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WO2018123966A1 - ３次元多孔性足場からの培養細胞回収方法 - Google Patents

３次元多孔性足場からの培養細胞回収方法 Download PDF

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WO2018123966A1
WO2018123966A1 PCT/JP2017/046420 JP2017046420W WO2018123966A1 WO 2018123966 A1 WO2018123966 A1 WO 2018123966A1 JP 2017046420 W JP2017046420 W JP 2017046420W WO 2018123966 A1 WO2018123966 A1 WO 2018123966A1
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WO
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cells
culture
edta
trypsin
cultured
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PCT/JP2017/046420
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English (en)
French (fr)
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俊明 千葉
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Fullstem Co Ltd
Original Assignee
Fullstem Co Ltd
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Publication date
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Priority to JP2018559455A priority patent/JP6699837B2/ja
Priority to US16/328,584 priority patent/US12049641B2/en
Priority to CN201780052929.0A priority patent/CN109689855B/zh
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    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C12N2509/10—Mechanical dissociation
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    • C12N2527/00—Culture process characterised by the use of mechanical forces, e.g. strain, vibration

Definitions

  • the present invention relates to a method for collecting cultured cells from a three-dimensional porous scaffold, and more particularly to a method for collecting cultured cells that efficiently collects a large amount of cultured cells from a three-dimensional porous scaffold having a large culture area.
  • Pluripotent stem cells are recognized as an important cell source for regenerative medicine because of their infinite proliferative ability and pluripotency. Since iPS cell technology can be applied to elucidation of pathological conditions by establishing drug toxicity tests and disease models, research and development have been promoted around the world in recent years. In application to regenerative medicine and drug discovery research using pluripotent stem cells, it is essential to supply a large amount of stable undifferentiated cells and differentiated cells.
  • three-dimensional culture In contrast to two-dimensional culture in which cells are monolayer cultured on a plate, a method of culturing cells with a thickness in the vertical direction is called three-dimensional culture. Since three-dimensional culture is closer to the state of cells in a living body than two-dimensional culture, it is not only suitable for establishing an experimental model that mimics the in vivo environment, but also enables large-scale cell culture.
  • Patent Document 1 describes a three-dimensional porous scaffold composed of an assembly of biocompatible polymeric fibers having a predetermined diameter and an apparent density (the scaffold may be described as a matrix in this specification). A cell culture method using this three-dimensional porous scaffold is described.
  • Patent Document 2 a three-dimensional porous scaffold in which cells are seeded is placed in a sealed cell culture vessel, and the three-dimensional porous scaffold is compressed with a piston to compress the three-dimensional porous scaffold. A cell culture method is described.
  • Patent Document 3 describes a three-dimensional porous scaffold in which cells are seeded, and a cell culture method in which a microfluid is caused to flow through a microfluidic channel with respect to the surface of the three-dimensional porous scaffold.
  • the present invention has been made in view of such a problem, and is a method for recovering cultured cells from a three-dimensional porous scaffold, which is efficiently recovered without damaging cells cultured on the three-dimensional porous scaffold.
  • the purpose is to provide.
  • the cultured cell recovery method includes a culture step of culturing cells in a three-dimensional porous scaffold enclosed in a culture vessel, and an enzyme solution containing trypsin-EDTA and caseinase is added to the culture vessel, An enzyme treatment step for performing an enzyme treatment on the cultured cells in the culture vessel, a pedestal that moves circularly in a horizontal plane, and the culture vessel are brought into contact with each other, and a vibration in a vertical direction is applied to the cultured cells treated with the enzyme. And a vibration processing step for performing processing.
  • cultured cells can be efficiently recovered from a three-dimensional porous scaffold without damaging the cells.
  • the cultured cell collection method includes a culture step for culturing cells, an enzyme treatment step for performing enzyme treatment on the cultured cells, and a vibration treatment step for performing vibration treatment by applying vibration to the cultured cells.
  • the cells are cultured on a three-dimensional porous scaffold enclosed in a culture vessel.
  • the cells to be cultured are not particularly limited, and any of cells that are less susceptible to cell damage and cells that are more susceptible to cell damage are possible, but preferably cells that are susceptible to cell damage. These include human embryonic stem (ES) cells, iPS cells, somatic stem cells (eg, mesenchymal stem cells derived from fat and bone marrow), and the like.
  • the culture vessel for culturing the cells is a non-cell-adhesive vessel in which the cultured cells are difficult to adhere to the inner wall of the vessel.
  • a plastic made of a low adhesion material such as polyethylene terephthalate, polypropylene, polyethylene, polycarbonate, polystyrene, or fluorine processing
  • a plastic or glass container having a hydrophobic surface treatment such as silicon processing.
  • the size and shape of the culture vessel are not particularly limited, and an arbitrary shape and size may be selected according to the cells to be cultured, such as bottle shape, flask shape, bag shape, well shape, dish shape, etc. However, it is preferably bottle-shaped. For example, it is a bottle-shaped culture container whose outer bottom surface at the bottom is flat, and for example, a culture container whose overall appearance is substantially cylindrical and whose outer bottom surface at the bottom is flat.
  • the volume is 250 ml (39 mm diameter, height 117 mm, bottom 72 mm), 500 ml (39 mm diameter, 137 mm height) , Bottom 92 mm) or 1000 ml (39 mm diameter, 156 mm height, 107 mm bottom) can be used.
  • the three-dimensional porous scaffold can be either a single or a plurality of scaffolds, and the culture area of the three-dimensional porous scaffold is not particularly limited, for example, 800 to 900,000 cm 2 , 800 to 45000 cm 2 is preferable.
  • the three-dimensional porous scaffold has, for example, an average porosity of 50 to 90%, preferably 80 to 90%, and an average pore size of 10 to 800 ⁇ m, preferably 200 to 400 ⁇ m.
  • the three-dimensional porous scaffold may be, for example, a fiber assembly (nonwoven fabric, woven fabric, knitted fabric, etc.) made of thermoplastic resin fibers, or a sheet prepared by kneading and then molding a thermoplastic resin in advance. (For example, a film, a plate, a board, etc.) may be sufficient.
  • the thermoplastic resin include polyglycolic acid, polylactic acid, polylactic acid-polyglycolic acid copolymer, polycaprolactone, polydioxanone, polytrimethylene carbonate, polybutylene succinate, polyethylene succinate, and the like.
  • the culture period is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the type of cells, the number of seeded cells, etc., and is, for example, 5 to 30 days after seeding.
  • the normal culture period can be, for example, 5 to 14 days, preferably 7 to 10 days.
  • the long culture period can be, for example, 15 to 30 days, preferably 22 to 26 days.
  • trypsin-EDTA hereinafter sometimes referred to as “T”
  • caseinase hereinafter sometimes referred to as “D”
  • / or collagenase hereinafter referred to as “T”
  • the content of EDTA in trypsin-EDTA is not particularly limited, for example, 1.0 to 12.0 mmol / L EDTA in 1.0 w / v% trypsin, for example 0.05 w / v% trypsin-0.53 mmol / L EDTA, 0.25 Examples include w / v% trypsin-1.0 mmol / L EDTA or 0.5 w / v% trypsin-5.3 mmol / L EDTA.
  • the collagenase is not particularly limited, and examples thereof include MMP families such as MMP (Matrix metalloproteinase) 1, 2, 3, 9, 13, 14 and the like.
  • the mixing ratio is not particularly limited as long as the enzyme treatment is possible.
  • trypsin-EDTA: caseinase 0.5-4: 1-2 Yes, preferably 2: 1.
  • x1 is 0.5 mg / ml
  • the mixing ratio is not particularly limited as long as the enzyme treatment is possible.
  • x1 is 0.5 mg / ml
  • the mixing ratio is not particularly limited as long as the enzyme treatment is possible.
  • T: C: D is, for example, 0.5 to 2: 1 to 2: 1 to 2, and preferably 2: 1: 1.
  • T: C: D is, for example, 2-4: 1-6: 2-6, preferably 2: 4: 4.
  • an extracellular matrix may be newly produced around the cells.
  • x1 is 0.5mg / ml
  • the amount of solution in the culture vessel can be 1 ml per 10 scaffolds when the 3D porous scaffold is an assembly of a plurality of scaffolds.
  • the conditions for the enzyme treatment are not particularly limited, but are, for example, 10 to 30 minutes and 36 to 38 ° C., preferably 15 minutes and 37 ° C.
  • the enzyme solution may further contain a proteolytic enzyme such as deoxyribonuclease (DNase), papain, elastase, hyaluronidase, chymotrypsin or pronase.
  • DNase deoxyribonuclease
  • papain elastase
  • hyaluronidase hyaluronidase
  • pronase pronase
  • the vibration treatment step the pedestal that moves circularly in the horizontal plane and the bottom surface of the culture vessel to which the enzyme solution is added are brought into surface contact, and the vibration treatment is performed by applying vertical vibration to the enzyme-treated culture cells. Do.
  • the circular motion is preferably a constant-velocity circular motion, and its frequency is, for example, 20 to 100 Hz, preferably 40 to 70 Hz.
  • the shape of the pedestal is not particularly limited, and examples thereof include a plate shape and a bowl shape.
  • the pedestal that moves circularly in the horizontal plane can be, for example, a rubber pedestal provided at the top of a vortex mixer (hereinafter sometimes referred to as “V”).
  • V vortex mixer
  • a convex portion can be provided on the upper portion of the pedestal.
  • adheres to the convex part can be provided in the outer bottom face of the bottle-shaped culture container whose bottom part is flat.
  • the pedestal moves in a horizontal plane in a state where the convex part at the top of the pedestal is closely fitted and inserted into the concave part at the bottom of the bottle-shaped culture vessel, and the top surface of the pedestal and the bottom surface of the culture vessel are in surface contact.
  • the circular motion of the pedestal is accurately transmitted to the culture vessel.
  • a convex portion can be provided on the upper portion of the pedestal, and a concave portion can be provided on the outer bottom surface of the culture vessel to be in close contact with the convex portion.
  • the vortex mixer is an experimental instrument that swirls the bottom of the container at high speed to stir the liquid content, and an upward electric motor has a rubber pedestal at a position displaced from the center of the drive shaft.
  • the culture container can be placed with its bottom part in close contact with the pedestal, or can be placed with the lid on the top of the container in close contact with the pedestal with the culture container turned upside down. Furthermore, it is possible to hold the culture vessel between the fixing member and the pedestal by bringing the fixing member into contact with the lid while the culture vessel is turned upside down and the bottom portion is brought into contact with the pedestal moving in the horizontal plane.
  • the movement of the enzyme solution inside the container is transmitted to the three-dimensional porous scaffold inside the container, and as a result, vertical vibration is given to the cultured cells.
  • the content liquid is stirred in a spiral shape, and the matrix also operates in accordance with the spiral flow of the content liquid, so that no vertical movement occurs.
  • the three-dimensional porous scaffold inside the container floats above the enzyme solution and stays near the center of the swirl flow, and vibration is not easily transmitted to the three-dimensional porous scaffold. In the treatment process, it is preferable to suppress the generation of the spiral flow as much as possible.
  • the time for the vibration treatment is not particularly limited, but is, for example, 10 seconds to 30 minutes.
  • a vibration treatment for applying vibration to the cultured cells is performed by pipetting (hereinafter sometimes referred to as “P”) in which an enzyme solution containing the cultured cells is repeatedly sucked and discharged by a nozzle. Is also possible.
  • a 500 ml bottle is used as a culture container, and a three-dimensional porous scaffold having a total culture area of 34000 cm 2 is enclosed in the culture container, for example, 1 ⁇ 10 7
  • Individual human adipose tissue-derived mesenchymal cells can be included. And after culture
  • cells can be efficiently recovered with a high survival rate as shown in the following examples. By installing a plurality of culture vessels or increasing the internal volume of the culture vessel, a larger amount of cells can be cultured and recovered, and the benefits obtained by the present invention are immeasurable.
  • Example 1 the cultured cell collection method according to this example is compared with the cultured cell collection method according to a comparative example in which neither enzyme treatment nor vibration treatment is performed.
  • Subcutaneous adipose tissue was aseptically collected from the abdomen of the subject with permission.
  • Cells were dispersed by treating adipose tissue with collagenase and centrifuged to collect SVF (Stromal vascular fraction). After washing SVF with PBS (-), resuspend in DMEM / F12 in serum-free medium for primary culture in which 20 ⁇ g / ml reduced glutathione, 5 ⁇ g / ml fibronectin and 100 nM ecotin are added. After seeding, the cells were cultured at 37 ° C./5% CO 2 until reaching 95% confluence.
  • the cells are detached and collected using a release agent, washed with PBS (-), suspended in a serum-free medium for subculture containing 20 ⁇ g / ml reduced glutathione in DMEM / F12, and suspended in a T flask. And cultured under conditions of 37 ° C./5% CO 2 . This passaging operation was repeated to obtain 1 ⁇ 10 8 human adipose tissue-derived mesenchymal cells.
  • CESCO's high-density culture system BelloCell was used for cell culture.
  • One BelloCell-500 disposable culture bottle contained 900 BioNOC II matrices. The capacity of the bottle was 500 ml (39 mm diameter, 137 mm height, 92 mm bottom). All of the surface area matrix within 1 bottle was 15,600cm 2. 1 ⁇ 10 7 human adipose tissue-derived mesenchymal cells were placed in the bottle. By raising and lowering the elevator inside the BelloCell system, the water level of the medium in the BelloCell bottle rises and falls, thereby aeration and nutrient supply to the cells and discharge of metabolites (CO 2 ). After seeding the cells in the bottle Seven days of cell culture were performed. Thereafter, PBS (-) was added for washing.
  • PBS (-) was recovered, the minimum amount of enzyme solution was added so that the entire matrix was below the water surface, and the enzyme treatment was performed at 37 ° C for 15 minutes.
  • the enzyme solution was a mixed solution of trypsin-EDTA and caseinase.
  • the amount of liquid in the bottle was 90 ml.
  • vibration treatment was performed using a vortex mixer device (2,800-3,200 rpm, 10-sec bottom).
  • the BelloCell bottle containing the cells that have been subjected to enzyme treatment is placed on the rubber pedestal of the vortex mixer device, and the vibration treatment is performed by applying vertical vibration to the cultured cells that have been subjected to enzyme treatment. It was. Thereafter, the bottle was manually shaken gently in the vertical direction, and again subjected to vibration treatment using a vortex mixer device (2,800-3,200 rpm, 10-sec bottom).
  • the matrix in the bottle was washed with PBS ( ⁇ ), and 1 ⁇ 10 8 human adipose tissue-derived mesenchymal cells detached from the matrix were collected.
  • the human adipose tissue-derived mesenchymal cells stained the detached matrix and photographed. For staining, cells were fixed with 4% paraformaldehyde, stained with 5 mg / ml crystal violet, excess crystal violet was washed and dried, and crystal violet was eluted with 2% SDS solution, and then photographed. The results are shown in Figure 1. The cell survival rate was 97.6%.
  • Human adipose tissue-derived mesenchymal cells were suspended and suspended in 20 ml of medium.
  • Example 2 In Example 2, the enzyme solution used in the enzyme treatment step was examined.
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, cells were seeded in a bottle for 7 days using CESCO's high-density culture system BelloCell, and then washed with PBS (-).
  • PBS (-) was recovered, the minimum amount of enzyme solution was added so that the entire matrix was below the water surface, and the enzyme treatment was performed at 37 ° C for 15 minutes.
  • the enzyme solution was a mixed solution of trypsin-EDTA, collagenase and caseinase.
  • Example 2 Thereafter, in the same manner as in Example 1, a vibration treatment was performed using a vortex mixer device (2,800-3,200 rpm, 10-sec sec bottom).
  • Example 1 Example 1
  • the cell survival rate was 98.5%.
  • Example 2 As a comparative example, in the same way as in Example 1, cell culture is performed in a bottle using CESCO's high-density culture system BelloCell, and then PBS (-) is added for washing, and neither enzyme treatment nor vibration treatment is performed. The matrix was stained with crystal violet and photographed (FIG. 3 (D)).
  • FIG. 4 shows a comparison of cell recovery rates in the case of enzyme solutions having different components.
  • FIG. 4 shows relative values when the cell recovery in the case of the enzyme solution T2C1D1 is 100.
  • the enzyme solution used for the enzyme treatment needs to include trypsin-EDTA and caseinase and / or collagenase, and an enzyme containing trypsin-EDTA, collagenase and caseinase. In the case of a solution, it was shown that it can be recovered more efficiently.
  • Example 3 the mixing ratio of the enzyme solution, which is a mixed solution of trypsin-EDTA, collagenase and caseinase, which has the best recovery efficiency in the case of a normal culture period, was examined.
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, cells were seeded in a bottle for 7 days using CESCO's high-density culture system BelloCell, and then washed with PBS (-).
  • PBS (-) was recovered, the minimum amount of enzyme solution was added so that the entire matrix was below the water surface, and the enzyme treatment was performed at 37 ° C for 15 minutes.
  • Example 2 Thereafter, in the same manner as in Example 1, a vibration treatment was performed using a vortex mixer device (2,800-3,200 rpm, 10-sec sec bottom).
  • Example 1 Example 1
  • the cell viability was 95.4%.
  • Example 1 After washing the matrix in the bottle with PBS (-), human adipose tissue-derived mesenchymal cells peeled from the matrix were collected, and crystal violet staining was performed and photographed as in Example 1 (FIG. 6A). )). The cell viability was 99.1%.
  • the cell viability was 85.5%.
  • FIG. 7 shows a comparison of cell recovery rates when the vibration treatment process is performed by a vortex mixer apparatus and when pipetting is performed.
  • FIG. 7 shows relative values when the cell recovery is 100 when the enzyme solution T2C1D1 is used and the vortex mixer apparatus is used.
  • Example 4 the mixing ratio of the enzyme solution, which is a mixed solution of trypsin-EDTA, collagenase, and caseinase, which has the best recovery efficiency in the case of a long culture period, was examined.
  • the cells used were human adipose tissue-derived mesenchymal cells purchased from Lonza. Culture was performed in a bottle-type culture bottle. The capacity of the bottle was 1500 ml (caliber 100 mm, height 210 mm, bottom 110 mm). The culture bottle was filled with a matrix formed of a culture solution and a non-woven fabric of polymer material, and human adipose tissue-derived mesenchymal cells were seeded on the matrix. Aeration and nutrient supply to the cells, discharge of metabolites (CO 2 ) were performed, and cell culture was performed for 25 days after seeding the cells. Thereafter, PBS (-) was added for washing.
  • CO 2 metabolites
  • PBS (-) was collected, the enzyme solution was added, and the enzyme treatment was performed at 37 ° C for 15 minutes.
  • vibration treatment was performed using a vortex mixer device (2,800-3,200 rpm, bottom surface of 30 sec).
  • the culture bottle containing the enzyme-treated cells is placed on the rubber pedestal of the vortex mixer device, and the vibration treatment is performed by applying vertical vibration to the cultured cells treated with the enzyme. It was. Thereafter, the bottle was manually shaken gently in the vertical direction, and again subjected to vibration treatment using a vortex mixer device (2,800-3,200 rpm, 30-sec sec bottom).
  • the matrix in the bottle was washed with PBS ( ⁇ ), and then the human adipose tissue-derived mesenchymal cells detached from the matrix were collected, photographed after staining with crystal violet (FIG. 8 (A)).
  • the cell viability was 96.3%.
  • human adipose tissue-derived mesenchymal cells are seeded in a culture bottle filled with a culture medium and a matrix formed of a nonwoven fabric made of a polymer material, and cultured for 25 days after seeding, and then PBS (- ) Was added and washed, and a stage where no enzyme treatment was performed was taken as a comparative example (FIG. 8 (E)).
  • FIG. 8 (E) many human adipose tissue-derived mesenchymal cells were attached to the matrix.
  • FIG. 8 (A) almost no human adipose tissue-derived mesenchymal cells were attached to the matrix.
  • FIG. 9 shows the number of cells collected when the mixing ratio of the enzyme solution is T2C4D4, T2C1D4, T2C4D1, and T2C1D1. As shown in FIG. 9, the number of cells recovered in the order of T2C4D4, T2C1D4, T2C4D1, and T2C1D1 was large.
  • It can be used for collecting large-scale cultured cells from scaffolds.

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Abstract

大量培養した細胞を３次元多孔性足場から効率的に回収にする方法を提供する。培養容器内に封入された３次元多孔性足場にて細胞を培養する培養工程と、培養容器に、トリプシン-EDTAと、カゼイナーゼ及び／又はコラゲナーゼと、を有する酵素溶液を添加して、培養容器内の培養細胞に酵素処理を行う酵素処理工程と、水平面内を円運動する台座と培養容器の底面とを面接触させ、酵素処理された培養細胞に対して鉛直方向の振動を与えて振動処理を行う振動処理工程と、を有する。

Description

３次元多孔性足場からの培養細胞回収方法
　本発明は、３次元多孔性足場からの培養細胞回収方法に関し、より詳しくは培養面積の広い３次元多孔性足場から大量の培養細胞を効率的に回収する培養細胞回収方法に関する。
　多能性幹細胞（胚性幹細胞、人工多能性幹（iPS）細胞）は、その無限増殖能及び多分化能から、再生医療の重要な細胞ソースとして認識されている。iPS細胞技術は、薬物毒性試験や疾患モデルの確立によって病態解明への応用が可能であることから、近年世界中で研究開発が進められている。多能性幹細胞を用いた再生医療及び創薬研究への応用においては、大量かつ安定的な未分化細胞及び分化細胞の供給が不可欠である。
　プレート上で細胞を単層培養する二次元培養に対して、縦方向の厚みを持たせて細胞を培養する手法を三次元培養という。三次元培養は二次元培養よりも生体内の細胞の状態に近いため生体内環境を模した実験モデルの確立に適しているのみならず、大量の細胞培養が可能となる。
　特許文献１には、所定直径及び見かけ密度を有する生体適合性ポリマー性繊維の集合体からなる３次元多孔性足場（なお、本明細書において足場をマトリックスと記載することがある。）が記載されており、この３次元多孔性足場を使用する細胞培養方法が記載されている。
　特許文献２には、細胞が播種された３次元多孔性足場を密封細胞培養容器内に入れ、その３次元多孔性足場に対してピストンで加圧を行うことで３次元多孔性足場の圧縮変形を行う細胞培養方法が記載されている。
　特許文献３には、細胞が播種された３次元多孔性足場が記載されており、その３次元多孔性足場表面に対してマイクロ流体チャンネルを通してマイクロ流体を流動させる細胞培養方法が記載されている。
再表２００７／１０２６０６号公報 特開２００９－１２５０６８号公報 特表２０１０－５０５３９３号公報
　しかし、上述の３次元多孔性足場にて細胞の大量培養は可能ではあるが、培養された細胞を足場から効率的に回収することは困難である。特に３次元多孔性足場の奥深くに埋没した培養細胞にダメージを与えることなく効率的に回収することは極めて困難である。
　本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、３次元多孔性足場にて培養された細胞にダメージを与えること無く効率的に回収する、３次元多孔性足場からの培養細胞回収方法を提供することを目的とする。
　本発明にかかる培養細胞回収方法は、培養容器内に封入された３次元多孔性足場にて細胞を培養する培養工程と、前記培養容器にトリプシン-EDTA及びカゼイナーゼを有する酵素溶液を添加して、前記培養容器内の培養細胞に酵素処理を行う酵素処理工程と、水平面内を円運動する台座と前記培養容器とを接触させ、酵素処理された培養細胞に対して鉛直方向の振動を与えて振動処理を行う振動処理工程と、を有することを特徴とする。
　本発明によれば、細胞にダメージを与えること無く、３次元多孔性足場から培養細胞を効率的に回収できる。
実施例１にかかる培養細胞回収方法にて細胞を回収したマトリックスの写真図であり、酵素溶液はトリプシン-EDTA：カゼイナーゼ＝２：１である。 比較例にかかる培養細胞回収方法にて細胞を回収したマトリックスの写真図である。 実施例２にかかる培養細胞回収方法にて細胞を回収したマトリックスの写真図であり、そのうち(A)はトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝２：１：１であり、(B)はトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ＝２：１であり、(C)はコラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝１：１であり、(D)は比較例である。 成分が異なる酵素溶液の場合における細胞回収率の比較を示す図である。 実施例３にかかる培養細胞回収方法にて細胞を回収したマトリックスの写真図であり、そのうち(A)はトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝２：２：２であり、(B)はトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝２：１：１であり、(C)はトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝0.5：２：２であり、(D)はトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝１：１：１である。 振動処理工程をピペッティングで行った場合における細胞回収率の比較を示す図であり、そのうち(A)はトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝２：２：２であり、(B)はトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝２：１：１であり、(C)はトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝0.5：２：２であり、(D)はトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝１：１：１である。 成分が異なる酵素溶液の場合における細胞回収率の比較を示す図である。 実施例４にかかる培養細胞回収方法にて細胞を回収したマトリックスの写真図であり、そのうち(A)はトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝２：４：４であり、(B)はトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝２：１：４であり、(C)はトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝２：４：１であり、(D)はトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝２：１：１であり、(E)は酵素処理をしていない比較例である。 実施例４にかかる培養細胞回収方法にて回収した細胞数を示す図である。
　以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
　本実施形態にかかる培養細胞回収方法は、細胞を培養する培養工程と、培養細胞に酵素処理を行う酵素処理工程と、培養細胞に対して振動を与えて振動処理を行う振動処理工程と、を有する。
　培養工程では、培養容器内に封入された３次元多孔性足場にて細胞を培養する。培養対象となる細胞は、特に限定されるものでなく、細胞障害を受けにくい細胞及び細胞障害を受けやすい細胞のいずれも可能であるが、好ましくは細胞障害を受けやすい細胞であり、具体的には、ヒト胚性幹(ES)細胞、iPS細胞、体性幹細胞（脂肪や骨髄由来の間葉系幹細胞等）等が挙げられる。
　細胞を培養する培養容器は、培養した細胞が容器内壁に付着しにくい細胞非接着性の容器であり、例えばポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリスチレン等の付着性の低いプラスチック製あるいは、フッ素加工、シリコン加工のような疎水性表面加工を施したプラスチック製又はガラス製の容器である。
　培養容器の大きさや形状は特に限定されるものではなく、例えばボトル状、フラスコ状、バック状、ウェル状、ディッシュ状等のように培養する細胞に応じて任意の形状及び大きさを選択することが可能であるが、好ましくはボトル状である。例えば底部の外底面が平坦状であるボトル状の培養容器であり、また例えば全体の外観が略円柱形状であり、底部の外底面が平坦状である培養容器である。全体の外観が略円柱形状であり、底部の外底面が平坦状である培養容器としては、例えば容積が250 ml(口径39mm、高さ117mm、底72mm)、500 ml(口径39mm、高さ137mm、底92mm)又は1000 ml(口径39mm、高さ156mm、底107mm)等の培養容器を使用することができる。
　３次元多孔性足場は、単一又は複数の足場の集合体のいずれも可能であり、３次元多孔性足場の培養面積は特に限定されるものではないが、例えば800～900000 cm2であり、好ましくは800～45000 cm2である。また、３次元多孔性足場は、例えば平均間隙率が50～90％、好ましくは80～90％であり、平均ポアサイズが10～800μm、好ましくは200～400μmである。
　３次元多孔性足場は、例えば、熱可塑性樹脂製の繊維からなる繊維集合体（不織布、織物、編み物等）であってもよいし、熱可塑性樹脂を予め混練した後、成形して作製したシート（例えば、フィルム、プレート、ボード等）であってもよい。熱可塑性樹脂は、例えば、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ乳酸－ポリグリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、ポリトリメチレンカーボネート、ポリブチレンサクシネート、ポリエチレンサクシネート等が挙げられる。
　培養期間は、特に限定されるものではなく、細胞の種類、細胞の播種数等により適宜選択可能であるが、例えば、細胞を播種後５日～３０日である。通常の培養期間としては、例えば、５日～１４日、好ましくは７日～１０日とすることができる。長期の培養期間としては、例えば、１５日～３０日、好ましくは２２日～２６日とすることができる。
　次に酵素処理工程では、培養容器に、トリプシン-EDTA(以下「T」と表記することがある。)と、カゼイナーゼ(以下「D」と表記することがある。)及び／又はコラゲナーゼ(以下「C」と表記することがある。)と、を有する酵素溶液を添加して、培養容器内の培養細胞に酵素処理を行う。トリプシン-EDTAにおけるEDTAの含有量は、特に限定されるものではなく例えば1.0w/v％ トリプシンにおいて4.0～12.0mmol/L EDTAであり、例えば0.05w/v％ トリプシン-0.53mmol/L EDTA、0.25w/v％ トリプシン-1.0mmol/L EDTA、又は、0.5w/v％ トリプシン-5.3mmol/L EDTA等が挙げられる。
コラゲナーゼは、特に限定されるものではなく例えば、MMP（Matrix metalloproteinase）１、２、３、９、１３、１４等のMMPファミリー等が挙げられる。
　酵素溶液がトリプシン-EDTA及びカゼイナーゼの双方を包含する場合、その混合割合は酵素処理が可能である限り特に限定されるものではないが、例えばトリプシン-EDTA：カゼイナーゼ＝0.5～４：１～２であり、好ましくは２：１である。ここでトリプシン-EDTAでは×１が0.5 mg/mlであり、カゼイナーゼでは×１が1000 units (1mg/ml ＝300 units)である。そのため、トリプシン-EDTA：カゼイナーゼ＝２：１とは、1.0 mg/mlのトリプシン-EDTAと3.334 mg/mlのカゼイナーゼとの混合液を意味する。
　酵素溶液がトリプシン-EDTA及びコラゲナーゼの双方を包含する場合、その混合割合は酵素処理が可能である限り特に限定されるものではないが、例えばトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ＝0.5～４：１～４であり、好ましくは２：１である。ここでトリプシン-EDTAでは×１が0.5 mg/mlであり、コラゲナーゼでは×１が300 units (1mg/ml ＝300 units)である。
　酵素溶液がトリプシン-EDTA、コラゲナーゼ及びカゼイナーゼの全てを包含する場合、その混合割合は酵素処理が可能である限り特に限定されるものではないが、例えばトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝０．５～４：１～６：１～６である。通常の培養期間の場合はT：C：Dは例えば０．５～２：１～２：１～２であり、好ましくは２：１：１である。長期の培養期間の場合はT：C：Dは例えば２～４：１～６：２～６であり、好ましくは２：４：４である。長期の培養期間の場合、細胞が増殖するため細胞周囲に新たに細胞外マトリックスが産生することがある。そしてこの産生した細胞外マトリックスにより細胞を回収しにくくなるが、後述の実施例で示されているように、本発明者は酵素処理工程における酵素溶液の配合比率を検討することにより、長期の培養期間の場合でも容易な細胞の回収を可能とした。ここでトリプシン-EDTAでは×１が0.5mg/mlであり、コラゲナーゼでは×１が300 units (1mg/ml ＝300 units)であり、カゼイナーゼでは×１が1000 units (1mg/ml ＝300 units)である。
　なお、培養容器内の溶液量は、３次元多孔性足場が複数の足場の集合体の場合、各足場10個あたり1 mlとすることが可能である。
　酵素処理の条件は特に限定されるものではないが、例えば10～30分、36～38℃であり、好ましくは15分、37℃である。
　なお、酵素溶液には、更に、デオキシリボヌクレアーゼ(DNase)、パパイン、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、キモトリプシン又はプロナーゼ等のタンパク質分解酵素を包含させることも可能である。
　次に振動処理工程では、水平面内を円運動する台座と酵素溶液が添加された培養容器の底面とを面接触させ、酵素処理された培養細胞に対して鉛直方向の振動を与えて振動処理を行う。
　円運動は好ましくは等速円運動であり、その周波数は例えば20～100 Hzであり、好ましくは40～70 Hzである。台座の形状は特に限定されるものではなく、例えば板状、椀状等があげられる。水平面内を円運動する台座は、例えばボルテックスミキサー(以下「V」と表記することがある。)の上部に設けられたゴム製の台座とすることが可能である。板状の台座の場合、台座の上部に凸部を設けることができる。そして、底部が平坦状であるボトル状培養容器の外底面に、その凸部に密着して嵌合する凹部を設けることができる。台座上部の凸部がボトル状培養容器の底部の凹部に密着して嵌合挿入されて、台座の上面と培養容器の底面とが面接触している状態で、台座が水平面内を円運動する場合、台座の円運動が的確に培養容器に伝わる。また、椀状の台座の場合も台座の上部に凸部を設け、そして培養容器の外底面にその凸部に密着して嵌合する凹部を設けることができる。なお、ボルテックスミキサーは、容器の底部を高速旋回して内容液を撹拌する実験器具であり、上向きの電動機に駆動軸の中心からずれた位置にゴム製の台座がついている。
　培養容器はその底部を台座に密着させて載置されることが可能であり、また培養容器を逆さまにして容器上部にある蓋部を台座に密着させて載置されることも可能である。更には、培養容器を逆さまにして底部を水平面内を円運動する台座に接触させつつ、蓋部に固定部材を接触させて該固定部材と台座とで培養容器を挟持することも可能である。
　水平面内を円運動する台座と接触している培養容器内では、培養細胞に対して鉛直方向の振動が与えられるが、これは下記理由によるものと考えられる。例えば、底部の外底面が平坦状である円柱形状の培養容器をボルテックスミキサーの台座に載置させて振動を培養容器に与えた場合、ボルテックスミキサーの台座は等速円運動しており、容器下部では容器内部の酵素溶液に水平方向の振動が伝わる。容器底部の水平方向の振動により、容器内部の酵素溶液は容器内壁に衝突して、鉛直上向きに移動し、その後重力により鉛直下向きに落下し、これを繰り返すことにより、容器内部の酵素溶液は鉛直上向き及び鉛直下向きの移動を繰り返す。容器内部の酵素溶液の動きは容器内部の３次元多孔性足場に伝わり、その結果、培養細胞に対して鉛直方向の振動が与えられるのである。なお、底部の外底面が円錐状の場合は、渦巻状に内容液が撹拌され、マトリックスも同様に内容液の渦巻流に伴って動作する為、鉛直方向への移動が発生しない。また、容器内部に渦巻流が発生すると容器内部の３次元多孔性足場が酵素溶液の上方へ浮上し、渦巻流中心付近に留まることになり、３次元多孔性足場に振動が伝わりにくいため、振動処理工程では渦巻流の発生を極力抑制することが好ましい。
振動処理の時間は特に限定されるものではないが、例えば10秒～30分である。
　なお、振動処理工程では、培養細胞を包含する酵素溶液をノズルにより吸引・吐出を繰り返し行うピペッティング(以下「P」と表記することがある。)により培養細胞に振動を与える振動処理を行うことも可能である。
　本実施形態にかかる培養細胞回収方法によれば、例えば培養容器として500 mlのボトルを使用し、その培養容器内に例えば合計培養面積34000 cm2の３次元多孔性足場を封入させ、例えば1x107個のヒト脂肪組織由来間葉系細胞を入れることができる。そして培養後、酵素処理及び振動処理を経ることにより３次元多孔性足場の深部に位置する細胞であっても効率的に３次元多孔性足場から回収できる。しかも本実施形態にかかる発明によれば下記実施例で示すように高い生存率にて効率的に細胞を回収できる。培養容器を複数設置するか又は培養容器の内容積を増大することにより、更に大量の細胞培養及び細胞回収も可能となり、本発明により得られる利益は計り知れない。
　（１）実施例１
　実施例１では、本実施例にかかる培養細胞回収方法と、酵素処理も振動処理も行わない比較例にかかる培養細胞回収方法とを比較する。
　許可を得た被験者の腹部から皮下脂肪組織を無菌的に採取した。脂肪組織をコラゲナーゼで処理することで細胞を分散して遠心に供してSVF(Stromal vascular fraction)を回収した。PBS（-）でSVFを洗浄後、DMEM/F12に20 μg/mlの還元型グルタチオン、５ μg/mlのフィブロネクチン及び100 nMのエコチンを加えた初代培養用無血清培地に懸濁し、Tフラスコに播種したうえで、37℃／5％CO2条件下で95％コンフルエントに達するまで培養した。
　その後、剥離剤を用いて細胞を剥離回収し、PBS(-)による洗浄の後、DMEM/F12に20 μg/mlの還元型グルタチオンを加えた継代培養用無血清培地に懸濁してTフラスコに播種して、37℃／5％CO2条件下で培養した。この継代作業を繰り返し、1x108個のヒト脂肪組織由来間葉系細胞を得た。
　細胞培養にはCESCO社の高密度培養システム BelloCellを使用した。1本のBelloCell-500ディスポーザブル培養ボトルには、900個のBioNOC IIマトリックスが入っていた。ボトルの容量は500ｍｌ(口径39mm、高さ137mm、底92mm)であった。1ボトル内のマトリックス全ての表面積は15,600cm2であった。ボトル内に1x107個のヒト脂肪組織由来間葉系細胞を入れた。BelloCellシステムの機器内エレベーターの昇降により、BelloCellボトル内の培地の水位が上下し、これにより細胞へのエアレーションと栄養供給、代謝産物（CO2）の排出が行われ、ボトル内で細胞を播種後7日間の細胞培養が行われた。その後PBS(-)を加えて洗浄した。
　PBS(-)を回収し、マトリックス全部が水面下になる必要最低量の酵素溶液を加え、15分、37℃で酵素処理を行った。酵素溶液は、トリプシン-EDTA及びカゼイナーゼの混合液であった。混合割合は、トリプシン-EDTA：カゼイナーゼ＝２：１(T2D1)であった。ボトル内の液量は90 mlであった。
　その後、ボルテックスミキサー装置(2,800-3,200rpm、10 sec底面)を使用して振動処理を行った。即ち、酵素処理を行った細胞が入っているBelloCellボトルをボルテックスミキサー装置のゴム製の台座の上に載置し、酵素処理された培養細胞に対して鉛直方向の振動を与えて振動処理を行った。その後ボトルを手動にて鉛直方向に緩やかに振り、再度、ボルテックスミキサー装置(2,800-3,200rpm、10 sec底面)を使用して振動処理を行った。
　次にPBS(-)にてボトル内のマトリックスを洗浄後、マトリックスから剥離された1x108個のヒト脂肪組織由来間葉系細胞を回収した。
　ヒト脂肪組織由来間葉系細胞が剥離後のマトリックスを染色して写真撮影した。染色は、4％ パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、5mg/ml クリスタルバイオレットで染色し、余剰分のクリスタルバイオレットを洗浄後、乾燥させ、2％ SDS溶液によりクリスタルバイオレットを溶出し、その後に撮影した。結果を図1に示す。なお、細胞の生存率は９７．６％であった。
　剥離された多量のヒト脂肪組織由来間葉系細胞を細胞懸濁液の状況で、20μm（細胞径より大きい、かつ、異物破片より小さい）のフィルタに通し、50 ml遠心管4本へ細胞懸濁液を回収した。
　遠心管内の細胞懸濁液と等量の培地を加え、400ｇ 5min、4℃の条件で遠心し、細胞ペレットの状態にするため、上清を破棄した。
　20 mlの培地にヒト脂肪組織由来間葉系細胞を懸濁・浮遊させた。
　50 mlの遠心管内にて、比重1.20（なおヒト脂肪組織由来間葉系細胞の比重は1.075、異物破片の比重は1.36）のショ糖溶液の上に、細胞懸濁液を静かに加える事で、重層化した。
　その状態で、400ｇ 10min 4℃の条件で遠心し、比重の重い異物破片はショ糖溶液内、かつ遠心管の最下部へ沈殿し、ヒト脂肪組織由来間葉系細胞はショ糖溶液より上層に細胞層を形成した。
　細胞層のみを50 ml遠心管に回収し、等量以上の培地を加え、400ｇ 5min、4℃の条件で遠心し、細胞ペレットの状態にしたのち、必要量の培地や生理食塩水に再懸濁し、細胞懸濁液を作製した。
　次に、比較例として、上記と同様に、CESCO社の高密度培養システム BelloCellを使用してボトル内で細胞培養を行い、その後PBS(-)を加えて洗浄した。上記の酵素処理も振動処理も行わずにマトリックスをクリスタルバイオレット染色後、写真撮影した。結果を図２に示す。本実施例にかかる培養細胞回収方法によれば、効率的に細胞回収が可能であることが示された。
　（２）実施例２
　実施例２では、酵素処理工程で使用する酵素溶液について検討した。
　実施例１と同様に、CESCO社の高密度培養システム BelloCellを使用してボトル内で細胞を播種後7日間の細胞培養を行い、その後PBS(-)を加えて洗浄した。
　PBS(-)を回収し、マトリックス全部が水面下になる必要最低量の酵素溶液を加え、15分、37℃で酵素処理を行った。酵素溶液は、トリプシン-EDTA、コラゲナーゼ及びカゼイナーゼの混合液であった。混合割合は、トリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝２：１：１(T2C1D1)であった。
　その後、実施例１と同様に、ボルテックスミキサー装置(2,800-3,200rpm、10 sec底面)を使用して振動処理を行った。
　次にPBS(-)にてボトル内のマトリックスを洗浄後、マトリックスから剥離されたヒト脂肪組織由来間葉系細胞を回収し、実施例１と同様にクリスタルバイオレット染色を行い写真撮影した（図３(A)）。なお、細胞の生存率は９８．５％であった。
　酵素処理工程で、混合割合がトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ＝２：１(T2C1)の酵素溶液を使用した以外は上述と同様にして写真撮影した（図３(B)）。なお、細胞の生存率は９６．９％であった。
　酵素処理工程で、混合割合がコラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝１：１(C1D1)の酵素溶液を使用した以外は上述と同様にして写真撮影した（図３(C)）。なお、細胞の生存率は９３．２％であった。
　比較例として、実施例１と同様に、CESCO社の高密度培養システム BelloCellを使用してボトル内で細胞培養を行い、その後PBS(-)を加えて洗浄し、酵素処理も振動処理も行わずにマトリックスをクリスタルバイオレット染色後、写真撮影した（図３(D)）。
　次に図４に、成分が異なる酵素溶液の場合における細胞回収率の比較を示す。図４では、酵素溶液T2C1D1の場合の細胞回収を100とした場合の相対値で示す。
　実施例１及び実施例２の結果から、酵素処理に使用する酵素溶液は、トリプシン-EDTAと、カゼイナーゼ及び／又はコラゲナーゼと、を包含する必要があり、トリプシン-EDTAとコラゲナーゼとカゼイナーゼとを含む酵素溶液である場合は更に効率的に回収可能であることが示された。
　（３）実施例３
　実施例３では、通常の培養期間の場合において、最も回収効率が優れるトリプシン-EDTA、コラゲナーゼ及びカゼイナーゼの混合液である酵素溶液の混合割合について検討した。
　実施例１と同様に、CESCO社の高密度培養システム BelloCellを使用してボトル内で細胞を播種後7日間の細胞培養を行い、その後PBS(-)を加えて洗浄した。
　PBS(-)を回収し、マトリックス全部が水面下になる必要最低量の酵素溶液を加え、15分、37℃で酵素処理を行った。酵素溶液の混合割合は、トリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝２：２：２(T2C2D2)であった。
　その後、実施例１と同様に、ボルテックスミキサー装置(2,800-3,200rpm、10 sec底面)を使用して振動処理を行った。
　次にPBS(-)にてボトル内のマトリックスを洗浄後、マトリックスから剥離されたヒト脂肪組織由来間葉系細胞を回収し、実施例１と同様にクリスタルバイオレット染色を行い写真撮影した（図５(A)）。細胞の生存率は９５．４％であった。
　酵素処理工程で、混合割合がトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝２：１：１(T2C1D1)の酵素溶液を使用した以外は上述と同様にして写真撮影した（図５(B)）。なお、この混合割合は実施例２の図３(A)で示したものと同一である。細胞の生存率は９４．８％であった。
　酵素処理工程で、混合割合がトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝０．５：２：２(T0.5C2D2)の酵素溶液を使用した以外は上述と同様にして写真撮影した（図５(C)）。細胞の生存率は９６．２％であった。
　酵素処理工程で、混合割合がトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝１：１：１(T1C1D1)の酵素溶液を使用した以外は上述と同様にして写真撮影した（図５(D)）。細胞の生存率は９３．１％であった。
　なお参考例として、振動処理工程をピペッティングにて行った。即ち、実施例１と同様に、CESCO社の高密度培養システム BelloCellを使用してボトル内で細胞培養を行い、その後PBS(-)を加えて洗浄した。PBS(-)を回収し、マトリックス全部が水面下になる必要最低量の酵素溶液を加え、15分、37℃で酵素処理を行った。酵素溶液の混合割合は、トリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝２：２：２(T2C2D2)であった。その後パスツールピペットにてピペッティングにより振動処理を行った。PBS(-)にてボトル内のマトリックスを洗浄後、マトリックスから剥離されたヒト脂肪組織由来間葉系細胞を回収し、実施例１と同様にクリスタルバイオレット染色を行い写真撮影した（図６(A)）。細胞の生存率は９９．１％であった。
　酵素処理工程で、混合割合がトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝２：１：１(T2C1D1)の酵素溶液を使用した以外は上述と同様にピペッティングにより振動処理を行った（図６(B)）。細胞の生存率は９５．３％であった。
　酵素処理工程で、混合割合がトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝０．５：２：２(T0.5C2D2)の酵素溶液を使用した以外は上述と同様にピペッティングにより振動処理を行った（図６(C)）。細胞の生存率は８５．５％であった。
　酵素処理工程で、混合割合がトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝１：１：１(T1C1D1)の酵素溶液を使用した以外は上述と同様にピペッティングにより振動処理を行った（図６(D)）。細胞の生存率は９０．５％であった。
　次に図７は、振動処理工程をボルテックスミキサー装置で行う場合とピペッティングで行う場合とにおいて、細胞回収率の比較を示す。図７では、酵素溶液T2C1D1の場合でボルテックスミキサー装置を使用する場合の細胞回収を100とした場合の相対値で示す。
　実施例３の結果から、通常の培養期間の場合において、トリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝２：１：１の酵素溶液を使用した場合が細胞回収率において最も優れていることが示された。
　（４）実施例４
　実施例４では、長期の培養期間の場合において、最も回収効率が優れるトリプシン-EDTA、コラゲナーゼ及びカゼイナーゼの混合液である酵素溶液の混合割合について検討した。
　細胞は、Lonza社から購入したヒト脂肪組織由来間葉系細胞を使用した。培養はボトル型の培養ボトル内にて行われた。ボトルの容量は1500ｍｌ(口径100mm、高さ210mm、底110mm)であった。培養ボトル内には、培養液及び高分子素材の不織布から形成されたマトリックスが充填され、そのマトリックスにヒト脂肪組織由来間葉系細胞が播種された。細胞へのエアレーションと栄養供給、代謝産物（CO２）の排出が行われ、細胞を播種後２５日間の細胞培養が行われた。その後PBS(-)を加えて洗浄した。
　PBS(-)を回収し、酵素溶液を加え、15分、37℃で酵素処理を行った。酵素溶液の混合割合は、トリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝２：４：４(T2C4D4)であった。
　その後、ボルテックスミキサー装置(2,800-3,200rpm、30 sec底面)を使用して振動処理を行った。即ち、酵素処理を行った細胞が入っている培養ボトルをボルテックスミキサー装置のゴム製の台座の上に載置し、酵素処理された培養細胞に対して鉛直方向の振動を与えて振動処理を行った。その後ボトルを手動にて鉛直方向に緩やかに振り、再度、ボルテックスミキサー装置(2,800-3,200rpm、30 sec底面)を使用して振動処理を行った。
　次にPBS(-)にてボトル内のマトリックスを洗浄後、マトリックスから剥離されたヒト脂肪組織由来間葉系細胞を回収し、クリスタルバイオレット染色後、写真撮影した（図８(A)）。細胞の生存率は９６．３％であった。
　酵素処理工程で、混合割合がトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝２：１：４(T2C1D4)の酵素溶液を使用した以外は上述と同様にしてクリスタルバイオレット染色後、写真撮影した（図８(B)）。細胞の生存率は９７．２％であった。
　酵素処理工程で、混合割合がトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝２：４：１(T2C4D1)の酵素溶液を使用した以外は上述と同様にしてクリスタルバイオレット染色後、写真撮影した（図８(C)）。細胞の生存率は９７．７％であった。
　酵素処理工程で、混合割合がトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝２：１：１(T2C1D1)の酵素溶液を使用した以外は上述と同様にしてクリスタルバイオレット染色後、写真撮影した（図８(D)）。細胞の生存率は９６．０％であった。
　なお、ヒト脂肪組織由来間葉系細胞を、培養液及び高分子素材の不織布から形成されたマトリックスが充填された培養ボトル内に播種し、播種後２５日間の細胞培養を行い、その後PBS(-)を加えて洗浄し、酵素処理を行わない段階を比較例として写真撮影した（図８(E)）。図８(E)を参照するにマトリックスには多数のヒト脂肪組織由来間葉系細胞が付着していた。図８(A)を参照するにマトリックスにはヒト脂肪組織由来間葉系細胞はほとんど付着していなかった。図８(A)、図８(B)、図８(C)、図８(D)の順番にマトリックスに付着しているヒト脂肪組織由来間葉系細胞の数は多いものであった。図９には酵素溶液の混合割合がT2C4D4、T2C1D4、T2C4D1、T2C1D1の場合における回収された細胞数を示す。図９に示されるように、T2C4D4、T2C1D4、T2C4D1、T2C1D1の順番に回収された細胞数は多いものであった。この実験結果から細胞の培養期間が長い場合、酵素処理工程で、混合割合がトリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼ＝２：４：４(T2C4D4)の酵素溶液を使用した場合、最も細胞の回収率が優れることが判明した。
　大量培養した細胞の足場からの回収に利用できる。

Claims (9)

  1. 　培養容器内に封入された３次元多孔性足場にて細胞を培養する培養工程と、
    　前記培養容器に、トリプシン-EDTAと、カゼイナーゼ及び／又はコラゲナーゼと、を有する酵素溶液を添加して、前記培養容器内の培養細胞に酵素処理を行う酵素処理工程と、
    　水平面内を円運動する台座と前記酵素溶液が添加された培養容器の底面とを面接触させ、酵素処理された培養細胞に対して鉛直方向の振動を与えて振動処理を行う振動処理工程と、
    を有することを特徴とする、３次元多孔性足場からの培養細胞回収方法。
  2. 　前記酵素は、トリプシン-EDTAと、コラゲナーゼと、カゼイナーゼと、を含むことを特徴とする請求項１に記載の培養細胞回収方法。
  3. 　前記培養工程における細胞の培養期間が５日～１４日の場合、前記酵素処理工程における酵素の溶液の比率は、トリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼが０．５～２：１～２：１～２である、ことを特徴とする請求項２に記載の培養細胞回収方法。
  4. 　前記培養工程における細胞の培養期間が１５日～３０日の場合、前記酵素処理工程における酵素の溶液の比率は、トリプシン-EDTA：コラゲナーゼ：カゼイナーゼが２～４：１～６：２～６である、ことを特徴とする請求項２に記載の培養細胞回収方法。
  5. 　前記培養容器は底部の外底面が平坦状であることを特徴とする請求項１乃至４の何れか１項に記載の培養細胞回収方法。
  6. 　前記台座の水平面内の円運動は周波数20～100 Hzであることを特徴とする請求項１乃至５の何れか１項に記載の培養細胞回収方法。
  7. 　前記細胞は、ES細胞、iPS細胞又は体性幹細胞である請求項１乃至６の何れか１項に記載の培養細胞回収方法。
  8. 　前記３次元多孔性足場は、平均間隙率80 ％以上且つ平均ポアサイズ10～800μｍであることを特徴とする請求項１乃至７の何れか１項に記載の培養細胞回収方法。
  9. 　前記３次元多孔性足場の培養面積は800～900000 cm2であることを特徴とする請求項１乃至８の何れか１項に記載の培養細胞回収方法。
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