテオグリカンから構成される。さらに、TGF-β、線維芽細胞増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、EHSなどの他の増殖因子を含む。本願の第５ステージにおいて用いられる三次元スキャホールド材としては、マトリゲルTM基底膜マトリックス（マトリゲル）が好適に用いられる。
　三次元スキャホールド材としてマトリゲルを用いる場合、マトリゲルは培地で通常１：０．５～１：２、例えば約１：１希釈される。
　第５ステージの培養期間は５から３０日、好ましくは７から２０日、例えば約１５日間とすればよい。第５ステージにおいて、尿管芽様細胞の誘導は、ＧＡＴＡ３、ＲＥＴ、ＰＡＸ、ＣＡＬＢ１などのマーカーの発現によって確認することができる。得られる尿管芽様組織のサイズは通常30～200μm、好ましくは約50μmである。また、１つの尿管芽様組織は通常２～３回分枝する。
分枝構造を有する尿管芽様組織が形成されたことは、顕微鏡下で確認することができる。
第５’ステージ
　第５’ステージは第４’ステージで得られた成熟ウォルフ管細胞凝集塊を尿管芽様組織に誘導する工程である。第５’ステージにおいて、成熟ウォルフ管細胞凝集体をＧＳＫ３β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニストおよびグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）の存在下で浮遊培養する。本工程においては、第４’ステージで得られる成熟ウォルフ管細胞の凝集体を単離し、低濃度の三次元スキャホールド材を含む培地中で浮遊培養する。用いる培地は第3ステージで用いたものに三次元スキャホールド材を加えたものである。用いる三次元スキャホールド材は第５ステージで用いたものと同じである。
　三次元スキャホールド材としてマトリゲルを用いる場合、培地中のマトリゲルの濃度は通常１～５％、例えば約２％である。
　第５’ステージの培養期間は１から１５日、好ましくは３から１０日、例えば約６日間とすればよい。第５’ステージにおいて、尿管芽様細胞の誘導は、ＧＡＴＡ３、ＲＥＴ、ＰＡＸ、ＣＡＬＢ１などのマーカーの発現によって確認することができる。分枝構造を有する尿管芽様組織が形成されたことは、顕微鏡下で確認することができる。
第６ステージ
　第６ステージは尿管芽様組織から尿管芽様オルガノイドを誘導する工程である。尿管芽様組織を単離し、ＧＳＫ３β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニストおよびグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）の存在下において低濃度の三次元スキャホールド材を含む培地中で浮遊培養する。尿管芽様組織は本願の方法で得られたものでも、公知の別の方法によって得られたものであってもよい。用いる培地および三次元スキャホールド材は第５’ステージで用いたものと同じである。
　本願の明細書および請求の範囲において、「尿管芽様オルガノイド」は単離培養して得られた分枝構造を有する尿管芽様の自己組織化構造物を意味する。尿管芽様オルガノイドのサイズは通常約100～約1000μｍである。また、１つの尿管芽様オルガノイドは通常３～５回分枝する。尿管芽様組織の誘導は、ＧＡＴＡ３、ＲＥＴ、ＰＡＸ、ＣＡＬＢ１などのマーカーの発現によって確認することができる。尿管芽様組織が分枝構造を有することは、顕微鏡下で確認することができる。
　三次元スキャホールド材としてマトリゲルを用いる場合、培地中のマトリゲルの濃度は通常１～５％、例えば約２％である。
　培養は、５から３０日、好ましくは７から２０日、例えば約１４日間行う。第６ステージにおいて、尿管芽様オルガノイドが形成されたことは顕微鏡下で確認することができる。尿管芽様オルガノイドが極性を有していることは、LAMININおよびEZRINの発現によって確認することができる。
第７ステージ
　第７ステージは、尿管芽様オルガノイドを維持する工程である。尿管芽様オルガノイドの先端領域を切り取り、尿管芽様先端組織を得る工程と、得られた尿管芽様先端組織をＧＳＫ３β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニストおよびグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）の存在下において低濃度の三次元スキャホールド材を含む培地中で浮遊培養する工程を繰り返すことにより、尿管芽様オルガノイドを維持する。尿管芽様オルガノイドは本願の方法で得られたものでも、公知の別の方法によって得られたものであってもよい。第7ステージの工程は少なくとも3回以上繰り返すことが可能であり、繰り返しの回数は特に制限されず、所望の回数を繰り返してよい。用いる培地および三次元スキャホールド材は第５’ステージで用いたものと同じである。
　本願の明細書および請求の範囲において、「尿管芽様先端組織」は、尿管芽様オルガノイドの分枝の先端部分を切り取った組織を意味する。尿管芽様先端組織のサイズは通常30～200μｍであり、好ましくは約50μｍである。尿管芽様先端組織を適当に培養することにより、分枝構造が形成され、尿管芽様オルガノイドが作製され得る。
　培養は１回の工程において、１から１５日、好ましくは３から１０日、例えば約７日間行う。第７ステージにおいて、分枝した尿管芽様組織が形成されたことは顕微鏡下で確認することができる。尿管芽様組織が極性を有していることは、LAMININおよびEZRINの発現によって確認することができる。
第６’ステージ
　第６’ステージは、尿管芽様先端組織を拡大培養する工程である。尿管芽様組織培養物中の組織を単一の細胞ごとに分離し、グリア細胞株由来神経栄養因子、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニスト、GSK３β阻害剤およびYes-associated protein(YAP)活性阻害剤の存在下において三次元培養する。本工程においては、尿管芽様組織培養物を単一の細胞ごとに分離し、三次元スキャホールド材を培地で希釈することにより得られたハイドロゲル上に播種し、三次元培養する。尿管芽様組織培養物は本願の方法で得られたものでも、公知の別の方法によって得られたものであってもよい。用いる培地は第4ステージで用いたものと同じである。
　細胞の分離方法としては、従来公知の細胞凝集塊の分離方法を適宜採用すればよく、例えば、力学的に分離する方法、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、AccutaseおよびAccumaxなど）またはコラゲナーゼ活性のみを有する分離溶液を用いた分離方法が挙げられる。好ましくは、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（特に好ましくは、Accutase）を用いて細胞凝集塊を解離し、力学的に細かく単一細胞へ分散する方法が用いられる。
　三次元スキャホールド材としてマトリゲルを用いる場合、ハイドロゲル中のマトリゲルの濃度は、通常３０％～７０％、例えば約５０％である。
　培養は、１から１５日、好ましくは３から１０日、例えば約６日間または約７日間行う。第６’ステージにおいて、尿管芽様先端組織が誘導されたことはCK8、GATA3およびRETなどのマーカーの発現によって確認することができる。
第７’ステージ
　第７’ステージは、第６’ステージで得られた尿管芽様先端組織から尿管芽様オルガノイドを誘導する工程である。第６’ステージで得られた尿管芽様先端組織をＧＳＫ３β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニストおよびグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）の存在下において低濃度の三次元スキャホールド材を含む培地中で浮遊培養する。用いる培地および三次元スキャホールド材は第５’ステージで用いたものと同じである。
　培養は、５から３０日、好ましくは７から２０日、例えば約１４日間行う。第７’ステージにおいて、尿管芽様オルガノイドが形成されたことは顕微鏡下で確認することができる。尿管芽様オルガノイドが極性を有していることは、LAMININおよびEZRINの発現によって確認することができる。
第７’’ステージ
　第７’’ステージは、尿管芽様先端組織を集合管前駆細胞に誘導する工程である。第６’ステージで得られた尿管芽様先端組織を単離し、Wntシグナル阻害剤およびTGFβシグナル阻害剤の存在下で接着培養する。
　Ｗｎｔシグナル阻害剤としてＩＷＲ－１を用いる場合、その培地中の濃度は、０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは０．１μＭから１０μＭ、より好ましくは０．５μＭから２μＭ、例えば約１μＭである。
　ＴＧＦβ阻害剤としてＡ８３－０１を用いる場合、その培地中の濃度は通常０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは０．１μＭから１０μＭ、より好ましくは０．５μＭから２μＭ、例えば約１μＭである。
　第７’’ステージにおいて、尿管芽様組織は細胞外マトリックスタンパク質、例えばラミニンでコートされた細胞培養プレート中で培養する。培養は１から１５日、好ましくは３から１０日、例えば約７日間行う。集合管前駆細胞の生成は、細胞へのアクアポリン2（AQP2）の発現にて確認できる。
　以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。
［材料と方法］
細胞培養
　ヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）およびヒト胚性幹細胞（hESC）を用いた実験は、京都大学医学科および医学研究科の倫理委員会によって承認された。施設内倫理委員会に従い、hiPSCの由来となったドナー対象からインフォームドコンセントを得た。
　hiPSC/ESCを、Stem Fit AK02N培地（Takara）を用いたフィーダーフリー培養によって、iMatrix-511 silk（Nippi）をコートした細胞培養プレート上に維持した。細胞を0.5mM EDTA/PBS（Thermo Fisher Scientific）を用いて4日ごとに継代し、マイコプラズマ汚染について定期的に検査した。
分化誘導
　本実施例で使用した増殖因子および小分子の詳細を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
前方原始線条（APS）誘導
　未分化hiPSC/ESCを、組織培養プレート上の10μM Y-27632およびiMatrix-511 silkを含む維持培地に2.5x104細胞/cm2の密度で播種した。細胞を24時間後にPBSで洗浄し、10ng/ml骨形成タンパク質（BMP）4（PeproTech）を含む、または含まない100ng/mlアクチビンA（R&D Systems）および3μM CHIR99021（Stem RD）を含むEssential 6培地（Thermo Fisher Scientific）で24時間処理した。
中胚葉誘導
　前方原始線条細胞を、0.1μM LDN193189（Axon Medchem）、1μM A83-01（WAKO）および3μM CHIR99021を含むEssential 6培地で24時間処理し、前体節中胚葉細胞を誘導した。培地を1μg/mlレチノイン酸（RA; MERCK）および0.5μM PD0325901（WAKO）を含むEssential 6培地に24時間交換し、初期体節を誘導した。
　前方中間中胚葉を誘導するために、前方原始線条細胞を、200ng/ml線維芽細胞増殖因子（FGF）8（Peprotech）、0.1μM 4-[(E)-2-(5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5,8,8-テトラメチル-2-ナフタレニル)-1-プロペニル]-安息香酸（TTNPB; Santa Cruz Biotechnology）、1μM A83-01および0.1μM LDN193189で2日間処理した。次に細胞を、マトリゲルをコートしたプレート上の10μM Y-27632を含む前方中間中胚葉誘導培地に1x105細胞/cm2の密度で再播種し、さらに24時間インキュベートした。
ウォルフ管誘導
　前方中間中胚葉細胞を、0.1μM TTNPBを含む、または含まない、1μM CHIR99021、0.1μM LDN193189、200 ng/ml FGF8および100 ng/mlグリア細胞株由来神経栄養因子（GDNF; R&D Systems）を含むEssential 6培地で2日間処理することで、ウォルフ管の最先端の細胞の誘導を増強した。次に細胞をAccutase（Innovative Cell Technologies）で処理した後、穏やかなピペット操作によって単一の細胞に分離した。この細胞を低接着96ウェルプレート（Sumitomo Bakelite）上の100ng/ml GDNF、200ng/ml FGF1（R&D Systems）、0.1μM TTNPB、3μM CHIR99021および10μM Thiazovivin（Santa Cruz Biotechnology）を含むEssential 6培地に1x104細胞/ウェルの密度で播種し、2日間インキュベートして成熟ウォルフ管凝集体を誘導した。
尿管芽の分枝
　得られた成熟ウォルフ管凝集体を低接着96ウェルプレートにおいてEssential 6培地で（1:1）希釈した30μlマトリゲル（BD Biosciences）中に埋め込み、30分間インキュベートした。マトリゲルの凝固後、100ng/ml GDNF、200ng/ml FGF1、0.1μM TTNPB、3μM CHIR99021および10μM Thiazovivinを添加したEssential 6培地を加えた。
成熟ウォルフ管凝集体および尿管芽の誘導の改良法
　前方中間中胚葉細胞から誘導された初期ウォルフ管細胞をAccutaseで処理した後、穏やかなピペット操作によって単一の細胞に分離した。この細胞を低接着96ウェルプレート上の1μM CHIR99021、0.1μM LDN193189、200 ng/ml FGF8、100 ng/ml GDNF、0.1μM TTNPBおよび10μM Y-27632を含むEssential 6培地に1x104細胞/ウェルの密度で播種し、成熟ウォルフ管凝集体を2日間誘導した。
　次に、成熟ウォルフ管凝集体を1μM CHIR99021、0.1μM LDN193189、200ng/ml FGF8、100ng/ml GDNF、0.1μM TTNPBおよび2%マトリゲルを含むEssential 6培地中で浮遊培養し、尿管芽組織を誘導した。
ウォルフ管細胞の凍結保存
　24ウェルプレート中で前方中間中胚葉細胞から誘導された初期ウォルフ管細胞をPBS 0.5mlで一回洗浄した後、Accutase 0.3mlと共に37℃で3分間インキュベートした。ピペット操作をした後、細胞を回収し、2.7mlのDMEMおよび10 % FBS液を加え、900RPMで5分間遠心した。上清を除去した後、stem cell banker 3mlで懸濁し、3本のストックチューブに1mlずつ分注した。-80℃で24時間緩慢凍結した後、液体窒素タンクへ移動し、保存した。
尿管芽組織の分枝の進行
　尿管芽組織を顕微鏡下で成熟ウォルフ管凝集体から機械的に単離し、1μM CHIR99021、0.1μM LDN193189、200ng/ml FGF8、100ng/ml GDNF、0.1μM TTNPBおよび2%マトリゲルを含むEssential 6培地中で浮遊培養した。
　さらに作製した構造体の先端領域を機械的に切り取り、1μM CHIR99021、0.1μM LDN193189、200ng/ml FGF8、100ng/ml GDNF、0.1μM TTNPBおよび2%マトリゲルを含むEssential 6培地中で浮遊培養した。
尿管芽オルガノイドの拡大培養法
　尿管芽組織を機械的単離せず、37℃で3分間Accutase処理し、分離させた。DMEM/F12+B27(vit A free)に各因子（3μM CHIR99021、10μM Thiazovivin、200ng/ml FGF1、0.1μM TTNPB、および100ng/ml GDNF）を加えた培地で懸濁した。5-6個の凝集体から得られた単一細胞を48ウェルプレート上に作製したハイドロゲル上に播種して培養した。ハイドロゲルは、50％マトリゲルを含むDMEM/F12+B27(vit A free)培地を37℃で30分インキュベートして凝固させることで作製した。
　6日間培養した後、上記の培地にCell recovery solutionを1ml加え、4℃で1時間インキュベートした。ハイドロゲルを溶解し、チューブに移した後、さらに2ml Cell recovery solutionを加えて軽くピペット操作をした。500Gで5分間遠心し、上清を捨てEssential 6培地2mlで洗浄した。その後500Gで5分間遠心し、上清を捨て、Essential 6培地に各因子（1μM CHIR99021、0.1μM LDN193189、200ng/ml FGF8、100ng/ml GDNF、0.1μM TTNPBおよび2%マトリゲル）を加えて35mm非接着プレートで培養した。4日目に1つの凝集体ごとに96ウェルプレートの各ウェルに移動してさらに培養した。
集合管前駆細胞の誘導
　尿管芽オルガノイドの拡大培養法において、ハイドロゲル上に播種した細胞を7日間培養後、Accutase処理により単一の細胞に解離した。この単一細胞をiMatrix-silkをコーティングしたプレート上の1μM IWR-1および1μM A83-01を含むEssential 6培地に播種し、さらに7日間培養した。
免疫染色
　細胞を4% PFA/PBSを用いて4℃で20分間固定した。PBSで洗浄した後、細胞を1％正常ロバ血清（Millipore）および3％ウシ血清アルブミン（BSA; Nacalai Tesque）/PBST （PBS/0.25%トリトンX100）を用いて室温で1時間ブロックした。一次抗体をブロッキング溶液に希釈し、試料と共に4℃で一晩インキュベートした。二次抗体を室温で1時間インキュベートした。
　細胞凝集体を4%PFA/PBSを用いて4℃で一晩固定した。固定した凝集体を30%ショ糖緩衝液で処理し、次にOCT化合物（Tissue-Tek）で凍結し、凍結切片法によって凍結切片を作製した。凍結切片を蒸留水で洗浄し、ブロッキング溶液を用いて室温で1時間インキュベートした。一次抗体をブロッキング溶液に希釈し、試料と共に室温で一晩インキュベートした。次いで、細胞を二次抗体と共に室温で1時間インキュベートした。本実施例で使用した抗体の詳細を表２および表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
フローサイトメトリー
　細胞をAccutaseで分離した後、BD Cytofix/Cytopermキット（Becton Dickinson）で固定、透過処理、およびブロックした。次に細胞を、ブロッキング溶液で1:100に希釈した一次抗体と共に室温で30分インキュベートした。細胞を2回洗浄した後、ブロッキング溶液で1:500に希釈した二次抗体と共に室温で30分インキュベートした。その後、細胞をFACS AriaIIセルソーター（Becton Dickinson）を用いて分析した。
［結果］
hiPSCから前方中間中胚葉細胞への分化
　hPSC由来の前方原始線条細胞をインビトロで前体節中胚葉に分化できることが公知であるため（K.M. Loh et al, Cell 166 (2016) 451-467）、本発明者らはまずhiPSCを前方原始線条に分化し、その後前体節中胚葉に誘導する方法を確立することを目的とした（図１Ａ、図５Ａ）。本発明者らは以前に、アクチビンAおよびGSK3β阻害剤であるCHIR99021を用いてhPSCから前方原始線条を誘導する方法を確立している（S.I. Mae et al, Nat. Commun. 4 (2013) 1367）。そこで以前に作製したOSR-GFPノックインhiPSC株（3D45）（S.I. Mae et al, Nat. Commun. 4 (2013) 1367）を100ng/mlアクチビンAおよび3μM CHIR99021を含むフィーダーフリー培養下で処理し、無血清二次元培養でBRACHYURY＋細胞を誘導した（図５Ｂ）。前方原始線条から前体節中胚葉を誘導するために、既報の方法（K.M. Loh et al, Cell 166 (2016) 451-467）を改変し、前体節中胚葉のマーカーであるTBX6の発現を観察した（図５Ｃ）。MEK阻害剤のPD0325901（これはFGFシグナル伝達の刺激を阻害する）およびRAを用いてhiPSC由来のTBX6＋細胞の発生能を評価した結果、PAX3＋初期体節細胞への分化が見出された（図５Ｄ）。これらの結果は、hiPSCを前方原始線条分化を介して前体節中胚葉に誘導する方法が確立されたことを支持している。
　初期前体節中胚葉をFGF9とRAの処理によって前方中間中胚葉に誘導できることが報告されているが（M. Takasato et al, Nature 526 (2015) 564-568）、中間中胚葉の最も初期のマーカーの1つであるOsr1の発現はマウスの中間中胚葉発生においてFgf9よりも早くに検出される（J.S. Colvin et al, Dev. Dyn. 216 (1999) 72-88; P.L. So et al, Mech. Dev. 84 (1999) 157-160; Q. Wang et al, Dev. Biol. 288 (2005) 582-594）。そこで前体節中胚葉および中間中胚葉において発現するFGF8（B. Wilm et al, Dev. Biol. 271 (2004) 176-189）、およびRAアゴニストであるTTNPB（これはOSR1の発現を誘導できる; T. Araoka et al, PLoS One 9 (2014), e84881）を用いて、前方中間中胚葉の発生学的起源を特定した。OSR1（GFP）および前方中間中胚葉マーカーであるGATA3の免疫染色分析の結果、前体節中胚葉細胞は併用処理によってOSR1＋GATA3＋前方中間中胚葉細胞に誘導されず、OSR1＋GATA3－中間中胚葉様細胞に分化したことがわかった（図１Ｂ）。驚くべきことに、前方原始線条細胞が同じ処理でOSR1＋GATA3＋前方中間中胚葉様細胞に分化した（図１Ｂ）。従前の報告は、前方原始線条よりも長くWnt刺激に曝露された前体節中胚葉は後方中間中胚葉に誘導された後、ネフロン前駆（NP）細胞に分化し得ることを示している（M. Takasato et al, Nature 526 (2015) 564-568）。前体節中胚葉からネフロン前駆細胞を誘導するための従前報告されたプロトコル（A. Taguchi et al, Cell Stem Cell 14 (2014) 53-67; M. Takasato et al, Nature 526 (2015) 564-568; R. Morizane et al, Nat. Biotechnol. 33 (2015) 1193-1200）を改変することによって、前体節中胚葉をOSR1＋SIX2＋ネフロン前駆様細胞に分化させることに成功した（図５Ｅ）。これらのデータは前方中間中胚葉と後方中間中胚葉の発生学的起源が異なっていることを示している。
前方中間中胚葉細胞の頑強な誘導方法の確立
　前方中間中胚葉細胞の誘導効率を改善するために、TGFβシグナル伝達阻害剤であるA83-01をFGF8およびTTNPBに追加することで、SOX17＋胚体内胚葉細胞の分化が減少した（図５Ｆ）。誘導されたOSR1＋GATA3＋中間中胚葉様細胞は他の前方中間中胚葉マーカー（PAX2、LHX1およびHOXB4を含む）を発現していた（図１Ｃ）。OSR1＋細胞、GATA3＋細胞、LHX1＋細胞およびHOXB4＋細胞は得られた全細胞数に対してそれぞれ46.6±13.6%、35.8±18.2%、69.6±16.5%および67.2±14.5%（n=4）であった（図１Ｄ）。この結果から、前方中間中胚葉細胞は3つの因子（FGF8、TTNPBおよびA83-01）を用いた処理によって前方原始線条から生成することが確認された。
　BMPシグナルは腎臓発生の様々な面において重要な役割を担っているため（L. Oxburgh et al, Pediatr. Nephrol. 29 (2014) 531-536）、BMPシグナルの効果を前方原始線条誘導および前方中間中胚葉誘導の各段階において調べた。BMP4を前方原始線条誘導の段階で添加すると、OSR1＋GATA3＋細胞の割合が得られた全細胞数に対して約70%に増加した（図１Ｅ、ＦおよびＨ）。一方、BMPシグナル阻害剤であるLDN193189を前方中間中胚葉誘導段階で添加してもOSR1＋GATA3＋細胞の誘導効率は変化せず、またBMP4の添加は分化を阻害した。これらの結果はBMPシグナルが前方原始線条から前方中間中胚葉への分化に必要でないことを示唆する（図１Ｅ、ＧおよびＨ）。これはBmpシグナル伝達経路の下流の分子であるSmad1がニワトリの発生初期の前方中間中胚葉領域においてリン酸化されていないという知見と一貫している（S. Faure et al, Dev. Biol. 244 (2002) 44-65）。
　次に、本願の前方中間中胚葉細胞分化プロトコルが、3D45に加えて、mCherryを構成的に発現するhiPSC株（511-3E; F. Oceguera-Yanez et al, Methods 101 (2016) 43-55）、常染色体優性多発性嚢胞腎（ADPKD）を患う患者から確立されたhiPSC株（CiRA00009; T. Ameku et al, Sci. Rep. 6 (2016) 30013）およびヒト胚性幹細胞（hESC）株（KhES3; H. Suemori et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 345 (2006) 926-932）を含む複数のhPSC株に適用可能であることを確認した。この結果は本願におけるhPSCから前方中間中胚葉細胞への分化方法の頑強性を支持する（図６）。
ウォルフ管細胞の誘導
　ウォルフ管は表層外胚葉から分泌されるWntタンパク質の影響下において前方中間中胚葉から背側に形成されるため（T. Obara-Ishihara et al, Development 126 (1999) 1103-1108）、外因性WNTが前方中間中胚葉細胞からウォルフ管への分化に必要であり得ることが想定される（図２Ａ）。前方中間中胚葉細胞にCHIR99021を添加すると、OSR－GATA3＋PAX2＋細胞の分化が増強された（図２Ｂ）。Osr1発現の低下はウォルフ管誘導の重要なマーカーであるため（F. Costantini et al, Dev. Cell 18 (2010) 698-712）、この所見はウォルフ管分化の開始を示唆している。一方、WNTシグナル伝達阻害剤であるIWR-1を補充すると、OSR1発現が延長され、GATA3およびPAX2発現が減少した（図２Ｂ）。
　表層外胚葉および側板中胚葉から分泌されたBmp4のウォルフ管誘導に対する効果に関して、矛盾した結果が報告されている（T. Obara-Ishihara et al, Development 126 (1999) 1103-1108; T. Yoshino et al, Nat. Commun. 7 (2016) 12561）。本発明者らは、BMP4の添加が前方中間中胚葉細胞からウォルフ管への分化を抑制し、LDN193189処理が誘導を増強したことを見出した（図２Ｃ）。これらの結果はWNT活性化とBMP阻害の両方がウォルフ管誘導を促進することを示唆している。
　ウォルフ管の最先端の細胞は伸長している間、高用量のFGF8に引きつけられ、ウォルフ管の後部の細胞はFGFシグナルの減少によって上皮化が増強することが知られている（Y. Atsuta et al, Development 142 (2015) 2329-2337）。想定されるように、FGF8の補充はGATA3＋細胞の数を増加させた（図２Ｄ）。また、GDNFの添加はGATA3＋ウォルフ管細胞の数を増加させ（図２ＥおよびＦ）、この細胞は増殖マーカーKi67およびRETを発現していた（図２ＦおよびＧ）。さらにこのGATA3＋ウォルフ管細胞はE-CADHERINを発現していなかったが、PAX2、LHX1およびCytokeratin 8（CK8）を含む他のウォルフ管マーカーを発現していた（図２Ｈ）。この結果はウォルフ管の最先端の細胞に分化していることを示している。本願における分化プロトコルはまた、hESC由来の前方中間中胚葉細胞から伸長する間にウォルフ管細胞を効率的に作製し（図７Ａ）、ウォルフ管細胞に分化しなかった細胞は神経前駆細胞のマーカーであるPAX6またはOSR1を発現していた（図７Ｂ）。
　また、ウォルフ管細胞マーカーであるRETの上流はレチノイン酸シグナルであることが知られている。前方中間中胚葉細胞にさらにTTNPBを添加すると初期ウォルフ管細胞が安定的に作製され（データ示さず）、レチノイン酸シグナル伝達阻害剤であるAGN193109を添加するとRET発現が低下した（図８Ａ、Ｂ）。
分枝する尿管芽組織の作製
　最近の報告によると、単離されたマウス胚性尿管芽細胞を5つの因子（Gdnf、Fgf1、RA、CHIR99021およびY-27632）で併用処理すると、インビトロにおいて分枝構造の形成が誘導される（S. Yuri et al, Stem Cell Rep. 8 (2017) 401-416）。また、尿管芽の分枝にはYes-associated protein（YAP）活性の抑制が必要であり（A. Reginensi et al, Nat. Commun. 7 (2016) 12309）、ROCK阻害剤であるThiazovivinはYAP活性を阻害する（Y. Oku et al, FEBS Open Bio. 5 (2015) 542-549）。そこで、上記の組合せのRAとY-27632をそれぞれTTNPBとThiazovivinに交換し、この5つの因子の存在下でウォルフ管細胞凝集体を形成することを試みた。2日間浮遊培養した後、GATA3＋細胞は他の細胞種から自発的に分離し、集合してE-CADHENRIN＋上皮構造を形成した（図３ＡおよびＢ）。次いで不要な細胞をピペット操作で機械的に取り除いた（図３Ｃ）。単離された上皮構造は、成熟ウォルフ管マーカーであるRET、CALB1、CDH16およびSOX9を発現していた（図３Ｄ）。
　次に尿管芽構造を誘導するため、ウォルフ管上皮凝集体を5つの因子の存在下でマトリゲルに埋め込んだ。その結果、GATA3、PAX2、RETおよびCALB1を発現する尿管芽様出芽構造（図３Ｇ）が形成された（図３ＥおよびＦ）。さらなる培養によって、これらの尿管芽様構造の拡大および分枝組織の形成が誘導された（図３Ｈ）。先端の細胞はRETを発現し（図３Ｈ）、幹の細胞はCK19染色に陽性であった（図３Ｈ）。この結果は極性を有する分枝する尿管芽様組織の発生を示している。
尿管芽組織作製の改良法
　前方中間中胚葉細胞からウォルフ管細胞を誘導するための培養時間を延長することによりE-CADHERIN陽性細胞が増加したため（図９ＡおよびＢ）、前方中間中胚葉細胞からウォルフ管細胞を誘導する因子（CHIR99021、LDN193189、FGF8、TTNPBおよびGDNF）を用いてウォルフ管上皮凝集体を作製できることが想定された。ウォルフ管細胞をこれらの因子およびY-27632の存在下で2日間浮遊培養すると、上記の5つの因子（Gdnf、Fgf1、TTNPB、CHIR99021およびThiazovivin）での培養と同様にGATA3＋細胞が他の細胞種から自発的に分離し、集合してE-CADHENRIN＋上皮構造を形成した（図９Ｃ左）。また不要な細胞をピペット操作で機械的に取り除くことも可能であった（図９Ｃ右）。
　次に、成熟ウォルフ管凝集体を各因子（CHIR99021、LDN193189、FGF8、TTNPBおよびGDNF）および2%マトリゲルを含むEssential 6培地中で浮遊培養し、尿管芽構造を誘導した（図１０ＡおよびＢ）。その結果、管腔側においてEZRIN、基底膜側においてマトリゲル由来のLAMININが染色された、極性を有する尿管芽が作製された（図１０ＣおよびＤ）。
ウォルフ管細胞の凍結保存
　上記方法で前方中間中胚葉細胞から初期ウォルフ管細胞を誘導した後、stem cell bankerを用いてウォルフ管細胞を凍結保存した（図１１Ａ）。この細胞を起眠し、上記改良法と同じ因子（CHIR99021、LDN193189、FGF8、TTNPB、GDNFおよびY-27632）の存在下で浮遊培養することによって、GATA3＋細胞が他の細胞種から自発的に分離し、集合してE-CADHENRIN＋上皮構造を形成した。また、不要な細胞をピペット操作で機械的に取り除くことも可能であった（図１１Ｂ）。
尿管芽組織の分枝の進行
　尿管芽組織作製の改良法で得られた極性を有する尿管芽組織を顕微鏡下で成熟ウォルフ管細胞凝集体から機械的に単離し、低濃度マトリゲル含有培地で浮遊培養した。その結果、尿管芽オルガノイドが作製された（図１２Ａ～Ｃ）。この尿管芽オルガノイドは極性を維持しており（図１２Ｆ）、RET陽性の先端の細胞およびCK8陽性の幹の細胞を含んでいた（図１２ＤおよびＥ）。
　次に、この尿管芽オルガノイドの分枝の先端領域を機械的に切り取り、単離した尿管芽先端組織を低濃度マトリゲル含有培地で浮遊培養した。その結果、再度分枝構造を形成する尿管芽オルガノイドを作製できることがわかった（図１３Ａ～Ｃ）。作製した尿管芽オルガノイドの先端領域を切り取り、切り取った尿管芽先端組織を浮遊培養して尿管芽オルガノイドを作製することを繰り返すことで、尿管芽先端組織を維持できることが示された。
尿管芽オルガノイドの拡大培養法
　尿管芽組織作製の改良法で得られた極性を有する尿管芽様組織を成熟ウォルフ管細胞凝集体と共にAccutase処理によって単一細胞ごとに分離した。これらの細胞をハイドロゲル上で三次元培養した結果、GATA3/RET共陽性の尿管芽先端組織が多数作製された（図１４Ａ～Ｄ）。また、作製された尿管芽先端組織を低濃度マトリゲル培地中で浮遊培養させると、尿管芽オルガノイドが作製された（図１５Ａ～Ｄ）。これらの結果は、極性を有する尿管芽を成熟ウォルフ管細胞凝集体と共に単一細胞ごとに分離し、培養することによって、1つの凝集体から多数の尿管芽オルガノイドを作製できることを示している。
集合管前駆細胞の誘導
　尿管芽オルガノイドの拡大培養法において、ハイドロゲル上で三次元培養することによって得られたGATA3/RET共陽性の尿管芽先端組織をAccutase処理によって単一細胞ごとに分離した。これらの細胞を接着培養した結果、細胞は集合管前駆細胞マーカーであるアクアポリン2（AQP2）を発現していた（図１６ＡおよびＢ）。

Claims (22)

  1. 　（１）前方原始線条細胞を線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニスト、TGFβ阻害剤、およびBMP阻害剤の存在下で二次元培養して、前方中間中胚葉細胞培養物を得る工程、および
    　（２）前方中間中胚葉細胞培養物をGSK3β阻害剤、BMP阻害剤、線維芽細胞増殖因子およびグリア細胞株由来神経栄養因子の存在下で二次元培養する工程を含む、初期ウォルフ管細胞を誘導する方法。
  2. 　（１）の工程において、線維芽細胞増殖因子がFGF8であり、レチノイン酸受容体アゴニストがTTNPBであり、TGFβ阻害剤がA83-01であり、BMP阻害剤がLDN193189である、請求項１記載の方法。
  3. 　（２）の工程において、GSK3β阻害剤がCHIR99021であり、BMP阻害剤がLDN193189であり、線維芽細胞増殖因子がFGF8である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　（２）の工程においてさらにレチノイン酸受容体アゴニストが存在している、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 　（２）の工程において、レチノイン酸受容体アゴニストがTTNPBである、請求項４記載の方法。
  6. 　多能性幹細胞を、アクチビン受容体キナーゼ４，７の活性化剤、GSK3β阻害剤、およびBMP4の存在下で二次元培養して、前方原始線条細胞を得る工程をさらに含む、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
  7. 　前方原始線条細胞を得る工程において、アクチビン受容体キナーゼ４，７の活性化剤がアクチビンAであり、GSK3β阻害剤がCHIR99021である、請求項６記載の方法。
  8. 　請求項１～７のいずれかに記載の方法によって初期ウォルフ管細胞を得、さらに初期ウォルフ管細胞を凍結保存する工程を含む、凍結初期ウォルフ管細胞を製造する方法。
  9. 　請求項１～７のいずれかに記載の方法によって初期ウォルフ管細胞を得、さらに
    　（３）初期ウォルフ管細胞を、グリア細胞株由来神経栄養因子、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニスト、GSK３β阻害剤およびYes-associated protein(YAP)活性阻害剤の存在下で浮遊培養して、成熟ウォルフ管細胞凝集体を得る工程、および
    　（４）成熟ウォルフ管細胞凝集体を、グリア細胞株由来神経栄養因子、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニスト、GSK３β阻害剤およびYes-associated protein(YAP)活性阻害剤の存在下で三次元培養する工程を含む、尿管芽様組織を誘導する方法。
  10. 　（３）および（４）の工程において、線維芽細胞増殖因子がFGF1であり、レチノイン酸受容体アゴニストがTTNPBであり、GSK３β阻害剤がCHIR99021であり、Yes-associated protein(YAP)活性阻害剤がThiazovivinである、請求項９記載の方法。
  11. 　請求項１～７のいずれかに記載の方法によって初期ウォルフ管細胞を得、さらに
    　（３’）初期ウォルフ管細胞を、GSK3β阻害剤、BMP阻害剤、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニストおよびグリア細胞株由来神経栄養因子の存在下で浮遊培養して、成熟ウォルフ管細胞凝集体を得る工程、および
    　（４’）成熟ウォルフ管細胞凝集体を、GSK3β阻害剤、BMP阻害剤、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニストおよびグリア細胞株由来神経栄養因子の存在下で浮遊培養する工程を含む、尿管芽様組織を誘導する方法。
  12. 　（３’）および（４’）の工程において、GSK3β阻害剤がCHIR99021であり、BMP阻害剤がLDN193189であり、線維芽細胞増殖因子がFGF8であり、レチノイン酸受容体アゴニストがTTNPBである、請求項１１記載の方法。
  13. 　請求項９～１２のいずれかに記載の方法で尿管芽様組織培養物を得、さらに
    　（５－１）尿管芽様組織を単離する工程、および
    　（５－２）単離した尿管芽様組織を、GSK3β阻害剤、BMP阻害剤、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニストおよびグリア細胞株由来神経栄養因子の存在下で浮遊培養する工程を含む、尿管芽様オルガノイドを誘導する方法。
  14. 　（５－２）の工程において、GSK3β阻害剤がCHIR99021であり、BMP阻害剤がLDN193189であり、線維芽細胞増殖因子がFGF8であり、レチノイン酸受容体アゴニストがTTNPBである、請求項１３記載の方法。
  15. 　請求項１３または１４に記載の方法で尿管芽様オルガノイド培養物を得、さらに
    　（６－１）尿管芽様オルガノイドの先端領域を切り取り、尿管芽様先端組織を得る工程、
    　（６－２）尿管芽様先端組織を、GSK3β阻害剤、BMP阻害剤、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニストおよびグリア細胞株由来神経栄養因子の存在下で浮遊培養して、尿管芽様オルガノイドを誘導する工程、および
    　（６－３）工程（６－１）および工程（６－２）を繰り返す工程を含む、尿管芽様オルガノイドを維持する方法。
  16. 　（６－２）の工程において、GSK3β阻害剤がCHIR99021であり、BMP阻害剤がLDN193189であり、線維芽細胞増殖因子がFGF8であり、レチノイン酸受容体アゴニストがTTNPBである、請求項１５記載の方法。
  17. 　請求項９～１２のいずれかに記載の方法で尿管芽様組織培養物を得、さらに
    　（５’－１）尿管芽様組織培養物中の組織を単一細胞に分離する工程、および
    　（５’－２）前記単一細胞をグリア細胞株由来神経栄養因子、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニスト、GSK３β阻害剤およびYes-associated protein(YAP)活性阻害剤の存在下で三次元培養する工程を含む、尿管芽様先端組織を拡大培養する方法。
  18. 　（５’－２）の工程において、線維芽細胞増殖因子がFGF1であり、レチノイン酸受容体アゴニストがTTNPBであり、GSK３β阻害剤がCHIR99021であり、Yes-associated protein(YAP)活性阻害剤がThiazovivinである、請求項１７記載の方法。
  19. 　請求項１７または１８に記載の方法で尿管芽様先端組織を得、さらに
    　（６’）尿管芽様先端組織をGSK3β阻害剤、BMP阻害剤、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニストおよびグリア細胞株由来神経栄養因子の存在下で浮遊培養する工程を含む、尿管芽様オルガノイドを誘導する方法。
  20. 　（６’）の工程において、GSK3β阻害剤がCHIR99021であり、BMP阻害剤がLDN193189であり、線維芽細胞増殖因子がFGF8であり、レチノイン酸受容体アゴニストがTTNPBである、請求項１９記載の方法。
  21. 　請求項１７または１８に記載の方法で尿管芽様先端組織を得、さらに
    　（６’’－１）尿管芽様先端組織を単一細胞に分離する工程、および
    　（６’’－２）前記単一細胞をWntシグナル阻害剤およびTGFβシグナル阻害剤の存在下で接着培養する工程を含む、集合管前駆細胞を誘導する方法。
  22. 　（６’’－２）の工程において、Wntシグナル阻害剤がIWR-1であり、TGFβシグナル阻害剤がA83-01である、請求項２１に記載の方法。
PCT/JP2018/042567 2017-11-17 2018-11-16 尿管芽様組織誘導方法 Ceased WO2019098349A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16/763,875 US20210009960A1 (en) 2017-11-17 2018-11-16 Method for inducing ureteric bud-like tissue
JP2019554327A JP7162349B2 (ja) 2017-11-17 2018-11-16 尿管芽様組織誘導方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762587693P 2017-11-17 2017-11-17
US62/587,693 2017-11-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019098349A1 true WO2019098349A1 (ja) 2019-05-23

Family

ID=66538726

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2018/042567 Ceased WO2019098349A1 (ja) 2017-11-17 2018-11-16 尿管芽様組織誘導方法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20210009960A1 (ja)
JP (1) JP7162349B2 (ja)
WO (1) WO2019098349A1 (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020213734A1 (ja) * 2019-04-19 2020-10-22 国立大学法人京都大学 ネフロン前駆細胞の製造方法
WO2021066076A1 (ja) 2019-10-01 2021-04-08 国立大学法人京都大学 尿管芽先端部細胞の単離方法
WO2022163670A1 (ja) * 2021-01-26 2022-08-04 国立大学法人九州大学 多能性幹細胞から卵巣組織を分化させる培養技術
JP2023549137A (ja) * 2020-11-02 2023-11-22 コンセプション バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 性腺体細胞のインビトロ誘導
WO2023228908A1 (ja) 2022-05-23 2023-11-30 国立大学法人京都大学 腎集合管細胞および腎盂上皮細胞の製造方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20230340419A1 (en) * 2020-04-27 2023-10-26 University Of Southern California Methods for generation of mouse and human ureteric bud organoids and collecting duct organoids

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150284689A1 (en) * 2012-10-26 2015-10-08 The Regents Of The University Of California Strategy for engineering various 3d tissues, organoids and vasculature
JP2018183137A (ja) * 2017-04-25 2018-11-22 国立大学法人 熊本大学 多能性幹細胞から樹状分岐した集合管を伴う腎臓構造を作製する方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016085765A1 (en) * 2014-11-25 2016-06-02 President And Fellows Of Harvard College Methods for generation of podocytes from pluripotent stem cells and cells produced by the same

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150284689A1 (en) * 2012-10-26 2015-10-08 The Regents Of The University Of California Strategy for engineering various 3d tissues, organoids and vasculature
JP2018183137A (ja) * 2017-04-25 2018-11-22 国立大学法人 熊本大学 多能性幹細胞から樹状分岐した集合管を伴う腎臓構造を作製する方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARAOKA, TOSHIKAZU ET AL.: "Efficient and Rapid Induction of Human iPSCs/ESCs into Nephrogenic Intermediate Mesoderm Using Small Molecule-Based Differentiation Methods", PLOS ONE, vol. 9, no. 1, 2014, pages e84881, XP055184928, DOI: doi:10.1371/journal.pone.0084881 *
MAE, SHIN-ICHI ET AL.: "Generation of Branching ureteric bud tissues from human pluripotent stem cells", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 495, 20 November 2017 (2017-11-20) - 1 January 2018 (2018-01-01), pages 954 - 961, XP055609767 *
REGINENSI, ANTOINE ET AL.: "A critical role for NF2 and the Hippo pathway in branching morphogenesis", NATURE COMMUNICATIONS, vol. 7, August 2016 (2016-08-01), pages 12309, XP055609762 *
TAGUCHI, ATSUHIRO ET AL.: "Higher-Order Kidney Organogenesis from Pluripotent Stem Cells", CELL STEM CELL, vol. 21, no. 6, 9 November 2017 (2017-11-09), pages 730 - 746, XP085301486 *
YAMASHITA, KAZUNARI ET AL.: "Development of kidney and its molecular mechanism", PROTEIN, NUCLEIC ACID AND ENZYME, vol. 50, no. 6, 2005, pages 644 - 649 *
YURI, SHUNSUKE ET AL.: "In Vitro Propagation and Branching Morphogenesis from Single Ureteric Bud Cells", STEM CELL REPORTS, vol. 8, February 2017 (2017-02-01), pages 401 - 416, XP055609758 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7471558B2 (ja) 2019-04-19 2024-04-22 国立大学法人京都大学 ネフロン前駆細胞の製造方法
JPWO2020213734A1 (ja) * 2019-04-19 2020-10-22
WO2020213734A1 (ja) * 2019-04-19 2020-10-22 国立大学法人京都大学 ネフロン前駆細胞の製造方法
WO2021066076A1 (ja) 2019-10-01 2021-04-08 国立大学法人京都大学 尿管芽先端部細胞の単離方法
JPWO2021066076A1 (ja) * 2019-10-01 2021-04-08
KR20220069096A (ko) 2019-10-01 2022-05-26 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠 요관아 선단부 세포의 단리 방법
JP7619633B2 (ja) 2019-10-01 2025-01-22 国立大学法人京都大学 尿管芽先端部細胞の単離方法
EP4043553A4 (en) * 2019-10-01 2023-11-22 Kyoto University METHOD FOR ISOLATING URETERIC BUD TIP CELLS
JP2023549137A (ja) * 2020-11-02 2023-11-22 コンセプション バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 性腺体細胞のインビトロ誘導
JP2022114012A (ja) * 2021-01-26 2022-08-05 国立大学法人九州大学 多能性幹細胞から卵巣組織を分化させる培養技術
WO2022163670A1 (ja) * 2021-01-26 2022-08-04 国立大学法人九州大学 多能性幹細胞から卵巣組織を分化させる培養技術
JP7729579B2 (ja) 2021-01-26 2025-08-26 国立大学法人九州大学 多能性幹細胞から卵巣組織を分化させる培養技術
WO2023228908A1 (ja) 2022-05-23 2023-11-30 国立大学法人京都大学 腎集合管細胞および腎盂上皮細胞の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20210009960A1 (en) 2021-01-14
JPWO2019098349A1 (ja) 2020-11-26
JP7162349B2 (ja) 2022-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7162349B2 (ja) 尿管芽様組織誘導方法
EP3060652B1 (en) In vitro production of foregut stem cells
US10961508B2 (en) Method for inducing alveolar epithelial progenitor cells
JP7011260B2 (ja) ドーパミン産生神経前駆細胞の製造方法
JP7471558B2 (ja) ネフロン前駆細胞の製造方法
JP7201223B2 (ja) 多能性幹細胞から、内胚葉系細胞を選択的に誘導する方法
CN106536718B (zh) 胰芽细胞的制造方法及含有胰芽细胞的胰疾病治疗剂
JPWO2016143803A1 (ja) 肺胞上皮細胞の分化誘導法
JP6883859B2 (ja) 膵芽細胞の製造方法
JP7357369B2 (ja) 新規腎前駆細胞マーカーおよびそれを利用した腎前駆細胞の濃縮方法
JP7274683B2 (ja) 多能性幹細胞から樹状分岐した集合管を伴う腎臓構造を作製する方法
JP7619633B2 (ja) 尿管芽先端部細胞の単離方法
US20220135940A1 (en) Method for producing kidney structure having dendritically branched collecting duct from pluripotent stem cells
CN119948151A (zh) 胰腺内胚层细胞的制造方法
US12024721B2 (en) Method of differentiating human pluripotent stem cells to podocytes
WO2018021293A1 (ja) Ｐｔｆ１ａ陽性細胞の製造方法
WO2025127102A1 (ja) 肝幹細胞の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18878032

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019554327

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 18878032

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1