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WO2019088374A1 - 새로운 비타민 e 기반의 양친매성 화합물 및 이의 활용 - Google Patents

새로운 비타민 e 기반의 양친매성 화합물 및 이의 활용 Download PDF

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WO2019088374A1
WO2019088374A1 PCT/KR2018/002462 KR2018002462W WO2019088374A1 WO 2019088374 A1 WO2019088374 A1 WO 2019088374A1 KR 2018002462 W KR2018002462 W KR 2018002462W WO 2019088374 A1 WO2019088374 A1 WO 2019088374A1
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WO
WIPO (PCT)
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compound
veg
membrane protein
formula
saccharide
Prior art date
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Ceased
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PCT/KR2018/002462
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English (en)
French (fr)
Inventor
채필석
무하매드에산
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Industry University Cooperation Foundation IUCF HYU
Original Assignee
Industry University Cooperation Foundation IUCF HYU
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Publication date
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    • G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins

Definitions

  • Non-Patent Document 1 S. Newstead et al., Protein Sci . 17 (2008) 466-472.
  • the X 4 may be a branched pentasaccharide of glucose center.
  • R 1 and R 2 in Formula 2 are methyl groups;
  • the above-mentioned X 4 is a branched pentasaccharide of the glucose center, which is referred to as " VEG-5 ", and can be represented by the following formula (7).
  • the method for measuring the radius of micelles is not particularly limited, but a method well known in the art can be used and can be measured using, for example, dynamic light scattering (DLS) experiments.
  • DLS dynamic light scattering
  • Protein was diluted 1: 150 in a buffer containing DDM, VEG (VEG-1, VEG-2, VEG-3, VEG-4 or VEG-5) or LMNG at a concentration of CMC + 0.2 wt% .
  • CPM dye (Invitrogen) stored in DMSO (Sigma) was diluted with dye buffer (20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.03% DDM, 5 mM EDTA) and 3 ⁇ l of diluted dye was added to the individual protein samples . The reaction mixture was incubated at 40 < 0 > C for 120 minutes.
  • LMNG and DDM were superior to VEG-3 and VEG-5 in membrane protein extraction and solubility, as compared to VEG-3 and VEG-5.
  • UAPA solubilized by LMNG and DDM when annealed at 45 ° C significantly degraded, while UapA solubilized by VEG-3 and VEG-5 maintained protein integrity (FIG. 8).
  • VEG-3 and VEG-5 exhibited excellent effects in keeping the UAPA extracted from the cell membrane in a structurally stable state in aqueous solution, and thus could be effectively used for stabilizing the membrane protein.
  • Protein activity was determined by measuring the [3 H] -Leu bond using (. M. Quicketal., Proc. Natl, Acad. Sci. USA. 2007, 104, 3603-3608) (scintillation proximity assay) SPA. Analysis was performed at 450 mM NaCl at the final concentration and a sample containing each of the above compounds. The SPA reaction was carried out in the presence of 20 nM [ 3 H] -Leu and 1.25 mg / mlcopper chelate (His-Tag) YSi beads (both purchased from PerkinElmer, Denmark). [ 3 H] -Leu binding was measured using a MicroBeta liquid scintillation counter (PerkinElmer).
  • VEG-5 among the VEGs showed similar ability to maintain LeuT transporter activity similar to DDM.

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Abstract

본 발명은 비타민 E 기반의 양친매성 화합물, 이의 제조방법 및 이를 이용하여 막단백질을 추출, 용해화, 안정화 또는 결정화하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 화합물을 이용하면 막단백질 추출, 가용화 효과가 우수할 뿐 아니라 막단백질을 수용액에서 장기간 안정적으로 보관할 수 있기 때문에, 이를 통해 그 기능분석 및 구조 분석에 활용될 수 있다. 또한, 본 비타민 E 기반의 양친매성 화합물들은 전자현미경을 통한 단백질 복합체의 가시화에 매우 탁월한 특성을 보여주었다. 막단백질 구조 및 기능 분석은 현 생물학 및 화학에서 가장 관심을 갖고 있는 분야 중 하나이고, 현재 개발되고 있는 신약의 절반 이상이 막단백질을 타깃으로 하므로 신약 개발과 긴밀한 관계가 있는 막단백질 구조 연구에 응용이 가능하다.

Description

새로운 비타민 E 기반의 양친매성 화합물 및 이의 활용
본 발명은 새롭게 개발한 비타민 E 기반의 양친매성 화합물 및 이를 이용하여 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법에 관한 것이다.
막단백질(membrane proteins)은 생물학적 시스템에서 중요한 역할을 한다. 이 생체거대분자(bio-macromolecules)는 친수성 및 소수성 부분을 포함하므로, 막단백질을 지질 환경으로부터 추출하고, 수용액에서 용해화와 안정화시키기 위해서는 양친매성 분자가 필요하다.
막단백질의 구조 분석을 위해서는 양질의 막단백질 결정을 얻어야 하는데 이를 위해서는 수용액에서의 막단백질의 구조적 안정성이 선행되어야 한다. 막단백질 연구에 사용되어 온 기존의 양친매성 분자들의 개수는 100가지 이상으로 다수가 존재하지만 그 중 5개 정도만 막단백질 구조 연구에 활발히 활용되어 왔다. 이 5개의 양쪽성 분자는 OG (n-octyl-β-D-glucopyranoside), NG (n-nonyl-β-D-glucopyranoside), DM (n-decyl-β-D-maltopyranoside), DDM (n-dodecyl-β-D-maltopyranoside), 및 LDAO (lauryldimethylamine-N-oxide)를 포함한다(비특허문헌 1, 비특허문헌 2). 하지만 이들 분자에 의해 둘러싸여 있는 많은 막단백질은 그 구조가 쉽게 변성되거나 응집되어 그 기능을 빠르게 상실하기 때문에 이 분자들을 활용한 막단백질의 기능 및 구조 연구에 상당한 제한점이 있다. 이는 종래의 분자들이 화학구조가 간단하여 충분히 다양한 특성을 나타내주지 못하기 때문이다.
막단백질의 구조분석을 위해서 수용액 상에서의 막단백질의 구조적 안정성을 유지하는 것이 중요한 부분이고, 막단백질은 아직까지 밝혀지지 않은 종류가 많고 그 구조적 특성이 다양하기 때문에 기존에 쓰이고 있는 양친매성 분자로 밝힐 수 있는 막단백질의 수는 한계가 있어 왔다.
상기 문제점을 해결하기 위한 많은 양친매성 분자들이 개발되어 왔으나, 현재 천연 물질을 소수성기로 사용한 예는 많지 않다.
이에 본 발명자들은 천연 물질인 비타민 E를 소수성기로 포함하는 새로운 양친매성 분자를 개발하여 본 발명을 완성하였다.
(비특허문헌 1) S. Newstead et al., Protein Sci .17 (2008) 466-472.
(비특허문헌 2) S. Newstead et al., Mol . Membr . Biol .25 (2008) 631-638.
본 발명의 목적은 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 화합물을 포함하는 막단백질의 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 이용하여 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 구체예는 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2018002462-appb-I000001
상기 화학식 1에서,
상기 R1 및 R2 는 각각 독립적으로 수소(H) 또는 CH3일 수 있고;
상기 L은 -CH2-, -CH2CH2-, NHCOCH2 -, -CH2OCH2CH2- 또는 직접결합일 수 있고;
상기 X1 및 X2는 각각 독립적으로 산소로 연결된 당류(saccharide)일 수 있고; 그리고
상기 Z는 수소(H) 또는 -CH2-X3이고, 상기 X3은 산소로 연결된 당류(saccharide)일 수 있다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2018002462-appb-I000002
상기 화학식 2에서,
상기 R1 및 R2 는 각각 독립적으로 수소(H) 또는 CH3일 수 있고; 그리고
상기 X4는 글루코스(glucose) 중심의 가지친(branched) 오당류(pentasaccharide)일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "당류(saccharide)"는 탄수화물 중에서 비교적 분자가 작고, 물에 녹아서 단맛이 나는 화합물을 의미한다. 당류는 당을 구성하는 분자의 수에 따라 단당류, 이당류 및 다당류로 구분된다.
상기 구체예에서 사용된 당류는 단당류(monosaccharide) 또는 이당류(disaccharide)일 수 있으며, 구체적으로 글루코스(glucose) 또는 말토오스(maltose)일 수 있고, 보다 구체적으로 말토오스(maltose)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 당류는 친수성기로 작용할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따른 화합물은 친수성 부분에글루코스 또는 말토오스 2개 또는 3개를 병렬로 연결하거나 글루코스 중심으로 가지친 다당류를 제조하여 친수성기의 크기를 크게 하면서도 길이의 증가를 최소화함으로써 막단백질과의 복합체 형성시 그 크기를 작게하였다.
본 발명의 화합물에서 비타민 E 구조는 소수성기로 작용할 수 있다. 상기 비타민 E는 R1 및 R2의 작용기에 따라 종류가 달라질 수 있다. 구체적으로 본 발명의 화합물은 R1 및 R2 가 모두 메틸기인 비타민 E(알파-토코페롤)일 수 있다.
상기 소수성기로 사용된 비타민 E는 기존의 양친매성 분자에서 사용되는 일반적인 선형 알킬 사슬과는 달리 알킬 사슬의 헤드 부분에 부피가 큰 바이사이클릭 고리(bulkybicyclic ring)의 존재로 인해 원뿔 모양의 기하학 분자구조를 형성하고, 이와 같은 구조는 본 발명의 화합물간 또는 막단백질과의 상호 작용에 보다 적합할 수 있다.
본 발명의 화합물은 다양한 링커 구조에 의해 상기 소수성기와 친수성기가 연결될 수 있고,화합물 중심부의 경직도(rigidity)를 유지하면서 알킬 사슬의 유동성을 충분히 확보하기 위한 링커를 도입하였다.
구체적인 일 실시예에서, 상기 R1 및 R2는 메틸기이고; 상기 L은 -CH2- 또는, -CH2OCH2CH2-이고; 상기 Z는 -CH2-X3이고; 그리고 상기 X1 및 X2는 산소로 연결된 글루코스 (glucose) 또는 말토오스(maltose)일 수 있다.
구체적인 일 실시예에서, 상기 R1 및 R2는 메틸기이고; 상기 L은 -CH2CH2- 또는 -NHCOCH2 -이고; 상기 Z는 수소이고; 상기 X1 및 X2는 산소로 연결된 글루코스 (glucose) 또는 말토오스(maltose)일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 "VEGs(vitamin E-based glycosides)"로 명명하였다.
보다 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서, 화학식 1의 상기 R1 및 R2는 메틸기이고; 상기 L은 -CH2- 이고; 상기 -CH2-X3이고; 그리고 상기 X1 및 X3은 산소로 연결된 글루코스 (glucose)인 화합물을 "VEG-1"로 명명하였고, 하기 화학식 3으로 표시될 수 있다.
[화학식 3]
Figure PCTKR2018002462-appb-I000003
보다 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 화학식 1의 상기 R1 및 R2는 메틸기이고; 상기 L은 -CH2OCH2CH2-이고; 상기 Z는 -CH2-X3이고; 그리고 상기 X1 및 X3은 산소로 연결된 글루코스 (glucose)인 화합물을 "VEG-2"로 명명하였고, 하기 화학식 4로 표시될 수 있다.
[화학식 4]
Figure PCTKR2018002462-appb-I000004
보다 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 화학식 1의 상기 R1 및 R2는 메틸기이고; 상기 L은 -NHCOCH2 -이고; 상기 Z는 수소이고; 상기 X1 및 X2는 산소로 연결된 말토오스(maltose)인 화합물을 "VEG-3"로 명명하였고, 하기 화학식 5로 표시될 수 있다.
[화학식 5]
Figure PCTKR2018002462-appb-I000005
보다 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 화학식 1의 상기 R1 및R2는 메틸기이고; 상기 L은 -CH2CH2- 이고; 상기 Z는 수소이고; 상기 X1 및 X2는 산소로 연결된 말토오스(maltose)인 화합물을 "VEG-4"로 명명하였고, 하기 화학식 6으로 표시될 수 있다.
[화학식 6]
Figure PCTKR2018002462-appb-I000006
보다 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 화학식 2의 R1 및 R2는 메틸기이고; 상기 X4는 글루코스 중심의 가지친 오당류(branched pentasaccharide)인 화합물을 "VEG-5"로 명명하였고, 하기 화학식 7로 표시될 수 있다.
[화학식 7]
Figure PCTKR2018002462-appb-I000007
본 발명의 다른 구체예에 따른 화합물은 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하기 위한 양친매성 분자일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어, "양친매성 분자"란 한 분자 내에 소수성기와 친수성기가 존재하여 극성, 비극성 용매에 대해 2가지 성질 모두에 친화성을 갖는 분자를 의미한다. 계면활성제나 세포막에 존재하는 인지질 분자들은 한 끝에는 친수성기, 다른 끝에는 소수성기를 가진 분자로 양친매성을 갖고 수용액 중에서 미셀이나 리포좀을 형성하는 특징이 있다. 친수성기가 극성을 갖고 있으나 비극성기가 공존하기 때문에 이들의 양친매성 분자는 물에 잘 녹지 않는 경향이 있다. 그러나 농도가 어느 한계농도(임계 미셀 농도, CMC) 이상이 되면 소수성 상호작용에 의해 소수성기가 내부로 집합하여 친수성기가 표면에 노출되는 미셀이 생성되어 물에 대한 용해성이 크게 증가한다.
CMC를 측정하는 방법은 특별히 제한되지 않으나, 당해 기술 분야에서 널리 알려진 방법으로 사용할 수 있으며, 예를 들어 디페닐헥사트리엔(diphenylhexatriene; DPH)을 이용한 형광 염색 방법으로 측정할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 화합물은 수용액에서 임계 미셀 농도(CMC)가 0.0001mM 내지 1mM일 수 있으며, 구체적으로, 0.0001mM 내지 0.01mM, 보다 구체적으로, 0.001mM 내지 0.01mM일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
기존에 막단백질 연구에 주로 사용되고 있는 DDM의 경우 임계 미셀 농도가 0.17 mM인 것과 비교하여 본 구체예의 VEGs는 DDM 보다 매우 작은 CMC 값을 가졌다. 따라서, VEGs는 적은 양으로도 미셀이 용이하게 형성되므로, 적은 양을 사용하여 막단백질을 효과적으로 연구 분석할 수 있어 DDM 보다 유리함을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명의 또 다른 구체예는 상기 화합물을 포함하는 막단백질의 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 미셀, 리포좀, 에멀션 또는 나노입자의 제형인 것일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 미셀은 반지름이 2.0 nm 내지 30.0 nm일 수 있고, 구체적으로 3.0 nm 내지 20.0 nm일 수 있으며, 보다 구체적으로 본 발명의 실시예들에 따른 VEGs에 의해 형성된 미셀은 반지름이 3.0 nm 내지 5.0 nm일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
미셀의 반지름을 측정하는 방법은 특별히 제한되지 않으나, 당해 기술 분야에서 널리 알려진 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어 동적 광산란(dynamic light scattering; DLS) 실험을 이용해 측정할 수 있다.
상기 미셀, 리포좀, 에멀션 또는 나노입자는 내부에 막단백질을 포함할 수 있다. 즉, 상기 미셀, 리포좀, 에멀션 또는 나노입자는 세포막 내부에 존재하는 막단백질을 추출하여 감싸안을 수 있다. 따라서, 상기 미셀에 의하여 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 것이 가능하다.
상기 조성물은 막단백질의 추출, 용해화, 안정화 또는 분석에 도움이 될 수 있는 버퍼 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 1) 내지 4)의 단계를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조 방법을 제공한다:
1) 비타민 E(tocopherol)에 -CH2-, -CH2CH2-, NHCOCH2 - 또는 -CH2OCH2CH2- 구조의 링커를 도입하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 생성물을 4-(브로모메틸)-메틸-2,6,7-트리옥사바이사이클로[2,2,2]-옥탄(4-(bromomethyl)-methyl-2,6,7-trioxabicyclo[2.2.2]-octane) 또는 다이에틸 말로네이트(diethyl malonate)와 반응시킨 다음 환원시켜 알코올기를 생성시키는 단계;
3) 상기 단계 2)의 생성물에 글리코실레이션(glycosylation) 반응을 수행하여 보호기가 부착된 당류를 도입하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 생성물에 탈보호기화(deprotection) 반응을 수행하는 단계
[화학식 1]
Figure PCTKR2018002462-appb-I000008
상기 화학식 1에서,
상기 R1 및 R2 는 각각 독립적으로 수소(H) 또는 CH3일 수 있고;
상기 L은 -CH2-, -CH2CH2-, NHCOCH2 -, -CH2OCH2CH2- 또는 직접결합일 수 있고;
상기 X1 및 X2는 각각 독립적으로 산소로 연결된 당류(saccharide)일 수 있고; 그리고
상기 Z는 수소(H) 또는 -CH2-X3이고, 상기 X3은 산소로 연결된 당류(saccharide)일 수 있다.
상기 방법에 따라 제조된 화합물은 상기 화학식 3 내지 화학식 6으로 표시되는 화합물일 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 1) 내지 4)의 단계를 포함하는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물의 제조 방법을 제공한다:
1) 비타민 E(tocopherol)에 글리코실레이션(glycosylation) 반응을 수행하여 보호기가 부착된 당류를 도입하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 생성물에 탈보호기화(deprotection) 반응을 수행하는 단계.
3) 1), 2)의 반응을 반복하여 수행하는 단계
[화학식 2]
Figure PCTKR2018002462-appb-I000009
상기 화학식 2에서,
상기 R1 및 R2 는 각각 독립적으로 수소(H) 또는 CH3일 수 있고; 그리고
상기 X4는 글루코스(glucose) 중심의 가지친(branched) 오당류(pentasaccharide)일 수 있다.
상기 방법에 따라 제조된 화합물은 상기 화학식 7로 표시되는 화합물일 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 구체예는 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 수용액에서 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 막단백질에 처리하는 단계를 포함하는, 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법을 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2018002462-appb-I000010
상기 화학식 1에서,
상기 R1 및 R2 는 각각 독립적으로 수소(H) 또는 CH3일 수 있고;
상기 L은 -CH2-, -CH2CH2-, NHCOCH2 -, -CH2OCH2CH2- 또는 직접결합일 수 있고;
상기 X1 및 X2는 각각 독립적으로 산소로 연결된 당류(saccharide)일 수 있고; 그리고
상기 Z는 수소(H) 또는 -CH2-X3이고, 상기 X3은 산소로 연결된 당류(saccharide)일 수 있다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2018002462-appb-I000011
상기 화학식 2에서,
상기 R1 및 R2 는 각각 독립적으로 수소(H) 또는 CH3일 수 있고; 그리고
상기 X4는 글루코스(glucose) 중심의 가지친(branched) 오당류(pentasaccharide)일 수 있다.
구체적인 일 실시예에서, 상기 R1 및 R2는 메틸기이고; 상기 L은 -CH2- 또는, -CH2OCH2CH2-이고; 상기 Z는 -CH2-X3이고; 그리고 상기 X1 및 X2는 산소로 연결된 글루코스 (glucose) 또는 말토오스(maltose)일 수 있다.
구체적인 일 실시예에서, 상기 R1 및 R2는 메틸기이고; 상기 L은 -CH2CH2- 또는 -NHCOCH2 -이고; 상기 Z는 수소이고; 상기 X1 및 X2는 산소로 연결된 글루코스 (glucose) 또는 말토오스(maltose)일 수 있다.
상기 화합물은 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 화학식 3 내지 7로 표시되는 7종의 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질"이란 세포막 지질이중층으로 이입되는 단백질 또는 당단백질의 총칭이다. 이는 세포막 전체 층을 관통하거나, 표층에 위치하거나, 세포막을 배접하는 등 여러 상태로 존재하고 있다. 막단백질의 예로 효소, 펩티드호르몬, 국소호르몬 등의 수용체, 당 등의 수용담체, 이온채널, 세포막 항원 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 막단백질은 세포막 지질이중층으로 이입되는 단백질 또는 당단백질이라면 어느 것이나 포함하며, 구체적으로 LHI-RC 복합체(light harvesting-I and the reaction center complex), UapA (uricacid-xanthine/H+symporter), MelB (melibiose permease), LeuT (Leucine transporter), GPCRs (G-protein coupled receptors) 또는 이들의 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 추출"이란 막단백질을 세포막(membrane)으로부터 분리하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 용해화(solubilization)"란 물에 녹지 않는 막단백질을 수용액에서 미셀에 녹아들도록 하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 안정화(stabilization)"란 막단백질의 구조, 기능이 변하지 않도록 3차 또는 4차 구조를 안정하게 보존하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 결정화(crystallization)"란 용액에서 막단백질의 결정을 형성하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 분석(analysis)"이란 막단백질의 구조 또는 기능을 분석하는 것을 의미한다. 상기 구체예에서, 막단백질의 분석은 공지의 방법을 이용할 수 있으며, 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 전자현미경(electron microscopy)을 이용하여 막단백질의 구조를 분석할 수 있다.
본 발명의 구체예들에 따른 비타민 E를 소수성기로 포함하는 양친매성의 화합물을 이용하면 기존 화합물 대비 막단백질을 수용액에서 장기간 안정적으로 보관할 수 있고, 이를 통해 그 기능분석 및 구조 분석에 활용될 수 있다.
막단백질 구조 및 기능 분석은 현 생물학 및 화학에서 가장 관심을 갖고 있는 분야 중 하나이며, 현재 개발되고 있는 신약의 절반 이상이 막단백질을 타깃으로 하고 있으므로, 신약 개발과 긴밀한 관계가 있는 단백질 구조 연구에 응용이 가능하다.
도 1는 본 발명의 VEGs의 합성스킴을 나타낸 도이다.
도 2은 본 발명의 VEGs의 화학 구조를 나타낸 도이다.
도 3은 분자 기하학적 측면에서 양친매성 분자의 소수성 부분(DDM (a)의 알킬사슬 구조과 (b)의 VEGs의 비타민 E 구조)을 비교한 결과이다.
도 4는 각 VEGs에 의해 형성된 마이셀들의 dynamic light scattering (DLS) 프로파일을 나타낸 도이다.
도 5는 VEG-3 자가조립체(self-assemblies)의 물리적 특성을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 (a) CMC+0.04 wt% 농도 및 (b) CMC+0.2 wt% 농도로 각각 사용된 VEGs에 의해 가용화된 LHI-RC 복합체의 구조적 안정성을 일정한 기간 간격에 따라 875 nm의 흡광도를 모니터링하여 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 최종 농도 CMC + 0.2 wt%의 VEGs 또는 DDM에 의한 수용액에서의 UapA 열적안정성을 CPM 어세이 방법을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 도이다:
도 8은 VEGs(VEG-3 and VEG-5), DDM 또는 LMNG에 의한 가용화된UapA의 열적안정성을 평가한 결과를 나타낸 것으로, FSEC (형광 크기 배제 크로마토그래피)를 이용하여 (a) 열처리전 및 (b) 열처리후를 비교하였다.
도 9는 VEGs 또는 DDM을 1.5 wt% 농도로 사용하여 MelBst 단백질을 2개의 온도(0 와 23℃)에서 90분 동안 추출 후, 23 ℃에서 추출한 단백질 샘플을 추가적으로 세개의 다른 온도 (45, 55, 그리고 65 ℃)에서 90분 동안 인큐베이션한 다음 수용액에 용해되어 있는 MelBst단백질의 양을 측정한 결과이다:
(a) 및 (c) 각 양친매성 화합물 존재하에서 용해된 MelBst 단백질의 양을 나타낸 SDS-PAGE 및 Western Blotting 결과;
(b) 및 (d) 각 양친매성 화합물 존재하에서 용해된 MelBst 단백질의 양을 45℃ 열처리를 한 후 용액내에 존재하는 전체 MelBst 단백질 양의 퍼센티지(%)로 나타낸 히스토그램(histogram) 결과.
도 10은 (a) DDM, VEGs에 의해 가용화된 β2AR의 장기간 안정성 및 (b) VEG-3에 가용화된 β2AR-Gs 복합체의 장기간 SEC 프로파일(long-term SEC profiles)을 나타낸 것이다.
도 11은 DDM, VEGs에 의해 가용화된 β2AR의 안정성을 측정한 결과로, CMC+0.2 wt%농도의 DDM 및 VEGs에 의해 가용화된 β2AR을 30분 동안 상온에서 인큐베이션한 후 [3H]-dihydroalprenolol (DHA)를 사용하여 단백질 활성을 측정하였다.
도 12는 VEG-3에 의해 가용화된 β2AR-Gs 복합체의 EM 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 CMC+0.04 wt% 농도의 VEGs에 의해 가용화된 LeuT 단백질의 장기간 안정성을 SPA(scintillation proximity assay)를 이용하여 측정한 결과를 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.
<제조예 1>VEG-1의 합성 방법
VEG-1의 합성 스킴을 도 1에 나타내었다. 하기 <1-1> 내지 <1-3>의 합성 방법에 따라 VEG-1의 화합물을 합성하여 도 2에 나타내었다.
<1-1> 도 1의 화합물 B의 합성
비타민 E(화합물 A; DL-α-토코페롤, 1.0 당량)의 혼합물에 DMF(12 ml)와의 혼합된 NaH(3.0 당량)로 처리하고, 상기 반응 혼합물을 실온에서 15분 동안 격렬하게 교반하였다. THF(12 ml)에 용해된 4-(브로모메틸)-메틸-2,6,7-트리 옥사바이사이클로[2.2.2]-옥탄(4-(bromomethyl)-methyl-2,6,7-trioxabicyclo[2.2.2]-octane, 1.8 당량)을 반응 혼합물에 적가하였다. 생성된 혼합물을 100℃에서 24시간 동안 질소하에 가열하였다. 메탄올로 반응을 종료시킨 후, 유기 용매를 감압하에 제거하였다. 고체 잔류물을 CH2Cl2에 용해시키고 유기 용액을 염수(brine)로 세척하고 무수 Na2SO4상에서 건조시켰다. 유기 용매를 농축시킨 후, 잔류물을 CH2Cl2/MeOH 혼합물에 용해시켰다. 이 용액에 농축HCl수 방울을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 50℃에서 4시간 동안 가열하였다. NaOH로 중화시키고 반응 혼합물을 농축시킨 후, 잔류물을 컬럼크로마토그래피(EtOAc/헥산)로 정제하여 78% 수율로 목적 화합물 B을 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.92 (s, 6H), 3.66 (s, 2H), 3.05 (br s, 3H),2.56 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.16(s, 3H), 2.12 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 1.88-1.72 (m, 2H), 1.54-1.50 (m,3H), 1.43-1.05 (m, 21H), 0.88-0.84 (m, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 148.4, 147.1, 127.7, 125.8, 123.4, 118.0, 75.1, 64.8, 45.4, 40.2, 40.1, 39.6, 37.7, 37.6, 37.5, 32.9, 32.8, 31.4, 28.1, 25.0, 24.6, 24.0, 22.9, 22.8, 21.3, 20.8, 19.9, 19.8, 12.8, 12.0, 11.9.
<1-2> 당화(glycosylation)반응의 일반 합성 절차를 통한 VEG-1a의 합성
N2 대기하에서, 무수 CH2Cl2와 혼합된 화합물 B(1.0 당량), AgOTf(3.6 당량) 및 2,4,6-콜리딘(2,4,6-collidine, 1.0 당량)의 혼합물을 -45℃에서 교반하였다. 이 현탁액에 CH2Cl2와 혼합된 과산화 벤조일화글루코실브로마이드 (perbenzoylated glucosylbromide, 3.6 당량)의 용액을 적가하였다. -45℃에서 30분 동안 교반을 계속한 다음, 반응 혼합물을 0 ℃로 가온시키고 30분 동안 교반하였다. 반응 완결 후(TLC로 나타냄), 피리딘(pyridine)을 반응 혼합물에 첨가한 후, CH2Cl2로 희석시킨 후 셀라이트(celite)상에서 여과하였다. 여과액을 1M Na2S2O3 수용액, 0.1M HCl 수용액 및 염수로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고 용매를 회전 증발기로 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼크로마토그래피(EtOAc/헥산)로 정제하여 VEG-1a를 유리질 고체형태로80% 수율로 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.10-7.83 (m, 18H), 7.62-7.15 (m, 42H), 5.66 (t, J = 9.6 Hz, 3H), 5.56 (t, J = 9.6 Hz, 3H), 5.41 (t, J = 8.0 Hz, 3H), 4.42-4.39 (m, 3H), 4.33-4.30 (m, 3H), 4.12 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 4.02 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 3.73 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.54 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.34 (m, 6H), 2.56 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.16(s, 3H), 2.12 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 1.88-1.72 (m, 2H), 1.54-1.50 (m, 3H), 1.43-1.05 (m, 21H), 0.88-0.84 (m, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 166.1, 165.9, 165.1, 164.7, 147.7, 147.3, 133.6, 133.5, 133.3, 133.1, 130.0, 129.8, 129.6, 129.1, 128.9, 128.8, 128.6, 128.5, 128.4, 128.1, 126.1, 122.5, 117.3, 101.23, 74.6, 72.6, 71.9, 71.8, 69.5, 68.1, 62.9, 45.0, 39.4, 37.7, 37.5, 37.4, 32.8, 28.0, 24.9, 24.5, 23.8, 22.8, 22.7, 21.2, 19.9, 12.45, 11.8, 12.4, 11.8, 11.6.
<1-3> 탈보호기화 반응 (deprotection reaction)을 통한 VEG-1의 합성
O-벤조일화된 VEG-1a(O-benzoylated VEG-1a)를 MeOH에 용해시킨 후, 0.5M NaOMe의 메탄올 용액을 필요한 양으로 처리하여 NaOMe의 최종 농도가 0.05M가 되도록 하였다. 반응 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반하고 Amberlite IR-120(H+ form) 수지로 중화시켰다. 수지를 여과하여 제거하고, MeOH로 세척하고, 혼합 여과액으로부터 용매를 진공상태에서 제거하였다. 50 mL의 다이에틸 에터를 2 mL의 MeOH : CH2Cl2(1 : 1) 혼합물에 용해된 잔류물에 첨가하여 VEG-1를 백색 고체형태로 92% 수율로 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 4.33 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 4.17 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 3.83-3.74 (m, 8H), 3.61-3.59 (m, 5H), 3.34 (t, J = 8.0 Hz, 3H), 3.25-3.22 (m, 8H), 3.17 (t, J = 8.0 Hz, 4H), 2.50 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 2.11 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 1.97 (s, 3H), 1.71-1.66 (m, 2H), 1.49-1.32 (m, 8H), 1.24-1.21 (m, 8H), 1.13-1.04 (m, 11H), 0.82-0.79 (m, 12H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 149.0, 148.9, 129.14, 127.3, 123.7, 118.7, 104.8, 78.0, 77.8, 75.7, 75.3, 72.9, 71.8, 70.0, 62.9, 46.6, 41.0, 40.6, 38.8, 38.7, 38.6, 38.5, 38.4, 34.0, 33.9, 33.8, 32.7, 29.2, 26.0, 25.5, 24.2, 24.1, 23.3, 23.2, 22.1, 21.7, 20.4, 20.3, 13.4, 12.5, 12.2; HRMS (FAB+): calcd. forC52H90O20[M+Na]+ 1057.5923, observed 1057.5920.
<제조예 2> VEG-2의 합성
VEG-2의 합성 스킴을 도 1에 나타내었다. 하기 <2-1> 내지 <2-4>의 합성 방법에 따라 VEG-2의 화합물을 합성하여 도 2에 나타내었다.
<2-1> 도 1의 화합물 C의 합성
무수 아세톤에 혼합된 비타민 E(화합물 A; DL-α-토코페롤, 16 mmol), 메틸 브로모아세테이트(methyl bromoacetate, 22 mmol), 무수 K2CO3(35 mmol), KI(8 mmol)의 혼합물을 아르곤 대기하에서 교반하여 밤새 환류시켰다. 용매를 제거한 후, 잔류물을 CH2Cl2에 용해시키고 물 및 염수로 추출하였다. 유기층을 무수 Na2SO4상에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축시켰다. 용매를 완전히 증발시킨 후, 0℃에서 THF에 용해된 잔류물에 LiAlH4(14.0 mmol)를 천천히 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하고, 0℃에서 MeOH, 물, 1.0N 수용성 HCl 용액을 연속적으로 첨가하여반응을 종료시킨 다음, CH2Cl2로 2회 추출하였다. 혼합 유기층을 염수로 세척하고 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여 85% 수율로 목적 화합물 C를 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.92-3.90 (m, 2H), 3.77-3.75 (m, 2H), 2.75 (br s, 1H), 2.57 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.17 (s, 3H), 2.13 (s, 3H), 2.08 (s, 3H), 1.88-1.72 (m, 2H), 1.54-1.50 (m,3H), 1.43-1.05 (m, 21H), 0.88-0.84 (m, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 148.1, 147.7, 127.8, 125.8, 123.0, 117.0, 74.9, 73.9, 62.4, 53.5, 40.3, 40.2, 39.5, 37.8, 37.7, 37.6, 37.5, 37.4, 33.0, 32.9, 32.8, 31.4, 31.3, 28.1, 25.0, 24.9, 24.6, 24.0, 22.9, 22.8, 21.2, 20.8, 19.9, 19.6, 12.8, 11.9.
<2-2> 도 1의 화합물 D의 합성
화합물 C에 DMF(12 ml)와의 혼합된 NaH(3.0 당량)로 처리하고, 상기 반응 혼합물을 실온에서 15분 동안 격렬하게 교반하였다. THF(12 ml)에 용해된 4-(브로모메틸)-메틸-2,6,7-트리 옥사바이사이클로[2.2.2]-옥탄(4-(bromomethyl)-methyl-2,6,7-trioxabicyclo[2.2.2]-octane, 1.8 당량)을 반응 혼합물에 적가하였다. 생성된 혼합물을 100℃에서 24시간 동안 질소하에 가열하였다. 메탄올로 반응을 종료시킨 후, 유기 용매를 감압하에 제거하였다. 고체 잔류물을 CH2Cl2에 용해시키고 유기 용액을 염수(brine)로 세척하고 무수 Na2SO4상에서 건조시켰다. 유기 용매를 농축시킨 후, 잔류물을 CH2Cl2/MeOH 혼합물에 용해시켰다. 이 용액에 농축HCl수 방울을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 50℃에서 4시간 동안 가열하였다. NaOH로 중화시키고 반응 혼합물을 농축시킨 후, 잔류물을 컬럼크로마토그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여 80% 수율로 목적 화합물 D를 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.78-3.76 (m, 2H), 3.70 (s, 6H), 3.60 (s, 2H), 3.50 (s, 2H), 2.55 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.15(s, 3H), 2.11 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 1.88-1.72 (m, 2H), 1.54-1.50 (m, 3H), 1.43-1.05 (m, 21H), 0.87-0.83 (m, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 148.1, 147.7, 127.8, 125.9, 123.1, 117.8, 75.0, 73.1. 72.0, 71.2, 64.1, 45.4, 40.4, 40.3, 39.5, 37.7, 37.6, 37.5, 37.4, 33.0, 32.9, 32.8, 31.4, 31.3, 28.1, 25.0, 24.9, 24.6, 24.0, 22.9, 22.8, 21.2, 20.8, 20.0, 19.9, 19.8, 19.7, 19.6, 12.8, 11.9.
<2-3> 당화(glycosylation)반응의 일반 합성 절차를 통한 VEG-2a의 합성
N2 대기하에서, 무수 CH2Cl2와 혼합된 화합물 D(1.0 당량), AgOTf(3.6 당량) 및 2,4,6-콜리딘(2,4,6-collidine, 1.0 당량)의 혼합물을 -45℃에서 교반하였다. 이 현탁액에 CH2Cl2와 혼합된 과산화 벤조일화 글루코실브로마이드 (perbenzoylated glucosylbromide, 3.6 당량)의 용액을 적가하였다. -45℃에서 30분 동안 교반을 계속한 다음, 반응 혼합물을 0℃로 가온시키고 30분 동안 교반하였다. 반응 완결 후(TLC로 나타냄), 피리딘(pyridine)을 반응 혼합물에 첨가한 후, CH2Cl2로 희석시킨 후 셀라이트(celite)상에서 여과하였다. 여과액을 1M Na2S2O3 수용액, 0.1M HCl 수용액 및 염수로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고 용매를 회전 증발기로 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼크로마토그래피(EtOAc/헥산)로 정제하여 VEG-2a를 유리질 고체형태로 85% 수율로 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.10-7.80 (m, 18H), 7.60-7.10 (m, 42H), 5.66 (t, J = 9.6 Hz, 3H), 5.56 (t, J = 9.6 Hz, 3H), 5.41 (t, J = 8.0 Hz, 3H), 4.42-4.39 (m, 3H), 4.16-4.14 (m, 3H), 3.88 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 3.64 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 3.36-3.46 (m, 4H), 3.38-3.25 (m, 4H), 3.22-3.15 (m, 4H), 2.55 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.15(s, 3H), 2.11 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 1.88-1.72 (m, 2H), 1.54-1.50 (m,3H), 1.43-1.05 (m, 21H), 0.87-0.83 (m, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 166.1, 165.8, 165.1, 164.8, 147.9, 147.7, 133.6, 133.4, 133.3, 133.1, 130.1, 129.8, 129.7, 129.6, 129.1, 129.0, 128.9, 128.5, 128.4, 128.3, 128.0, 127.9, 126.0, 122.8, 117.6, 101.4, 74.8, 72.7, 72.0, 71.6, 70.7, 69.7, 67.6, 63.0, 45.3, 40.4, 39.5, 37.7, 37.6, 37.5, 37.4, 37.3, 32.9, 32.8, 31.4, 28.0, 25.0, 24.5, 23.8, 23.7, 22.8, 22.7, 21.7, 20.7, 19.9, 19.7, 12.8, 12.0, 11.9.
<2-4> 탈보호기화 반응 (deprotection reaction)을 통한 VEG-2의 합성
O-벤조일화된 VEG-2a(O-benzoylated VEG-2a)를 MeOH에 용해시킨 후, 0.5M NaOMe의 메탄올 용액을 필요한 양으로 처리하여 NaOMe의 최종 농도가 0.05M가 되도록 하였다. 반응 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반하고 Amberlite IR-120(H+ form) 수지로 중화시켰다. 수지를 여과하여 제거하고, MeOH로 세척하고, 혼합 여과액으로부터 용매를 진공상태에서 제거하였다. 50 mL의 다이에틸 에터를 2 mL의 MeOH : CH2Cl2(1 : 1) 혼합물에 용해된 잔류물에 첨가하여 VEG-2를 백색 고체형태로 92% 수율로 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 4.35 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 4.02 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 3.83 (d, J = 8.0 Hz, 4H), 3.75-3.74 (m, 4H), 3.68-3.62 (m, 8H), 3.37-3.17 (m, 15H), 2.55 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 2.15 (s, 3H), 2.11 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 1.76-1.71 (m, 2H), 1.53-1.36 (m, 8H), 1.28-1.18 (m, 12H), 1.14-1.07 (m, 7H), 0.86-0.83 (m, 12H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 149.2, 149.1, 128.8, 127.0, 123.8, 118.9, 105.1, 78.1, 77.8, 75.8, 75.2, 73.5, 72.0, 71.7, 70.8, 69.9, 62.8, 46.7, 41.1, 41.0, 40.6, 38.8, 38.6, 38.5, 38.4, 34.0, 33.9, 32.7, 29.2, 26.0, 25.6, 24.2, 23.3, 23.2, 22.2, 21.7, 20.4, 20.3, 13.3, 12.4, 12.2; HRMS (FAB+): calcd. forC54H94O21[M+Na]+ 1101.6185, observed 1101.6189.
<제조예 3> VEG-3의 합성
VEG-3의 합성 스킴을 도 1에 나타내었다. 하기 <3-1> 내지 <3-3>의 합성 방법에 따라 VEG-3의 화합물을 합성하여 도 2에 나타내었다.
<3-1> 도 1의 화합물 E의 합성
무수 아세톤에 혼합된 비타민 E (화합물 A; DL-α-토코페롤, 16 mmol), 메틸 브로모아세테이트(methyl bromoacetate, 22 mmol), 무수 K2CO3(35 mmol), KI(8 mmol)의 혼합물을 아르곤 대기하에서 교반하여 밤새 환류시켰다. 용매를 제거한 후, 잔류물을 CH2Cl2에 용해시키고 물 및 염수로 추출하였다. 유기층을 무수 Na2SO4상에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축시켜 무색 오일을 수득하였다. 상기 오일을 재증류된 Me2SO(redistilled Me2SO, 20 mL)에 용해된 세리놀(serinol, 25 mmol) 및 무수 K2CO3(35 mmol)로 처리하고 25℃에서 6시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 희석하고, Et2O로 추출하였다. 유기층을 염수로 세척하고 무수 Na2SO4상에서 건조시켰다. 용매를 완전히 증발시킨 후, 잔류물을 플래쉬 컬럼크로마토그래피(EtOAc/헥산)로 정제하여 목적 화합물 E를 백색 고체로 85% 수율로 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.68 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.20 (br s, 2H), 4.09-4.01 (m, 1H), 3.88-3.85 (m, 2H), 3.78-3.75 (m, 2H), 2.55 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.15(s, 3H), 2.11 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 1.88-1.72 (m, 2H), 1.54-1.50 (m,3H), 1.43-1.05 (m, 21H), 0.87-0.83 (m, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 170.3, 148.5, 146.8, 127.4, 125.5, 123.3, 117.8, 75.0, 71.1, 61.8, 52.3, 40.3, 40.2, 39.5, 37.7, 37.6, 37.6, 37.4, 32.9, 32.8, 31.2, 28.1, 24.9, 24.6, 23.8, 22.8, 22.7, 21.1, 20.7, 20.0, 19.8, 19.7, 19.6, 12.8, 12.0.
<3-2> 당화(glycosylation)반응의 일반 합성 절차를 통한 VEG-3a의 합성
N2 대기하에서, 무수 CH2Cl2와 혼합된 화합물 E(1.0 당량), AgOTf(3.6 당량) 및 2,4,6-콜리딘(2,4,6-collidine, 1.0 당량)의 혼합물을 -45℃에서 교반하였다. 이 현탁액에 CH2Cl2와 혼합된 과산화 벤조일화 말토실브로마이드 (perbenzoylated maltosylbromide, 2.4 당량)의 용액을 적가하였다. -45℃에서 30분 동안 교반을 계속한 다음, 반응 혼합물을 0℃로 가온시키고 30분 동안 교반하였다. 반응 완결 후(TLC로 나타냄), 피리딘(pyridine)을 반응 혼합물에 첨가한 후, CH2Cl2로 희석시킨 후 셀라이트(celite)상에서 여과하였다. 여과액을 1M Na2S2O3 수용액, 0.1M HCl 수용액 및 염수로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고 용매를 회전 증발기로 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼크로마토그래피(EtOAc/헥산)로 정제하여 VEG-3a를 유리질 고체형태로 80% 수율로 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.09-7.93 (m, 14H), 7.89-7.86 (m, 4H), 7.82-7.80 (m, 4H), 7.76-7.71 (m, 4H), 7.64-7.58 (m, 2H), 7.53-7.16 (m, 42H), 6.18 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 5.73-5.64 (m, 4H), 5.40-5.33 (m, 2H), 5.21-5.13 (m, 4H), 4.72-4.56 (m, 4H), 4.39-4.10 (m, 10H), 3.85-3.80 (m, 2H), 3.39 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.33 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 3.07 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 2.91 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 2.51 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.14(s, 3H), 2.11 (s, 3H), 2.08 (s, 3H), 1.86-1.72 (m, 2H), 1.54-1.50 (m,3H), 1.43-1.05 (m, 21H), 0.87-0.84 (m, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 168.7, 166.2, 166.1, 166.0, 165.9, 165.8, 165.6, 165.5, 165.1, 165.0, 164.9, 164.8, 148.4, 147.1, 134.0, 133.7, 133.6, 133.5, 133.4, 130.1, 130.0, 129.9, 129.8, 129.7, 129.5, 129.3, 129.0, 128.9, 128.8, 128.7, 128.6, 128.5, 128.3, 127.5, 125.6, 123.2, 117.7, 100.9, 95.7, 74.9, 72.0, 71.4, 69.8, 69.1, 69.0, 62.6, 39.4, 37.6, 37.5, 37.4, 37.3, 32.8, 28.0, 24.9, 24.5, 24.0, 23.8, 22.8, 22.7, 21.1, 19.9, 19.8, 12.0, 11.9.
<3-3> 탈보호기화 반응 (deprotection reaction)을 통한 VEG-3의 합성
O-벤조일화된 VEG-3a(O-benzoylated VEG-2a)를 MeOH에 용해시킨 후, 0.5M NaOMe의 메탄올 용액을 필요한 양으로 처리하여 NaOMe의 최종 농도가 0.05M가 되도록 하였다. 반응 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반하고 Amberlite IR-120(H+ form) 수지로 중화시켰다. 수지를 여과하여 제거하고, MeOH로 세척하고, 혼합 여과액으로부터 용매를 진공상태에서 제거하였다. 50 mL의 다이에틸 에터를 2 mL의 MeOH : CH2Cl2(1 : 1) 혼합물에 용해된 잔류물에 첨가하여 VEG-3를 백색 고체형태로 90% 수율로 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 5.13 (d, J = 4.0 Hz, 2H), 4.42-4.39 (m, 1H), 4.36 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 4.14 (s, 2H), 4.04-3.98 (m, 2H), 3.91-3.86 (m, 3H), 3.81-3.74 (m, 6H), 3.68-3.57 (m, 10H), 3.49 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 3.44-3.38 (m, 5H), 3.32-3.23 (m, 6H), 2.56 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 2.12 (s, 3H), 2.09 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 1.78-1.73 (m, 2H), 1.53-1.34 (m, 8H), 1.28-1.19 (m, 12H), 1.13-1.05 (m, 7H), 0.86-0.83 (m, 12H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 171.8, 149.6, 148.6, 128.5, 126.8, 124.1, 119.1, 104.8, 102.9, 81.3, 77.8, 76.7, 76.0, 75.1, 74.9, 74.8, 74.2, 72.3, 71.5, 69.4, 62.8, 62.3, 50.6, 41.0, 40.6, 38.6, 38.5, 38.4, 34.0, 33.9, 33.8, 32.7, 29.2, 26.0, 25.5, 24.2, 23.3, 23.2, 22.2, 21.2, 20.8, 19.9, 19.8, 19.7, 19.6, 13.0, 12.2, 12.0; HRMS (FAB+): calcd. for C58H99NO25[M+Na]+ 1232.6404, observed 1232.6410.
<제조예 4> VEG-4의 합성
VEG-4의 합성 스킴을 도 1에 나타내었다. 하기 <4-1> 내지 <4-4>의 합성 방법에 따라 VEG-4의 화합물을 합성하여 도 2에 나타내었다.
<4-1> 도 1의 화합물 C의 합성
무수 아세톤에 혼합된 비타민 E(화합물 A; DL-α-토코페롤, 16 mmol), 메틸 브로모아세테이트(methyl bromoacetate, 22 mmol), 무수 K2CO3(35 mmol), KI(8 mmol)의 혼합물을 아르곤 대기하에서 교반하여 밤새 환류시켰다. 용매를 제거한 후, 잔류물을 CH2Cl2에 용해시키고 물 및 염수로 추출하였다. 유기층을 무수 Na2SO4상에서 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축시켰다. 용매를 완전히 증발시킨 후, 0℃에서 THF에 용해된 잔류물에 LiAlH4(14.0 mmol)를 천천히 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하고, 0℃에서 MeOH, 물, 1.0N 수용성 HCl 용액을 연속적으로 첨가하여반응을 종료시킨 다음, CH2Cl2로 2회 추출하였다. 혼합 유기층을 염수로 세척하고 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(EtOAc/헥산)로 정제하여 85% 수율로 목적 화합물 C를 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.92-3.90 (m, 2H), 3.77-3.75 (m, 2H), 2.75 (br s, 1H), 2.57 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.17(s, 3H), 2.13 (s, 3H), 2.08 (s, 3H), 1.88-1.72 (m, 2H), 1.54-1.50 (m,3H), 1.43-1.05 (m, 21H), 0.88-0.84 (m, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 148.1, 147.7, 127.8, 125.8, 123.0, 117.0, 74.9, 73.9, 62.4, 53.5, 40.3, 40.2, 39.5, 37.8, 37.7, 37.6, 37.5, 37.4, 33.0, 32.9, 32.8, 31.4, 31.3, 28.1, 25.0, 24.9, 24.6, 24.0, 22.9, 22.8, 21.2, 20.8, 19.9, 19.6, 12.8, 11.9.
<4-2> 도 1의 화합물 F의 합성
무수 CH2Cl2에 혼합된 화합물 C(1.0 당량), PPh3(1.5 당량) 및 CBr4(1.2 당량)의 혼합물을 아르곤하에서 4시간 동안 실온에서 교반하였다. 용액을 NaHCO3 및 염수로 세척하고, Na2SO4상에서 건조시키고 여과시켰다. 여과액을 증발시켜 생성물을 수득하고, 이를 추가 정제없이 다음 단계에 사용하였다. 상기 생성물을 에탄올에 용해된 다이에틸 말로네이트(diethyl malonate, 1.0 당량) 및 NaH(1.0 당량)의 교반된 용액에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 환류하에 4시간 동안 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 물을 첨가하고 생성물을 Et2O로 추출하고, Na2SO4상에서 건조시키고, 용매를 회전 증발기로 제거하여 생성물을 수득하고, 건조 THF와 혼합된 LiAlH4(3.5 당량)로 실온에서 4시간 동안 추가로 처리하였다. 반응 완료 후, 물을 용액에 적가하고, CH2Cl2로 2회 추출하였다. 혼합 추출물을 1.0M HCl 및 염수로 세척하고, Na2SO4상에서 건조시키고 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(EtOAc/헥산)로 정제하여 80% 수율로 목적 화합물 F를 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.83-3.78 (m, 2H), 3.75-3.70 (m, 4H), 3.05 (br s, 2H), 2.56 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.15(s, 3H), 2.11 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 1.88-1.76 (m, 2H), 1.74-1.70 (m, 2H), 1.69-1.67 (m, 1H), 1.54-1.50 (m,3H), 1.43-1.05 (m, 21H), 0.87-0.83 (m, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 148.2, 148.1, 127.8, 125.9, 123.4, 117.7, 75.0, 71.3, 65.7, 40.5, 40.3, 40.2, 39.5, 37.7, 37.6, 37.5, 37.4, 33.0, 32.9, 32.8, 31.4, 31.3, 29.1, 28.1, 25.0, 24.6, 24.0, 22.9, 22.8, 21.2, 20.8, 19.9, 19.8, 19.7, 19.6, 13.0, 12.2, 12.0.
<4-3> 당화(glycosylation)반응의 일반 합성 절차를 통한 VEG-4a의 합성
N2 대기하에서, 무수 CH2Cl2와 혼합된 화합물 F(1.0 당량), AgOTf(3.6 당량) 및 2,4,6-콜리딘(2,4,6-collidine, 1.0 당량)의 혼합물을 -45℃에서 교반하였다. 이 현탁액에 CH2Cl2와 혼합된 과산화 벤조일화 말토실브로마이드 (perbenzoylated maltosylbromide, 2.4 당량)의 용액을 적가하였다. -45℃에서 30분 동안 교반을 계속한 다음, 반응 혼합물을 0℃로 가온시키고 30분 동안 교반하였다. 반응 완결 후(TLC로 나타냄), 피리딘(pyridine)을 반응 혼합물에 첨가한 후, CH2Cl2로 희석시킨 후 셀라이트(celite)상에서 여과하였다. 여과액을 1M Na2S2O3 수용액, 0.1M HCl 수용액 및 염수로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고 용매를 회전 증발기로 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼크로마토그래피(EtOAc/헥산)로 정제하여 VEG-4a를 유리질 고체형태로 78% 수율로 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.11 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.05-7.93 (m, 12H), 7.87-7.85 (m, 6H), 7.81-7.78 (m, 2H), 7.74-7.72 (m, 6H), 7.53-7.18 (m, 42H), 6.15 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 5.81 (t, J = 4.0 Hz, 2H), 5.71-5.62 (m, 4H), 5.37-5.24 (m, 4H), 5.19-5.09 (m, 2H), 4.77-4.08 (m, 12H), 3.74-3.72 (m, 2H), 3.60-3.44 (m, 4H), 3.30-3.27 (m, 2H), 3.16 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 3.05 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 2.99 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 2.85 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 2.53 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.15(s, 3H), 2.11 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 1.88-1.76 (m, 2H), 1.74-1.70 (m, 2H),1.69-1.67 (m, 1H), 1.54-1.50 (m,3H), 1.43-1.05 (m, 21H), 0.88-0.84 (m, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 166.2, 166.1, 165.9, 165.8, 165.5, 165.2, 165.1, 164.0, 164.9, 148.3, 147.6, 133.7, 133.6, 133.5, 133.4, 133.3, 133.2, 130.1, 130.0, 129.9, 129.8, 129.7, 129.6, 129.5, 129.4, 129.3, 129.0, 128.9, 128.8, 128.7, 128.6, 128.5, 128.4, 128.3, 127.8, 125.8, 122.7, 117.5, 74.7, 72.3, 72.1. 71.3, 70.2, 69.8, 69.1, 69.0, 39.4, 37.5, 37.4, 37.3, 32.8, 32.7, 28.0, 25.0, 24.5, 23.9, 22.8, 22.7, 21.1, 20.6, 20.0, 19.8, 12.8, 12.0, 11.8.
<4-4> 탈보호기화 반응 (deprotection reaction)을 통한 VEG-4의 합성
O-벤조일화된 VEG-4a(O-benzoylated VEG-2a)를 MeOH에 용해시킨 후, 0.5M NaOMe의 메탄올 용액을 필요한 양으로 처리하여 NaOMe의 최종 농도가 0.05M가 되도록 하였다. 반응 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반하고 Amberlite IR-120(H+ form) 수지로 중화시켰다. 수지를 여과하여 제거하고, MeOH로 세척하고, 혼합 여과액으로부터 용매를 진공상태에서 제거하였다. 50 mL의 다이에틸 에터를 2 mL의 MeOH : CH2Cl2(1 : 1) 혼합물에 용해된 잔류물에 첨가하여 VEG-4를 백색 고체형태로 90% 수율로 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 5.16 (d, J = 4.0 Hz, 2H), 4.35 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.02-3.96 (d, J = 4.0 Hz, 2H), (m, 2H), 3.90-3.58 (m, 22H), 3.52 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 3.45-3.42 (m, 2H), 3.39-3.33 (m, 4H), 3.30-3.23 (m, 6H), 2.56 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 2.26-2.22 (m, 1H), 2.13 (s, 3H), 2.09 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 1.91-1.85 (m, 2H), 1.78-1.73 (m, 2H), 1.58-1.35 (m, 8H), 1.29-1.19 (m, 12H), 1.16-1.05 (m, 7H), 0.87-0.84 (m, 12H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 149.6, 149.0, 128.7, 126.9, 123.8, 118.8, 104.9, 104.7, 103.0, 81.4, 77.9, 76.6, 75.8, 74.8, 74.2, 72.2, 71.6, 71.3, 70.8, 62.8, 62.3, 40.9, 40.6, 38.6, 38.5, 38.4, 38.1, 38.0, 34.0, 33.9, 32.8, 30.2, 29.2, 26.0, 25.5, 24.3, 23.3, 23.2, 22.1, 21.7, 20.4, 20.3, 13.3, 12.4, 12.2; HRMS (FAB+): calcd. forC58H100O24[M+Na]+ 1203.6502, observed 1203.6504.
<제조예 5>VEG-5의 합성
VEG-5의 합성 스킴을 도 1에 나타내었다. 하기 <5-1> 내지 <5-3>의 합성 방법에 따라 VEG-5의 화합물을 합성하여 도 2에 나타내었다.
<5-1> 당화(glycosylation)반응 및 탈보호기화 반응 (deprotection reaction)을 통한 화합물 G의 합성
N2 대기하에서, 무수 CH2Cl2와 혼합된 비타민E(화합물 A; DL-α-토코페롤, 1.0 당량), AgOTf(3.6 당량) 및 2,4,6-콜리딘(2,4,6-collidine, 1.0 당량)의 혼합물을 -45℃에서 교반하였다. 이 현탁액에 CH2Cl2와 혼합된 과산화 벤조일화 글루코실브로마이드 (perbenzoylated glucosylbromide, 1.2 당량)의 용액을 적가하였다. -45℃에서 30분 동안 교반을 계속한 다음, 반응 혼합물을 0℃로 가온시키고 30분 동안 교반하였다. 반응 완결 후(TLC로 나타냄), 피리딘(pyridine)을 반응 혼합물에 첨가한 후, CH2Cl2로 희석시킨 후 셀라이트(celite)상에서 여과하였다. 여과액을 1M Na2S2O3 수용액, 0.1M HCl 수용액 및 염수로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고 용매를 회전 증발기로 제거하였다. O-벤조일화된 상기 생성물을 MeOH에 용해시킨 후, 0.5M NaOMe의 메탄올 용액을 필요한 양으로 처리하여 NaOMe의 최종 농도가 0.05M가 되도록 하였다. 반응 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반하고 Amberlite IR-120(H+ form) 수지로 중화시켰다. 수지를 여과하여 제거하고, MeOH로 세척하고, 혼합 여과액으로부터 용매를 진공상태에서 제거하였다. 50 mL의 다이에틸 에터를 2 mL의 MeOH : CH2Cl2(1 : 1) 혼합물에 용해된 잔류물에 첨가하여 화합물 G를 백색 고체형태로 88% 수율로 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 4.52 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.77-3.74 (m, 1H), 3.65-3.62 (m, 1H), 3.52-3.48 (m, 1H), 3.44-3.40 (m, 1H), 3.31 (s, 2H), 2.58 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.22(s, 3H), 2.18 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 1.88-1.76 (m, 2H), 1.74-1.70 (m, 2H), 1.69-1.67 (m, 1H), 1.54-1.50 (m,3H), 1.43-1.05 (m, 21H), 0.87-0.83 (m, 12H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 149.4, 147.4, 129.9, 129.8, 128.0, 123.5, 118.6, 106.2, 78.1, 77.9, 75.9, 75.8, 71.9, 63.0, 40.6, 38.6, 38.5, 34.1, 34.0, 33.9, 29.3, 26.0, 25.6, 24.3, 23.3, 23.2, 21.8, 20.4, 20.3, 14.3, 13.4, 12.1, 12.0.
<5-2> 당화(glycosylation)반응의 일반 합성 절차를 통한 VEG-5a의 합성
N2 대기하에서, 무수 CH2Cl2와 혼합된 화합물 G(1.0 당량), AgOTf(3.6 당량) 및 2,4,6-콜리딘(2,4,6-collidine, 1.0 당량)의 혼합물을 -45℃에서 교반하였다. 이 현탁액에 CH2Cl2와 혼합된 과산화 벤조일화 글루코실브로마이드 (perbenzoylated glucosylbromide, 5.0 당량)의 용액을 적가하였다. -45℃에서 30분 동안 교반을 계속한 다음, 반응 혼합물을 0 ℃로 가온시키고 30분 동안 교반하였다. 반응 완결 후(TLC로 나타냄), 피리딘(pyridine)을 반응 혼합물에 첨가한 후, CH2Cl2로 희석시킨 후 셀라이트(celite)상에서 여과하였다. 여과액을 1M Na2S2O3 수용액, 0.1M HCl 수용액 및 염수로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고 용매를 회전 증발기로 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼크로마토그래피(EtOAc/헥산)로 정제하여 VEG-5a를 유리질 고체형태로 70% 수율로 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.26 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.15-7.80 (m, 24H), 7.72-6.67 (m, 5H), 7.66-7.59 (m, 3H), 7.58-7.12 (m, 46H), 5.90-5.75 (m, 4H), 5.71-4.45 (m, 7H), 5.34 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 4.95 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.82-4.75 (m, 4H), 4.62-4.56 (m, 3H), 4.47-4.35 (m, 4H), 4.16-4.08 (m, 2H), 4.04-4.01 (m, 1H), 3.92-3.85 (m, 3H), 3.80-3.68 (m, 2H), 3.02 (br s, 1H), 2.56 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.17(s, 3H), 2.16 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 1.88-1.75 (m, 2H), 1.74-1.70 (m, 2H),1.69-1.67 (m, 1H), 1.54-1.50 (m,3H), 1.43-1.05 (m, 21H), 0.87-0.84 (m, 12H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): 166.2, 165.9, 165.3, 165.2, 165.1, 133.7, 133.5, 133.2, 130.2, 129.9, 129.8, 129.7, 129.6, 129.5, 129.3, 129.0, 128.8, 128.6, 128.5, 128.4, 128.0, 122.4, 74.8, 74.6, 74.2, 72.5, 72.4, 72.3, 72.1, 69.8, 69.1, 39.5, 37.6, 37.5, 32.9, 28.1, 25.0, 24.6, 22.9, 22.8, 19.9, 19.8, 14.2, 13.3, 12.1, 11.9.
<5-3> 탈보호기화 반응 (deprotection reaction)을 통한 VEG-5의 합성
O-벤조일화된 VEG-5a(O-benzoylated VEG-5a)를 MeOH에 용해시킨 후, 0.5M NaOMe의 메탄올 용액을 필요한 양으로 처리하여 NaOMe의 최종 농도가 0.05M가 되도록 하였다. 반응 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반하고 Amberlite IR-120(H+ form) 수지로 중화시켰다. 수지를 여과하여 제거하고, MeOH로 세척하고, 혼합 여과액으로부터 용매를 진공상태에서 제거하였다. 50 mL의 다이에틸 에터를 2 mL의 MeOH : CH2Cl2 (1 : 1) 혼합물에 용해된 잔류물에 첨가하여 VEG-5를 백색 고체형태로 88% 수율로 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 4.99 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.93 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.72 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.65 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.26 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.20-4.09 (m, 4H), 3.87-3.75 (m, 5H), 3.69-3.55 (m, 5H), 3.41-3.12 (m, 22H), 2.57 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 2.20 (s, 3H), 2.17 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.78-1.73 (m, 2H), 1.52-1.36 (m, 8H), 1.28-1.18 (m, 12H), 1.12-1.07 (m, 7H), 0.85-0.82 (m, 12H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 149.6, 147.5, 123.7, 123.6, 118.8, 104.8, 104.5, 103.8, 103.0, 102.4, 81.4, 79.9, 78.1, 78.0, 77.9, 77.8, 75.9, 75.3, 75.2, 71.9, 71.8, 71.6, 71.5, 69.6, 62.9, 62.7, 41.1, 40.6, 38.8, 38.6, 38.5, 38.4, 34.0, 33.9, 29.2, 26.0, 25.5, 24.2, 23.3, 23.2, 22.2, 21.8, 20.4, 20.3, 20.2, 14.6, 14.5, 13.7, 12.1, 12.0; HRMS (FAB+): calcd. forC59H100O27[M+Na]+ 1263.6350, observed 1263.6353.
<실시예 1> VEGs 특성
상기 제조예 1 내지 5의 합성 방법에 따라 합성된 VEGs의 특성을 확인하기 위하여, VEGs의 분자량(M.W.), 임계미셀농도(critical micellar concentration; CMC) 및 형성된 미셀의 유체역학적 반지름(hydrodynamic radii; R h)을 측정하였다.
구체적으로, 임계미셀농도(CMC)는 소수성 형광 염색, 디페닐헥사트리엔(diphenylhexatriene; DPH)을 이용하여 측정하였고, 각각의 제제에 의해 형성된 미셀의 유체역학적 반지름(R h)은 동적 광산란(dynamic light scattering; DLS) 실험을 통해 측정하였다. 측정된 결과를 기존의 양친매성 분자(detergent)인 DDM과 비교하여 표 1에 나타내었다.
Detergent MWa CMC (mM) CMC (wt%) R h (nm)b
VEG-1 1035.3 ~0.002 ~0.0002 4.2±0.1
VEG-2 1079.3 ~0.003 ~0.0003 4.7±0.1
VEG-3 1210.4 ~0.002 ~0.0002 4.8±0.1
VEG-4 1181.4 ~0.003 ~0.0003 5.1±0.1
VEG-5 1241.4 ~0.002 ~0.0002 3.9±0.1
DDM 510.1 0.170 0.0087 3.4±0.0
a Molecular weight of detergents. b Hydrodynamic radius of micelleswas determined at 1.0 wt% by dynamic light scatteringa Molecular weight of detergents. b Hydrodynamic radius of micelleswas determined at 1.0 wt% by dynamic light scattering.VEGs의 CMC 값은 DDM 보다 훨씬 작았다. 따라서, VEGs 는 낮은 농도에서 미셀이 용이하게 형성되므로, 수용액상에서 DDM 보다 응집하려는 경향이 더 큼을 알 수 있었다.
또한, VEGs은 서로 다른 친수성 구조를 가짐에도 불구하고, 거의 유사한 CMC 값을 나타내었다. 이는 양친매성 분자의 미셀 형성은 주로 소수성 효과에 의해 유도되는 것으로, 모든 VEGs가 공통적으로 비타민 E를 소수성기로 포함하고 있기 때문인 것으로 판단된다.
VEGs에 의해 형성된 미셀의 크기의 분포는3.8~5.2 nm 로 좁게 나타났고, DDM보다 큰 미셀을 형성함을 확인하였다. 추가로 상기 VEGs에 의해 형성된 미셀의 크기 분포를 분석한 결과, 대부분의 VEGs는 균질한 크기를 가진 미셀을 형성하는 것을 확인하였다(도 4 및 도 5).
<실시예 2> VEGs의 R. capsulatussuperassembly(LHI-RC)구조 안정화 능력 평가(도 5)
VEGs에 의한 로도박터 캡슐라터스(Rhodobacter capsulatus)의 광합성 어셈블리(photosynthetic superassembly)구조안정화 능력을 평가하는 실험을 하였다. 광합성 어셈블리는 LHI(light-harvesting complex I) 및 RC(reaction centre complex)로 구성되어 있다. LHI-RC의 구조적 안정성은 UV-Vis 분광법을 활용하여 20일간 단백질의 구조를 모니터링하는 방법으로 측정하였다. 양친매성 분자는 본 발명의 모든 VEGs와 기존 양친매성 분자인 DDM 및 OG를 사용하였으며, 양친매성 분자의 농도는 CMC + 0.04 wt%(도 5a) 및 CMC + 0.2 wt%(도 5b)에서 측정하여 양친매성 분자의 농도에 따른 LHI-RC 단백질 안정성을 조사하였다.
구체적으로, R. capsulatus의 광합성 어셈블리의 안정성은 본 발명자의 2008년 논문(P. S. Chae et al., ChemBioChem2008, 9, 1706-1709.)에 게재된 방법을 이용하여 측정하였다. 요약하면, 본 발명자는 LHII(light-harvesting complex II)를 가지고 있지 않은 R. capsulatus, U43[pUHTM86Bgl] 박테리아로부터 얻은 멤브레인을 이용하였다. R. capsulatus 멤브레인의 동결액 10 ㎖ 분액을 유리 균질기(glass homogenizer)를 이용하여 균질화하고, 30분 동안 32℃에서 약하게 교반하여 배양하였다. 상기 균질화된 멤브레인을 1.0 wt% DDM을 32℃에서 30분 동안 처리하였다. 멤브레인 파편(debris)은 초원심분리하여 펠렛을 수집하였다. DDM에 의해 가용화된 LHI-RC 복합체를 함유하는 상층액에 200 μL Ni2+-NTA resin (10 mM Tris, pH 7.8을 포함하는 버퍼에서 전-평형 및 저장됨)을 첨가하여 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 수지 함유 용액을 10 개의 HisSpinTrap 컬럼을 사용하여 여과하고, 개별 컬럼을10 mM Tris (pH 7.8), 100 mL NaCl 및 1 x CMC DDM을 함유하는 500 μL 결합 버퍼로 두 번 세척하였다. 새로운 초원심분리 튜브로 교체한 후, 1M 이미다졸(2×300 μL)이 함유된 버퍼를 사용하여 DDM에 의해 정제된 LHI-RC 복합체를 용출시켰다. 80 ㎕의 단백질 시료를 각각 920 μL의 VEGs, DDM 및 OG로 희석하여 최종 농도가 CMC + 0.04 wt% 또는 CMC + 0.2 wt%가 되도록 하였다. 각각의 세제 내에서 생성된 LHI-RC 복합체를 25℃에서 20일 동안 인큐베이션한 다음 7일동안은 인큐베이션 온도를 25℃로 증가시켰다. 단백질 안정성은 650 nm에서 950 nm의 범위에서 시료의 UV-가시 스펙트럼을 측정하여 배양하는 동안 규칙적인 간격으로 측정되었다. 단백질 보전성은 875 nm 흡광도 (A875)를 모니터링함으로써 평가하였다.
모든 VEGs는 LHI-RC 복합체 완전성을 유지하는 능력에 있어서 DDM보다 우수하였고, 특히 VEG-3가 가장 우수한 효과를 나타내었다(도 6). 양친매성 화합물 농도를 CMC + 0.2 wt%로 증가시키면 DDM 및 VEGs 간의 효능 차이는 증가되었다. 또한, DDM과 마찬가지로 본 발명의 양친매성 화합물은 배양 온도를 32℃로 증가시키면 복합체를 안정화시키는 능력은 감소하지만 VEGs에서 단백질 분해는 DDM보다 현저히 느리게 일어났는데 이는 VEGs가 막단백질 복합체 안정화 능력이 탁월함을 보여준다(도 6).
<실시예 3> VEGs의 UapA 막단백질 구조 안정화 능력 평가
UapAG411V△1-11(이하 'UapA'라고 함)은 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae) FGY217 균주에서 GFP 융합으로 발현되었고, 샘플 버퍼(20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.03% DDM, 1 mM xanthine) 내로 분리하였으며, 이는 J. Leung 등의 논문(Mol . Membr . Biol . 2013, 30, 32-42)에 기재된 방법을 따랐다. 단백질을 100kDa 분자량 차단 필터(Millipore)를 사용하여 약 10 mg/ml로 농축시켰다. 단백질을 Greiner 96에서 CMC + 0.2 wt%의 농도로 DDM, VEG(VEG-1, VEG-2, VEG-3, VEG-4 또는 VEG-5) 또는 LMNG를 함유하는 버퍼으로 1:150으로 희석하였다. DMSO (Sigma)에 저장된 CPM 염료 (Invitrogen)를 염료 버퍼(20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.03 % DDM, 5 mM EDTA)로 희석하고 희석된 염료 3 ㎕를 개별 단백질 샘플에 첨가하였다. 반응 혼합물을 40℃에서 120분 동안 항온 처리하였다. 형광 방출 강도는 387 및 463 nm의 흥분 및 방출 파장으로 각각 설정된 마이크로 플레이트 분광 형광 측정기를 사용하여 모니터링하였다. 최대 형광값은이 배양기간 동안 접힌 단백질의 백분율을 계산하는 데 사용되었다. 접힌 단백질의 상대적 양은 GraphPad Prism을 사용하여 시기별로 플롯되었다.
UapA를 함유하는 멤브레인을 10 mM 이미다졸, 150 mM NaCl, 10% 글리세롤을 함유하는 pH 8.0 PBS 버퍼에 재현탁시키고 단백질 농도를 측정하였다. 멤브레인을 1 mg/ml의 농도로 조정하고, 1 ml 분취액을 1.0 ml의 DDM, LMNG, VEG-3 및 VEG-5와 함께 각각 교반하에 얼음에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 각 튜브에서 100 ㎕ 분취액을 채취하고 150,000 g에서 10분간 초원심분리한 후 각 시료에 대해 형광 SEC(FSEC)를 측정하였다. 나머지 가용성 분획을 45℃에서 10분 동안 인큐베이션하여 열처리하였다. 열처리된 샘플을 FSEC에 적용하여 트랜스포터의 완전성을 모니터링하였다. FSEC는 적절한 제제 (DDM, LMNG, VEG-3 또는 VEG-5)를 함유하는 버퍼로 평형화된 Superose6 컬럼 (GE Healthcare)을 사용하여 수행하였다.
도 7에 나타난 결과와 같이, VEG-3 및 VEG-5는 LMNG 및 DDM보다 UapA를 수용액에서 구조적으로 안정한 상태로 유지하는 능력이 우수한 것으로 나타났다. 다른 VEGs(VEG-1, 2 및 4)는 테스트된 조건 하에서 DDM과 유사한 결과를 나타내었다.
효과가 우수한 VEG-3 및 VEG-5를 대상으로 LMNG 및 DDM와의 추가 FSEC 비교실험을 수행한 결과, 막 단백질 추출 및 용해 능력에 있어서는 LMNG 및 DDM이 VEG-3 및 VEG-5보다 우수하였다. 그러나 45℃로 열처리한 경우에 LMNG 및 DDM에 의해 가용화된 UapA는 분해가 상당히 이루어진 반면에, VEG-3 및 VEG-5에 의해 가용화된 UapA는 단백질의 완전성을 유지하였다(도 8). 이에 따라, VEG-3 및 VEG-5는세포막으로부터 추출한 UapA를 수용액에서 구조적으로 안정한 상태로 유지하는 데 우수한 효과를 나타내므로, 막단백질을 안정화시키는 데 효과적으로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 4> VEGs의 MelBst막단백질 구조 안정화 능력 평가
VEGs에 의한 MelB(Salmonella typhimurium melibiose permease) 단백질의 구조 안정성을 측정하는 실험을 하였다.
구체적으로, 플라스미드 pK95△AHB/WT MelBSt/CH10를 사용하여 C-말단에 10-His tag를 가지는 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) MelBSt (melibiose permease)를 E. coli DW2 세포 (△ melB및 △ lacZY)에서 발현하였다. A. S. Ethayathulla 등의 논문(Nat. Commun. 2014, 5,　3009)에 기재된 방법에 따라 세포 성장 및 멤브레인 준비를 수행했다. 단백질 검정은 Micro BCA 키트(Thermo Scientific, Rockford, IL)로 수행했다. P. S. Chae 등의 Nat. Methods 2010, 7, 1003-1008에 기재된 프로토콜을 사용하여 MelBSt 안정성에 대해 VEGs또는 DDM을 평가하였다. MelBSt를 함유하는 멤브레인 샘플(최종 단백질 농도는 10 mg/mL)을 1.5 wt% DDM 또는VEGs를 함유하는 용해화 버퍼 (50 mM sodium phosphate, pH 7.5, 200 mM NaCl, 10% 글리세롤, 20 mM melibiose)에 90분 동안 4개의 온도(0 및 23℃)에서 인큐베이션하였다. 불용성 물질을 제거하기 위하여, 30분 동안 4℃에서 TLA-100 rotor가 구비된 Beckman OptimaTM MAX 초원심분리기로 355,590g에서 초원심분리를 수행하였다. 초원심분리하지 않은 멤브레인 단백질 20 ㎍을 미처리된 멤브레인 또는 초원심분리 후 동량의 상기 화합물들의 추출물에 적용하고, 처리된 샘플은 동등 부피로 각각의 웰에 로딩하였다. 로딩된 샘플을 SDS-15% PAGE로 분석하고, 그 다음 Penta-His-HRP 항체 (Qiagen, Germantown, MD)로 면역블로팅하여 시각화하였다.
다양한 양친매성 분자에서 MelBSt의 열적 안정성을 평가하기 위해 23 ℃에서 개별 양친매성 분자로 추출한 MelBSt를 3가지 다른 온도(45, 55 및 65 ℃)에서 추가로 90분 동안 열처리하고 초원심분리 후 SDS-15% PAGE 및 웨스턴 블럿팅으로 분석하였다. MelBSt는 ImageQuant LAS 4000 Biomolecular Imager (GE Healthcare Life Science)에 의해 SuperSignalWest Pico 화학 발광 기질을 사용하여 검출되었다.
도 9(a) 내지 (d)에 나타난 결과와 같이, 0℃ 및 23℃에서 DDM는 VEGs보다 MelBst를 세포막으로부터 추출 용해하는데 더 효율적이었다.
그러나, 온도를 45℃로 올렸을 때 DDM 및 VEGs는거의 유사한 효율로 MelBst 단백질을 가용화하였고 더 높은 온도(55℃)에서는 DDM의 MelBst 가용화 효력이 현저히 떨어진 반면에, 대부분의 VEGs는 55℃에서도 MelBst 가용화 효력이 별로 감소하지 않았다. 특히, VEG-4 및 VEG-5는 그 효력을 온전히 유지하였다. 65℃에서는 모든 VEGs가 DDM보다 MelBst의 가용화 능력이 우수하였고,특히 VEG-3 및 VEG-4는 이 높은 온도에서도 매우 우수한 단백질 가용화 능력을 나타내었다.
전체적으로 낮은 온도(0°C 및 23°C)에서는 DDM이 VEGs보다 높은 단백질 추출 효율을 보여준 반면 온도를 올려 측정한 단백질 열적안정성 실험에서는 VEGs(특히 VEG-3 및 VEG-4)가 DDM보다 더 우수한 트랜스포터 용해화 능력을 보여주어 단백질 안정화 능력이 탁월함을 확인하였다.
<실시예 5> VEGs의 β2AR 단백질 안정화 능력 평가
<5-1> 장기간 안정성 측정(Long-term stability measurement)
수용체는 바큘로바이러스(baculovirus)로 감염된 Sf9 곤충 세포에서 발현되었고 1% DDM에 가용화되었다. DDM에 가용화된 수용체는 0.01% 콜레스테릴 석시네이트 (cholesteryl succinate,CHS)의존재하에 알프레놀올 세파로스(alprenolol sepharose)에 의해 정제되었다. DDM에 의해 정제된 β2AR을 DDM 또는 VEGs(VEG-1, VEG-2, VEG-3 및 VEG-5)를 함유하는 버퍼로 희석하여 최종 농도가 CMC+0.2 wt% 되도록 하였다. 각 화합물에 가용화된 β2AR을 실온에서 10일 동안 보관하였고, 실온에서 30분 동안 10 nM의 방사성 [3H]-다이하이드로알프레놀올(dihydroalprenolol, DHA)로 인큐베이트함으로써 규칙적인 간격으로 수용체의 리간드 결합능력을 측정하였다. 혼합물을 G-50 컬럼에 로딩하고, 일정량의 결합 버퍼(20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mg/ml BSA가 보충된)을 사용하여 상층액을 수집하였다. 추가로 15 ml 섬광 유체를 첨가하였다. 수용체-결합된 [3H]-DHA는 섬광 계수기(Beckman)로 측정하였다.
그 결과, VEGs(VEG-1, VEG-2, VEG-3 및 VEG-5)는 DDM과 유사한 가용화된 수용체의 초기 활성 유지 능력을 보였다(도 11). 그러나 장기간 수용체 안정화 능력에 있어서, DDM 및 VEG-5에 의해 가용화된 수용체는 시간이 지남에 따라 빠른 활성 손실을 보여준 반면, VEG-2 및 VEG-3에 가용화된 수용체는 10일 배양 과정동안 수용체의 활성을 지속적으로 유지함을 보였다(도 10(a)). 따라서 VEG-2 및 VEG-3은 DDM보다 가용화된 수용체 단백질 연구에 더욱 효과적일 것으로 판단된다.
<5-2> VEG-3에 의해 가용화된 β2AR-Gs복합체의 정제 및 안정성 측정
0.1% DDM에 가용화된 100 μM β2AR을실온에서 30분 동안 120μM Gs 헤테로트리머(heterotrimer)와 혼합하였다. 0.5 unit apyrase(NEB) 및 2 mM MgCl2를 첨가하여 복합체 형성을 촉진시킨 다음, 1시간 더 인큐베이션하였다. 이어서, 1.0% VEG-3을 첨가하여 0.2%의 최종 농도로 만들고 DDM에서 VEG-3으로 변경하기 위해 샘플을 추가로 30분 동안 인큐베이션하였다. 단백질 용액을 M1 Flag column에 넣고 0.1% DDM 버퍼 대 0.5% VEG-3버퍼의 몰비가 다른 일련의 버퍼로 세척하여 DDM에서 VEG-3으로 완전히 변경하고 수용체-Gs 복합체는 0.05% VEG-3 버퍼로 최종 용출되었다. 제조 겔 여과(preparative gel filtration)를 러닝 버퍼 (20mM HEPES pH 7.5, 100mM NaCl, 0.005 % VEG-3, 1mM BI, 100μM TCEP)로 β2AR-Gs복합체를 정제하기 위해 수행하였다. VEG-3에서 β2AR-Gs 복합체의 안정성을 측정하기 위해 분석 겔 여과(analytical gel filtrations)는 상기와 같은 러닝 버퍼를 사용했지만 3일 및 15일 배양 후 VEG-3(화합물이 없는 조건)을 사용하지 않고 수행하였다.
도 10(b)에 나타난 결과와 같이, VEG-3에 의해 정제된 β2AR-Gs 복합체가 이전 연구에서 DDM에 의해 정제된 β2AR-Gs 복합체로부터 얻은 결과와 대조적으로 15일 동안 복합체로서의 완전성을 계속 유지한다는 것을 확인하였다. DDM의 경우에 이 복합체는 2일 배양 후에도 수용체와 Gs 단백질 사이에 상당한 정도의 해리를 보였다.
<5-3> VEG-3에 의해 가용화된 β2AR-Gs 복합체의 negative stain EM analysis
β2AR-Gs 단백질 복합체는 기존의 음성 염색 프로토콜을 사용하여 전자 현미경 검사를 위해 준비되었으며 저용량 절차를 사용하여 120 kV에서 작동되는 Tecnai T12 전자 현미경으로 실내 온도에서 영상화하였다. 이미지는 Gatan US4000 CCD 카메라에서 71,138x의 배율 및 약 -1.4 ㎛ 의 디포커스 값(defocus value)으로 기록하였다. 모든 이미지는 표본 수준에서 4.16 Å의 픽셀 크기를 얻기 위해 binned(2x2 픽셀)되었다. 입자들는 e2boxer(EMAN2 소프트웨어 제품군의 일부)를 사용하여 수동으로 제거하였다. ISAC를 사용하여 2D reference-free alignment 및 입자 투영 분류를 수행하였다. β2AR-Gs의 23035 투영은 양방향 매칭 및 5401 개의 입자 투영에 대해 일관된 19 개의 클래스를 생성하는 ISAC에 적용하였다.
그 결과, VEG-3에 의해 정제된 β2AR-Gs 복합체로부터 생성된 입자들은 이전 연구에서 DDM에 의해 정제된 복합체에서 관찰된 입자들의 응집한 형태와 달리 매우 균일한 것으로 나타났다. 또한 대표적인 2D 클래스 이미지에서 본 복합체의 각 구성요소(β2AR, Gαs 및 Gβγ)들은 명확하게 구별되었다(도 12b, c). VEG-3의 사용을 통해 얻은 본 단백질 복합체의 EM 이미지는 다른 양친매성 분자들를 통해 얻은 복합체 이미지와 비슷하거나 보다 선명하고 명확하였다. 이는 본 발명의 양친매성 화합물이 EM 분석을 통해 막 단백질 복합체의 구조 및 동적 구조 변화를 설명할 수 있는 중요한 잠재력을 가지고 있음을 나타낸다.
<실시예 6> VEGs의 막단백질(LeuT) 구조 안정화 능력 평가
G. Deckert 등의 논문(Nature 1998, 392, 353-358.)에 게재된 방법에 따라, 아퀴펙스 에오리쿠스(Aquifex aeolicus)로부터 와일드 타입 LeuT(leucine transporter)의 정제를 수행하였다. LeuT는 C-말단 8xHis-태그된 트랜스포터를 암호화하는 pET16b로 형질전환된 E. coli C41(DE3)에서 발현된다(발현 플라스미드는 Dr E. Gouaux, Vollum Institute, Portland, Oregon, USA에 의해 제공받음). 요약하면, LeuT 단백질을 분리하고, 1.0 wt% DDM에 용해화한 후에, 단백질을 Ni2 +-NTA resin (Life Technologies, Denmark)에 결합시키고, 20 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1 mM NaCl, 199 mM KCl, 0.05% DDM 및 300 mM 이미다졸로 용출시켰다. 그 다음, 약 1.5 mg/ml 단백질 샘플(stock)을 DDM 및 이미다졸이 없으나 VEGs 또는 DDM (대조군)을 최종 농도가 CMC + 0.04 wt%이 되도록 보충한 동일한 버퍼로 10배 희석하였다. 단백질 샘플은 상온에 10일간 보관하고, 단백질 활성 측정 전 인큐베이션 동안 일정한 간격으로 원심분리하였다. 단백질 활성은 SPA(scintillation proximity assay) (M. Quicketal.,Proc . Natl , Acad . Sci . U.S.A .2007, 104, 3603-3608.)를 이용하여 [3H]-Leu 결합을 측정하여 결정하였다. 상기 최종 농도에서 450 mM NaCl 및 각각의 상기 화합물을 함유하는 시료로 분석을 수행하였다. 20 nM [3H]-Leu 및 1.25 mg/mlcopper chelate (His-Tag) YSi beads(둘 모두 PerkinElmer, Denmark 로부터 구매함)의 존재 하에 SPA 반응을 수행하였다. [3H]-Leu 결합은 MicroBeta liquid scintillation counter(PerkinElmer)를 이용하여 측정하였다.
도 13에 나타난 결과와 같이, VEGs 중 VEG-5는 DDM과 유사한 LeuT 트랜스포터 활성 유지 능력을 나타내었다.

Claims (17)

  1. 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2018002462-appb-I000012
    상기 화학식 1에서,
    상기 R1 및 R2 는 각각 독립적으로 수소(H) 또는 CH3이고;
    상기 L은 -CH2-, -CH2CH2-, NHCOCH2-, -CH2OCH2CH2- 또는 직접결합이고;
    상기 X1 및 X2는 각각 독립적으로 산소로 연결된 당류(saccharide)이고; 그리고
    상기 Z는 수소(H) 또는 -CH2-X3이고, 상기 X3은 산소로 연결된 당류(saccharide)이다.
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2018002462-appb-I000013
    상기 화학식 2에서,
    상기 R1 및 R2 는 각각 독립적으로 수소(H) 또는 CH3이고; 그리고
    상기 X4는 글루코스(glucose) 중심의 가지친(branched) 오당류(pentasaccharide)이다.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 화학식 1 의 상기 당류는 글루코스(glucose) 또는 말토오스(maltose) 인 화합물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 R1 및 R2는 CH3인 화합물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 R1 및 R2는 CH3이고; 상기 L은 -CH2CH2- 또는 -NHCOCH2 -이고; 그리고 상기 Z는 수소인 화합물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 R1 및 R2는 CH3이고; 상기 L은 -CH2- 또는, -CH2OCH2CH2-이고; 그리고 상기 Z는 -CH2-X3인 화합물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 3 내지 7 중 하나인 화합물:
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2018002462-appb-I000014
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2018002462-appb-I000015
    [화학식 5]
    Figure PCTKR2018002462-appb-I000016
    [화학식 6]
    Figure PCTKR2018002462-appb-I000017
    [화학식 7]
    Figure PCTKR2018002462-appb-I000018
  7. 제 1항에 있어서, 상기 화합물은 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하기 위한 양친매성 분자인 화합물.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 화합물은 수용액에서 임계 미셀 농도(CMC)가 0.1 내지 10μM인 화합물.
  9. 제 1항에 따른 화합물을 포함하는 막단백질의 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석용 조성물.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 조성물은 미셀, 리포좀, 에멀션 또는 나노입자의 제형인 것인 조성물.
  11. 1) 비타민 E(tocopherol)에 -CH2-, -CH2CH2-, NHCOCH2 - 또는 -CH2OCH2CH2- 구조의 링커를 도입하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 생성물을 4-(브로모메틸)-메틸-2,6,7-트리옥사바이사이클로[2,2,2]-옥탄(4-(bromomethyl)-methyl-2,6,7-trioxabicyclo[2.2.2]-octane) 또는 다이에틸 말로네이트(diethyl malonate)와 반응시킨 다음 환원시켜 알코올기를 생성시키는 단계;
    3) 상기 단계 2)의 생성물에 글리코실레이션(glycosylation) 반응을 수행하여 보호기가 부착된 당류를 도입하는 단계; 및
    4) 상기 단계 3)의 생성물에 탈보호기화(deprotection) 반응을 수행하는 단계;를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조 방법:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2018002462-appb-I000019
    상기 화학식 1에서,
    상기 R1 및 R2 는 각각 독립적으로 수소(H) 또는 CH3이고;
    상기 L은 -CH2-, -CH2CH2-, NHCOCH2-, -CH2OCH2CH2- 또는 직접결합이고;
    상기 X1 및 X2는 각각 독립적으로 산소로 연결된 당류(saccharide)이고; 그리고
    상기 Z는 수소(H) 또는 -CH2-X3이고, 상기 X3은 산소로 연결된 당류(saccharide)이다.
  12. 1) 비타민 E(tocopherol) 글리코실레이션(glycosylation) 반응을 수행하여 보호기가 부착된 당류를 도입하는 단계; 및
    2) 상기 단계 1)의 생성물에 탈보호기화(deprotection) 반응을 수행하는 단계;를 반복하여 수행하는 단계를 포함하는, 하기 화학식 2로 표시되는 화합물의 제조 방법:
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2018002462-appb-I000020
    상기 화학식 2에서,
    상기 R1 및 R2 는 각각 독립적으로 수소(H) 또는 CH3이고; 그리고
    상기 X4는 글루코스(glucose) 중심의 가지친(branched) 오당류(pentasaccharide)이다.
  13. 제 11항에 있어서, 상기 R1 및 R2 는 CH3이고; 그리고 상기 당류는 글로코스 또는 말토오스인, 방법.
  14. 수용액에서 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 막단백질에 처리하는 단계를 포함하는, 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2018002462-appb-I000021
    상기 화학식 1에서,
    상기 R1 및 R2 는 각각 독립적으로 수소(H) 또는 CH3이고;
    상기 L은 -CH2-, -CH2CH2-, NHCOCH2-, -CH2OCH2CH2- 또는 직접결합이고;
    상기 X1 및 X2는 각각 독립적으로 산소로 연결된 당류(saccharide)이고; 그리고
    상기 Z는 수소(H) 또는 -CH2-X3이고, 상기 X3은 산소로 연결된 당류(saccharide)이다.
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2018002462-appb-I000022
    상기 화학식 2에서,
    상기 R1 및 R2 는 각각 독립적으로 수소(H) 또는 CH3이고; 그리고
    상기 X4는 글루코스(glucose) 중심의 가지친(branched) 오당류(pentasaccharide)이다.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 R1 및 R2는 CH3이고; 상기 L은 -CH2CH2- 또는 -NHCOCH2 -이고; 그리고 상기 Z는 수소인, 방법.
  16. 제 14항에 있어서, 상기 R1 및 R2는 CH3이고; 상기 L은 -CH2- 또는, -CH2OCH2CH2-이고; 그리고 상기 Z는 -CH2-X3인, 방법.
  17. 제 14항에 있어서, 상기 막단백질은 LHI-RC 복합체(light harvesting-I and the reaction center complex), UapA (Uric acid-xanthine/H+ symporter), LeuT (Leucine transporter), β2AR (human β2 adrenergic receptor), MelB (Melibiose permease), 또는 이들의 2 이상의 조합인 방법.
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