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WO2019069561A1 - インフルエンザに対する医薬 - Google Patents

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WO2019069561A1
WO2019069561A1 PCT/JP2018/030141 JP2018030141W WO2019069561A1 WO 2019069561 A1 WO2019069561 A1 WO 2019069561A1 JP 2018030141 W JP2018030141 W JP 2018030141W WO 2019069561 A1 WO2019069561 A1 WO 2019069561A1
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WO
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virus
positive cells
antibody
influenza virus
influenza
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PCT/JP2018/030141
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English (en)
French (fr)
Inventor
文彦 安井
小原　道法
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Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
Original Assignee
Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
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Priority to JP2019546556A priority patent/JPWO2019069561A1/ja
Priority to CN201880055435.2A priority patent/CN111065400A/zh
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    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
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    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16171—Demonstrated in vivo effect

Definitions

  • the present invention relates to an agent for preventing and treating the onset of influenza virus infection that is the cause of the onset of influenza.
  • H5N1 highly pathogenic avian influenza and H7N9 avian influenza are included as new influenza.
  • H5N1 highly pathogenic avian influenza virus H5N1 HPAIV was reported for the first cases of infected patients in 1997, and the number of infected people expanded from 2003 onwards, mainly in China, Southeast Asia, and the Middle East.
  • H5N1 HPAIV a pre-pandemic vaccine prepared by predicting the epidemic strain was infected and propagated using embryonated chicken eggs for four clades (Clade 1, 2.1, 2.2, 2.3) It is stored as a whole particle inactivated virus vaccine.
  • H5N1 HPAIV infection of embryonated chicken eggs has problems such as high lethality and difficulty in mass preparation due to low virus yield.
  • the pre-pandemic vaccine for H5N1 HPAIV manufactured and stored in Japan the “safety test” conducted on a scale of 6,000 people from 2008 to 2009, and the “first vaccination test” for 200 people, And three clinical trials of "boosting trials” were conducted for 200 people who were already in the early stage. With regard to safety, it is believed that it was within the scope of the forecast.
  • NA neuraminidase
  • Non-patent Document 4 For severe acute respiratory syndrome (SARS), we have succeeded in producing recombinant vaccinia virus with cDNA of SARS-CoV, which is known as its pathogen, and it has excellent preventive effect and re-administrable formulation. It is confirmed that there exists (nonpatent literature 3). Furthermore, H5N1 HPAIV has also succeeded in producing a recombinant vaccinia virus having H5N1 HPAIV HA cDNA, and it has been confirmed that the preparation exhibits excellent preventive effect (Non-patent Document 4). .
  • SARS severe acute respiratory syndrome
  • the problem to be solved by the present invention is to provide an anti-influenza drug effective for preventing the onset of influenza virus infection including H5N1 HPAIV.
  • the present invention is as follows.
  • Prevention or protection against influenza which comprises a recombinant vaccinia virus containing an expression promoter and all or part of a DNA encoding an influenza virus-derived protein in the genome of vaccinia virus strain DIs, or an inactivated influenza virus Therapeutic medicine.
  • the medicine according to (1) wherein the prevention or treatment against influenza is by the action of activated CD4 positive cells and / or activated CD8 positive cells.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating influenza which comprises any one of the following components (a) to (c): (a) at least one component selected from the group consisting of activated CD4 positive cells, an activator for CD4 positive cells, and a combination of CD4 positive cells and an activator for CD4 positive cells (b) activated At least one component selected from the group consisting of a CD8 positive cell, an activator for CD8 positive cells, and a combination of a CD8 positive cell and a CD8 positive cell activator (c) (a) and (b) above Component (7)
  • the recombinant vaccinia virus further comprising an expression promoter and all or part of a DNA encoding an influenza virus-derived protein in the genome of the vaccinia virus strain DIs, or an inactivated influenza virus
  • influenza virus-derived protein H5N1 highly pathogenic avian influenza virus-derived hemagglutinin protein.
  • Prevention or protection against influenza which comprises a recombinant vaccinia virus containing an expression promoter and all or part of a DNA encoding a protein derived from influenza virus in the genome of vaccinia virus strain DIs, or an inactivated influenza virus Therapeutic kit.
  • the kit according to (11), wherein the prevention or treatment against influenza is by the action of activated CD4 positive cells and / or activated CD8 positive cells.
  • the kit according to any one of (11) to (14), wherein the influenza virus-derived protein is a H5N1 highly pathogenic avian influenza virus-derived hemagglutinin protein.
  • a kit for preventing or treating influenza comprising any one of the following components (a) to (c): (a) at least one component selected from the group consisting of activated CD4 positive cells, an activator for CD4 positive cells, and a combination of CD4 positive cells and an activator for CD4 positive cells (b) activated At least one component selected from the group consisting of a CD8 positive cell, an activator for CD8 positive cells, and a combination of a CD8 positive cell and a CD8 positive cell activator (c) (a) and (b) above Component combination component (17) A recombinant vaccinia virus, which contains an expression promoter and all or part of a DNA encoding an influenza virus-derived protein, in the genome of vaccinia virus strain DIs, or an inactivated influenza virus is further added.
  • the kit as described in (16) including. (18) The kit according to (16) or (17), further comprising an antibody against influenza virus-derived protein. (19) The kit according to (18), wherein the antibody is a binding antibody. (20) The kit according to any one of (17) to (19), wherein the influenza virus-derived protein is a H5N1 highly pathogenic avian influenza virus-derived hemagglutinin protein.
  • influenza preventive or therapeutic agent vaccine for preventing or treating influenza
  • vaccine for preventing or treating influenza vaccine for preventing or treating influenza
  • FIG. 1 shows the gene structure of a plasmid vector.
  • “Influenza HA” represents the HA protein gene (cDNA) of each influenza virus
  • “H5 subtype” represents H5N1 HPAIV (the same applies to other figures).
  • FIG. 6 shows the amount of virus in lung tissue from day 5 after challenge with H5N1 HPAIV in BALB / c mice inoculated with a vaccine for H5N1 HPAIV (rDIs / mCl2.2).
  • FIG. 6 shows viral load one day and six days after viral infection in BALB / c mice to which a conjugated antibody against HA protein was administered. Wild-type mice or Fc receptor gamma-deficient mice were inoculated with a vaccine for H5N1 HPAIV (rDIs / mCl2.2), weight change up to 9 days after H5N1 HPAIV challenge, and lung tissue 1 and 3 days after virus infection It is a figure which shows the amount of viruses.
  • FIG. 6 shows the effect of CD8 positive cell depletion in the vaccinated group, or CD4 positive and CD8 positive cell depletion on the amount of virus in lung tissue. It is a figure which shows the influence on the body weight and survival rate by both CD4 positive and CD8 positive cell depletion in a vaccination group.
  • the current pre-pandemic vaccine against H5N1 HPAIV is a whole particle vaccine inactivated by formalin that produces influenza virus with H5N1 HA deleted of multibasic sites using reverse genetics technology .
  • the preventive effect is significantly reduced against the need for two inoculations at three-week intervals or against clade virus strains different from the inoculated vaccine.
  • vaccinia virus serving as a recombinant mother used for the production of RVV needs to be a vaccine strain with established safety, and such vaccine strains include vaccinia virus DIs strain and LC16m8 strain.
  • the vaccinia virus strain DIs is a highly attenuated vaccinia virus strain isolated by subculturing vaccinia virus strain (DEI strain) with egg embryo (Tagaya I, et al., A new mutant of Nature, 1961, vol. 192, p.
  • the vaccinia virus LC16m8 strain is a safe and effective attenuated vaccine strain that has been approved by the Ministry of Health and Welfare at that time in 1975 as a smallpox vaccine, and has been used for more than 50,000 infants.
  • the attenuation of the LC16m8 strain is derived from the fact that the full-length B5R protein is not expressed due to a single base deletion of the B5R protein gene of the LC16mO strain thought to be involved in cell adsorption / infection (Morikawa S J. Virol., 2005, vol. 79 (18), p. 11873-1189) .., et al., An LC an LC16m8 smallpox vaccine: analysis of full-genome sequence and induction of immune protection.
  • the safety is likely to be secured even when inoculated into an immunodeficient or immunosuppressed person, and it is possible to develop a live recombinant influenza vaccine having such advantages as no inoculation mark.
  • the inventor has established a recombinant pandemic influenza vaccine using this DIs strain as a mother, and has shown efficacy against single infection with H5N1 HPAIV.
  • the DIs strain-derived RVV that expresses the influenza virus HA protein gene can be lethal H5N1 HAPIV by a single inoculation of 1 ⁇ 10 7 PFU of RVV as a vaccine for H5N1 HPAIV (rDIs / mCl2.2). It also shows rapid weight recovery and 100% survival for challenge infections.
  • RVV derived from DIs strain also has a sufficient effect as a vaccine for H5N1 HPAIV.
  • the vaccine for H5N1 HPAIV (rDIs / mCl2.2) was inoculated in which the gene encoding the hemagglutinin (HA) protein of H5N1 highly pathogenic avian influenza virus (H5N1 HPAIV) was incorporated into vaccinia virus DIs strain together with the expression promoter
  • H5N1 HPAIV highly pathogenic avian influenza virus
  • the binding antibody produced after vaccination contributes to the protection against viral infection by the group of cells with the binding antibody and Fc gamma receptor for protection against infection until 1 day after H5N1 HPAIV infection, and it is possible to mediate FcRg It is highly likely that you are doing However, it was shown that the virus exclusion contribution rate of the antibody was not high, and did not lead to the virus elimination as seen in the individual (FIG. 3) inoculated with the vaccine for H5N1 HPAIV (rDIs / mCl2.2) (FIG. 5). , 6).
  • CD4 positive cells are essential for protection against viral infection from 1 day to 3 days after infection with H5N1 HPA IV vaccine (rDIs / mCl2.2) -infected individuals, from the results of CD4 positive cell depletion experiments It became clear ( Figure 7). Furthermore, CD8 positive cells were found to play an important role in virus elimination from 3 days to 6 days after infection (FIG. 8). Furthermore, by depleting both CD4 positive cells and CD8 positive cells, even in the vaccinated individuals, the virus could not be eliminated regardless of 10 days after infection, and the body weight decreased significantly and began to die (FIG. 9). .
  • a recombinant vaccinia virus containing an expression promoter and all or part of a DNA encoding an influenza virus-derived protein in the genome of vaccinia virus strain DIs, or an inactivated influenza virus can be used against influenza Alternatively, it can be used as a therapeutic drug or a vaccine for preventing or treating influenza.
  • the preventive or therapeutic effect on influenza is exerted by the action of activated CD4 positive cells, activated CD8 positive cells, or a combination of these cells.
  • CD4 positive cells activated to influenza virus HA protein and / or activated CD8 positive cells can be a safe and effective preventive agent or therapeutic agent against influenza virus which shows rapid outbreak. I found that.
  • activated CD4 positive cells activators of CD4 positive cells, or activation of CD4 positive cells
  • the combination of the agent and CD4 positive cells is used as a medicament for the prophylaxis or treatment of influenza (pharmaceutical composition for the prophylaxis or treatment).
  • an activated CD8-positive cell, an activator for a CD8-positive cell, or a combination of a CD8-positive cell and a CD8-positive cell activator is used as a prophylactic or therapeutic drug for influenza.
  • CD4 positive cells or CD8 positive cells, or both CD4 positive cells and CD8 positive cells are also referred to as "CD4 / CD8 positive cells”.
  • the DIs strain-derived RVV.H5N1 HPAIV (rDIs / mCl2.2) or the like, or an inactivated influenza virus is used as the inactivated vaccine in the above-described activated CD4 / CD8 positive cells, CD4 / It can be used together with an activator of CD8 positive cells or a combination of CD4 / CD8 positive cells and an activator of CD4 / CD8 positive cells.
  • CD4 positive cells are helper T cells (classified as Th1, Th2 or Th17) and regulatory T cells. T cell receptors (TCRs) possessed by CD4 positive cells bind to class II MHC molecules possessed by macrophages and B cells. Helper T cells receive antigen presentation from macrophages and the like through MHC class II molecules, and activate B cells and cytotoxic T cells. On the other hand, regulatory T cells are involved in the termination of the immune response.
  • CD8 cells are T cells that show reactivity to antigens presented on MHC class I molecules, and act as cytotoxic T cells that discriminate the antigens and destroy virus-infected cells. It also acts on virus-infected cells via the production of interferon gamma (IFN-g) and promotes the degradation of intracellular antigens in a non-cytotoxic manner.
  • IFN-g interferon gamma
  • Inactivated influenza virus refers to those obtained by inoculating and developing influenza virus for vaccine production into embryonated eggs, partially degrading the virus purified and concentrated from the urine fluid with ether, and further inactivating it with formalin . However, in the present invention, it is also possible to use one in which virus particles themselves are inactivated.
  • CD4 / CD8 positive cells are collected from the blood, bone marrow and the like of the subject and obtained by a cell sorter and the like. Alternatively, they can be derived from stem cells such as iPS. Confirmation that the collected cells are CD4 / CD8 positive cells can be performed by flow cytometry. Examples of activators of CD4 positive cells include interleukin (IL) -2, IL-4, CD86, OX40 ligand, HA protein which is an antigen, and a part thereof. CD4 positive cells are activated by culturing with the above-mentioned activating agent.
  • IL interleukin
  • Examples of activating agents for CD8 positive cells include IL-2, IL-12, IFN-g, CD86, CD137 ligand, OX40 ligand, HA protein which is an antigen, and a part thereof.
  • CD8 positive cells are activated by culturing with the above-mentioned activating agent.
  • Confirmation of activation of CD4 / CD8 positive cells can be carried out by confirming cytokine production and expression of activity markers by flow cytometry or ELISpot.
  • the CD4 / CD8 positive cell activating agent when administered to a subject (healthy person or patient), the subject-derived CD4 / CD8 positive cells become active in the body of the administered subject.
  • CD4 / CD8 positive cells in the body is as follows: when a CD4 positive cell activator such as IL-2, IL-4, CD86, OX40 ligand, HA protein which is an antigen, or a part thereof is administered, Expression of surface molecules such as CD40L, CD44 and CD69 is enhanced, resulting in activation of CD4 positive cells.
  • a CD8-positive cell activator such as IL-2, IL-12, IFN-g, CD86, CD137 ligand, OX40 ligand, HA protein which is an antigen, or a part thereof is administered, such as CD44 or CD69
  • Surface molecule expression is enhanced, resulting in activation of CD8 positive cells.
  • CD4 / CD8 positive cells when a combination of CD4 / CD8 positive cells and an activator for CD4 / CD8 positive cells is used, administering the combination to a subject activates the CD4 / CD8 positive cells used for administration. At the same time, endogenous CD4 / CD8 positive cells derived from the subject are activated in the body of the administered subject. Confirmation of activation of these CD4 / CD8 positive cells can be carried out by confirming cytokine production and expression of activity markers by flow cytometry or ELISpot method.
  • an antibody against influenza virus-derived protein is used as a medicament for the prophylaxis or treatment of influenza together with the recombinant vaccinia virus of the present invention or inactivated influenza virus.
  • an antibody against an influenza virus-derived protein is used as a medicament for the prophylaxis or treatment of influenza together with an activator for CD4 / CD8 positive cells and / or activated CD4 / CD8 positive cells. .
  • influenza virus-derived proteins used in the present invention include, but are not particularly limited to, H1N1, H3N2 and influenza B virus.
  • H5N1 HPAIV-derived hemagglutinin (HA) protein can be used.
  • an antibody against the above influenza virus-derived protein or an antigen-binding fragment thereof is used as a medicament for the prophylaxis or treatment of influenza.
  • the antibody may be either a binding antibody against influenza virus derived protein or a neutralizing antibody against influenza virus derived protein. Also, these antibodies may be polyclonal antibodies or monoclonal antibodies, or fragments thereof.
  • an antibody against the protein referred to as "anti-HA antibody”
  • binding antibody is an antibody whose antigen is an influenza virus-derived protein (for example, HA protein of H5N1 virus), and has an opsonization or an action similar to opsonization as a function. Binding antibodies are antibodies that have the function of binding to an antigen but do not have neutralizing activity against influenza virus (eg H5N1 HPAIV).
  • the "neutralizing antibody” is an antibody having an influenza virus-derived protein (for example, HA protein of H5N1 virus) as an antigen, and is an antibody produced from an individual after DIs vaccination described later.
  • the neutralizing activity of the neutralizing antibody means the function of inhibiting adhesion of the virus to the target cell and / or infection. That is, regardless of which part of the influenza virus-derived protein is bound, the function of the neutralizing antibody is that the protein of the virus adheres to and infects a receptor on the target cell surface by binding to the protein. It means the function to inhibit.
  • the antibody of the present invention has binding activity to a polypeptide having the amino acid sequence shown in Accession No. listed in Table 1 below, but in addition to that, one or several (for example, 2) of these amino acid sequences , 3, 4 or 5) amino acid substitution, deletion or insertion, the amino acid sequence shown in the SEQ ID NO: 80% or more, preferably 90% or more, 95% or more, 98 or more It may be one that recognizes a mutant polypeptide having% or more, or 99% or more identity.
  • the antibody of the present invention is a polypeptide encoded by a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in Accession No. listed in Table 1, or 80% to 90% of the nucleotide sequence. What recognizes a mutant polypeptide encoded by a polynucleotide having an identity of 95% or more, 98% or more, or 99% or more is included. Furthermore, in another embodiment of the present invention, the antibody of the present invention is a mutation encoded by a polynucleotide comprising a base sequence that hybridizes under high stringency conditions with the base sequence shown in Accession No. listed in Table 1. It may be one that recognizes a type polypeptide.
  • the neutralizing antibody of the present invention is an antibody produced from an individual after DIs vaccination as described above. Immunize the non-human mammals such as rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, goats, horses, sheep, etc. with DIs vaccine as such or with carriers and diluents. Methods of immunization are well known. Measurement of the neutralization titer of the antibody in serum can be performed by a microneutralization antibody measurement method or the like. After confirming that the neutralization titer has sufficiently increased, whole blood is collected and the antibody is separated and purified by a commonly used method. The separation and purification can be carried out by appropriately selecting known methods such as ammonium sulfate precipitation, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, affinity chromatography or the like, or by combining them.
  • the conjugated antibody of the present invention is an antibody against influenza virus-derived protein (for example, HA protein of H5N1 virus), it is the same as the method for producing ordinary polyclonal antibody or monoclonal antibody using the protein or its partial peptide as an antigen. Can be produced.
  • influenza virus-derived protein for example, HA protein of H5N1 virus
  • Preparation of Antibody (1) Preparation of Polyclonal Antibody Influenza virus-derived protein or partial peptide may be administered to a non-human mammal such as rabbit, dog, guinea pig, mouse, rat, goat etc. Immunize by The dose of an antigen per animal, the dose when using an adjuvant, the type of adjuvant, the site of immunization, the interval of immunization, etc. are well known. Measurement of antibody titer in serum is also well known and can be performed by ELISA, EIA, RIA and the like. After confirming that the antibody titer has risen sufficiently, the whole blood can be collected, and the antibody can be separated and purified by a commonly used method. The separation and purification can be carried out by appropriately selecting known methods such as ammonium sulfate precipitation, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, affinity chromatography or the like, or by combining them.
  • a non-human mammal such as rabbit, dog,
  • a method for producing a monoclonal antibody is also well known. For example, collection of antibody-producing cells, cell fusion of antibody-producing cells with myeloma cells to obtain hybridomas, selection and cloning of hybridomas, collection of monoclonal antibodies, etc. can be performed by methods known to those skilled in the art. Furthermore, in the present invention, the epitope (antigenic determinant) of the antibody is not particularly limited as long as it is at least a part of an influenza virus-derived protein that is an antigen.
  • the antibody of the present invention includes an antibody that binds to a site (eg, an epitope) to which the antibody binds, eg, an antibody that binds to a site to which an antibody produced by the hybridoma of the present invention binds.
  • a site eg, an epitope
  • One of the preferred embodiments of the antibody of the present invention is a genetically modified antibody.
  • genetically modified antibodies include, but are not limited to, chimeric antibodies, humanized antibodies and humanized antibodies.
  • a chimeric antibody ie, a human chimeric antibody
  • a chimeric antibody is an antibody in which the variable region of a mouse-derived antibody is linked (conjugated) to a constant region derived from human (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855, (1984 When producing chimeras, etc.), they can be easily constructed by genetic recombination technology so as to obtain such linked antibodies.
  • CDR grafting When making a humanized antibody, a technique called so-called CDR grafting (CDR grafting) can be employed. Methods for producing such humanized antibodies are well known in the art (Nature, 321, 522-525 (1986); J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987); Queen C et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10033 (1989), see Patent No. 2828340, etc.).
  • a human antibody (a fully human antibody) is a hypervariable region that is generally an antigen binding site of a variable region (V region), the other part of the V region and the structure of the constant region are the same as human antibodies.
  • V region variable region
  • the Techniques for producing human antibodies are also known, and methods for producing gene sequences common to humans by genetic engineering techniques have been established.
  • a human antibody can be produced by using a human antibody-producing mouse having a human chromosomal fragment containing a heavy chain (H chain) and a light chain (L chain) gene of human antibody (Tomizuka, K. et al., Nature Genetics) , (1977) 16, 133-143; Kuroiwa, Y. et. Al., Nuc.
  • fragments of antibodies against influenza virus-derived proteins used in the present invention include Fab, Fab ′, F (ab ′) 2, Fv, diabodies (dibodies), dsFv, scFv (single). chain Fv) and the like.
  • the above antibody fragment can be obtained by cleaving the antibody of the present invention with various proteolytic enzymes according to the purpose.
  • Fab is obtained by treating an antibody molecule with papain
  • F (ab ') 2 is obtained by treating an antibody molecule with pepsin, respectively.
  • Fab ' is obtained by cleaving the disulfide bond in the hinge region of F (ab') 2 above.
  • scFv cDNA encoding heavy chain variable region (H chain V region) and light chain variable region (L chain V region) of antibody is obtained, and DNA encoding scFv is constructed. This DNA is inserted into an expression vector, and the expression vector is introduced into a host organism and expressed to produce a scFv.
  • cDNA encoding H chain V region and L chain V region of antibody is obtained, and DNA encoding scFv is constructed so that the length of the amino acid sequence of the peptide linker is 8 residues or less.
  • This DNA is inserted into an expression vector, and the expression vector is introduced into a host organism and expressed to produce a diabody.
  • dsFv cDNA encoding H chain V region and L chain V region of antibody is obtained, and DNA encoding dsFv is constructed. This DNA is inserted into an expression vector, and the expression vector is introduced into a host organism and expressed to produce dsFv.
  • the vaccine for H5N1 HPAIV (rDIs-H5 HA) or inactivated vaccine
  • the method for producing the vaccine for H5N1 HPAIV is known (patent 5884100 patent) and can be produced according to the known method. The outline of the preparation method is shown below.
  • the HA protein gene of H5N1 HPAIV has been designated in the GenBank database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) already provided by the National Center for Biotechnology Information (NCBI). It is registered by the accession number (Accession No.) of. For example, as shown in Table 1 below, GenBank accession number was deleted a part of DNA encoding HA protein derived from each clade of H5N1 HPAIV or DNA encoded HA protein of each clade of H5N1 HPAIV Gene is registered.
  • HA protein genes (including partially deleted / mutated genes) have already been cloned and inserted into a plasmid. Therefore, all (including a mutant sequence) or part of the gene contained in the recombinant vaccinia virus of the present invention can be obtained by conventional genetic engineering techniques.
  • the above-mentioned method is the site specificity described in “Molecular Cloning, A Laboratory Manual (4th edition)” (Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)) or “Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)”. It can be prepared using a mutational introduction method or a kit for introducing a mutation using the Kunkel method, Gapped duplex method or the like.
  • the expression promoter contained in the recombinant vaccinia virus of the present invention is not particularly limited as long as it is inserted into the gene deletion region of vaccinia virus strain DIs, and includes, for example, vaccinia virus promoter mH5 etc. (Virology. vol. 351, p. 368-380).
  • a hybrid promoter composed of a poxvirus type A inclusion body (ATI) promoter and a plurality of repeated vaccinia virus 7.5 kDa protein (p7.5) early expression promoters can also be used.
  • This promoter can be ligated to a suitable plasmid, for example, pUC / DIs are known (see Arch. Virol. Vol. 138, p. 315-330, 1994; JP-A-6-237773).
  • a recombinant vaccinia virus is produced by introducing the plasmid vector obtained by inserting the DNA encoding the expression promoter and HA protein into the host vaccinia virus.
  • any known method can be adopted, for example, recombinant vaccinia virus by introducing the obtained plasmid vector into chicken fibroblasts infected with attenuated vaccinia virus strain DIs.
  • Viruses rDIs / mCl1, rDIs / mCl2.1, rDIs / mCl2.2, and rDIs / mCl2.3
  • Methods for producing inactivated vaccines are known. As described above, influenza virus for vaccine production is inoculated into growth chicken eggs and propagated, and the virus purified and concentrated from the allantoic fluid is partially degraded with ether and further inactivated with formalin.
  • the present invention relates to (i) the above-mentioned recombinant vaccinia virus or inactivated virus derived from DIs strain, or (ii) the recombinant vaccinia virus or inactivated virus
  • the present invention provides a medicament for the prophylaxis or treatment of influenza, which comprises the combination of and an antibody against a protein derived from influenza virus.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating influenza, which comprises at least one selected from the group consisting of the following (a) to (d): (a) Activated CD4 / CD8 positive cells (b) CD4 / CD8 positive cell activator (c) Combination of CD4 positive cells and CD4 positive cell activator (d) CD8 positive cells and CD8 positive Combination with cell activator
  • the medicament of the present invention may further comprise (e) an antibody against a protein derived from influenza virus, (f) the above-mentioned recombinant vaccinia virus or non-derived from strain DIs, in addition to any one of (a) to (d) above or a combination thereof.
  • An activated virus, or (g) a combination of the recombinant vaccinia virus or inactivated virus and an antibody may further be included.
  • the present invention relates to a method for preventing and treating influenza, comprising administering the above-mentioned drug or the above-mentioned drug to a patient (subject), use of the above-mentioned drug for the prevention and treatment of influenza, the preventive drug for the new influenza And the use of the above medicament for producing a therapeutic agent.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be introduced into a living body by a known method, for example, injection such as muscle, intraperitoneal, intradermal or subcutaneous injection, or inhalation from the nasal cavity, oral cavity or lung, or oral administration.
  • the antibodies contained in the pharmaceutical composition of the present invention, CD4 / CD8 positive cells, activators of CD4 / CD8 positive cells, or a combination thereof may be used in combination with the above-mentioned recombinant vaccinia virus or inactivated virus. It is.
  • the mode of combination is not particularly limited, and the drug of the present invention and the recombinant vaccinia virus or inactivated virus of the present invention may be simultaneously administered, or one may be administered after a certain period of time after administration of the other. It can also be introduced into a living body by the method of administration.
  • the antibody, CD4 / CD8 positive cells, CD4 / CD8 positive cells activator, or a combination thereof is used as a pharmaceutical composition, an excipient, a bulking agent, a binder, a lubricant, etc. It can be mixed with known pharmaceutically acceptable carriers, buffers, tonicity agents, chelating agents, coloring agents, preservatives, flavors, flavors, sweeteners and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be orally administered as tablets, capsules, powders, granules, pills, solutions, syrups, etc., parenterally administered as injections, external preparations, suppositories, eye drops, etc. Depending on the form, it can be administered orally or parenterally.
  • intradermal injection, local injection into muscle, abdominal cavity and the like are exemplified.
  • the dose is appropriately selected according to the type of active ingredient, administration route, administration subject, patient's age, body weight, sex, symptoms and other conditions.
  • Intravenous CD4 / CD8 positive cells activated Intravenous CD4 / CD8 positive cell activator: oral, intravenous
  • the daily dose of the virus is about 1000 to 1000 PFU (plaque forming units) in the oral case, preferably about 100000 to 100 PFU, and about 100 to 1000 PFU in the parenteral case, preferably 1000 to 100000000. It is about PFU.
  • the virus can be administered once a day, or can be divided into several doses.
  • the recombinant vaccinia virus or inactivated virus of the present invention is used as a vaccine for preventing and treating influenza. Also, so far, in the development of a vaccine against H5N1 HPAIV, it has been considered that neutralizing antibody titer against H5N1 HPAIV is important. On the other hand, the recombinant vaccinia virus of the present invention can exert an effective protective effect even under the condition where the neutralizing antibody titer is hardly induced, and a cell group or a cell group that works with the passage of time after H5N1 HPAIV infection. It turned out that the factors are different.
  • the virus in an individual vaccinated with the H5N1 HPAIV vaccine (rDIs / mCl2.2), the virus is usually eliminated to below the detection limit by 6 days after H5N1 HPAIV infection.
  • a group of cells having a binding antibody and an Fc gamma receptor is important for protection against viral infection for protection against infection until one day after H5N1 HPAIV infection.
  • CD4 positive cells are essential for protection against viral infection from 1 day to 3 days after infection.
  • CD8 positive cells are required for protection against viral infection from 3 days to 6 days after infection.
  • the recombinant vaccinia virus (collectively referred to as "Flu HA-RVVs") produced by the present inventors was considered to be important as a preventive effect by conventional whole particle inactivated vaccination.
  • Antigen-specific antibodies (especially neutralizing antibodies) are capable of exerting a protective effect against H5N1 HPAIV infection by a different mechanism of action.
  • kits of the invention can include RVV (rDIs) or inactivated viruses, antibodies to influenza virus derived proteins, or combinations thereof.
  • the kit of the present invention contains any of the following (a) to (d), or a combination thereof.
  • (a) Activated CD4 / CD8 positive cells (b) CD4 / CD8 positive cell activator (c) Combination of CD4 positive cells and CD4 positive cell activator (d) CD8 positive cells and CD8 positive Combination with cell activator
  • kits of the present invention in addition to the above (a) to (d), (e) an antibody against a protein derived from influenza virus, (f) RVV (rDIs) or inactivated virus, or (g) the recombinant Combinations of vaccinia virus or inactivated virus and antibody or combinations thereof may further be included.
  • the kit of the present invention is used for the prevention or treatment of H5N1 highly pathogenic avian influenza.
  • the present invention will be more specifically described by way of examples. These examples are for illustrative purposes and do not limit the scope of the present invention.
  • ⁇ Method> 1 Preparation of recombinant vaccinia virus derived from DIs strain into which influenza virus hemagglutinin protein gene has been introduced: Hemagglutinin protein (HA) gene, which is an antigen of H5N1 HPAIV artificially synthesized downstream of vaccinia virus promoter mH5 sequence, is linked, for homologous recombination It was inserted into a plasmid vector (FIG. 1). At this time, when the H5N1 subtype HA sequence was inserted, Hind III site was used as a restriction enzyme site.
  • HA Hemagglutinin protein
  • RVV Recombinant vaccinia virus
  • the HA protein derived from influenza virus exhibits an agglutination reaction to guinea pig erythrocytes, whereas the HA protein derived from vaccinia virus does not cause an aggregation reaction to guinea pig erythrocytes. Therefore, the above recombinant virus was infected with CEF, and RVV screening was performed using the agglutination reaction of guinea pig red blood cells to the plaque formed thereby as an index. The target recombinant viruses were selected to form red plaques with hemagglutination activity.
  • H5N1 HPAIV challenge to single vaccination FcR gamma deficient mice and wild type mice ⁇ br/> Recombinant vaccinia virus (rDIs / mCl 2.2) at 1 ⁇ 10 7 PFU of FcR gamma deficient mice and back of wild type mice Inoculated into the skin.
  • challenge infection with H5N1 HPAIV was performed, daily weight measurement was performed, and survival rate was determined.
  • lung tissue samples were collected after one or three days, and the amount of virus in lung tissue was measured.
  • the RVV (rDIs / mCl2.2) single-inoculated mice produced transient weight loss after challenge infection with H5N1 HPAIV, but then recovered rapidly and showed 100% survival rate.
  • the non-vaccinated control group showed a rapid weight loss and all the animals died (FIG. 2).
  • the control group showed a high virus titer until 9 days after the infection, but in the vaccination group, it became up to 6 days after the infection in most individuals.
  • the virus titer had dropped below the detection limit ( Figure 3).
  • the virus titer in lung tissue of FcR gamma deficient mice showed higher value than that of wild type mice (FIG. 6).
  • the results of antigen-specific IgG transfer experiments and experimental results in FcR gamma-deficient mice reveal that the drop in virus titer in lung tissue one day after infection in vaccinated individuals is the effect of the cell population with bound antibody and FcR did.
  • CD4 positive cell group was depleted by intravenously administering anti-CD4 antibody every other day during the infection period from two days before H5N1 HPAIV challenge infection.
  • CD4 positive cell-depleted group the virus titer in lung tissue at 3 days after H5N1 HPAIV infection showed a high value. From these results, it was found that CD4 positive cells play an important role in virus elimination from 1 day to 3 days after infection. In addition, in the group where individual CD4 positive cells were infected virus was detected even 6 days after infection, but it was low compared to non-vaccinated individuals, so for virus exclusion 3 days after infection 6 days after In addition to the CD4 positive cell group, it became clear that other cell groups or factors are required (FIG. 7).
  • CD8 positive cells or both CD4 positive cells and CD8 positive cells were simultaneously depleted from the vaccinated individuals.
  • both the CD8 cell-depleted group and the CD4 / CD8 cell-depleted group it was found that the virus could not be eliminated 6 days after the infection (FIG. 8).
  • the CD4 / CD8 cell-depleted group despite being vaccinated, some individuals lost weight gradually and died (FIG. 9).
  • RVV expressing the influenza virus HA protein gene can be lethally infected with lethal H5N1 HPAIV infection by single inoculation with 1 ⁇ 10 7 PFU of RVV It also showed rapid weight recovery and 100% survival rate. Therefore, the DIs strain-derived RVV also has a sufficient effect as a vaccine for H5N1 HPAIV.
  • the virus is eliminated to below the detection limit 6 days after H5N1 HPAIV infection.
  • CD4 positive cells and CD8 positive cells mainly contributed to virus elimination in the virus infection protection from 3 days to 6 days after infection. In individuals who were depleted of CD4 / CD8 positive cells, some died despite being vaccinated. These results indicate that CD4 positive cells and CD8 positive cells are multistagely different in the action mechanism different from the neutralizing antibody considered to be important as the preventive action by the conventional whole particle inactivation vaccination. By acting, it turned out that it has a protective effect against H5N1 HPAIV infection.
  • influenza virus HA protein gene-expressing DIs strain-derived RVV of the present invention is a safe and effective vaccine against influenza viruses that show a sharp epidemic. Furthermore, it also became clear that CD4 positive cells and CD8 positive cells act in multiple steps as the protective mechanism.

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Abstract

ワクシニアウイルスDIs株のゲノム中に、発現プロモーターと、インフルエンザウイルス由来タンパク質をコードするDNAの全部若しくは一部とを含む組換えワクシニアウイルス、又は不活化したインフルエンザウイルスを含む、インフルエンザに対する予防又は治療用医薬。

Description

インフルエンザに対する医薬
　本発明は、インフルエンザの発症原因であるインフルエンザウイルス感染に対する発症予防及び治療薬に関する。
　季節性インフルエンザは、毎年冬季に流行し、人口の10から20%の罹患者の発生が報告されている。その病原体は、A/H1N1、 A/H3N2、またはB型インフルエンザウイルスであるが、毎年少しずつその抗原性が変化する為、その流行予測株に合わせたワクチンの製造が必要となっている。一方、新型インフルエンザとしては、H5N1 高病原性鳥インフルエンザやH7N9鳥インフルエンザがある。特に、H5N1高病原性鳥インフルエンザウイルス（H5N1 HPAIV）は、1997年に最初の感染患者が報告され、2003年以降に中国、東南アジア、中近東地域を中心に感染者が拡大した。これまでに、800人以上の感染例とその約50%にあたる450人以上の死亡者が報告されている。現在、H5N1 HPAIV用ワクチンとしては、その流行株を予測して作製されたプレパンデミックワクチンが4つのクレード（クレード1、2.1、2.2、2.3）について、孵化鶏卵を用いて感染・増殖させたウイルスの全粒子不活化ウイルスワクチンとして、備蓄されている。
  しかし、孵化鶏卵へのH5N1 HPAIV感染は、致死性が高く、ウイルス収量が低いために大量調製が困難であるなどの問題点がある。実際、日本で製造・備蓄されたH5N1 HPAIV用プレパンデミックワクチンについては、2008年から2009年にかけて6000人規模で実施された「安全性試験」、ならびに200人を対象にした「初回接種試験」、及び既に初期済みの200人を対象にした「追加接種試験」の3つの臨床試験が行われた。安全性については、予測の範囲内であったとの見解が出されている。一方、既に「ベトナム株」のH5N1ワクチンにて初期済みの被験者に対して異なるワクチン株であるインドネシア株、あるいは安徽株で接種された「追加接種試験」では、反応交叉性が確認されたものの、3週間間隔で同一ワクチンにより2回接種された「初回接種試験」では、異なるウイルス株に対する中和抗体誘導が不十分であることが報告されている。また、マウスモデルを用いた感染防御実験においても、実験室レベルにて同様の手法により作製したこれら4種のワクチンのうち、特に、クレード2.2及び2.3の亜型間における反応交叉性が低く、致死性を完全に抑えることができなかったとの報告がされている（非特許文献１）。よって、あくまで流行株を予測して作製されるワクチンであるため、実際に流行する株に対してワクチン効果を発揮できるか否かについては不明な点も多い。
　現在、インフルエンザ治療薬としては、インフルエンザウイルスの出芽に重要であるノイラミニダーゼ（NA）の作用を阻害するタミフル及びリレンザがあるものの、発症後48時間以内の投薬が重要であるなど、その効果は限られている。その他、NA阻害剤の静注剤は既に開発されている。また、インフルエンザウイルスのポリメラーゼ阻害剤であるアビガンは、2014年3月に日本国内での製造販売が承認されたものの、厚生労働大臣からの要請を受けて製造及び供給を行い、一般向けには販売出来ないなどの条件付のものとなっている。
　このような現状から、流行予測が困難であるインフルエンザウイルスに対して、幅広くかつ長期にわたり効果を発揮できる予防薬及び治療薬の確立が強く望まれている。
　各種ワクチンの中でも、生ワクチンは最も有効の高いものの一つであるが、一般に、新興ウイルスの弱毒性ワクチンの開発には非常に長い期間を必要とすることが知られている。これまでに、本発明者らが開発した、狂犬病ウイルス用又はリンダペスト用の組換えワクシニアウイルス（RVV）は、野外試験等において、優れた感染発症予防効果を発揮することが実証されている（非特許文献２）。また、重症急性呼吸器症候群（SARS）に対しても、その病原体として知られるSARS-CoVのcDNAを有する組換えワクシニアウイルスの作製に成功しており、優れた予防効果と再投与可能な製剤であることが確認されている（非特許文献３）。更に、H5N1 HPAIVに対して、H5N1 HPAIVのHAのcDNAを有する組換えワクシニアウイルスの作製にも成功しており、優れた予防効果を示す製剤であることが確認されている（非特許文献４）。
国際公開第2006/038742号
Muarakami S. et al., Cross-clade protective immunity of H5N1 influenza vaccines in a mouse model., Vaccine, vol. 26(50), p. 6398-6404, 2008. Tsukiyama K. et al., Development of heat-stable recombinant rinderpest vaccine. Arch. Virol., 1989, vol. 107, p. 225-235 Kitabatake M. et al., SARS-CoV spike protein-expressing recombinant vaccinia virus efficiently induces neutralizing antibodies in rabbits pre-immunized with vaccinia virus. Vaccine, 2007, vol. 25, p. 630-637 Yasui F. et al., Sensitization with vaccinia virus encoding H5N1 hemagglutinin restore immune potential against H5N1 influenza virus. Sci. Rep., 2016, vol. 6, p. 37915
　本発明が解決しようとする課題は、H5N1 HPAIVを含むインフルエンザウイルス感染による発症を阻止するのに有効な抗インフルエンザ薬を提供することにある。
　本発明者らは、これまでの新型インフルエンザウイルス感染に関する解析及び検討結果をもとに、さらに鋭意研究を行い、組換えワクシニアワクチンを用いて免疫の強力な活性化をもたらすことが、有力なインフルエンザウイルス感染予防法につながるものと考えた。そして、組換えワクシニアウイルス作製に用いるウイルス株として、ワクシニアウイルスDIs株を用いれば、単回接種により、クレードの異なる株による攻撃感染に対しても発症防御ができる等、上記課題を解決できることを見出した。一方で、その防御作用は、従来の不活化ワクチンにおいて考えられてきた中和抗体によるものと異なり、中和抗体価に依存しない機序によって防御効果が発揮されている等、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）ワクシニアウイルスDIs株のゲノム中に、発現プロモーターと、インフルエンザウイルス由来タンパク質をコードするDNAの全部若しくは一部とを含む組換えワクシニアウイルス、又は不活化したインフルエンザウイルスを含む、インフルエンザに対する予防又は治療用医薬。
（２）インフルエンザに対する予防又は治療が、活性化されたCD4陽性細胞及び／又は活性化されたCD8陽性細胞の作用によるものである（１）に記載の医薬。
（３）インフルエンザウイルス由来タンパク質に対する抗体をさらに含む、（１）又は（２）に記載の医薬。
（４）抗体が結合抗体である（３）に記載の医薬。
（５）インフルエンザウイルス由来タンパク質が、H5N1高病原性鳥インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質である（１）～（４）のいずれか１項に記載の医薬。
（６）以下の(a)～(c)のいずれかの成分を含む、インフルエンザに対する予防又は治療用医薬。
  (a) 活性化されたCD4陽性細胞、CD4陽性細胞の活性化剤、及びCD4陽性細胞とCD4陽性細胞の活性化剤との組み合わせからなる群から選ばれる少なくとも１つの成分
  (b) 活性化されたCD8陽性細胞、CD8陽性細胞の活性化剤、及びCD8陽性細胞とCD8陽性細胞の活性化剤との組み合わせからなる群から選ばれる少なくとも１つの成分
  (c) 上記(a)及び(b)の成分の組み合わせの成分
（７）ワクシニアウイルスDIs株のゲノム中に、発現プロモーターと、インフルエンザウイルス由来タンパク質をコードするDNAの全部若しくは一部とを含む組換えワクシニアウイルス、又は不活化したインフルエンザウイルスをさらに含む、（６）に記載の医薬。
（８）インフルエンザウイルス由来タンパク質に対する抗体をさらに含む、（６）又は（７）に記載の医薬。
（９）抗体が結合抗体である（８）に記載の医薬。
（１０）インフルエンザウイルス由来タンパク質が、H5N1高病原性鳥インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質である（７）～（９）のいずれか１項に記載の医薬。
（１１）ワクシニアウイルスDIs株のゲノム中に、発現プロモーターと、インフルエンザウイルス由来タンパク質をコードするDNAの全部若しくは一部とを含む組換えワクシニアウイルス、又は不活化したインフルエンザウイルスを含む、インフルエンザに対する予防又は治療用キット。
（１２）インフルエンザに対する予防又は治療が、活性化されたCD4陽性細胞及び／又は活性化されたCD8陽性細胞の作用によるものである（１１）に記載のキット。
（１３）インフルエンザウイルス由来タンパク質に対する抗体をさらに含む、（１１）又は（１２）に記載のキット。
（１４）抗体が結合抗体である（１３）に記載のキット。
（１５）インフルエンザウイルス由来タンパク質が、H5N1高病原性鳥インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質である（１１）～（１４）のいずれか１項に記載のキット。
（１６）以下の(a)～(c)のいずれかの成分を含む、インフルエンザに対する予防又は治療用キット。
  (a)活性化されたCD4陽性細胞、CD4陽性細胞の活性化剤、及びCD4陽性細胞とCD4陽性細胞の活性化剤との組み合わせからなる群から選ばれる少なくとも１つの成分
  (b) 活性化されたCD8陽性細胞、CD8陽性細胞の活性化剤、及びCD8陽性細胞とCD8陽性細胞の活性化剤との組み合わせからなる群から選ばれる少なくとも１つの成分
  (c) 上記(a)及び(b)の成分の組み合わせの成分
（１７）ワクシニアウイルスDIs株のゲノム中に、発現プロモーターと、インフルエンザウイルス由来タンパク質をコードするDNAの全部若しくは一部とを含む組換えワクシニアウイルス、又は不活化したインフルエンザウイルスをさらに含む、（１６）に記載のキット。
（１８）インフルエンザウイルス由来タンパク質に対する抗体をさらに含む、（１６）又は（１７）に記載のキット。
（１９）抗体が結合抗体である（１８）に記載のキット。
（２０）インフルエンザウイルス由来タンパク質が、H5N1高病原性鳥インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質である（１７）～（１９）のいずれか１項に記載のキット。
　本発明によれば、インフルエンザの予防又は治療に有効であり、かつ安全性の高い新規なインフルエンザ用予防薬又は治療薬（インフルエンザの予防又は治療用ワクチン）を提供することができる。
新型インフルエンザウイルス（H5N1 HPAIV）のHAタンパク質遺伝子を有する組換えワクシニアウイルス（RVV）（具体的にはrDIs/mCl1、rDIs/mCl2.1、rDIs/mCl2.2及びrDIs/mCl2.3）の作製のための、プラスミドベクターの遺伝子構造を示す図である。図中、「Influenza HA」は、各インフルエンザウイルスのHAタンパク質遺伝子（cDNA）を表し、また、「H5亜型」はH5N1 HPAIVを表す（他の図においても同様）。 BALB/cマウスへのH5N1 HPAIVの攻撃感染に対する、H5N1 HPAIV由来HAタンパク質遺伝子を有するDIs株由来RVV（H5N1 HPAIV用ワクチン：rDIs/mCl2.2）の単回接種による感染防御効果の検討結果を示す図である。 H5N1 HPAIV用ワクチン（rDIs/mCl2.2）を単回接種したBALB/cマウスにおける、H5N1 HPAIVの攻撃感染から９日後までの肺組織中ウイルス量を示す図である。 H5N1 HPAIV用ワクチン（rDIs/mCl2.2）を単回接種したBALB/cマウスにおける、H5N1 HPAIVの攻撃感染から６日後までの中和価を示す図である。 HAタンパク質に対する結合抗体が投与されたBALB/cマウスにおける、ウイルス感染１日後及び6日後のウイルス量を示す図である。 野生型マウスまたはFcレセプターgamma欠損マウスにH5N1 HPAIV用ワクチン（rDIs/mCl2.2）接種し、H5N1 HPAIVの攻撃感染から9日後までの体重変化と、ウイルス感染１日後及び３日後までの肺組織中ウイルス量を示す図である。 H5N1 HPAIV用ワクチン（rDIs/mCl2.2）を単回接種したBALB/cマウスでのCD4陽性細胞の枯渇によるH5N1 HPAIVの攻撃感染から６日後までの肺組織中ウイルス量への影響を示す図である。 ワクチン接種群でのCD8陽性細胞枯渇、又はCD4陽性及びCD8陽性両細胞枯渇による肺組織中ウイルス量に対する影響を示す図である。 ワクチン接種群でのCD4陽性及びCD8陽性両細胞枯渇による体重及び生存率への影響を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
  本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。なお、本明細書において引用した特許文献、非特許文献その他の刊行物は、参照として本明細書に組み込まれるものとする。
１．本発明の概要
　現行のH5N1 HPAIVに対するプレパンデミックワクチンは、リバースジェネティクス技術を用いて、マルチベーシック部位を欠損させた H5N1 HAを持つインフルエンザウイルスを作出し、ホルマリンにより不活化させた全粒子ワクチンである。効果的な免疫応答を誘導する為には、3週間間隔で2回の接種が必要である事や接種ワクチンとは異なるクレードのウイルス株に対して、予防効果が顕著に減弱する。
　一方で、生ワクチンとして組換えワクシニアウイルス（RVV）を作製するという遺伝子工学的手法が知られている。RVVの作製に用いる組換え母体となるワクシニアウイルスとしては、安全性の確立されているワクチン株である必要があるが、そのようなワクチン株として、ワクシニアウイルスDIs株やLC16m8株がある。ワクシニアウイルスDIs株は、ワクシニアウイルス大連株（DEI株）を鶏卵胚にて継代培養することによって分離された高度に弱毒化したワクシニアウイルス株であり（Tagaya I, et al., A new mutant of dermovaccinia virus. Nature, 1961, vol. 192, p. 1187-1188）、ニワトリ胎児繊維芽細胞（CEF）では増殖できるが、他の哺乳動物細胞内では非増殖性であり、安全性が高い。一方、ワクシニアウイルスLC16m8株は、天然痘ワクチンとして1975年に当時の厚生省に認可され、5万人以上に乳幼児に接種された実績を持つ安全かつ効果的な弱毒ワクチン株である。LC16m8株の弱毒性は、細胞への吸着・感染に関与すると考えられているLC16mO株のB5Rタンパク質遺伝子が一塩基欠損していることにより、全長のB5Rタンパク質が発現しないことに由来する（Morikawa S., et al. An attenuated LC16m8 smallpox vaccine: analysis of full-genome sequence and induction of immune protection. J. Virol., 2005, vol. 79(18), p. 11873-1189）。
  そのため、免疫不全又は免疫抑制者へ接種させた場合にも安全性が担保される可能性が高く、また接種痕もできないなどの長所を有する組換えインフルエンザ生ワクチンの開発が可能となる。本発明者は、このDIs株を母体として用いた組換え新型インフルエンザワクチンを樹立し、H5N1 HPAIV感染に対して、単回接種で有効性を示した。このように、インフルエンザウイルスHAタンパク質遺伝子を発現するDIs株由来RVVは、H5N1 HPAIV用ワクチン（rDIs/mCl2.2）として、1x107 PFU量のRVVを単回接種することで、致死性のH5N1 HAPIV攻撃感染に対しても速やかな体重回復と100%の生存率を示す。従って、DIs株由来RVVは、H5N1 HPAIV用ワクチンとしても十分な効果を有するものである。
  他方、H5N1 HPAIV用ワクチン（rDIs/mCl2.2）接種個体では、H5N1 HPAIVに対する中和抗体が誘導されずとも良好な予防効果を発揮する事が判明した（図3、図4）。
  そこで本発明においては、中和抗体に依存しない防御効果の解明を目指した。
　この結果、H5N1高病原性鳥インフルエンザウイルス（H5N1 HPAIV）のヘマグルチニン（HA）タンパク質をコードする遺伝子を、発現プロモーターとともにワクシニアウイルスDIs株に組み込んだH5N1 HPAIV用ワクチン（rDIs/mCl2.2）を接種した個体では、感染後日数経過とともに様々な細胞群や因子が感染防御に関わる事を解明した。詳しくは、H5N1 HPAIV用ワクチン（rDIs/mCl2.2）を接種した個体では、通常、H5N1 HPAIV感染6日後までには、ウイルスが検出限界以下にまで排除される。このワクチン接種個体において、ワクチン接種後に産生される結合抗体はH5N1 HPAIV感染1日後までの感染防御には、結合抗体とFc gammaレセプターを有する細胞群がウイルス感染防御に寄与しており、FcRgを介したADCCを行っている可能性が高い。しかし、抗体のウイルス排除寄与率は高くなく、H5N1 HPAIV用ワクチン（rDIs/mCl2.2）を接種した個体（図3）で見られるようなウイルス排除には至らないことが示された（図５、6）。
  一方で、H5N1 HPAIV用ワクチン（rDIs/mCl2.2）接種個体の感染1日後から3日後までのウイルス感染防御には、CD4陽性細胞が必須であることが、CD4陽性細胞の枯渇実験の結果から明らかとなった（図7）。
  更に、感染3日後から6日までのウイルス排除には、CD8陽性細胞が重要な役割を果たす事が判明した（図８）。更に、CD4陽性細胞及びCD8陽性細胞の両方を枯渇する事で、ワクチン接種個体においても、感染10日後にも関わらずウイルスを排除できず、著しく体重が減少し、死亡し始めた（図９）。
  これらの結果は、HPAIV用ワクチン（rDIs/mCl2.2）は、従来の全粒子不活化ワクチン接種による予防作用として重要であると考えられていた抗原特異的抗体（特に中和抗体）とは異なり、CD4陽性細胞及び/又はCD8陽性細胞を介した強力な抗インフルエンザウイルス作用機序によって、H5N1 HPAIV感染に対する防御効果を発揮している事が判明した。
  以上の結果より、ワクシニアウイルスDIs株のゲノム中に、発現プロモーターと、インフルエンザウイルス由来タンパク質をコードするDNAの全部若しくは一部とを含む組換えワクシニアウイルス、又は不活化したインフルエンザウイルスは、インフルエンザに対する予防又は治療用医薬、あるいはインフルエンザに対する予防又は治療用ワクチンとして使用することができる。本発明において、インフルエンザに対する予防又は治療効果は、活性化されたCD4陽性細胞、活性化されたCD8陽性細胞、又はこれらの細胞の組み合わせが作用することにより発揮される。
　また、インフルエンザウイルスHAタンパク質に対して活性化されたCD4陽性細胞及び/又は活性化されたCD8陽性細胞は、急激な流行を示すインフルエンザウイルスに対して、安全かつ有効な予防薬又は治療薬となることが分かった。
２．CD4/CD8陽性細胞の活性化剤及び活性化されたCD4/CD8陽性細胞
  本発明の一つの態様では、活性化されたCD4陽性細胞、CD4陽性細胞の活性化剤、又はCD4陽性細胞の活性化剤とCD4陽性細胞との組み合わせをインフルエンザの予防又は治療用医薬（予防又は治療用医薬組成物）として使用する。
  また本発明の一つの態様では、活性化されたCD8陽性細胞、CD8陽性細胞の活性化剤、又はCD8陽性細胞とCD8陽性細胞の活性化剤との組み合わせを、インフルエンザに対する予防薬又は治療用医薬（予防又は治療用医薬組成物）として使用する。
  以下、CD4陽性細胞若しくはCD8陽性細胞、又はCD4陽性細胞及びCD8陽性細胞の両者を、「CD4/CD8陽性細胞」ともいう。
  さらに、本発明の一つの態様では、DIs株由来RVV・H5N1 HPAIV（rDIs/mCl2.2）等や、不活化したインフルエンザウイルスを不活化ワクチンとして上記活性化されたCD4/CD8陽性細胞、CD4/CD8陽性細胞の活性化剤又はCD4/CD8陽性細胞とCD4/CD8陽性細胞の活性化剤との組み合わせとともに使用することができる。
  CD4陽性細胞は、ヘルパーT細胞（Th1、Th2又はTh17に分類される）及び制御性T細胞である。CD4陽性細胞が持つT細胞受容体（TCR）はマクロファージやB細胞が持つクラスIIのMHC分子と結合する。ヘルパーT細胞はマクロファージなどからMHCクラスII分子を通じて、抗原提示を受け、B細胞や細胞傷害性T細胞を活性化する。他方、制御性T細胞は、免疫応答の終結に関与する。
  CD8細胞は、MHCクラスI分子に提示された抗原に反応性を示すT細胞であり、当該抗原を識別してウイルス感染細胞を破壊する細胞傷害性T細胞として作用する。また、インターフェロンガンマ(IFN-g)の産生を介して、ウイルス感染細胞に作用し、細胞内抗原の分解を非細胞傷害的に促進する。
  不活化したインフルエンザウイルスとは、ワクチン製造用のインフルエンザウイルスを発育鶏卵に接種して増殖させ、漿尿液から精製・濃縮したウイルスをエーテルで部分分解し、更にホルマリンで不活化したものを意味する。但し本発明においては、ウイルス粒子そのものを不活化したものも使用することができる。
  CD4/CD8陽性細胞は、被検者の血液、骨髄などから採取し、セルソーター等により取得する。あるいは、iPSなどの幹細胞から誘導することもできる。
  採取された細胞がCD4/CD8陽性細胞であることの確認は、フローサイトメトリー法により行うことができる。
  CD4陽性細胞の活性化剤としては、インターロイキン(IL)-2、IL-4、CD86、OX40リガンド、抗原であるHAタンパク質やその一部などが挙げられる。CD4陽性細胞を上記活性化剤とともに培養することにより活性化させる。
  CD8陽性細胞の活性化剤としては、IL-2、IL-12、IFN-g、CD86、CD137 リガンド、OX40リガンド、抗原であるHAタンパク質やその一部などが挙げられる。CD8陽性細胞を上記活性化剤とともに培養することにより活性化させる。
  CD4/CD8陽性細胞が活性化されたことの確認は、フローサイトメトリー法やELISpot法によるサイトカイン産生や活性マーカーの発現上昇を確認することにより行うことができる。
  他方、本発明において、CD4/CD8陽性細胞活性化剤を被検者（健常者又は患者）に投与すると、投与された被検者の体内において、被検者由来のCD4/CD8陽性細胞が活性化される。体内におけるCD4/CD8陽性細胞の活性化の仕組みは、IL-2、IL-4、CD86、OX40リガンド、抗原であるHAタンパク質やその一部などのCD4陽性細胞活性化剤が投与されると、CD40L 、CD44及びCD69などの表面分子発現が亢進し、その結果、CD4陽性細胞が活性化される。また、IL-2、IL-12、IFN-g、CD86、CD137 リガンド、OX40リガンド、抗原であるHAタンパク質やその一部などのCD8陽性細胞活性化剤が投与されると、CD44やCD69などの表面分子発現が亢進し、その結果、CD8陽性細胞が活性化される。
  また、CD4/CD8陽性細胞とCD4/CD8陽性細胞の活性化剤との組み合わせを用いると、当該組み合わせを被検者に投与することにより、投与に使用したCD4/CD8陽性細胞が活性化されるとともに、投与された被検者の体内において、被検者由来の内在するCD4/CD8陽性細胞が活性化される。これらのCD4/CD8陽性細胞が活性化されたことの確認は、フローサイトメトリー法やELISpot法によるサイトカイン産生や活性マーカーの発現上昇を確認することにより行うことができる。
３．インフルエンザウイルス由来タンパク質に対する抗体
　本発明における別の態様として、インフルエンザウイルス由来タンパク質に対する抗体を、本発明の組換えワクシニアウイルス、又は不活化したインフルエンザウイルスとともに、インフルエンザの予防又は治療用医薬として使用する。
  また本発明における別の態様として、インフルエンザウイルス由来タンパク質に対する抗体は、CD4/CD8陽性細胞の活性化剤及び/又は活性化されたCD4/CD8陽性細胞とともに、インフルエンザの予防又は治療用医薬として使用する。
  本発明において使用されるインフルエンザウイルス由来タンパク質としては、例えばH1N1、H3N2、B型インフルエンザウイルスが挙げられ、特に限定されるものではない。本発明においては、主にH5N1 HPAIV由来ヘマグルチニン(HA)タンパク質を用いることができる。
  また、上記インフルエンザウイルス由来タンパク質に対する抗体又はその抗原結合断片を、インフルエンザの予防又は治療用医薬として使用する。
  抗体は、インフルエンザウイルス由来タンパク質に対する結合抗体、及びインフルエンザウイルス由来タンパク質に対する中和抗体のいずれであってもよい。また、これらの抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよく、これらの断片であってもよい。抗原としてH5N1 HPAIV由来HAタンパク質を用いると、当該タンパク質に対する抗体（「抗HA抗体」という）は、生体内の環境で有するHAタンパク質（インタクトな立体構造の状態にあるHAタンパク質）を認識することができる。
  「結合抗体」とは、インフルエンザウイルス由来タンパク質（例えばH5N1ウイルスのHAタンパク質）を抗原とする抗体であり、機能として、オプソニン作用又はオプソニン作用に類似する作用を有する。結合抗体は、抗原に結合する機能を有するが、インフルエンザウイルス（例えばH5N1 HPAIV）に対する中和活性を有さない抗体である。
  「中和抗体」とは、インフルエンザウイルス由来タンパク質（例えばH5N1ウイルスのHAタンパク質）を抗原とする抗体であり、後述のDIsワクチン接種後の個体から産生される抗体である。中和抗体の中和活性とは、ウイルスが標的細胞への接着及び/又は感染を阻害する機能を意味する。すなわち、中和抗体の機能は、インフルエンザウイルス由来タンパク質のどの部分に結合するかは問わず、当該タンパク質に結合することにより、ウイルスのタンパク質が標的細胞表面にある受容体に接着し感染することを阻害する機能を意味する。
　本発明の抗体は、後述の表１に記載のアクセッション番号に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドへの結合活性を有するが、それ以外にも、これらのアミノ酸配列の1個又は数個（例えば2、3、4又は5個）のアミノ酸の置換、欠失又は挿入が行われている変異型ポリペプチド、当該配列番号に示すアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、９５％以上、９８％以上、あるいは９９％以上の同一性を有する変異型ポリペプチドを認識するものであってもよい。
  また、本発明の別の態様において、本発明の抗体は、表１に記載のアクセッション番号に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドでコードされるポリペプチド、あるいは当該塩基配列と80％以上、90%以上、95％以上、98％以上、又は99％以上の同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる変異型ポリペプチドを認識するものが含まれる。
  さらに、本発明の別の態様において、本発明の抗体は、表１に記載のアクセッション番号に示す塩基配列と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる変異型ポリペプチドを認識するものであってもよい。
  ＜中和抗体＞
  本発明の中和抗体は、上記の通り、DIsワクチン接種後の個体から産生される抗体である。
  DIsワクチンをそれ自体で、あるいは担体、希釈剤と共に非ヒト哺乳動物、例えばウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヤギ、ウマ、ヒツジ等に投与することにより免疫する。免疫方法は周知である。
  血清中の抗体の中和価の測定は、マイクロ中和抗体測定法等によって行うことができる。中和価が十分上昇したことを確認した後、全採血し、通常行われる方法により抗体を分離精製する。分離精製は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより、精製することができる。
＜結合抗体＞
  本発明の結合抗体は、インフルエンザウイルス由来タンパク質（例えばH5N1ウイルスのHAタンパク質）に対する抗体であるから、当該タンパク質又はその部分ペプチドを抗原として用いて、通常のポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を作製する方法と同様にして作製することができる。
４．抗体の作製
（１）ポリクローナル抗体の作製
　インフルエンザウイルス由来タンパク質又は部分ペプチドをそれ自体で、あるいは担体、希釈剤と共に非ヒト哺乳動物、例えばウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヤギ等に投与することにより免疫する。抗原の動物１匹当たりの投与量、アジュバントを用いるときの投与量、アジュバンドの種類、免疫部位、免疫の間隔等は周知である。
  血清中の抗体価の測定も周知であり、ELISA、EIA、RIA等によって行うことができる。抗体価が十分上昇したことを確認した後、全採血し、通常行われる方法により抗体を分離精製することができる。分離精製は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより、精製することができる。
（２）モノクローナル抗体の作製
  モノクローナル抗体の作製法も周知である。例えば、抗体産生細胞の採取、ハイブリドーマを得るための抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合、ハイブリドーマの選別及びクローニング、モノクローナル抗体の採取などは、当業者に周知の方法により行うことができる。
　さらに、本発明において、抗体のエピトープ（抗原決定基）は、抗原であるインフルエンザウイルス由来タンパク質の少なくとも一部であればよく限定はされない。本発明の抗体には、当該抗体が結合する部位（例えばエピトープ）に結合する抗体、例えば、本発明のハイブリドーマが産生する抗体が結合する部位に結合する抗体が含まれる。
（３）遺伝子組換え抗体の作製
　本発明の抗体の好ましい態様の一つとして、遺伝子組換え抗体が挙げられる。遺伝子組換え抗体としては、限定はされないが、例えば、キメラ抗体、ヒト型化抗体及びヒト化抗体等が挙げられる。
　キメラ抗体（すなわちヒト型キメラ抗体）は、マウス由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に連結（接合）した抗体であり（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851-6855, (1984) 等を参照）、キメラを作製する場合は、そのように連結した抗体が得られるよう、遺伝子組換え技術によって容易に構築できる。
　ヒト型化抗体を作製する場合は、いわゆるCDRグラフティング（CDR移植）と呼ばれる手法を採用することができる。このようなヒト型化抗体の作製法は、当分野において周知である（Nature, 321, 522-525 (1986)；J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)；Queen C et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10033 (1989)；特許第2828340号公報等を参照）。
　ヒト抗体（完全ヒト抗体）は、一般に可変領域（V領域）の抗原結合部位である超可変領域（hyper variable region）、V領域のその他の部分及び定常領域の構造が、ヒトの抗体と同じ構造を有するものである。ヒト抗体を作製する技術も公知であり、ヒトに共通の遺伝子配列については遺伝子工学的手法によって作製する方法が確立されている。ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体の重鎖（H鎖）及び軽鎖（L鎖）の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Tomizuka, K.et al., Nature Genetics, (1977)16, 133-143; Kuroiwa, Y.et.al., Nuc. Acids Res., (1998)26, 3447-3448; Yoshida, H.et.al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects,(1999)10, 69-73 (Kitagawa, Y.,Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers; Tomizuka, K.et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2000)97, 722-727 等を参照）や、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法（Wormstone, I. M.et.al, Investigative Ophthalmology & Visual Science., (2002)43 (7), 2301-8; Carmen, S. et.al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics,(2002)1 (2), 189-203; Siriwardena, D. et.al., Opthalmology, (2002)109 (3), 427-431 等を参照）により取得することができる。
（４）抗体断片の作製
　本発明で使用されるインフルエンザウイルス由来タンパク質に対する抗体の断片としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、diabody（dibodies）、dsFv、scFv（single chain Fv）などが挙げられる。上記抗体断片は、本発明の抗体を目的に応じて各種タンパク質分解酵素で切断することにより得ることができる。
  例えば、Fabは、抗体分子をパパインで処理することにより、F(ab')2は、抗体分子をペプシンで処理することによりそれぞれ得る。Fab'は、上記F(ab')2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することで得る。scFvの場合は、抗体の重鎖可変領域（H鎖V領域）及び軽鎖可変領域（L鎖V領域）をコードするcDNAを取得し、scFvをコードするDNAを構築する。このDNAを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、scFvを製造する。
　diabodyの場合は、抗体のH鎖V領域及びL鎖V領域をコードするcDNAを取得し、ペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるようにscFvをコードするDNAを構築する。このDNAを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、diabodyを製造する。dsFvの場合は、抗体のH鎖V領域及びL鎖V領域をコードするcDNAを取得し、dsFvをコードするDNAを構築する。このDNAを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、dsFvを製造する。
５．H5N1 HPAIV用ワクチン（rDIs-H5 HA）又は不活化ワクチン
  H5N1 HPAIV用ワクチンの作製方法は公知であり（第5884100号特許）、当該公知方法に従って作製することができる。作製方法の概要を以下に示す。
　H5N1 HPAIVのHAタンパク質遺伝子は、すでに米国生物工学情報センター(NCBI; National Center for Biotechnology Information)により提供されるGenBankデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）において、所定のアクセッション番号(Accession No.)により登録されている。
  例えば、下記表１に示すように、GenBankアクセッション番号に、H5N1 HPAIVの各クレード由来のHAタンパク質をコードする遺伝子、あるいはH5N1 HPAIVの各クレードのHAタンパク質をコードするDNAの一部を欠損させた遺伝子が登録されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　これらHAタンパク質遺伝子（一部欠損・変異させた遺伝子も含む）は、すでにクローニングされ、プラスミドに挿入されている。従って、本発明の組換えワクシニアウイルスに含まれる遺伝子の全部（変異配列も含む）又はその一部は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。
  上記方法は、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual (4th edition)」（Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)）や「Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)」等に記載の部位特異的変位誘発法、あるいはKunkel法や Gapped duplex法等を利用した変異導入用キットを用いて調製することができる。
　本発明の組換えワクシニアウイルスに含まれる発現プロモーターは、ワクシニアウイルスDIs株の遺伝子欠損領域に挿入されるものであれば良く、限定はされず、例えば、ワクシニアウイルスプロモーターmH5等が挙げられる（Virology. vol. 351, p. 368-380）。また、当該発現プロモーターとしては、例えば、ポックスウイルスA型封入体（ATI）プロモーター及び複数反復するワクシニアウイルス7.5 kDaタンパク質（p7.5）前期発現プロモーターにより構成されるハイブリットプロモーターを用いることもできる。このプロモーターは、適当なプラスミドに連結することができ、例えばpUC/DIsが知られている（Arch. Virol. vol. 138, p. 315-330, 1994；特開平6-237773号公報 参照）。
　上記発現プロモーター及びHAタンパク質をコードするDNAを挿入して得られたプラスミドベクターを、宿主であるワクシニアウイルスに導入することで、組換えワクシニアウイルスを作製する。プラスミドベクターの宿主への導入は、公知の任意の手法を採用することができ、例えば弱毒ワクシニアウイルスDIs株を感染したニワトリ繊維芽細胞中に得られたプラスミドベクターを導入することにより、組換えワクシニアウイルス（rDIs/mCl1、rDIs/mCl2.1、rDIs/mCl2.2、及びrDIs/mCl2.3）を作製することができる。
  不活化ワクチンの製造法は公知である。前記の通り、ワクチン製造用のインフルエンザウイルスを発育鶏卵に接種して増殖させ、漿尿液から精製・濃縮したウイルスをエーテルで部分分解し、更にホルマリンで不活化する。
６．新型インフルエンザの予防用及び治療用医薬と感染防御の作用機序
  本発明は、(i)DIs株由来の上記組換えワクシニアウイルス若しくは不活化ウイルス、又は(ii)当該組換えワクシニアウイルス若しくは不活化ウイルスとインフルエンザウイルス由来タンパク質に対する抗体との組み合わせを含む、インフルエンザの予防又は治療用医薬を提供する。
  さらに、本発明は、以下の(a)～(d)からなる群から選ばれる少なくとも１つを含む、インフルエンザに対する予防又は治療用医薬組成物を提供する。
  (a) 活性化されたCD4/CD8陽性細胞
  (b) CD4/CD8陽性細胞の活性化剤
  (c) CD4陽性細胞とCD4陽性細胞の活性化剤との組み合わせ
  (d) CD8陽性細胞とCD8陽性細胞の活性化剤との組み合わせ
  また本発明の医薬は、上記(a)～(d)のいずれか又はこれらの組合せに加えて、(e)インフルエンザウイルス由来タンパク質に対する抗体、(f)DIs株由来の上記組換えワクシニアウイルス若しくは不活化ウイルス、又は(g)当該組換えワクシニアウイルス若しくは不活化ウイルスと抗体との組み合わせをさらに含めることができる。
  さらに本発明は、上記医薬又は上記医薬を患者（被検者）に投与することを含む、インフルエンザの予防及び治療方法、インフルエンザの予防及び治療のための上記医薬の使用、上記新型インフルエンザの予防薬及び治療薬を製造するための上記医薬の使用等も提供する。
　本発明の医薬組成物は、公知の方法、例えば、筋肉、腹腔内、皮内又は皮下等の注射、あるいは鼻腔、口腔又は肺からの吸入、経口投与により生体に導入することができる。
  さらに、本発明の医薬組成物に含まれる抗体、CD4/CD8陽性細胞、CD4/CD8陽性細胞の活性化剤、又はこれらの組合せは、上記組換えワクシニアウイルス又は不活化ウイルスと併用することも可能である。
  併用の態様は特に限定されるものではなく、本発明の医薬と本発明の組換えワクシニアウイルス又は不活化ウイルスとを同時に投与することもでき、また、一方を投与後、一定時間経過後に他方を投与する方法により生体に導入することもできる。
　本発明において、抗体、CD4/CD8陽性細胞、CD4/CD8陽性細胞の活性化剤、又はこれらの組合せを医薬組成物として使用する場合は、賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤等公知の薬学的に許容される担体、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等と混合することができる。
　本発明の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、シロップ剤等の経口投与剤、注射剤、外用剤、坐剤、点眼剤等の非経口投与剤などの形態に応じて、経口投与又は非経口投与することができる。好ましくは、皮内、筋肉、腹腔等への局部注射等が例示される。
　投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象、患者の年齢、体重、性別、症状その他の条件により適宜選択される。
  抗体：静脈内
  活性化されたCD4/CD8陽性細胞：静脈内
  CD4/CD8陽性細胞の活性化剤：経口、静脈内
  ウイルスの一日投与量としては、経口の場合は1000～1000000000 PFU（plaque forming units）程度、好ましくは100000～100000000 PFU程度であり、非経口の場合は100～1000000000 PFU程度、好ましくは1000～100000000 PFU程度である。ウイルスは、1日1回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。
　本発明の組換えワクシニアウイルス又は不活化ウイルスは、インフルエンザ予防用及び治療用ワクチンとして使用される。また、これまでに、H5N1 HPAIV に対するワクチンの開発では、H5N1 HPAIVに対する中和抗体価が重要であると考えられてきた。一方、本発明の組換えワクシニアウイルスは、中和抗体価を殆ど誘導しない状況下においても、効果的な防御効果を発揮する事ができ、H5N1 HPAIV感染後の時間的経過とともに作用する細胞群や因子が異なっていることが判明した。
　具体的には、H5N1 HPAIV用ワクチン（rDIs/mCl2.2）を接種した個体では、通常、H5N1 HPAIV感染6日後までには、ウイルスが検出限界以下にまで排除される。このワクチン接種個体において、H5N1 HPAIV感染1日後までの感染防御には、結合抗体とFc gammaレセプターを有する細胞群がウイルス感染防御に重要である。
  一方で、感染1日後から3日後までのウイルス感染防御には、CD4陽性細胞が必須であることが、CD4陽性細胞の枯渇実験の結果から明らかとなった。更に、感染3日後から6日までのウイルス感染防御にはCD8陽性細胞が必要であることが判明した。
　以上のとおり、本発明者らが作製した組換えワクシニアウイルス（総称して「Flu HA-RVVs」という）は、従来の全粒子不活化ワクチン接種による予防作用として、重要であると考えられていた抗原特異的抗体（特に中和抗体）とは、異なる作用機序によって、H5N1 HPAIV感染に対する防御効果を発揮し得るものである。
７．キット
  本発明のキットには、RVV(rDIs)若しくは不活化ウイルス、インフルエンザウイルス由来タンパク質に対する抗体、又はこれらの組合せを含めることができる。 
  また、本発明のキットには、 以下の(a)～(d)のいずれか、又はこれらの組合せが含まれる。
  (a) 活性化されたCD4/CD8陽性細胞
  (b) CD4/CD8陽性細胞の活性化剤
  (c) CD4陽性細胞とCD4陽性細胞の活性化剤との組み合わせ
  (d) CD8陽性細胞とCD8陽性細胞の活性化剤との組み合わせ
  さらに、本発明のキットには、上記(a)～(d)に加えて、(e)インフルエンザウイルス由来タンパク質に対する抗体、(f) RVV(rDIs)若しくは不活化ウイルス、又は(g)当該組換えワクシニアウイルス若しくは不活化ウイルスと抗体との組み合わせを又はこれらの組合せをさらに含めることができる。 
  本発明のキットは、H5N1高病原性鳥インフルエンザに対する予防用又は治療用に使用される。
　以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
＜方法＞
1) インフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質遺伝子を導入したDIs株由来組換えワクシニアウイルスの作製
　ワクシニアウイルスプロモーターmH5配列の下流に人工合成したH5N1 HPAIVの抗原であるヘマグルチニンタンパク質(HA)遺伝子を連結させ、相同組換え用プラスミドベクターへ挿入した(図1)。この際、H5N1亜型HA配列を挿入する場合には、制限酵素部位としてHind III部位を使用した。予めDIs株を感染させておいたCEFへ作製した相同組換え用プラスミドベクター（制限酵素により一箇所切断し、線状化した。）を遺伝子導入することによって、DIs株の遺伝子欠損部位の隣接領域にて相同組換えを起こさせてワクシニアウイルスのゲノム中にmH5プロモーター及びインフルエンザウイルスHAタンパク質遺伝子を挿入した組換えワクシニアウイルス（RVV）、具体的には、rDIs/mCl1、rDIs/mCl2.1、rDIs/mCl2.2、及びrDIs/mCl2.3の各種RVVを作出した。インフルエンザウイルス由来のHAタンパク質は、モルモット赤血球に対して凝集反応を示すが、ワクシニアウイルス由来のHAタンパク質はモルモット赤血球に対して凝集反応を起こさない。従って、上記組換えウイルスをCEFに感染させ、これにより形成するプラークへのモルモット赤血球の凝集反応を指標にして、RVVのスクリーニングを行った。目的の組換えウイルスは、赤血球凝集活性を持つレッドプラークを形成するものを選別した。
2) DIs株由来組換えワクシニアウイルス単回接種マウスにおけるH5N1 HPAIV感染に対する防御効果
組換えワクシニアウイルス（rDIs/mCl2.2）を1x107 PFUでマウスの背部皮内へ接種した。接種から４週間後にH5N1 HPAIVの攻撃感染を行い、連日体重測定を行い、生存率を求めた。更に、１、３、６、９日後に採血と肺組織サンプル採取を行い、肺組織中ウイルス量の測定を行った。
3) 中和抗体価測定　
採取した血清を用いて、マウスへの感染に使用したH5N1 HPAIVと同一のウイルス株を用いて、血清中に含まれる中和価を測定した。
4) H5N1 HPAIVに対する結合抗抗体を移入したマウスへのH5N1 HPAIV感染
　H5N1 HPAIVへの結合抗体を移入したマウスへH5N1 HPAIVを攻撃感染し、感染1日後と6日後に肺組織サンプルを採取して、肺組織中ウイルス価を測定した。
5) ワクチン単回接種FcR gamma 欠損マウス及び野生型マウスへのH5N1 HPAIV攻撃感染
組換えワクシニアウイルス（rDIs/mCl2.2）を1x107 PFUでFcR gamma欠損マウスと野生型マウスの背部皮内へ接種した。接種から４週間後にH5N1 HPAIVの攻撃感染を行い、連日体重測定を行い、生存率を求めた。更に、１、３日後に肺組織サンプル採取を行い、肺組織中ウイルス量の測定を行った。
6) DIs株由来組換えワクシニアウイルス単回接種による感染防護効果におけるCD4陽性細胞の役割
組換えワクシニアウイルス（rDIs/mCl2.2）を1x107 PFUでBALB/cマウスの背部皮内へ接種した。接種から４週間後にH5N1 HPAIVの攻撃感染を行った。攻撃感染に先立ち、感染2日前より、一日おきにCD4陽性細胞枯渇用抗体を静脈内投与した。連日体重測定を行い、生存率を求めた。更に、１、３、６日後に肺組織サンプル採取を行い、肺組織中ウイルス量の測定を行った。
7) DIs株由来組換えワクシニアウイルス単回接種による感染防護効果におけるCD8陽性細胞、又はCD4陽性細胞及びCD8陽性細胞の役割
組換えワクシニアウイルス（rDIs/mCl2.2）を1x107 PFUでBALB/cマウスの背部皮内へ接種した。接種から４週間後にH5N1 HPAIVの攻撃感染を行った。攻撃感染に先立ち、感染2日前より、一日おきにCD8陽性細胞枯渇用抗体、又はCD4陽性細胞及びCD8陽性細胞枯渇用両抗体を静脈内投与した。１、３、６日後に肺組織サンプル採取を行い、肺組織中ウイルス量の測定を行った。
8) DIs株由来組換えワクシニアウイルス単回接種による感染防護効果におけるCD4陽性及びCD8陽性両細胞枯渇による体重及び生存率への影響
組換えワクシニアウイルス（rDIs/mCl2.2）を1x107PFUでBALB/cマウスの背部皮内へ接種した。接種から４週間後にH5N1 HPAIVの攻撃感染を行った。攻撃感染に先立ち、感染2日前より、一日おきにCD4陽性細胞及びCD8陽性細胞枯渇用両抗体を静脈内投与した。連日体重測定を行い、生存率を求めた。
＜結果＞
　作製したRVV（rDIs/mCl2.2）単回接種マウスでは、H5N1 HPAIVによる攻撃感染後に一過性の体重減少を示したが、その後速やかに回復、100％の生存率を示した。一方、ワクチンを接種していないコントロール群では、急激な体重減少を示し、全匹死亡した（図2）。この時、コントロール群及びワクチン接種群の肺組織中ウイルス価を測定した結果、コントロール群では、感染9日後まで高いウイルス価を示したが、ワクチン接種群では、殆どの個体において、感染6日後までにウイルス価は、検出限界以下にまで低下していた（図3）。
　一方、肺組織中ウイルスが速やかに排除されたワクチン接種個体においても、コントロール群と同様に攻撃感染ウイルス株に対する中和抗体価は、検出されなかった（図4）。
　そこで、ワクチン接種個体における防御作用機序を詳細に解析する目的で、ワクチン接種個体から回収した抗血清中に含まれるIgGを精製し、ナイーブマウスへ静脈内投与した後、H5N1 HPAIVの攻撃感染を行った。その結果、感染1日後の肺組織中ウイルス価は、ワクチン接種個体へのH5N1 HPAIV感染時と同様に、ワクチン非接種個体に比べて、1/5から1/10にまで低下していた（図5）。次に、抗原特異的IgGと結合するFcRを有する細胞群がこの感染初期のウイルス価の低下に関与するか否かを検討する目的で、FcR gamma欠損マウスにワクチン接種を行った後、H5N1 HPAIVを攻撃感染した。
  感染1日後の肺組織中ウイルス価を野生型マウスと比較した結果、FcR gamma欠損マウスの肺組織中ウイルス価は野生型マウスに比べて高値を示した（図6）。抗原特異的IgGの移入実験とFcR gamma欠損マウスでの実験結果から、ワクチン接種個体における感染1日後の肺組織中ウイルス価の低下は、結合抗体とFcRを有する細胞群の効果であることが判明した。更に、ワクチン接種個体に対して、H5N1 HPAIVの攻撃感染の2日前から感染期間中は一日おきに抗CD4抗体を静脈内投与する事でCD4陽性細胞群を枯渇した。
  CD4陽性細胞枯渇群では、H5N1 HPAIV感染3日後の肺組織中ウイルス価が高い値を示した。この結果から、感染1日後から3日後にかけて、CD4陽性細胞がウイルス排除に重要な役割を果たしている事が判明した。また、CD4陽性細胞を個体した群では、感染6日後においても、感染ウイルスが検出されたが、ワクチン非接種個体に比べると低値であった事から、感染3日後から6日後のウイルス排除には、CD4陽性細胞群に加えて、他の細胞群または因子が必要である事が明らかとなった（図7）。
  そこで次に、ワクチン接種個体からCD8陽性細胞、又はCD4陽性細胞とCD8陽性細胞の両者を同時に枯渇させた。その結果、CD8細胞枯渇群、及びCD4/CD8細胞枯渇群の両群において、感染6日後において、ウイルスが排除できない事が判明した（図８）。更に、CD4/CD8細胞枯渇群ではワクチンを接種しているにも関わらず、体重が漸減し、死亡する個体も見られた（図９）。
＜考察＞
　インフルエンザウイルスHAタンパク質遺伝子を発現するDIs株由来RVVは、H5N1 HPAIV用ワクチン（rDIs/mCl2.2）としては、1x107 PFU量のRVVを単回接種することで、致死性のH5N1 HPAIV攻撃感染に対しても速やかな体重回復と100%の生存率を示した。よって、DIs株由来RVVは、H5N1 HPAIV用ワクチンとしても十分な効果を有するものである。通常、H5N1 HPAIV用ワクチン（rDIs/mCl2.2）接種個体では、H5N1 HPAIV感染6日後において、ウイルスは検出限界以下にまで排除される。このワクチン接種個体において、H5N1 HPAIV感染1日後までの感染防御には、結合抗体とFc gammaレセプターを有する細胞群がウイルス感染防御に重要である事が判明した。一方で、感染1日後から3日後までのウイルス感染防御には、CD4陽性細胞が必須であることが、CD4陽性細胞の枯渇実験の結果から明らかとなった。
  更に、感染3日後から6日までのウイルス感染防御にはCD4陽性細胞、CD8陽性細胞が主にウイルス排除に寄与している可能性が考えられた。CD4/CD8陽性細胞を枯渇した個体では、ワクチンを接種しているにも関わらず、死亡する個体が見られた。これらの結果は、従来の全粒子不活化ワクチン接種による予防作用として、重要であると考えられていた中和抗体とは異なる作用機序、すなわち、CD4陽性細胞及びCD8陽性細胞が多段階的に作用する事によって、H5N1 HPAIV感染に対する防御効果を発揮している事が判明した。
　以上の結果より、本発明のインフルエンザウイルスHAタンパク質遺伝子発現DIs株由来RVVは、急激な流行を示すインフルエンザウイルスに対して、安全かつ有効なワクチンとなることが分かった。更に、その防御機構としてCD4陽性細胞及びCD8陽性細胞が多段階的に作用していることも明らかとなった。
 

Claims (20)

  1.   ワクシニアウイルスDIs株のゲノム中に、発現プロモーターと、インフルエンザウイルス由来タンパク質をコードするDNAの全部若しくは一部とを含む組換えワクシニアウイルス、又は不活化したインフルエンザウイルスを含む、インフルエンザに対する予防又は治療用医薬。
  2.   インフルエンザに対する予防又は治療が、活性化されたCD4陽性細胞及び／又は活性化されたCD8陽性細胞の作用によるものである請求項１に記載の医薬。
  3.   インフルエンザウイルス由来タンパク質に対する抗体をさらに含む、請求項１又は２に記載の医薬。
  4.   抗体が結合抗体である請求項３に記載の医薬。
  5.   インフルエンザウイルス由来タンパク質が、H5N1高病原性鳥インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質である請求項１～４のいずれか１項に記載の医薬。
  6.   以下の(a)～(c)のいずれかの成分を含む、インフルエンザに対する予防又は治療用医薬。
      (a) 活性化されたCD4陽性細胞、CD4陽性細胞の活性化剤、及びCD4陽性細胞とCD4陽性細胞の活性化剤との組み合わせからなる群から選ばれる少なくとも１つの成分
      (b) 活性化されたCD8陽性細胞、CD8陽性細胞の活性化剤、及びCD8陽性細胞とCD8陽性細胞の活性化剤との組み合わせからなる群から選ばれる少なくとも１つの成分
      (c) 上記(a)及び(b)の成分の組み合わせの成分
  7.   ワクシニアウイルスDIs株のゲノム中に、発現プロモーターと、インフルエンザウイルス由来タンパク質をコードするDNAの全部若しくは一部とを含む組換えワクシニアウイルス、又は不活化したインフルエンザウイルスをさらに含む、請求項６に記載の医薬。
  8.   インフルエンザウイルス由来タンパク質に対する抗体をさらに含む、請求項６又は７に記載の医薬。
  9.   抗体が結合抗体である請求項８に記載の医薬。
  10.   インフルエンザウイルス由来タンパク質が、H5N1高病原性鳥インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質である請求項７～９のいずれか１項に記載の医薬。
     
  11.   ワクシニアウイルスDIs株のゲノム中に、発現プロモーターと、インフルエンザウイルス由来タンパク質をコードするDNAの全部若しくは一部とを含む組換えワクシニアウイルス、又は不活化したインフルエンザウイルスを含む、インフルエンザに対する予防又は治療用キット。
  12.   インフルエンザに対する予防又は治療が、活性化されたCD4陽性細胞及び／又は活性化されたCD8陽性細胞の作用によるものである請求項１１に記載のキット。
  13.   インフルエンザウイルス由来タンパク質に対する抗体をさらに含む、請求項１１又は１２に記載のキット。
  14.   抗体が結合抗体である請求項１３に記載のキット。
  15.   インフルエンザウイルス由来タンパク質が、H5N1高病原性鳥インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質である請求項１１～１４のいずれか１項に記載のキット。
  16.   以下の(a)～(c)のいずれかの成分を含む、インフルエンザに対する予防又は治療用キット。
      (a)活性化されたCD4陽性細胞、CD4陽性細胞の活性化剤、及びCD4陽性細胞とCD4陽性細胞の活性化剤との組み合わせからなる群から選ばれる少なくとも１つの成分
      (b) 活性化されたCD8陽性細胞、CD8陽性細胞の活性化剤、及びCD8陽性細胞とCD8陽性細胞の活性化剤との組み合わせからなる群から選ばれる少なくとも１つの成分
      (c) 上記(a)及び(b)の成分の組み合わせの成分
  17.   ワクシニアウイルスDIs株のゲノム中に、発現プロモーターと、インフルエンザウイルス由来タンパク質をコードするDNAの全部若しくは一部とを含む組換えワクシニアウイルス、又は不活化したインフルエンザウイルスをさらに含む、請求項１６に記載のキット。
  18.   インフルエンザウイルス由来タンパク質に対する抗体をさらに含む、請求項１６又は１７に記載のキット。
  19.   抗体が結合抗体である請求項１８に記載のキット。
  20.   インフルエンザウイルス由来タンパク質が、H5N1高病原性鳥インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質である請求項１７～１９のいずれか１項に記載のキット。
     
     
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