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WO2019045105A1 - 異常拍動心筋モデル及びその製造方法、異常拍動心筋モデルの形成剤並びに心疾患治療薬の薬効評価方法 - Google Patents

異常拍動心筋モデル及びその製造方法、異常拍動心筋モデルの形成剤並びに心疾患治療薬の薬効評価方法 Download PDF

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WO2019045105A1
WO2019045105A1 PCT/JP2018/032643 JP2018032643W WO2019045105A1 WO 2019045105 A1 WO2019045105 A1 WO 2019045105A1 JP 2018032643 W JP2018032643 W JP 2018032643W WO 2019045105 A1 WO2019045105 A1 WO 2019045105A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
collagen
cells
model
beating
heart disease
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2018/032643
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English (en)
French (fr)
Inventor
典弥 松▲崎▼
史朗 北野
新司 入江
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toppan Inc
University of Osaka NUC
Original Assignee
Osaka University NUC
Toppan Printing Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to EP18850760.2A priority patent/EP3680327A4/en
Priority to JP2019539708A priority patent/JP7710205B2/ja
Priority to US16/644,059 priority patent/US12326433B2/en
Publication of WO2019045105A1 publication Critical patent/WO2019045105A1/ja
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    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/326—Arrhythmias, e.g. ventricular fibrillation, tachycardia, atrioventricular block, torsade de pointes

Definitions

  • the present invention relates to an abnormally beating myocardium model and a method for producing the same, a forming agent for an abnormally beating myocardium model, and a method for evaluating the efficacy of a therapeutic agent for heart disease.
  • Patent Documents 1 and 2 disclose a three-dimensional assembly of cardiomyocytes prepared using collagen as a scaffold.
  • An object of the present invention is to provide a novel abnormal beating myocardium model, a method for producing the same, and a forming agent that can be used for producing the abnormal beating myocardium model.
  • An abnormally pulsatile cardiac muscle model comprising a three-dimensional tissue containing at least a part of cells containing collagen and a cell containing cardiomyocytes and collagen.
  • the abnormally beating myocardial model according to [1] wherein the cells further contain collagen-producing cells.
  • the method for producing an abnormally pulsatile cardiac muscle model according to [6] wherein the cells further contain collagen-producing cells.
  • a forming agent of an abnormal beating myocardial model which comprises fragmented collagen
  • An agent for forming an abnormally pulsatile cardiac muscle model wherein the average length of fragmented collagen is 100 nm to 200 ⁇ m and the average diameter of fragmented collagen is 50 nm to 30 ⁇ m.
  • a method for evaluating the efficacy of a therapeutic agent for heart disease using the abnormally beating myocardial model according to any one of [1] to [5], wherein a therapeutic agent for cardiac disease is administered to the abnormally beating myocardial model A method for evaluating the efficacy of a therapeutic agent for heart disease, comprising: a process and an evaluation step for evaluating the efficacy of the treatment based on a change in beating behavior of an abnormal beating myocardial model administered with a therapeutic agent for heart disease.
  • A which shows fragmented collagen obtained by homogenizing for 2 minutes
  • B histogram which shows distribution of the length of fragmented collagen obtained by homogenizing for 5 minutes.
  • NHCF human cardiac fibroblasts
  • iPS-CM iPS cell-derived cardiomyocytes
  • NHCF human cardiac fibroblasts
  • the abnormally beating myocardium model according to the present embodiment contains a cell containing cardiomyocytes (hereinafter sometimes simply referred to as “cell” in some cases) and collagen, and at least a part of the cells adhere to collagen. Consists of three dimensional bodies.
  • abnormal beat cardiac muscle model refers to a cardiac muscle model which is composed of a three-dimensional tissue including cardiomyocytes and which has abnormal beat behavior as compared to a normal heart muscle model.
  • the behavior of the beat includes a beat interval, beat rate, beat power, contraction and / or relaxation rate, and the like.
  • the abnormal beating myocardial model may be one in which the beating behavior changes irregularly, and may be one in which the beating is enhanced or suppressed as compared with the normal myocardial model.
  • the abnormally beating myocardium model can be used as a heart disease model (for example, a heart failure model, an arrhythmia model, a myocardial infarction model, etc.) caused by an abnormal pulsation of the myocardium.
  • three-dimensional tissue is an aggregate of cells in which cells are three-dimensionally arranged via collagen such as fibrillar collagen, and is an aggregate artificially produced by cell culture. means.
  • collagen such as fibrillar collagen
  • the living tissue includes blood vessels and the like, and the configuration is more complicated than the three-dimensional tissue. Therefore, the three-dimensional tissue and the living tissue can be easily distinguished.
  • cardiomyocytes examples of animal species to be derived from include human, pig, cow, mouse and the like.
  • cardiomyocytes may be human iPS cell-derived cardiomyocytes (iPS-CM), mouse iPS-derived cardiomyocytes, or ES cell-derived cardiomyocytes.
  • iPS-CM human iPS cell-derived cardiomyocytes
  • mouse iPS-derived cardiomyocytes mouse iPS-derived cardiomyocytes
  • ES cell-derived cardiomyocytes iPS cell-derived cardiomyocytes
  • human iPS cell-derived cardiomyocytes for example, those obtained by Riken Cell Bank, Takara Bio, etc. can be used.
  • reagents to be initialized can be purchased from reprocell etc., iPS cells may be produced by themselves.
  • the cardiomyocyte content may be 5 to 95% by mass, and 25% to 75% by mass, based on the three-dimensional tissue.
  • the cells comprising cardiomyocytes may further comprise collagen producing cells. That is, the three-dimensional tissue may contain endogenous collagen.
  • collagen producing cells means cells that secrete collagen such as fibrillar collagen.
  • examples of animal species derived from collagen-producing cells include, for example, humans, pigs, cattle, mice and the like, fibroblasts (eg, human skin-derived fibroblasts (NHDF), human heart) Mention may be made of mesenchymal cells such as fibroblasts (NHCF), human myofibroblasts), chondrocytes, osteoblasts and the like, preferably fibroblasts.
  • fibroblasts include, for example, human cardiac fibroblasts (NHCF) or human myofibroblasts.
  • endogenous collagen means collagen produced by collagen-producing cells.
  • the endogenous collagen may be fibrillar collagen or non-fibrillar collagen.
  • the three-dimensional tissue contains collagen.
  • Collagen includes, for example, fibrillar collagen or non-fibrillar collagen.
  • the fibrillar collagen means collagen which is a main component of collagen fibers, and specific examples include type I collagen, type II collagen, type III collagen and the like.
  • Non-fibrillar collagen includes, for example, type IV collagen.
  • At least a part of cells including cardiomyocytes adhere to collagen.
  • the collagen contained in the three-dimensional tissue may include exogenous collagen.
  • the collagen preferably comprises fragmented collagen derived from exogenous collagen.
  • exogenous collagen refers to externally supplied collagen, and specifically includes fibrillar collagen, non-fibrillar collagen and the like.
  • exogenous collagen the animal species from which it is derived may be the same as or different from endogenous collagen. Examples of animal species from which exogenous collagen is derived include humans, pigs, cattle and the like. Alternatively, the exogenous collagen may be artificial collagen.
  • the exogenous collagen is preferably fibrillar collagen. Examples of the fibrillar collagen include, for example, type I collagen, type II collagen and type III collagen, and preferably type I collagen.
  • fibrillar collagen As the above-mentioned fibrillar collagen, commercially available collagen may be used, and as a specific example thereof, a pig skin-derived type I collagen freeze-dried product manufactured by Nippon Ham Co., Ltd. can be mentioned. Exogenous non-fibrillar collagen includes, for example, type IV collagen.
  • exogenous collagen the animal species from which it is derived may be different from cardiomyocytes and cells containing them.
  • the animal species derived from exogenous collagen may be different from collagen-producing cells. That is, the exogenous collagen may be heterologous collagen.
  • fragment collagen refers to a fragment of collagen such as fibrillar collagen, which maintains a triple helical structure.
  • One type of collagen from which fragmented collagen is derived may be used, or two or more types of collagen may be used in combination.
  • collagen such as fibrillar collagen was dissolved in an acidic aqueous solution or the like, but the concentration was about 0.1 to 0.3% by weight and could not be dissolved much. Therefore, it has been difficult to increase the amount of collagen such as fibrillar collagen in the three-dimensional tissue by the conventional method.
  • Fragmented collagen is hardly soluble in water, but it is speculated that dispersion in an aqueous medium facilitates contact with cells in the aqueous medium and promotes formation of a three-dimensional organized body.
  • the average length of the fragmented collagen is preferably 100 nm to 200 ⁇ m, more preferably 22 ⁇ m to 200 ⁇ m, and still more preferably 100 ⁇ m to 200 ⁇ m.
  • the average diameter of the fragmented collagen is preferably 50 nm to 30 ⁇ m, more preferably 4 ⁇ m to 30 ⁇ m, and still more preferably 20 ⁇ m to 30 ⁇ m.
  • the method of fragmenting collagen such as fibrillar collagen is not particularly limited, and for example, fragmentation of collagen such as fibrillar collagen using a homogenizer such as an ultrasonic homogenizer, a stirring homogenizer, and a high pressure homogenizer is also possible. Good.
  • a homogenizer such as an ultrasonic homogenizer, a stirring homogenizer, and a high pressure homogenizer is also possible.
  • collagen such as fibrillar collagen may be homogenized as it is or may be homogenized in an aqueous medium such as physiological saline.
  • the diameter and length of fragmented collagen can be determined by analyzing the individual fragmented collagen by electron microscopy.
  • the content of collagen in the three-dimensional tissue may be 0.01 to 90% by weight, preferably 10 to 90% by weight, more preferably 1 to 50% by weight based on the three-dimensional tissue. More preferably, it is 10 to 40% by weight, and may be 10 to 30% by weight.
  • collagen in a three-dimensional organized body means collagen constituting the three-dimensional organized body, which may be endogenous collagen or exogenous collagen. That is, the concentration of collagen constituting the three-dimensional tissue means the combined concentration of endogenous collagen and exogenous collagen.
  • the concentration of collagen in the three-dimensional tissue can be calculated from the volume of the obtained three-dimensional tissue and the mass of the decellularized three-dimensional tissue.
  • the content of collagen in a three-dimensional tissue can also be measured by a method using an antigen-antibody reaction such as ELISA or a chemical detection method such as QuickZyme.
  • the three-dimensional structure preferably has a remaining rate of 70% or more after treatment with trypsin at a concentration of 0.25% of trypsin, a temperature of 37 ° C., pH 7.4, and a reaction time of 15 minutes, and is 80% or more It is more preferable that the content be 90% or more.
  • the residual rate can be calculated, for example, from the mass of the three-dimensional tissue before and after trypsin treatment.
  • the three-dimensional structure preferably has a survival rate of 70% or more after collagenase treatment with a collagenase concentration of 0.25%, a temperature of 37 ° C., pH 7.4, and a reaction time of 15 minutes, and is 80% or more Some are more preferable, and 90% or more is even more preferable.
  • a three-dimensional assembly is stable because it is resistant to degradation by enzymes during or after culture.
  • the three-dimensional structure preferably has a thickness of 10 ⁇ m or more, more preferably 100 ⁇ m or more, and still more preferably 1000 ⁇ m or more.
  • a three-dimensional tissue body is a structure closer to a living tissue, and is suitable as a substitute for experimental animals and the like.
  • the upper limit of the thickness is not particularly limited, but may be, for example, 10 mm or less, 3 mm or less, 2 mm or less, or 1.5 mm or less. , 1 mm or less.
  • the thickness of the three-dimensional tissue body means the distance between both ends in the direction perpendicular to the main surface when the three-dimensional tissue body is in the form of a sheet or a rectangular parallelepiped.
  • the thickness means the distance at the thinnest portion of the main surface.
  • the three-dimensional tissue is spherical, it means its diameter.
  • the three-dimensional structure is an ellipsoid, it means its minor axis.
  • the thickness is the distance between two points at which the surface intersects a straight line passing through the center of gravity of the three-dimensional structure. Means the shortest distance.
  • the cells constituting the three-dimensional tissue may further include one or more other cells other than cardiomyocytes and collagen-producing cells.
  • the three-dimensional tissue may contain cells including cardiomyocytes and components other than collagen (other components).
  • Other components include, for example, elastin, collagen, proteoglycan, fibronectin, laminin and the like.
  • An abnormally pulsating myocardial model consisting of a three-dimensional tissue body can be applied as a substitute for experimental animals (eg, a heart disease model caused by abnormal pulsation of the myocardium), a myocardial infarction model, a myocardial fibrosis model, etc. is there.
  • the method for producing an abnormally beating cardiac muscle model comprises the steps of: contacting cells containing cardiomyocytes (hereinafter sometimes also simply referred to as “cells”) with exogenous collagen in an aqueous medium; And a culture step of culturing cells in contact with exogenous collagen, wherein the amount of exogenous collagen used in the contact step is 0 with respect to cells of 1.0 ⁇ 10 5 to 10.0 ⁇ 10 5 cells. .1 mg or more.
  • Aqueous medium means a liquid containing water as an essential component.
  • the aqueous medium is not particularly limited as long as exogenous collagen and cells can be stably present.
  • liquid medium such as physiological saline such as phosphate buffered saline (PBS), Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM), culture medium for vascular endothelial cells (EGM 2), etc. may be mentioned.
  • the liquid medium may be a mixed medium in which two types of medium are mixed. From the viewpoint of reducing the load on cells, the aqueous medium is preferably a liquid medium.
  • Contact process There is no particular limitation on the method of bringing the cells including cardiomyocytes into contact with the exogenous collagen in an aqueous medium.
  • a method of adding a dispersion of exogenous collagen to a culture solution containing cardiomyocytes a method of adding cells to a medium dispersion of exogenous collagen, or adding exogenous collagen and cardiomyocytes to an aqueous medium prepared in advance. The method is mentioned.
  • the cells may further contain collagen-producing cells.
  • the resulting three-dimensional tissue will be more stable and cells will be more uniformly distributed.
  • the details of the mechanism by which such a three-dimensional organization can be obtained are unknown, but are presumed as follows. First, cells contact and adhere to exogenous collagen. The cells then produce proteins (eg, collagen such as fibrillar collagen) which themselves constitute the extracellular matrix (ECM). The produced protein contacts and adheres on the exogenous collagen, thereby acting as a crosslinker between the exogenous collagens, and the structuring of fibrillar collagen and the like proceeds in an environment in which cells are uniformly present. As a result, a three-dimensional tissue structure which is stable and in which cells are uniformly distributed is obtained.
  • the above estimation does not limit the present invention.
  • fragmented collagen derived from exogenous collagen may be included as exogenous collagen.
  • exogenous collagen and the fragmented collagen those described above can be used.
  • the concentration of exogenous collagen in the aqueous medium in the contacting step can be appropriately determined in accordance with the shape, thickness, incubator size, etc. of the target three-dimensional tissue (abnormally pulsed myocardial model).
  • the concentration of exogenous collagen in the aqueous medium in the contacting step may be 0.1 to 90% by weight, or 1 to 30% by weight.
  • the amount of exogenous collagen used in the contacting step may be at least 0.1 mg per cell of 1.0 ⁇ 10 5 to 10.0 ⁇ 10 5 cells (cell count), 0.5 mg or more, 1 .0 mg or more, 2.0 mg or more, or 3.0 mg or more, 100 mg or less, or 50 mg or less.
  • the exogenous collagen has the above range and the above range with respect to 2.0 ⁇ 10 5 to 8.0 ⁇ 10 5 cells, 3.0 ⁇ 10 5 to 6.0 ⁇ 10 5 cells, or 5 ⁇ 10 5 cells. It may be added as follows.
  • the mass ratio of exogenous collagen to cells in the contacting step is preferably 1000: 1 to 1: 1, more preferably 900: 1 to 9: 1, and 500 It is even more preferable that it is from 1 to 10: 1.
  • the ratio of cardiomyocytes to collagen-producing cells (cell number) in the contacting step may be 99: 1 to 9: 1, or 80:20 to 50: It may be fifty.
  • the method may further include the step of settling the fragmented collagen and the cells together in an aqueous medium (precipitation step) during the contacting step or the culture step.
  • a specific method is not particularly limited, for example, a method of centrifuging a culture solution containing fragmented collagen and cells containing cardiac muscle cells can be mentioned.
  • the method for culturing the cells in contact with the fragmented collagen is not particularly limited, and can be carried out by a suitable culture method depending on the type of cells to be cultured.
  • the culture temperature may be 20 ° C to 40 ° C, or 30 ° C to 37 ° C.
  • the pH of the culture medium may be 6 to 8, or 7.2 to 7.4.
  • the culture time may be 1 day to 2 weeks, or 1 week to 2 weeks.
  • the medium is not particularly limited, and a suitable medium can be selected according to the type of cells to be cultured.
  • the medium include Eagle's MEM medium, DMEM, Modified Eagle medium (MEM), Minimum Essential medium, RPMI, and GlutaMax medium.
  • the medium may be a medium to which serum has been added, or may be a serum-free medium.
  • the culture medium may be a mixed culture medium in which two types of culture media are mixed.
  • the cell density in the culture medium in the culture step can be appropriately determined according to the shape, thickness, size of the incubator, etc. of the target abnormal beating myocardial model.
  • the cell density in the culture medium in the culture step may be 1 to 10 8 cells / ml, or 10 3 to 10 7 cells / ml.
  • the cell density in the culture medium in the culture step may be the same as the cell density in the aqueous medium in the contact step.
  • the contraction rate during culture of the three-dimensional tissue is preferably 20% or less, more preferably 15% or less, and still more preferably 10% or less.
  • the contraction rate can be calculated, for example, by the following equation.
  • L 1 represents the length of the longest part of the abnormal beating myocardium model on day 1 after culture
  • L 3 represents the length of the corresponding part in the three-dimensional tissue body on day 3 after culture .
  • Shrinkage rate (%) ⁇ (L 1 ⁇ L 3 ) / L 1 ⁇ ⁇ 100
  • the agent for forming an abnormally beating myocardium model is a forming agent for an abnormal beating model including fragmented collagen, and the average length of fragmented collagen is 100 nm to 200 ⁇ m, and the average of fragmented collagen is The diameter is 50 nm to 30 ⁇ m.
  • 95% of the total amount of fragmented collagen may be in the range of 100 nm to 200 ⁇ m.
  • 95% of the total amount of fragmented collagen may be in the range of 50 nm to 30 ⁇ m.
  • forming agent of an abnormal pulsatile cardiac muscle model is meant a reagent for producing an abnormal pulsatile cardiac muscle model.
  • the agent for forming the abnormal beating myocardium model may be in the form of powder, or may be in the form of a dispersion in which fragmented collagen is dispersed in an aqueous medium.
  • a method of producing fragmented collagen and a method of using the above-mentioned forming agent the same method as the method shown in the above (Method of producing an abnormal beating myocardium model) can be mentioned.
  • a method for evaluating the efficacy of a therapeutic agent for heart disease using an abnormally pulsatile cardiac muscle model comprising: administering a cardiac disease therapeutic agent to the abnormal pulsatile cardiac muscle model;
  • a method for evaluating the efficacy of a therapeutic agent for heart disease comprising: an evaluation step of evaluating the efficacy by the change in beating behavior of the administered abnormal heartbeat myocardial model.
  • a therapeutic agent for heart disease is administered to an abnormally beating myocardial model.
  • the heart disease therapeutic agent include heart failure therapeutic agents such as isoproterenol, ⁇ blockers, myocardial infarction therapeutic agents such as nitrates, and antiarrhythmics such as amiodarone.
  • Administration of the heart disease therapeutic agent may be carried out by using a medium containing the heart disease therapeutic agent as a culture medium for culturing the three-dimensional tissue, and the heart disease therapeutic agent is added to the culture medium for culturing the three-dimensional tissue. You may carry out by
  • the abnormally beating myocardium model to which a therapeutic agent for heart disease is administered may consist of a three-dimensional tissue cultured for one or more days, and may consist of a three-dimensional tissue cultured for five days or more, It may consist of a three-dimensional tissue cultured for six or more days, and may consist of a three-dimensional tissue cultured for more days.
  • the drug effect is evaluated by the change in the beating behavior of the abnormally beating myocardium model administered with a therapeutic agent for heart disease.
  • Efficacy can be evaluated using the behavior of pulsation as an index.
  • the behavior of the beat includes the beat interval, the beat rate, the beat power, the contraction and / or the relaxation rate, and the like.
  • the change in the behavior of the beat may be, for example, a change in the number of beats per unit time and / or a change in the beat interval (time between beats).
  • Efficacy may be evaluated based on a change in only one of the above-mentioned indicators, or may be evaluated on the basis of two or more of the above-mentioned indicators.
  • Evaluation of drug efficacy includes, for example, the beating behavior of an abnormally pulsating myocardial model consisting of a three-dimensional tissue body administered a therapeutic agent for heart disease, and an abnormal pulsation comprising a three-dimensional tissue body not receiving a therapeutic agent for cardiac disease It can be performed by comparing the behavior of pulsation with that in the absence of myocardial model administration.
  • the evaluation step may be performed multiple times. That is, evaluation of efficacy may be performed multiple times at predetermined intervals after administration of a therapeutic agent.
  • the beat per unit time of the abnormal pulsation myocardium model receiving the treatment for heart disease If the number is high, it may be evaluated as effective as a drug for treating heart failure, as compared with the number of beats per unit time of an abnormally beating myocardial model in which no drug for treating heart disease was administered. If the number of beats per unit time of the abnormally beating myocardial model in which the therapeutic agent is administered is low, it may be evaluated that it is not effective as a therapeutic agent for heart failure.
  • CMF fragmented collagen
  • Lyophilized pig skin-derived type I collagen manufactured by Nippon Ham Co., Ltd. is dispersed in 10-fold concentration phosphate buffered saline (X10 PBS), and homogenized for 2 minutes using a homogenizer to a diameter of about 20 ⁇ Fragmented collagen having a size of 30 ⁇ m and a length of about 100 to 200 ⁇ m was obtained ((A) in FIG. 1).
  • the diameter and length of fragmented collagen were determined by analyzing each fragmented collagen by electron microscopy.
  • the obtained fragmented collagen was washed with serum-free medium (DMEM) to obtain a medium dispersion of fragmented collagen.
  • DMEM serum-free medium
  • the obtained medium dispersion of fragmented collagen could be stored at room temperature for one week.
  • fragmented collagen obtained by the same method was used. Also, in the above method, when the homogenizing time is changed to 5 minutes, fragmented collagen having a diameter of about 950 nm to 16.8 ⁇ m and a length of about 9.9 ⁇ m to 78.6 ⁇ m was obtained (Table 1, (B) in FIG. From this result, it was found that the size of fragmented collagen can be controlled by adjusting the homogenization time.
  • Fragmented collagen was dispersed in a medium (DMEM) containing serum so that the concentration was 10 mg / ml, to prepare a dispersion containing fragmented collagen.
  • DMEM medium containing serum
  • Example 1 The three-dimensional structure was manufactured as shown in the schematic view shown in FIG. That is, the dispersion containing the above fragmented collagen, human cardiac fibroblasts (NHCF) and human iPS cell-derived cardiomyocytes (iPS-CM) (hereinafter, NHCF and iPS-CM are collectively referred to as “cells”. ) was added to a nonadherent 96 well round bottom plate to bring fragmented collagen into contact with cells (contacting step). The dispersion containing fragmented collagen was added so that the addition amount of fragmented collagen was 0.5 mg. NHCF and iPS-CM were mixed at a ratio of 25:75, and added so that the total number of cells was 5 ⁇ 10 5 cells.
  • FIG.2 Three-dimensional tissue 1 was spherical and had a diameter of about 1.0 mm after 21 days of culture.
  • a dark colored part indicates collagen fiber
  • a weak colored part indicates cytoplasm (hereinafter referred to as FIG. 2 (B), (D) and (E). The same applies to the above.
  • Example 2 A three-dimensional organized body 2 was produced in the same manner as in Example 1 except that the dispersion containing fragmented collagen was added so that the addition amount of fragmented collagen was 1.0 mg.
  • the observation result of the Masson's trichrome stained three-dimensional tissue 2 with a phase contrast microscope is shown in FIG. 2 (D).
  • the three-dimensional tissue 2 was spherical, and the diameter after 21 days of culture was about 1.2 mm.
  • Example 3 A three-dimensional organized body 3 was obtained in the same manner as in Example 1 except that the dispersion containing fragmented collagen was added so that the addition amount of fragmented collagen was 1.5 mg.
  • the observation result of the three-dimensional tissue body 3 stained with Masson's trichrome with a phase contrast microscope is shown in FIG. 2 (E).
  • the three-dimensional tissue 3 was spherical, and the diameter after 21 days of culture was about 1.6 mm.
  • Example 4 A three-dimensional organized body 4 was obtained in the same manner as in Example 1 except that the dispersion containing fragmented collagen was added so that the addition amount of fragmented collagen was 3.0 mg.
  • the diameter of the three-dimensional tissue 4 after 7 days of culture was about 4 mm.
  • Example 5 A three-dimensional organized body 5 was obtained in the same manner as Example 1, except that the dispersion containing fragmented collagen was added so that the addition amount of fragmented collagen was 5.0 mg.
  • the diameter of the three-dimensional construct 5 after 7 days of culture was about 5 mm.
  • Comparative three-dimensional tissue 1 was obtained in the same manner as in Example 1 except that the dispersion containing fragmented collagen was not added. The observation result of the comparison three-dimensional tissue 1 stained with Masson's trichrome by a phase contrast microscope is shown in FIG. 2 (B). Comparative three-dimensional tissue 1 was spherical and had a diameter of about 0.9 mm after 21 days of culture.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining the evaluation method of the pulsation interval and the pulsation power of the myocardial model.
  • the center of gravity of the myocardial model moves in response to the beat.
  • the moving distance of the center of gravity when the cardiac muscle model contracts (the distance from the center of gravity shown in FIG. 3A to the center of gravity shown in FIG. 3B) and the moving distance of the center of gravity when the cardiac muscle model relaxes after contracting (FIG. 3) Evaluation was performed by measuring the distance from the center of gravity shown in (B) to the center of gravity shown in (C). The results are shown in FIGS.
  • FIG. 4 (A) shows the beating behavior of the myocardial model of Example 2 obtained by adding 1.0 mg of fragmented collagen.
  • FIG. 4 (B) shows the observation start time (0 second), contraction time (0.67 time) and relaxation time (1.27 second time).
  • FIG. 5 (B) shows the beating behavior of a myocardial model obtained by adding 0 mg, 1.0 mg and 2.0 mg of fragmented collagen.
  • the beat (pulse time interval and beat power) of the obtained myocardial model changes irregularly as compared with the case where it is not added.
  • the beat power of the obtained myocardial model was reduced when collagen was added.
  • FIG. 5 (A) in the myocardial model which did not add collagen, the behavior of pulsation was close to normal.
  • FIGS. 6 and 8 show the beating behavior of the myocardial model in which the amount of fragmented collagen used is 0, 1, 3 and 5 mg, respectively.
  • FIG. 7A shows the interval between the broken lines shown in FIGS. 6A to 6D (that is, the difference between one contraction-relaxation completion to the next contraction-relaxation completion time) (unit: second) The result of the average beating interval calculated from is shown.
  • FIG. 7 (B) shows the average of standard deviations (S.D.) from 4 to 7 days of culture period (an indicator of pulsation irregularity).
  • FIG. 9 shows the interval between contraction and relaxation of the myocardial model calculated from the interval shown by the arrows in FIG.
  • FIG. 10 shows the results of measurement of the beating interval according to the number of days of culture, for myocardial models in which the amount of fragmented collagen used is 0, 1, 3, and 5 mg.
  • the myocardial model obtained by adding the fragmented collagen had a short mean beat interval (ie, a greater number of beats per unit time).
  • FIG. 7 (B) when 1 mg or 5 mg of fragmented collagen was added, the time interval of beats changed more irregularly.
  • FIG. 9 in the myocardial model obtained by adding the fragmented collagen, the time required for one contraction and relaxation became longer (ie, the pulsation rate per one time decreased).
  • the myocardial model manufactured by adding fragmented collagen is similar to the model which developed the disease. The pulsation behavior for each collagen amount is shown in FIG. In FIG.
  • CMF fragmented collagen
  • CMF concentration 9.8 mg / mL
  • the dispersion was weighed from CMF dispersion medium to CMF 0, 1, 2, 3 mg, mixed with 5 ⁇ 10 5 cells of iPS-CM 75% / NHCF 25%, and seeded on a 96-well round bottom non-adherent plate (medium volume 300 ⁇ L) ). Then, it was centrifuged at 1100 g for 5 minutes to precipitate CMF and cells. After centrifugation, the cells were cultured in a 37 ° C. incubator. Medium change was performed by removing old medium once every two days and adding 300 ⁇ L of fresh medium.
  • the above kit is a commercially available kit including DNeasy Mini Spin Column, collection tube, Buffer ATL, Buffer AL, Buffer AW1, Buffer AW2, Buffer AE, Proteinase K, etc. DNA was measured according to the following procedure.
  • the sample to be measured was placed in a 1.5 mL Eppendorf tube, and 180 ⁇ L of Buffer ATL was placed. To this, 20 ⁇ L of proteinase K was added, vortexed and incubated at 56 ° C. until the tissue was completely dissolved (overnight). Then, the mixture was vortexed for 15 seconds, Buffer AL and ethanol were mixed in equal amounts, 400 ⁇ L was added to one sample, and vortexing was performed. The solution was added into a DNeasy Mini Spin Column (hereinafter sometimes simply referred to as a column), and centrifuged at 8000 rpm for 1 min.
  • DNeasy Mini Spin Column hereinafter sometimes simply referred to as a column
  • the filtrate and collection tube were discarded, the column was transferred to a new collection tube, and 500 ⁇ L of Buffer AW1 was added. Thereafter, it was centrifuged at 8000 rpm for 1 min. The filtrate and collection tube were discarded, the column was transferred to a new collection tube and 500 ⁇ L of Buffer AW2 was added. After centrifugation at 14000 rpm for 3 min, the DNeasy membrane was completely dried. The filtrate and collection tube were discarded, the column was transferred to an Eppendorf tube (step 1), 200 ⁇ L of Buffer AE was added directly onto the DNeasy membrane (step 2) and incubated for 1 min at room temperature (step 3). Then, it centrifuged at 8000 rpm and 1 min conditions (operation 4). After repeating the steps 1 to 4, the collected filtrate was combined to 400 ⁇ L. This was measured by Nanodrop.
  • the results of the rate of change in the amount of DNA are shown in FIG.
  • FIG. 11 As a result of culturing for 7 days, the number of cells in the three-dimensional tissue using CMF increased more than that in the case where CMF was not used. By adding CMF and culturing, it is considered that more cells were alive or cells were alive longer. From the results in FIGS. 10 and 11, the three-dimensional tissue using CMF exhibits beating behavior similar to that at the initial stage of culture, even in the case of a long period (at least 7 days), and the cell survival rate is also CMF. Was higher compared to the construct (spheroid) that did not use. As a result, the myocardial model consisting of a three-dimensional tissue using CMF can be evaluated for efficacy over a long period of time due to the large number of cells or long survival.
  • the beats of the tissue after culture for 5 to 6 days were photographed using a SONY Motion analyzer, and the number of beats was measured.
  • the inside of the microscope was kept at 37 ° C. and photographed for 15 to 20 seconds.
  • the plate was once removed from the microscope to remove the medium, and 300 ⁇ L of DMEM (drug-free tissue) or 300 ⁇ L of 100 nM isoproterenol mixed DMEM was added, respectively, and returned to the microscope again and incubated at 37 ° C.
  • DMEM drug-free tissue
  • 300 ⁇ L of 100 nM isoproterenol mixed DMEM was added, respectively, and returned to the microscope again and incubated at 37 ° C.
  • Each beat was similarly photographed after incubation for 30, 60 and 80 minutes, and the number of beats was counted.
  • Rate of change in pulse rate (%) (beat rate after each time of drug-added tissue / pulse rate before drug addition of drug-added tissue) / (beat rate after each time of drug-free tissue / Number of beats before medium change of tissue without drug addition) ⁇ 100
  • FIG. 12 shows the results of the rate of change in pulse rate.
  • the amount of CMF used was 0 mg, the drug responsiveness was bad, and when the amount of CMF used was 1 mg and 3 mg, the drug responsiveness was shown.
  • the myocardial model in which CMF was used at 1 mg showed better drug responsiveness.

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Abstract

本発明は心筋細胞を含む細胞と、コラーゲンと、を含有し、細胞の少なくとも一部がコラーゲンに接着している三次元組織体からなる、異常拍動心筋モデルに関する。

Description

異常拍動心筋モデル及びその製造方法、異常拍動心筋モデルの形成剤並びに心疾患治療薬の薬効評価方法
　本発明は、異常拍動心筋モデル及びその製造方法、異常拍動心筋モデルの形成剤並びに心疾患治療薬の薬効評価方法に関する。
　近年、生体外で細胞の三次元組織体を構築する技術が開発されている。このような三次元組織体は、実験動物の代替品として利用可能な生体組織モデル等に適用することができる。特許文献１及び２には、コラーゲンを足場として用いて作製された心筋細胞の三次元組織体が開示されている。
Ａｒｔｉｆ　Ｏｒｇａｎｓ，２０１２，Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．９，ｐｐ．８１６－８１９ Ｊ．ｏｆ　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．　Ｔｒａｎｓ．　Ｒｅｓ．，２０１７，１０，ｐｐ．１１６－１２７
　本発明は、新規な異常拍動心筋モデル及びその製造方法、並びに、当該異常拍動心筋モデルの製造に用いることができる形成剤を提供することを目的とする。
　本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、以下に示す発明によって、上記課題が解決できることを見出した。
［１］心筋細胞を含む細胞と、コラーゲンと、を含有し、当該細胞の少なくとも一部がコラーゲンに接着している三次元組織体からなる、異常拍動心筋モデル。
［２］細胞が、コラーゲン産生細胞を更に含有する、［１］に記載の異常拍動心筋モデル。
［３］コラーゲンの含有率が、三次元組織体を基準として１０重量％～３０重量％である、［１］又は［２］に記載の異常拍動心筋モデル。
［４］コラーゲンが外因性コラーゲンを含む、［１］～［３］のいずれかに記載の異常拍動心筋モデル。
［５］コラーゲンが外因性コラーゲンに由来する断片化コラーゲンを含む、［１］～［４］のいずれかに記載の異常拍動心筋モデル。
［６］水性媒体中において、心筋細胞を含む細胞と外因性コラーゲンとを接触させる接触工程、及び
　外因性コラーゲンが接触した上記細胞を培養する培養工程、を含み、
　接触工程における外因性コラーゲンの使用量が、１．０×１０５～１０．０×１０５ｃｅｌｌｓの細胞に対して、０．１ｍｇ以上である、異常拍動心筋モデルの製造方法。
［７］上記細胞が、コラーゲン産生細胞を更に含む、［６］に記載の異常拍動心筋モデルの製造方法。
［８］外因性コラーゲンとして、断片化コラーゲンを含有する、［７］に記載の製造方法。
［９］断片化コラーゲンの平均長が１００ｎｍ～２００μｍである、［８］に記載の製造方法。
［１０］断片化コラーゲンの平均径が５０ｎｍ～３０μｍである、［８］又は［９］に記載の製造方法。
［１１］接触工程又は培養工程の間に、水性媒体中における外因性コラーゲンと細胞とを共に沈降させる工程を更に含む、［６］～［１０］のいずれかに記載の製造方法。
［１２］外因性コラーゲンと、上記細胞との質量比が、９００：１～９：１である、［６］～［１１］のいずれかに記載の製造方法。
［１３］断片化コラーゲンを含む、異常拍動心筋モデルの形成剤であって、
　断片化コラーゲンの平均長が１００ｎｍ～２００μｍであり、断片化コラーゲンの平均径が５０ｎｍ～３０μｍである、異常拍動心筋モデルの形成剤。
［１４］［１］～［５］のいずれかに記載の異常拍動心筋モデルを用いた心疾患治療薬の薬効評価方法であって、心疾患治療薬を異常拍動心筋モデルに投与する投与工程と、心疾患治療薬を投与した異常拍動心筋モデルの拍動の挙動の変化により薬効を評価する評価工程と、を含む、心疾患治療薬の薬効評価方法。
［１５］評価工程において、心疾患治療薬を投与しなかった異常拍動心筋モデルの単位時間あたりの拍動数と比較して、心疾患治療薬を投与した異常拍動心筋モデルの単位時間あたりの拍動数が多かった場合には、心不全治療薬として効果があると評価し、心疾患治療薬を投与しなかった異常拍動心筋モデルの単位時間あたりの拍動数と比較して、心疾患治療薬を投与した異常拍動心筋モデルの単位時間あたりの拍動数が少なかった場合には、心不全治療薬として効果がないと評価する、［１４］に記載の心疾患治療薬の薬効評価方法。
［１６］評価工程が複数回行われる、［１４］又は［１５］に記載の心疾患治療薬の薬効評価方法。
　本発明によれば、新規な異常拍動心筋モデル及びその製造方法、並びに、当該異常拍動心筋モデルの製造に用いることができる形成剤を提供することが可能になる。
２分間ホモジナイズすることで得られた断片化コラーゲンを示す写真（Ａ）、及び５分間ホモジナイズすることで得られた断片化コラーゲンの長さの分布を示すヒストグラム（Ｂ）である。 断片化コラーゲン、ヒト心臓線維芽細胞（ＮＨＣＦ）及びｉＰＳ細胞由来心筋細胞（ｉＰＳ－ＣＭ）を含む心筋モデル（三次元組織体）の製造工程を示す模式図と、ヒト心臓線維芽細胞（ＮＨＣＦ）及びｉＰＳ細胞由来心筋細胞（ｉＰＳ－ＣＭ）を含む三次元組織体をマッソントリクローム染色した写真である。 心筋モデルの評価方法を説明するための写真及びグラフである。 心筋モデルの拍動挙動の評価結果を示すグラフ及び写真である。 心筋モデルの拍動挙動の評価結果を示すグラフである。 心筋モデルの拍動挙動の評価結果を示すグラフである。 心筋モデルの拍動挙動の評価結果を示すグラフである。 心筋モデルの拍動挙動の評価結果を示すグラフである。 心筋モデルの拍動挙動の評価結果を示すグラフである。 心筋モデルの拍動挙動の評価結果を示すグラフである。 断片化コラーゲン量に対する細胞生存率の変化の評価結果を示すグラフである。 イソプロテレノール添加後の心筋モデルの拍動数変化の評価結果を示すグラフである。
　以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
＜異常拍動心筋モデル＞
　本実施形態に係る異常拍動心筋モデルは、心筋細胞を含む細胞（以下、場合により、単に「細胞」ともいう。）と、コラーゲンと、を含有し、細胞の少なくとも一部がコラーゲンに接着している三次元組織体からなる。
　「異常拍動心筋モデル」とは、心筋細胞を含む、三次元組織体からなり、正常な心筋モデルと比較して、拍動の挙動が異常である心筋モデルをいう。拍動の挙動としては、拍動間隔、拍動数、拍動力、収縮及び／又は弛緩速度、等が挙げられる。異常拍動心筋モデルは、拍動の挙動が不規則に変化するものであってもよく、正常な心筋モデルと比べ、拍動が亢進、又は抑制されているものであってよい。異常拍動心筋モデルは、心筋の異常拍動に起因する心疾患モデル（例えば、心不全モデル、不整脈モデル、心筋梗塞モデル等）として用いることができる。
　ここで、「三次元組織体」とは、線維性コラーゲン等のコラーゲンを介して細胞が三次元的に配置されている細胞の集合体であって、細胞培養によって人工的に作られる集合体を意味する。三次元組織体の形状には特に制限はなく、例えば、シート状、球体状、楕円体状、直方体状等が挙げられる。ここで、生体組織は、血管等を含み、構成が三次元組織体より複雑である。そのため、三次元組織体と生体組織とは容易に区別可能である。
　三次元組織体は、心筋細胞を含む細胞を含有する。心筋細胞において、由来とする動物種としては、ヒト、ブタ、ウシ、マウス等が挙げられる。例えば、心筋細胞は、ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞（ｉＰＳ－ＣＭ）、マウスｉＰＳ由来心筋細胞、又は、ＥＳ細胞由来心筋細胞であってよい。ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞は、例えば、理研セルバンク、タカラバイオなどにより入手したものを用いることができる。また、初期化させる試薬は、リプロセル等からも購入できるため、ｉＰＳ細胞を自作してもよい。
　心筋細胞の含有率は、三次元組織体を基準として、５～９５質量％であってよく、２５％～７５質量％であってよい。
　心筋細胞を含む細胞は、コラーゲン産生細胞を更に含んでいてよい。つまり、三次元組織体は、内因性コラーゲンを含んでいてよい。
　ここで、「コラーゲン産生細胞」とは、線維性コラーゲン等のコラーゲンを分泌する細胞を意味する。コラーゲン産生細胞において、由来とする動物種としては、例えば、ヒト、ブタ、ウシ、マウス等が挙げられるコラーゲン産生細胞としては、線維芽細胞（例えば、ヒト皮膚由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ）、ヒト心臓線維芽細胞（ＮＨＣＦ）、ヒト筋線維芽細胞）、軟骨細胞、骨芽細胞等の間葉系細胞が挙げられ、好ましくは、線維芽細胞である。好ましい線維芽細胞としては、例えば、ヒト心臓線維芽細胞（ＮＨＣＦ）又はヒト筋線維芽細胞が挙げられる。
　なお、「内因性コラーゲン」とは、コラーゲン産生細胞が産生するコラーゲンを意味する。内因性コラーゲンは、線維性コラーゲンであってもよいし、非線維性コラーゲンであってもよい。
　三次元組織体は、コラーゲンを含有する。コラーゲンとしては、例えば、線維性コラーゲン又は非線維性コラーゲンが挙げられる。線維性コラーゲンとは、コラーゲン線維の主成分となるコラーゲンを意味し、具体的には、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン等が挙げられる。非線維性コラーゲンとしては、例えば、ＩＶ型コラーゲンが挙げられる。
　三次元組織体は、心筋細胞を含む細胞の少なくとも一部がコラーゲンに接着している。
　三次元組織体に含まれるコラーゲンは、外因性コラーゲンを含んでいてよい。コラーゲンは、好ましくは、外因性コラーゲンに由来する断片化コラーゲンを含む。
　「外因性コラーゲン」とは、外部から供給されるコラーゲンを意味し、具体的には、線維性コラーゲン、非線維性コラーゲン等が挙げられる。外因性コラーゲンにおいて、由来となる動物種は、内因性コラーゲンと同じであっても異なっていてもよい。外因性コラーゲンにおいて、由来となる動物種としては、例えば、ヒト、ブタ、ウシ等が挙げられる。また、外因性コラーゲンは、人工のコラーゲンであってもよい。外因性コラーゲンは、線維性コラーゲンであることが好ましい。上記線維性コラーゲンとしては、例えば、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲンが挙げられ、好ましくはＩ型コラーゲンである。上記線維性コラーゲンは、市販されているコラーゲンを用いてもよく、その具体例としては、日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲン凍結乾燥体が挙げられる。外因性の非線維性コラーゲンとしては、例えば、ＩＶ型コラーゲンが挙げられる。
　外因性コラーゲンにおいて、由来する動物種は、心筋細胞及びこれを含む細胞とは異なっていてよい。また、心筋細胞を含む細胞が、コラーゲン産生細胞を含む場合、外因性コラーゲンにおいて、由来する動物種は、コラーゲン産生細胞とは異なっていてよい。つまり、外因性コラーゲンは、異種コラーゲンであってよい。
　「断片化コラーゲン」とは、線維性コラーゲン等のコラーゲンを断片化したものであって、三重らせん構造を維持しているものを意味する。断片化コラーゲンの由来となるコラーゲンは、一種類であってもよいし、複数種のコラーゲンを併用してもよい。従来、線維性コラーゲン等のコラーゲンは酸性の水溶液等に溶かしていたが、濃度は０．１～０．３重量％程度であり多く溶かすことはできなかった。そのため従来の方法では三次元組織体における線維性コラーゲン等のコラーゲンの量を多くすることが困難であった。断片化コラーゲンは水にほとんど溶解しないが、水性媒体に分散することにより、水性媒体中で細胞と接触しやすくなり、三次元組織体の形成を促進すると推測される。
　断片化コラーゲンの平均長は、１００ｎｍ～２００μｍであることが好ましく、２２μｍ～２００μｍであることがより好ましく、１００μｍ～２００μｍであることがさらに好ましい。断片化コラーゲンの平均径は、５０ｎｍ～３０μｍであることが好ましく、４μｍ～３０μｍであることがより好ましく、２０μｍ～３０μｍであることがさらに好ましい。
　線維性コラーゲン等のコラーゲンを断片化する方法は、特に制限はなく、例えば、超音波式ホモジナイザー、撹拌式ホモジナイザー、及び高圧式ホモジナイザー等のホモジナイザーを用いて線維性コラーゲン等のコラーゲンを断片化してもよい。撹拌式ホモジナイザーを用いる場合、線維性コラーゲン等のコラーゲンをそのままホモジナイズしてもよいし、生理食塩水等の水性媒体中でホモジナイズしてもよい。また、ホモジナイズする時間、回数等を調整することでミリメートルサイズ、ナノメートルサイズの断片化コラーゲンを得ることも可能である。
　断片化コラーゲンの直径及び長さは、電子顕微鏡によって個々の断片化コラーゲンを解析することによって求めることが可能である。
　三次元組織体におけるコラーゲンの含有率は、三次元組織体を基準として０．０１～９０重量％であってよく、好ましくは１０～９０重量％であり、より好ましくは１～５０重量％であり、更に好ましくは１０～４０重量％であり、１０～３０重量％であってよい。ここで、「三次元組織体におけるコラーゲン」とは、三次元組織体を構成するコラーゲンを意味し、内因性コラーゲンであってもよいし、外因性コラーゲンであってもよい。すなわち、三次元組織体を構成するコラーゲンの濃度は、内因性コラーゲン及び外因性コラーゲンを合わせた濃度を意味する。三次元組織体におけるコラーゲンの濃度は、得られた三次元組織体の体積、及び脱細胞化した三次元組織体の質量から算出することが可能である。また、三次元組織体におけるコラーゲンの含有率は、ＥＬＩＳＡ等の抗原抗体反応を利用した方法又はＱｕｉｃｋＺｙｍｅ等の化学的検出方法により測定することもできる。
　三次元組織体は、トリプシンの濃度０．２５％、温度３７℃、ｐＨ７．４、反応時間１５分でトリプシン処理を行った後の残存率が７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることが更に好ましい。このような三次元組織体は、培養中又は培養後において酵素による分解が起きにくく、安定である。上記残存率は、例えば、トリプシン処理の前後における三次元組織体の質量から算出できる。
　三次元組織体は、コラゲナーゼの濃度０．２５％、温度３７℃、ｐＨ７．４、反応時間１５分でコラゲナーゼ処理を行った後の残存率が７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることが更により好ましい。このような三次元組織体は、培養中又は培養後における酵素による分解が起きにくく、安定である。
　三次元組織体は、厚さが１０μｍ以上であることが好ましく、１００μｍ以上であることがより好ましく、１０００μｍ以上であることが更に好ましい。このような三次元組織体は、生体組織により近い構造であり、実験動物の代替品等として好適なものとなる。厚さの上限は、特に制限されないが、例えば、１０ｍｍ以下であってもよいし、３ｍｍ以下であってもよいし、２ｍｍ以下であってもよいし、１．５ｍｍ以下であってもよいし、１ｍｍ以下であってもよい。
　ここで、「三次元組織体の厚さ」とは三次元組織体がシート状、又は直方体状である場合、主面に垂直な方向における両端の距離を意味する。上記主面に凹凸がある場合、厚さは上記主面の最も薄い部分における距離を意味する。
　また、三次元組織体が球体状である場合、その直径を意味する。さらにまた、三次元組織体が楕円体状である場合、その短径を意味する。三次元組織体が略球体状又は略楕円体状であって表面に凹凸がある場合、厚さは、三次元組織体の重心を通る直線と上記表面とが交差する２点間の距離であって最短の距離を意味する。
　三次元組織体を構成する細胞は、心筋細胞及びコラーゲン産生細胞以外の、一種又は複数種の他の細胞を更に含んでもよい。
　三次元組織体は、心筋細胞を含む細胞、及びコラーゲン以外の成分（他の成分）含んでいてよい。他の成分としては、例えば、エラスチン、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン等が挙げられる。
　三次元組織体からなる異常拍動心筋モデルは、実験動物の代替品（例えば、心筋の異常拍動に起因する心疾患モデル）、心筋梗塞モデル、心筋線維症モデル等として適用することが可能である。
＜異常拍動心筋モデルの製造方法＞
　本実施形態に係る異常拍動心筋モデルの製造方法は、水性媒体中において、心筋細胞を含む細胞（以下、場合により、単に「細胞」ともいう。）と外因性コラーゲンとを接触させる接触工程、及び、外因性コラーゲンが接触した細胞を培養する培養工程、を含み、接触工程における外因性コラーゲンの使用量が、１．０×１０５～１０．０×１０５ｃｅｌｌｓの細胞に対して、０．１ｍｇ以上である。
　「水性媒体」とは、水を必須構成成分とする液体を意味する。水性媒体としては、外因性コラーゲン及び細胞が安定に存在できるものであれば、特に制限はない。例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の生理食塩水、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）、血管内皮細胞専用培地（ＥＧＭ２）等の液体培地が挙げられる。液体培地は、二種類の培地を混合した混合培地であってもよい。細胞に対する負荷を軽減する観点から、水性媒体は液体培地であることが好ましい。
（接触工程）
　水性媒体中において、心筋細胞を含む細胞と、外因性コラーゲンとを接触させる方法としては、特に制限はない。例えば、心筋細胞を含む培養液に、外因性コラーゲンの分散液を加える方法、外因性コラーゲンの培地分散液に細胞を加える方法、又は予め用意した水性媒体に、外因性コラーゲン及び心筋細胞をそれぞれ加える方法が挙げられる。
　接触工程においては、細胞がコラーゲン産生細胞を更に含んでいてよい。この場合、得られる三次元組織体がより安定になり、細胞がより均一に分布することとなる。このような三次元組織体が得られるメカニズムの詳細は不明であるが、以下のように推測される。まず細胞が外因性コラーゲン上に接触して接着する。その後、細胞は自分自身で細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を構成するタンパク質（例えば、線維性コラーゲン等のコラーゲン）を産生する。産生されたタンパク質は外因性コラーゲン上に接触して接着することで、外因性コラーゲン間の架橋剤として働き、細胞が均一に存在する環境下で線維性コラーゲン等の構造化が進む。その結果、安定で、細胞が均一に分布している三次元組織体が得られる。ただし、上記推測は本発明を限定するものではない。
　接触工程では、外因性コラーゲンとして、外因性コラーゲンに由来する断片化コラーゲンを含んでいてよい。外因性コラーゲン及び断片化コラーゲンとしては、上述のものを用いることができる。
　接触工程における水性媒体中の外因性コラーゲンの濃度は、目的とする三次元組織体（異常拍動心筋モデル）の形状、厚さ、培養器のサイズ等に応じて適宜決定できる。例えば、接触工程における水性媒体中の外因性コラーゲンの濃度は、０．１～９０重量％であってもよいし、１～３０重量％であってもよい。
　接触工程における外因性コラーゲンの使用量は、１．０×１０５～１０．０×１０５ｃｅｌｌｓ（細胞数）の細胞に対して、０．１ｍｇ以上であればよく、０．５ｍｇ以上、１．０ｍｇ以上、２．０ｍｇ以上又は３．０ｍｇ以上であってもよいし、１００ｍｇ以下、又は、５０ｍｇ以下であってもよい。外因性コラーゲンは、２．０×１０５～８．０×１０５ｃｅｌｌｓ、３．０×１０５～６．０×１０５ｃｅｌｌｓ、又は５×１０５ｃｅｌｌｓの細胞に対して、上記範囲となるように添加してもよい。
　接触工程における外因性コラーゲンと、細胞との質量比（外因性コラーゲン：細胞）が、１０００：１～１：１であることが好ましく、９００：１～９：１であることがより好ましく、５００：１～１０：１であることが更により好ましい。
　心筋細胞とコラーゲン産生細胞とを共に用いる場合、接触工程における、心筋細胞：コラーゲン産生細胞の比（細胞数）は、９９：１～９：１であってもよいし、８０：２０～５０：５０であってもよい。
　接触工程又は培養工程の間に、水性媒体中における断片化コラーゲンと細胞とを共に沈降させる工程（沈降工程）を更に含んでもよい。このような工程を行うことで、三次元組織体における外因性コラーゲン及び細胞の分布が、より均一になる。具体的な方法としては、特に制限はないが、例えば、断片化コラーゲンと心筋細胞を含む細胞とを含有する培養液を遠心操作する方法が挙げられる。
（培養工程）
　断片化コラーゲンが接触した細胞を培養する方法は、特に制限はなく、培養する細胞の種類に応じて好適な培養方法で行うことができる。例えば、培養温度は２０℃～４０℃であってもよく、３０℃～３７℃であってもよい。培地のｐＨは、６～８であってもよく、７．２～７．４であってもよい。培養時間は、１日～２週間であってもよく、１週間～２週間であってもよい。
　培地は特に制限はなく、培養する細胞の種類に応じて好適な培地を選択できる。培地としては、例えば、Ｅａｇｌｅ’ｓ　ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ培地（ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地、ＲＰＭＩ、及びＧｌｕｔａＭａｘ培地等が挙げられる。培地は、血清を添加した培地であってもよいし、無血清培地であってもよい。培地は、二種類の培地を混合した混合培地であってもよい。
　培養工程における培地中の細胞密度は、目的とする異常拍動心筋モデルの形状、厚さ、培養器のサイズ等に応じて適宜決定できる。例えば、培養工程における培地中の細胞密度は、１～１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌであってもよいし、１０３～１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌであってもよい。また、培養工程における培地中の細胞密度は、接触工程における水性媒体中の細胞密度と同じであってもよい。
　三次元組織体は、培養中の収縮率が２０％以下であることが好ましく、１５％以下であることがより好ましく、１０％以下であることがさらに好ましい。上記収縮率は、例えば、以下の式で算出できる。式中Ｌ１は、培養後１日目の異常拍動心筋モデルのもっとも長い部分の長さを示し、Ｌ３は、培養後３日目の三次元組織体における対応する部分の長さを示す。
　収縮率（％）＝｛（Ｌ１―Ｌ３）／Ｌ１｝×１００
＜異常拍動心筋モデルの形成剤＞
　本実施形態に係る異常拍動心筋モデルの形成剤は、断片化コラーゲンを含む、異常拍動モデルの形成剤であって、断片化コラーゲンの平均長が１００ｎｍ～２００μｍであり、断片化コラーゲンの平均径が５０ｎｍ～３０μｍである。また、断片化コラーゲンの長さについて、断片化コラーゲン全体のうち９５％が１００ｎｍ～２００μｍの範囲にあってもよい。さらに、断片化コラーゲンの直径について、断片化コラーゲン全体のうち９５％が５０ｎｍ～３０μｍの範囲にあってもよい。
　「異常拍動心筋モデルの形成剤」とは、異常拍動心筋モデルを製造するための試薬を意味する。異常拍動心筋モデルの形成剤は、粉末の状態であってもよいし、水性媒体に断片化コラーゲンが分散した分散液の状態であってもよい。断片化コラーゲンの製造方法及び上記形成剤の使用方法としては、上記（異常拍動心筋モデルの製造方法）において示されている方法と同様の方法が挙げられる。
＜心疾患治療薬の薬効評価方法＞
　本発明の一実施形態として、異常拍動心筋モデルを用いた心疾患治療薬の薬効評価方法であって、心疾患治療薬を異常拍動心筋モデルに投与する投与工程と、心疾患治療薬を投与した異常拍動心筋モデルの拍動の挙動の変化により薬効を評価する評価工程と、を含む、心疾患治療薬の薬効評価方法が提供される。本実施形態によれば、心筋細胞の拍動に影響を与える心疾患治療薬の薬効を効果的に評価することができる。
　投与工程では、心疾患治療薬を異常拍動心筋モデルに投与する。心疾患治療薬としては、例えば、イソプロテレノール等の心不全治療薬、β遮断薬、硝酸薬等の心筋梗塞治療薬、アミオダロン等の抗不整脈等が挙げられる。
　心疾患治療薬の投与は、三次元組織体を培養する培地として心疾患治療薬を含有する培地を用いることにより実施してもよく、三次元組織体を培養する培地に心疾患治療薬を添加することにより実施してもよい
　心疾患治療薬を投与する異常拍動心筋モデルは、１日以上培養された三次元組織体からなるものであってよく、５日以上培養された三次元組織体からなるものであってよく、６日以上培養された三次元組織体からなるものであってよく、それ以上の日数培養された三次元組織体からなるものであってよい。
　評価工程では、心疾患治療薬を投与した異常拍動心筋モデルの拍動の挙動の変化により薬効を評価する。薬効は、拍動の挙動を指標として評価することができる。拍動の挙動としては、拍動間隔、拍動数、拍動力、収縮及び／又は弛緩速度等が挙げられる。拍動の挙動の変化は、例えば、単位時間当たりの拍動数の変化及び／又は拍動間隔（拍動間の時間）の変化であってよい。薬効は、上記指標１種のみの変化に基づいて評価してもよいし、上記指標の２種以上に基づいて評価してもよい。
　薬効の評価は、例えば、心疾患治療薬を投与した三次元組織体からなる異常拍動心筋モデルの拍動の挙動と、心疾患治療薬を投与しなかった三次元組織体からなる異常拍動心筋モデル投与しなかった場合との拍動の挙動を比較することにより、行うことができる。
　評価工程は、複数回行われてよい。すなわち、薬効の評価は、治療薬の投与後、所定の間隔ごとに複数回行われてもよい。
　評価工程では、心疾患治療薬を投与しなかった異常拍動心筋モデルの単位時間あたりの拍動数と比較して、心疾患治療薬を投与した異常拍動心筋モデルの単位時間あたりの拍動数が多かった場合には、心不全治療薬として効果があると評価してよく、心疾患治療薬を投与しなかった異常拍動心筋モデルの単位時間あたりの拍動数と比較して、心疾患治療薬を投与した異常拍動心筋モデルの単位時間あたりの拍動数が少なかった場合には、心不全治療薬として効果がないと評価してよい。
＜Ｉ型コラーゲンを用いた断片化コラーゲン（ＣＭＦ）の製造＞
　日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲン凍結乾燥体を１０倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水（Ｘ１０　ＰＢＳ）に分散し、ホモジナイザーを用いて２分間ホモジナイズすることで、直径が約２０～３０μｍであり、長さが約１００～２００μｍである断片化コラーゲンを得た（図１の（Ａ））。断片化コラーゲンの直径及び長さは電子顕微鏡によって個々の断片化コラーゲンを解析することで求めた。得られた断片化コラーゲンを無血清培地（ＤＭＥＭ）で洗浄し、断片化コラーゲンの培地分散液を得た。得られた断片化コラーゲンの培地分散液は、室温で１週間保存できた。後述する各異常拍動心筋モデル（三次元組織体）の製造においては、同様の方法で得られた断片化コラーゲンを用いた。
　また、上記方法において、ホモジナイズする時間を５分間に変更した場合、直径が約９５０ｎｍ～１６．８μｍであり、長さが約９．９μｍ～７８．６μｍである断片化コラーゲンが得られた（表１、図１の（Ｂ））。この結果から、ホモジナイズする時間を調整することで、断片化コラーゲンのサイズを制御できることが分かった。
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＜三次元組織体の製造＞
　血清を含む培地（ＤＭＥＭ）にて濃度が１０ｍｇ／ｍｌとなるように断片化コラーゲンを分散させ、断片化コラーゲンを含む分散液を準備した。
（実施例１）
　三次元組織体は、図２（Ａ）に示す模式図のとおりに製造した。すなわち、上記の断片化コラーゲンを含む分散液、ヒト心臓線維芽細胞（ＮＨＣＦ）及びヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞（ｉＰＳ－ＣＭ）（以下、ＮＨＣＦ及びｉＰＳ－ＣＭをまとめて、「細胞」ともいう。）を、非接着９６ウェル丸底プレートに添加し、断片化コラーゲンと細胞とを接触させた（接触工程）。断片化コラーゲンを含む分散液は、断片化コラーゲンの添加量が０．５ｍｇとなるように添加した。ＮＨＣＦと、ｉＰＳ－ＣＭとは、２５：７５の割合で混合し、合計細胞数が、５×１０５ｃｅｌｌｓとなるように添加した。その後、所定期間培養し（培養工程）、三次元組織体１を製造した。三次元組織体１は、２１日間培養後にマッソントリクローム染色（Masson trichrome stain）した。三次元組織体１の位相差顕微鏡による写真を図２（Ｃ）に示す。三次元組織体１は、球体状であり、２１日間培養後における直径は約１．０ｍｍであった。なお、図２（Ｃ）の左側及び中央の図において、着色が濃い箇所は、コラーゲン繊維を示し、着色の薄い箇所は、細胞質を示す（以下、図２（Ｂ）、（Ｄ）及び（Ｅ）においても同様である。）。
（実施例２）
　断片化コラーゲンを含む分散液を、断片化コラーゲンの添加量が１．０ｍｇとなるように添加すること以外は、実施例１と同様にして三次元組織体２を製造した。マッソントリクローム染色した三次元組織体２の、位相差顕微鏡による観察結果を図２（Ｄ）に示す。三次元組織体２は、球体状であり、２１日間培養後における直径は、約１．２ｍｍであった。
（実施例３）
　断片化コラーゲンを含む分散液を、断片化コラーゲンの添加量が１．５ｍｇとなるように添加すること以外は、実施例１と同様にして三次元組織体３を得た。マッソントリクローム染色した三次元組織体３の、位相差顕微鏡による観察結果を図２（Ｅ）に示す。三次元組織体３は、球体状であり、２１日間培養後における直径は、約１．６ｍｍであった。
（実施例４）
　断片化コラーゲンを含む分散液を、断片化コラーゲンの添加量が３．０ｍｇとなるように添加すること以外は、実施例１と同様にして三次元組織体４を得た。三次元組織体４の７日間培養後における直径は、約４ｍｍであった。
（実施例５）
　断片化コラーゲンを含む分散液を、断片化コラーゲンの添加量が５．０ｍｇとなるように添加すること以外は、実施例１と同様にして三次元組織体５を得た。三次元組織体５の７日間培養後における直径は、約５ｍｍであった。
（比較例１）
　断片化コラーゲンを含む分散液を添加しなかったこと以外は、実施例１と同様にして比較三次元組織体１を得た。マッソントリクローム染色した比較三次元組織体１の、位相差顕微鏡による観察結果を図２（Ｂ）に示す。比較三次元組織体１は、球体状であり、２１日間培養後における直径は、約０．９ｍｍであった。
＜評価＞
（心筋モデルの拍動間隔及び拍動力）
　上記の方法で得られた三次元組織体１～５及び比較三次元組織体１をそれぞれ、実施例１～５及び比較例１の心筋モデルとした。心筋モデルの拍動間隔及び拍動力は、７日間培養後の心筋モデルの拍動を倒立顕微鏡で動画を撮影、それを画像解析(イメージｐｒｏ）を用いて観察することにより、評価した。具体的には、心筋モデルが拍動する際に移動する重心の移動距離及び拍動の時間間隔に基づいて評価した。図３は、心筋モデルの拍動間隔及び拍動力の評価方法を説明する図である。心筋モデルの重心は、拍動に応じて、移動する。心筋モデルが収縮した際の重心の移動距離（図３（Ａ）に示す重心から、（Ｂ）に示す重心までの距離）と、収縮後に心筋モデルが弛緩した際の重心の移動距離（図３（Ｂ）に示す重心から、（Ｃ）に示す重心までの距離）とを測定することにより評価を行った。結果を図４～１０に示す。
　図４（Ａ）は、断片化コラーゲンを１．０ｍｇ添加して得た、実施例２の心筋モデルの拍動挙動を示す。図４（Ｂ）は、観察開始時点（０秒）、収縮した時点（０．６７経過時点）及び弛緩した時点（１．２７秒経過時点）を示す。図５（Ｂ）は、断片化コラーゲンを０ｍｇ、１．０ｍｇ、２．０ｍｇ添加して得た、心筋モデルの拍動挙動を示す。
　図４及び５に示すとおり、断片化コラーゲンを添加した場合、添加しなかった場合と比べ、得られる心筋モデルの拍動（拍動の時間間隔及び拍動力）が不規則に変化するようになった。また、コラーゲンを添加しなかった場合と比べて、コラーゲンを添加した場合では、得られる心筋モデルの拍動力が低下した。なお、図５（Ａ）に示すとおり、コラーゲンを添加しなかった、心筋モデルでは、拍動の挙動が正常に近かった。
　図６及び８の（Ａ）～（Ｄ）は、それぞれ、断片化コラーゲンの使用量が、０、１、３、及び５ｍｇである心筋モデルの拍動挙動を示す。図７（Ａ）は、図６（Ａ）～（Ｄ）に示す破線間の間隔（つまり、１回の収縮－弛緩完了した時点から次の収縮－弛緩完了時点の差）（単位：秒）から算出した平均拍動間隔（ａｖｅｒａｇｅ　ｏｆ　ｂｅａｔｉｎｇ　ｉｎｔｅｒｖａｌ）の結果を示す。図７（Ｂ）は、培養期間４日から７日までの標準偏差（Ｓ．Ｄ．）の平均（拍動の不規則性の指標）を示す。図９は、図８（Ａ）～（Ｄ）の矢印で示す間隔（つまり、１回の収縮－弛緩に要する時間）（単位：秒）から算出した、心筋モデルの収縮と弛緩との間の時間（単位：秒）を示す。図１０は、断片化コラーゲンの使用量が、０、１、３、及び５ｍｇである心筋モデルの、培養日数に応じた拍動間隔（ｂｅａｔｉｎｇ　ｉｎｔｅｒｖａｌ）の測定結果を示す。
　図７（Ａ）に示すとおり、断片化コラーゲンを添加して得た心筋モデルは、平均拍動間隔が短かった（すなわち、単位時間当たりの拍動数がより多かった。）。図７（Ｂ）に示すとおり、１ｍｇ又は５ｍｇの断片化コラーゲンを添加した場合、より拍動の時間間隔が不規則に変化するようになった。図９に示すとおり、断片化コラーゲンを添加して得た心筋モデルでは、１回の収縮及び弛緩に要する時間がより長くなった（すなわち、１回あたりの拍動速度が低下した。）。以上のとおり、断片化コラーゲンを添加して製造した心筋モデルは、疾患を発症したモデルに近似していることが示唆された。図８にコラーゲン量毎の拍動挙動を示す。図９では、図８の結果から１回の収縮－弛緩にかかる時間を算出し、コラーゲンの影響を調べた。その結果、拍動に要する時間は、１ｍｇ、３ｍｇとコラーゲン量（添加量）依存的に、有意差をもって遅延していく傾向にあったが、コラーゲン量（添加量）が５ｍｇの場合では、拍動に要する時間は、１ｍｇとほぼ同様であった。拍動そのものの時間についてもコラーゲン量により制御できる可能性が示唆された。図１０に示すとおり、断片化コラーゲンを添加して得た心筋モデルは、培養期間をとおして、拍動間隔がより短く、より拍動数が多かった。
＜細胞生存率の測定＞
（三次元組織体の構築）
　５０ｍｇのブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲン（日本ハム株式会社提供）に５ｍＬの１０ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、ホモジナイザーで６分間ホモジナイズした。その後１００００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄み液を除去した。ここに５ｍＬの無血清ＤＭＥＭを加え、１分間ピペッティングにより洗浄した。洗浄後、１００００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄み液を除去した。ここに５ｍＬの血清入りＤＭＥＭを加えてピペッティングし、断片化コラーゲン（ＣＭＦ）分散培地（ＣＭＦ濃度９．８ｍｇ／ｍＬ）を得た。ＣＭＦ分散培地からＣＭＦ０，１，２，３ｍｇとなるよう分散液をはかり取り、５ｘ１０５ｃｅｌｌｓのｉＰＳ－ＣＭ７５％／ＮＨＣＦ２５％と混合し、９６ｗｅｌｌの丸底非接着プレートに播種した（培地量は３００μＬ）。その後、１１００ｇで５分間遠心分離し、ＣＭＦと細胞を沈殿させた。遠心後、３７℃のインキュベーター内で培養した。培地交換は２日に１回、古い培地を除去し、３００μＬの新しい培地を加えることで行った。
（ＤＮＡ量の測定）
　用いたキット：ＤＮｅａｓｙ　Ｂｌｏｏｄ　＆　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｋｉｔ　（５０）（６９５０４，ＱＩＡＧＥＮ）
　５ｘ１０５ｃｅｌｌｓのｉＰＳ－ＣＭ７５％／ＮＨＣＦ２５％のＤＮＡ量を、上記キットを用いて測定した。この時のＤＮＡ量を基準（１００％）とした。７日間培養後の各ＣＭＦ量の三次元組織体中のＤＮＡ量を、上記キットを用いて測定した。下記の式を用いて三次元組織体中の細胞生存率（ＤＮＡ量の変化率（ｃｈａｎｇｅ　ｏｆ　ＤＮＡ　ａｍｏｕｎｔ））を算出した。
　ＤＮＡ量の変化率（％）＝（７日間培養後の三次元組織体のＤＮＡ量）／（５×１０５ｃｅｌｌｓのｉＰＳ－ＣＭ７５％／ＮＨＣＦ２５％のＤＮＡ量）×１００
　なお、上記キットは、DNeasy Mini Spin Column、コレクションチューブ、Buffer ATL、Buffer AL、Buffer AW1、Buffer AW2、Buffer AE、Proteinase K等を含む市販のキットであり、ＤＮＡ測定は、下記手順に従い実施した。
　測定するサンプルを1.5mLエッペンチューブに入れ、Buffer ATL 180 μLを入れた。これにProteinase K 20μL添加し、ボルテックスを行って、組織が完全に溶解するまで56℃でインキュベートした（一晩）。その後、15秒間ボルテックスし、Buffer ALとエタノールを等量で混ぜ、1サンプルに400 μL添加し、ボルテックスを行った。溶液をDNeasy Mini Spin Column（以下、単にカラムと記載することがある。）内に添加し、8000 rpm、1 minの条件で遠心分離した。濾液およびコレクションチューブを捨て、カラムを新しいコレクションチューブに移し、Buffer AW1 500 μLを添加した。その後、8000 rpm、1 minの条件で遠心分離した。濾液およびコレクションチューブを捨て、カラムを新しいコレクションチューブに移し、Buffer AW2 500 μLを添加した。14000 rpm、3 minの条件で遠心後、DNeasyメンブレンを完全に乾燥させた。濾液およびコレクションチューブを捨て、カラムをエッペンチューブに移し（操作１）、200μLのBuffer AEをDNeasyメンブレン上に直接添加し（操作２）、室温で1 minインキュベートした（操作３）。その後、8000 rpm、1 minの条件で遠心分離した（操作４）。操作１～４を繰り返した後、回収した濾液をまとめて400μLとした。これをNanodropで測定した。
　ＤＮＡ量の変化率の結果を図１１に示す。図１１に示すとおり、７日間培養した結果、ＣＭＦを使用した三次元組織体の細胞数は、ＣＭＦを使用しなかった組織体と比べてより増加した。ＣＭＦを加えて培養することにより、より多くの細胞が生存していたか、または、細胞がより長期間生存していたと考えられる。図１０及び１１の結果から、ＣＭＦを使用した三次元組織体は、長期間（少なくとも７日間）した場合であっても、培養初期と同程度の拍動挙動を示し、細胞の生存率もＣＭＦを使用しなかった組織体（スフェロイド）と比較して高かった。これにより、ＣＭＦを使用した三次元組織体からなる心筋モデルは、細胞が多く生存、または長く生存していることによって、薬効評価を長期間に渡って行うことができる。
＜イソプロテレノールに対する薬剤応答性の評価＞
（三次元組織体の構築）
　用いたキット：Ｔｏｔａｌ　Ｃｏｌｌａｇｅｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（ＱＺＢＴＯＴＣＯＬ１，ＱｕｉｃｋＺｙｍｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
　三次元組織体は、上記同様にして構築した。ＣＭＦを１ｍｇ使用して構築した三次元組織体において、１日培養後のコラーゲンの含有率は、凍結乾燥した三次元組織体を基準として、３４重量％であった。三次元組織体におけるコラーゲンの含有量は、上記キットを用いて、上記キットの標準プロトコルにより測定した。
（薬剤応答性の評価）
　５～６日間培養後の組織体の拍動を、ＳＯＮＹ　Ｍｏｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｚｅｒを用いて撮影し、拍動数を計測した。撮影時は顕微鏡内を３７℃に保ち、１５～２０秒間撮影した。撮影後、一度プレートを顕微鏡から取り出して培地を除去し、３００μＬのＤＭＥＭ（薬剤未添加組織）、又は３００μＬの１００ｎＭイソプロテレノール混合ＤＭＥＭをそれぞれ加え、再び顕微鏡に戻して３７℃でインキュベートした。３０分、６０分、８０分インキュベート後にそれぞれの拍動を同様に撮影し、拍動数を計測した。計測結果からイソプロテレノール添加による拍動数の変化率（ｃｈａｎｇｅ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｂｅａｔｉｎｇ）を下記の式で算出した。結果は、単位時間当たりの拍動数が増加したことをもって、イソプロテレノールへの応答性が良好であったとした。
　拍動数の変化率（％）＝（薬剤添加組織の各時間後の拍動数／薬剤添加組織の薬剤添加前の拍動数）／（薬剤未添加組織の各時間後の拍動数／薬剤未添加組織の培地交換前の拍動数）×１００
　なお、上段の式でイソプロテレノール添加による拍動数の変化率を求め、この値を下段の未添加時の拍動数の変化率（＝培地交換による拍動数の変化）で割ることで補正している。
　図１２は、拍動数の変化率の結果を示す。心筋モデルにおいて、ＣＭＦ使用量０ｍｇの場合は、薬剤応答性が悪く、ＣＭＦ使用量１ｍｇ及び３ｍｇの場合は、薬剤応答性を示した。ＣＭＦ使用量１ｍｇであった心筋モデルは、より良好な薬剤応答性を示した。
　ＣＭＦを用いた三次元組織体からなる心筋モデルを用いた薬効評価結果は、イソプロテレノールの心筋のアドレナリン受容体に作用して収縮力を増強する効果の知見と一致しており、ＣＭＦを用いた三次元組織体からなる心筋モデルにより心不全治療薬の効果を正しく評価可能であることが示された。
　本発明によれば、新規な異常拍動心筋モデルの提供が可能となり、例えば、心臓の異常拍動に起因する疾患等に有効な薬剤開発への応用が期待される。

Claims (16)

  1. 　心筋細胞を含む細胞と、コラーゲンと、を含有し、前記細胞の少なくとも一部が前記コラーゲンに接着している三次元組織体からなる、異常拍動心筋モデル。
  2. 　前記細胞が、コラーゲン産生細胞を更に含有する、請求項１に記載の異常拍動心筋モデル。
  3. 　前記コラーゲンの含有率が、前記三次元組織体を基準として１０～３０重量％である、請求項１又は２に記載の異常拍動心筋モデル。
  4. 　前記コラーゲンが外因性コラーゲンを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の異常拍動心筋モデル。
  5. 　前記コラーゲンが外因性コラーゲンに由来する断片化コラーゲンを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の異常拍動心筋モデル。
  6. 　水性媒体中において、心筋細胞を含む細胞と外因性コラーゲンとを接触させる接触工程、及び
    　前記外因性コラーゲンが接触した前記細胞を培養する培養工程、を含み、
    　前記接触工程における前記外因性コラーゲンの使用量が、１．０×１０５～１０．０×１０５ｃｅｌｌｓの細胞に対して、０．１ｍｇ以上である、異常拍動心筋モデルの製造方法。
  7. 　前記細胞が、コラーゲン産生細胞を更に含む、請求項６に記載の異常拍動心筋モデルの製造方法。
  8. 　前記外因性コラーゲンとして、断片化コラーゲンを含有する、請求項６又は７に記載の製造方法。
  9. 　前記断片化コラーゲンの平均長が１００ｎｍ～２００μｍである、請求項８に記載の製造方法。
  10. 　前記断片化コラーゲンの平均径が５０ｎｍ～３０μｍである、請求項８又は９に記載の製造方法。
  11. 　前記接触工程又は前記培養工程の間に、前記水性媒体中における前記外因性コラーゲンと前記細胞とを共に沈降させる工程を更に含む、請求項６～１０のいずれか一項に記載の製造方法。
  12. 　前記外因性コラーゲンと、前記細胞との質量比が、９００：１～９：１である、請求項６～１１のいずれか一項に記載の製造方法。
  13. 　断片化コラーゲンを含む、異常拍動心筋モデルの形成剤であって、
    　前記断片化コラーゲンの平均長が１００ｎｍ～２００μｍであり、前記断片化コラーゲンの平均径が５０ｎｍ～３０μｍである、異常拍動心筋モデルの形成剤。
  14. 　請求項１～５のいずれか一項に記載の異常拍動心筋モデルを用いた心疾患治療薬の薬効評価方法であって、
    　前記心疾患治療薬を前記異常拍動心筋モデルに投与する投与工程と、
    　前記心疾患治療薬を投与した前記異常拍動心筋モデルの拍動の挙動の変化により薬効を評価する評価工程と、を含む、心疾患治療薬の薬効評価方法。
  15. 　前記評価工程において、
    　前記心疾患治療薬を投与しなかった前記異常拍動心筋モデルの単位時間あたりの拍動数と比較して、前記心疾患治療薬を投与した前記異常拍動心筋モデルの単位時間あたりの拍動数が多かった場合には、心不全治療薬として効果があると評価し、
    　前記心疾患治療薬を投与しなかった前記異常拍動心筋モデルの単位時間あたりの拍動数と比較して、前記心疾患治療薬を投与した前記異常拍動心筋モデルの単位時間あたりの拍動数が少なかった場合には、心不全治療薬として効果がないと評価する、請求項１４に記載の心疾患治療薬の薬効評価方法。
  16. 　前記評価工程が複数回行われる、請求項１４又は１５に記載の心疾患治療薬の薬効評価方法。
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