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WO2018221685A1 - 改変されたＣａｓ９タンパク質及びその用途 - Google Patents

改変されたＣａｓ９タンパク質及びその用途 Download PDF

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Publication number
WO2018221685A1
WO2018221685A1 PCT/JP2018/021068 JP2018021068W WO2018221685A1 WO 2018221685 A1 WO2018221685 A1 WO 2018221685A1 JP 2018021068 W JP2018021068 W JP 2018021068W WO 2018221685 A1 WO2018221685 A1 WO 2018221685A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
mutation
amino acid
protein according
seq
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2018/021068
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
理 濡木
弘志 西増
央人 平野
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Tokyo NUC
Original Assignee
University of Tokyo NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Tokyo NUC filed Critical University of Tokyo NUC
Priority to US16/617,498 priority Critical patent/US11371030B2/en
Priority to JP2019521316A priority patent/JP6628385B6/ja
Priority to EP18809170.6A priority patent/EP3633034A4/en
Priority to CN201880050453.1A priority patent/CN110914423B/zh
Publication of WO2018221685A1 publication Critical patent/WO2018221685A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to US17/849,581 priority patent/US11702645B2/en
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Definitions

  • the present invention relates to a modified Cas9 protein in which a more targetable region is expanded and its use.
  • CRISPR Clustered Regularly Arranged Short Palindromic Repeats
  • Cas Cas-associated genes
  • exogenous DNA is cleaved into fragments of about 30 bp by the Cas protein family and inserted into CRISPR.
  • Cas1 and Cas2 proteins which are one of the Cas protein family, recognize a base sequence called proto-spacer adadient motif (PAM) of foreign DNA, cut the upstream, and insert it into the CRISPR sequence of the host. It becomes immune memory of bacteria.
  • RNA generated by transcription of a CRISPR sequence including immune memory (referred to as pre-crRNA) is part of the Cas protein family by pairing with partially complementary RNA (trans-activating crRNA). It is incorporated into Cas9 protein.
  • the pre-crRNA and tracrRNA incorporated into Cas9 are cleaved by RNaseIII to form small RNA fragments (CRISPR-RNAs: crRNAs) containing a foreign sequence (guide sequence) to form a Cas9-crRNA-tracrRNA complex.
  • CRISPR-RNAs crRNAs
  • the Cas9-crRNA-tracrRNA complex binds to a foreign invasive DNA complementary to crRNA, and the Cas9 protein, which is an enzyme that cleaves the DNA, cleaves the foreign invasive DNA, thereby invading DNA from outside. Suppress and eliminate the function of
  • Cas9 protein recognizes the PAM sequence in the foreign invading DNA and cleaves the double-stranded DNA upstream of it so as to be a blunt end.
  • the length and base sequence of the PAM sequence vary depending on the bacterial species, and Streptococcus pyogenes (S. pyogenes) recognizes 3 bases of “NGG”.
  • Streptococcus thermophilus (S. thermophilus) has two Cas9 and recognizes 5-6 bases of “NGGNG” or “NNAGAA” as PAM sequences, respectively.
  • Francisella novicida (F. novicida) recognizes three bases “NGR”. The number of bps upstream of the PAM sequence depends on the bacterial species.
  • crRNA and tracrRNA are fused and expressed as a tracrRNA-crRNA chimera (hereinafter referred to as guide RNA (gRNA)) and utilized.
  • gRNA guide RNA
  • nuclease RNA-guided nuclease: RGN
  • the CRISPR-Cas system includes type I, II, and III. However, the type II CRISPR-Cas system is exclusively used for genome editing. In type II, Cas9 protein is used as RGN. S.
  • the pyogenes-derived Cas9 protein recognizes three bases, NGG, as a PAM sequence, it can be cleaved upstream as long as there is a sequence of two guanines.
  • NGG nuclease
  • TALEN transactivator-like activator
  • Patent Document 1 S.A. A genome editing technique utilizing a CRISPR-Cas system derived from pyogenes is disclosed.
  • Patent Document 2 S.A. A genome editing technique using a C. thermophilus-derived CRISPR-Cas system is disclosed.
  • Patent Document 2 discloses that the D31A or N891A mutant of Cas9 protein functions as a nickase that is a DNA cleaving enzyme that inserts nick into only one DNA strand. Furthermore, it has been shown that homologous recombination efficiency comparable to that of the wild-type Cas9 protein is maintained while the incidence of non-homologous end joining, which is likely to cause mutations such as insertion deletion, in the repair mechanism after DNA cleavage remains small.
  • Non-Patent Document 1 describes S.I. CRISPR-Cas system using Casogen derived from pyogenes, using a D10A mutant of two Cas9 proteins and a pair of target-specific guide RNAs forming a complex with the D10A mutant Is disclosed.
  • the D10A variant of each Cas9 protein and the target-specific guide RNA complex make only one nick in the DNA strand that is complementary to the guide RNA.
  • the pair of guide RNAs is shifted by about 20 bases and recognizes only the target sequence located on the opposite strand of the target DNA.
  • the pyogenes-derived Cas9 (also referred to herein as SpCas9) protein has two bases with a recognizable PAM sequence of “NGG (N is an arbitrary base)”.
  • N is an arbitrary base
  • SpCas9 protein is used, and two recognizable PAM sequences are present in each of the sense strand and the antisense strand in the target sequence. This further restricts the target sequence that can be edited.
  • the conventional Cas9 protein has a problem in that the target sequence that can be edited is limited because the PAM sequence that can be recognized is limited.
  • An object of the present invention is to provide a modified Cas9 protein in which the restriction of the target sequence is relaxed while maintaining the binding ability to the guide RNA and the use thereof.
  • the present inventors paid attention to the SpCas9 protein as the Cas9 protein and intensively studied to solve the above problems.
  • the conventional NGG N is an arbitrary base
  • the present PAM sequence was successfully converted to a single base sequence of NG, and the present invention was completed.
  • the Cas9 protein before introducing a mutation may be referred to as a wild-type Cas9 protein
  • the Cas9 protein after introducing a mutation may be referred to as a modified Cas9 protein or a mutant Cas9 protein. That is, the present invention is as follows.
  • arginine at position 1335 is selected from the group consisting of alanine, glycine, cysteine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, proline, valine, threonine, asparagine and aspartic acid
  • a protein comprising a sequence containing an amino acid sequence substituted with one amino acid and having the ability to bind to a guide RNA.
  • arginine at position 1335 is selected from the group consisting of alanine, glycine, cysteine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, proline, valine, threonine, asparagine and aspartic acid.
  • a protein comprising an amino acid sequence substituted with one amino acid and further having a mutation at position 1219, and having a binding ability to a guide RNA.
  • arginine at position 1335 is selected from the group consisting of alanine, glycine, cysteine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, proline, valine, threonine, asparagine and aspartic acid.
  • a protein comprising an amino acid sequence substituted with one amino acid and further having a mutation at position 1322, and having a binding ability to a guide RNA.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 further has a mutation at at least one position selected from the group consisting of positions 1111, 1135, 1218 and 1337.
  • the protein in any one of.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 further has mutations in at least two positions selected from the group consisting of positions 1111, 1135, 1218, and 1337. protein.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 further has mutations in at least three positions selected from the group consisting of positions 1111, 1135, 1218, and 1337. protein.
  • the mutation at position 1111 is substitution of leucine with arginine, histidine or lysine;
  • the mutation at position 1135 is a substitution of aspartic acid for valine;
  • the mutation at position 1218 is a substitution of glycine for arginine, histidine or lysine;
  • [16] The protein according to any one of [1] to [15] above, which has 80% or more identity at a site other than the position where the mutation of SEQ ID NO: 1 has been performed.
  • [17] Any one of [1] to [15] above, wherein 1 to several amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added at a site other than the position where the mutation of SEQ ID NO: 1 has been performed.
  • Protein. [18] The protein according to any one of [1] to [17] above, which has RNA-inducible DNA endonuclease activity.
  • a mutation that partially or entirely lacks nuclease activity is selected from the group consisting of (i) positions 10, 762, 839, 983, and 986 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. And / or (ii) a mutation at a position selected from the group consisting of positions 840 and 863 or at a position corresponding thereto, [19].
  • a method for site-specific modification of a target double-stranded polynucleotide comprising: Mixing and incubating the target double-stranded polynucleotide, the protein, and the guide RNA; Modifying the target double-stranded polynucleotide at a binding site located upstream of the PAM sequence;
  • the target double-stranded polynucleotide has a PAM sequence consisting of NG (N means any base, G means guanine),
  • the protein is the protein according to any one of [1] to [24] above,
  • the method wherein the guide RNA includes a polynucleotide having a base sequence complementary to a base sequence from 1 base upstream to 20 bases to 24 bases upstream of the PAM sequence in the target double-stranded polynucleotide.
  • [31] A method for reducing expression of a target gene in a cell, comprising expressing the protein according to [24] above and one or more guide RNAs for the target gene in the cell, Method. [32] The method described in [30] or [31] above, wherein the cell is a eukaryotic cell. [33] The method according to [30] or [31] above, wherein the cell is a yeast cell, plant cell or animal cell.
  • the present invention it is possible to obtain a Cas9 protein in which recognition of a PAM sequence is widespread while maintaining a binding force to a guide RNA.
  • 1A is a diagram showing the results of agarose gel electrophoresis in a DNA cleavage activity measurement test in Example 1.
  • FIG. “TGT” was used as the PAM sequence, and EcoRI was used as the restriction enzyme.
  • 1B is a diagram showing the results of agarose gel electrophoresis in a DNA cleavage activity measurement test in Example 1.
  • FIG. “TGG” was used as the PAM sequence, and HindIII was used as the restriction enzyme.
  • 1C is a diagram showing the results of agarose gel electrophoresis in a DNA cleavage activity measurement test in Example 1.
  • FIG. “TGNA” was used as the PAM sequence, and BamHI was used as the restriction enzyme.
  • FIG. 1D is a diagram showing the results of agarose gel electrophoresis in a DNA cleavage activity measurement test in Example 1.
  • FIG. “TGN” was used as the PAM sequence, and BamHI was used as the restriction enzyme.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of agarose gel electrophoresis in the DNA cleavage activity measurement test in Example 2.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of a DNA cleavage activity measurement test in Example 3. “TGA” was used as the PAM sequence, and BamHI was used as the restriction enzyme.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of a DNA cleavage activity measurement test in Example 4.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of a DNA cleavage activity measurement test in Example 5.
  • the protein of this embodiment is a Cas9 protein in which recognition of a PAM sequence is widespread while maintaining a binding force to a guide RNA. According to the protein of the present embodiment, a site-specific genome editing technique can be provided simply and quickly for a target sequence.
  • the “guide RNA” is a mimic of the hairpin structure of tracrRNA-crRNA, preferably from 20 to 24 bases from one base upstream of the PAM sequence in the target double-stranded polynucleotide. More preferably, the 5 ′ end region contains a polynucleotide comprising a base sequence complementary to a base sequence of 22 to 24 bases. Furthermore, it comprises one or more polynucleotides comprising a base sequence that is non-complementary to the target double-stranded polynucleotide, arranged so as to be symmetrically complementary with one point as an axis, and can have a hairpin structure. You may go out.
  • the guide RNA has a function of binding to the mutant Cas9 protein of the present invention and guiding the protein to the target DNA.
  • the guide RNA has a sequence complementary to the target DNA at its 5 ′ end, and binds to the target DNA via the complementary sequence, thereby leading the mutant Cas9 protein of the present invention to the target DNA.
  • the mutant Cas9 protein functions as a DNA endonuclease
  • the DNA can be cleaved at a site where the target DNA exists, for example, the function of the target DNA can be specifically lost.
  • the guide RNA is designed and prepared based on the sequence information of the target DNA to be cleaved or modified. Specific examples include sequences as used in the examples.
  • “endonuclease” means an enzyme that cleaves the middle of a nucleotide chain. Therefore, the Cas9 protein having endonuclease activity and widespread recognition of the PAM sequence of this embodiment is induced by the guide RNA and has an enzyme activity that cleaves the middle of the DNA strand.
  • polypeptide means polymers of amino acid residues and are used interchangeably. It also means an amino acid polymer in which one or more amino acids are chemical analogues or modified derivatives of the corresponding naturally occurring amino acids.
  • sequence means a nucleotide sequence having an arbitrary length, which is deoxyribonucleotide or ribonucleotide, linear, circular, or branched, single-stranded or double-stranded. Is a chain.
  • PAM sequence means a sequence that exists in the target double-stranded polynucleotide and can be recognized by the Cas9 protein, and the length and base sequence of the PAM sequence vary depending on the bacterial species.
  • a sequence that can be recognized by the Cas9 protein, in which the recognition of the PAM sequence of this embodiment is widespread, can be represented by “5′-NG-3 ′”.
  • N means any one base selected from the group consisting of adenine, cytosine, thymine and guanine
  • A means adenine
  • G means guanine
  • C means Cytosine
  • T means thymine
  • R means a base having a purine skeleton (adenine or guanine)
  • Y means a base having a pyrimidine skeleton (cytosine or thymine).
  • polynucleotide refers to a deoxyribonucleotide or ribonucleotide polymer that is in a linear or circular conformation and is in either a single-stranded or double-stranded form, and the length of the polymer. Is not to be construed as limiting. Also included are known analogs of natural nucleotides, as well as nucleotides (eg, phosphorothioate backbones) that are modified in at least one of a base moiety, a sugar moiety and a phosphate moiety. In general, analogs of specific nucleotides have the same base-pairing specificity, for example, analogs of A base-pair with T.
  • the present invention provides a protein (Aspect 1) comprising an amino acid sequence having a mutation at position 1335 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having an ability to bind to a guide RNA.
  • the protein of embodiment 1 has RNA-induced DNA endonuclease activity.
  • SEQ ID NO: 1 is the full-length amino acid sequence of SpCas9 protein.
  • the sequence of the PAM sequence recognition site in the SpCas9 protein is an amino acid sequence consisting of 271 residues from the 1097th to the 1368th of SEQ ID NO: 1.
  • the mutation at position 1335 of SEQ ID NO: 1 is specifically selected from the group consisting of alanine, glycine, cysteine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, proline, threonine, valine, asparagine and aspartic acid of arginine at position 1335 Substitution to one amino acid. Substitution with alanine is preferable. Another preferred mutation at position 1335 is substitution with isoleucine, methionine, threonine or valine. Since the mutation at position 1335 eliminates the hydrogen bond with the third guanine (5′-NG “G” -3 ′) in the PAM sequence, recognition of the PAM sequence of the protein can be broadened.
  • the present invention provides a protein having a mutation at position 1219 and capable of binding to a guide RNA (Aspect 2) in addition to the mutation of Aspect 1 above.
  • the protein of aspect 2 has RNA-induced DNA endonuclease activity.
  • the mutation at position 1219 is specifically a substitution of glutamic acid at position 1219 for phenylalanine. Mutations at position 1219 can contribute to an increase (maintenance) in the rate of expression of RNA-induced DNA endonuclease activity.
  • the present invention in addition to the mutation of the aspect 1 or 2, the present invention further comprises a protein having a mutation at position 1322 and having a binding ability to a guide RNA (aspect 3).
  • the protein of aspect 3 has RNA-induced DNA endonuclease activity.
  • the mutation at position 1322 is specifically a substitution of alanine at position 1322 with arginine, histidine or lysine. Preference is given to substitution with arginine.
  • a mutation at position 1322 may contribute to increased activity (maintenance of activity) of RNA-induced DNA endonuclease activity.
  • the present invention provides at least one selected from the group consisting of positions 1111, 1135, 1218 and 1337, in addition to the mutation of the above aspects 1, 2 or 3.
  • the present invention provides a protein having a mutation at all two positions, preferably two, more preferably three, and particularly preferably all four, and capable of binding to a guide RNA (Aspect 4).
  • the protein of embodiment 4 has RNA-induced DNA endonuclease activity.
  • the mutation at the 1111 position is specifically a substitution of leucine at the 1111 position with arginine, histidine or lysine. Preference is given to substitution with arginine.
  • the mutation at position 1135 is specifically a substitution of aspartic acid at position 1135 with valine.
  • the mutation at position 1218 is specifically a substitution of glycine at position 1218 with arginine, histidine or lysine. Preference is given to substitution with arginine.
  • the mutation at position 1337 is specifically a substitution of threonine at position 1337 with arginine, histidine or lysine. Preference is given to substitution with arginine.
  • the present invention in addition to the mutation of the above-described aspects 1, 2, 3, or 4, the present invention further comprises (i) positions 10, 762, 839, 983, and 986.
  • a protein having a mutation in at least one position selected from the group and / or (ii) a position selected from the group consisting of positions 840 and 863 and having the ability to bind to a guide RNA (Aspect 5) I will provide a.
  • the mutation at position 10 is specifically a substitution of aspartic acid at position 10 with alanine or asparagine.
  • the mutation at position 762 is substitution of glutamic acid at position 762 with glutamine.
  • the mutation at position 839 is specifically a substitution of aspartic acid at position 839 with alanine or asparagine.
  • the mutation at position 983 is specifically a substitution of histidine at position 983 with asparagine or tyrosine.
  • the mutation at position 986 is specifically a substitution of aspartic acid for aspartic acid at position 986.
  • the mutation at position 840 is specifically a substitution of histidine at position 840 with alanine, asparagine or tyrosine.
  • the mutation at position 863 is specifically a substitution of asparagine at position 863 with aspartic acid, serine or histidine.
  • Aspect 5 is preferably a protein in which aspartic acid at position 10 is substituted with alanine or asparagine, or histidine at position 840 is substituted with alanine, asparagine or tyrosine.
  • the protein of embodiment 5 having the mutation (i) or the mutation (ii) has nickase activity.
  • the protein of embodiment 5 having the mutation (i) and the mutation (ii) binds to the guide RNA and is carried to the target DNA, but the endonuclease activity is inactivated.
  • the present invention provides a protein (Aspect 6) that is functionally equivalent to the protein of Aspects 1-5.
  • a protein (Aspect 6) that is functionally equivalent to the protein of Aspects 1-5.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 80% or more of the sequence at a site other than the position where the mutation was performed in the first to fifth aspects It has identity and has the ability to bind to guide RNA.
  • the “site other than the position where the mutation has been applied” can be interpreted as “the site other than the position corresponding to the position where the mutation has been applied”.
  • amino acid sequence identity can be determined by a method known per se. For example, amino acid sequence identity (%) can be determined using a program commonly used in the art (eg, BLAST, FASTA, etc.) by default. In another aspect, identity (%) is determined by any algorithm known in the art, such as Needleman et al. (1970) (J. Mol. Biol. 48: 444-453), Myers and Miller (CABIOS, 1988, 4: 11-17) can be used.
  • Needleman et al.'S algorithm is incorporated into the GAP program in the GCG software package (available at www.gcg.com), and the percent identity is, for example, BLOSUM 62 matrix or PAM250 matrix, and gap weight: 16, It can be determined by using either 14, 12, 10, 8, 6 or 4 and length weight: 1, 2, 3, 4, 5 or 6.
  • the Myers and Miller algorithms are also incorporated into the ALIGN program that is part of the GCG sequence alignment software package. When using the ALIGN program to compare amino acid sequences, for example, PAM120 weight residue table, gap length penalty 12, gap penalty 4 can be used.
  • one to several amino acids at a site other than the position where the mutation was performed in the first to fifth aspects Is substituted, deleted, inserted and / or added, and a protein having the ability to bind to a guide RNA (Aspect 7) is provided.
  • the “site other than the position where the mutation has been applied” can be interpreted as “the site other than the position corresponding to the position where the mutation has been applied”.
  • a technique for artificially performing “amino acid substitution, deletion, insertion and / or addition” for example, conventional site-directed mutagenesis is performed on DNA encoding a predetermined amino acid sequence, and then this is performed.
  • a technique for expressing DNA by a conventional method is mentioned.
  • the site-directed mutagenesis method include a method using amber mutation (gapped duplex method, Nucleic Acids Res., 12, 9441-9456 (1984)), and a PCR method using a mutagenesis primer. Etc.
  • the number of amino acids modified as described above is at least one residue, specifically one or several, or more. Of the substitutions, deletions, insertions or additions, amino acid substitution is particularly preferred.
  • substitution is more preferably substitution with an amino acid having similar properties such as hydrophobicity, charge, pK, and steric features.
  • substitutions include, for example, i) glycine, alanine; ii) valine, isoleucine, leucine; iii) aspartic acid, glutamic acid, asparagine, glutamine; iv) serine, threonine; v) lysine, arginine; vi) phenylalanine, Substitution within the tyrosine group.
  • arginine at position 1335 is alanine (R1335A), leucine at position 1111, is arginine (L1111R), and aspartic acid at position 1135 Is valine (D1135V), glycine at position 1218 is arginine (G1218R), glutamic acid at position 1219 is phenylalanine (E1219F), alanine at position 1322 is arginine (A1322R), and threonine at position 1337 is arginine (T1337R) And a protein containing the mutated amino acid sequence (SEQ ID NO: 18).
  • arginine at position 1335 is isoleucine (R1335I), methionine (R1335M), threonine (R1335T) or valine (R1335V) (more preferably R1335M and R1335V), and leucine at position 1111 is arginine (L1111R).
  • Aspartic acid is valine (D1135V)
  • glycine at position 1218 is arginine (G1218R)
  • glutamic acid at position 1219 is phenylalanine (E1219F)
  • alanine at position 1322 is arginine (A1322R)
  • threonine at position 1337 is arginine
  • a protein containing an amino acid sequence mutated to (T1337R) is also preferred as the Cas9 protein with broad recognition of the PAM sequence of the present invention.
  • Each of the proteins corresponds to a protein comprising an amino acid sequence in which alanine at position 1335 in SEQ ID NO: 18 is mutated to isoleucine, methionine, threonine, or valine.
  • the alphabet displayed on the left side of the number representing the number of amino acid residues up to the substitution site indicates the single letter code of the amino acid before substitution
  • the alphabet displayed on the right side indicates the single letter code of the amino acid after substitution.
  • the Cas9 protein with widespread PAM recognition in the present embodiment can be prepared by, for example, the following method. First, a host is transformed with a vector containing a nucleic acid encoding a Cas9 protein in which PAM recognition is widespread. Subsequently, the host is cultured to express the protein. Conditions such as medium composition, culture temperature, time, addition of inducer, etc. can be determined by those skilled in the art according to known methods so that transformants grow and the protein is efficiently produced. For example, when an antibiotic resistance gene is incorporated into an expression vector as a selection marker, a transformant can be selected by adding an antibiotic to the medium.
  • the host is not particularly limited, and examples include animal cells, plant cells, insect cells, or microorganisms such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, and yeast.
  • the present invention relates to the protein shown in ⁇ Cas9 protein with wide recognition of PAM sequence> described above and one of the PAM (Proto-spacer Adjacent Motif) sequences in the target double-stranded polynucleotide.
  • a protein-RNA complex comprising a guide RNA containing a polynucleotide having a base sequence complementary to a base sequence from 20 bases to 24 bases upstream from the base upstream.
  • the PAM sequence is widened, and the site-specific target double-stranded polynucleotide can be edited easily and rapidly.
  • the protein and the guide RNA can form a protein-RNA complex by mixing under mild conditions in vitro and in vivo.
  • Mild conditions indicate a temperature and pH at which protein is not degraded or denatured, and the temperature is preferably 4 ° C. or higher and 40 ° C. or lower, and the pH is preferably 4 or higher and 10 or lower.
  • the time for mixing and incubating the protein and the guide RNA is preferably 0.5 hours or more and 1 hour or less.
  • the complex of the protein and the guide RNA is stable, and can remain stable even when left at room temperature for several hours.
  • the present invention provides a first vector comprising a gene encoding the protein shown in ⁇ Cas9 protein with extensive recognition of PAM sequence> described above, and a PAM in a target double-stranded polynucleotide.
  • a CRISPR-Cas vector system comprising a second vector containing a guide RNA containing a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to a base sequence from 1 base upstream to 20 bases to 24 bases upstream of the sequence.
  • the PAM sequence is widened, and the site-specific target double-stranded polynucleotide can be edited easily and rapidly.
  • the guide RNA consists of a base sequence complementary to a base sequence of preferably 20 to 24 bases, more preferably 22 to 24 bases from one base upstream of the PAM sequence in the target double-stranded polynucleotide. What contains a polynucleotide in a 5 'terminal area
  • polynucleotides comprising a base sequence that is non-complementary to the target double-stranded polynucleotide, arranged so as to be symmetrically complementary with one point as an axis, and can have a hairpin structure. You may go out.
  • the vector of this embodiment is preferably an expression vector.
  • the expression vector is not particularly limited.
  • plasmids derived from E. coli such as pBR322, pBR325, pUC12, and pUC13
  • plasmids derived from Bacillus subtilis such as pUB110, pTP5, and pC194
  • plasmids derived from yeast such as pSH19 and pSH15
  • Bacteriophages viruses such as adenoviruses, adeno-associated viruses, lentiviruses, vaccinia viruses, baculoviruses; and modified vectors thereof.
  • the Cas9 protein and the guide RNA expression promoter are not particularly limited.
  • These promoters can be appropriately selected depending on the types of cells that express the Cas9 protein and the guide RNA, or the Cas9 protein and the guide RNA.
  • the above-described expression vector may further have a multicloning site, an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, a replication origin, and the like.
  • the present invention is a method for site-specific modification of a target double-stranded polynucleotide comprising: Mixing and incubating a target double-stranded polynucleotide, protein and guide RNA; modifying the target double-stranded polynucleotide at a binding site where the protein is located upstream of a PAM sequence; With The target double-stranded polynucleotide has a PAM sequence consisting of NG (N means any base, G means guanine), The protein is the protein shown in the above ⁇ Cas9 protein with wide recognition of PAM sequence>
  • the guide RNA includes a method comprising a polynucleotide having a base sequence complementary to a base sequence from 1 base upstream to 20 bases to 24 bases upstream of the PAM sequence in the target double-stranded polynucleo
  • the target double-stranded polynucleotide can be modified in a simple, rapid and site-specific manner with respect to the target sequence. Can do.
  • the target double-stranded polynucleotide is not particularly limited as long as it has a PAM sequence composed of NG (N means any base and G means guanine).
  • the protein and the guide RNA are as described in the above ⁇ Cas9 protein in which recognition of the PAM sequence is widespread>.
  • the protein and the guide RNA are mixed and incubated under mild conditions.
  • the mild conditions are as described above.
  • the incubation time is preferably 0.5 hours or more and 1 hour or less.
  • the complex of the protein and the guide RNA is stable, and can remain stable even when left at room temperature for several hours.
  • the protein and the guide RNA form a complex on the target double-stranded polynucleotide.
  • the protein recognizes a PAM sequence consisting of “5′-NG-3 ′” and binds to the target double-stranded polynucleotide at a binding site located upstream of the PAM sequence.
  • the polynucleotide When the protein has endonuclease activity, the polynucleotide is cleaved at the site.
  • the Cas9 protein recognizes the PAM sequence, and starting from the PAM sequence, the double helix structure of the target double-stranded polynucleotide is stripped, and the base complementary to the target double-stranded polynucleotide in the guide RNA By annealing with the sequence, the double helix structure of the target double-stranded polynucleotide is partially loosened.
  • the Cas9 protein cleaves the phosphodiester bond of the target double-stranded polynucleotide at a cleavage site located upstream of the PAM sequence and a cleavage site located upstream of the sequence complementary to the PAM sequence. .
  • the above-described CRISPR-Cas vector system is used to further combine the protein shown in ⁇ Cas9 protein with wide recognition of PAM sequence> and guide RNA.
  • An expression step for expression may be provided.
  • Cas9 protein and guide RNA are expressed using the above-described CRISPR-Cas vector system.
  • a host is transformed using an expression vector containing a gene encoding Cas9 protein and an expression vector containing a guide RNA.
  • the host is cultured to express Cas9 protein and guide RNA.
  • Conditions such as medium composition, culture temperature, time, addition of inducer, etc. can be determined by those skilled in the art according to known methods so that the transformant grows and the fusion protein is efficiently produced.
  • an antibiotic resistance gene is incorporated into an expression vector as a selection marker, a transformant can be selected by adding an antibiotic to the medium.
  • Cas9 protein and guide RNA expressed by the host are purified by an appropriate method to obtain Cas9 protein and guide RNA.
  • the present invention is a method for site-specific modification of a target double-stranded polynucleotide comprising: Mixing and incubating the target double-stranded polynucleotide, protein and guide RNA; and binding the protein to the target double-stranded polynucleotide at a binding site located upstream of the PAM sequence; Obtaining the modified target double-stranded polynucleotide in a region determined by complementary binding of the guide RNA and the target double-stranded polynucleotide, and The target double-stranded polynucleotide has a PAM sequence consisting of NG (N means any base, G means guanine),
  • the protein is the above-described ⁇ Cas9 protein with wide recognition of PAM sequence>
  • the protein shown in The guide RNA includes a method comprising a polynucle
  • RNA-induced DNA endonuclease with a wide PAM sequence, a target double-stranded polynucleotide is modified in a simple and rapid manner and site-specifically with respect to the target sequence. can do.
  • the above-described ⁇ Cas9 protein with wide recognition of PAM sequence> and ⁇ target double-stranded polynucleotide are site-specifically modified. As shown in the method for
  • the steps up to site-specific binding to the target double-stranded polynucleotide are the same as the steps shown in ⁇ Method for cleaving target double-stranded polynucleotide site-specifically>. Subsequently, in the region determined by the complementary binding of the guide RNA and the double-stranded polynucleotide, a target double-stranded polynucleotide that has been modified according to the purpose can be obtained.
  • modification means that the base sequence of the target double-stranded polynucleotide is changed.
  • cleavage of the target double-stranded polynucleotide change of the base sequence of the target double-stranded polynucleotide by insertion of exogenous sequence after cleavage (insertion by physical insertion or replication through homologous directed repair), non-breaking after cleavage
  • NHEJ homologous end ligation
  • changes in the base sequence of the target double-stranded polynucleotide due to the addition of a functional protein or base sequence can be mentioned.
  • the modification of the target double-stranded polynucleotide in the present embodiment can introduce mutations into the target double-stranded polynucleotide or destroy or alter the function of the target double-stranded polynucleotide.
  • the above-described CRISPR-Cas vector system prior to the incubation step, is used to further combine the protein shown in ⁇ Cas9 protein with wide recognition of PAM sequence> and guide RNA.
  • An expression step for expression may be provided.
  • Cas9 protein and guide RNA are expressed using the above-described CRISPR-Cas vector system.
  • the specific method for the expression is the same as the method exemplified in [Second Embodiment] in ⁇ Method for modifying site-specifically target double-stranded polynucleotide> described above.
  • the present invention is a method for site-specific modification of a target double-stranded polynucleotide in a cell comprising: An expression step of introducing the above-described CRISPR-Cas vector system into a cell, and expressing the above-described ⁇ Cas9 protein in which recognition of the PAM sequence is widespread> and a guide RNA; The protein binds to the target double-stranded polynucleotide at a binding site located upstream of the PAM sequence; Obtaining the modified target double-stranded polynucleotide in a region determined by complementary binding of the guide RNA and the target double-stranded polynucleotide, The target double-stranded polynucleotide has a PAM sequence consisting of NG (N means any base, G means guanine),
  • the guide RNA includes a method comprising
  • Cas9 protein and guide RNA are expressed in cells using the above-described CRISPR-Cas vector system.
  • Examples of organisms from which cells to which the method of this embodiment is applied include prokaryotes, yeasts, animals, plants, insects, and the like. There is no special limitation as said animal, For example, a human, a monkey, a dog, a cat, a rabbit, a pig, a cow, a mouse, a rat etc. are mentioned, It is not limited to these.
  • the type of organism from which the cells are derived can be arbitrarily selected depending on the type, purpose, etc. of the desired target double-stranded polynucleotide.
  • animal-derived cells to which the method of the present embodiment is applied include, for example, germ cells (sperm, ova, etc.), somatic cells constituting the living body, stem cells, progenitor cells, cancer cells separated from living bodies, living bodies Cells that have been isolated from the body and have acquired immortalization and are stably maintained outside the body (cell lines), cells that have been isolated from the living body and have been artificially genetically modified, and cells that have been isolated from the living body and have been artificially exchanged in the nucleus
  • germ cells sperm, ova, etc.
  • somatic cells constituting the living body
  • stem cells progenitor cells
  • cancer cells separated from living bodies living bodies
  • living bodies Cells that have been isolated from the body and have acquired immortalization and are stably maintained outside the body (cell lines)
  • cells that have been isolated from the living body and have been artificially genetically modified cells that have been isolated from the living body and have been artificially exchanged in the nucleus
  • somatic cells constituting the living body include skin, kidney, spleen, adrenal gland, liver, lung, ovary, pancreas, uterus, stomach, colon, small intestine, large intestine, bladder, prostate, testis, thymus, muscle, connective tissue, Examples include, but are not limited to, cells collected from any tissue such as bone, cartilage, vascular tissue, blood, heart, eye, brain, and nerve tissue.
  • somatic cells for example, fibroblasts, bone marrow cells, immune cells (for example, B lymphocytes, T lymphocytes, neutrophils, macrophages, monocytes, etc.), erythrocytes, platelets, bone cells Bone marrow cells, pericytes, dendritic cells, keratinocytes, adipocytes, mesenchymal cells, epithelial cells, epidermal cells, endothelial cells, vascular endothelial cells, lymphatic endothelial cells, hepatocytes, islet cells (eg, ⁇ cells, ⁇ cells, ⁇ cells, ⁇ cells, PP cells, etc.), chondrocytes, cumulus cells, glial cells, neurons (neurons), oligodendrocytes, microglia, astrocytes, cardiomyocytes, esophageal cells, muscle cells (For example, smooth muscle cells, skeletal muscle cells, etc.), melanocytes, mononucle
  • Stem cells are cells that have both the ability to replicate themselves and the ability to differentiate into other multiple cell lines.
  • Stem cells include, for example, embryonic stem cells (ES cells), embryonic tumor cells, embryonic germ stem cells, induced pluripotent stem cells (iPS cells), neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, hepatic stem cells, pancreatic stem cells , Muscle stem cells, germ stem cells, intestinal stem cells, cancer stem cells, hair follicle stem cells, and the like.
  • Cancer cells are cells that are derived from somatic cells and have acquired unlimited proliferative capacity.
  • cancers from which cancer cells are derived include breast cancer (eg, invasive breast cancer, non-invasive breast cancer, inflammatory breast cancer, etc.), prostate cancer (eg, hormone-dependent prostate).
  • pancreatic cancer eg, pancreatic duct cancer, etc.
  • stomach cancer eg, papillary adenocarcinoma, mucinous adenocarcinoma, adenosquamous carcinoma, etc.
  • lung cancer eg, Non-small cell lung cancer, small cell lung cancer, malignant mesothelioma, etc.
  • colon cancer eg, gastrointestinal stromal tumor
  • rectal cancer eg, gastrointestinal stromal tumor
  • colorectal cancer eg, Familial colorectal cancer, hereditary nonpolyposis colorectal cancer, gastrointestinal stromal tumor, etc.
  • small intestine cancer eg, non-Hodgkin lymphoma, gastrointestinal stromal tumor, etc.
  • esophageal cancer duodenal cancer, tongue Cancer, pharyngeal cancer (eg, nasopharyngeal cancer, oropharyngeal cancer, hypophary
  • a cell line is a cell that has acquired infinite proliferative capacity through artificial manipulation in vitro.
  • Examples of cell lines include HCT116, Huh7, HEK293 (human embryonic kidney cells), HeLa (human cervical cancer cell line), HepG2 (human hepatoma cell line), UT7 / TPO (human leukemia cell line), CHO (Chinese hamster ovary cell line), MDCK, MDBK, BHK, C-33A, HT-29, AE-1, 3D9, Ns0 / 1, Jurkat, NIH3T3, PC12, S2, Sf9, Sf21, High Five, Vero, etc. However, it is not limited to these.
  • a method for introducing the CRISPR-Cas vector system into cells it can be performed by a method suitable for the living cells to be used. Electroporation method, heat shock method, calcium phosphate method, lipofection method, DEAE dextran method, microinjection method , Particle gun method, method using virus, FuGENE (registered trademark) 6 Transfection Reagent (manufactured by Roche), Lipofectamine 2000 Reagent (manufactured by Invitrogen), Lipofectamine LTX Reagent (manufactured by Invitrogen), Lipofectamine Reingen And methods using commercially available transfection reagents such as It is possible.
  • FuGENE registered trademark 6 Transfection Reagent
  • Lipofectamine 2000 Reagent manufactured by Invitrogen
  • Lipofectamine LTX Reagent manufactured by Invitrogen
  • Lipofectamine Reingen And methods using commercially available transfection reagents such as It is possible.
  • the subsequent modification step is the same as the method described in [First embodiment] in ⁇ Method for site-specific modification of target double-stranded nucleotide> described above.
  • the protein is the target double-stranded polynucleotide at a binding site located upstream of the PAM sequence. But can't stay there and cut. Therefore, for example, when a labeled protein such as a fluorescent protein (eg, GFP) is fused to the protein, the labeled protein can be bound to the target double-stranded polynucleotide via the guide RNA-mutated Cas9 protein.
  • a labeled protein such as a fluorescent protein (eg, GFP)
  • the labeled protein can be bound to the target double-stranded polynucleotide via the guide RNA-mutated Cas9 protein.
  • Various functions can be imparted to the target double-stranded polynucleotide by appropriately selecting a substance to be bound to the mutant Cas9 protein.
  • a transcriptional regulatory factor protein or domain can be linked to the N-terminus or C-terminus of the mutant Cas9 protein or a protein that lacks some or all of the cleavage enzyme activity from the mutant Cas9.
  • Transcriptional regulators or domains thereof include transcriptional activators or domains thereof (eg, VP64, NF- ⁇ B p65) and transcription silencers or domains thereof (eg, heterochromatin protein 1 (HP1)) or transcriptional repressors or domains thereof (E.g., Kruppel related box (KRAB), ERF repressor domain (ERD), mSin3A interaction domain (SID)).
  • Enzymes that modify the methylation state of DNA eg, DNA methyltransferase (DNMT), TET
  • enzymes that modify histone subunits eg, histone acetyltransferase (HAT), histone deacetylase (HDAC), histone methyltransferase
  • Histone demethylase eg., DNA methyltransferase (DNMT), TET
  • HAT histone acetyltransferase
  • HDAC histone deacetylase
  • Histone demethylase Histone demethylase
  • the present invention provides methods and compositions for performing genome editing and treating genes.
  • the method of this embodiment is efficient and inexpensive to implement and is adaptable to any cell or organism. Any segment of a cell or organism double-stranded nucleic acid can be modified by the gene therapy method of this embodiment.
  • the gene therapy method of this embodiment utilizes both homologous recombination processes and non-homologous recombination processes that are endogenous to all cells.
  • gene editing refers to a specific recombination or targeted mutation performed by a technique such as CRISPR / Cas9 system or Transcribing Activator-Like Effector Nucleases (TALEN). It means a new gene modification technology that performs gene disruption and knock-in of reporter gene.
  • CRISPR / Cas9 system or Transcribing Activator-Like Effector Nucleases (TALEN). It means a new gene modification technology that performs gene disruption and knock-in of reporter gene.
  • TALEN Transcribing Activator-Like Effector Nucleases
  • the present invention also provides a gene therapy method for performing targeted DNA insertion or targeted DNA deletion.
  • This gene therapy method includes a step of transforming a cell with a nucleic acid construct containing donor DNA.
  • the scheme for DNA insertion and DNA deletion after target gene cleavage can be determined by those skilled in the art according to known methods.
  • the present invention provides a gene therapy method that is used in both somatic cells and germ cells and performs genetic manipulation at a specific locus.
  • the present invention also provides a gene therapy method for disrupting a gene in somatic cells.
  • the gene overexpresses a product harmful to the cell or organism and expresses a product harmful to the cell or organism.
  • Such genes can be overexpressed in one or more cell types that occur in the disease. Disruption of the overexpressed gene by the gene therapy method of the present embodiment can bring better health to an individual suffering from a disease caused by the overexpressed gene. That is, the destruction of only a small percentage of the cells in the cell works, reducing the expression level and producing a therapeutic effect.
  • the present invention also provides a gene therapy method for disrupting a gene in a germ cell.
  • a cell in which a specific gene is disrupted can be used to produce an organism that does not have the function of the specific gene.
  • the gene can be knocked out completely. This loss of function in a particular cell can have a therapeutic effect.
  • the present invention also provides a gene therapy method for inserting a donor DNA encoding a gene product.
  • This gene product has a therapeutic effect when constitutively expressed.
  • a method of inserting the donor DNA into an individual (patient) suffering from diabetes in order to cause insertion of a donor DNA encoding an active promoter and an insulin gene.
  • the population of pancreatic cells containing the donor DNA can then produce insulin and treat diabetic patients.
  • the donor DNA can be inserted into a plant to produce a pharmacologically related gene product.
  • Protein product genes eg, insulin, lipase, or hemoglobin
  • regulatory elements e.g., insulin, lipase, or hemoglobin
  • Such protein products can then be isolated from the plant.
  • Transgenic plants or animals use nucleic acid transfer techniques (McCreath, KJ et al. (2000) Nature 405: 1066-1069; Polejaeva, IA et al. (2000) Nature 407: 86-90). Can be produced by a method. Tissue type specific cells or cell type specific vectors can be utilized to provide gene expression only in selected cells.
  • donor DNA can be inserted into the target gene, and cells having the designed genetic changes can be generated by all subsequent cell divisions.
  • the gene therapy method of the present embodiment can be applied to, for example, any organism, cultured cell, cultured tissue, cultured nucleus (cultured cell, cultured tissue, or cultured nuclear intact can be used to regenerate the organism.
  • Cell, tissue or nucleus cultured cell, cultured tissue, or cultured nuclear intact can be used to regenerate the organism.
  • Cell, tissue or nucleus gametes (eg, eggs or sperm at various stages of development) and the like.
  • the cell to which the gene therapy method of this embodiment is applied is derived from any organism (insects, fungi, rodents, cattle, sheep, goats, chickens, other agriculturally important animals, and other Mammals (including, but not limited to, mammals such as, but not limited to, dogs, cats and humans) and the like.
  • the gene therapy method of this embodiment can be used in plants.
  • the plant to which the gene therapy method of the present embodiment is applied is not particularly limited, and can be applied to any variety of plant species (for example, monocotyledonous plants or dicotyledonous plants).
  • Example 1 Preparation of wild type and mutant SpCas9 (1) Design of construct A wild type or mutant SpCas9 gene whose codon was optimized by gene synthesis was incorporated into pET vector (Novagen). Furthermore, a TEV recognition sequence was added between the His tag and the SpCas9 gene. The N-terminal of Cas9 expressed from the completed construct is designed such that 6-residue histidine is continuous (His tag) and a TEV protease recognition site is added. The base sequence of the used SpCas9 gene is as follows.
  • WT base sequence of wild type SpCas9: SEQ ID NO: 2 m0 : base sequence of mutant SpCas9 gene (R1335A): SEQ ID NO: 3 m4 : base sequence of mutant SpCas9 gene (R1335A / G1218R): SEQ ID NO: 4 m18 : base sequence of mutant SpCas9 gene (R1335A / G1218R / T1337R): SEQ ID NO: 5 m19 : base sequence of mutant SpCas9 gene (R1335A / G1218R / T1337R / L1111R): SEQ ID NO: 6 m20 : base sequence of mutant SpCas9 gene (R1335A / G1218R / T1337R / L1111R / D1332R): SEQ ID NO: 7 m21: Mutant SpCas9 gene (R1335A / G1218R / T1337R / L111111
  • m62 base sequence of mutant SpCas9 gene (R1335L / G1218R / T1337R / L1111R / A1322R / E1219F / D1135V): base sequence obtained by converting gcc at positions 4003 to 4005 to ctg with respect to the base sequence of m43 (SEQ ID NO: 18) .
  • m63 base sequence of the mutant SpCas9 gene (R1335M / G1218R / T1337R / L1111R / A1322R / E1219F / D1135V): base sequence obtained by converting gcc at positions 4003 to 4005 to atg relative to the base sequence of m43 (SEQ ID NO: 18) .
  • m64 base sequence of mutant SpCas9 gene (R1335F / G1218R / T1337R / L1111R / A1322R / E1219F / D1135V): base sequence obtained by converting gcc at positions 4003 to 4005 to ttt with respect to the base sequence of m43 (SEQ ID NO: 18) .
  • m65 base sequence of mutant SpCas9 gene (R1335T / G1218R / T1337R / L1111R / A1322R / E1219F / D1135V): base sequence obtained by converting gcc at positions 4003 to 4005 to acc with respect to the base sequence of m43 (SEQ ID NO: 18) .
  • m66 base sequence of mutant SpCas9 gene (R1335V / G1218R / T1337R / L1111R / A1322R / E1219F / D1135V): base sequence obtained by converting gcc at positions 4003 to 4005 to gtg with respect to the base sequence of m43 (SEQ ID NO: 18) .
  • Buffer E is changed from 10% to 50%.
  • the target protein was eluted by applying a linear gradient (NaCl concentration from 200 mM to 1 M).
  • the compositions of buffers A to E are shown below.
  • Buffer A 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole Buffer B: 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1000 mM NaCl, 20 mM imidazole Buffer C: 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 300 mM imidazole Buffer D: 20 mM Tris-HCl, pH 8.0 Buffer E: 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2000 mM NaCl
  • RNA sequence ggaaauuaggugcgcuuggc guuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaagug; SEQ ID NO: 19
  • the underlined portion indicates a 20 base guide sequence, and the remainder corresponds to the scaffold portion (stem-loop 2).
  • a T7 promoter sequence was added upstream of the guide RNA sequence and incorporated into a linearized pUC119 vector (TaKaRa). Based on the prepared vector, template DNA for in vitro transcription reaction was prepared using PCR.
  • an in vitro transcription reaction with T7 RNA polymerase was performed at 37 ° C. for 4 hours.
  • An equal amount of phenol chloroform was added to and mixed with the reaction solution containing the transcription product, followed by centrifugation (10,000 g, 2 minutes) at 20 ° C., and the supernatant was collected.
  • 1/10 amount of 3M sodium acetate and 2.5 times amount of 100% ethanol were added to the supernatant, and the mixture was centrifuged at 4 ° C. (10,000 g, 3 minutes) to precipitate the transcription product.
  • the supernatant was discarded, 70% ethanol was added, centrifuged at 4 ° C. (10,000 g, 3 minutes), and the supernatant was discarded again.
  • the precipitate was air-dried, resuspended in TBE buffer, and purified by 7M Urea modified 10% PAGE. A band located at the molecular weight of the target RNA was cut out, and RNA was extracted with an Elutrap electroelution system (GE Healthcare). Thereafter, the extracted RNA was passed through a PD-10 column (GE Healthcare), and the buffer was exchanged with buffer H (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl).
  • Plasmid DNA cleavage activity measurement test For use in a DNA cleavage activity measurement test, a vector into which a target DNA sequence and a PAM sequence were inserted was prepared. PAM sequences 1 to 4 were added to the target DNA sequence and incorporated into a linearized pUC119 vector. Target sequences and PAM sequences 1-4 are shown in Table 1.
  • E. coli Mach1 strain (Life Technologies) was transformed and cultured at 37 ° C. in an LB medium containing 20 ⁇ g / mL ampicillin. After culturing, the cells were collected by centrifugation (8,000 g, 1 minute), and the plasmid DNA was purified using QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN). Cleavage experiments were performed using target plasmid DNA to which the purified PAM sequence was added. Plasmid DNA was linearized with restriction enzymes. When wild-type or mutant SpCas9 cleaves the target DNA sequence in the linearized DNA, cleavage products of about 1,000 bp and about 2,000 bp are formed.
  • cleavage buffer B As a buffer for cleavage, cleavage buffer B having the following composition was used. Composition of B ( ⁇ 10) 200 mM HEPES 7.5 1000 mM KCl 50% glycerol 10 mM DTT 5 mM EDTA 20 mM MgCl 2 The sample after the reaction was subjected to electrophoresis using a 1% concentration agarose gel, and the band of the cleavage product was confirmed. The results are shown in FIGS. 1A-D. In the figure, “Substrate” indicates a substrate, and “Product” indicates a cleavage product. PAM sequences and reaction conditions are shown in the figure.
  • Wild type SpCas9 recognizes only when the third base of the PAM sequence is G, and the target plasmid DNA is cleaved, whereas mutant SpCas9 recognizes the PAM sequence other than G in the third base, The target plasmid DNA could be cleaved. Therefore, it was confirmed that the wild type SpCas9 recognizes the PAM sequence “NGG”, whereas the mutant SpCas9 recognizes the PAM sequence “NG”. From the above, it has been clarified that in the mutant SpCas9, the PAM sequence is widespread, and the site-specific target double-stranded polynucleotide can be cleaved with respect to the target sequence simply and rapidly.
  • Example 2 Using the mutant SpCas9 (m43) prepared in Example 1, a plasmid DNA cleavage activity measurement test was performed in the same manner as in Example 1. The results are shown in FIG. Wild type SpCas9 recognizes only when the third base of the PAM sequence is G, and the target plasmid DNA is cleaved, whereas mutant SpCas9 recognizes the PAM sequence other than G in the third base, The target plasmid DNA could be cleaved. Therefore, it was confirmed that the wild type SpCas9 recognizes the PAM sequence “NGG”, whereas the mutant SpCas9 recognizes the PAM sequence “NG”.
  • Example 3 Using the mutant SpCas9 (m43, m61 to m66) prepared in Example 1, a plasmid DNA cleavage activity measurement test was performed in the same manner as in Example 1. For detection of cleavage products, a MultiNA capillary electrophoresis apparatus (Shimadzu Corporation) was used. As the PAM sequence, 5′-TGC-3 ′, which is PAM sequence 4, was used. Cutting experiments were performed at 0.5 minutes (0.5 m) and 2 minutes (2 m). The results are shown in FIG. Excellent DNA cleavage activity was confirmed for m61, m63, m65 and m66.
  • Example 4 Using the mutant SpCas9 (m43, m61, m63 and m66) prepared in Example 1, a plasmid DNA cleavage activity measurement test was conducted in the same manner as in Example 1. Cutting experiments were performed at 0.5 minutes (0.5 m) and 2 minutes (2 m). The results are shown in FIG. In wild-type SpCas9, it recognizes only when the third base of the PAM sequence is G, and the target plasmid DNA is cleaved, whereas in mutant SpCas9, the third base recognizes a PAM sequence other than G, The target plasmid DNA could be cleaved. It was confirmed that m61, m63 and m66, particularly m63 and m66, can cleave DNA with high efficiency even when TGA and TGC PAM sequences, which were less efficient with m43, were used.
  • Example 5 Using the wild-type SpCas9 and mutant SpCas9 (WT, m43) prepared in Example 1 and the following mutant SpCas9 prepared in the same manner as in Example 1, a plasmid DNA cleavage activity measurement test was performed in the same manner as in Example 1. went. Cutting experiments were performed over time (0, 0.5, 1, 2, 5 minutes). The results are shown in FIG. The rise of cleavage activity comparable to WT was confirmed at m43.
  • Base sequence of mutant SpCas9 gene (R1335A / G1218R / T1337R / L1111R / A1322R / D1135V): base sequence obtained by converting gac at positions 3403-3405 to gtt with respect to the base sequence of m25 (SEQ ID NO: 12).

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Abstract

本発明は、ガイドＲＮＡとの結合能は維持しつつ標的配列の制限が緩和された改変されたＣａｓ９タンパク質及びその用途を提供することを目的とする。配列番号１において１３３５位のアルギニンがアラニン（Ｒ１３３５Ａ）、イソロイシン（Ｒ１３３５Ｉ）、メチオニン（Ｒ１３３５Ｍ）、スレオニン（Ｒ１３３５Ｔ）又はバリン（Ｒ１３３５Ｖ）に、１１１１位のロイシンがアルギニンに（Ｌ１１１１Ｒ）、１１３５位のアスパラギン酸がバリンに（Ｄ１１３５Ｖ）、１２１８位のグリシンがアルギニンに（Ｇ１２１８Ｒ）、１２１９位のグルタミン酸がフェニルアラニンに（Ｅ１２１９Ｆ）、１３２２位のアラニンがアルギニンに（Ａ１３２２Ｒ）、１３３７位のスレオニンがアルギニンに（Ｔ１３３７Ｒ）に変異したアミノ酸配列を含むタンパク質等。

Description

改変されたＣａｓ９タンパク質及びその用途
　本発明は、より標的可能な領域が拡張された、改変されたＣａｓ９タンパク質及びその用途に関する。
　クラスター化した規則的な配置の短い回文反復配列（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ　Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ　Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ　Ｓｈｏｒｔ　Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ　Ｒｅｐｅａｔｓ：ＣＲＩＳＰＲ）は、Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）遺伝子と共に、細菌及び古細菌において侵入外来核酸に対する獲得耐性を提供する適応免疫系を構成することが知られている。ＣＲＩＳＰＲは、ファージまたはプラスミドＤＮＡに起因することが多く、大きさの類似するスペーサーと呼ばれる独特の可変ＤＮＡ配列が間に入った、２４～４８ｂｐの短い保存された反復配列からなる。また、リピート及びスペーサー配列の近傍には、Ｃａｓタンパク質ファミリーをコードする遺伝子群が存在する。
　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムにおいて、外来性のＤＮＡは、Ｃａｓタンパク質ファミリーによって３０ｂｐ程度の断片に切断され、ＣＲＩＳＰＲに挿入される。Ｃａｓタンパク質ファミリーの一つであるＣａｓ１及びＣａｓ２タンパク質は、外来性ＤＮＡのｐｒｏｔｏ－ｓｐａｃｅｒ　ａｄｊａｃｅｎｔ　ｍｏｔｉｆ（ＰＡＭ）と呼ばれる塩基配列を認識して、その上流を切り取って、宿主のＣＲＩＳＰＲ配列に挿入し、これが細菌の免疫記憶となる。免疫記憶を含むＣＲＩＳＰＲ配列が転写されて生成したＲＮＡ（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡと呼ぶ。）は、一部相補的なＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ）と対合し、Ｃａｓタンパク質ファミリーの一つであるＣａｓ９タンパク質に取り込まれる。Ｃａｓ９に取り込まれたｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡはＲＮａｓｅＩＩＩにより切断され、外来配列（ガイド配列）を含む小さなＲＮＡ断片（ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡｓ：ｃｒＲＮＡｓ）となり、Ｃａｓ９－ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が形成される。Ｃａｓ９－ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体はｃｒＲＮＡと相補的な外来侵入性ＤＮＡに結合し、ＤＮＡを切断する酵素（ｎｕｃｌｅａｓｅ）であるＣａｓ９タンパク質が、外来侵入性ＤＮＡを切断することよって、外から侵入したＤＮＡの機能を抑制及び排除する。
　Ｃａｓ９タンパク質は外来侵入性ＤＮＡ中のＰＡＭ配列を認識して、その上流で二本鎖ＤＮＡを平滑末端になるように切断する。ＰＡＭ配列の長さや塩基配列は細菌種によってさまざまであり、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）では「ＮＧＧ」の３塩基を認識する。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）は２つのＣａｓ９を持っており、それぞれ「ＮＧＧＮＧ」又は「ＮＮＡＧＡＡ」の５～６塩基をＰＡＭ配列として認識する。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ　ｎｏｖｉｃｉｄａ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）では「ＮＧＲ」の３塩基を認識する。ＰＡＭ配列の上流の何ｂｐのところを切断するかも細菌種によって異なるが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓを含め大部分のＣａｓ９オルソログはＰＡＭ配列の３塩基上流を切断する。
　近年、細菌でのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを、ゲノム編集に応用する技術が盛んに開発されている。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを融合させて、ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡキメラ（以下、ガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ　ＲＮＡ：ｇＲＮＡ）と呼ぶ。）として発現させ、活用している。これによりｎｕｃｌｅａｓｅ（ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ　ｎｕｃｌｅａｓｅ：ＲＧＮ）を呼び込み、目的の部位でゲノムＤＮＡを切断する。
　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムには、ｔｙｐｅＩ、ＩＩ、ＩＩＩがあるが、ゲノム編集で用いるのはもっぱらｔｙｐｅＩＩ　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムであり、ｔｙｐｅＩＩではＲＧＮとしてＣａｓ９タンパク質が用いられている。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質はＮＧＧという３つの塩基をＰＡＭ配列として認識するため、グアニンが２つ並んだ配列がありさえすればその上流を切断できる。
　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いた方法は、目的のＤＮＡ配列と相同な短いｇＲＮＡを合成するだけでよく、単一のタンパク質であるＣａｓ９タンパク質を用いてゲノム編集ができる。そのため、従来用いられていたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）やトランス活性化因子様作動体（ＴＡＬＥＮ）のようにＤＮＡ配列ごとに異なる大きなタンパク質を合成する必要がなく、簡便かつ迅速にゲノム編集を行うことができる。
　特許文献１には、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを活用したゲノム編集技術が開示されている。
　特許文献２には、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを活用したゲノム編集技術が開示されている。さらに、特許文献２には、Ｃａｓ９タンパク質のＤ３１Ａ又はＮ８９１Ａ変異体が、一方のＤＮＡ鎖のみにｎｉｃｋを入れるＤＮＡ切断酵素であるｎｉｃｋａｓｅとして機能することが開示されている。さらに、ＤＮＡ切断後の修復メカニズムで挿入欠失などの変異を起こしやすい非相同末端結合の発生率は少ないままで、野生型Ｃａｓ９タンパク質と同程度の相同組み換え効率を有することが示されている。
　非特許文献１には、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９を使用したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムであって、２つのＣａｓ９タンパク質のＤ１０Ａ変異体と、該Ｄ１０Ａ変異体と複合体を形成する１対の標的特異的ガイドＲＮＡを利用するダブルニッカーゼシステムが開示されている。各Ｃａｓ９タンパク質のＤ１０Ａ変異体及び標的特異的ガイドＲＮＡの複合体は、ガイドＲＮＡと相補するＤＮＡ鎖に１つだけニックを作る。一対のガイドＲＮＡは約２０塩基程度ずれており、標的ＤＮＡの反対鎖に位置する標的配列のみを認識する。各Ｃａｓ９タンパク質のＤ１０Ａ変異体及び標的特異的ガイドＲＮＡの複合体によって作られた２つのニックはＤＮＡ二本鎖切断（ＤＮＡ　ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ　ｂｒｅａｋ：ＤＳＢ）を模倣する状態になり、一対のガイドＲＮＡを利用することで高レベルの効率を維持しつつ、Ｃａｓ９タンパク質媒介型遺伝子編集の特異性を改善できることが示されている。
　特許文献３には、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質の各種変異体が、特許文献４には、Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣａｓ９タンパク質の各種変異体が開示されている。
ＷＯ２０１４／０９３６６１ 特表２０１５－５１０７７８号公報 ＷＯ２０１６／１４１２２４ ＷＯ２０１７／０１０５４３
Ran, F. A., et al., Double Nicking by RNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced Genome Editing Specificity, Cell, vol.154, p1380-1389, 2013.
　特許文献１に開示されているＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９（本明細書中、ＳｐＣａｓ９とも称する）タンパク質は、認識可能なＰＡＭ配列が「ＮＧＧ（Ｎは任意の塩基）」の２塩基である。また、非特許文献１に開示されているダブルニッカーゼシステムでは、ＳｐＣａｓ９タンパク質を使用しており、認識可能なＰＡＭ配列が標的配列内のセンス鎖及びアンチセンス鎖に１か所ずつ計２か所必要となるため、さらに編集可能な標的配列が制限される。
　このように従来のＣａｓ９タンパク質には、認識可能なＰＡＭ配列に制限があるため、編集可能な標的配列が制限されるという問題点があった。
　本発明は、ガイドＲＮＡとの結合能は維持しつつ標的配列の制限が緩和された改変されたＣａｓ９タンパク質及びその用途を提供することを目的とする。
　本発明者らは、Ｃａｓ９タンパク質として、ＳｐＣａｓ９タンパク質に着目し、上記課題を解決すべく鋭意検討した。結果、ＳｐＣａｓ９タンパク質の所定の位置のアミノ酸を特定のアミノ酸に置換する（変異を導入する）ことによって、ガイドＲＮＡとの結合能は維持しつつ、従来ＮＧＧ（Ｎは任意の塩基）の２塩基であったＰＡＭ配列をＮＧの１塩基の配列とすることに成功し、本発明を完成するに至った。
　本明細書中、変異を導入する前のＣａｓ９タンパク質を野生型Ｃａｓ９タンパク質、変異を導入した後のＣａｓ９タンパク質を改変されたＣａｓ９タンパク質あるいは変異型Ｃａｓ９タンパク質と称する場合がある。
　即ち、本発明は以下の通りである。
［１］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１３３５位のアルギニンがアラニン、グリシン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、バリン、スレオニン、アスパラギン及びアスパラギン酸からなる群より選ばれる１つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有するタンパク質。
［２］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、さらに１２１９位に変異を有する、上記［１］に記載のタンパク質。
［３］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、さらに１３２２位に変異を有する、上記［１］又は［２］に記載のタンパク質。
［４］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１３３５位のアルギニンがアラニン、グリシン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、バリン、スレオニン、アスパラギン及びアスパラギン酸からなる群より選ばれる１つのアミノ酸で置換され、さらに１２１９位に変異を有するアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有するタンパク質。
［５］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１３３５位のアルギニンがアラニン、グリシン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、バリン、スレオニン、アスパラギン及びアスパラギン酸からなる群より選ばれる１つのアミノ酸で置換され、さらに１３２２位に変異を有するアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有するタンパク質。
［６］１３３５位のアルギニンの置換がアラニンへの置換である、上記［１］～［５］のいずれかに記載のタンパク質。
［７］１３３５位のアルギニンの置換がイソロイシン、メチオニン、スレオニン又はバリンへの置換である、上記［１］～［５］のいずれかに記載のタンパク質。
［８］１２１９位の変異がグルタミン酸のフェニルアラニンへの置換である、上記［２］又は［４］記載のタンパク質。
［９］１３２２位の変異がアラニンのアルギニン、ヒスチジン又はリジンへの置換である、上記［３］又は［５］記載のタンパク質。
［１０］１３２２位の変異がアラニンのアルギニンへの置換である、上記［９］記載のタンパク質。
［１１］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、さらに、１１１１位、１１３５位、１２１８位及び１３３７位からなる群より選択される少なくとも１つの位置に変異を有する、上記［１］～［１０］のいずれかに記載のタンパク質。
［１２］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、さらに、１１１１位、１１３５位、１２１８位及び１３３７位からなる群より選択される少なくとも２つの位置に変異を有する、上記［１１］に記載のタンパク質。
［１３］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、さらに、１１１１位、１１３５位、１２１８位及び１３３７位からなる群より選択される少なくとも３つの位置に変異を有する、上記［１１］に記載のタンパク質。
［１４］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、さらに、１１１１位、１１３５位、１２１８位及び１３３７位に変異を有する、上記［１１］に記載のタンパク質。
［１５］１１１１位の変異がロイシンのアルギニン、ヒスチジン又はリジンへの置換であり；
　１１３５位の変異がアスパラギン酸のバリンへの置換であり；
　１２１８位の変異がグリシンのアルギニン、ヒスチジン又はリジンへの置換であり；
　１３３７位の変異がスレオニンのアルギニン、ヒスチジン又はリジンへの置換である、上記［１１］～［１４］のいずれかに記載のタンパク質。
［１６］配列番号１の変異が施された位置以外の部位において８０％以上の同一性を有する、上記［１］～［１５］のいずれかに記載のタンパク質。
［１７］配列番号１の変異が施された位置以外の部位において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加された、上記［１］～［１５］のいずれかに記載のタンパク質。
［１８］ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する、上記［１］～［１７］のいずれかに記載のタンパク質。
［１９］さらに、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、ヌクレアーゼ活性を一部あるいは全部を欠失する変異を有する、上記［１］～［１６］のいずれかに記載のタンパク質。
［２０］ヌクレアーゼ活性を一部あるいは全部欠失する変異が、配列番号１で表されるアミノ酸配列における、(ｉ)１０位、７６２位、８３９位、９８３位及び９８６位からなる群より選択される少なくとも１つの位置又はそれに相当する位置、及び／又は（ｉｉ）８４０位及び８６３位からなる群より選択される位置又はそれに相当する位置における変異である、上記［１９］に記載のタンパク質。
［２１］１０位のアスパラギン酸がアラニン又はアスパラギンに置換し；又は
　８４０位のヒスチジンがアラニン、アスパラギン又はチロシンに置換している、上記［２０］に記載のタンパク質。
［２２］転写制御因子タンパク質又はドメインを連結した、上記［１９］～［２１］のいずれかに記載のタンパク質。
［２３］転写制御因子が転写活性化因子である、上記［２２］記載のタンパク質。
［２４］転写制御因子が転写サイレンサー又は転写抑制因子である、上記［２２］記載のタンパク質。
［２５］上記［１］～［２４］のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸。
［２６］上記［１］～［２４］のいずれかに記載のタンパク質と、標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ（Proto-spacer Adjacent Motif）配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むガイドＲＮＡと、を備えるタンパク質－ＲＮＡ複合体。
［２７］標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に改変するための方法であって、
　標的二本鎖ポリヌクレオチドと、タンパク質と、ガイドＲＮＡとを混合し、インキュベートする工程と、
　前記タンパク質が、ＰＡＭ配列の上流に位置する結合部位で前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを改変する工程と、を備え、
　前記標的二本鎖ポリヌクレオチドは、ＮＧ（Ｎは任意の塩基を、Ｇはグアニンをそれぞれ意味する）からなるＰＡＭ配列を有し、
　前記タンパク質は、上記［１］～［２４］のいずれかに記載のタンパク質であり、
　前記ガイドＲＮＡは、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中の前記ＰＡＭ配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものである方法。
［２８］改変が、標的二本鎖ポリヌクレオチドの部位特異的な切断である、上記［２７］記載の方法。
［２９］改変が、標的二本鎖ポリヌクレオチドにおける部位特異的な、１以上のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は付加である、上記［２７］記載の方法。
［３０］細胞の標的遺伝子の発現を増大させる方法であって、前記細胞内で上記［２３］に記載のタンパク質と、前記標的遺伝子に対する１つ又は複数のガイドＲＮＡとを発現させることを含む、方法。
［３１］細胞の標的遺伝子の発現を減少させる方法であって、前記細胞内で上記［２４］に記載のタンパク質と、前記標的遺伝子に対する１つ又は複数のガイドＲＮＡとを発現させることを含む、方法。
［３２］細胞が真核細胞である、上記［３０］又は［３１］に記載の方法。
［３３］細胞が酵母細胞、植物細胞又は動物細胞である、上記［３０］又は［３１］に記載の方法。
　本発明によれば、ガイドＲＮＡへの結合力を保ちながら、ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質を得ることができる。また、前記Ｃａｓ９タンパク質を利用した簡便且つ迅速で標的配列に部位特異的なゲノム編集技術を提供することができる。
図１Ａは、実施例１におけるＤＮＡ切断活性測定試験のアガロースゲル電気泳動の結果を表わした図である。ＰＡＭ配列として「ＴＧＴ」を用い、制限酵素としてＥｃｏＲＩを用いた。 図１Ｂは、実施例１におけるＤＮＡ切断活性測定試験のアガロースゲル電気泳動の結果を表わした図である。ＰＡＭ配列として「ＴＧＧ」を用い、制限酵素としてＨｉｎｄＩＩＩを用いた。 図１Ｃは、実施例１におけるＤＮＡ切断活性測定試験のアガロースゲル電気泳動の結果を表わした図である。ＰＡＭ配列として「ＴＧＮＡ」を用い、制限酵素としてＢａｍＨＩを用いた。 図１Ｄは、実施例１におけるＤＮＡ切断活性測定試験のアガロースゲル電気泳動の結果を表わした図である。ＰＡＭ配列として「ＴＧＮ」を用い、制限酵素としてＢａｍＨＩを用いた。 図２は、実施例２におけるＤＮＡ切断活性測定試験のアガロースゲル電気泳動の結果を表わした図である。 図３は、実施例３におけるＤＮＡ切断活性測定試験の結果を表わしたグラフである。ＰＡＭ配列として「ＴＧＡ」を用い、制限酵素としてＢａｍＨＩを用いた。 図４は、実施例４におけるＤＮＡ切断活性測定試験の結果を表わしたグラフである。 図５は、実施例５におけるＤＮＡ切断活性測定試験の結果を表わしたグラフである。
　以下、本発明を説明する。本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味を有する。
＜ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質＞
　本実施形態のタンパク質は、ガイドＲＮＡへの結合力を保ちながら、ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質である。本実施形態のタンパク質によれば、簡便且つ迅速で標的配列に部位特異的なゲノム編集技術を提供することができる。
　本明細書中において、「ガイドＲＮＡ」とは、ｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡのヘアピン構造を模倣したものであり、標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ配列の１塩基上流から、好ましくは２０塩基以上２４塩基以下、より好ましくは２２塩基以上２４塩基以下までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを５’末端領域に含むものである。さらに、標的二本鎖ポリヌクレオチドと非相補的な塩基配列からなり、一点を軸として対称に相補的な配列になるように並び、ヘアピン構造をとり得る塩基配列からなるポリヌクレオチドを１つ以上含んでいてもよい。
　ガイドＲＮＡは、本発明の変異型Ｃａｓ９タンパク質と結合して、該タンパク質を標的ＤＮＡに導く機能を有する。ガイドＲＮＡは、その５’末端に標的ＤＮＡに相補的な配列を有し、該相補的な配列を介して標的ＤＮＡに結合することにより、本発明の変異型Ｃａｓ９タンパク質を標的ＤＮＡに導く。変異型Ｃａｓ９タンパク質がＤＮＡエンドヌクレアーゼとして機能する場合には、標的ＤＮＡが存在する部位でＤＮＡを切断し、例えば、標的ＤＮＡの機能を特異的に喪失させることができる。
　ガイドＲＮＡは、切断あるいは修飾すべき標的ＤＮＡの配列情報に基づき設計され調製される。具体的には実施例で用いられるような配列が挙げられる。
　本明細書において、「エンドヌクレアーゼ」とは、ヌクレオチド鎖の途中を切断する酵素を意味する。よって、エンドヌクレアーゼ活性を有する、本実施形態のＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質は、ガイドＲＮＡにより誘導され、ＤＮＡ鎖の途中を切断する酵素活性を有する。
　本明細書において、「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」とは、アミノ酸残基のポリマーを意味し、互換的に使用される。また、１つ若しくは複数のアミノ酸が、天然に存在する対応アミノ酸の化学的類似体、又は修飾誘導体である、アミノ酸ポリマーを意味する。
　本明細書中において、「配列」とは、任意の長さのヌクレオチド配列を意味しており、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、線状、環状、又は分岐状であり、一本鎖又は二本鎖である。
　本明細書中において、「ＰＡＭ配列」とは、標的二本鎖ポリヌクレオチド中に存在し、Ｃａｓ９タンパク質により認識可能な配列を意味し、ＰＡＭ配列の長さや塩基配列は細菌種によって異なる。本実施形態のＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質により認識可能な配列は、「５’－ＮＧ－３’」で表すことができる。
　なお、本明細書において、「Ｎ」は、アデニン、シトシン、チミン及びグアニンからなる群から選択された任意の１塩基を意味し、「Ａ」はアデニン、「Ｇ」はグアニン、「Ｃ」はシトシン、「Ｔ」はチミン、「Ｒ」はプリン骨格を有する塩基（アデニン又はグアニン）、「Ｙ」はピリミジン骨格を有する塩基（シトシン又はチミン）を意味する。
　本明細書中において、「ポリヌクレオチド」とは、線状又は環状配座であり、一本鎖又は二本鎖形態のいずれかである、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを意味し、ポリマーの長さに関して制限するものとして解釈されるものではない。また、天然ヌクレオチドの公知の類似体、並びに塩基部分、糖部分及びリン酸部分のうち少なくとも一つの部分において修飾されるヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート骨格）を包含する。一般に、特定ヌクレオチドの類似体は、同一の塩基対合特異性を有し、例えば、Ａの類似体は、Ｔと塩基対合する。
　一実施形態において、本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１３３５位に変異を有するアミノ酸配列からなり、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有するタンパク質（態様１）を提供する。加えて、態様１のタンパク質はＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する。
　配列番号１は、ＳｐＣａｓ９タンパク質の全長アミノ酸配列である。ＳｐＣａｓ９タンパク質中のＰＡＭ配列認識部位の配列は、配列番号１の１０９７番目～１３６８番目までの２７１残基からなるアミノ酸配列である。
　配列番号１の１３３５位における変異は、具体的には、１３３５位のアルギニンの、アラニン、グリシン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、スレオニン、バリン、アスパラギン及びアスパラギン酸からなる群より選ばれる１つのアミノ酸への置換である。好ましくはアラニンへの置換である。また、１３３５位における別の好ましい変異は、イソロイシン、メチオニン、スレオニン又はバリンへの置換である。
　１３３５位における変異によりＰＡＭ配列中の３番目のグアニン（５’－ＮＧ『Ｇ』－３’）との水素結合がなくなるため、該タンパク質のＰＡＭ配列の認識を広範化することができる。
　本発明の別の一実施態様において、本発明は、前記態様１の変異に加えて、さらに１２１９位に変異を有し、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有するタンパク質（態様２）を提供する。加えて、態様２のタンパク質は、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する。
　該１２１９位における変異は、具体的には、１２１９位のグルタミン酸のフェニルアラニンへの置換である。
　１２１９位における変異は、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性の発現速度の上昇（維持）に寄与し得る。
　本発明の別の一実施態様において、本発明は、前記態様１又は２の変異に加えて、さらに１３２２位に変異を有し、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有するタンパク質（態様３）を提供する。加えて、態様３のタンパク質は、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する。
　該１３２２位における変異は、具体的には、１３２２位のアラニンのアルギニン、ヒスチジン又はリジンへの置換である。好ましくは、アルギニンへの置換である。
　１３２２位における変異は、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性の活性上昇（活性維持）に寄与し得る。
　本発明の別の一実施態様において、本発明は、前記態様１、２又は３の変異に加えて、さらに、１１１１位、１１３５位、１２１８位及び１３３７位からなる群より選択される少なくとも１つ、好ましくは２つ、より好ましくは３つ、特に好ましくは４つ全ての位置に変異を有し、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有するタンパク質（態様４）を提供する。態様４のタンパク質はＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する。
　該１１１１位における変異は、具体的には、１１１１位のロイシンのアルギニン、ヒスチジン又はリジンへの置換である。好ましくは、アルギニンへの置換である。
　該１１３５位における変異は、具体的には、１１３５位のアスパラギン酸のバリンへの置換である。
　該１２１８位における変異は、具体的には、１２１８位のグリシンのアルギニン、ヒスチジン又はリジンへの置換である。好ましくは、アルギニンへの置換である。
　該１３３７位における変異は、具体的には、１３３７位のスレオニンのアルギニン、ヒスチジン又はリジンへの置換である。好ましくは、アルギニンへの置換である。
　本発明の別の一実施態様において、本発明は、前記態様１、２、３又は４の変異に加えて、さらに、（ｉ）１０位、７６２位、８３９位、９８３位、９８６位からなる群より選択される少なくとも１つの位置、及び／又は（ｉｉ）８４０位及び８６３位からなる群より選択される位置に変異を有し、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有するタンパク質（態様５）を提供する。
　該１０位における変異は、具体的には、１０位のアスパラギン酸のアラニン又はアスパラギンへの置換である。
　該７６２位における変異は、具体的には、７６２位のグルタミン酸のグルタミンへの置換である。
　該８３９位における変異は、具体的には、８３９位のアスパラギン酸のアラニン又はアスパラギンへの置換である。
　該９８３位における変異は、具体的には、９８３位のヒスチジンのアスパラギン又はチロシンへの置換である。
　該９８６位における変異は、具体的には、９８６位のアスパラギン酸のアスパラギンへの置換である。
　該８４０位における変異は、具体的には、８４０位のヒスチジンのアラニン、アスパラギン又はチロシンへの置換である。
　該８６３位における変異は、具体的には、８６３位のアスパラギンのアスパラギン酸、セリン又はヒスチジンへの置換である。
　態様５として好ましくは、１０位のアスパラギン酸がアラニン若しくはアスパラギンに置換し、又は８４０位のヒスチジンが、アラニン、アスパラギン若しくはチロシンに置換したタンパク質である。
　（ｉ）の変異又は（ｉｉ）の変異を有する態様５のタンパク質は、ニッカーゼ活性を有する。
　（ｉ）の変異及び（ｉｉ）の変異を有する態様５のタンパク質は、ガイドＲＮＡと結合し標的ＤＮＡへと運ばれるがエンドヌクレアーゼ活性が失活している。
　本発明の別の一実施態様において、本発明は、前記態様１～５のタンパク質と機能的に同等なタンパク質（態様６）を提供する。前記態様１～５のタンパク質と機能的に同等であるためには配列番号１で表されるアミノ酸配列において、前記態様１～５で変異が施された位置以外の部位において、８０％以上の配列同一性を有し、且つガイドＲＮＡとの結合能を有する。変異によりアミノ酸に増減があった場合には、該「変異が施された位置以外の部位」は「変異が施された位置に相当する位置以外の部位」と解することができる。係る同一性としては、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上が更に好ましく、９５％以上が特に好ましく、９９％以上が最も好ましい。アミノ酸配列同一性は自体公知の方法により決定できる。例えば、アミノ酸配列同一性（％）は、当該分野で慣用のプログラム（例えば、BLAST、FASTA等）を初期設定で用いて決定することができる。また、別の局面では、同一性（％）は、当該分野で公知の任意のアルゴリズム、例えば、Needlemanら(1970) (J. Mol. Biol. 48: 444-453)、Myers及びMiller (CABIOS, 1988, 4: 11-17)のアルゴリズム等を使用して決定することができる。Needlemanらのアルゴリズムは、GCGソフトウェアパッケージ(www.gcg.comで入手可能)のGAPプログラムに組み込まれており、同一性（％）は、例えば、BLOSUM 62 matrix又はPAM250 matrix、並びにgap weight: 16、14、12、10、8、6若しくは4、及びlength weight: 1、2、3、4、5若しくは6のいずれかを使用することによって決定することができる。また、Myers及びMillerのアルゴリズムは、GCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラムに組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、例えば、PAM120 weight residue table、gap length penalty 12、gap penalty 4を用いることができる。
　前記態様１～５のタンパク質と機能的に同等なタンパク質として、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、前記態様１～５で変異が施された位置以外の部位において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加され、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有するタンパク質（態様７）が提供される。変異によりアミノ酸に増減があった場合には、該「変異が施された位置以外の部位」は「変異が施された位置に相当する位置以外の部位」と解することができる。
　「アミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加」を人為的に行う場合の手法としては、例えば、所定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このＤＮＡを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Nucleic Acids Res., 12, 9441-9456 (1984)）、変異導入用プライマーを用いたPCRによる方法等が挙げられる。
　前記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも1残基、具体的には1若しくは数個、またはそれ以上である。また前記置換、欠失、挿入または付加のうち、特にアミノ酸の置換が好ましい。当該置換は、疎水性、電荷、pK、立体構造上における特徴等の類似した性質を有するアミノ酸への置換がより好ましい。このような置換としては、例えば、i)グリシン、アラニン；ii)バリン、イソロイシン、ロイシン；iii)アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；iv)セリン、スレオニン；v)リジン、アルギニン；vi)フェニルアラニン、チロシンのグループ内での置換が挙げられる。
　本発明のＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質として、好ましくは、配列番号１において１３３５位のアルギニンがアラニンに（Ｒ１３３５Ａ）、１１１１位のロイシンがアルギニンに（Ｌ１１１１Ｒ）、１１３５位のアスパラギン酸がバリンに（Ｄ１１３５Ｖ）、１２１８位のグリシンがアルギニンに（Ｇ１２１８Ｒ）、１２１９位のグルタミン酸がフェニルアラニンに（Ｅ１２１９Ｆ）、１３２２位のアラニンがアルギニンに（Ａ１３２２Ｒ）、１３３７位のスレオニンがアルギニンに（Ｔ１３３７Ｒ）に変異したアミノ酸配列（配列番号１８）を含むタンパク質が挙げられる。
　配列番号１において１３３５位のアルギニンがイソロイシン（Ｒ１３３５Ｉ）、メチオニン（Ｒ１３３５Ｍ）、スレオニン（Ｒ１３３５Ｔ）又はバリン（Ｒ１３３５Ｖ）に（より好ましくはＲ１３３５Ｍ及びＲ１３３５Ｖ）、１１１１位のロイシンがアルギニンに（Ｌ１１１１Ｒ）、１１３５位のアスパラギン酸がバリンに（Ｄ１１３５Ｖ）、１２１８位のグリシンがアルギニンに（Ｇ１２１８Ｒ）、１２１９位のグルタミン酸がフェニルアラニンに（Ｅ１２１９Ｆ）、１３２２位のアラニンがアルギニンに（Ａ１３２２Ｒ）、１３３７位のスレオニンがアルギニンに（Ｔ１３３７Ｒ）に変異したアミノ酸配列を含むタンパク質もまた本発明のＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質として好ましい。該タンパク質は、それぞれ、配列番号１８において１３３５位のアラニンがイソロイシン、メチオニン、スレオニン又はバリンに変異したアミノ酸配列を含むタンパク質に相当する。
　本明細書中、置換箇所までのアミノ酸残基数を表わす数字の左側に表示したアルファベットは置換前のアミノ酸の1文字表記を示し、右側に表示したアルファベットは置換後のアミノ酸の1文字表記を示している。
　本実施形態におけるＰＡＭ認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質は、例えば次のような方法により作成することができる。まず、前記ＰＡＭ認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含むベクターを用いて、宿主を形質転換する。続いて、当該宿主を培養して前記タンパク質を発現させる。培地の組成、培養の温度、時間、誘導物質の添加等の条件は、形質転換体が生育し、前記タンパク質が効率よく産生されるよう、公知の方法に従って当業者が決定できる。また、例えば、選択マーカーとして抗生物質抵抗性遺伝子を発現ベクターに組み込んだ場合、培地に抗生物質を加えることにより、形質転換体を選択することができる。続いて、宿主が発現した前記タンパク質を適宜自体公知の方法により精製することにより、ＰＡＭ認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質が得られる。
　宿主としては、特に限定されず、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、又は、大腸菌、枯草菌、酵母等の微生物が挙げられる。 
＜ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質－ガイドＲＮＡ複合体＞
　一実施形態において、本発明は、上述の＜ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質＞において示されたタンパク質と、標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ（Ｐｒｏｔｏ－ｓｐａｃｅｒ　Ａｄｊａｃｅｎｔ　Ｍｏｔｉｆ）配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むガイドＲＮＡと、を備えるタンパク質－ＲＮＡ複合体を提供する。 
　本実施形態のタンパク質－ＲＮＡ複合体によれば、ＰＡＭ配列が広範化され、簡便且つ迅速で標的配列に対し部位特異的な標的二本鎖ポリヌクレオチドの編集をすることができる。 
　前記タンパク質及び前記ガイドＲＮＡは、iｎ　ｖｉｔｒｏ及びiｎ　ｖｉｖｏにおいて、温和な条件で混合することで、タンパク質－ＲＮＡ複合体を形成することができる。温和な条件とは、タンパク質が分解又は変性しない程度の温度及びｐＨを示しており、温度は４℃以上４０℃以下が好ましく、ｐＨは４以上１０以下が好ましい。
　また、前記タンパク質及び前記ガイドＲＮＡを混合し、インキュベートする時間は、０．５時間以上１時間以下が好ましい。前記タンパク質及び前記ガイドＲＮＡによる複合体は、安定しており、室温で数時間静置しても安定性を保つことができる。 
＜ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクターシステム＞
　一実施形態において、本発明は、上述の＜ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質＞において示されたタンパク質をコードする遺伝子を含む第１のベクターと、標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むガイドＲＮＡを含む第２のベクターと、を備えるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクターシステムを提供する。 
　本実施形態のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクターシステムによれば、ＰＡＭ配列が広範化され、簡便且つ迅速で標的配列に対し部位特異的な標的二本鎖ポリヌクレオチドの編集をすることができる。 
　ガイドＲＮＡは、標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ配列の１塩基上流から、好ましくは２０塩基以上２４塩基以下、より好ましくは２２塩基以上２４塩基以下までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを５’末端領域に含むものを適宜設計すればよい。さらに、標的二本鎖ポリヌクレオチドと非相補的な塩基配列からなり、一点を軸として対称に相補的な配列になるように並び、ヘアピン構造をとり得る塩基配列からなるポリヌクレオチドを１つ以上含んでいてもよい。
　本実施形態のベクターは、発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターとしては特に制限されず、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等の大腸菌由来のプラスミド；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のプラスミド；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等の酵母由来プラスミド；λファージ等のバクテリオファージ；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス等のウイルス；及びこれらを改変したベクター等を用いることができる。 
　上述の発現ベクターにおいて、前記Ｃａｓ９タンパク質、及び前記ガイドＲＮＡ発現用プロモーターとしては特に限定されず、例えば、ＥＦ１αプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウィルス）プロモーター、ＨＳＶ－ｔｋプロモーター等の動物細胞における発現用のプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、ＲＥＦ（ｒｕｂｂｅｒ
　ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ）プロモーター等の植物細胞における発現用のプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、ｐ１０プロモーター等の昆虫細胞における発現用のプロモーター等を使用することができる。これらプロモーターは、前記Ｃａｓ９タンパク質、及び前記ガイドＲＮＡ、又は前記Ｃａｓ９タンパク質、及び前記ガイドＲＮＡを発現する細胞の種類に応じて、適宜選択することができる。
　上述の発現ベクターは、さらに、マルチクローニングサイト、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、複製起点等を有していてもよい。
＜標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に改変するための方法＞
［第１実施形態］
　一実施形態において、本発明は、標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に改変するための方法であって、
　標的二本鎖ポリヌクレオチドと、タンパク質と、ガイドＲＮＡとを混合し、インキュベートする工程と、前記タンパク質が、ＰＡＭ配列の上流に位置する結合部位で前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを改変する工程と、を備え、
　前記標的二本鎖ポリヌクレオチドは、ＮＧ（Ｎは任意の塩基を、Ｇはグアニンをそれぞれ意味する）からなるＰＡＭ配列を有し、
　前記タンパク質は、上述の＜ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質＞において示されたタンパク質であり、
　前記ガイドＲＮＡは、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中の前記ＰＡＭ配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものである方法を提供する。
　本実施形態の方法によれば、ＰＡＭ配列が広範化された変異型Ｃａｓ９タンパク質を用いることで、簡便であって迅速、且つ標的配列に対し部位特異的に標的二本鎖ポリヌクレオチドを改変することができる。 
　本実施形態において、標的二本鎖ポリヌクレオチドは、ＮＧ（Ｎは任意の塩基を、Ｇはグアニンをそれぞれ意味する）からなるＰＡＭ配列を有するものであればよく、特別な限定はない。
　本実施形態において、タンパク質及びガイドＲＮＡについては、上述の＜ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質＞において示されたとおりである。
　標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に改変するための方法について、以下に詳細を説明する。
　まず、前記タンパク質及び前記ガイドＲＮＡを温和な条件で混合し、インキュベートする。温和な条件とは、上述のとおりである。インキュベートする時間は、０．５時間以上１時間以下が好ましい。前記タンパク質及び前記ガイドＲＮＡによる複合体は、安定しており、室温で数時間静置しても安定性を保つことができる。
　次に、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド上において、前記タンパク質及び前記ガイドＲＮＡは複合体を形成する。前記タンパク質は、「５’－ＮＧ－３’」からなるＰＡＭ配列を認識し、ＰＡＭ配列の上流に位置する結合部位で、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに結合する。前記タンパク質がエンドヌクレアーゼ活性を有する場合当該部位で該ポリヌクレオチドを切断する。前記Ｃａｓ９タンパク質がＰＡＭ配列を認識し、ＰＡＭ配列を起点として、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの二重らせん構造が引き剥され、前記ガイドＲＮＡ中の前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列とアニーリングすることで、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの二重らせん構造が部分的にほぐれる。このとき、前記Ｃａｓ９タンパク質は、ＰＡＭ配列の上流に位置する切断部位、及びＰＡＭ配列と相補的な配列の上流に位置する切断部位で、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドのリン酸ジエステル結合を切断する。 
［第２実施形態］
　本実施形態において、インキュベート工程の前に、さらに、上述のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクターシステムを用いて、上述の＜ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質＞において示されたタンパク質と、ガイドＲＮＡとを発現させる発現工程を備えていてもよい。 
　本実施形態の発現工程において、まず、上述のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクターシステムを用いて、Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡを発現させる。発現させる具体的な方法としては、Ｃａｓ９タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター、及びガイドＲＮＡを含む発現ベクターそれぞれを用いて、宿主を形質転換する。続いて、当該宿主を培養してＣａｓ９タンパク質、及びガイドＲＮＡを発現させる。培地の組成、培養の温度、時間、誘導物質の添加等の条件は、形質転換体が生育し、融合タンパク質が効率よく産生されるよう、公知の方法に従って当業者が決定できる。また、例えば、選択マーカーとして抗生物質抵抗性遺伝子を発現ベクターに組み込んだ場合、培地に抗生物質を加えることにより、形質転換体を選択することができる。続いて、宿主が発現したＣａｓ９タンパク質、及びガイドＲＮＡを適宜の方法により精製することにより、Ｃａｓ９タンパク質、及びガイドＲＮＡが得られる。 
＜標的二本鎖ヌクレオチドを部位特異的に修飾するための方法＞
［第１実施形態］
　一実施形態において、本発明は、標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に改変するための方法であって、
　標的二本鎖ポリヌクレオチドと、タンパク質と、ガイドＲＮＡとを混合し、インキュベートする工程と、前記タンパク質が、ＰＡＭ配列の上流に位置する結合部位で前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに結合する工程と、前記ガイドＲＮＡと前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、修飾された前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを得る工程と、を備え、
　前記標的二本鎖ポリヌクレオチドは、ＮＧ（Ｎは任意の塩基を、Ｇはグアニンをそれぞれ意味する）からなるＰＡＭ配列を有し、
　前記タンパク質は、上述の＜ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質＞
において示されたタンパク質であり、
　前記ガイドＲＮＡは、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中の前記ＰＡＭ配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものである方法を提供する。 
　本実施形態の方法によれば、ＰＡＭ配列が広範化されたＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼを用いることで、簡便であって迅速、且つ標的配列に対し部位特異的に標的二本鎖ポリヌクレオチドを修飾することができる。 
　本実施形態において、標的二本鎖ポリヌクレオチド、タンパク質及びガイドＲＮＡについては、上述の＜ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質＞、及び＜標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に改変するための方法＞において示されたとおりである。 
　標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に改変するための方法について、以下に詳細を説明する。標的二本鎖ポリヌクレオチドに部位特異的に結合するまでの工程は上述の＜標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に切断するための方法＞に示された工程と同様である。続いて、前記ガイドＲＮＡと前記二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、目的に応じた修飾が施された標的二本鎖ポリヌクレオチドを得ることができる。 
　本明細書中において、「改変」とは、標的二本鎖ポリヌクレオチドの塩基配列が変化することを意味する。例えば、標的二本鎖ポリヌクレオチドの切断、切断後の外因性配列の挿入（物理的挿入又は相同指向修復を介する複製による挿入）による標的二本鎖ポリヌクレオチドの塩基配列の変化、切断後の非相同末端連結（ＮＨＥＪ：切断により生じたＤＮＡ末端どうしが再び結合すること）に加え、機能的なタンパク質や塩基配列の付加による標的二本鎖ポリヌクレオチドの塩基配列の変化等が挙げられる。
　本実施形態における標的二本鎖ポリヌクレオチドの修飾により、標的二本鎖ポリヌクレオチドへの変異の導入、又は、標的二本鎖ポリヌクレオチドの機能を破壊、改変することができる。 
［第２実施形態］
　本実施形態において、インキュベート工程の前に、さらに、上述のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクターシステムを用いて、上述の＜ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質＞において示されたタンパク質と、ガイドＲＮＡとを発現させる発現工程を備えていてもよい。 
　本実施形態の発現工程において、まず、上述のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクターシステムを用いて、Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡを発現させる。発現させる具体的な方法としては、上述の＜標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に改変するための方法＞の［第２実施形態］において例示された方法と同様である。 
＜標的二本鎖ポリヌクレオチドを細胞内において部位特異的に改変するための方法＞
　一実施形態において、本発明は、標的二本鎖ポリヌクレオチドを細胞内において部位特異的に改変するための方法であって、
　上述のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクターシステムを細胞に導入し、上述の＜ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質＞において示されたタンパク質と、ガイドＲＮＡとを発現させる発現工程と、
　前記タンパク質が、ＰＡＭ配列の上流に位置する結合部位で前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに結合する工程と、
前記ガイドＲＮＡと前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、改変された前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを得る工程と、を備え、
　前記標的二本鎖ポリヌクレオチドは、ＮＧ（Ｎは任意の塩基を、Ｇはグアニンをそれぞれ意味する）からなるＰＡＭ配列を有し、
　前記ガイドＲＮＡは、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中の前記ＰＡＭ配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものである方法を提供する。 
　本実施形態の発現工程において、まず、上述のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクターシステムを用いて、細胞内において、Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡを発現させる。 
　本実施形態の方法の適用対象となる細胞の由来となる生物としては、例えば、原核生物、酵母、動物、植物、昆虫等が挙げられる。前記動物としては、特別な限定はなく、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット等が挙げられ、これらに限定されない。また、細胞の由来となる生物の種類は、所望の標的二本鎖ポリヌクレオチドの種類、目的等により任意に選択することができる。 
　本実施形態の方法の適用対象となる動物由来の細胞としては、例えば、生殖細胞（精子、卵子等）、生体を構成する体細胞、幹細胞、前駆細胞、生体から分離されたがん細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）、生体から分離され人為的に遺伝子改変された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が挙げられ、これらに限定されない。 
　生体を構成する体細胞としては、例えば、皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臓、眼、脳、神経組織等の任意の組織から採取される細胞等が挙げられ、これらに限定されない。体細胞として、より具体的には、例えば、線維芽細胞、骨髄細胞、免疫細胞（例えば、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、マクロファージ、単球、等）、赤血球、血小板、骨細胞、骨髄細胞、周皮細胞、樹状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、肝細胞、膵島細胞（例えば、α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞、ＰＰ細胞等）、軟骨細胞、卵丘細胞、グリア細胞、神経細胞（ニューロン）、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心筋細胞、食道細胞、筋肉細胞（例えば、平滑筋細胞、骨格筋細胞等）、メラニン細胞、単核細胞等が挙げられ、これらに限定されない。 
　幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞である。幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、がん幹細胞、毛包幹細胞等が挙げられ、これらに限定されない。 
　がん細胞とは、体細胞から派生して無限の増殖能を獲得した細胞である。がん細胞の由来となるがんとしては、例えば、乳がん（例えば、浸潤性乳管がん、非浸潤性乳管がん、炎症性乳がん等）、前立腺がん（例えば、ホルモン依存性前立腺がん、ホルモン非依存性前立腺がん等）、膵がん（例えば、膵管がん等）、胃がん（例えば、乳頭腺がん、粘液性腺がん、腺扁平上皮がん等）、肺がん（例えば、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、悪性中皮腫等）、結腸がん（例えば、消化管間質腫瘍等）、直腸がん（例えば、消化管間質腫瘍等）、大腸がん（例えば、家族性大腸がん、遺伝性非ポリポーシス大腸がん、消化管間質腫瘍等）、小腸がん（例えば、非ホジキンリンパ腫、消化管間質腫瘍等）、食道がん、十二指腸がん、舌がん、咽頭がん（例えば、上咽頭がん、中咽頭がん、下咽頭がん等）、頭頚部がん、唾液腺がん、脳腫瘍（例えば、松果体星細胞腫瘍、毛様細胞性星細胞腫、びまん性星細胞腫、退形成性星細胞腫等）、神経鞘腫、肝臓がん（例えば、原発性肝がん、肝外胆管がん等）、腎臓がん（例えば、腎細胞がん、腎盂と尿管の移行上皮がん等）、胆嚢がん、胆管がん、膵臓がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、卵巣がん（例、上皮性卵巣がん、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣性胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍等）、膀胱がん、尿道がん、皮膚がん（例えば、眼内（眼）黒色腫、メルケル細胞がん等）、血管腫、悪性リンパ腫（例えば、細網肉腫、リンパ肉腫、ホジキン病等）、メラノーマ（悪性黒色腫）、甲状腺がん（例えば、甲状腺髄様ガン等）、副甲状腺がん、鼻腔がん、副鼻腔がん、骨腫瘍（例えば、骨肉腫、ユーイング腫瘍、子宮肉腫、軟部組織肉腫等）、転移性髄芽腫、血管線維腫、隆起性皮膚線維肉腫、網膜肉腫、陰茎癌、精巣腫瘍、小児固形がん（例えば、ウィルムス腫瘍、小児腎腫瘍等）、カポジ肉腫、ＡＩＤＳに起因するカポジ肉腫、上顎洞腫瘍、線維性組織球腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、慢性骨髄増殖性疾患、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病等）等が挙げられ、これらに限定されない。
　細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞である。細胞株としては、例えば、ＨＣＴ１１６、Ｈｕｈ７、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞）、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸がん細胞株）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝がん細胞株）、ＵＴ７／ＴＰＯ（ヒト白血病細胞株）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＢＨＫ、Ｃ－３３Ａ、ＨＴ－２９、ＡＥ－１、３Ｄ９、Ｎｓ０／１、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、Ｓ２、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ、Ｖｅｒｏ等が挙げられ、これらに限定されない。 
　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクターシステムの細胞への導入方法としては、使用する生細胞に適した方法で行うことができ、エレクトロポレーション法、ヒートショック法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、パーティクル・ガン法、ウイルスを用いた方法や、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標） ６　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００　Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＬＴＸ　Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　３０００　Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）などの市販のトランスフェクション試薬を用いた方法などを挙げることができる。 
　続く、修飾工程については、上述の＜標的二本鎖ヌクレオチドを部位特異的に改変するための方法＞の［第１実施形態］に示された方法と同様である。
　本実施形態における標的二本鎖ポリヌクレオチドの修飾により、標的二本鎖ポリヌクレオチドへの変異の導入、又は、標的二本鎖ポリヌクレオチドの機能が破壊、改変された細胞を得ることができる。 
　本発明の変異型Ｃａｓ９タンパク質として、エンドヌクレアーゼ活性を有さない態様（例、態様５）を用いた場合には、該タンパク質はＰＡＭ配列の上流に位置する結合部位で前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに結合することができるが、そこにとどまって切断することができない。従って、例えば該タンパク質に蛍光タンパク質（例、ＧＦＰ）等の標識タンパク質を融合させておくと、ガイドＲＮＡ－変異型Ｃａｓ９タンパク質を介して標識タンパク質を標的二本鎖ポリヌクレオチドに結合させることができる。変異型Ｃａｓ９タンパク質に結合させる物質を適宜選択することによって多様な機能を標的二本鎖ポリヌクレオチドに与えることが可能となる。
　さらに、変異型Ｃａｓ９タンパク質あるいは変異型Ｃａｓ９から一部あるいは全部の切断酵素活性を欠失したタンパク質のＮ末端あるいはＣ末端に転写制御因子タンパク質又はドメインを連結することができる。転写制御因子又はそのドメインとしては、転写活性化因子又はそのドメイン（例、ＶＰ６４、ＮＦ－κＢ ｐ６５）及び転写サイレンサー又はそのドメイン（例、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１））又は転写抑制因子又はそのドメイン（例、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、ｍＳｉｎ３Ａ相互作用ドメイン（ＳＩＤ））が挙げられる。
　ＤＮＡのメチル化状態を修飾する酵素（例、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）、ＴＥＴ）やヒストンサブユニットを修飾する酵素（例、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ）を連結することもできる。
＜遺伝子治療＞
　一実施形態において、本発明は、ゲノム編集を実行し、遺伝子を治療するための方法及び組成物を提供する。以前に知られている標的化された遺伝子組換えの方法と対照的に、本実施形態の方法は、実行が、効率的かつ安価であり、そして任意の細胞または生物に適応可能である。細胞又は生物の二本鎖核酸の任意のセグメントは、本実施形態の遺伝子治療方法により改変することができる。本実施形態の遺伝子治療方法は、全ての細胞に内在性である相同組換えプロセス及び非相同組換えプロセスの両方を利用する。 
　本明細書において、「ゲノム編集」とは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムやＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ　Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮ）等の技術により標的化された遺伝子組換えまたは標的化された変異を実行することにより、特異的な遺伝子破壊やレポーター遺伝子のノックイン等を行う新しい遺伝子改変技術を意味する。
　また、一実施形態において、本発明は、標的化されたＤＮＡ挿入又は標的化されたＤＮＡ欠失を行う遺伝子治療方法を提供する。この遺伝子治療方法は、ドナーＤＮＡを含む核酸構築物を用いて、細胞を形質転換する工程を包含する。標的遺伝子切断後のＤＮＡ挿入およびＤＮＡ欠失に関するスキームについては、公知の方法に従って当業者が決定できる。 
　また、一実施形態において、本発明は、体細胞及び生殖細胞の両方で利用され、特定の遺伝子座で遺伝子操作を行う遺伝子治療方法を提供する。 
　また、一実施形態において、本発明は、体細胞において遺伝子を壊すための遺伝子治療方法を提供する。ここで、遺伝子は、細胞又は生物に対して有害な産物を過剰発現し、細胞又は生物に対して有害な産物を発現する。このような遺伝子は、疾患において生じる１つ以上の細胞型において過剰発現され得る。本実施形態の遺伝子治療方法による、前記過剰発現した遺伝子の破壊は、前記過剰発現した遺伝子に起因する疾患を被る個体に、より良い健康をもたらすることができる。すなわち、細胞のほんの小さな割合の遺伝子の破壊が働き、発現レベルを減少し、治療効果を生じさせる。 
　また、一実施形態において、本発明は、生殖細胞において遺伝子を壊すための遺伝子治療方法を提供する。特定の遺伝子が破壊された細胞は、特定の遺伝子の機能を有さない生物を作製するために活用することができる。前記遺伝子が破壊された細胞において、遺伝子は完全にノックアウトさせることができる。この特定の細胞における機能の欠損は、治療効果を有し得る。 
　また、一実施形態において、本発明は、遺伝子産物をコードするドナーＤＮＡを挿入する遺伝子治療方法を提供する。この遺伝子産物は、構成的に発現された場合、治療効果を有する。例えば、膵細胞の個体群において、活性プロモーター及びインシュリン遺伝子をコードするドナーＤＮＡの挿入を引き起こすために、前記ドナーＤＮＡを、糖尿病を被る個体（患者）に挿入する方法が挙げられる。次いで、前記ドナーＤＮＡを含む膵細胞の前記個体群は、インシュリンを生成し、糖尿病患者を治療することができる。さらに、前記ドナーＤＮＡは植物に挿入され、薬剤的関連遺伝子産物を生成させることができる。タンパク質産物の遺伝子（例えば、インシュリン、リパーゼまたはヘモグロビン）は、制御エレメント（構成的活性プロモーター、または誘導性プロモーター）と一緒に植物に挿入され、植物中で大量の医薬品を生成することができる。次いで、このようなタンパク質産物は、植物から単離することができる。
　トランスジェニック植物又はトランスジェニック動物は、核酸移入技術（ＭｃＣｒｅａｔｈ，Ｋ．Ｊ．ら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ　４０５：１０６６－１０６９；Ｐｏｌｅｊａｅｖａ，Ｉ．Ａ．ら，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ　４０７：８６－９０）を用いる方法で作製することができる。組織型特異的ベクター又は細胞型特異的ベクターは、選択した細胞内でのみ遺伝子発現を提供するために利用することができる。 
　また、上記の方法を生殖細胞に用いた場合、標的遺伝子にドナーＤＮＡを挿入させて、後の全ての細胞分裂により、設計された遺伝的変更を有する細胞を生成することができる。 
　本実施形態の遺伝子治療方法の適用対象としては、例えば、任意の生物、培養細胞、培養組織、培養核（培養細胞、培養組織、又は培養核インタクトには、生物を再生するために使用可能な細胞、組織又は核を含む）、配偶子（例えば、発達の様々な段階の卵又は精子）等が挙げられ、これらに限定されない。
　本実施形態の遺伝子治療方法の適用対象となる細胞の由来としては、任意の生物（昆虫、真菌、げっ歯類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、及び他の農業上重要な動物、並びに他の哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ及びヒトが挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない）等が挙げられ、これらに限定されない。 
　さらに、本実施形態の遺伝子治療方法は、植物において使用することができる。本実施形態の遺伝子治療方法の適用対象となる植物としては、特別な限定はなく、任意の様々な植物種（例えば、単子葉植物又は双子葉植物等）において適用することができる。 
　以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
１．野生型及び変異型ＳｐＣａｓ９の調製
（１）コンストラクトの設計
　遺伝子合成によりコドンが最適化された野生型あるいは変異型ＳｐＣａｓ９遺伝子を、ｐＥＴ　ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に組み込んだ。さらに、ＨｉｓタグとＳｐＣａｓ９遺伝子の間にＴＥＶ認識配列を付加した。完成したコンストラクトから発現するＣａｓ９のＮ末端には６残基のヒスチジンが連続し（Ｈｉｓタグ）、ＴＥＶプロテアーゼ認識サイトが付加される設計になっている。
　使用したＳｐＣａｓ９遺伝子の塩基配列は以下の通り。
ＷＴ：野生型ＳｐＣａｓ９の塩基配列：配列番号２
ｍ０：変異型ＳｐＣａｓ９遺伝子（Ｒ１３３５Ａ）の塩基配列：配列番号３
ｍ４：変異型ＳｐＣａｓ９遺伝子（Ｒ１３３５Ａ／Ｇ１２１８Ｒ）の塩基配列：配列番号４
ｍ１８：変異型ＳｐＣａｓ９遺伝子（Ｒ１３３５Ａ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｔ１３３７Ｒ）の塩基配列：配列番号５
ｍ１９：変異型ＳｐＣａｓ９遺伝子（Ｒ１３３５Ａ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｔ１３３７Ｒ／Ｌ１１１１Ｒ）の塩基配列：配列番号６
ｍ２０：変異型ＳｐＣａｓ９遺伝子（Ｒ１３３５Ａ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｔ１３３７Ｒ／Ｌ１１１１Ｒ／Ｄ１３３２Ｒ）の塩基配列：配列番号７
ｍ２１：変異型ＳｐＣａｓ９遺伝子（Ｒ１３３５Ａ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｔ１３３７Ｒ／Ｌ１１１１Ｒ／Ｄ１３３２Ｒ／Ａ１３２２Ｒ）の塩基配列：配列番号８
ｍ２２：変異型ＳｐＣａｓ９遺伝子（Ｒ１３３５Ａ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｔ１３３７Ｒ／Ｌ１１１１Ｒ／Ｄ１３３２Ｒ／Ａ１３２２Ｒ／Ｄ１２８４Ｒ／Ａ１２８５Ｒ）の塩基配列：配列番号９
ｍ２３：変異型ＳｐＣａｓ９遺伝子（Ｒ１３３５Ａ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｌ１１１１Ｒ／Ｄ１３３２Ｒ／Ａ１３２２Ｒ）の塩基配列：配列番号１０
ｍ２４：変異型ＳｐＣａｓ９遺伝子（Ｒ１３３５Ａ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｌ１１１１Ｒ／Ｄ１３３２Ｒ／Ａ１３２２Ｒ／Ｄ１２８４Ｒ／Ａ１２８５Ｒ）の塩基配列：配列番号１１
ｍ２５：変異型ＳｐＣａｓ９遺伝子（Ｒ１３３５Ａ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｔ１３３７Ｒ／Ｌ１１１１Ｒ／Ａ１３２２Ｒ）の塩基配列：配列番号１２
ｍ２６：変異型ＳｐＣａｓ９遺伝子（Ｒ１３３５Ａ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｌ１１１１Ｒ／Ａ１３２２Ｒ）の塩基配列：配列番号１３
ｍ２９：変異型ＳｐＣａｓ９遺伝子（Ｒ１３３５Ａ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｌ１１１１Ｒ）の塩基配列：配列番号１４
ｍ３２：変異型ＳｐＣａｓ９遺伝子（Ｒ１３３５Ａ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｔ１３３７Ｒ／Ｌ１１１１Ｒ／Ａ１３２２Ｒ／Ｅ１２１９Ｍ）の塩基配列：配列番号１５
ｍ３３：変異型ＳｐＣａｓ９遺伝子（Ｒ１３３５Ａ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｔ１３３７Ｒ／Ｌ１１１１Ｒ／Ａ１３２２Ｒ／Ｅ１２１９Ｆ）の塩基配列：配列番号１６
ｍ３４：変異型ＳｐＣａｓ９遺伝子（Ｒ１３３５Ａ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｔ１３３７Ｒ／Ｌ１１１１Ｒ／Ａ１３２２Ｒ／Ｅ１２１９Ｗ）の塩基配列：配列番号１７
ｍ４３：変異型ＳｐＣａｓ９遺伝子（Ｒ１３３５Ａ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｔ１３３７Ｒ／Ｌ１１１１Ｒ／Ａ１３２２Ｒ／Ｅ１２１９Ｆ／Ｄ１１３５Ｖ）の塩基配列：配列番号１８
ｍ６１：変異型ＳｐＣａｓ９遺伝子（Ｒ１３３５Ｉ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｔ１３３７Ｒ／Ｌ１１１１Ｒ／Ａ１３２２Ｒ／Ｅ１２１９Ｆ／Ｄ１１３５Ｖ）の塩基配列：ｍ４３の塩基配列（配列番号１８）に対し、４００３－４００５位のｇｃｃがａｔｃに変換した塩基配列。
ｍ６２：変異型ＳｐＣａｓ９遺伝子（Ｒ１３３５Ｌ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｔ１３３７Ｒ／Ｌ１１１１Ｒ／Ａ１３２２Ｒ／Ｅ１２１９Ｆ／Ｄ１１３５Ｖ）の塩基配列：ｍ４３の塩基配列（配列番号１８）に対し、４００３－４００５位のｇｃｃがｃｔｇに変換した塩基配列。
ｍ６３：変異型ＳｐＣａｓ９遺伝子（Ｒ１３３５Ｍ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｔ１３３７Ｒ／Ｌ１１１１Ｒ／Ａ１３２２Ｒ／Ｅ１２１９Ｆ／Ｄ１１３５Ｖ）の塩基配列：ｍ４３の塩基配列（配列番号１８）に対し、４００３－４００５位のｇｃｃがａｔｇに変換した塩基配列。
ｍ６４：変異型ＳｐＣａｓ９遺伝子（Ｒ１３３５Ｆ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｔ１３３７Ｒ／Ｌ１１１１Ｒ／Ａ１３２２Ｒ／Ｅ１２１９Ｆ／Ｄ１１３５Ｖ）の塩基配列：ｍ４３の塩基配列（配列番号１８）に対し、４００３－４００５位のｇｃｃがｔｔｔに変換した塩基配列。
ｍ６５：変異型ＳｐＣａｓ９遺伝子（Ｒ１３３５Ｔ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｔ１３３７Ｒ／Ｌ１１１１Ｒ／Ａ１３２２Ｒ／Ｅ１２１９Ｆ／Ｄ１１３５Ｖ）の塩基配列：ｍ４３の塩基配列（配列番号１８）に対し、４００３－４００５位のｇｃｃがａｃｃに変換した塩基配列。
ｍ６６：変異型ＳｐＣａｓ９遺伝子（Ｒ１３３５Ｖ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｔ１３３７Ｒ／Ｌ１１１１Ｒ／Ａ１３２２Ｒ／Ｅ１２１９Ｆ／Ｄ１１３５Ｖ）の塩基配列：ｍ４３の塩基配列（配列番号１８）に対し、４００３－４００５位のｇｃｃがｇｔｇに変換した塩基配列。
（２）大腸菌での発現
　作成したベクターを大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｒｏｓｅｔｔａ２ （ＤＥ３）株へ形質転換した。その後、２０μｇ／ｍｌカナマイシン及び２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ培地で培養した。ＯＤ＝０．８になるまで培養した時点で、発現誘導剤としてイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ　β－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ：ＩＰＴＧ）（終濃度１ｍＭ）を添加し、３７℃で４時間培養した。培養後、大腸菌を遠心（５，０００ｇ、１０分）により回収した。
（３）野生型及び変異型ＳｐＣａｓ９の精製
　（２）で回収した菌体を緩衝液Ａで懸濁し、超音波破砕した。遠心（２５，０００ｇ，３０分）により上清を回収し、緩衝液Ａで平衡化したＮｉ－ＮＴＡ　Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂 （ＱＩＡＧＥＮ）と混合し、１時間穏やかに転倒混和した。素通り画分を回収した後、４カラム容量の緩衝液Ａ、さらに２カラム容量の高塩濃度緩衝液Ｂで洗浄を行った。
　次いで、再度２カラム容量の緩衝液Ａで洗浄した後、５カラム容量の高イミダゾール濃度緩衝液Ｃで目的タンパク質を溶出した。
　次いで、粗精製したサンプルをＨｉＴｒａｐＳＰ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にチャージした。次いで、５カラム容量分の緩衝液Ｄ（０Ｍ　ＮａＣｌ）９２．５％及び緩衝液Ｆ（２Ｍ　ＮａＣｌ）７．５％の混合溶液で洗浄を行った後、緩衝液Ｅを１０％から５０％へ（ＮａＣｌ濃度は２００ｍＭから１Ｍへ）直線勾配をかけて目的タンパク質を溶出した。
　緩衝液Ａ～Ｅの組成を以下に示す。
緩衝液Ａ：20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole
緩衝液Ｂ：20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1000 mM NaCl, 20 mM imidazole
緩衝液Ｃ：20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 300 mM imidazole
緩衝液Ｄ：20 mM Tris-HCl, pH 8.0
緩衝液Ｅ：20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2000 mM NaCl
２．ガイドＲＮＡの調製
　目的のガイドＲＮＡ配列（ggaaauuaggugcgcuuggcguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaagug;配列番号１９）が挿入されたベクターの作製を行った。下線部が２０塩基のガイド配列を示し、残りがscaffoldの部分（stem－loop 2）に相当する。ガイドＲＮＡ配列の上流にＴ７プロモーター配列を付加し、線状化したｐＵＣ１１９ベクター（ＴａＫａＲａ）に組み込んだ。作製したベクターを元に、ＰＣＲを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応の鋳型ＤＮＡを作製した。この鋳型ＤＮＡを用いて、３７℃、４時間、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼによるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応を行った。転写産物を含む反応液に等量のフェノールクロロホルムを加えて混合した後、２０℃にて遠心（１０，０００ｇ、２分）し、上清を回収した。上清に１／１０量の３Ｍ　酢酸ナトリウムおよび２．５倍量の１００％エタノールを添加し、４℃にて遠心（１０，０００ｇ、３分）し、転写産物を沈殿させた。上清を廃棄して７０％エタノールを添加し、４℃にて遠心（１０，０００ｇ、３分）し再び上清を廃棄した。沈殿を風乾後、ＴＢＥ緩衝液に再懸濁し、７Ｍ　Ｕｒｅａ変性１０％ＰＡＧＥにより精製した。目的ＲＮＡの分子量に位置するバンドを切り出し、Ｅｌｕｔｒａｐ電気溶出システム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりＲＮＡを抽出した。その後、抽出したＲＮＡをＰＤ－１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通し、緩衝液を緩衝液Ｈ（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ （ｐＨ ８．０）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ）に交換した。
３．プラスミドＤＮＡ切断活性測定試験
　ＤＮＡ切断活性測定試験に用いるために、標的ＤＮＡ配列およびＰＡＭ配列が挿入されたベクターの作製を行った。標的ＤＮＡ配列にＰＡＭ配列１～４をそれぞれ付加し、線状化したｐＵＣ１１９ベクターに組み込んだ。標的配列およびＰＡＭ配列１～４を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　作製したベクターを用いて、大腸菌Ｍａｃｈ１株（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を形質転換し、２０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃にて培養した。
　培養後、菌体を遠心（８，０００ｇ、１分）により回収し、ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。
　精製したＰＡＭ配列が付加した標的プラスミドＤＮＡを用いて切断実験を行った。プラスミドＤＮＡは、制限酵素により１本に線状化した。この線状化ＤＮＡ中の標的ＤＮＡ配列を野生型、又は変異型のＳｐＣａｓ９が切断すると、約１，０００ｂｐと約２，０００ｂｐの切断産物ができる。切断の際のバッファーとしては下記の組成のcleavage buffer Ｂを用いた。
Ｂ(×１０）の組成
　200 mM HEPES 7.5
　1000 mM KCl
　50% glycerol
　10 mM DTT
　5 mM EDTA
　20 mM MgCl2
　反応後のサンプルについて、１％濃度のアガロースゲルを用いて電気泳動を行い、切断産物のバンドを確認した。結果を図１Ａ～Ｄに示す。図中、「Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ」とは基質を示し、「Ｐｒｏｄｕｃｔ」とは切断産物を示す。ＰＡＭ配列及び反応条件を図中に示す。
　野生型ＳｐＣａｓ９では、ＰＡＭ配列の三番目の塩基がＧの場合のみ認識し、標的プラスミドＤＮＡが切断されたのに対し、変異型ＳｐＣａｓ９では、三番目の塩基がＧ以外のＰＡＭ配列も認識し、標的プラスミドＤＮＡを切断することができた。
　よって、野生型のＳｐＣａｓ９ではＰＡＭ配列「ＮＧＧ」を認識するのに対し、変異型のＳｐＣａｓ９ではＰＡＭ配列「ＮＧ」を認識することが確かめられた。 
　以上から、変異型のＳｐＣａｓ９ではＰＡＭ配列が広範化されており、簡便且つ迅速に標的配列に対し部位特異的な標的二本鎖ポリヌクレオチドの切断を行えることが明らかとなった。 
実施例２
　実施例１で調製した変異型ＳｐＣａｓ９（ｍ４３）を用いて、実施例１と同様にしてプラスミドＤＮＡ切断活性測定試験を行った。結果を図２に示す。
　野生型ＳｐＣａｓ９では、ＰＡＭ配列の三番目の塩基がＧの場合のみ認識し、標的プラスミドＤＮＡが切断されたのに対し、変異型ＳｐＣａｓ９では、三番目の塩基がＧ以外のＰＡＭ配列も認識し、標的プラスミドＤＮＡを切断することができた。
　よって、野生型のＳｐＣａｓ９ではＰＡＭ配列「ＮＧＧ」を認識するのに対し、変異型のＳｐＣａｓ９ではＰＡＭ配列「ＮＧ」を認識することが確かめられた。
実施例３
　実施例１で調製した変異型ＳｐＣａｓ９（ｍ４３、ｍ６１～ｍ６６）を用いて、実施例１と同様にしてプラスミドＤＮＡ切断活性測定試験を行った。尚、切断産物の検出には、MultiNAキャピラリー電気泳動装置（島津製作所）を用いた。ＰＡＭ配列としては、ＰＡＭ配列４である５’－ＴＧＣ－３’を用いた。切断実験は０．５分（０．５ｍ）及び２分（２ｍ）で行った。結果を図３に示す。ｍ６１、ｍ６３、ｍ６５及びｍ６６に優れたＤＮＡ切断活性が確認された。
実施例４
　実施例１で調製した変異型ＳｐＣａｓ９（ｍ４３、ｍ６１、ｍ６３及びｍ６６）を用いて、実施例１と同様にしてプラスミドＤＮＡ切断活性測定試験を行った。切断実験は０．５分（０．５ｍ）及び２分（２ｍ）で行った。結果を図４に示す。
　野生型ＳｐＣａｓ９では、ＰＡＭ配列の三番目の塩基がＧの場合のみ認識し、標的プラスミドＤＮＡが切断されるのに対し、変異型ＳｐＣａｓ９では、三番目の塩基がＧ以外のＰＡＭ配列も認識し、標的プラスミドＤＮＡを切断することができた。ｍ６１、ｍ６３及びｍ６６、特にｍ６３とｍ６６はｍ４３では効率の低かったＴＧＡ及びＴＧＣのＰＡＭ配列を用いた場合でも高い効率でＤＮＡを切断できることが確認された。
実施例５
　実施例１で調製した野生型ＳｐＣａｓ９及び変異型ＳｐＣａｓ９（ＷＴ、ｍ４３）及び実施例１と同様にして調製した下記の変異型ＳｐＣａｓ９を用いて実施例１と同様にしてプラスミドＤＮＡ切断活性測定試験を行った。切断実験は、経時的（０、０．５、１、２、５分）に行った。結果を図５に示す。ｍ４３においてＷＴに匹敵する切断活性の立ち上がりが確認された。
変異型ＳｐＣａｓ９遺伝子（Ｒ１３３５Ａ／Ｇ１２１８Ｒ／Ｔ１３３７Ｒ／Ｌ１１１１Ｒ／Ａ１３２２Ｒ／Ｄ１１３５Ｖ）の塩基配列：ｍ２５の塩基配列（配列番号１２）に対し、３４０３－３４０５位のｇａｃがｇｔｔに変換した塩基配列。
　本発明によれば、標的二本鎖ポリヌクレオチドへの結合力を保ち、さらにエンドヌクレアーゼ活性を保ちながら、ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質を得ることができる。また、前記Ｃａｓ９タンパク質を利用した簡便且つ迅速で標的配列に部位特異的なゲノム編集技術を提供することができる。
　本出願は、日本で出願された特願２０１７－１０８５５６（出願日：２０１７年５月３１日）を基礎としておりその内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (33)

  1. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１３３５位のアルギニンがアラニン、グリシン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、バリン、スレオニン、アスパラギン及びアスパラギン酸からなる群より選ばれる１つのアミノ酸で置換されているアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有するタンパク質。
  2. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列において、さらに１２１９位に変異を有する、請求項１に記載のタンパク質。
  3. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列において、さらに１３２２位に変異を有する、請求項１又は２に記載のタンパク質。
  4. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１３３５位のアルギニンがアラニン、グリシン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、バリン、スレオニン、アスパラギン及びアスパラギン酸からなる群より選ばれる１つのアミノ酸で置換され、さらに１２１９位に変異を有するアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有するタンパク質。
  5. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１３３５位のアルギニンがアラニン、グリシン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、バリン、スレオニン、アスパラギン及びアスパラギン酸からなる群より選ばれる１つのアミノ酸で置換され、さらに１３２２位に変異を有するアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ガイドＲＮＡとの結合能を有するタンパク質。
  6. 　１３３５位のアルギニンの置換がアラニンへの置換である、請求項１～５のいずれか１項に記載のタンパク質。
  7. 　１３３５位のアルギニンの置換がイソロイシン、メチオニン、スレオニン又はバリンへの置換である、請求項１～５のいずれか１項に記載のタンパク質。
  8. 　１２１９位の変異がグルタミン酸のフェニルアラニンへの置換である、請求項２又は４記載のタンパク質。
  9. 　１３２２位の変異がアラニンのアルギニン、ヒスチジン又はリジンへの置換である、請求項３又は５記載のタンパク質。
  10. 　１３２２位の変異がアラニンのアルギニンへの置換である、請求項９記載のタンパク質。
  11. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列において、さらに、１１１１位、１１３５位、１２１８位及び１３３７位からなる群より選択される少なくとも１つの位置に変異を有する、請求項１～１０のいずれか１項に記載のタンパク質。
  12. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列において、さらに、１１１１位、１１３５位、１２１８位及び１３３７位からなる群より選択される少なくとも２つの位置に変異を有する、請求項１１に記載のタンパク質。
  13. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列において、さらに、１１１１位、１１３５位、１２１８位及び１３３７位からなる群より選択される少なくとも３つの位置に変異を有する、請求項１１に記載のタンパク質。
  14. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列において、さらに、１１１１位、１１３５位、１２１８位及び１３３７位に変異を有する、請求項１１に記載のタンパク質。
  15. 　１１１１位の変異がロイシンのアルギニン、ヒスチジン又はリジンへの置換であり；
    　１１３５位の変異がアスパラギン酸のバリンへの置換であり；
    　１２１８位の変異がグリシンのアルギニン、ヒスチジン又はリジンへの置換であり；
    　１３３７位の変異がスレオニンのアルギニン、ヒスチジン又はリジンへの置換である、請求項１１～１４のいずれか１項に記載のタンパク質。
  16. 　配列番号１の変異が施された位置以外の部位において８０％以上の同一性を有する、請求項１～１５のいずれか１項に記載のタンパク質。
  17. 　配列番号１の変異が施された位置以外の部位において１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加された、請求項１～１５のいずれか１項に記載のタンパク質。
  18. 　ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する、請求項１～１７のいずれか１項に記載のタンパク質。
  19. 　さらに、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、ヌクレアーゼ活性を一部あるいは全部を欠失する変異を有する、請求項１～１６のいずれか１項に記載のタンパク質。
  20. 　ヌクレアーゼ活性を一部あるいは全部欠失する変異が、配列番号１で表されるアミノ酸配列における、(ｉ)１０位、７６２位、８３９位、９８３位及び９８６位からなる群より選択される少なくとも１つの位置又はそれに相当する位置、及び／又は（ｉｉ）８４０位及び８６３位からなる群より選択される位置又はそれに相当する位置における変異である、請求項１９に記載のタンパク質。
  21. 　１０位のアスパラギン酸がアラニン又はアスパラギンに置換し；又は
    　８４０位のヒスチジンがアラニン、アスパラギン又はチロシンに置換している、請求項２０に記載のタンパク質。
  22. 　転写制御因子タンパク質又はドメインを連結した、請求項１９～２１のいずれか１項に記載のタンパク質。
  23. 　転写制御因子が転写活性化因子である、請求項２２記載のタンパク質。
  24. 　転写制御因子が転写サイレンサー又は転写抑制因子である、請求項２２記載のタンパク質。
  25. 　請求項１～２４のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸。
  26. 　請求項１～２４のいずれか１項に記載のタンパク質と、標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ（Proto-spacer Adjacent Motif）配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むガイドＲＮＡと、を備えるタンパク質－ＲＮＡ複合体。
  27. 　標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に改変するための方法であって、
    　標的二本鎖ポリヌクレオチドと、タンパク質と、ガイドＲＮＡとを混合し、インキュベートする工程と、
    　前記タンパク質が、ＰＡＭ配列の上流に位置する結合部位で前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを改変する工程と、を備え、
    　前記標的二本鎖ポリヌクレオチドは、ＮＧ（Ｎは任意の塩基を、Ｇはグアニンをそれぞれ意味する）からなるＰＡＭ配列を有し、
    　前記タンパク質は、請求項１～２４のいずれか１項に記載のタンパク質であり、
    　前記ガイドＲＮＡは、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中の前記ＰＡＭ配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものである方法。
  28. 　改変が、標的二本鎖ポリヌクレオチドの部位特異的な切断である、請求項２７記載の方法。
  29. 　改変が、標的二本鎖ポリヌクレオチドにおける部位特異的な、１以上のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は付加である、請求項２７記載の方法。
  30. 　細胞の標的遺伝子の発現を増大させる方法であって、前記細胞内で請求項２３に記載のタンパク質と、前記標的遺伝子に対する１つ又は複数のガイドＲＮＡとを発現させることを含む、方法。
  31. 　細胞の標的遺伝子の発現を減少させる方法であって、前記細胞内で請求項２４に記載のタンパク質と、前記標的遺伝子に対する１つ又は複数のガイドＲＮＡとを発現させることを含む、方法。
  32. 　細胞が真核細胞である、請求項３０又は３１に記載の方法。
  33. 　細胞が酵母細胞、植物細胞又は動物細胞である、請求項３０又は３１に記載の方法。
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