[go: up one dir, main page]

WO2019049843A1 - 産生物の製造方法 - Google Patents

産生物の製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2019049843A1
WO2019049843A1 PCT/JP2018/032678 JP2018032678W WO2019049843A1 WO 2019049843 A1 WO2019049843 A1 WO 2019049843A1 JP 2018032678 W JP2018032678 W JP 2018032678W WO 2019049843 A1 WO2019049843 A1 WO 2019049843A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
cell
culture vessel
diameter
pump
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2018/032678
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
真一 中居
高橋　直人
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fujifilm Corp
Original Assignee
Fujifilm Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fujifilm Corp filed Critical Fujifilm Corp
Priority to EP18853414.3A priority Critical patent/EP3663390A4/en
Priority to CN201880056019.4A priority patent/CN111051496B/zh
Priority to JP2019540952A priority patent/JP6929947B2/ja
Publication of WO2019049843A1 publication Critical patent/WO2019049843A1/ja
Priority to US16/807,740 priority patent/US11685888B2/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
    • B01D61/14—Ultrafiltration; Microfiltration
    • B01D61/147—Microfiltration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/04—Mechanical means, e.g. sonic waves, stretching forces, pressure or shear stimuli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/34—Internal compartments or partitions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/10—Perfusion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C12M33/14—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus with filters, sieves or membranes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/48—Automatic or computerized control
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/10—Separation or concentration of fermentation products
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2311/00—Details relating to membrane separation process operations and control
    • B01D2311/25—Recirculation, recycling or bypass, e.g. recirculation of concentrate into the feed
    • B01D2311/252—Recirculation of concentrate
    • B01D2311/2523—Recirculation of concentrate to feed side
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2527/00—Culture process characterised by the use of mechanical forces, e.g. strain, vibration

Definitions

  • the disclosed technology relates to methods of producing products produced from cells.
  • the medium containing antibodies is continuously withdrawn from the culture vessel, while fresh medium is continuously supplied to the culture vessel Perfusion cultures are known.
  • JP-A-2014-507959 describes that insufficient cell growth is observed in association with the increase in average cell diameter.
  • Perfusion culture makes it possible to culture cells at a high concentration, and the productivity of products such as antibodies produced from the cells is improved.
  • concentration of cells in the culture vessel is increased, there is a problem that the viability of the cells is reduced or the quality of the product produced from the cells is reduced.
  • One embodiment of the present invention enhances product quality while maintaining product productivity by high concentration culture of cells.
  • the method for producing a product according to the disclosed technology is a method for producing a product produced by cells housed in a culture vessel, wherein the concentration of cells in the culture vessel is 3 ⁇ 10 7 cells / ml or more and 3 ⁇ and 10 8 cells / ml or less, the average diameter of the cell itself in the culture vessel when the a, in the culture vessel, the diameter of the cell itself is more than 5% of the number ratio of 1.4 ⁇ a or more cells
  • the number ratio of cells having a diameter of a single cell within the range of A ⁇ A / 7 is set to 50% or more.
  • cells having a diameter of 1.4 ⁇ A or more may be selectively reduced. It is preferable to set the standard deviation of the diameters of single cells in the culture vessel to A / 4 or less.
  • a method for producing a product according to the disclosed technology comprises: using a pump to remove a cell suspension extracted from a culture vessel, a cell concentrate containing cells and a liquid having a cell concentration lower than that of the cell suspension;
  • the method may include the steps of performing separation processing to separate into, separating the cell concentrate into the culture vessel, and supplying fresh medium into the culture vessel.
  • the above-mentioned pump may be a magnetically levitated pump that rotates a rotating vane suspended in a cell suspension by magnetic force, and an external force due to a liquid flow generated by the pump is applied to the cell to make the cell unity. Cells with a diameter of 1.4 ⁇ A or more may be selectively reduced.
  • the diameter of the rotary blade of the pump is D
  • the distance between the tip of the rotary blade and the inner wall surrounding the rotary blade is L
  • the rotational speed per second of the rotary blade is R
  • the pi is ⁇
  • cell suspension Assuming that the viscosity of the solution is X Pascal second, and the delivery pressure of the pump is P Pascal
  • Y ⁇ D ⁇ ⁇ ⁇ R / L, 2000 ⁇ 10000Y + P ⁇ 80000 and 3 ⁇ log 10 (P / Y) ⁇ 5 It is preferable to satisfy .6.
  • Y corresponds to the shear stress exerted on the cell suspension by the rotation of the pump's rotary vanes.
  • the separation process can separate cells and products by known methods.
  • the separation treatment may be a membrane separation treatment using a hollow fiber membrane, and the hollow fiber membrane may be a microfiltration membrane.
  • the membrane separation process may be tangential flow filtration.
  • the method for producing a product according to the disclosed technology can include a recovery step of recovering the liquid that has permeated the hollow fiber membrane.
  • the method may further include the step of purifying the liquid recovered in the recovery step.
  • the cells contained in the culture vessel may be CHO cells, and the product produced from the cells may be an antibody.
  • the cell used as a cell producing a product is not particularly limited, and animal cells, plant cells, eukaryotic cells such as yeast, There may be mentioned prokaryotic cells such as Bacillus subtilis and E. coli. Animal cells such as CHO cells, BHK-21 cells and SP2 / 0-Ag14 cells are preferred, and CHO cells are more preferred.
  • the product produced by the cell in the present disclosure is not particularly limited as long as the above-mentioned cell produces a substance in a culture solution, and, for example, substances such as alcohol, enzymes, antibiotics, recombinant proteins, antibodies and the like Can be mentioned.
  • a product preferably, a recombinant protein, an antibody, more preferably an antibody.
  • the antibody to be produced in animal cells is not particularly limited.
  • the antibodies include not only monoclonal antibodies derived from animals such as human, mouse, rat, hamster, rabbit and monkey but also artificially modified antibodies such as chimeric antibodies, humanized antibodies and bispecific antibodies.
  • the resulting antibody or fragment thereof can be purified to near homogeneity.
  • the separation and purification of the antibody or fragment thereof may be carried out using the separation and purification methods used in conventional polypeptides.
  • separation and purification of antibodies can be achieved by appropriately selecting and combining chromatography columns such as affinity chromatography, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, SDS polyacrylamide gel electrophoresis and isoelectric focusing electrophoresis etc. But not limited thereto.
  • the concentration of the obtained antibody can be measured by measurement of absorbance, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or the like.
  • cells are housed in a culture vessel together with a culture medium and cultured by a perfusion culture mode. That is, in the method for producing an antibody according to the present embodiment, the cell suspension continuously withdrawn from the culture vessel using a pump is a cell concentrate in which cells are concentrated, and a cell lower than the cell suspension.
  • a step of performing separation treatment to separate into a liquid having a concentration a step of returning the cell concentrate obtained by the separation treatment to the culture vessel, a step of supplying fresh medium into the culture vessel, and separation in the separation treatment And collecting the liquid having a cell concentration lower than that of the cell suspension, and purifying the antibody contained in the collected liquid.
  • the present inventors maintain the concentration of cells in the culture vessel within a predetermined range in the perfusion culture including the above-described respective steps, and the number of excessively grown cells in the culture vessel (hereinafter referred to as overgrowth cells). It has been found that by setting the ratio to a predetermined value or less, the quality of the antibody can be improved while maintaining high viability in cultured cells and maintaining the productivity of the antibody by high concentration culture.
  • Over-growing cells are senescent cells, which have a lower ability to produce antibodies and are more likely to produce lower quality antibodies compared to normal cells. Therefore, the quality of the antibody can be enhanced while maintaining high antibody production capacity by perfusion culture by selectively removing the overgrowth cells and setting the number ratio of the overgrowth cells to a predetermined value or less.
  • the concentration of cells contained in the culture vessel increases, cell division is inhibited, overgrowth cells are more likely to be generated, and the viability of the cells is reduced.
  • the concentration of cells contained in the culture vessel is lowered, the productivity of the antibody is lowered. Therefore, it is preferable to control the concentration of cells contained in the culture vessel within a range in which antibody productivity can be secured while suppressing the increase of overgrown cells and the decrease of cell viability during the culture period.
  • the concentration of cells in the culture vessel it is preferred to maintain the range of 3 ⁇ 10 7 cells / ml or more 3 ⁇ 10 8 cells / ml, 4 ⁇ 10 7 cells / ml or more and 2 ⁇ 10 8 cells / ml or less are more preferable, 5 ⁇ 10 7 cells / ml or more and 1.5 ⁇ 10 8 cells / ml or less are further preferable, and 6 ⁇ 10 7 cells / ml or more and 1.2 ⁇ The most preferable is 10 8 cells / ml or less.
  • the concentration of cells in the culture vessel can be adjusted by, for example, a cell bleed process of extracting a part of cells in the culture vessel 10 at an appropriate timing during the culture period.
  • the concentration of cells can be obtained using a known method, for example, an autoanalyzer, or can be obtained using a light microscope.
  • the number ratio of the overgrown cells having a diameter of 1.4 ⁇ A or more in the culture vessel is preferably 5% or less, more preferably 4% or less, still more preferably 3% or less, and 0. It is most preferable that the content is at least 01% and at most 2.5%.
  • the diameter of a single cell and the number ratio of overgrown cells can be obtained, for example, using an autoanalyzer, or can be obtained by processing an image obtained using an optical microscope.
  • the standard deviation ⁇ of the diameter of the single cell in the culture vessel is preferably A / 4 or less, and more preferably A / 100 or more and A / 5 or less.
  • the standard deviation ⁇ of the diameter of single cells in the culture vessel is A / 4 or less means that elimination of overgrowth cells is appropriately performed, thereby enhancing the antibody production capacity. The quality of the antibody can be enhanced.
  • the number ratio of cells having a diameter of a single cell within the range of A ⁇ A / 7 is preferably 50% or more, more preferably 55% or more, and 60% or more. % Or less is more preferable.
  • the ratio of the number of cells with a single cell diameter in the range of A ⁇ A / 7 is 5 Being 0% or more means that a large amount of normal cells is contained in the culture vessel and the cells have high homogeneity, whereby the quality of the antibody can be stabilized.
  • the viability of the cells in the culture vessel at least at any time during the culture period is preferably 90% or more, more preferably 92% or more, still more preferably 95% or more, and most preferably 97% or more. preferable.
  • the cell viability is the proportion of the number of surviving cells out of all cells in the culture vessel at a certain point in time. By setting the cell survival rate to 90% or more, the antibody production capacity can be enhanced.
  • Cell viability can be obtained using a known method, for example, an autoanalyzer, or can be obtained using a light microscope.
  • the separation treatment performed in the above separation step may be a membrane separation treatment using a hollow fiber membrane.
  • a microfiltration membrane MF membrane
  • the type of membrane separation processing may be tangential flow type.
  • the tangential flow method is a method in which a component having a small size is sent to the permeation side while flowing a liquid to be subjected to membrane separation processing along the membrane surface of the filtration membrane.
  • a sonication method as a separation processing method other than membrane separation.
  • the separation treatment of the cell suspension using the sonoaggregation method the cell suspension is separated into cells and a supernatant by irradiating the cell suspension with a sound wave to aggregate and precipitate the cells.
  • Overgrowing cells are more fragile than normal cells. Therefore, the overgrowth cells can be selectively destroyed and reduced by applying an external force of appropriate size to the cells.
  • a pump installed in a cell culture apparatus can be used, or ultrasonic waves can be applied.
  • the pump for applying an external force to the cells may be, for example, a pump for transferring the cell suspension from the culture vessel to the separation processing unit.
  • a magnetic levitation type pump can be suitably used as a pump for applying an external force to cells.
  • these external forces can also break up cell aggregates into single cells or destroy and reduce dead cells. This also provides certain improvement effects of cell proliferation and viability and antibody quality.
  • FIG. 1 is a view showing an example of the configuration of a magnetic levitation type pump 200 applicable to the practice of the method for producing an antibody according to the present embodiment.
  • the pump 200 is provided at the bottom of the rotary vane 220 and a case 210 having a suction port 211 for sucking in the cell suspension and a discharge port 212 for discharging the cell suspension, the rotary vane 220 housed in the case 210.
  • a stator 230 for rotating the rotor magnet 221, and a coil 240 wound around the stator 230.
  • the stator 230 rotates, the cell suspension is sucked from the suction port 211 and discharged from the discharge port 212. Since the pump 200 does not have a rotating shaft for driving the rotary vanes 220 to rotate, it is possible to reduce the work load when performing the cleaning process and the sterilization process.
  • the diameter of the rotary blade 220 is D meter (see FIG. 1)
  • the distance between the tip of the rotary blade 220 and the inner wall of the case 210 surrounding the rotary blade 220 is L meter (see FIG. 1)
  • the circle ratio is ⁇
  • the viscosity of the cell suspension is X Pascal second
  • the shear stress Y acting on the cell suspension by the rotation of the rotating blade 220 is given by Can be approximated by the equation.
  • rotation speed means the rotation speed set in the apparatus of a rotary blade. The viscosity can be measured based on the method of measuring the viscosity of a liquid according to JIS Z 8803.
  • Y X ⁇ D ⁇ ⁇ ⁇ R / L (1)
  • the shear stress Y is weighted 10000 times because the effect of the shear stress Y is greater than the effect of the liquid transfer pressure P in the selective removal of the overgrown cells.
  • Overgrowing cells are more likely to be destroyed by the application of external force than normal cells, and by controlling the index value F shown by equation (2), overgrowing cells are suppressed while suppressing damage to normal cells. Can be destroyed.
  • the index value F preferably satisfies 2000 ⁇ F ⁇ 80000, more preferably 4000 ⁇ F ⁇ 60000, still more preferably 6000 ⁇ F ⁇ 40000, and 7000 ⁇ F ⁇ 30000 is most preferred.
  • the index value F By setting the index value F to 2000 or more, the overgrowth cells can be efficiently destroyed.
  • the index value F By setting the index value F to 80,000 or less, damage to normal cells can be suppressed.
  • the index value F is in the above range, if the shear stress Y is excessive, there is a risk that normal cells may be damaged, and if the fluid delivery pressure P of the pump is simply increased. And destruction of overgrown cells may not be promoted. Therefore, it is preferable to control not only the index value F but also the ratio between the shear stress Y and the liquid delivery pressure P together. Specifically, it is preferable to satisfy 3 ⁇ log 10 (P / Y) ⁇ 5.6, and more preferably 3.7 ⁇ log 10 (P / Y) ⁇ 5. By setting log 10 (P / Y) to 3 or more, damage to normal cells can be suppressed. By setting log 10 (P / Y) to 5.6 or less, overgrown cells can be efficiently destroyed.
  • the shear stress Y preferably satisfies 0.1 ⁇ Y ⁇ 3, more preferably 0.2 ⁇ Y ⁇ 2.5, and 0.25 It is further preferable that ⁇ Y ⁇ 2.
  • the shear stress Y By setting the shear stress Y to 0.1 or more, the overgrown cells can be efficiently destroyed. By setting the shear stress Y to 3 or less, damage to normal cells can be suppressed.
  • the liquid transfer pressure P preferably satisfies 500 ⁇ P ⁇ 80000, more preferably 1500 ⁇ P ⁇ 50000, and still more preferably 3000 ⁇ P ⁇ 30000. .
  • the delivery pressure P preferably satisfies 500 ⁇ P ⁇ 80000, more preferably 1500 ⁇ P ⁇ 50000, and still more preferably 3000 ⁇ P ⁇ 30000.
  • FIG. 2 is a view showing an example of the configuration of the cell culture apparatus 100 applicable to the implementation of the method for producing an antibody according to the embodiment of the disclosed technology.
  • the cell culture apparatus 100 includes a culture vessel 10 for containing cells with a culture medium, a filter unit 20 having a filter membrane 24 for performing a membrane separation process on a cell suspension extracted from the culture vessel 10, and a filter membrane 24 And the flow path 53 through which the component that has passed through the filter membrane 24 passes, and the recovery tank 40 connected to the flow path 53.
  • a stirring device having a stirring blade 11 is provided inside the culture vessel 10. By rotating the stirring wing 11, the medium contained in the culture vessel 10 is agitated, and the homogeneity of the medium is maintained.
  • One end of the channel 51 is connected to the bottom of the culture vessel 10, and the other end is connected to the inlet 20 a of the filter unit 20.
  • a pump PU1 for extracting the cell suspension contained in the culture vessel 10 and sending it to the filter unit 20 is provided in the middle of the flow path 51.
  • the pump PU1 is used as a means for applying an external force to the cells to selectively remove the overgrown cells. That is, while the cell suspension is transferred from the culture vessel 10 to the filter unit 20, an external force by the liquid flow generated by the pump PU1 is applied to the cells, whereby the overgrowth cells are selectively destroyed.
  • a magnetically levitated pump 200 shown in FIG. 1 can be used as the pump PU1.
  • the shear stress Y acting on the cell suspension has a diameter D of the rotary blade 220, a distance L between the tip of the rotary blade 220 and the inner wall of the case 210 surrounding the periphery of the rotary blade 220, and 1 of the rotary blade 220. It is possible to adjust by the number of revolutions R per second.
  • the liquid delivery pressure P can be measured by a pressure gauge 60 installed between the pump PU1 and the filter unit 20.
  • the liquid transfer pressure P of the pump PU1 can be adjusted by the opening degree of the pinch valve V provided on the flow path 52.
  • the filter unit 20 separates the container 21 and the space in the container 21 into the supply side 22 and the permeation side 23, and a filter membrane 24 that performs a membrane separation process on the cell suspension extracted from the culture container 10. And.
  • the filter unit 20 has, on the supply side 22, an inlet 20a into which the cell suspension flows and an outlet 20b from which the cell suspension flows out.
  • the cell suspension withdrawn from the culture vessel 10 flows on the filter membrane 24 while flowing into the interior of the vessel 21 from the inlet 20 a and flowing out of the outlet 20 b to the outside of the vessel 21.
  • the filter unit 20 is a tangential flow method that sends a component having a small size to the transmission side 23 while flowing the liquid to be subjected to the membrane separation process along the film surface of the filter film 24 (in the direction parallel to the film surface).
  • Perform membrane separation treatment may form a flow in which the cell suspension extracted from the culture vessel 10 circulates in one direction in parallel along the membrane surface of the filter membrane 24.
  • the cell suspension may form a reciprocating flow along the membrane surface of the filter membrane 24.
  • KrosFlo perfusion culture flow path apparatus KML-100, KPS-200, KPS-600 manufactured by Spectrum Laboratories, Inc. or PuraLev series manufactured by Levitronix can be suitably used.
  • REPLIGEN's ATF system can be suitably used.
  • the cells contained in the cell suspension do not permeate the filter membrane 24 and flow out of the outlet 20 b to the outside of the container 21 and are returned to the inside of the culture container 10 via the flow path 52.
  • the antibody contained in the cell suspension passes through the filter membrane 24 and is discharged from the discharge port 20 c provided on the permeation side 23 to the outside of the container 21.
  • a flow path 53 provided with the pump PU 2 is connected to the permeation side 23, and the permeation liquid containing the antibody permeated to the permeation side 23 is collected into the recovery tank 40 via the flow path 53.
  • the pump PU2 may be a magnetically levitated pump 200 shown in FIG.
  • the filter film 24 it is possible to use a mesh filter formed by weaving fibrous members in a mesh shape.
  • a mesh filter it is possible to promote the elimination of components unnecessary for cell culture, including cell death and cell breakage, to the permeate side, as compared with the case of using a hollow fiber membrane.
  • components unnecessary for cell culture can be effectively removed from the culture container 10, and the proliferation of cells in the culture container 10 can be enhanced.
  • a hollow fiber membrane can be used as the filter membrane 24.
  • the risk of cells permeating can be reduced compared to the case of using a mesh filter.
  • the risk of occurrence of clogging due to entry of cells into the filter membrane 24 can be reduced. These can reduce cell loss.
  • the cell culture apparatus 100 has a flow path 54 for supplying fresh culture medium to the culture container 10, and a pump PU3 provided in the middle of the flow path 54.
  • the pump PU3 may be a magnetically levitated pump 200 shown in FIG.
  • a cell bleed process is performed to extract some of the cells in the culture vessel 10 at an appropriate timing during the culture period.
  • cells in the culture vessel 10 are discharged to the outside of the culture vessel 10 via the flow path 55.
  • the cell culture apparatus 100 shown in FIG. 2 performs separation processing by membrane separation processing by the filter unit 20, it is also possible to replace the filter unit 20 with a processing unit that performs separation processing by sonication method. is there.
  • Example 13 Experiments were performed to produce antibodies by performing cell culture by a perfusion culture system under a plurality of different conditions using the cell culture apparatus 100 shown in FIG. The evaluation results on the contents of each condition and the viability of cells corresponding to each condition, and the evaluation results on the quality of the obtained antibody are shown in FIG. In Example 13, in place of the membrane separation process by the filter unit 20, the separation process by the sonication method was performed.
  • the cells were seeded so that the cell concentration in the culture vessel 10 was 1.0 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • CHO cells were used in Examples 1-15 and Comparative Examples 1-5.
  • the pump PU1 is driven under predetermined conditions, the cell suspension is sent to the separation processing unit (filter unit 20 or separation processing unit by sonication), and the permeated liquid or supernatant obtained by the separation processing is 15 L / day.
  • the culture medium was continuously supplied with fresh medium such that the liquid volume in the culture vessel 10 was maintained at 10 L while drawing out continuously at a rate.
  • the culture was continued until the concentration of the cells in the culture container 10 reached a predetermined value, and then the cell suspension was continuously withdrawn from the culture container 10 so that the concentration of the cells remained at the predetermined value.
  • a sample is obtained from the cell suspension in the culture vessel 10 and the permeate or supernatant obtained by separation treatment, and the cell viability is obtained. And assessment of antibody quality.
  • a pump PU1 for extracting the cell suspension from the culture vessel 10 a magnetically levitated pump (Examples 1 to 15, Comparative Examples 1 to 5) and a diaphragm reciprocating ATF pump (Comparative Example 1) were used.
  • the magnetic levitation type pump used PuraLevi30SU, i100SU, 600SU, 2000SU made from Levitronix.
  • the rotary vanes were appropriately processed so that the diameter D of the rotary vanes and the distance L between the tip of the rotary vanes and the inner wall surrounding the periphery of the rotary vanes become each value shown in FIG.
  • the pump [1] is an i100SU.
  • the pump [2] is obtained by processing the rotating blades of i100SU.
  • the pump [3] is a machined rotor of i30SU.
  • the pump [4] is a processed blade of 600 SU.
  • the pump [5] is a processed blade of 2000 SU.
  • the diaphragm reciprocating ATF pump used ATF2 manufactured by Repligen.
  • the number of revolutions R per second of the rotary vanes of the magnetically levitated pump and the pressure P of liquid feed were adjusted to the values shown in FIG.
  • the delivery pressure P was adjusted by the opening degree of the pinch valve V.
  • the shear stress Y was calculated using equation (1).
  • the separation treatment was carried out by the membrane separation method (Examples 1 to 12, 14, 15 and Comparative Examples 1 to 5) using the hollow fiber type MF membrane and the sonoaggregation method (Example 13).
  • a PES (polyether sulfone) filter S06-P20U-10-S with a pore diameter of 0.2 ⁇ m of Spectrum Laboratories was used as the hollow fiber type MF membrane. Sonication is performed by Aplikon Biotechnolgy's Biosep Acoustic The Perfusion System was used.
  • Viable cell brightness 85% Cell sharpness: 100 Viable cell spot brightness: 75% Viable cell sprot area: 5% Minimum circularity: 0 Decluster degree: Medium
  • the output value of Vi-CELL was used as the average diameter A of the single cell. Standard deviation ⁇ of diameter of single cell, number ratio of cells having diameter of 1.4 ⁇ A or more, and number ratio of single cell diameter in the range of A ⁇ A / 7 from Vi-CELL It was calculated from data of diameter and number of cells to be output.
  • the viscosity of the cell suspension was measured with a tuning fork oscillatory viscometer SV-10 manufactured by A & D Co., while keeping the cell suspension at 37 ° C.
  • a Spectrum Laboratories KrosFlo digital pressure monitor (ACPM-200-01N) was installed immediately after the outlet of pump PU1, and the delivery pressure P of pump PU1 was measured.
  • As the antibody quality the state of degradation / aggregation of the antibody was evaluated by size exclusion chromatography according to the following procedure. (1) 100 ⁇ l of Ab Capcher Extra (Protenova Co., Ltd.) was added to 7 ml of the permeate or supernatant obtained by the separation treatment, and allowed to stand for 30 minutes. (2) The obtained liquid was centrifuged, the supernatant liquid was discarded, and the precipitated gel was recovered.
  • the size distribution of the antibody was measured by size exclusion chromatography (SEC) using a TSKgel G3000SW column manufactured by Tosoh Corporation for the above prepared solution, and the proportion of the main peak was calculated. The larger the proportion of the main peak, the higher the quality of the antibody contained in the permeate or supernatant.
  • the evaluation criteria for cell viability are as follows. A: Cell viability is 97% or more. B: Cell viability is 95% or more and less than 97%. C: Cell viability is 92% or more and less than 95%. D: Cell viability is 90% or more and less than 92%. E: Cell viability is less than 90%.
  • the evaluation criteria for the proportion of the main peak obtained by size exclusion chromatography are as follows. A: The proportion of the main peak is 99% or more. B: The proportion of the main peak is 97% or more and less than 99%. C: The ratio of the main peak is 95% or more and less than 97%. D: The proportion of main peak is less than 95%
  • Examples 1 to 15 the evaluation on cell viability is either A judgment, B judgment, C judgment or D judgment, and the evaluation on the proportion of the main peak obtained by size exclusion chromatography is A It became either of the judgment, the B judgment, and the C judgment.
  • the selective removal of the overgrowth cells was appropriately performed, thereby enhancing the cell survival rate and improving the quality of the antibody. That is, in Examples 1 to 15, it was possible to enhance the quality of the product (antibody) while maintaining the productivity of the product (antibody) by high concentration culture of cells.
  • the number ratio of cells having a diameter of 1.4 ⁇ A or more is set to 2.5% or less, and the diameter of the cell alone is determined.
  • the number ratio of cells in the range of A ⁇ A / 7 is 60% or more, the evaluation on the viability of cells and the evaluation on the proportion of the main peak However, all became A judgment.

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Computer Hardware Design (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

開示の技術に係る産生物の製造方法は、培養容器内における細胞の濃度を３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上３×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以下とし、培養容器内における細胞単体の平均径をＡとした場合、培養容器内において、細胞単体の径が１．４×Ａ以上の細胞の個数割合を５％以下とし、細胞単体の径がＡ±Ａ/７の範囲にある細胞の個数割合を５０％以上とすることを含む。

Description

産生物の製造方法
　開示の技術は、細胞から産生される産生物の製造方法に関する。
　細胞から産生される抗体を含むバイオ医薬品等の製造において、抗体の生産性を向上するため、培養容器から抗体を含む培地を連続的に抜き出す一方、新鮮な培地を連続的に培養容器に供給する灌流培養が知られている。
　灌流培養に関する技術として、例えば、特表２０１４－５０７９５９号公報には、平均細胞直径が増大したことに関連して、不十分な細胞増殖が観察されることが記載されている。
　また、Characterization and comparison of ATF and TFF in stirred bioreactors for continuous mammalian cell culture processes (Biochemical Engineering Journal 110(2016)17-26)には、磁気浮上型ポンプを使用した培養において、ＡＴＦ（Alternating Tangential Flow Filtration）ダイアフラム式往復ポンプと同等の培養結果が得られることが記載されている。
　灌流培養によれば細胞の高濃度培養が可能となり、細胞から産生される抗体等の産生物の生産性が向上する。しかしながら、培養容器内における細胞の濃度が高まると、細胞のバイアビリティが低下したり、細胞から産生される産生物の品質が低下したりするといった問題がある。
　本発明の一つの実施形態は、細胞の高濃度培養による産生物の生産性を維持しつつ、産生物の品質を高める。
　開示の技術に係る産生物の製造方法は、培養容器に収容された細胞によって産生される産生物の製造方法であって、培養容器内における細胞の濃度を３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上３×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以下とし、培養容器内における細胞単体の平均径をＡとした場合、前記培養容器内において、細胞単体の径が１．４×Ａ以上の細胞の個数割合を５％以下とし、培養容器内において、細胞単体の径がＡ±Ａ/７の範囲にある細胞の個数割合を５０％以上とすることを含む。
　培養容器に収容された細胞に外力を与えることにより、細胞単体の径が１．４×Ａ以上の細胞を選択的に削減してもよい。培養容器内における細胞単体の径の標準偏差をＡ/４以下とすることが好ましい。
　開示の技術に係る産生物の製造方法は、培養容器からポンプを用いて抜き出した細胞懸濁液を、細胞が濃縮された細胞濃縮液と前記細胞懸濁液よりも低い細胞濃度を有する液体とに分離する分離処理を行う工程と、前記細胞濃縮液を培養容器に戻す工程と、培養容器内に新鮮培地を供給する工程と、を含み得る。上記のポンプが、細胞懸濁液中に浮遊させた回転羽根を磁力によって回転させる磁気浮上型のポンプであってもよく、ポンプが発生させる液流による外力を細胞に与えることにより、細胞単体の径が１．４×Ａ以上の細胞を選択的に削減してもよい。
　ポンプの回転羽根の径をＤメートル、回転羽根の先端と回転羽根の周囲を囲う内壁との距離をＬメートル、回転羽根の１秒間あたりの回転数をＲ、円周率をπ、細胞懸濁液の粘度をＸパスカル秒、前記ポンプの送液圧力をＰパスカル、Ｙ＝Ｘ×Ｄ×π×Ｒ／Ｌとした場合、２０００≦１００００Ｙ＋Ｐ≦８００００且つ３≦ｌｏｇ１０（Ｐ／Ｙ）≦５．６を満たすことが好ましい。Ｙは、ポンプの回転羽根の回転によって細胞懸濁液に作用するせん断応力に相当する。また、０．１≦Ｙ≦３を満たすことが好ましく、５００≦Ｐ≦８００００を満たすことが好ましい。
　分離処理は公知の方法により、細胞と産生物を分離することができる。例えば分離処理は、中空糸膜による膜分離処理であってもよく、中空糸膜が、精密濾過膜であってもよい。膜分離方処理は、タンジェンシャルフローフィルトレーション方式であってもよい。
　開示の技術に係る産生物の製造方法は、中空糸膜を透過した液を回収する回収工程を含み得る。更に、回収工程において回収された液を精製する工程を含み得る。培養容器に収容される細胞がＣＨＯ細胞であってもよく、細胞から産生される産生物が抗体であってもよい。
　本発明の一つの実施形態によれば、細胞の高濃度培養による産生物の生産性を維持しつつ、産生物の品質を高めることが可能となる。
開示の技術の実施形態に係る抗体の製造方法の実施に適用可能な磁気浮上型のポンプの構成の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る抗体の製造方法の実施に適用可能な細胞培養装置の構成の一例を示す図である。 開示の技術の実施形態に係る抗体の製造方法を実施した結果を示す図表である。
　開示の技術の実施形態に係る細胞によって産生される産生物の製造方法において、産生物を産生する細胞として用いられる細胞は、特に限定されないが、動物細胞、植物細胞、酵母などの真核細胞、枯草菌などの原核細胞及び大腸菌などが挙げられる。ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ－２１細胞及びＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞などの動物細胞が好ましく、ＣＨＯ細胞がより好ましい。また本開示における細胞によって産生される産生物は、上記の細胞が培養液中に生産する物質であれば、特に限定されず、例えば、アルコール、酵素、抗生物質、組換えタンパク質、抗体などの物質が挙げられる。中でも産生物として、好ましくは、組み換えタンパク質、抗体であり、より好ましくは抗体である。
　動物細胞に産生させる抗体としては、特に限定されないが、例えば、抗IL-6レセプター抗体、抗IL-6抗体、抗グリピカン-3抗体、抗CD3抗体、抗CD20抗体、抗GPIIb/IIIa抗体、抗TNF抗体、抗CD25抗体、抗EGFR抗体、抗Her2/neu抗体、抗RSV抗体、抗CD33抗体、抗CD52抗体、抗IgE抗体、抗CD11a抗体、抗VEGF抗体及び抗VLA4抗体などが挙げられる。抗体としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ及びサル等の動物由来のモノクローナル抗体だけでなく、キメラ抗体、ヒト化抗体及びbispecific抗体など人為的に改変した抗体も含む。
　得られた抗体又はその断片は、略均一にまで精製することができる。抗体又はその断片の分離及び精製は通常のポリペプチドで使用されている分離及び精製方法を使用すればよい。例えば、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルタ、限外濾過、塩析、透析、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動及び等電点電気泳動等
を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離及び精製することができるが、これらに限定されるものではない。得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は酵素結合免疫吸着検定法(Enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA）等により行うことができる。
　開示の技術の実施形態に係る抗体の製造方法において、細胞は、培地と共に培養容器に収容され、灌流培養方式によって培養される。すなわち、本実施形態に係る抗体の製造方法は、培養容器からポンプを用いて連続的に抜き出した細胞懸濁液を、細胞が濃縮された細胞濃縮液と、前記細胞懸濁液よりも低い細胞濃度を有する液体とに分離する分離処理を行う工程と、分離処理によって得られた細胞濃縮液を培養容器に戻す工程と、培養容器内に新鮮培地を供給する工程と、分離処理において分離された、前記細胞懸濁液よりも低い細胞濃度を有する液体を回収する工程と、回収された該液体に含まれる抗体を精製する工程と、を含む。
　本発明者らは、上記の各工程を含む灌流培養において、培養容器内の細胞の濃度を所定範囲に維持すると共に、培養容器内の過剰に成長した細胞（以下、過剰成長細胞という）の個数割合を所定値以下にすることで、培養細胞において高い生存率を維持して高濃度培養による抗体の生産性を維持しつつ、抗体の品質を向上できることを見出した。
　過剰成長細胞は、老化した細胞であり、正常細胞と比較して、抗体を産生する能力が低く、また、低品質の抗体を産生しやすい。従って、過剰成長細胞を選択的に除去して過剰成長細胞の個数割合を所定値以下にすることで、灌流培養による高い抗体生産能力を維持しつつ、抗体の品質を高めることができる。
　また、培養容器に収容される細胞の濃度が高くなる程、細胞分裂が阻害され、過剰成長細胞が発生しやすくなり、また、細胞のバイアビリティの低下を招く。一方、培養容器に収容される細胞の濃度を低くすると、抗体の生産性が低下する。従って、培養容器に収容される細胞の濃度は、培養期間中、過剰成長細胞の増加及び細胞のバイアビリティの低下を抑制しつつ抗体の生産性を確保できる範囲にコントロールすることが好ましい。
　具体的には、培養期間中、培養容器内における細胞の濃度を、３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上３×１０８ｃｅｌｌｓ/ｍｌ以下の範囲に維持することが好ましく、４×１０７
ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上２×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以下がより好ましく、５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上１．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以下が更に好ましく、６×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上１．２×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以下が最も好ましい。
　培養容器内における細胞の濃度を３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上とすることで、抗体の生産性を確保することができる。また、細胞径の推移の観察が容易となる。一方、培養容器内における細胞の濃度を３×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以下とすることで、細胞の濃度過多による細胞のバイアビリティの低下及び細胞から産生される抗体の品質低下を抑制することができる。培養容器内における細胞の濃度は、例えば、培養期間中における適切なタイミングで培養容器１０内の細胞の一部を抜き取るセルブリード処理によって調整することが可能である。細胞の濃度については、公知の方法、例えば、オートアナライザーを用いて取得することもでき、光学顕微鏡を用いて取得することもできる。
　上記のように、過剰成長細胞を選択的に除去し、培養期間中、培養容器に含まれる過剰成長細胞の個数割合を所定値以下にすることが好ましい。本開示の技術では、培養容器に収容された細胞単体の径の平均値をＡとした場合、細胞単体の径が１．４×Ａ以上の細胞を過剰成長細胞とする。培養期間中、培養容器内における径が１．４×Ａ以上である過剰成長細胞の個数割合を５％以下とすることが好ましく、４％以下がより好ましく、３％以下が更に好ましく、０．０１％以上２．５％以下が最も好ましい。培養容器内における径が１．４×Ａ以上である過剰成長細胞の個数割合が５％以下であることは、過剰成長細胞の除去が適切に行われていることを意味し、これにより抗体の生産能力を高めるとともに、抗体の品質を高めることができる。細胞単体の径や過剰成長細胞の個数割合については、例えば、オートアナライザーを用いて取得することもでき、光学顕微鏡を用いて取得した画像を処理することによって得ることもできる。
　細胞単体の径の平均値Ａは、例えば、以下の式で求められる。
　細胞単体の径の平均値Ａ＝細胞の径の和÷細胞の数
　また培養容器内における径が１．４×Ａ以上である過剰成長細胞の個数割合は以下の式で求められる。
　培養容器内における径が１．４×Ａ以上である過剰成長細胞の個数割合％＝（径が１．４×Ａ以上である過剰成長細胞の個数）÷（細胞の全個数）×１００
　また、培養期間中、培養容器内における細胞単体の径の標準偏差σをＡ/４以下とすることが好ましく、Ａ／１００以上Ａ／５以下が更に好ましい。培養容器内における細胞単体の径の標準偏差σがＡ/４以下であることは、過剰成長細胞の排除が適切に行われていることを意味し、これにより、抗体の生産能力を高めるとともに、抗体の品質を高めることができる。
　また、培養期間中、培養容器内において、細胞単体の径がＡ±Ａ/７の範囲にある細胞の個数割合を５０％以上とすることが好ましく、５５％以上がより好ましく、６０％以上９５％以下が更に好ましい。細胞単体の径がＡ±Ａ/７の範囲にある細胞の個数割合が５
０％以上であることは、培養容器内において正常な細胞が多く含まれ且つ細胞の均質性が高いことを意味し、これにより、抗体の品質を安定化させることができる。
　培養容器内における細胞単体の径がＡ±Ａ/７の範囲にある細胞の個数割合は以下の式で求められる。
　培養容器内における細胞単体の径がＡ±Ａ/７の範囲にある細胞の個数割合％＝（細胞単体の径がＡ±Ａ/７の範囲にある細胞の個数）÷（細胞の全個数）×１００
　また、培養期間中の少なくともいずれかの時点における培養容器内にける細胞の生存率は９０％以上であることが好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上が更に好ましく、９７％以上が最も好ましい。細胞の生存率とは、ある時点における培養容器内の全細胞のうち、生存している細胞の個数割合である。細胞の生存率を９０％以上とすることで、抗体の生産能力を高めることができる。
　細胞の生存率は、公知の方法、例えば、オートアナライザーを用いて取得することもでき、光学顕微鏡を用いて取得することもできる。
　上記の分離工程において行われる分離処理は、中空糸膜を用いた膜分離処理であってもよい。この場合、中空糸膜として精密濾過膜（ＭＦ膜）を用いることができる。膜分離処理の方式は、タンジェンシャルフロー方式であってもよい。タンジェンシャルフロー方式は、膜分離処理の対象となる液体を濾過膜の膜面に沿って流しながら、サイズの小さい成分を透過側に送る方式である。また、膜分離以外の分離処理方式として、例えば音波凝集法を用いることも可能である。音波凝集法を用いた細胞懸濁液の分離処理では、細胞懸濁液に音波を照射して細胞を凝集及び沈殿させることで、細胞懸濁液が細胞と上澄み液とに分離する。
　過剰成長細胞は、正常な細胞よりも脆弱である。従って、細胞に適当な大きさの外力を与えることによって過剰成長細胞を選択的に破壊し、削減することができる。細胞に外力を与える手段として、細胞培養装置に設置されたポンプを用いることもできるし、超音波によって与えることもできる。細胞に外力を与えるためのポンプは、例えば、細胞懸濁液を培養容器から分離処理部に移送するためのポンプであってもよい。細胞に外力を与えるためのポンプは、例えば、磁気浮上型のポンプを好適に用いることができる。
またこれらの外力により、過剰成長した細胞に加え、細胞の凝集体をほぐし単一細胞にしたり、死細胞を破壊し、削減することもできる。これによっても細胞の増殖性やバイアビリティ、抗体品質の一定の改良効果も得られる。
　図１は、本実施形態に係る抗体の製造方法の実施に適用可能な磁気浮上型のポンプ２００の構成の一例を示す図である。ポンプ２００は、細胞懸濁液を吸入する吸入口２１１及び細胞懸濁液を排出する排出口２１２を有するケース２１０と、ケース２１０内に収容された回転羽根２２０と、回転羽根２２０の底部に設けられたロータ磁石２２１と、ロータ磁石２２１を回転させるステータ２３０と、ステータ２３０に巻回されたコイル２４０と、を含んで構成されている。コイル２４０に電流を流すことで、ステータ２３０に磁力が発生する。ケース２１０内において細胞懸濁液中に浮遊した回転羽根２２０は、ステータ２３０が発生させる磁力によって回転する。ステータ２３０が回転することで、細胞懸濁液は吸入口２１１から吸入され、排出口２１２から排出される。ポンプ２００は、回転羽根２２０を回転駆動させるための回転軸を有していないため、洗浄処理及び滅菌処理を行う際の作業負担を軽減できる。
　ここで、回転羽根２２０の径をＤメートル（図１参照）、回転羽根２２０の先端と回転羽根２２０の周囲を囲うケース２１０の内壁との距離をＬメートル（図１参照）、回転羽根２２０の１秒間あたりの回転数をＲ、円周率をπ、細胞懸濁液の粘度をＸパスカル秒とすると、回転羽根２２０の回転によって細胞懸濁液に作用するせん断応力Ｙは、下記の（１）式によって概算することができる。なお、回転数とは、回転羽根の装置において設定された回転数を意味する。粘度については、液体の粘度測定方法 JIS Z 8803の方法に基づいて測定することができる。
Ｙ＝Ｘ×Ｄ×π×Ｒ／Ｌ　・・・（１）
　ポンプ２００の送液圧力をＰパスカルとすると、本開示の技術では、せん断応力Ｙと送液圧力Ｐとを重み付け加算した値を、ポンプ２００が発生させる液流によって細胞に加わる外力の指標値Ｆとして用いている。指標値Ｆは、下記の（２）式によって表わされる。Ｆ＝１００００Ｙ＋Ｐ　・・・（２）
　せん断応力Ｙに１００００倍の重み付けを行っているのは、過剰成長細胞の選択的な除去において、せん断応力Ｙの影響が、送液圧力Ｐの影響よりも大きいからである。過剰成長細胞は、正常な細胞と比較して、外力の印加によって破壊されやすく、（２）式によって示される指標値Ｆをコントロールすることで、正常な細胞へのダメージを抑制しつつ過剰成長細胞を破壊することができる。
　過剰成長細胞の選択的な除去を行うためには、指標値Ｆについて、２０００≦Ｆ≦８００００を満たすことが好ましく、４０００≦Ｆ≦６００００がより好ましく、６０００≦Ｆ≦４００００が更に好ましく、７０００≦Ｆ≦３００００が最も好ましい。指標値Ｆを２０００以上とすることで、過剰成長細胞を効率的に破壊することができる。指標値Ｆを８００００以下とすることで、正常な細胞へのダメージを抑制することができる。
　また、指標値Ｆが上記の範囲内にある場合でも、せん断応力Ｙが過大である場合には、正常な細胞にダメージを与えるおそれがあり、また、ポンプの送液圧力Ｐを大きくするだけでは、過剰成長細胞の破壊が促進されないおそれがある。従って、指標値Ｆのみならず、せん断応力Ｙと送液圧力Ｐとの比率も併せてコントロールすることが好ましい。具体的には、３≦ｌｏｇ１０（Ｐ／Ｙ）≦５．６を満たすことが好ましく、３．７≦ｌｏｇ１０（Ｐ／Ｙ）≦５が更に好ましい。ｌｏｇ１０（Ｐ／Ｙ）を３以上とすることで、正常な細胞へのダメージを抑制することができる。ｌｏｇ１０（Ｐ／Ｙ）を５．６以下とすることで、過剰成長細胞を効率的に破壊することができる。
　また、過剰成長細胞の選択的な除去を行うためには、せん断応力Ｙについて、０．１≦Ｙ≦３を満たすことが好ましく、０．２≦Ｙ≦２．５がより好ましく、０．２５≦Ｙ≦２が更に好ましい。せん断応力Ｙを０．１以上とすることで、過剰成長細胞を効率的に破壊することができる。せん断応力Ｙを３以下とすることで、正常な細胞へのダメージを抑制することができる。
　また、過剰成長細胞の選択的な除去を行うためには、送液圧力Ｐについて、５００≦Ｐ≦８００００を満たすことが好ましく、１５００≦Ｐ≦５００００がより好ましく、３０００≦Ｐ≦３００００が更に好ましい。送液圧力Ｐを５００以上とすることで、過剰成長細胞を効率的に破壊することができる。送液圧力Ｐを８００００以下とすることで、正常な細胞へのダメージを抑制することができる。
　図２は、開示の技術の実施形態に係る抗体の製造方法の実施に適用可能な細胞培養装置１００の構成の一例を示す図である。
　細胞培養装置１００は、細胞を培地とともに収容する培養容器１０と、培養容器１０から抜き出された細胞懸濁液に対して膜分離処理を施すフィルタ膜２４を有するフィルタ部２０と、フィルタ膜２４によって阻止された成分を培養容器１０に戻す流路５２と、フィルタ膜２４を透過した成分が通過する流路５３と、流路５３に接続された回収タンク４０とを有する。
　培養容器１０の内部には、撹拌翼１１を有する撹拌装置が設けられている。撹拌翼１１を回転させることで、培養容器１０の内部に収容された培地が撹拌され、培地の均質性が保たれる。
　流路５１は、一端が培養容器１０の底部に接続され、他端がフィルタ部２０の流入口２０ａに接続されている。流路５１の途中には、培養容器１０に収容されている細胞懸濁液を抜き出して、フィルタ部２０に送るポンプＰＵ１が設けられている。ポンプＰＵ１は、過剰成長細胞の選択的な除去を行うための、細胞への外力の印加手段として用いられる。すなわち、細胞懸濁液を培養容器１０からフィルタ部２０に移送する間に、ポンプＰＵ１が発生させる液流による外力が細胞に加わることで、過剰成長細胞が選択的に破壊される。ポンプＰＵ１として、図１に示す磁気浮上型のポンプ２００を用いることができる。この場合、細胞懸濁液に作用するせん断応力Ｙは、回転羽根２２０の径Ｄ、回転羽根２２０の先端と回転羽根２２０の周囲を囲うケース２１０の内壁との距離Ｌ、及び回転羽根２２０の１秒間あたりの回転数Ｒによって調整することが可能である。送液圧力ＰはポンプＰＵ１とフィルタ部２０との間に設置された圧力計６０によって測定することが可能である。ポンプＰＵ１の送液圧力Ｐは、流路５２上に設けられたピンチバルブＶの開度によって調整することが可能である。
　フィルタ部２０は、容器２１と、容器２１内の空間を供給側２２と透過側２３とに隔て、培養容器１０から抜き出された細胞懸濁液に対して膜分離処理を施すフィルタ膜２４と、を備える。また、フィルタ部２０は、供給側２２において、細胞懸濁液が流入する流入口２０ａと細胞懸濁液が流出する流出口２０ｂとを有する。培養容器１０から抜き出された細胞懸濁液は、流入口２０ａから容器２１の内部に流入して流出口２０ｂから容器２１の外部に流出する間にフィルタ膜２４上を通過する。フィルタ部２０は、膜分離処理の対象となる液体をフィルタ膜２４の膜面に沿って（膜面と平行な方向に）流しながら、サイズの小さい成分を透過側２３に送るタンジェンシャルフロー方式による膜分離処理を行う。タンジェンシャルフロー方式による膜分離処理は、培養容器１０から抜き出された細胞懸濁液がフィルタ膜２４の膜面に沿って平行に一方向に循環する流れを形成するものであってもよいし、細胞懸濁液がフィルタ膜２４の膜面に沿って往復する流れを形成するものであってもよい。循環する流れを形成する場合、例えばスペクトラムラボラトリーズ社のKrosFlo灌流培養フローパス装置（KML-100、KPS-200、KPS-600）やＬｅｖｉｔｒｏｎｉｘ製のＰｕｒａＬｅｖシリーズを好適に用いることができる。また往復する流れを形成する場合、REPLIGEN社のATFsystemを好適に用いることができる。
　細胞懸濁液に含まれる細胞は、フィルタ膜２４を透過せず、流出口２０ｂから容器２１の外部に流出し、流路５２を介して培養容器１０の内部に戻される。一方、細胞懸濁液に含まれる抗体は、フィルタ膜２４を透過して、透過側２３に設けられた排出口２０ｃから容器２１の外部に排出される。透過側２３には、ポンプＰＵ２が設けられた流路５３が接続されており、透過側２３に透過した抗体を含む透過液は、流路５３を介して回収タンク４０に回収される。なお、ポンプＰＵ２は、図１に示す磁気浮上型のポンプ２００であってもよい。
　フィルタ膜２４として、繊維状部材を網目状に織ることにより構成されるメッシュフィルタを用いることが可能である。メッシュフィルタを用いることで、中空糸膜を用いる場合と比較して、細胞の死骸及び細胞の破砕物を含む細胞培養に不要な成分の透過側への排出を促進させることができる。これにより、培養容器１０内から細胞培養に不要な成分を効果的に除去することができ、培養容器１０内における細胞の増殖性を高めることができる。
　また、フィルタ膜２４として、中空糸膜を用いることができる。中空糸膜を用いることで、メッシュフィルタを用いる場合と比較して、細胞が透過側に透過するリスクを低減できる。また、フィルタ膜２４に細胞が入り込むことによる目詰まりの発生のリスクを低減できる。これらにより、細胞のロスを低減できる。
　フィルタ膜２４を透過し、回収タンク４０に回収された透過液に含まれる抗体は、流路５６を介して、抗体の精製を行う精製処理部（図示せず）に送られる。
　細胞培養装置１００は、新鮮な培地を培養容器１０に供給するための流路５４と、流路５４の途中に設けられたポンプＰＵ３を有する。ポンプＰＵ３は、図１に示す磁気浮上型のポンプ２００であってもよい。
　培養容器１０内の細胞の濃度が過度に高くなることを防止するために、培養期間中における適切なタイミングで培養容器１０内の細胞の一部を抜き取るセルブリード処理が行われる。セルブリード処理において、培養容器１０内の細胞は、流路５５を介して培養容器１０の外部に排出される。
　なお、図２に示す細胞培養装置１００は、分離処理をフィルタ部２０による膜分離処理によって行うものであるが、フィルタ部２０を、音波凝集法による分離処理を行う処理部に置き換えることも可能である。
［実施例］
　図２に示す細胞培養装置１００を用いて互いに異なる複数の条件下で灌流培養方式によって細胞培養を行うことで、抗体を製造する実験を行った。各条件の内容及び各条件に対応する細胞の生存率に関する評価結果、及び得られた抗体の品質に関する評価結果を図３に示す。なお、実施例１３では、フィルタ部２０による膜分離処理に代えて、音波凝集法による分離処理を行った。
＜実験方法＞
　培養容器１０に新鮮な培地を１０Ｌ注入し、３７℃で１日間コンディショニングを行った。
　培養容器１０内の細胞濃度が１．０×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌとなるように細胞を播種した。実施例１～１５及び比較例１～５においてＣＨＯ細胞を使用した。
　ポンプＰＵ１を所定の条件で駆動し、分離処理部（フィルタ部２０または音波凝集による分離処理部）に細胞懸濁液を送り、分離処理によって得られた透過液または上澄み液を、１５Ｌ／ｄａｙの割合で連続的に引き抜くとともに、培養容器１０内の液量が１０Ｌを維持するように、新鮮な培地を連続的に供給した。
　培養容器１０内の細胞の濃度が所定値に達するまで培養を継続し、その後、細胞の濃度が所定値を保つように培養容器１０から細胞懸濁液を連続的に抜き出した。
　培養容器１０内の細胞の濃度が所定値に達してから１０日目に培養容器１０内の細胞懸濁液及び分離処理によって得られた透過液または上澄み液からサンプルを得て、細胞の生存率及び抗体品質に関する評価を行った。
＜各種条件＞
　培養容器１０から細胞懸濁液を抜き出すためのポンプＰＵ１として、磁気浮上型ポンプ（実施例１～１５、比較例１～５）及びダイアフラム往復ＡＴＦポンプ（比較例１）を使用した。磁気浮上型ポンプは、Ｌｅｖｉｔｒｏｎｉｘ製のＰｕｒａＬｅｖｉ３０ＳＵ、ｉ１００ＳＵ、６００ＳＵ、２０００ＳＵを用いた。回転羽根の径Ｄ、及び回転羽根の先端と回転羽根の周囲を囲う内壁との距離Ｌが、図３に示す各値となるように、回転羽根を適宜加工した。ポンプ［１］は、ｉ１００ＳＵである。ポンプ［２］は、ｉ１００ＳＵの回転羽根を加工したものである。ポンプ［３］はｉ３０ＳＵの回転羽根を加工したものである。ポンプ［４］は、６００ＳＵの回転羽根を加工したものである。ポンプ［５］は、２０００ＳＵの回転羽根を加工したものである。ダイアフラム往復ＡＴＦポンプは、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ製のＡＴＦ２を用いた。
　磁気浮上型ポンプの回転羽根の１秒間あたりの回転数Ｒ、及び送液圧力Ｐが図３に示す各値となるように調整した。送液圧力Ｐは、ピンチバルブＶの開度によって調整した。せん断応力Ｙは、（１）式を用いて算出した。
　分離処理は、中空糸型ＭＦ膜による膜分離法（実施例１～１２、１４、１５、比較例１～５）及び音波凝集法（実施例１３）により行った。
　中空糸型ＭＦ膜はＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社の０．２μｍ孔径の
ＰＥＳ（ポリエーテルスルフォン）フィルタＳ０６－Ｐ２０Ｕ－１０－Ｓを用いた。音波凝集はＡｐｌｉｋｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ社のＢｉｏｓｅｐ Ａｃｏｕｓｔｉｃ 
Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いた。
＜測定＞
　培養容器１０内の細胞の濃度が所定値に達してから１０日目に培養容器１０内の細胞懸濁液を抜き取り、ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社のＣｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａ
ｎａｌｙｚｅｒ Ｖｉ-ＣＥＬＬ ＸＲを用いて、細胞の濃度、細胞の生存率及び細胞の径
を測定した。なおＶｉ－ＣＥＬＬのソフトはＶｉ-ＣＥＬＬ ＸＲ２．０４を用い、測定時のパラメータは以下のように設定した。
　Ｍｉｎ ｄｉａｍｅｔｅｒ：６μｍ
　Ｍａｘ ｄｉａｍｅｔｅｒ：５０μｍ
　Ｄｉｌｕｔｉｏｎ：細胞濃度が１００×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以下ではサンプルは希釈せず、Ｄｉｌｕｔｉｏｎは１で測定。細胞濃度が１００×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上ではサンプルを１０倍希釈した上でＤｉｌｕｔｉｏｎは１０で測定。
　Ｃｅｌｌ ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ：８５％
　Ｃｅｌｌ ｓｈａｒｐｎｅｓｓ：１００
　Ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｓｐоｔ ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ：７５％
　Ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｓｐоｔ ａｒｅａ：５％
　Ｍｉｎｉｍｕｍ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｔｙ：０
　Ｄｅｃｌｕｓｔｅｒ ｄｅｇｒｅｅ：Ｍｅｄｉｕｍ
　細胞単体の平均径ＡについてはＶｉ－ＣＥＬＬの出力値を用いた。細胞単体の径の標準偏差σ、細胞単体の径が１．４×Ａ以上の細胞の個数割合、細胞単体の径がＡ±Ａ／７の範囲にある細胞の個数割合についてはＶｉ－ＣＥＬＬから出力される細胞の径と、個数のデータから算出した。
　細胞懸濁液の粘度については、細胞懸濁液を３７℃に保った状態で、エー・アンド・デイ社の音叉振動式粘度計ＳＶ－１０により測定した。
　Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社のＫｒｏｓＦｌｏデジタル圧力モニタ
（ＡＣＰＭ－２０１－０１Ｎ）を、ポンプＰＵ１の排出口の直後に設置し、ポンプＰＵ１の送液圧力Ｐを測定した。
　抗体品質として、サイズ排除クロマトグラフィーにより、抗体の分解・凝集状態を以下のような手順で評価した。
（１）分離処理によって得られた透過液または上澄み液７ｍｌにＡｂ Ｃａｐｃｈｅｒ Ｅｘｔｒａ（プロテノバ株式会社）１００μｌを加え３０ｍｉｎ静置した。
（２）得られた液を遠心分離し、上清液は廃却し、沈殿したゲルを回収した。
（３）２ｍｌのマイクロチューブにセットしたマイクロバイオスピンカラム６（バイオ・ラッド社）内に得られたゲルを入れ、溶出バッファー（０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣ
ｌ（ｐＨ２．８））４００μｌをカラムに加え遠心分離した。
（４）カラムを通過しチューブ内に溜まった液内に、中和バッファー（１．０Ｍ Ｔｒｉ
ｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ９．０）を３０μｌ添加し中和した。
（５）得られた中和液をアミコンウルトラ３０ｋＤａ（メルク株式会社）を用い、リン酸緩衝生理食塩水８０％と超純水２０％の混合液にバッファー交換し、抗体濃度が５ｍｇ／Ｌになるよう調製した。
（６）上記調製液を東ソー社製のＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラムを用いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって抗体のサイズ分布を測定し、メインピークの割合を算出した。メインピークの割合が大きい程、透過液または上澄み液に含まれる抗体が高品質であることを示す。
＜評価＞
　細胞の生存率に関する評価判定基準は以下のとおりである。
　Ａ：細胞の生存率が９７％以上である。
　Ｂ：細胞の生存率が９５％以上であり、９７％未満である。
　Ｃ：細胞の生存率が９２％以上であり、９５％未満である。
　Ｄ：細胞の生存率が９０％以上であり、９２％未満である。
　Ｅ：細胞の生存率が９０％未満である。
　サイズ排除クロマトグラフィーによって得られたメインピークの割合に関する評価判定基準は以下のとおりである。
　Ａ：メインピークの割合が９９％以上である
　Ｂ：メインピークの割合が９７％以上であり、９９％未満である。
　Ｃ：メインピークの割合が９５％以上であり、９７％未満である。
　Ｄ：メインピークの割合が９５％未満である
　培養容器１０内における細胞単体の平均径をＡとした場合、比較例１～５は、細胞単体の径がＡ±Ａ/７の範囲にある細胞の個数割合が５０％未満であり、細胞単体の径の標準偏差σがＡ/４よりも大である点が、実施例１～実施例１５と異なる。比較例３及び５において、細胞の生存率に関する評価が、どちらもＥ判定（９０％未満）となった。比較例１～５において、サイズ排除クロマトグラフィーによって得られたメインピークの割合に関する評価が、いずれもＤ判定（９５％未満）となった。比較例１～５では、過剰成長細胞の選択的な除去が不十分であり、これに起因して、抗体の品質が低下したものと考えられる。
　一方、実施例１～１５において、細胞の生存率に関する評価が、Ａ判定、Ｂ判定、Ｃ判定及びＤ判定のいずれかとなり、サイズ排除クロマトグラフィーによって得られたメインピークの割合に関する評価が、Ａ判定、Ｂ判定及びＣ判定のいずれかとなった。実施例１～１５では、過剰成長細胞の選択的な除去が適切に行われ、これによって細胞の生存率が高まり、また、抗体の品質が向上したものと考えられる。すなわち、実施例１～１５において、細胞の高濃度培養による産生物（抗体）の生産性を維持しつつ、産生物（抗体）の品質を高めることができた。特に、過剰成長細胞の選択的な除去を行うことによって、細胞単体の径が１．４×Ａ以上の細胞（すなわち過剰成長細胞）の個数割合を２．５％以下とし、且つ細胞単体の径がＡ±Ａ/７の範囲にある細胞の個数割合を６０％以上とした実施例１～実施例５及び実施例１４～実施例１５では、細胞の生存率に関する評価及びメインピークの割合に関する評価がいずれもＡ判定となった。
　本出願は、２０１７年９月６日出願の日本出願である特願２０１７－１７１３３１及び２０１７年１１月１０日出願の日本出願である特願２０１７－２１７３９５の優先権を主張するものであり、この出願の全内容は参照により本明細書に取り込まれる。また本明細書に記載された全ての文献、特許出願及び技術規格は、個々の文献、特許出願及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。

Claims (14)

  1. 　培養容器に収容された細胞によって産生される産生物の製造方法であって、
    　前記培養容器内における細胞の濃度を３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上３×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以下とし、
    　前記培養容器内における細胞単体の平均径をＡとした場合、前記培養容器内において、細胞単体の径が１．４×Ａ以上の細胞の個数割合を５％以下とし、
    　前記培養容器内において、細胞単体の径がＡ±Ａ／７の範囲にある細胞の個数割合を５０％以上とする
    　製造方法。
  2. 　前記培養容器に収容された細胞に外力を与えることにより、細胞単体の径が１．４×Ａ以上の細胞を選択的に削減する
    　請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記培養容器内における細胞単体の径の標準偏差σをＡ／４以下とする
    　請求項１または請求項２に記載の製造方法。
  4. 　前記培養容器からポンプを用いて抜き出した細胞懸濁液を、細胞が濃縮された細胞濃縮液と、前記細胞懸濁液よりも低い細胞濃度を有する液体とに分離する分離処理を行う工程と、
    　前記細胞濃縮液を前記培養容器に戻す工程と、
    　前記培養容器内に新鮮培地を供給する工程と、
    　を含み、
    　前記ポンプが、細胞懸濁液中に浮遊させた回転羽根を磁力によって回転させる磁気浮上型のポンプであり、前記ポンプが発生させる液流による外力を細胞に与えることにより、細胞単体の径が１．４×Ａ以上の細胞を選択的に削減する
    　請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の製造方法。
  5. 　前記回転羽根の径をＤメートル、前記回転羽根の先端と前記回転羽根の周囲を囲う内壁との距離をＬメートル、前記回転羽根の１秒間あたりの回転数をＲ、円周率をπ、細胞懸濁液の粘度をＸパスカル秒、前記ポンプの送液圧力をＰパスカル、Ｙ＝Ｘ×Ｄ×π×Ｒ／Ｌとした場合、
    　２０００≦１００００Ｙ＋Ｐ≦８００００
    　３≦ｌｏｇ１０（Ｐ／Ｙ）≦５．６
    　を満たす請求項４に記載の製造方法。
  6. 　前記回転羽根の径をＤメートル、前記回転羽根の先端と前記回転羽根の周囲を囲う内壁との距離をＬメートル、前記回転羽根の１秒間あたりの回転数をＲ、円周率をπ、細胞懸濁液の粘度をＸパスカル秒、Ｙ＝Ｘ×Ｄ×π×Ｒ／Ｌとした場合、
    　０．１≦Ｙ≦３
    　を満たす請求項４または請求項５に記載の製造方法。
  7. 　前記ポンプの送液圧力をＰパスカルとした場合、
    　５００≦Ｐ≦８００００
    　を満たす請求項４から請求項６のいずれか１項に記載の製造方法。
  8. 　前記分離処理が中空糸膜による膜分離処理である
    　請求項４から請求項７のいずれか１項に記載の製造方法。
  9. 　前記中空糸膜が、精密濾過膜である
    　請求項８に記載の製造方法。
  10. 　前記膜分離処理がタンジェンシャルフローフィルトレーション方式である
    　請求項８に記載の製造方法。
  11. 　前記中空糸膜を透過した液を回収する回収工程を含む
    　請求項８から請求項１０のいずれか１項に記載の製造方法。
  12. 　前記回収工程において回収された液を精製する工程を含む
    　請求項１１に記載の製造方法。
  13. 　前記培養容器に収容される細胞がＣＨＯ細胞である
    　請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載の製造方法。
  14. 　前記産生物が抗体である
    　請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の製造方法。
PCT/JP2018/032678 2017-09-06 2018-09-03 産生物の製造方法 Ceased WO2019049843A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18853414.3A EP3663390A4 (en) 2017-09-06 2018-09-03 PROCESS FOR MANUFACTURING A PRODUCT
CN201880056019.4A CN111051496B (zh) 2017-09-06 2018-09-03 产物的制造方法
JP2019540952A JP6929947B2 (ja) 2017-09-06 2018-09-03 産生物の製造方法
US16/807,740 US11685888B2 (en) 2017-09-06 2020-03-03 Method for producing product

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017171331 2017-09-06
JP2017-171331 2017-09-06
JP2017217395 2017-11-10
JP2017-217395 2017-11-10

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US16/807,740 Continuation US11685888B2 (en) 2017-09-06 2020-03-03 Method for producing product

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019049843A1 true WO2019049843A1 (ja) 2019-03-14

Family

ID=65634072

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2018/032678 Ceased WO2019049843A1 (ja) 2017-09-06 2018-09-03 産生物の製造方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US11685888B2 (ja)
EP (1) EP3663390A4 (ja)
JP (1) JP6929947B2 (ja)
CN (1) CN111051496B (ja)
WO (1) WO2019049843A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021107123A1 (ja) * 2019-11-29 2021-06-03 富士フイルム株式会社 細胞培養方法、抗体製造方法、有機酸除去方法、及び、抗体
WO2024154711A1 (ja) 2023-01-17 2024-07-25 富士フイルム株式会社 核酸導入細胞の製造方法、および有用物質の製造方法
WO2025070513A1 (ja) * 2023-09-27 2025-04-03 富士フイルム株式会社 細胞培養液の処理装置、処理方法、及び産生物の製造方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014507959A (ja) 2011-03-18 2014-04-03 ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ 細胞培養用可撓性バッグ
JP2017171331A (ja) 2016-03-23 2017-09-28 Ｊｆｅ環境株式会社 平パレット
JP2017217395A (ja) 2016-06-10 2017-12-14 株式会社岡村製作所 肘掛け、及び、椅子

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2456015T3 (es) 2004-03-05 2014-04-21 Dsm Ip Assets B.V. Procedimiento para cultivar células mediante perfusión continua y flujo tangencial alternante
WO2007124106A2 (en) * 2006-04-21 2007-11-01 Bayer Healthcare Llc Application of antl-apoptotic genes in mammalian cells for perfusion culture.
KR20130123366A (ko) * 2010-07-01 2013-11-12 가부시키가이샤 가네카 세포 배양용 디스포저블 세트, 세포 배양 장치 및 세포 조제 방법
US20140093952A1 (en) * 2012-10-02 2014-04-03 David Serway Bioreactor Tangential Flow Perfusion Filter System
JP6062845B2 (ja) 2013-03-25 2017-01-18 株式会社ユニバーサルエンターテインメント 遊技システム
SG11201704788SA (en) * 2014-12-18 2017-07-28 Flodesign Sonics Inc Acoustic perfusion devices

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014507959A (ja) 2011-03-18 2014-04-03 ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ 細胞培養用可撓性バッグ
JP2017171331A (ja) 2016-03-23 2017-09-28 Ｊｆｅ環境株式会社 平パレット
JP2017217395A (ja) 2016-06-10 2017-12-14 株式会社岡村製作所 肘掛け、及び、椅子

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOCHEMICAL ENGINEERING JOURNAL, vol. 110, 2016, pages 17 - 26
CLINCKE, M. F. ET AL.: "Very high density of Chinese hamster ovary cells in perfusion by alternating tangential flow or tangential flow filtration in WAVE bioreactor?-part II: Applications for antibody production and cryopreservation", BIOTECHNOL. PROG., vol. 29, no. 3, 2013, pages 768 - 777, XP055168922, DOI: doi:10.1002/btpr.1703 *
WANG, S. ET AL.: "Shear contributions to cell culture performance and product recovery in ATF and TFF perfusion systems", J. BIOTECHNOL., vol. 246, March 2017 (2017-03-01), pages 52 - 60, XP055580748 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021107123A1 (ja) * 2019-11-29 2021-06-03 富士フイルム株式会社 細胞培養方法、抗体製造方法、有機酸除去方法、及び、抗体
JPWO2021107123A1 (ja) * 2019-11-29 2021-06-03
JP7352650B2 (ja) 2019-11-29 2023-09-28 富士フイルム株式会社 細胞培養方法、抗体製造方法、有機酸除去方法、及び、抗体
WO2024154711A1 (ja) 2023-01-17 2024-07-25 富士フイルム株式会社 核酸導入細胞の製造方法、および有用物質の製造方法
EP4653538A1 (en) 2023-01-17 2025-11-26 FUJIFILM Corporation Method for producing nucleic acid introduced cells, and method for producing useful substance
WO2025070513A1 (ja) * 2023-09-27 2025-04-03 富士フイルム株式会社 細胞培養液の処理装置、処理方法、及び産生物の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3663390A1 (en) 2020-06-10
CN111051496A (zh) 2020-04-21
US20200216792A1 (en) 2020-07-09
JP6929947B2 (ja) 2021-09-01
JPWO2019049843A1 (ja) 2020-03-26
CN111051496B (zh) 2024-03-08
EP3663390A4 (en) 2020-08-05
US11685888B2 (en) 2023-06-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12049614B2 (en) Cell culture apparatus and cell culture method
KR102427715B1 (ko) 교번 접선 유동식의 신속한 수확
US11685888B2 (en) Method for producing product
WO2019181234A1 (ja) 生産物の製造方法
WO2017180724A1 (en) Perfusion filtration systems
WO2019240222A1 (ja) 細胞培養システム及び細胞培養方法
WO2022250035A1 (ja) 細胞外小胞の分離精製方法
US20220402968A1 (en) Intensified virus filtration using diafiltration buffer
JP2017511144A (ja) 高細胞密度フィル・アンド・ドロー発酵プロセス
US20220403308A1 (en) Cell culture device, cell culture method, and production method of product
WO2020044984A1 (ja) 細胞培養方法及び細胞培養装置
EP4365284A1 (en) Virus recovery method
CN117642502A (zh) 病毒的回收方法
JP2023006419A (ja) 不純物の除去性が高い細胞培養液のろ過方法
CN119242566A (zh) 一种制备外泌体的方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18853414

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019540952

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018853414

Country of ref document: EP

Effective date: 20200303

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE