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WO2019092387A1 - Procede d'extraction de carotenoides-composition et produits associes - Google Patents

Procede d'extraction de carotenoides-composition et produits associes Download PDF

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WO2019092387A1
WO2019092387A1 PCT/FR2018/052821 FR2018052821W WO2019092387A1 WO 2019092387 A1 WO2019092387 A1 WO 2019092387A1 FR 2018052821 W FR2018052821 W FR 2018052821W WO 2019092387 A1 WO2019092387 A1 WO 2019092387A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
carotenoids
cells
composition
solvent
diol
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/FR2018/052821
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English (en)
Inventor
Ruxandra TODERASC
Hajer ARTIGUE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Algobiotech
Original Assignee
Algobiotech
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Algobiotech filed Critical Algobiotech
Publication of WO2019092387A1 publication Critical patent/WO2019092387A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D11/00—Solvent extraction
    • B01D11/02—Solvent extraction of solids
    • B01D11/0288—Applications, solvents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
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    • A23L5/44—Addition of dyes or pigments, e.g. in combination with optical brighteners using naturally occurring organic dyes or pigments, their artificial duplicates or their derivatives using carotenoids or xanthophylls
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01D—SEPARATION
    • B01D11/00—Solvent extraction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C403/00—Derivatives of cyclohexane or of a cyclohexene or of cyclohexadiene, having a side-chain containing an acyclic unsaturated part of at least four carbon atoms, this part being directly attached to the cyclohexane or cyclohexene or cyclohexadiene rings, e.g. vitamin A, beta-carotene, beta-ionone
    • C07C403/24—Derivatives of cyclohexane or of a cyclohexene or of cyclohexadiene, having a side-chain containing an acyclic unsaturated part of at least four carbon atoms, this part being directly attached to the cyclohexane or cyclohexene or cyclohexadiene rings, e.g. vitamin A, beta-carotene, beta-ionone having side-chains substituted by six-membered non-aromatic rings, e.g. beta-carotene
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B61/00—Dyes of natural origin prepared from natural sources, e.g. vegetable sources
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes

Definitions

  • the present invention relates to a method for extracting carotenoids from cells, as well as to a composition obtainable by said process and products containing said composition.
  • Carotenoids are natural pigments found in many living organisms. They are present in green and yellow vegetables and fruits such as carrots, citrus fruits, broccoli and spinach, but also in algae, many fungi, microalgae and cyanobacteria. Carotenoids are two families, carotenes and xanthophylls. The main carotenoids studied are astaxanthin, iycopene, beta-carotene, lutein and zeaxanthin. They are used in agribusiness for their coloring properties, in cosmetics for their antioxidant properties and also in the health industry. Indeed, beta-carotene is a precursor of provitamin A and is used in pharmaceutical applications. Moreover, its contribution in food is essential since it can not be synthesized by the body in humans.
  • carotenoids on the market are often of synthetic origin and their synthesis uses complex processes. A lower proportion of carotenoids can be obtained by extraction from a natural source. Nevertheless, the processes for extracting carotenoids remain difficult to implement on an industrial scale, because of the thermal sensitivity of the carotenoids.
  • carotenoids in particular beta-carotene
  • beta-carotene are extracted mainly from the halotolerant microalgae grown in bulk of the genus Dunaliella.
  • Microalgae are autotrophic microorganisms, able to use solar radiation as a source of energy and inorganic C0 2 as a source of carbon.
  • Microalgae are a rich source of carotenoids and therefore have a high potential for the industrial production of carotenoids.
  • Patent EP 0 693 133 B1 describes a process for extracting carotenoids and more particularly astaxanthin from a microalgae culture, using an organic solvent chosen from acetone or dichloromethane, the culture microalgae being preferably a culture of Haemotococcus pluvialis.
  • the patent application EP 1 361 280 A1 describes a process for extracting carotenoids from a natural source, preferably from the Dunaliella Salina alga, with the aid of an organic phase consisting of a dodecane ( Ci 2 H 2 6) or hexadecane (C 18 H 34 ).
  • US Patent Application 4,680,314 A1 discloses a process for extracting carotenes from algae, more particularly from the genus Dunaliella Salina, with the aid of a vegetable oil chosen from corn oil, safflower, peanut oil or coconut oil.
  • a technical problem that the invention seeks to solve is to provide a process for extracting carotenoids which does not include a heating step capable of degrading the carotenoids.
  • Another technical problem that the invention seeks to solve is to propose a process for extracting carotenoids which provides a composition containing carotenoids that can be used directly in the agrifood and cosmetic fields, because it respects the regulation of these two domains. , in terms of the authorized solvent in particular.
  • Another technical problem that the invention seeks to solve is to propose a process for extracting carotenoids which is respectful of the environment.
  • the present invention proposes a process for extracting carotenoids from cells, optionally lysed, according to which said cells are lysed if they are not already lysed and the carotenoids contained in said lysed cells.
  • said carotenoids are extracted by contacting said lysed cells with a solvent comprising propanediol, in particular in a solvent comprising propane-1,3-diol, optionally with stirring, and said carotenoids in solution are recovered in the supernatant thus formed.
  • the method comprises a step of lysis of the cells. It is preferable to lyse the cells, that is to say to break their outer membrane, few time before the extraction of carotenoids. This avoids any degradation and in particular oxidation of the contents of the cells.
  • the process of the invention comprises a step of lysing the cells
  • this step can be carried out by any means known to those skilled in the art, whether mechanical, chemical or enzymatic.
  • the lysis of the cells of the biomass is carried out by adding a solution of calcium chloride (CaCl 2 ) in water.
  • This aqueous solution of calcium chloride may have a concentration of 10 g / l.
  • the solvent is not limited.
  • the solvent is chosen from compositions comprising in particular aqueous compositions comprising at least 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, for example at least 99% by weight of propanediol, in particular at least 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 90%, 95%, for example at least 99% by weight of propane-1,3-diol.
  • compositions comprising between 10% and 99.9% by weight of propanediol and in particular of propane-1,3-diol, the compositions comprising between 50% and 99% by weight of propanediol and in particular of propane-1,3 diol, the compositions comprising 50% by weight of propanediol, in particular propane-1,3-diol, 60% by weight of propanediol and especially of propane-1,3-diol, 70% by weight of propanediol, in particular propane 1,3-diol, in particular 80% by weight of propanediol, in particular 80% by weight of propane-1,3-diol, or 90% by weight of propanediol, in particular 90% by weight of propane-1,3- diol and solutions comprising at least 99% by weight of propanediol and especially at least 99% by weight of propane-1,3-diol or 99.9% and in particular aqueous compositions comprising at least 99% by weight of propanediol and in particular
  • a solvent whose components are miscible so as to obtain a mono-phase mixture.
  • solvents consisting of water and propane-1,3-diol are chosen.
  • the carotenoids extracted with these solvents are directly usable in cosmetics or food processing, in particular.
  • a mixture of water and propane-1,3-diol and containing 99.8% by weight of propane-1,3-diol is used.
  • Such a solvent has been found to be a good extraction solvent.
  • the solvent is a solution of water and propanediol, in particular water and 1,3-propane. diol.
  • the solvent is preferably a water solution in propane-1,3-diol and which contains at least 99% propane-1,3-diol.
  • Propane-1,3-diol is a compound that can be obtained according to an environmentally friendly fermentation process such as in particular that described in WO2004101437 (A2).
  • the use of a solution of propane-1,3-diol which can be obtained by the aforementioned method makes it possible to make the process of the invention particularly environmentally friendly both from the point of view of energy consumption and use of solvents.
  • the lysed cells are washed with water and then the suspension obtained is centrifuged and the said carotenoids are extracted at the same time. using said solvent from the pellet obtained after washing and centrifugation of said suspension.
  • This washing makes it possible to solubilize compounds other than carotenoids; the purity of the carotenoid extract obtained according to the invention is thus increased by washing off the soluble compounds in water.
  • the washing is advantageously carried out with a volume of washing liquid equal to the volume of the lysed cells or equal to the volume of the suspension formed by the lysed cells when these have been lysed with the aid of a solution.
  • the method according to the invention does not include any addition of betaine to extract the carotenoids, including no addition of betaine in all its forms, for example in hydrated form.
  • betaine to extract the carotenoids, including no addition of betaine in all its forms, for example in hydrated form.
  • the Applicant has indeed shown that the extraction of carotenoids could be particularly effective even in the absence of betaines.
  • the phycobiliproteins are extracted from said lysed cells.
  • the extraction method is not limited according to the invention.
  • the purity of the carotenoid solution obtained according to the process of the invention is thus increased by eliminating the phycobiliproteins which are at least partially extracted at the same time as the carotenoids, in particular when the solvent is an aqueous propanediol mixture.
  • One merit of the Applicant is therefore to have demonstrated that it is possible to extract carotenoids from a biomass that has already been used for the extraction of phycobiliproteins.
  • the method of the invention further comprises a step of stabilizing said carotenoids, in particular by adding ascorbic acid, said stabilization occurring simultaneously with the addition of said solvent or after the addition of said solvent.
  • ascorbic acid is used for stabilization. It is the merit of the Applicant to have found that the addition of ascorbic acid can slow down and limit the degradation of carotenoids over time.
  • Ascorbic acid is an organic acid with antioxidant properties. It is widely used in the food industry (E300) as a food additive for its antioxidant properties.
  • the ascorbic acid can be used in an amount such that its concentration in the carotenoid solution obtained by extraction according to the process of the invention or in the solution before extraction according to the process of the invention is 10 g. / L at 500g / L, preferably between 100g / L to 500g / L.
  • Ascorbic acid can be used in the composition according to the invention or in the mixture before extraction so that its concentration in one or other of these compositions is 100 g / l, or 150 g / l or 200 g / L or 250g / L or 300g / L or 350g / L or 400g / L or 450g / L or 500g / L.
  • ascorbic acid is used at a concentration of 100g / L or 125g / L or 150g / L or 175g / L or 200g / L in the composition of the invention.
  • ascorbic acid is carried out simultaneously or not at the stage of solubilization of the carotenoids; the ascorbic acid is advantageously mixed with the solvent comprising propane-1,3-diol in the proportions of 5 g of ascorbic acid per 40 ml of solvent.
  • ascorbic acid can be synthesized chemically, said process will advantageously be carried out with an ascorbic acid derived from a natural source (Cooper).
  • the type of cell is not limited.
  • These cells which are of vegetable origin or from a microalgae culture, can be alive, dead but hydrated, dehydrated or freeze-dried. They have possibly undergone extraction of the phycobiliproteins before the extraction of said carotenoids.
  • one will choose either living cells or dehydrated cells. The latter are kept, transport easily and allow a good yield of extracted carotenoids.
  • the cells form a biomass that corresponds to the total mass of organic matter of the cells lysed or not.
  • This biomass can be fresh or dehydrated. When the biomass is dehydrated, it is for example in the form of powder or flakes.
  • the biomass can be of plant origin or from a culture of microalgae.
  • the biomass according to the invention is a biomass resulting from a culture of microalgae.
  • the biomass is a plant biomass or a biomass of eukaryotic or prokaryotic microalgae.
  • the biomass chosen is preferably characterized by a carotenoid content at least equal to at least one milligram (1) per gram of biomass, ie one hundred milligrams (100 mg) per hundred grams (100 g) of biomass.
  • the plant biomass may be selected from a biomass formed or substantially formed of sweet potato, carrot, dandelion, parsley, spinach, chervil, apricot, mache, mango, broccoli, fennel cells. or chives. This list is not exhaustive.
  • the biomass is a biomass of microalgae.
  • the microalgae can be prokaryotic and is then a biomass of cyanobacteria.
  • the microalgae may also be eukaryotic and is then chosen from chlorophyceae, chrysophyceae, coccolithophyceae, diatoms, euglenophyceae, rhodophyceae or trebouxiophyceae such as chlorellae.
  • Biomass is obtained after cultivation of microalgae under appropriate conditions and concentration.
  • the biomass is obtained after cultivation, for example in open or covered basins or in any other production system known to those skilled in the art, such as, for example, photo-bioreactors.
  • the cells may be chosen from plant cells, eukaryotic or prokaryotic microalgae cells, cyanobacterial cells, in particular of the genus Arthrospira, more particularly Arthrospira platensis, and the cells of halophilic green algae, in particular of the species Dunaliella salina and mixtures of these types of cells.
  • the cyanobacterial cells of the genus Arthrospira, more particularly Arthrospira platensis, and the green algal cells Dunaliella salina, which are particularly rich in carotenoids, will advantageously be selected.
  • Dunaliella salina is a green alga that is particularly rich in astaxanthin, a pigment of the family of xanthophiles, included in carotenoids.
  • the process of the invention makes it possible to extract all the carotenoids. It is particularly effective in extracting beta-carotene, astaxanthin and Iutein.
  • the present invention also relates to a composition that can be obtained in particular according to the method of the invention.
  • This composition comprises carotenoids, especially beta-carotene, astaxanthin and lutein, propanediol, especially propane-1,3-diol and optionally ascorbic acid.
  • the composition also contains water and more advantageously, it contains, as a solvent, propane-1,3-diol and water, thus making it directly usable in certain fields.
  • the composition contains mainly or essentially as carotenoids of beta-carotene, astaxanthin and Iutein.
  • the composition contains as propanediol only propane-1,3-diol.
  • Propane-1,3-diol is a residue of the process of the invention, which advantageously is not eliminated since it constitutes an ingredient used in the formulation of pharmaceutical, cosmetic and agri-food compositions.
  • the carotenoid composition contains less than 3.9 g / l of phycobiliproteins.
  • the carotenoid concentration of the composition of the invention is substantially equal to or greater than 8 g / ml and substantially equal to or less than 30 g / ml. These values also apply when the composition contains as carotenoids only beta-carotene, astaxanthin and lutein.
  • the concentration of ascorbic acid is advantageously substantially equal to or greater than 100 mg / l and substantially less than 150 mg / l and in particular substantially equal to 125 mg / l.
  • composition according to the invention does not comprise betaine.
  • composition according to the invention comprises betaine in all its forms, in particular betaine in hydrated form.
  • the present invention also relates to a product chosen from cosmetics, pharmaceutical compositions, food compositions, especially food supplements; typically, according to the invention, this product comprises the composition of the invention, especially as an excipient, additive or dye.
  • the present invention also relates to a dye, especially food, an additive and an excipient which all comprise the composition of the invention.
  • the carotenoid composition according to the invention is used in the composition of the drugs or as excipients.
  • the carotenoid composition is used in cosmetic compositions.
  • Carotenoids are used in the field of cosmetics for their antioxidant, photoprotective and as a precursor of provitamin A.
  • the advantage of the present composition comprising propane-1,3-diol is that the use of said composition makes it possible to dispense with the addition of any other additive of the humectant or preservative type, because of the presence of propane-1,3-diol.
  • Another advantage of said composition is the possible substitution of any humectant by said composition which brings in addition to the humectant effect of propane-1,3-diol, the effect of carotenoids.
  • the carotenoid composition according to the invention is used in the field of food processing, preferably as a dietary supplement or dye, in drinks or foods.
  • Said composition may serve as an additive for the purpose of coloring a food regardless of its shape, but also an additive to the antioxidant power.
  • the composition according to the invention has the advantage of containing only natural products whose use is compatible with the regulatory requirements.
  • Another subject of the invention relates to a cosmetic product comprising a composition according to the invention.
  • the present invention also relates to the use of propran-1,3-diol for the solubilization of carotenoids.
  • propane-diol refers to propane-diol
  • propane-1,2-diol R and S form and mixtures thereof, especially their racemic mixture
  • propane-1,3-diol propane-2,2-diol and mixtures thereof; at least two of these compounds.
  • propane-1,3-diol when not used in reference to the solvent, denotes in particular a solution containing at least 99% by weight of propane-1,3 -diol in water.
  • the term "ingredient” any substance that enters the composition of a cosmetic or food product or a drug.
  • “Additive” means any substance that is added to a product, conferring one or more additional properties or improving a property of said product.
  • cosmetic product any substance or mixture of substances intended to be brought into contact with the various superficial parts of the human body (epidermis, hair and capillary systems, nails, lips and external genitals) or with the teeth and mucous membranes. Orally, in view, exclusively or mainly, to clean, perfume, modify the appearance, protect, maintain or repair body odors.
  • the cosmetic product is a cream, a lotion, an oil, a shampoo.
  • FIG. 1 shows the stability over time of the carotenoid composition obtained by the process according to the invention, in the presence of ascorbic acid (curve with square shaped dots) or in the absence of ascorbic acid (curve with the diamond shaped dots);
  • FIG. 2 represents the chromatographic profile (thin layer chromatography) of the carotenoid composition obtained in Example 1.
  • Example 1 Extraction of carotenoids from a biomass of Arthrospira platensis dehydrated
  • the cells were lysed by osmotic shock by mixing the dehydrated algae with a solution of 400 ml of CaCl 2 at 10 g / l (approximately 30 g of cells per liter). with stirring at room temperature. Stirring was carried out for at least 30 minutes and up to 2 hours at room temperature. A volume of 5 mL was taken from the lysis solution obtained above and an equivalent volume of water was added thereto. A new mixture was then obtained respecting the 1: 1 ratio. Centrifugation at 4500 rpm for 15 minutes was performed. The supernatant has been removed. The pellet has been preserved.
  • the pellet was then resuspended with 10 ml of propane-1,3-diol (DuPont and Tate & Lyle Bio Products, Loudon, USA, purity being 99.8%) which resulted in immediate solubilization of carotenoids.
  • a second centrifugation at 4500 rpm for 15 minutes was carried out. The carotenoids were then contained in the supernatant.
  • Stabilization with ascorbic acid can be carried out at the solubilization stage by mixing ascorbic acid with propane-1,3-diol at the rate of 125 g / l of ascorbic acid or after the centrifugation step in the same concentration conditions.
  • the concentration of the total carotenoid solution was measured using a spectrophotometer at a wavelength of 450 nm (Scott KJ, Detection and Measurement of Carotenoids by UV / VIS Spectrophotometry, in Current Protocols in Food Analytical Chemistry. 2001) F2.2.1-F2.2.10).
  • the yield of carotenoids was equal to or greater than 1 mg and equal to or less than 1.5 mg per gram of dehydrated algae.
  • the propane-1,3-diol solution containing the carotenoids therefore has a carotenoid concentration substantially equal to or greater than 17 ⁇ g / ml and substantially equal to or less than 30 ⁇ g / ml.
  • EXAMPLE 2 Extraction of Carotenoids from an Arthmspim Dlatensish Biomass Using 1-3-Propanedlol
  • the first step was the extraction of phycobiliproteins from the biomass. Extraction of phycobiliproteins:
  • the cells are lysed by osmotic shock using an aqueous solution of CaCl 2 at 10 g / l. Then a centrifugation of 15 minutes at 4500 rpm was carried out in order to separate the different phases. The supernatant containing phycobiliproteins has been reserved.
  • the pellet obtained was resuspended for the first time with a volume of 10 ml of water. A new centrifugation at 4500 rpm for 15 minutes was performed. The supernatant was removed and the pellet was resuspended with a volume of 10mL of propane-1,3-diol (DuPont and Tate & Bio Lyle Products, Loudon, USA, purity being 99.8%). A new centrifugation was carried out at 4500 rpm for 15 minutes. The carotenoids were then contained in the supernatant.
  • Stabilization with ascorbic acid can be carried out at the solubilization stage by mixing ascorbic acid with propane-1,3-diol at the rate of 125 g / l of ascorbic acid or after the centrifugation step in the same concentration conditions.
  • the concentration of the carotenoid solution was measured using a spectrophotometer at the wavelength of 450 nm.
  • the carotenoid concentration of the propane-1,3-diol composition was therefore substantially equal to or greater than 10 g / ml and substantially equal to or less than 20 ⁇ g / ml.
  • the yield of carotenoids was substantially equal to or greater than 1 mg and substantially equal to or less than 1.5 mg per gram of biomass.
  • the samples chosen during this manipulation were the following: solution according to Example 1 without addition of ascorbic acid, solution according to Example 1 with addition of acid ascorbic acid during extraction. Each sample was diluted 10 before being deposited on the microplate.
  • Example 2 For each sample, 1.5 ml of the composition obtained according to Example 1 was taken and mixed with 500 ⁇ l of chloroform in a microcentrifuge tube. The whole was vigorously mixed with the pipette. The samples were placed in a water bath at 50 ° C for 10 minutes and then placed at 4 ° C for 30 minutes. Phase separation occurred, forming two layers. The lower layer (fraction containing chloroform) was carefully removed and placed in a new microcentrifuge tube. 4.2 Thin layer chromatography procedure
  • the solvent of the mobile phase was a solution of petroleum ether, hexane or acetone in a 2: 1: 1 ratio, ie 40mL of each component.
  • Lines 2 to 4 correspond to different volumes (6pL, 10pL and 20 ⁇ ) of the carotenoid composition obtained according to the process of the invention.
  • Band I corresponds to beta-carotene.
  • Band II corresponds to astaxanthin.
  • Band III with lutein.
  • the carotenoid composition extracted according to the process of the invention was composed in particular of beta-carotene, astaxanthin, and lutein.
  • the thin layer chromatographic experiment presented here is not representative of the concentration of carotenoids contained in the composition.
  • Example S Extraction of carotenoids from a biomass of Arthrosoira olatensis using different solvents derived from natural origin
  • the three solvents of natural origin were tested in substitution for propane-1,3-diol according to the method described in Example 1.
  • the three solvents below are known for their properties, especially as humectant in cosmetic formulations and have been chosen for their compatibility with the regulations of this field.
  • the first solvent of vegetable origin is Coco-caprylate (AMI CHEMISTRY).
  • the second plant-based solvent is Caprylic / Capric Triglyceride (AMI CHEMISTRY).
  • the third of natural origin is lactic acid (AMI CHEMISTRY). None of these three solvents allowed to extract carotenoids.
  • coco-caprylate and Caprylic / Capric triglyceride the supernatant obtained after the last centrifugation is transparent.
  • With lactic acid the supernatant obtained after the last centrifugation was green, in particular containing chlorophyll, the extraction using a solvent comprising propan-1,3-diol giving, for its part, an orange supernatant.
  • the first solvent of vegetable origin is glycerol (COOPER) and the second of sunflower oil. These two solvents have also been chosen for their properties in cosmetic formulations, as humectant or emollient. None of these two solvents allowed to extract carotenoids. In one case, the supernatant obtained after the last centrifugation was transparent and in the other, it is green. It has therefore been impossible to solubilize carotenoids with these solvents.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé d'extraction de caroténoïdes à partir de cellules, éventuellement lysées, selon lequel on lyse lesdites cellules si elles ne sont pas déjà lysées et on extrait les caroténoïdes contenus dans lesdites cellules lysées. De manière caractéristique, selon l'invention, on extrait lesdits caroténoïdes par mise en contact desdites cellules lysées avec un solvant comprenant du propanediol, notamment dans un solvant comprenant du propane-l,3-diol, éventuellement sous agitation, et en ce que l'on récupère lesdits caroténoïdes en solution dans le surnageant ainsi formé.

Description

i
PROCEDE D'EXTRACTION DE CAROTENOIDES-COM POSITION ET PRODUITS
ASSOCIES
La présente invention concerne un procédé d'extraction de caroténoïdes à partir de cellules, ainsi qu'une composition pouvant être obtenue par ledit procédé et des produits contenant ladite composition.
Les caroténoïdes sont des pigments naturels présents chez de nombreux organismes vivants. Ils sont présents dans les légumes et les fruits verts et jaunes tels que les carottes, les agrumes, le brocoli et les épinards, mais aussi chez les algues, dans de nombreux champignons, dans les microalgues et les cyanobactéries. Les caroténoïdes regroupent deux familles, les carotènes et les xanthophylles. Les principaux caroténoïdes étudiés sont l'astaxanthine, le iycopène, le beta-carotène, la lutéine et la zéaxanthine. Ils sont utilisés en agroalimentaire pour leurs propriétés colorantes, en cosmétique pour leurs propriétés antioxydantes et aussi dans l'industrie de santé. En effet, le béta-carotène est un précurseur de la provitamine A et est utilisé dans des applications pharmaceutiques. Par ailleurs, son apport dans l'alimentation est essentiel puisqu'il ne peut pas être synthétisé par l'organisme chez l'homme.
Actuellement, les caroténoïdes présents sur le marché sont souvent d'origine synthétique et leur synthèse fait appel à des procédés complexes. Une plus faible proportion de caroténoïdes peut être obtenue par extraction à partir d'une source naturelle. Néanmoins, les procédés d'extraction des caroténoïdes restent délicats à mettre en œuvre à l'échelle industrielle, du fait de la sensibilité thermique des caroténoïdes.
Aujourd'hui, les caroténoïdes, en particulier le bêta-carotène, sont extraits principalement des microalgues halotolérantes cultivées en masse du genre Dunaliella. Les microalgues sont des microorganismes autotrophes, capables d'utiliser le rayonnement solaire comme source d'énergie et le C02 inorganique comme source de carbone. Les microalgues sont une source riche en caroténoïdes et de ce fait présentent un haut potentiel pour la production industrielle des caroténoïdes.
Le brevet EP 0 693 133 Bl décrit un procédé d'extraction de caroténoïdes et plus particulièrement d'astaxanthine à partir d'une culture de microalgues, à l'aide d'un solvant organique choisi parmi l'acétone ou le dichlorométhane, la culture de microalgues étant de préférence une culture d'Haemotococcus pluvialis. La demande de brevet EP 1 361 280 Al décrit un procédé d'extraction de caroténoïdes à partir d'une source naturelle, de préférence à partir de l'algue Dunaliella Salina, à l'aide d'une phase organique constitué par un dodécane (Ci2H26) ou un hexadécane (Ci6H34).
La demande de brevet US 4 680 314 Al décrit un procédé d'extraction de carotènes à partir d'algues, plus particulièrement du genre Dunaliella Salina, à l'aide d'une huile végétale choisie parmi l'huile de maïs, l'huile de carthame, l'huile d'arachide ou encore l'huile de coco.
Les procédés d'extraction décrits dans l'art antérieur sont des procédés basés sur l'utilisation des solvants chimiques. La demande de brevet US 4 680 314 Al décrit l'utilisation d'huile végétale mais le procédé comprend également l'utilisation de produits chimiques et une étape de chauffage, connue pour dégrader les caroténoïdes.
Un problème technique que cherche à résoudre l'invention est de fournir un procédé d'extraction des caroténoïdes qui ne comprend pas d'étape de chauffage susceptible de dégrader les caroténoïdes.
Un autre problème technique que cherche à résoudre l'invention est de proposer un procédé d'extraction des caroténoïdes qui fournit une composition contenant des caroténoïdes, utilisable directement dans les domaines agroalimentaires et cosmétiques, du fait qu'elle respecte la réglementation de ces deux domaines, en termes de solvant autorisé notamment.
Un autre problème technique que cherche à résoudre l'invention est de proposer un procédé d'extraction des caroténoïdes qui soit respectueux de l'environnement.
Afin de résoudre au moins un des problèmes techniques précités, la présente invention propose un procédé d'extraction de caroténoïdes à partir de cellules, éventuellement lysées, selon lequel on lyse lesdites cellules si elles ne sont pas déjà lysées et on extrait les caroténoïdes contenus dans lesdites cellules lysées. De manière caractéristique, on extrait lesdits caroténoïdes par mise en contact desdites cellules lysées avec un solvant comprenant du propanediol, notamment dans un solvant comprenant du propane-l,3-diol, éventuellement sous agitation, et l'on récupère lesdits caroténoïdes en solution dans le surnageant ainsi formé.
Avantageusement, le procédé comprend une étape de lyse des cellules. Il est préférable de lyser les cellules, c'est-à-dire rompre leur membrane externe, peu de temps avant l'extraction des caroténoïdes. Cela évite toute dégradation et notamment oxydation du contenu des cellules.
Lorsque le procédé de l'invention comporte une étape de lyse des cellules, cette étape peut être réalisée par tout moyen connu de l'homme du métier, qu'il soit mécanique, chimique ou enzymatique. Avantageusement, la lyse des cellules de la biomasse est réalisée par l'ajout d'une solution de chlorure de calcium (CaCI2) dans de l'eau. Cette solution aqueuse de chlorure de calcium peut avoir une concentration de lOg/L.
Selon l'invention, le solvant n'est pas limité. Selon un mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention, le solvant est choisi parmi les compositions notamment aqueuses comprenant au moins 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, par exemple au moins 99% en masse de propanediol, en particulier au moins 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, par exemple au moins 99% en masse de propane- 1,3-diol.
En particulier, les compositions comprenant entre 10% et 99,9% en masse de propanediol et notamment de propane-l,3-diol, les compositions comprenant entre 50% et 99% en masse de propanediol et notamment de propane-l,3-diol, les compositions comprenant 50% en masse de propanediol, notamment de propane-1,3- diol, 60% en masse de propanediol et notamment de propane- 1,3-diol, 70% en masse de propanediol, notamment de propane-l,3-diol, en particulier 80% en masse de propanediol, notamment 80% en masse de propane-l,3-diol, ou 90% en masse de propanediol, notamment 90% en masse de propane-l,3-diol et les solutions comprenant au moins 99% en masse de propanediol et notamment au moins 99% en masse de propane-l,3-diol ou 99,9% et en particulier les compositions aqueuses comprenant au moins 99% en masse de propanediol et notamment les compositions aqueuses comprenant au moins 99% en masse de propane- 1,3-diol.
Avantageusement, on choisira un solvant dont les composants sont miscibles de manière à obtenir un mélange mono phasique. Avantageusement, on choisit des solvants composés d'eau et de propane-l,3-diol. Les caroténoïdes extraits avec ces solvants sont directement utilisables en cosmétique ou en agroalimentaire, notamment. Avantageusement, on utilise un mélange d'eau et de propane-l,3-diol et contenant 99,8% en masse de propane-l,3-diol. Un tel solvant s'est avéré être un bon solvant d'extraction. Selon un mode de mise en œuvre particulièrement avantageux, qui peut être combiné avec l'un quelconque des modes de mise en œuvre précités, le solvant est une solution d'eau et de propanediol, notamment d'eau et de propane-l,3-diol. Le solvant est de préférence une solution d'eau dans du propane-l,3-diol et qui contient au moins 99% de propane-l,3-diol.
Le propane- 1,3-diol est un composé qui peut être obtenu selon un procédé de fermentation respectueux de l'environnement tel que notamment celui décrit dans le document WO2004101437 (A2). L'utilisation d'une solution de propane-l,3-diol qui peut être obtenue selon le procédé précité permet de rendre le procédé de l'invention particulièrement respectueux de l'environnement tant du point de vue de la consommation énergétique que de l'utilisation de solvants.
Selon un mode de mise en œuvre qui peut être combiné à l'un quelconque des modes de mise en œuvre précités, on lave notamment à l'eau les cellules Iysées puis on centrifuge la suspension obtenue et l'on extrait lesdits caroténoïdes à l'aide dudit solvant à partir du culot obtenu après lavage et centrifugation de ladite suspension. Ce lavage permet de solubiliser des composés autres que les caroténoïdes ; on augmente ainsi la pureté de l'extrait de caroténoïdes obtenu selon l'invention en éliminant par lavage les composés solubles dans l'eau.
Le lavage se fait avantageusement avec un volume de liquide de lavage égal au volume des cellules Iysées ou égal au volume de la suspension formée par les cellules Iysées lorsque celles-ci ont été Iysées à l'aide d'une solution.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention ne comprend aucun ajout de bétaïne pour extraire les caroténoïdes, notamment aucun ajout de bétaïne sous toutes ses formes, par exemple sous forme hydratée. La demanderesse a en effet montré que l'extraction des caroténoïdes pouvait être particulièrement efficace même en l'absence de bétaïnes.
Selon un mode de mise en œuvre qui peut être combiné à l'un quelconque des modes de mise en œuvre précités, préalablement à ladite extraction desdits caroténoïdes, on extrait les phycobiliprotéines desdites cellules Iysées. La méthode d'extraction n'est pas limitée selon l'invention. On augmente ainsi la pureté de la solution de caroténoïdes obtenue selon le procédé de l'invention en éliminant les phycobiliprotéines qui sont au moins partiellement extraites en même temps que les caroténoïdes, en particulier lorsque le solvant est un mélange aqueux de propanediol. Un mérite de la Demanderesse est donc d'avoir mis en évidence qu'il est possible d'extraire des caroténoïdes à partir d'une biomasse ayant déjà été utilisée pour l'extraction des phycobiliprotéines. Le déchet du procédé d'extraction des phycobiliprotéines devient la matière première du procédé d'extraction des caroténoïdes selon l'invention. Selon un mode de mise en œuvre particulier et particulièrement avantageux qui peut être combiné à l'un quelconque des modes de mise en œuvre précités, le procédé de l'invention comprend, en outre, une étape de stabilisation desdits caroténoïdes, notamment par ajout d'acide ascorbique, ladite stabilisation ayant lieu simultanément à l'ajout dudit solvant ou après l'ajout dudit solvant. De manière avantageuse on utilise l'acide ascorbique pour la stabilisation. C'est le mérite de la Demanderesse que d'avoir constaté que l'ajout d'acide ascorbique permet de ralentir et de limiter la dégradation des caroténoïdes dans le temps. L'acide ascorbique est un acide organique ayant des propriétés antioxydantes. Il est largement utilisé dans l'industrie agroalimentaire (E300) comme additif alimentaire pour ses propriétés antioxydantes. Il empêche l'oxydation des aliments et la prolifération de microorganismes. Selon l'invention, l'acide ascorbique peut être utilisé dans une quantité telle que sa concentration dans la solution de caroténoïdes obtenue par extraction selon le procédé de l'invention ou dans la solution avant extraction selon le procédé de l'invention soit de lOg/L à 500g/L, de préférence entre 100g/L à 500g/L. L'acide ascorbique peut être utilisé dans la composition selon l'invention ou dans le mélange avant extraction de manière à ce que sa concentration dans l'une ou l'autre de ces compositions soit de 100g/L, ou 150g/L ou 200g/L ou 250g/L ou 300g/L ou 350g/L ou 400g/L ou 450g/L ou 500g/L. De préférence, l'acide ascorbique est utilisé à une concentration de 100g/L ou 125g/L ou 150g/L ou 175g/L ou 200g/L dans la composition de l'invention. L'ajout d'acide ascorbique est réalisé simultanément ou non à l'étape de solubilisation des caroténoïdes ; l'acide ascorbique est avantageusement mélangé au solvant comprenant du propane-l,3-diol dans les proportions de 5g d'acide ascorbique pour 40mL de solvant. Bien que l'acide ascorbique puisse être synthétisé chimiquement, ledit procédé sera avantageusement mis en œuvre avec un acide ascorbique issu d'une source naturelle (Cooper).
Selon le procédé de l'invention, le type de cellule n'est pas limité. Ces cellules qui sont d'origine végétale ou issue d'une culture microalgues, peuvent être vivantes, mortes mais hydratées, déshydratées ou lyophilisées. Elles ont éventuellement subi avant l'extraction desdits caroténoïdes, une extraction des phycobiliprotéines. Avantageusement, on choisira soit des cellules vivantes soit des cellules déshydratées. Ces dernières se conservent, se transportent facilement et permettent un bon rendement en caroténoïdes extraits.
Les cellules forment une biomasse qui correspond à la masse totale de matière organique des cellules lysées ou non. Cette biomasse peut être fraîche ou déshydratée. Lorsque la biomasse est déshydratée, elle se présente par exemple sous forme de poudre ou de paillettes. La biomasse peut être d'origine végétale ou issue d'une culture de microalgues. Avantageusement, la biomasse selon l'invention est une biomasse issue d'une culture de microalgues. Dans un mode de réalisation particulier, la biomasse est une biomasse végétale ou une biomasse de microalgues eucaryotes ou procaryotes. La biomasse choisie est de préférence, caractérisée par une teneur en caroténoïdes au moins égale à au moins un milligramme (1) par gramme de biomasse, soit cent milligrammes (lOOmg) pour cent grammes (100g) de biomasse. La biomasse végétale peut être choisie parmi une biomasse formée ou essentiellement formée de cellules de patate douce, de carotte, de pissenlit, de persil, d'épinards, de cerfeuil, d'abricots, de mâche, de mangue, de brocoli, de fenouil ou encore de ciboulette. Cette liste n'est pas exhaustive. Dans un mode préféré de réalisation, la biomasse est une biomasse de microalgues. La microalgue peut être procaryote et est alors une biomasse de cyanobactéries. La microalgue peut également être eucaryote et est alors choisie parmi les chlorophycées, les chrysophycées, les coccolithophyceae, les diatomées, les euglénophycées, les rhodophycées ou encore les trebouxiophyceae comme les chlorelles.
La biomasse est obtenue après culture des microalgues dans des conditions appropriées et concentration. Lorsque la biomasse est une biomasse de microalgues procaryotes, la biomasse est obtenue après culture, par exemple dans des bassins ouverts ou couverts ou dans tout autre système de production connu de l'homme du métier, comme par exemple, les photo bioréacteurs.
Les cellules peuvent être choisies parmi les cellules végétales, les cellules de microalgues eucaryotes ou procaryotes, les cellules de cyanobactéries, notamment du genre Arthrospira, plus particulièrement Arthrospira platensis, et les cellules d'algues vertes halophiles, notamment de l'espèce Dunaliella salina et les mélanges de ces types de cellules. On choisira avantageusement les cellules de cyanobactéries du genre Arthrospira, plus particulièrement û' Arthrospira platensis, et les cellules d'algues vertes l'espèce Dunaliella salina qui sont particulièrement riches en caroténoïdes. Dunaliella salina est une algue verte particulièrement riche en astaxanthine, un pigment de la famille des xanthophiles, compris dans les caroténoïdes.
Le procédé de l'invention permet d'extraire tous les caroténoïdes. Il s'avère particulièrement efficace pour extraire le béta-carotène, l'astaxanthine et la Iutéine.
La présente invention concerne également une composition qui peut être obtenue notamment selon le procédé de l'invention. Cette composition comprend des caroténoïdes, notamment du béta-carotène, de l'astaxanthine et de la Iutéine, du propanediol, notamment du propane-l,3-diol et éventuellement de l'acide ascorbique. Avantageusement, la composition contient également de l'eau et plus avantageusement encore, elle contient à titre de solvant du propane-l,3-diol et de l'eau, la rendant ainsi directement utilisable dans certains domaines. Selon un mode de réalisation particulier, la composition contient majoritairement ou essentiellement en tant que caroténoïdes du béta-carotène, de l'astaxanthine et de la Iutéine. De manière avantageuse la composition contient en tant que propanediol uniquement du propane- 1,3-diol. Le propane-l,3-diol est un résidu du procédé de l'invention, qui avantageusement n'est pas éliminé puisqu'il constitue un ingrédient utilisé dans la formulation des compositions pharmaceutiques, cosmétiques et agroalimentaires. Avantageusement, la composition de caroténoïdes contient moins de 3,9g/L de phycobiliprotéines. Selon un mode de réalisation, la concentration en caroténoïdes de la composition de l'invention est sensiblement égale ou supérieure à 8 g/mL et sensiblement égale ou inférieure à 30pg/mL. Ces valeurs s'appliquent également lorsque la composition ne contient en tant que caroténoïdes que du béta-carotène, de l'astaxanthine et de la Iutéine.
Lorsque la composition contient de l'acide ascorbique, la concentration de l'acide ascorbique est avantageusement sensiblement égale ou supérieure à 100 mg/L et sensiblement inférieure à 150mg/L et notamment sensiblement égale à 125mg/L.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition selon l'invention ne comprend pas de bétaïne. Avantageusement, la composition selon l'invention ne comprend de bétaïne sous toutes ses formes, notamment de bétaïne sous forme hydratée.
La présente invention concerne également un produit choisi parmi les produits cosmétiques, les compositions pharmaceutiques, les compositions alimentaires, notamment les compléments alimentaires ; de manière caractéristique, selon l'invention, ce produit comprend la composition de l'invention, notamment en tant qu'excipient, additif ou colorant.
La présente invention concerne également un colorant, notamment alimentaire, un additif et un excipient qui comprennent tous la composition de l'invention.
Dans un autre mode de réalisation, la composition de caroténoïdes selon l'invention est utilisée dans la composition des médicaments ou comme excipients.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition de caroténoïdes est utilisée dans des compositions cosmétiques. Les caroténoïdes sont utilisés dans le domaine de la cosmétique pour leurs propriétés antioxydante, photoprotectrice et en tant que précurseur de la provitamine A. L'avantage de la présente composition comprenant du propane-l,3-diol, réside dans le fait que l'utilisation de ladite composition permet de s'affranchir de l'ajout de tout autre additif de type humectant ou conservateur, du fait de la présence du propane-l,3-diol. Un autre avantage de ladite composition est la possible substitution de tout humectant par ladite composition qui apporte outre l'effet humectant du propane- 1,3-diol, l'effet des caroténoïdes.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition de caroténoïdes selon l'invention est utilisée dans le domaine de l'agroalimentaire, de préférence comme complément alimentaire ou colorant, dans des boissons ou aliments. Ladite composition peut servir d'additif ayant pour but la coloration d'un aliment quel que soit sa forme, mais également un additif au pouvoir antioxydant. (Wilhelm Stahl et Helmut Sies, Antioxidant activity of carotenoids, Molecular Aspects of Medicine 24 (2003) 345- 351). Dans ce cas, la composition selon l'invention présente l'avantage de ne contenir que des produits naturels dont l'utilisation est compatible avec les exigences réglementaires.
Un autre objet de l'invention concerne un produit cosmétique comprenant une composition selon l'invention.
La présente invention concerne également l'utilisation du proprane-l,3-diol pour la solubilisation des caroténoïdes.
Définitions
Au sens de la présente invention, le terme « propanediol » désigne le propane-
1-1-diol, le propane- 1,2-diol (forme R et S et leurs mélanges, notamment leur mélange racémique), le propane-l,3-diol, le propane-2,2-diol et les mélanges d'au moins deux de ces composés. Au sens de la présente invention, le terme « propane-l,3-diol », lorsqu'il n'est pas utilisé en référence au solvant, désigne en particulier une solution contenant au moins 99% en masse de propane-l,3-diol dans de l'eau.
Au sens de la présente invention, on entend par « ingrédient » toute substance qui entre dans la composition d'un produit cosmétique ou alimentaire ou d'un médicament. On entend par « additif », toute substance qui s'ajoute à un produit, conférant une ou plusieurs propriétés additionnelles ou améliorant une propriété dudit produit.
On entend par produit cosmétique, toute substance ou mélange de substances, destiné à être mis en contact avec les diverses parties superficielles du corps humain (épiderme, systèmes pileux et capillaire, ongles, lèvres et organes génitaux externes) ou avec les dents et les muqueuses buccales, en vue, exclusivement ou principalement, de les nettoyer, de les parfumer, d'en modifier l'aspect, de les protéger, de les maintenir en bon état ou de corriger les odeurs corporelles. Dans le cadre de la présente invention, le produit cosmétique est une crème, une lotion, une huile, un shampooing.
La présente invention, ses caractéristiques et les divers avantages qu'elle procure apparaîtront mieux à la lecture qui suit des exemples présentés à titre d'exemple illustratifs et non limitatifs et qui font références aux figures annexées sur lesquels :
- la Fig. 1 montre la stabilité dans le temps de la composition de caroténoïdes obtenue par le procédé selon l'invention, en présence d'acide ascorbique (courbe avec les points en forme de carré) ou en l'absence d'acide ascorbique (courbe avec les points en forme de losange) ; et
- la Fig. 2 représente le profil chromatographique (chromatographie sur couche mince) de la composition de caroténoïdes obtenue dans l'exemple 1. EXEMPLES
Exemple 1 ; Extraction de caroténoïdes à partir d'une biomasse û'Arthrospira platensis deshydratée
A partir de 13g d'algues déshydratées de l'espèce Arthrospira platensis, on a réalisé la lyse des cellules par choc osmotique en mélangeant les algues déshydratées à une solution de 400mL de CaCI2 à lOg/L (environ 30g de cellules par litre) sous agitation à température ambiante. L'agitation a été mise en œuvre pendant 30 mn minimum et jusqu'à 2h maximum à température ambiante. Un volume de 5mL a été prélevé de la solution de lyse obtenue précédemment et un volume équivalent d'eau y a été ajouté. Un nouveau mélange a alors été obtenu respectant le ratio 1:1. Une centrifugation à 4500 rpm pendant 15 minutes a été réalisée. Le surnageant a été supprimé. Le culot a été conservé.
Le culot a ensuite été remis en suspension à l'aide de lOmL de propane-l,3-diol (DuPont and Tate & Lyle Bio Products, Loudon, USA, la pureté étant égale à 99,8%) ce qui a entraîné la solubilisation immédiate des caroténoïdes. Une seconde centrifugation à 4500 rpm pendant 15 mn a été réalisée. Les caroténoïdes étaient alors contenus dans le surnageant.
Une stabilisation par l'acide ascorbique peut être réalisée à l'étape de solubilisation en mélangeant l'acide ascorbique au propane-l,3-diol à raison de 125g/L d'acide ascorbique ou après l'étape de centrifugation dans les mêmes conditions de concentration.
La concentration de la solution de caroténoïdes totale a été mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre à la longueur d'onde de 450nm (Scott KJ. Détection and Measurement of Carotenoids by UV/VIS Spectrophotometry, in Current Protocols in Food Analytical Chemistry (2001) F2.2.1-F2.2.10).
Le rendement de caroténoïdes était égal ou supérieur à lmg et égal ou inférieur à l,5mg par gramme d'algues déshydratées. La solution de propane-l,3-diol contenant les caroténoïdes présente donc une concentration en caroténoïdes sensiblement égale ou supérieure à 17pg/mL et sensiblement égale ou inférieure à 30 g/mL. Exemple 2 : Extraction de caroténoïdes à partir d'une biomasse é'Arthmspim Dlatensish l'aide de 1-3-propanedlol
La première étape a consisté en l'extraction des phycobiliprotéines à partir de la biomasse. Extraction des phycobiliprotéines :
On a utilisé une suspension de cellules ù'Arthrospira platensis à une concentration égale à 32,5g/L
On lyse les cellules par choc osmotique à l'aide d'une solution aqueuse de CaCI2 à lOg/L. Puis on a réalisé une centrifugation de 15 mn à 4500 rpm afin de séparer les différentes phases. Le surnageant, contenant les phycobiliprotéines a été réservé.
Extraction des caroténoïdes :
Le culot obtenu a été remis en suspension une première fois avec un volume de lOmL d'eau. Une nouvelle centrifugation à 4500 rpm pendant 15 mn a été réalisée. Le surnageant a été supprimé et le culot a été remis en suspension avec un volume de lOmL de propane-l,3-diol (DuPont and Tate & Lyle Bio Products, Loudon, USA, la pureté étant égale à 99,8%). Une nouvelle centrifugation a été réalisée à 4500 rpm, pendant 15 mn. Les caroténoïdes étaient alors contenus dans le surnageant.
Une stabilisation par l'acide ascorbique peut être réalisée à l'étape de solubilisation en mélangeant l'acide ascorbique au propane-l,3-diol à raison de 125g/L d'acide ascorbique ou après l'étape de centrifugation dans les mêmes conditions de concentration.
La concentration de la solution de caroténoïdes a été mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre à la longueur d'onde de 450nm. La concentration en caroténoïdes de la composition de propane-l,3-diol était donc sensiblement égale ou supérieure à 10 g/mL et sensiblement égale ou inférieure à 20pg/mL Le rendement en caroténoïdes était sensiblement égal ou supérieure à lmg et sensiblement égal ou inférieur à l,5mg par gramme de biomasse.
Exemple 3 : Mesure de ta stabilité des caroténoïdes par spectrophotométrie 3.1 : Préparation des échantillons
Les échantillons choisis lors de cette manipulation étaient les suivants : solution selon l'exemple 1 sans ajout d'acide ascorbique, solution selon l'exemple 1 avec ajout d'acide ascorbique pendant l'extraction. Chaque échantillon a été dilué au 10 avant d'être déposé sur la microplaque.
3.2 : Mesure par spectrophotométrie de la stabilité des caroténoïdes
200μΙ_ de chaque échantillon préalablement dilué ont été déposés sur une microplaque de 96 puits. Une lecture d'absorbance a alors été réalisée à une longueur d'onde de 450nm, grâce à un appareil Clariostar (BMG Labtech). La concentration a alors été déterminée grâce à méthode de quantification détaillée dans la littérature (Scott KJ. 2001).
C°nccaroténoïdes^g/mL) = ^° χ ^οη χ 10 (mg/m L) χ 1000
3.3 : Analyse des résultats
Les résultats ont alors été analysés et représentés sous forme de graphique en prenant comme référence les résultats obtenus le premier jour. Ils sont représentés sur la figure 1. Comme visible sur la Fig. 1, on constate qu'au bout de 7 jours, la concentration en caroténoïdes pour l'échantillon contenant de l'acide ascorbique ajouté lors de l'étape de solubilisation avec le propane-l,3-diol était de 60% alors qu'elle n'était que de 30% environ pour l'échantillon sans acide ascorbique. Au bout de 30 jours, la concentration en caroténoïdes était de 38% pour l'échantillon contenant de l'acide ascorbique et de 5% pour l'échantillon sans acide ascorbique.
On a obtenu les mêmes résultats si l'acide ascorbique a été ajouté dans la même concentration après l'étape d'extraction.
Exemple 4 : Analyse des caroténoïdes par chromatograp ie sur couche mince
4yl Préparation des ; échantillons
Pour chaque échantillon, on a prélèvé l,5mL de composition obtenue selon l'exemple 1 et on l'a mélangé à 500μί de chloroforme dans un tube microcentrifugation. L'ensemble a été mélangé vigoureusement à la pipette. Les échantillons ont été placés dans un bain-marie à 50°C pendant 10 mn puis placés à 4°C pendant 30 mn. Il s'est produit une séparation de phases, formant deux couches. La couche inférieure (fraction contenant le chloroforme) a été prélevée avec précaution et déposée dans un nouveau tube de microcentrifugation. 4.2 Procédure de chromatographie sur couche mince
160 ml_ du solvant de la phase mobile ont été versés dans la chambre de chromatographie, qui a ensuite été fermée avec du film plastique et maintenue ainsi pendant 15mn. Le solvant de la phase mobile était une solution d'éther de pétrole, d'hexane ou d'acétone dans un ratio 2: 1:1, soit 40mL de chaque composant.
Sur un support de chromatographie sur couche mince, de type gel de silice (10 cm x 10 cm), une ligne de dépôt est matérialisée. 2μί de chaque échantillon ont été déposés en utilisant une micropipette capillaire et chaque dépôt a été identifié. Un temps de séchage de 5 à 10 minutes a été opéré avant de mettre la plaque de chromatographie en position verticale dans la chambre, de manière à ce que le solvant de la phase mobile touche le bas de la plaque de transfert. La plaque a été séchée et le calcul du rapport frontal a été réalisé en mesurant « distance parcourue par le soluté » / « distance parcourue par le solvant ». Les résultats sont montrés sur la figure 2. La ligne 1 correspond à un dépôt de 2pL d'un standard de caroténoïdes (Sigma Aldrich) à lmg/mL. Les lignes 2 à 4 correspondent à différents volumes (6pL, 10pL et 20μί) de la composition de caroténoïdes obtenue selon le procédé de l'invention. La bande I correspond au béta-carotène. La bande II correspond à l'astaxanthine. La bande III à la lutéine.
Les différents caroténoïdes sont identifiés sur la base de la littérature suivante : 1) Mikami K and Hosokawa M, Biosynthetic Pathway and Health Benefits of Fucoxanthin, an Algae-Specific Xanthophyll in Brown Seaweeds. Int J Mol Sci. 2013 Jul; 14(7): 13763-13781; et 2) Nagaraj S et.al., Antiproliferative potential of astaxanthin-rich alga Haematococcus pluvialis Flotow on human hepatic cancer (HepG2) cell line. Biomed Prev Nutr. 2012 Jul-Sep;2(3): 149-53;
La composition de caroténoïdes extraite selon le procédé de l'invention était composée notamment de béta-carotène, d'astaxanthine, et de lutéine. L'expérience de chromatographie sur couche mince présentée ici, n'est pas représentative de la concentration en caroténoïdes contenus dans la composition.
Exemple S : Extraction de caroténoïdes à partir d'une biomasse d'Arthrosoira olatensisà l'aide de différents solvants issus d'origine naturelle
Trois solvants d'origine naturelle ont été testés en substitution au propane-l,3-diol suivant le procédé décrit à l'exemple 1. Les trois solvants ci-après sont connu pour leurs propriétés, notamment en tant qu'humectant dans les formulations cosmétiques et ont été choisi pour leur compatibilité avec la réglementation de ce domaine. Le premier solvant d'origine végétale est le Coco-caprylate (AMI CHIMIE). Le second solvant d'origine végétale est le Caprylic/Capric triglycéride (AMI CHIMIE). Le troisième d'origine naturelle est l'acide lactique (AMI CHIMIE). Aucun de ces trois solvants n'a permis d'extraire des caroténoïdes. Avec le Coco-caprylate et le Caprylic/Capric triglycéride, le surnageant obtenu après la dernière centrifugation est transparent. Avec l'acide lactique, le surnageant obtenu après la dernière centrifugation était vert, contenant notamment de la chlorophylle, l'extraction à l'aide d'un solvant comprenant propan-l,3-diol donnant quant à elle, un surnageant orange.
Deux autres solvants d'origine naturelle ont été testés en substitution au propane-1,3- diol, en suivant le procédé selon l'exemple 2.
Le premier solvant d'origine végétale est du glycérol (COOPER) et le second de l'huile de tournesol. Ces deux solvants ont également été choisi pour leur propriétés dans les formulations cosmétiques, en tant qu'humectant ou émollient. Aucun de ces deux solvants n'a permis d'extraire des caroténoïdes. Dans un cas, le surnageant obtenu après la dernière centrifugation était transparent et dans l'autre, il est vert. Il a donc été impossible d'extraire par solubilisation, des caroténoïdes avec ces solvants.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'extraction de caroténoïdes à partir de cellules, selon lequel on lyse lesdites cellules si elles ne sont pas déjà lysées et on extrait les caroténoïdes contenus dans lesdites cellules lysées, caractérisé en ce que l'on extrait lesdits caroténoïdes par mise en contact desdites cellules lysées avec un solvant comprenant du propanediol, éventuellement sous agitation, et en ce que l'on récupère lesdits caroténoïdes en solution dans le surnageant ainsi formé.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le procédé ne comprend aucun ajout de bétaïne pour extraire les caroténoïdes.
3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit solvant est choisi parmi les compositions, notamment aqueuses, comprenant au moins 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, par exemple au moins 99% en masse de propanediol.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le propanediol est le propane-l,3-diol.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on lave, notamment à l'eau, les cellules lysées puis on centrifuge la suspension obtenue et en ce que l'on extrait lesdits caroténoïdes à l'aide dudit solvant à partir du culot obtenu après lavage et centrifugation de ladite suspension.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que préalablement à ladite extraction desdits caroténoïdes, on extrait les phycobiliprotéines desdites cellules lysées.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre, une étape de stabilisation desdits caroténoïdes, notamment par ajout d'acide ascorbique, ladite stabilisation ayant lieu simultanément à l'ajout dudit solvant ou après l'ajout dudit solvant.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdites cellules sont vivantes, déshydratées ou lyophilisées et en ce qu'elles ont éventuellement subi avant l'extraction desdits caroténoïdes, une extraction des phycobiliprotéines.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdites cellules sont choisies parmi les cellules végétales, notamment les cellules de patate douce, de carotte, de pissenlit, de persil, d'épinards, de cerfeuil, d'abricots, de mâche, de mangue, de fenouil de brocoli ou encore de ciboulette, les cellules de microalgues eucaryotes ou procaryotes, les cellules de cyanobactéries, notamment du genre Arthrospira, plus particulièrement à'Arthrospira platensis, et les cellules d'algues vertes halophiles, notamment de l'espèce Dunaliella salina et les mélanges d'au moins deux de ces types de cellules.
10. Composition de caroténoïdes susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce qu'elle comprend des caroténoïdes, notamment du béta-carotène, de l'astaxanthine, de la Iutéine, du propanediol, notamment du propane-l,3-diol, et éventuellement de l'acide ascorbique.
11. Composition de caroténoïdes selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle contient moins de 3,9g/L de phycobiliprotéines.
12. Composition selon l'une des revendications 10 ou 11, caractérisée en ce qu'elle contient une concentration en caroténoïdes, notamment en béta-carotène, astaxanthine et Iutéine, sensiblement égale ou supérieure à 8 g/mL et sensiblement égale ou inférieure à 36pg/ml_ et notamment sensiblement égale à 30 g/ml_ et en ce que lorsque ladite composition contient de l'acide ascorbique, sa concentration en acide ascorbique est sensiblement égale ou supérieure à 100 mg/L et sensiblement inférieure à 150mg/l et notamment sensiblement égale à 125mg/L.
13. Composition selon l'une des revendications 10 à 12, ladite composition ne comprend pas de bétaïne.
14. Produit choisi parmi les produits cosmétiques, les compositions pharmaceutiques, les compositions alimentaires, notamment les compléments alimentaires, caractérisé en ce qu'il contient la composition selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, notamment en tant qu'excipient, additif ou colorant.
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