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WO2018105667A1 - Ａｌｄｈ３ａ１検出蛍光プローブ - Google Patents

Ａｌｄｈ３ａ１検出蛍光プローブ Download PDF

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WO2018105667A1
WO2018105667A1 PCT/JP2017/043881 JP2017043881W WO2018105667A1 WO 2018105667 A1 WO2018105667 A1 WO 2018105667A1 JP 2017043881 W JP2017043881 W JP 2017043881W WO 2018105667 A1 WO2018105667 A1 WO 2018105667A1
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WO
WIPO (PCT)
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group
carbon atoms
formula
compound
atom
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2017/043881
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English (en)
French (fr)
Inventor
泰照 浦野
匡 上野
一哉 土原
淳 ▲柳▼下
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Tokyo NUC
National Cancer Center Japan
National Cancer Center Korea
Original Assignee
University of Tokyo NUC
National Cancer Center Japan
National Cancer Center Korea
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Tokyo NUC, National Cancer Center Japan, National Cancer Center Korea filed Critical University of Tokyo NUC
Priority to US16/466,190 priority Critical patent/US20200207989A1/en
Priority to JP2018555047A priority patent/JPWO2018105667A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C09B23/04—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups one >CH- group, e.g. cyanines, isocyanines, pseudocyanines
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    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
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    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
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    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology
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    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/90203—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)

Definitions

  • the present invention is a novel fluorescent probe. More specifically, the present invention relates to a fluorescent probe capable of detecting ALDH3A1.
  • ALDH is an enzyme that oxidizes various aldehydes to carboxylic acids.
  • Table 1 shows ALDH isoforms and their characteristics that are relatively actively studied in the field of stem cell and cancer research.
  • ALDH1A1 and ALDH1A3 are stem cell markers in normal and cancer cells.
  • ALDH3A1 is studied from the viewpoint of anticancer drug resistance because it metabolizes and invalidates some anticancer drugs.
  • ALDH3A1 is reported to be involved in cell proliferation by knockdown experiments of lung cancer cell lines (Non-patent Document 1), and in prostate cancer cells, ALDH3A1 is associated with spheroid formation ability and further malignant transformation of cancer tissue. There is a report that it is involved (Non-Patent Document 2).
  • ALDH3A1 is considered to have an important function, its research is significantly delayed compared to ALDH1.
  • One reason is the presence or absence of a fluorescent probe for ALDH.
  • ALDH1 already has a fluorescent probe (ALDEFLUOR (registered trademark)) that can discriminate ALDH1 activity in living cells, sort cells based on their levels, and perform further experiments in succession. Yes.
  • the stem cell ability includes self-replication ability and differentiation ability, but it is necessary to show this in an experiment to show that ALDH1 is a stem cell marker. In this case, it is necessary to sort out the cells according to the level of ALDH1 activity using living cells.
  • MTT assay a dye that is widely used because it is simple and compatible with high throughput.
  • Non-patent Document 3 the activity of ALDH varies from cell to cell even within the same cell line, but there are many reports that this ALDH activity is related to anticancer drug resistance.
  • An object of the present invention is to provide an ALDH3A1 detection fluorescent probe that can be used in a flow cytometer that can be adapted to living cells.
  • the present inventors diligently studied to solve the above problems, and found that benzaldehyde is effective as a reaction substrate with ALDH3A1, and further binds benzaldehyde and a fluorophore with a linker having a specific structure. Thus, it was found that a fluorescent probe that specifically reacts with ALDH3A1 can be provided.
  • the present inventors have found that the benzaldehyde at the reaction site is highly hydrophobic, and therefore, when combined with a highly hydrophobic fluorophore, the water solubility of the entire probe is low even if metabolized to the carboxylic acid type. It was found that the carboxylic acid type probe could not stay and accumulate in the cell.
  • an ALDH3A1 detection fluorescent probe that can be used in a flow cytometer that can be adapted to living cells can be provided by setting the hydrophilicity level when the fluorescent probe becomes a carboxylic acid type to a specific range, The present invention has been completed.
  • a compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof (Where R a represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms; T is the following divalent group: -N (R b )-, -C (R c ) 2- -O- (R b represents an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, R c represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, and each R c may be the same or different.
  • R a represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms
  • T is the following divalent group: -N (R b )-, -C (R c ) 2- -O-
  • R b represents an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms
  • R c represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms
  • each R c may be the same or different.
  • L represents a linker
  • the retention time of the HPLC chromatogram measured under the following conditions is greater than 6.9 minutes in the case of the aldehyde form of the compound, and 6.9 minutes or less in the case of the carboxylic acid form of the compound. Or a salt thereof.
  • HPLC conditions solvent A 0.01M ammonium formate / water, solvent B 80% acetonitrile 0.01M ammonium formate / water, 20% solvent B for 2.5 minutes followed by 20% to 100% solvent.
  • the bridging group is selected from a substituted or unsubstituted alkylene group having 1 to 6 carbon atoms, — (CH 2 —CH 2 —O) m — (m is 1 or 2), or a combination thereof.
  • R 1 represents a hydrogen atom or 1 to 4 identical or different monovalent substituents present on the benzene ring
  • R 2 represents a hydrogen atom, a monovalent substituent or a bond
  • R 3 and R 4 each independently represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a halogen atom or a bond
  • R 5 and R 6 each independently represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an aryl group or a bond, provided that X is not an oxygen atom
  • R 7 and R 8 each independently represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a halogen atom or a bond
  • X represents an oxygen atom or a silicon atom
  • Heterocyclyl or heteroaryl is alkyl having 1 to 6 carbon atoms, alkenyl having 2 to 6 carbon atoms, or alkynyl having 2 to 6 carbon atoms, aralkyl group having 6 to 10 carbon atoms, or 6 to 10 carbon atoms.
  • R 1 to R 8 and X are as defined in formula (II);
  • R 9 and R 10 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, R 9 and R 10 together may form a 4-7 membered heterocyclyl containing the nitrogen atom to which R 9 and R 10 are attached;
  • R 9 or R 10 , or both R 9 and R 10 together with R 3 or R 7 , respectively, are 5- to 7-membered containing the nitrogen atom to which R 9 or R 10 is
  • Heterocyclyl or heteroaryl is alkyl having 1 to 6 carbon atoms, alkenyl having 2 to 6 carbon atoms, or alkynyl having 2 to 6 carbon atoms, aralkyl group having 6 to 10 carbon atoms, or 6 to 10 carbon atoms.
  • R 11 and R 12 each independently represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms or a bond; R 11 and R 12 together may form a 4-7 membered heterocyclyl containing the nitrogen atom to which R 11 and R 12 are attached; R 11 or R 12 , or both R 11 and R 12 together with R 4 or R 8 , respectively, are 5- to 7-membered containing the nitrogen atom to which R 11 or R 12 is attached.
  • Heterocyclyl or heteroaryl is alkyl having 1 to 6 carbon atoms, alkenyl having 2 to 6 carbon atoms, or alkynyl having 2 to 6 carbon atoms, aralkyl group having 6 to 10 carbon atoms, or 6 to 10 carbon atoms.
  • Optionally substituted with an alkyl-substituted alkenyl group of * Represents a bonding site with L in the formula (I) at an arbitrary position on the benzene ring;
  • L is bonded at any position on the benzene ring and at least one position selected from any positions of R 2 to R 12 .
  • an ALDH3A1 detection fluorescent probe that can be used in a flow cytometer that can be adapted to living cells.
  • ALDH3A1 activity as a cell can be detected using living cells. That is, if ground cells are used, it is possible to evaluate the expression level and activity of ALDH3A1 using conventional techniques. However, by examining the activity of ALDH3A1 while the cells are alive, It becomes possible to approach the essence of biology, such as what kind of fate to follow.
  • OE21 cells in which ALDH3A1 was inhibited by CB7 20 ⁇ M were used.
  • the Western blotting of OE21 cells into which non-target shRNA (ctrl) or shRNA (KD) for ALDH3A1 was introduced is shown.
  • Flow cytometry using OE21 cells into which shRNA has been introduced is shown (Probe5 50 ⁇ M, MK-571 200 ⁇ M).
  • an “alkyl group” or an alkyl part of a substituent containing an alkyl part (such as an alkoxy group), for example, unless otherwise specified, has, for example, 1 to 6 carbon atoms, preferably 1 to 4 carbon atoms, More preferably, it means an alkyl group composed of straight, branched, cyclic, or a combination thereof having about 1 to 3 carbon atoms.
  • alkyl group for example, methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, cyclopropyl group, n-butyl group, sec-butyl group, isobutyl group, tert-butyl group, cyclopropyl
  • methyl group, an n-pentyl group, an n-hexyl group and the like can be mentioned.
  • halogen atom may be any of a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, or an iodine atom, preferably a fluorine atom, a chlorine atom, or a bromine atom.
  • One embodiment of the present invention is a compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof.
  • R a represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms. 1 to 4 R a are present on the benzene ring, and these may be the same or different. In one preferred embodiment of the present invention, each R a is a hydrogen atom.
  • T is the following divalent group: -N (R b )-, -C (R c ) 2- -O- Selected from.
  • R b represents an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, preferably a methyl group or an ethyl group.
  • R c represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, and each R c may be the same or different.
  • T is —N (R b ) —.
  • L represents a linker.
  • the linker include various substituents that bond the fluorophore and the nitrogen atom.
  • the linker is represented by X- (S), X represents a linking group and S, if present, represents a bridging group.
  • the linking group is preferably an amide group (—CONH—), an alkylamide group (—R—CONH—), an ester group (—COO—), an alkyl ester group (—R—COO—), an alkyl ether group ( -RO-) or an alkylcarbonyl group (-R-CO-).
  • R represents a hydrocarbon group, preferably alkyl having 1 to 8 carbon atoms.
  • the bridging group is preferably a substituted or unsubstituted alkylene group having 1 to 6 carbon atoms; ethylene glycol group, diethylene glycol group (that is, — (CH 2 —CH 2 —O) m — (m is 1 or 2)); or a combination thereof.
  • the aldehyde group (—CHO) can be introduced at any position on the benzene ring, but is preferably introduced at the p-position with respect to T.
  • the fluorophore is preferably selected from xanthene dyes (Tokyo Magenta fluorophore, Tokyo Green fluorophore, rhodamine fluorophore, rhodol fluorophore), BODIPY fluorophore or cyanine fluorophore.
  • xanthene dyes Tokyo Magenta fluorophore, Tokyo Green fluorophore, rhodamine fluorophore, rhodol fluorophore
  • BODIPY fluorophore or cyanine fluorophore.
  • the principle schematically shown in FIG. 1 is used as a mechanism for detecting ALDH3A1 highly active cells using a fluorescent probe.
  • the aldehyde type probe is hydrophobic and can penetrate the cell membrane.
  • the probe when the probe is metabolized to the carboxylic acid type by the activity of ALDH3A1, it becomes water-soluble due to the negative charge of the carboxylic acid and becomes impermeable to the membrane.
  • the principle is that carboxylic acid type probes that have become membrane-impermeable only in cells with high activity stay and accumulate.
  • an ALDH3A1 detection fluorescent probe that can be used in a flow cytometer that can be adapted to living cells is provided by setting the hydrophilicity level of the compound of formula (I) to a carboxylic acid type within a specific range. Is possible.
  • the retention time of the HPLC chromatogram is a measure of hydrophilicity.
  • One preferred embodiment of the present invention is a compound represented by the general formula (I) or a salt thereof, and the retention time of the HPLC chromatogram measured under the following conditions is 6 in the case of the aldehyde form of the compound. Greater than 9 minutes, or less than 6.9 minutes in the case of the carboxylic acid form of the compound.
  • HPLC conditions Solvent A 0.01M ammonium formate / water, solvent B 80% acetonitrile 0.01M ammonium formate / water, 20% solvent B for 2.5 minutes followed by 20% to 100% solvent B
  • a C18 column HP 3 ⁇ m, inner diameter: 2.1 mm, length: 150 mm, GL Science
  • flow rate 500 ⁇ l / min
  • a xanthene dye (Tokyo Magenta fluorophore, Tokyo Green fluorophore, rhodamine fluorophore, so that the compound represented by the formula (I) has the retention time of the above-mentioned HPLC chromatogram.
  • Any fluorophore selected from a rhodole fluorophore), a BODIPY fluorophore, or a cyanine fluorophore can be used.
  • R 1 represents a hydrogen atom or 1 to 4 identical or different monovalent substituents present on the benzene ring.
  • the type of monovalent substituent represented by R 1 is not particularly limited, and examples thereof include alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms, alkenyl groups having 1 to 6 carbon atoms, alkynyl groups having 1 to 6 carbon atoms, carbon It is preferably selected from the group consisting of several to six alkoxy groups, hydroxyl groups, carboxy groups, sulfonyl groups, alkoxycarbonyl groups, halogen atoms, or amino groups. These monovalent substituents may further have one or more arbitrary substituents.
  • the alkyl group represented by R 1 may have one or more halogen atoms, carboxy groups, sulfonyl groups, hydroxyl groups, amino groups, alkoxy groups, and the like.
  • the alkyl group represented by R 1 is a halogen atom.
  • An alkyl group, a hydroxyalkyl group, a carboxyalkyl group, or an aminoalkyl group may be used.
  • each R 1 is a hydrogen atom.
  • R 2 represents a hydrogen atom, a monovalent substituent or a bond.
  • the kind of the monovalent substituent represented by R 2 is not particularly limited, but for example, as in R 1 , for example, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkenyl group having 1 to 6 carbon atoms, and 1 to 6 carbon atoms.
  • R 2 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, preferably a methyl group, a carboxyl group, a methoxy group, or a hydroxymethyl group.
  • R 3 and R 4 each independently represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or a halogen atom.
  • the alkyl group may contain one or more halogen atoms, carboxy groups, sulfonyl groups, hydroxyl groups, amino groups, alkoxy groups,
  • the alkyl group represented by R 3 or R 4 may be a halogenated alkyl group, a hydroxyalkyl group, a carboxyalkyl group, or the like.
  • R 3 and R 4 are each independently preferably a hydrogen atom or a halogen atom. When R 3 and R 4 are both hydrogen atoms, or R 3 and R 4 are both fluorine atoms or chlorine atoms. More preferred.
  • R 5 and R 6 each independently represent an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an aryl group or a bond, provided that when X is an oxygen atom, R 5 and R 6 are present. do not do.
  • R 5 and R 6 are preferably each independently an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, and more preferably both R 5 and R 6 are methyl groups.
  • the alkyl group represented by R 5 and R 6 may contain one or more halogen atoms, carboxy groups, sulfonyl groups, hydroxyl groups, amino groups, alkoxy groups, and the like, for example, R 5 or R 6 represents The alkyl group may be a halogenated alkyl group, a hydroxyalkyl group, a carboxyalkyl group, or the like.
  • R 5 or R 6 represents an aryl group
  • the aryl group may be either a monocyclic aromatic group or a condensed aromatic group, and the aryl ring has one or more ring-constituting heteroatoms. (For example, a nitrogen atom, an oxygen atom, or a sulfur atom) may be contained.
  • the aryl group is preferably a phenyl group.
  • One or more substituents may be present on the aryl ring.
  • the substituent for example, one or two or more halogen atoms, carboxy groups, sulfonyl groups, hydroxyl groups, amino groups, alkoxy groups and the like may be present.
  • R 7 and R 8 each independently represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a halogen atom or a bond, and are the same as those described for R 3 and R 4. . It is preferred that R 7 and R 8 are both hydrogen atoms, both chlorine atoms, or both fluorine atoms.
  • X represents an oxygen atom or a silicon atom.
  • X is an oxygen atom.
  • L can be bonded at any position on the benzene ring and at least one position selected from any of R 2 to R 8 .
  • L can be bonded to any position of the benzene ring bonded to the xanthene ring skeleton, but is preferably bonded to the 4-position or 5-position of the benzene ring.
  • One preferable embodiment of the present invention is a compound represented by the following formula (IIa) or a salt thereof.
  • R a , R b and L are as described for formula (I), and R 3 , R 4 , R 7 and R 8 are as described for formula (II).
  • R 1 to R 8 and X in the formula (III) are as defined in the formula (II).
  • R 9 and R 10 each independently represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, or a bond. Furthermore, R 9 and R 10 may form a heterocyclyl 4-7 membered containing a nitrogen atom attached is R 9 and R 10 together. R 9 or R 10 , or both R 9 and R 10 together with R 4 or R 8 , respectively, contain a nitrogen atom to which R 9 or R 10 is bonded. Member heterocyclyl or heteroaryl may be formed. The ring member may contain 1 to 3 further heteroatoms selected from the group consisting of oxygen atom, nitrogen atom and sulfur atom, and the heterocyclyl or heteroaryl has 1 to 6 carbon atoms.
  • heterocyclyl or heteroaryl examples include, but are not limited to, pyrrolidine, piperidine, hexamethyleneimine, pyrrole, imidazole, pyrazole, oxazole, thiazole and the like.
  • * represents a bonding site with L in the formula (I) at an arbitrary position on the benzene ring.
  • L is bonded at any position on the benzene ring and at least one position selected from any positions of R 2 to R 10 .
  • L can be bonded to any position of the benzene ring bonded to the xanthene ring skeleton, but is preferably bonded to the 4-position or 5-position of the benzene ring.
  • R 1 to R 8 and X are as described for the formula (II).
  • R 9 and R 10 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. Furthermore, R 9 and R 10 may form a heterocyclyl 4-7 membered containing a nitrogen atom attached is R 9 and R 10 together. Examples of the heterocyclyl include azetidine, pyrrolidine and the like, and these heterocyclyl may be substituted with a substituent such as alkyl having 1 to 6 carbon atoms. Also, R 9 or R 10 , or both R 9 and R 10 together with R 3 or R 7 each contain a nitrogen atom to which R 9 or R 10 is attached 5-7 Member heterocyclyl or heteroaryl may be formed.
  • the ring member may contain 1 to 3 further heteroatoms selected from the group consisting of oxygen atom, nitrogen atom and sulfur atom, and the heterocyclyl or heteroaryl has 1 to 6 carbon atoms. Or an alkyl-substituted alkenyl group having 2 to 6 carbon atoms, or an alkynyl group having 2 to 6 carbon atoms, an aralkyl group having 6 to 10 carbon atoms, or an alkyl-substituted alkenyl group having 6 to 10 carbon atoms. .
  • heterocyclyl or heteroaryl examples include, but are not limited to, pyrrolidine, piperidine, hexamethyleneimine, pyrrole, imidazole, pyrazole, oxazole, thiazole and the like.
  • R 11 and R 12 each independently represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, or a bond.
  • R 11 and R 12 may together form a 4-7 membered heterocyclyl containing the nitrogen atom to which R 11 and R 12 are attached.
  • the heterocyclyl include azetidine, pyrrolidine and the like, and these heterocyclyl may be substituted with a substituent such as alkyl having 1 to 6 carbon atoms.
  • R 11 or R 12 , or both R 11 and R 12 together with R 4 or R 8 contain a nitrogen atom to which R 11 or R 12 is bonded 5-7 Member heterocyclyl or heteroaryl may be formed.
  • the ring member may contain 1 to 3 further heteroatoms selected from the group consisting of oxygen atom, nitrogen atom and sulfur atom, and the heterocyclyl or heteroaryl has 1 to 6 carbon atoms. Or an alkyl-substituted alkenyl group having 2 to 6 carbon atoms, or an alkynyl group having 2 to 6 carbon atoms, an aralkyl group having 6 to 10 carbon atoms, or an alkyl-substituted alkenyl group having 6 to 10 carbon atoms. .
  • heterocyclyl or heteroaryl examples include, but are not limited to, pyrrolidine, piperidine, hexamethyleneimine, pyrrole, imidazole, pyrazole, oxazole, thiazole and the like.
  • * represents a bonding site with L in the formula (I) at an arbitrary position on the benzene ring.
  • L is bonded at any position on the benzene ring and at least one position selected from any positions of R 2 to R 12 .
  • R 13 and R 14 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • R 15 independently represents a hydrogen atom, a carboxyl group or a sulfonic acid group.
  • n an integer of 1 to 3.
  • * represents the coupling
  • R 16 to R 22 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a carbonyl group, an allyl group, an aryl group, a pyrrole group, a thiophene group, a furan group, or a sulfonic acid.
  • L is bonded at at least one position selected from any position of R 16 to R 22 .
  • the compound of the present invention may have one or more asymmetric carbons depending on the type of substituent, and may have a stereoisomer such as an optical isomer or a diastereoisomer. Pure forms of stereoisomers, any mixture of stereoisomers, racemates, and the like are all within the scope of the present invention.
  • the compound of the present invention represented by the general formula (I) or a salt thereof may exist as a hydrate or a solvate, and any of these substances is included in the scope of the present invention.
  • solvents such as ethanol, acetone, isopropanol, can be illustrated.
  • Another aspect of the present invention is an ALDH3A1 detection fluorescent probe comprising a compound represented by the general formula (I) and having the above-mentioned HPLC chromatogram retention time or a salt thereof.
  • the RP-UPLC analysis was measured by Waters Acquity UPLC H-Class / ACQUITY UPLC PDA e ⁇ detector / Xevo TQD quadrupole MS / MS analyzer.
  • LC / MS analysis was measured with an Agilent 1200 Series Diode Array Detector / 6130 quadruple MS analyzer. Imaging acquired the image by Leica TCS SP8. For flow cytometry, analysis was performed with BD FACS Canto II, and cell sorting was performed with BD FACS Aria.
  • Compound 3 is based on the method described in the paper (Giulio Cas et al. “Site-specific traceless coupling of potent cytotoxic drugs to recombinant antibodies for pharmacodelivery” J. Am. Chem. Soc., 2012 134, pp5887-5892). -Synthesized from cyanobenzaldehyde.
  • Compound 3 (10 mg, 25.6 ⁇ mol) and 8 mL of distilled THF were added to a 50 mL round bottom flask.
  • DIEA 5.4 ⁇ L, 36.5 ⁇ mol
  • BODIPY FL SE dissolved in 1 mL of THF were sequentially added to the reaction solution, heated to 40 ° C. on an oil bath, and stirred for 3 hours.
  • reaction solution was diluted with 20 mL of CH 2 Cl 2 , and this was washed with 10 mL of citric acid aqueous solution (10 w / v%), 2 mL of NaHCO 3 aqueous solution 10 mL, and saturated saline 10 mL.
  • the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, the solution was filtered, and the filtrate was concentrated under reduced pressure.
  • the concentrated residue was purified by column chromatography using silica gel as a carrier to obtain Compound 4. A part of the purified product was contaminated with a compound in which acetal was deprotected, but it was directly used in the next reaction.
  • Compound 7 was synthesized by the method known in the paper (Dalla Via et al. “DNA-targeting pyrroloquinoline-linked butenone and chalcones: Synthesis and biological evaluation” Eur. J. Med. Chem., 2009 44, pp2854-2861).
  • 7 (2 mg, 14 ⁇ mol) and BODIPY FL (3 mg, 7 ⁇ mol) were weighed and 150 ⁇ L of CH 2 Cl 2 was added.
  • HATU (15.6 mg 39.5 ⁇ mol) and DIEA (50 ⁇ L) were added to the solution, and the mixture was stirred overnight at room temperature under an argon atmosphere.
  • Compound 12 was prepared according to the method described in a paper (Julien Massin, J. et al, “Near-infrared solid-state emitters based on isophorone: Synthesis, crystal structure and spectroscopic properties” Chem. Mater., 2011, 23, pp862-873). Synthesized. Compound 12 (730 mg) was weighed in a 50 mL round bottom flask, and distilled MeOH 40 mL and triethyl orthoformate 1.09 mL were added. After adding 12 drops of concentrated hydrochloric acid, the mixture was heated at 40 ° C. for 3 hours, and then cooled to room temperature. The reaction was diluted with MeOH, CH 2 Cl 2 , sat.
  • Compound 18 was synthesized by a method known in the literature (Lorella Pasquinucci et al, “Evaluation” of “N-substitution” in 6,7-benzomorphan “compounds” “Bioorg. Med. Chem., 2010, 18, 18, pp4975-4982).
  • a dry 100 mL round bottom two-necked flask 4 g, 26.2 mmol of 2-benzyloxyethanol are weighed and dissolved in 20 mL of distilled THF, and then the inside of the container is filled with an argon atmosphere using a three-way cock equipped with a balloon filled with argon. And sealed with a rubber septum.
  • Reduction of the azide group of Compound 25 was performed according to the synthesis method of Compound 14 shown above. Using Compound 25 (823 mg, 2.67 mmol), LiAlH 4 (203 mg, 5.34 mmol) and 10 mL of THF, Compound 26 was obtained as a colorless liquid at 629 mg in a yield of 83%.
  • Probes 1 to 3 The reactivity of Probes 1 to 3 synthesized above to ALDH1A1, ALDH1A3, and ALDH3A1 was examined.
  • the UPCL chromatogram was run from 5% acetonitrile 0.01M ammonium formate / water to 95% acetonitrile 0.01M ammonium formate / water linear gradient over 5 minutes at a flow rate of 800 ⁇ L / min.
  • the aldehyde type and carboxylic acid type probes were detected by absorbance at a wavelength of 504 nm, and it was confirmed that the m / z of the MS spectrum at each peak matched the expected m / z.
  • ALDEFLUOR is known to react with ALDH1A1 and ALDH1A3, it was performed only with ALDH3A1. The results are shown in Table 2.
  • Probe1 and Probe3 were esophageal squamous cell carcinoma cell lines (OE21 cell line), which are ALDH3A1 highly expressing cells.
  • OE21 cell line esophageal squamous cell carcinoma cell lines
  • CB7 ALDH3A1 specific inhibitor
  • Probe2 can be used in the same manner as ALDEFLUOR, which can detect ALDH1 highly active cells. Therefore, imaging using A549 cells reported in the literature that ALDEFLUOR can detect ALDH1A1 highly active cells is possible. However, no clear difference in brightness was observed with respect to the negative control.
  • BODIPY is a hydrophobic probe, but Probes 1 to 3 are aromatic aldehydes having strong hydrophobicity unlike short-chain aliphatic aldehydes contained in the reaction part of ALDEFLUOR. In other words, the combination of hydrophobic substances shifted the water-solubility of the entire probe toward the hydrophobic side, and it was thought that even the carboxylic acid type was not so hydrophilic as to be non-permeable to the membrane.
  • Probes 4 and 5 in order to make the probe more hydrophilic, a fluorophore that is more hydrophilic than BODIPY was used, and Tokyo Green (TG) was used as the fluorophore.
  • TG Tokyo Green
  • As the reaction part DEAB having a relatively high specificity for ALDH3A1 was used. Further, from the results of Probes 1 and 2, since the binding part also affected the reactivity to ALDH, Probes 4 and 5 used two types of linkers having different binding part lengths.
  • the HPCL chromatogram shows that solvent A is 0.01M ammonium formate / water, solvent B is 80% acetonitrile 0.01M ammonium formate / water, 20% B for 2.5 minutes, then 20% to 100% B for 5 minutes.
  • the measurement was performed under the condition of a linear gradient (flow rate: 500 ⁇ l / min).
  • Probes containing BODIPY were detected by absorbance at a wavelength of 504 nm and probes containing TG at a wavelength of 495 nm, and it was confirmed that the m / z of the MS spectrum at each peak matched the expected m / z.
  • Three independent experiments were performed and the mean ⁇ S. D. Was calculated. The obtained data is shown in Table 3 and FIG.
  • Aldehyde type probes of compounds 1, 2, and 3 were detected after 8 minutes, while aldehyde type Probes 4, 5 and ALDEFLUOR were detected in the first half of 7 minutes.
  • the probe 1 with the fastest detection time among the carboxylic acid type probes 1, 2, and 3 was 7.098 minutes, while the carboxylic acid type ALDEFLUOR was 6.741 minutes and the carboxylic acid type Probe 5 was further reduced. Detected earlier. Since the imaging of Probe 1 was not successful, it was considered that there was a threshold at which the membrane permeability changed rapidly between 6.741 minutes and 7.098 minutes (the band in FIG. 2).
  • Km and Kcat were calculated by fitting the reaction rate at each probe concentration obtained to the Michaelis-Menten equation. For fitting, Kaleida Graph ver. 4.1 (HULLINKS Inc.) was used. The obtained data is shown in Table 4. Since the Km was relatively small, it was considered that the reaction rate of the probe was close to Vmax at the actual probe use concentration. Therefore, as a measure of the specificity of ALDH1A1 / ALDH3A1, the Kcat ratio (Kcat / ALDH1A1 of ALDH3A1 with respect to Probe1, Probe3, and Probe5) Kcat) was calculated (Table 5). Probe5 is approximately 6 times more reactive with ALDH3A1 than ALDH1A1 under the same ALDH concentration under a probe concentration close to Vmax, making it a more specific probe for ALDH3A1. .
  • Example 2 Cell imaging using Probe 5 Imaging was performed using Probe5 and an esophageal squamous cell carcinoma cell line (OE21 cell line), which are cells highly expressing ALDH3A1. 40 ⁇ M Probe 5 was added to the medium (RPMI 1640, 10% FBS, 15 mM HEPES, Phenol Red free), and the cells were incubated at 37 ° C. for 90 minutes. The cells were then washed with an ice-cold medium and observed under a confocal microscope.
  • the medium RPMI 1640, 10% FBS, 15 mM HEPES, Phenol Red free
  • a sample to which a specific ALDH3A1 inhibitor (1-[(4-Fluorophenyl) sulfonyl] -2-methyl-1H-benzimidazole, CB710 ⁇ M) was added was used as a negative control.
  • Excitation was performed with a 488 nm laser, and detection was performed at a wavelength of 500 to 570 nm. As shown in FIG. 3, high-luminance cells were observed with respect to the negative control.
  • Example 3 (Flow cytometry using Probe 5) Flow cytometry was performed using Probe5 and OE21 cells. Cells were trypsinized, passed through a cell strainer (40 ⁇ m, Corning), and cell density was measured. A cell suspension of 500 ⁇ l was prepared in a medium containing 40 ⁇ M Probe 5 so as to be 2.5 to 5 ⁇ 10 5 / ml, and cultured at 37 ° C. for 90 minutes. After the reaction, centrifugation was performed at 1500 rpm for 3 minutes to remove the supernatant, and the cells were washed with an ice-cooled medium and centrifuged to remove the medium.
  • the cells were suspended again in 100 ⁇ l of the medium, 4 ⁇ l of SYTOX (registered trademark) Red dead cell stain (Thermo Fisher) was added for the purpose of removing dead cells, allowed to stand on ice for 5 minutes, and then 150 ⁇ l of the medium was added.
  • SYTOX registered trademark
  • Red dead cell stain Thermo Fisher
  • a sample to which CB7 (10 ⁇ M) was added was used as a negative control. Analysis was performed with FACS Canto II (BD Biosciences). It was excited with a blue layer (488 nm), and the brightness of Probe 5 in each cell was detected with a FITC channel (515 to 545 nm). Each sample was subjected to removal of doublets and removal of dead cells, and then about 30,000 cells were analyzed.
  • the positive gate was set according to the ALDEFLUOR assay in the range from the vicinity of the upper limit of luminance in the negative control to the region above the upper limit so that the cells present in the gate in the negative control sample were below 3% at the maximum. Three independent experiments were performed. As shown in FIG. 4, the positive rate was 10-15%.
  • Example 4 (Flow cytometry by ALDH3A1 knockdown) For the purpose of confirming that the positive group in flow cytometry using OE21 cells and compound 5 is due to the activity of ALDH3A1, knockdown of ALDH3A1 using small interference RNA (siRNA) was performed, and flow cytometry was performed. Two siRNAs that were confirmed to be effective from Thermo Fisher (Silencer (registered trademark) Select, s1243 and s1244) and a negative control (Silencer (registered trademark) Negative Control # 1) were purchased.
  • siRNA small interference RNA
  • RNAiMAX Lipofectamine (registered trademark) RNAiMAX was purchased as Transfection Reagent and Opti-MEM (registered trademark) was purchased from Thermo Fisher as a diluent. According to the procedure, 300 ⁇ l of siRNA-Lipofectamine complex was prepared according to the procedure so that siRNA was 10 nM and Lipofectamine was 3%, of which 250 ⁇ l and 2.5 ml of OE21 cell suspension were mixed and seeded in 6 well dish. . The effect of knockdown was confirmed by Western blotting after 6 days (Figure 6a). When flow cytometry was performed under the same conditions as described above using Probe 5 under these conditions, the positive rate markedly decreased in the ALDH3A1 knockdown group, and the probe 5 positive cells were caused by the activity of ALDH3A1. ( Figure 5).
  • Example 5 (Confirmation of ALDH3A1 expression level by sort-out)
  • the activity of ALDH is regulated by the expression level.
  • ALDEFLUOR assay at least the activities of ALDH1A1, ALDH1A3, and ALDH2 are detected without distinction. Therefore, Western blotting is usually performed using an antibody against the target ALDH isoform when sorting out.
  • a high-brightness group and a low-brightness group were sorted out using Probe5 and OE21 cells, and Western blotting was performed.
  • FACS Aria II (BD Biosciences) was used.
  • the assay was performed in the same manner as in normal flow cytometry, and a positive gate (Top) and a gate (Bottom) were placed in the lower 10-15% of the lower luminance side, and the cells were sorted out. A lysate was prepared from the obtained cells, and Western blotting was performed. Each band was detected and quantified by an luminescence method using ImageQuant LAS 4000mini (GE healthcare).
  • the expression level of ALDH3A1 was standardized with ACTB, a housekeeping gene, and the expression level of ALDH3A1 was compared between Top and Bottom. As shown in FIG. 6, the difference in the expression level was not so much as expected.
  • Example 6 Optimization by active extracellular discharge of Probe and its control
  • MRP multidrug resistance-associated protein
  • MK-571 is an agent that inhibits multiple isoforms of MRP.
  • the active excretion of Probe 5 was markedly suppressed (FIG. 7b). Therefore, when flow cytometry was performed with MK-571 (200 ⁇ M) added (FIG. 7c), a marked improvement was obtained with a positive rate of about 90%.
  • Example 7 (Flow cytometry with ALDH3A1 knockdown cells combined with MK-571) Flow cytometry combined with MK-571 markedly improved the positive rate.
  • siRNA was used to knockdown ALDH3A1 in OE21 cells and flow cytometry.
  • FIG. 8 When the assay was performed with MK-571 200 ⁇ M, Probe 5 50 ⁇ M, and negative control CB7 at 20 ⁇ M, cells treated with negative control siRNA showed a positive rate of about 90%. From the decrease, it was confirmed that the positive cells in the assay in which the positive rate was markedly improved using MK-571 were derived from the activity of ALDH3A1.
  • Example 8 (Separation and sort-out of positive and negative cells)
  • cells with ALDH3A1 knocked down constantly by short hairpin RNA (shRNA) were prepared.
  • ShRNA against ALDH3A and Non-target shRNA as a negative control were introduced into OE21 cells using lentivirus.
  • a lysate is prepared using a negative control cell (ctrl) in which ALDH3A1 is not knocked down and a cell in which ALDH3A1 is constantly knocked down (KD), Western blotting is performed, and ALDH3A1 is knocked down prominently Was confirmed (FIG. 9a).
  • Compound 5 can detect ALDH3A1 highly active cells when used in combination with an MRP inhibitor. Moreover, by using a cell sorter, ALDH3A1 high-activity cells / low-activity cells can be sorted, and can be used for biological experiments continuously.

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Abstract

【解決課題】　生細胞に適応可能なフローサイトメーターに用いることができるＡＬＤＨ３Ａ１検出蛍光プローブを提供すること 【解決手段】　一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩であって、以下の条件で測定したＨＰＬＣクロマトグラムの保持時間は、当該化合物のアルデヒド型の場合においては６．９分より大きく、当該化合物のカルボン酸型の場合においては６．９分以下である、前記化合物又はその塩。

Description

ＡＬＤＨ３Ａ１検出蛍光プローブ
　本発明は、新規な蛍光プローブ。より具体的には、ＡＬＤＨ３Ａ１を検出できる蛍光プローブに関する。
　ＡＬＤＨは種々のアルデヒドをカルボン酸に酸化する酵素である。ヒトのＡＬＤＨは１９のアイソフォームが知られており、それぞれ得意とする基質を有する（基質特異性）。
　幹細胞や癌の研究分野において比較的盛んに研究が行われているＡＬＤＨアイソフォームとその特徴を表１に示す。
　マーカーとしての知見が蓄積しているアイソフォームはＡＬＤＨ１Ａ１及びＡＬＤＨ１Ａ３であり、正常および癌細胞において幹細胞マーカーであるとの多くの報告がなされている。一方で、ＡＬＤＨ３Ａ１は一部の抗がん剤を代謝・無効化することから抗がん剤耐性との観点から研究されている。また、ＡＬＤＨ３Ａ１が肺癌細胞株のノックダウン実験により、細胞の増殖に関与しているという報告(非特許文献１)や、前立腺癌細胞においてはＡＬＤＨ３Ａ１がスフェロイド形成能や癌組織の更なる悪性化に関与しているとの報告(非特許文献２)がある。
表１　 主なＡＬＤＨアイソフォームとその特徴
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000014
　このように、ＡＬＤＨ３Ａ１は重要な機能を持つと考えられるが、ＡＬＤＨ１と比較してその研究は大幅に遅れている。その理由の１つとして、ＡＬＤＨに対する蛍光プローブの有無があげられる。ＡＬＤＨ１には生細胞におけるＡＬＤＨ１活性を判別し、その高低に基づいて細胞を分取し、連続して更なる実験を行うことを可能とする蛍光プローブ（ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ（登録商標））がすでに存在している。幹細胞能として自己複製能および分化能があるが、ＡＬＤＨ１が幹細胞マーカーであることを示すにはこれを実験で示す必要がある。この場合、生細胞を使ってＡＬＤＨ１活性の高低に従って細胞をソート・アウトする必要がある。また、抗癌剤の効果をｉｎ　ｖｉｔｒｏで調べる場合、ＭＴＴ　ａｓｓａｙという色素を用いた生細胞の定量法があり、簡便でＨｉｇｈ　ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔにも対応していることから、広く用いられている。
　上記のようにＡＬＤＨの活性は同じ細胞株内でも高低が細胞ごとに異なっているが、このＡＬＤＨ活性の高低と抗癌剤耐性には関連があるとの報告が多数ある（非特許文献３）。抗癌剤投与前後で生細胞のＡＬＤＨ活性の分布をみることにより、抗癌剤耐性とＡＬＤＨ活性の関連性を詳細に検討することが可能である。
　このように生細胞に適応可能なＡＬＤＨ３Ａ１のプローブがあればさまざまな研究へ展開することが可能であるが、未だ有用なＡＬＤＨ３Ａ１のプローブは実現していない。
Mol Caner 2008, 7, 87. Br J Cancer 2014, 110, 2593. Biomed Pharmacother. 2013 Sep;67(7):669-80. "The role of aldehyde dehydrogenase (ALDH) in cancer drug resistance."
　本発明は、生細胞に適応可能なフローサイトメーターに用いることができるＡＬＤＨ３Ａ１検出蛍光プローブを提供することを目的とする。
　本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意検討したところ、ＡＬＤＨ３Ａ１との反応基質として、ベンズアルデヒドが有効であることを見出し、更にベンズアルデヒドと蛍光団を特定の構造を有するリンカーで結合することにより、ＡＬＤＨ３Ａ１と特異的に反応する蛍光プローブを提供できることを見出した。
　また、本発明者等は、蛍光プローブを用いてＡＬＤＨ３Ａ１高活性細胞を検出する際のメカニズムとして、アルデヒド型の蛍光プローブは疎水性で細胞膜を透過可能であるが、ＡＬＤＨ３Ａ１の活性によりプローブがカルボン酸型に代謝されると、カルボン酸の陰性電荷のため水溶性となり膜不透過となるため、ＡＬＤＨ３Ａ１の活性が高い細胞にのみ膜不透過となったカルボン酸型プローブが滞留及び蓄積されるという原理を用いた（図１参照）。
　本発明者等は、種々検討したところ、反応部位のベンズアルデヒドの疎水性が高いことから、疎水性の高い蛍光団を組み合わせると、カルボン酸型に代謝されてもプローブ全体としての水溶性が低いために過剰な膜透過性を有し、カルボン酸型プローブを細胞内に滞留及び蓄積できないことを知見した。そこで、蛍光プローブがカルボン酸型になった時の親水性のレベルを特定の範囲とすることにより、生細胞に適応可能なフローサイトメーターに用いることができるＡＬＤＨ３Ａ１検出蛍光プローブを提供できることを見出し、本発明を完成した。
　即ち、本発明は、
［１］以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩であって、
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000015
（式中、
Ｒａは、水素原子又は炭素数１～４のアルキル基を表し；
Ｔは、以下の二価の基：
－Ｎ（Ｒｂ）－、
－Ｃ（Ｒｃ）２－
－Ｏ－
から選択され（Ｒｂは、炭素数１～４のアルキル基を表し、Ｒｃは、水素原子又は炭素数１～４のアルキル基を表し、各々のＲｃは、同じであっても異なっていてもよい）；
Ｌは、リンカーを表し；
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000016
は、蛍光団を表し、
前記蛍光団は、キサンテン系色素、ＢＯＤＩＰＹ系蛍光団又はシアニン系蛍光団から選択される）
以下の条件で測定したＨＰＬＣクロマトグラムの保持時間は、当該化合物のアルデヒド型の場合においては６．９分より大きく、当該化合物のカルボン酸型の場合においては６．９分以下である、前記化合物又はその塩。
（ＨＰＬＣ条件：溶媒Ａを０．０１Ｍギ酸アンモニウム／水、溶媒Ｂを８０％アセトニトリル　０．０１Ｍギ酸アンモニウム／水とし、２０％の溶媒Ｂで２．５分に続いて２０％から１００％の溶媒Ｂ、５分間のリニアグラジエント（流速５００μｌ／分）の条件で行う。）
［２］前記リンカーが、Ｙ－（Ｓ）で表され、Ｙは結合基を表し、Ｓは存在する場合は架橋基を表す、［１］に記載の化合物又はその塩。
［３］前記結合基が、－ＣＯＮＨ－、－Ｒ－ＣＯＮＨ－、－ＣＯＯ－、－Ｒ－ＣＯＯ－、－ＲＯ－又は－Ｒ－ＣＯ－（ここで、Ｒは炭化水素基を表す）から選択される、［２］に記載の化合物又はその塩。
［４］前記架橋基が、炭素数１～６の置換又は無置換のアルキレン基、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－（ｍは１又は２である）又はこれらの組合せから選択される、［２］又は［３］に記載の化合物又はその塩。
［５］式（Ｉ）における
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000017
は、以下の式（ＩＩ）で表される、［１］～［４］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000018
Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４個の同一又は異なる一価の置換基を示し；
Ｒ２は、水素原子、一価の置換基又は結合を示し； 
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基、ハロゲン原子又は結合を示し；
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基、アリール基又は結合を示し、但し、Ｘが酸素原子の場合は存在しない；
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基、ハロゲン原子又は結合を示し；
Ｘは、酸素原子又は珪素原子を示し；
＊は、ベンゼン環上の任意の位置における式（Ｉ）のＬとの結合箇所を表し、
ここで、Ｌは、ベンゼン環上の任意の位置、Ｒ２～Ｒ８のいずれかの位置から選択される少なくとも１つの位置において結合する。）
［６］以下の式（ＩＩａ）で表される、［５］に記載の化合物又はその塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000019
（式中、Ｒａ、Ｒｂ及びＬは式（Ｉ）で定義した通りであり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７、Ｒ８は、式（ＩＩ）で定義した通りである。）
［７］式（Ｉ）における
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000020
は、以下の式（ＩＩＩ）で表される、［１］～［４］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000021
（式中、Ｒ１～Ｒ８、Ｘは、式（ＩＩ）で定義した通りであり；
Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～３個のアルキル基又は結合を示し、
Ｒ９及びＲ１０は一緒になってＲ９及びＲ１０が結合している窒素原子を含む４～７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
Ｒ９又はＲ１０は、或いは、Ｒ９及びＲ１０の両方は、夫々、Ｒ４又はＲ８と一緒になって、Ｒ９又はＲ１０が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１～６個のアルキル、炭素数２～６個のアルケニル、又は炭素数２～６個のアルキニル、炭素数６～１０個のアラルキル基、炭素数６～１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
＊は、ベンゼン環上の任意の位置における式（Ｉ）のＬとの結合箇所を表し、
ここで、Ｌは、ベンゼン環上の任意の位置、Ｒ２～Ｒ１０のいずれかの位置から選択される少なくとも１つの位置において結合する）
［８］式（Ｉ）における
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000022
は、以下の式（ＩＶ）で表される、［１］～［４］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000023
（式中、Ｒ１～Ｒ８、Ｘは、式（ＩＩ）で定義した通りであり；
Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１～６個のアルキル基を示し、
Ｒ９及びＲ１０は一緒になってＲ９及びＲ１０が結合している窒素原子を含む４～７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
Ｒ９又はＲ１０は、或いは、Ｒ９及びＲ１０の両方は、夫々、Ｒ３又はＲ７と一緒になって、Ｒ９又はＲ１０が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１～６個のアルキル、炭素数２～６個のアルケニル、又は炭素数２～６個のアルキニル、炭素数６～１０個のアラルキル基、炭素数６～１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～３個のアルキル基又は結合を示し、
Ｒ１１及びＲ１２は一緒になってＲ１１及びＲ１２が結合している窒素原子を含む４～７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
Ｒ１１又はＲ１２は、或いは、Ｒ１１及びＲ１２の両方は、夫々、Ｒ４又はＲ８と一緒になって、Ｒ１１又はＲ１２が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１～６個のアルキル、炭素数２～６個のアルケニル、又は炭素数２～６個のアルキニル、炭素数６～１０個のアラルキル基、炭素数６～１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
＊は、ベンゼン環上の任意の位置における式（Ｉ）のＬとの結合箇所を表し、
ここで、Ｌは、ベンゼン環上の任意の位置、Ｒ２～Ｒ１２のいずれかの位置から選択される少なくとも１つの位置において結合する。）
［９］式（Ｉ）における
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000024
は、以下の式（Ｖ）で表される、［１］～［４］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000025
（式中、
Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１～６個のアルキル基を示し；
Ｒ１５は、それぞれ独立に、水素原子、カルボキシル基又はスルホン酸基を示し：
ｎは、１～３の整数を示し；
＊は、式（Ｉ）のＬとの結合箇所を表す。）
［１０］式（Ｉ）における
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000026
は、以下の式（ＶＩ）で表される、［１］～［４］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000027
（式中、Ｒ１６～Ｒ２２は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基、カルボニル基、アリル基、アリール基、ピロール基、チオフェン基、 フラン基、スルホン酸基、スルホニルアミド基、カルボキシル基、メトキシ基又は結合を示し；
Ｌは、Ｒ１６～Ｒ２２のいずれかの位置から選択される少なくとも１つの位置において結合する。）
［１１］［１］～［１０］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む、ＡＬＤＨ３Ａ１検出蛍光プローブ。
を、提供するものである。
　本発明により、生細胞に適応可能なフローサイトメーターに用いることができるＡＬＤＨ３Ａ１検出蛍光プローブを提供することが可能である。
　本発明の蛍光プローブにより、ＡＬＤＨ３Ａ１の細胞としての活性を生きた細胞を用いて検出することが可能である。即ち、すりつぶした細胞を用いればＡＬＤＨ３Ａ１の発現量や活性を評価することは従来の技術でも可能であるが、細胞が生きた状態でＡＬＤＨ３Ａ１の活性を調べることにより、高活性の細胞が、その後、どのような運命をたどるか等の生物学の本質により迫ることが可能となる。
プローブを用いたＡＬＤＨ３Ａ１高活性細胞検出の原理 各プローブにおけるアルデヒド型およびカルボン酸型のRetention time（保持時間） Ｐｒｏｂｅ５を用いた細胞イメージングの結果（Ｓｃａｌｅ　ｂａｒ　１００μｍ） Ｐｒｏｂｅ５を用いたフローサイトメトリー ＯＥ２１細胞をｓｉＲＮＡにてノックダウン後６日目に、ウエスタン・ブロッティングを行った結果を示す。 ノックダウンされた細胞を用いてフローサイトメトリーを行った結果を示す。（上段は陰性コントロールｓｉＲＮＡで処理した細胞によるアッセイ。下段はノックダウンされた細胞によるアッセイ。） Ｐｒｏｂｅ５を用いてセルソーターでＰｒｏｂｅ５の高輝度細胞(Top)と低輝度細胞（Bottom）をソート・アウトしウエスタン・ブロッティングを行った結果を示す。 ３７℃下での同一視野におけるタイムラプス観察結果。Ｐｒｏｂｅ５　４０μＭ、ＭＫ－５７１なし（Ｓｃａｌｅ　ｂａｒ　１００μＭ） ３７℃下での同一視野におけるタイムラプス観察結果。Ｐｒｏｂｅ５　４０μＭ、ＭＫ－５７１　２００μＭ（Ｓｃａｌｅ　ｂａｒ　１００μＭ） フローサイトメトリー。（ＯＥ２１　ｃｅｌｌ、Ｐｒｏｂｅ５　５０μＭ、ＭＫ－５７１　２００μＭ） ＯＥ２１細胞に対しｓｉＲＮＡを用いてＡＬＤＨ３Ａ１をノックダウンした後にフローサイトメトリーを行った結果を示す。（Ｐｒｏｂｅ５　５０μＭとともにＭＫ－５７１　２００μＭを併用した。陰性コントロールにはＣＢ７　２０μＭによりＡＬＤＨ３Ａ１を阻害したＯＥ２１細胞を用いた。） Ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔ　ｓｈＲＮＡ（ｃｔｒｌ）もしくはＡＬＤＨ３Ａ１に対するｓｈＲＮＡ（ＫＤ）を導入したＯＥ２１細胞のウエスタン・ブロッティグを示す。 ｓｈＲＮＡを導入したＯＥ２１細胞を用いたフローサイトメトリーを示す（Ｐｒｏｂｅ５　５０μＭ、ＭＫ－５７１　２００μＭ）。 ｃｔｒｌ／ＫＤ＝１：１混合サンプルを用いてセルソーターで輝度の上位／下位２５％（Ｔｏｐ／Ｂｏｔｔｏｍ）をそれぞれ分取しウエスタン・ブロッティングを行った結果を示す。
　本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基（例えばアルコキシ基など）のアルキル部分は、特に言及しない場合には例えば炭素数１～６個、好ましくは炭素数１～４個、更に好ましくは炭素数１～３個程度の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。より具体的には、アルキル基として、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、シクロプロピルメチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基などを挙げることができる。
　本明細書において「ハロゲン原子」という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、好ましくはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子である。
　本発明の１つの態様は、以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000028
　式（Ｉ）において、Ｒａは、水素原子又は炭素数１～４のアルキル基を表す。Ｒａは、ベンゼン環上において、１～４個存在し、これらは同一又は異なっていてもよい。
　本発明の１つの好ましい態様においては、Ｒａはいずれも水素原子である。
　式（Ｉ）において、Ｔは、以下の二価の基：
－Ｎ（Ｒｂ）－、
－Ｃ（Ｒｃ）２－
－Ｏ－
から選択される。
　ここで、Ｒｂは、炭素数１～４のアルキル基を表し、好ましくは、メチル基、エチル基である。
　Ｒｃは、水素原子又は炭素数１～４のアルキル基を表し、各々のＲｃは、同じであっても異なっていてもよい。
　本発明の１つの好ましい態様においては、Ｔが－Ｎ（Ｒｂ）－である。
　式（Ｉ）において、Ｌは、リンカーを表す。リンカーとしては、蛍光団と窒素原子を結合する種々の置換基が挙げられる。
　本発明の１つの好ましい態様において、リンカーは、Ｘ－（Ｓ）で表され、Ｘは結合基を表し、Ｓは存在する場合は架橋基を表す。
　前記結合基は、好ましくは、アミド基（－ＣＯＮＨ－）、アルキルアミド基（－Ｒ－ＣＯＮＨ－）、エステル基（－ＣＯＯ－）、アルキルエステル基（－Ｒ－ＣＯＯ－）、アルキルエーテル基（－ＲＯ－）又はアルキルカルボニル基（－Ｒ－ＣＯ－）から選択される。ここで、Ｒは炭化水素基を表し、好ましくは炭素数１～８のアルキルである。
　前記架橋基は、好ましくは、炭素数１～６の置換又は無置換のアルキレン基；エチレングリコール基、ジエチレングルコール基（即ち、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－（ｍは１又は２である））；又はこれらの組合せから選択される。　
　式（Ｉ）において、アルデヒド基（－ＣＨＯ）は、ベンゼン環上のいずれの位置に導入することができるが、Ｔに対してｐ位に導入することが好ましい、
　式（Ｉ）における
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000029
は、蛍光団を表す。
　蛍光団としては、好ましくは、キサンテン系色素（Tokyo Magenta系蛍光団、Tokyo Green系蛍光団、ローダミン系蛍光団、ロドール系蛍光団）、ＢＯＤＩＰＹ系蛍光団又はシアニン系蛍光団から選択される。
　本発明においては、蛍光プローブを用いてＡＬＤＨ３Ａ１高活性細胞を検出する際のメカニズムとして図１で模式的に示した原理を用いた。つまり、アルデヒド型のプローブは疎水性で細胞膜を透過可能であるが、ＡＬＤＨ３Ａ１の活性によりプローブがカルボン酸型に代謝されると、カルボン酸の陰性電荷のため水溶性となり膜不透過となり、ＡＬＤＨ３Ａ１の活性が高い細胞にのみ膜不透過となったカルボン酸型プローブが滞留・蓄積するという原理である。
　ここで、本発明の式（Ｉ）の化合物の反応部位であるベンズアルデヒドの疎水性が比較的高いため、疎水性の高い蛍光団を組み合わせると、カルボン酸型に代謝されてもプローブ全体としての水溶性が低いために過剰な膜透過性を有し、カルボン酸型プローブを細胞内に滞留及び蓄積できない。そこで、式（Ｉ）の化合物においてカルボン酸型になった場合の親水性のレベルを特定の範囲とすることにより、生細胞に適応可能なフローサイトメーターに用いることができるＡＬＤＨ３Ａ１検出蛍光プローブを提供することが可能である。
　本発明においては、親水性の尺度としてＨＰＬＣクロマトグラムの保持時間を用いるのが好ましい。
　本発明の１つの好ましい態様は、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩であって、以下の条件で測定したＨＰＬＣクロマトグラムの保持時間は、当該化合物のアルデヒド型の場合においては６．９分より大きく、当該化合物のカルボン酸型の場合においては６．９分以下である、前記化合物又はその塩である。
ＨＰＬＣ条件：溶媒Ａを０．０１Ｍギ酸アンモニウム／水、溶媒Ｂを８０％アセトニトリル　０．０１Ｍギ酸アンモニウム／水とし、２０％の溶媒Ｂで２．５分に続いて２０％から１００％の溶媒Ｂ、５分間のリニアグラジエント（流速５００μｌ／分）の条件で行う
　カラムとしては、例えば、Ｃ１８カラム（ＨＰ　３　μｍ、内径：２．１ｍｍ、長さ：１５０ｍｍ、ジーエル　サイエンス）を好適に用いることができる。
　本発明においては、式（Ｉ）で表される化合物が上記のＨＰＬＣクロマトグラムの保持時間を具備するように、キサンテン系色素（Tokyo Magenta系蛍光団、Tokyo Green系蛍光団、ローダミン系蛍光団、ロドール系蛍光団）、ＢＯＤＩＰＹ系蛍光団又はシアニン系蛍光団から選択される任意の蛍光団を用いることができる。
　本発明の１つの側面においては、式（Ｉ）における
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000030
は、以下の式（ＩＩ）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000031
　式（ＩＩ）において、Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４個の同一又は異なる一価の置換基を示す。
　Ｒ１が示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、例えば、炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルケニル基、炭素数１～６個のアルキニル基、炭素数１～６個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、又はアミノ基からなる群から選ばれることが好ましい。これらの一価の置換基は更に任意の置換基を１個又は２個以上有していてもよい。例えば、Ｒ１が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ１が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、又はアミノアルキル基などであってもよい。
　本発明の１つの好ましい態様においては、Ｒ１はいずれも水素原子である。
　式（ＩＩ）において、Ｒ２は、水素原子、一価の置換基又は結合を示す。Ｒ２が示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、Ｒ１と同様に、例えば、炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルケニル基、炭素数１～６個のアルキニル基、炭素数１～６個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、又はアミノ基等が挙げられる。
　本発明の１つの好ましい態様においては、Ｒ２は、炭素数１～６個のアルキル基であり、好ましくは、メチル基、カルボキシル基，メトキシ基，ハイドロキシメチル基である。
　式（ＩＩ）において、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基、又はハロゲン原子を示す。
Ｒ３又はＲ４がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ３又はＲ４が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ３及びＲ４がともに水素原子である場合、又はＲ３及びＲ４がともにフッ素原子又は塩素原子である場合がより好ましい。
　式（ＩＩ）において、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基、アリール基又は結合を示す、但し、Ｘが酸素原子の場合はＲ５及びＲ６は存在しない。
　Ｘが珪素原子の場合は、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、炭素数１～３個のアルキル基であることが好ましく、Ｒ５及びＲ６がともにメチル基であることがより好ましい。Ｒ５及びＲ６が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ５又はＲ６が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。Ｒ５又はＲ６がアリール基を示す場合には、アリール基は単環の芳香族基又は縮合芳香族基のいずれであってもよく、アリール環は１個又は２個以上の環構成ヘテロ原子（例えば窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子など）を含んでいてもよい。アリール基としてはフェニル基が好ましい。アリール環上には１個又は２個以上の置換基が存在していてもよい。置換基としては、例えばハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。
　式（ＩＩ）において、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基、ハロゲン原子又は結合を示し、Ｒ３及びＲ４について説明したものと同様である。Ｒ７及びＲ８が共に水素原子であるか、共に塩素原子であるか、又は共にフッ素原子であることが好ましい。
　Ｘは、酸素原子又は珪素原子を示す。好ましくは、Ｘは、酸素原子である。
　＊は、ベンゼン環上の任意の位置における式（Ｉ）のＬとの結合箇所(結合点、以下同様）を表す。ここで、Ｌは、ベンゼン環上の任意の位置、Ｒ２～Ｒ８のいずれかの位置から選択される少なくとも１つの位置において結合することができる。好ましくは、Ｌは、キサンテン環骨格に結合しているベンゼン環の任意の位置に結合することができるが、当該ベンゼン環の４位または５位に結合することが好ましい。
　本発明の１つの好ましい態様は、以下の式（ＩＩａ）で表される化合物又はその塩である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000032
　式（ＩＩａ）において、Ｒａ、Ｒｂ及びＬは式（Ｉ）について記載した通りであり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７、Ｒ８は、式（ＩＩ）について記載した通りである。
　本発明の１つの側面においては、式（Ｉ）における
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000033
は、以下の式（ＩＩＩ）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000034
　式（ＩＩＩ）におけるＲ１～Ｒ８、Ｘは、式（ＩＩ）で定義した通りである。
　式（ＩＩＩ）において、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～３個のアルキル基又は結合を示す。
　また、Ｒ９及びＲ１０は一緒になってＲ９及びＲ１０が結合している窒素原子を含む４～７員のヘテロシクリルを形成していてもよい。
　また、Ｒ９又はＲ１０は、或いは、Ｒ９及びＲ１０の両方は、夫々、Ｒ４又はＲ８と一緒になって、Ｒ９又はＲ１０が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよい。環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１～６個のアルキル、炭素数２～６個のアルケニル、又は炭素数２～６個のアルキニル、炭素数６～１０個のアラルキル基、炭素数６～１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい。このようにして形成されるヘテロシクリル又はヘテロアリールとしては、例えば、ピロリジン、ピペリジン、ヘキサメチレンイミン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、チアゾールなどが挙げられるが、これらに限定されない。
　式（ＩＩＩ）において、＊は、ベンゼン環上の任意の位置における式（Ｉ）のＬとの結合箇所を表す。ここで、Ｌは、ベンゼン環上の任意の位置、Ｒ２～Ｒ１０のいずれかの位置から選択される少なくとも１つの位置において結合する。
　好ましくは、Ｌは、キサンテン環骨格に結合しているベンゼン環の任意の位置に結合することができるが、当該ベンゼン環の４位または５位に結合することが好ましい。
　本発明の１つの側面においては、式（Ｉ）における
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000035
は、以下の式（ＩＶ）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000036
　式（ＩＶ）において、Ｒ１～Ｒ８、Ｘは、式（ＩＩ）について記載した通りである。
　式（ＩＶ）において、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１～６個のアルキル基を示す。
　また、Ｒ９及びＲ１０は一緒になってＲ９及びＲ１０が結合している窒素原子を含む４～７員のヘテロシクリルを形成していてもよい。ヘテロシクリルとしては、アゼチジン、ピロリジン等があげられ、これらヘテロシクリルは炭素数１～６個のアルキル等の置換基で置換されていてもよい。
　また、Ｒ９又はＲ１０は、或いは、Ｒ９及びＲ１０の両方は、夫々、Ｒ３又はＲ７と一緒になって、Ｒ９又はＲ１０が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよい。環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１～６個のアルキル、炭素数２～６個のアルケニル、又は炭素数２～６個のアルキニル、炭素数６～１０個のアラルキル基、炭素数６～１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい。このようにして形成されるヘテロシクリル又はヘテロアリールとしては、例えば、ピロリジン、ピペリジン、ヘキサメチレンイミン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、チアゾールなどが挙げられるが、これらに限定されない。
　式（ＩＶ）において、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～３個のアルキル基又は結合を示す。
　Ｒ１１及びＲ１２は一緒になってＲ１１及びＲ１２が結合している窒素原子を含む４～７員のヘテロシクリルを形成していてもよい。ヘテロシクリルとしては、アゼチジン、ピロリジン等があげられ、これらヘテロシクリルは炭素数１～６個のアルキル等の置換基で置換されていてもよい。
　また、Ｒ１１又はＲ１２は、或いは、Ｒ１１及びＲ１２の両方は、夫々、Ｒ４又はＲ８と一緒になって、Ｒ１１又はＲ１２が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよい。環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１～６個のアルキル、炭素数２～６個のアルケニル、又は炭素数２～６個のアルキニル、炭素数６～１０個のアラルキル基、炭素数６～１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい。このようにして形成されるヘテロシクリル又はヘテロアリールとしては、例えば、ピロリジン、ピペリジン、ヘキサメチレンイミン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、チアゾールなどが挙げられるが、これらに限定されない。
　式（ＩＶ）において、＊は、ベンゼン環上の任意の位置における式（Ｉ）のＬとの結合箇所を表す。ここで、Ｌは、ベンゼン環上の任意の位置、Ｒ２～Ｒ１２のいずれかの位置から選択される少なくとも１つの位置において結合する。
　本発明の１つの側面においては、式（Ｉ）における
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000037
は、以下の式（Ｖ）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000038
　式（Ｖ）において、Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１～６個のアルキル基を示す。
　また、Ｒ１５は、それぞれ独立に、水素原子、カルボキシル基又はスルホン酸基を示す。
　式（Ｖ）において、ｎは、１～３の整数を示す。
　また、＊は、式（Ｉ）のＬとの結合箇所を表す。
　本発明の１つの側面においては、式（Ｉ）における
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000039
は、以下の式（ＶＩ）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000040
　式（ＶＩ）において、Ｒ１６～Ｒ２２は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基、カルボニル基、アリル基、アリール基、ピロール基、チオフェン基、フラン基、スルホン酸基、スルホニルアミド基、カルボキシル基、メトキシ基又は結合を示す。
式（ＶＩ）において、Ｌは、Ｒ１６～Ｒ２２のいずれかの位置から選択される少なくとも１つの位置において結合する。
　本発明の化合物は、置換基の種類に応じて１個または２個以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。また、一般式（Ｉ）で表される本発明の化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒を例示することができる。
　本発明のもう１つの態様は、一般式（Ｉ）で表され、上記のＨＰＬＣクロマトグラムの保持時間を有する化合物又はその塩を含む、ＡＬＤＨ３Ａ１検出蛍光プローブである。
　以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
［原料及び測定方法］
　有機合成に用いた試薬及び溶媒は、東京化成工業、和光純薬、アルドリッチ社から供給を受け、精製せずに用いた。
　水素核磁来共鳴（１Ｈ　ＮＭＲ）及び炭素ＮＭＲ（１３Ｃ　ＮＭＲ）スペクトルはＪＥＯＬ　ＪＭＮ－ＬＡ３００及びＪＭＮ－ＬＡ４００測定器で測定した。マススペクトルはＪＥＯＬ　ＪＭＳ－Ｔ１００ＬＣ　ＡｃｃｕＴＯＦで測定した。
　ＲＰ－ＵＰＬＣ分析はＷａｔｅｒｓ　Ａｃｑｕｉｔｙ　ＵＰＬＣ　Ｈ－Ｃｌａｓｓ／ＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ　ＰＤＡ　ｅλ　ｄｅｔｅｃｔｏｒ／Ｘｅｖｏ　ＴＱＤ　ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ　ＭＳ／ＭＳ　ａｎａｌｙｚｅｒで測定した。
　ＬＣ／ＭＳ分析はＡｇｉｌｅｎｔ　１２００　Ｓｅｒｉｅｓ　Ｄｉｏｄｅ　Ａｒｒａｙ　Ｄｅｔｅｃｔｏｒ／６１３０　ｑｕａｄｒｕｐｌｅ　ＭＳ　ａｎａｌｙｚｅｒで測定した。
　イメージングはＬｅｉｃａ　ＴＣＳ　ＳＰ８により画像を取得した。フローサイトメトリーは分析をＢＤ　ＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩで行い、セル・ソーティングをＢＤ　ＦＡＣＳ　Ａｒｉａで行った。
［合成実施例１及び２］
　以下のスキーム１によりＰｒｏｂｅ１及びＰｒｏｂｅ２を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000041
（１）Ｎ－（４－ジメトキシメチルベンジル）－３－（１，３－ジメチル－４，４－ジフルオロ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－５－イル）－プロイオンアミド（化合物４）の合成
（２）　
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000042
　化合物３は，論文既知（Giulio Cas et al.　”Site-specific traceless coupling of potent cytotoxic drugs to recombinant antibodies for pharmacodelivery” J. Am. Chem. Soc., 2012 134, pp5887-5892）の方法に基づき，４－シアノベンズアルデヒドから合成した．５０ｍＬ丸底フラスコに化合物３（１０ｍｇ、２５．６μｍｏｌ）および蒸留ＴＨＦ８ｍＬを加えた．反応液に、ＤＩＥＡ（５．４μＬ、３６．５μｍｏｌ）およびＴＨＦ１ｍＬに溶解させたＢＯＤＩＰＹ　ＦＬ　ＳＥを順に加え、オイルバス上で４０°Ｃに加熱し、３時間攪拌した。室温下まで冷却した後に反応液をＣＨ２Ｃｌ２　２０ｍＬで希釈し、これをクエン酸水溶液（１０ｗ／ｖ％）１０ｍＬ、２Ｍ　ＮａＨＣＯ３水溶液１０ｍＬ、飽和食塩水１０ｍＬで洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後に溶液をろ過し、濾液を減圧下、濃縮した。濃縮残渣をシリカゲルを担体としたカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物４を得た。精製物には一部、アセタールが脱保護された化合物の混入がみられたが、そのまま次の反応に用いた。
（２）Ｎ－（４－ホルミルベンジル）－３－（１，３－ジメチル－４，４－ジフルオロ－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－５－イル）－プロピオンアミド（Ｐｒｏｂｅ１）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000043
　上述の方法で得た化合物４（粗精製）を３０ｍＬ丸底フラスコに入れ、蒸留ＴＨＦ１．５ｍＬ、濃塩酸０．６ｍＬ、蒸留水１ｍＬの混合溶液をこれに加えた。１時間、室温下で激しく攪拌した後、反応溶液に飽和食塩水１０ｍＬ、およびＡｃＯＥｔ１０ｍＬを加えた。得られた溶液をＡｃＯＥｔ５ｍＬで２回抽出し、得られた有機層を炭酸ナトリウム水溶液１０ｍＬ、飽和食塩水１０ｍＬで洗浄を行った。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後にろ過し、濾液を減圧下、濃縮した。濃縮残渣をシリカゲルを担体としたカラムクロマトグラフィーにより精製し、Ｐｒｏｂｅ１を赤色固体として１０ｍｇ、収率９８％（ｉｎ　２　ｓｔｅｐｓ）で得た。
1H-NMR (300 MHz, CD2Cl2): δ 2.25 (s, 3H); 2.51 (s, 3H); 2.70 (t, J = 8.2 Hz, 2H); 3.25 (t, J = 8.2 Hz, 2H); 4.45 (d, J = 6.1 Hz, 2H); 6.15 (s, 1H); 6.25 (br, 1H); 6.28 (d, J = 3.6 Hz, 1H); 6.91 (d, J = 3.6 Hz, 1H); 7.14 (s, 1H); 7.32 (d, J = 8.1 Hz, 2H); 7.75 (d, J = 8.1 Hz, 2H); 9.94 (s, 1H).　13C-NMR (75 MHz, CDCl3): δ 11.5, 15.1, 25.0, 35.9, 43.4, 117.4, 120.9, 124.3, 128.3, 128.5, 130.1, 133.7, 135.6, 135.9, 144.9.146.2, 157.4, 161.0, 171.8, 192.1.　HRMS (ESI+): m/z calcd for C22H22BFN3O2, [M-F]+, 390.17891; found 390.17920 (-0.29 mmu).
（３）Ｎ－（４－ジメトキシメチルフェニル）－３－（１，３－ジメチル－４，４－ジフルオロ－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－５－イル）プロピオンアミド（化合物８）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000044
　化合物７は論文既知（Dalla Via et al. ”DNA-targeting pyrroloquinoline-linked butenone and chalcones: Synthesis and biological evaluation”Eur. J. Med. Chem., 2009 44, pp2854-2861）の方法により合成した。２ｍＬのガラスバイアルに、７（２ｍｇ、１４μｍｏｌ）およびＢＯＤＩＰＹ　ＦＬ（３ｍｇ、７μｍｏｌ）を秤量し、ＣＨ２Ｃｌ２１５０μＬを加えた。溶液にＨＡＴＵ（１５．６ｍｇ　３９．５μｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（５０μＬ）を加え、アルゴン雰囲気下で室温終夜攪拌を行った。得られた溶液は後処理を行わず、シリカゲルを担体とするカラムクロマトグラフィーにより直接精製し、化合物８を赤色固体として得た。精製物には一部、アセタールが脱保護された化合物の混入がみられたが、そのまま次の反応に用いた。
（４）Ｎ－（４－ホルミルフェニル）－３－（１，３－ジメチル－４，４－ジフルオロ－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－５－イル）－プロピオンアミド（Ｐｒｏｂｅ２）の合成
　アセタールの脱保護は，ｐｒｏｂｅ１の合成法に則り，同様に行った。化合物８（３ｍｇ）およびＴＨＦ３００μＬ、Ｈ２Ｏ　２００μＬ、１２０μＬを用い、Ｐｒｏｂｅ２を赤色固体として１．８ｍｇ、収率６７％（ｉｎ　２　ｓｔｅｐｓ）で得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 2.27 (s, 3H);2.60 (s, 3H); 2.85 (t, J = 7.3 Hz, 2H); 3.36 (t, J = 7.3 Hz, 2H); 6.16 (s, 1H); 6.29 (d, J = 3.7 Hz, 1H); 6.86 (d, J = 3.7 Hz, 1H); 7.10 (s, 1H); 7.65 (d, J = 8.8 Hz, 2H); 7.80 (d, J = 8.8 Hz, 2H); 7.89 (br, 1H); 9.89 (s, 1H). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): d 11.4, 15.0, 24.8, 38.0, 117.6, 119.1, 119.2, 120.8, 124.9, 128.3, 131.1, 132.1, 133.4, 143.6, 144.6, 156.0, 161.0, 170.5, 191.0.　HRMS (ESI+): m/z calcd for C21H20BFN3O2 [M-F]+, 376.16326; found, 376.16131 (-1.95 mmu). 
［合成実施例３及び４］
　以下のスキーム２によりＰｒｏｂｅ３及びＰｒｏｂｅ４を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000045
（１）２－（Ｎ－エチル－Ｎ－（４－ジメトキシメチルフェニル）アミノ）エチルアジド（化合物１３）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000046
　化合物１２は論文既知（Julien Massin, J. et al, ”Near-infrared solid-state emitters based on isophorone: Synthesis, crystal structure and spectroscopic properties” Chem. Mater., 2011, 23, pp862-873）の方法により合成した。５０ｍＬ丸底フラスコに化合物１２（７３０ｍｇ）を秤量し、蒸留ＭｅＯＨ４０ｍＬ、トリエチルオルトホルメート１．０９ｍＬを加えた。濃塩酸１２滴を滴下した後、４０°Ｃで３時間加熱し、その後、室温まで冷却した。反応液をＭｅＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２、ｓａｔ．　ＮａＨＣＯ３　ａｑで希釈し、混合溶液をＣＨ２Ｃｌ２２０ｍＬで抽出した。抽出液を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、ろ過、濾液を減圧下濃縮し、シリカゲルを担体とするカラムクロマトグラフィーで精製、化合物１２を無色液体として７５３ｍｇ、収率８５％で得た。
1H-NMR (300 MHz, CD2Cl2): δ 1.67 (t, J = 6.6 Hz, 3H); 3.28 (s, 6H); 3.39-3.65 (m, 6H); 5.26 (s, 1H); 6.69 (d, J = 8.8 Hz, 2H); 7.24 (d, J = 8.8 Hz, 2H).　13C-NMR (75 MHz, CD2Cl2): δ 12.3, 45.8, 49.4, 49.9, 52.8, 104.0, 111.9, 1226.6, 128.2, 147.8.　HRMS (ESI+): m/z calcd for C13H21N4O2, [M+H]+, 265.16645, found 265.16582 (-0.63 mmu).
（２）２－（Ｎ－エチル－Ｎ－（４－ジメトキシメチルフェニル）アミノ）エチルアミン（化合物１４）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000047
　乾燥させた２０ｍＬの丸底フラスコに化合物１３（５００ｍｇ、１．８９ｍｍｏｌ）を秤量し、蒸留ＴＨＦ２ｍＬを加えた。溶液を氷浴上で５分間攪拌した後に、蒸留ＴＨＦ５ｍＬに懸濁させたＬｉＡｌＨ４（１４３ｍｇ、３．７８ｍｍｏｌ）を、氷冷下、滴下してこれに加えた。滴下後、反応溶液を室温中で１２時間攪拌し、反応停止のため飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１．５ｍＬを加えた。懸濁液に、六シェル塩水溶液１０ｍＬを加え、均一な溶液となるまで攪拌した後、溶液をろ過した。濾液をＡｃＯＥｔ３０ｍＬで３回抽出した後、抽出液を飽和食塩水で洗浄、無水炭酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、減圧濃縮を行った。濃縮残渣をＮＨシリカゲルを担体としたカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物１４を無色液体として３４８ｍｇを収率７７％で得た。
1H-NMR (300 MHz, CD2Cl2): δ 1.43 (t, J = 7.3 Hz, 3H); 1.43 (br, 2H); 2.86 (t, J = 6.6 Hz, 2H); 3.28 (s, 6H); 3.29-3.45 (m, 6H); 5.25 (s, 1H); 6.78 (d, J = 8.8 Hz, 2H); 7.22 (d, J = 8.8 Hz, 2H).　13C-NMR (75 MHz, CD2Cl2): δ12.2, 40.3, 45.7, 52.8, 54.0, 104.1, 111.7, 125.7, 128.0, 148.6.　HRMS (ESI+): m/z calcd for C13H23N2O2, [M+H]+, 239.17595; found 239.17701 (+1.06 mmu).
（３）２－（Ｎ－エチル－Ｎ－（４－ホルミルフェニル）アミノ）エチル－３－（１，３－ジメチル－４，４－ジフルオロ－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－５－イル）－プロピオンアミド（Ｐｒｏｂｅ３）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000048
　化合物４と同様の方法で合成を行った．化合物１４（１１ｍｇ、３９μｍｏｌ）、ＢＯＤＩＰＹ　ＦＬ　ＳＥ（１５ｍｇ、３９μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ　７．８μＬ、４６μｍｏｌ）を用いた。シリカゲルを担体とするカラムクロマトグラフィーで精製を行うと、アセタールが脱保護されたｐｒｏｂｅ　３を赤色固体として１７ｍｇ、収率９３％で得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.15 (t, J = 7.3 Hz, 3H); 2.26 (s, 3H); 2.55 (s, 3H); 2.65 (d, J = 7.3 Hz, 2H); 3.26 (t, J = 7.3 Hz, 2H); 3.40 (m, 6H); 6.09 (br, 1H); 6.14 (s, 1H); 6.28 (d, J = 3.7 Hz, 1H); 6.70 (d, J = 8.8 Hz, 2H); 6.87 (d, J = 3.7 Hz, 1H); 7.09 (s, 1H); 7.67 (d, J = 8.8 Hz, 2H); 9.68 (s, 1H).　13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ 11.3, 12.1, 15.0, 24.8, 35.9, 37.2, 45.3, 49.1, 110.9, 117.4, 120.6, 123.8, 125.3, 128.2, 132.2, 133.3, 135.3, 144.3, 152.4, 156.8, 160.7, 172.2, 190.1.　HRMS (ESI+): m/z calcd for C25H29BFN4O2, [M-F]+, 447.23676; found 447.23230 (-4.46 mmu).
（４）２－（Ｎ－エチル－Ｎ－（４－ホルミルフェニル）アミノ）エチル－３－メチル－４－（６－ヒドロキシキサンテン－３－オン－９－イル）－ベンズアミド（Ｐｒｏｂｅ４）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000049
　２ｍＬのガラスバイアルに２－Ｍｅ－４－ＣＯＯＨ　ＴＧ（１０ｍｇ、２９μｍｏｌ）と化合物１４（８．３ｍｇ、４７μｍｏｌ）を秤量し、ＤＭＦ２７０μＬを加えた。この溶液に、ＨＡＴＵ（１３．２ｍｇ、３５μｍｏｌ）とＤＩＥＡ　１５μＬを加え、アルゴン雰囲気下、室温、遮光下で終夜攪拌した。反応溶液に２Ｎ　ＨＣｌ　ａｑ．２７０μＬを加え１５分間室温下で攪拌した後、溶液を反応溶液を分取ＨＰＬＣ用の溶出溶媒（Ａ／Ｂ＝６／４、Ａ：０．１Ｍ　Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ　ａｃｅｔａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ；Ｂ：Ａ／ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌ＝２／８）で希釈した。その後、希釈溶液を分取ＨＰＬＣにより精製し、目的物を含むフラクションを２Ｎ　ＨＣｌ　ａｑで酸性化した後、飽和食塩水で希釈した。希釈溶液をＡｃＯＥｔ　５０ｍＬで３回抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後にろ過、濾液を減圧下濃縮し、Ｐｒｏｂｅ４を黄色固体として７．５ｍｇ、収率５０％で得た。
1H-NMR (300 MHz, CD3OD): δ 1.24 (t, J = 8.0 Hz, 3H); 2.08 (s, 3H); 3.58-3.73 (m, 6H); 6.73 (m, 4H); 6.98 (m, 4H); 7.32 (d, J = 7.4 Hz, 1H); 7.71 (d, J = 8.8 Hz, 2H); 7.80 (m, 2H); 9.58 (s, 1H) .　HRMS (ESI+): m/z calcd for C29H31NO8, [M+H]+, 521.20497; found 521.20133 (-3.64 mmu).
［合成実施例５］
　以下のスキーム３によりＰｒｏｂｅ５を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000050
（１）Ｎ－エチル－２－（２－ベンジルオキシエトキシ）－Ｎ－フェニルアセトアミド（化合物１９）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000051
　化合物１８は文献既知（Lorella Pasquinucci et al, ”Evaluation of N-substitution in 6,7-benzomorphan compounds” Bioorg. Med. Chem., 2010, 18,　pp4975-4982）の方法で合成した．乾燥した１００ｍＬ丸底二頸フラスコに，２－ベンジルオキシエタノール４ｇ、２６．２ｍｍｏｌを秤量し、蒸留ＴＨＦ２０ｍＬに溶解させた後、アルゴンで満たした風船を装着した三方コックを用いて容器内をアルゴン雰囲気に置換しゴムセプタムで密栓した。この溶液に、ＮａＨ　１．１９ｇ（６０％　ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ　ｉｎ　ｍｉｎｅｒａｌ　ｏｉｌ）を加え、アルゴン雰囲気下、室温中で３０分攪拌し、ナトリウム　２－ベンジルオキシエトキシドの溶液を調整した。別途用意した丸底フラスコに化合物１７　３ｍＬを秤量し、蒸留ＴＨＦに溶解させた後、上で用意したナトリウム　２－ベンジルオキシエトキシド溶液をシリンジを用いて加え、室温下で１時間攪拌した。反応を停止させるため、氷水５０ｍＬを徐々に加え、混合液をＡｃＯＥｔ　３０ｍＬで３回抽出した。抽出液を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過した後減圧濃縮した。濃縮残渣をシリカゲルを担体としたカラムクロマトグラフィーで精製、化合物１９を無色液体として７．０４ｇ、収率９４％で得た。
1H-NMR (300 MHz, CD2Cl2): δ 1.10 (t, J = 7.3 Hz, 3H); 3.58 (s, 4H); 3.71 (q, J =7.3 Hz, 2H); 3.82 (s, 2H); 4.49 (s, 2H); 7.15-7.18 (m,2H); 7.27-7.41 (m, 8H).　13C-NMR (75 MHz, CD2Cl2): δ 13.1, 44.3, 69.8, 70.1, 70.9, 73.4, 127.8, 128.0, 128.5, 128.6, 128.7 .130.0, 138.9 ,141.3, 168.6.　HRMS (ESI+): m/z calcd for C19H23NNaO3, [M+Na]+, 336.15756; found 336.15517 (-2.39 mmu).
（２）Ｎ－エチル－２－（２－ヒドロキシエトキシ）－Ｎ－フェニルアセトアミド（化合物２０）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000052
　２００ｍＬの丸底フラスコに化合物１９（３ｇ、９．５８ｍｍｏｌ）を秤量し、蒸留ＭｅＯＨ１５０ｍＬに溶解させた。１０％Ｐｄ／Ｃ　３ｇを溶液に懸濁させ、水素雰囲気下、室温で攪拌した。ＴＬＣで反応の進行を確認し、原料消失後、反応液をろ過した。得られた濾液を減圧下濃縮し、化合物２０を淡黄色液体として２．０５ｇ、収率９６％で得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.13 (t, 3H); 3.60 (t, J =4.0 Hz, 2H); 3.69 (t, J = 4.0 Hz, 2H); 3.72-3.80 (m, 3H); 3.84 (s, 2H); 7.15 (d, J = 6.6 Hz, 2H); 7.43 (m, 3H). 13C-NMR (75 MHz, CDCl3): δ 12.5, 44.0, 61.2, 68.9, 73.7, 127.8, 128.2, 129.6, 139.9, 169.4.　HRMS (ESI+): m/z calcd for C12H17NNaO3, [M+Na]+, 246.11061; found 246.11242 (+1.80 mmu).
（３）２－（２－（Ｎ－エチル－Ｎ－フェニルアミノ）エトキシ）エタノール（化合物２１）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000053
　乾燥させた１００ｍＬ丸底フラスコに化合物２０（２．０４ｇ、９．１６ｍｍｏｌ）を秤量し、蒸留ＴＨＦ１００ｍＬに溶解させた。フラスコ内をアルゴン雰囲気に置換した後、溶液にＢＨ３　ＴＨＦ溶液（０．９ｍｍｏｌ／ｍＬ）５１ｍＬを室温下、滴下し加えた。反応の進行をＴＬＣでモニターし、室温中で攪拌、原料の消失後、蒸留水の添加により反応を停止させ、減圧下、反応液を濃縮した。濃縮した溶液をＡｃＯＥｔ５０ｍＬで３回抽出し、抽出液を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、これをろ過した。得られた濾液を減圧下濃縮し、化合物２１を無色液体として１．８４ｇ、収率９６％
で得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ1.15 (t, J =6.6 Hz, 3H); 3.42 (q, J = 6.6 Hz, 2H); 3.50 (t, J =5.8 Hz, 2H); 3.56 (t, J = 5.2 Hz, 2H); 3.64 (t, J = 5.8 Hz, 2H); 3.71 (t, J = 5.1 Hz, 2H); 6.69 (m, 3H); 7.21 (m, 2H).　13C-NMR (75 MHz, CDCl3): δ 12.1, 45.4, 50.0, 61.8. 68.9. 72.3, 112.0 116.0, 129.3, 147.8.　HRMS (ESI+): m/z calcd for C12H20NO2, [M+H]+, 210.14940; found 210.15041 (+1.01 mmu).
（４）２－（２－（Ｎ－エチル－Ｎ－フェニルアミノ）エトキシ）エチル　ｐ－トルエン　スルホネート（化合物２２）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000054
　乾燥させた５０ｍＬ丸底フラスコに化合物２１（１．８４ｇ、８．８ｍｍｏｌ）とＴｓＣｌ（２．５２ｇ、１３．２ｍｍｏｌ）を秤量した。このフラスコを氷浴上に設置し、蒸留ＣＨ２Ｃｌ２３０ｍＬを加えた。この反応溶液に対し、氷冷下、ピリジン（１．０６ｍＬ、１３．２ｍｍｏｌ）を滴下した後、反応溶液を室温中で終夜攪拌した。得られた反応溶液に蒸留水３０ｍＬを加えた後、混合液をＣＨ２Ｃｌ２３０ｍＬで２回抽出した。抽出液を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過した。得られた濾液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルを担体としたカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物２２を，６．１５ｇ、収率７０％で得た。得られた化合物２２は不安定であり、すぐに次の反応へと用いた。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ1.11 (t, J = 7.3 Hz, 3H); 2.43 (s, 3H); 3.35 (q, J = 7.3 Hz, 2H); 3.42 (t, J = 5.9 Hz, 2H); 3.56 (t, J = 5.8 Hz, 2H); 4.15 (t, J = 4.3 Hz, 2H); 6.65 (m, 3H); 7.19 (m, 2H); 7.33 (d, J = 8.1 Hz, 2H); 7.79 (d, J = 8.1 Hz, 2H). HRMS (ESI+): m/z calcd for C19H26NO4S, [M+H]+, 364.15825; found 364.15403 (-4.23 mmu).
（５）２－（２－（Ｎ－エチル－Ｎ－フェニルアミノ）エトキシ）エチル　アジド（化合物２３）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000055
　５０ｍＬ丸底フラスコに化合物２２（２．２１ｇ、６．０９ｍｍｏｌ）およびＮａＮ３（４７４ｍｇ、７．３ｍｍｏｌ）を加え、ＤＭＦ１０ｍＬを加えた。反応溶液を９０°Ｃに加熱し、終夜攪拌した。得られた反応液を、蒸留水５０ｍＬで希釈し、これをＡｃＯＥｔ３０ｍＬで３回抽出した。抽出液を、蒸留水２０ｍＬで２回、飽和食塩水で１回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過した。得られた濾液を減圧下濃縮し、濃縮残渣をＮＨシリカゲルを担体としたカラムクロマトグラフィーで精製、化合物２３を得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ1.16 (t, J = 7.5 Hz, 3H); 3.36 (t, J = 5.1 Hz, 2H); 3.42 (q, J = 7.5 Hz, 2H); 3.51 (t, J = 5.9 Hz, 2H); 3.64 (m, 4H); 6.63-6.70 (m, 3H); 7.18-7.24 (m, 2H).　13C-NMR (75 MHz, CDCl3): δ 12.1, 45.4, 50.0, 50.8, 69.1, 70.1, 111.8, 115.8.128.9, 129.3, 147.7.　HRMS (ESI+): m/z calcd for C12H10N4O, [M+H]+, 235.15589; found 235.15256 (-3.32 mmu) .
（６）２－（２－（Ｎ－エチル－Ｎ－（４－ホルミルフェニル）アミノ）エトキシ）エチル　アジド（化合物２４）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000056
　乾燥させた５０ｍＬ丸底フラスコに、化合物２３（１．２１ｇ、５．１８ｍｍｏｌ）を秤量し、蒸留ＤＭＦ５ｍＬに溶解させた。フラスコを氷浴上で５分間攪拌し、続いてＰＯＣｌ３（９６６ｍＬ、１０．３７ｍｍｏｌ）を滴下した。その後、反応液を終夜４０°Ｃに加熱し、攪拌した。その後、フラスコを氷浴上で冷却し、ＮａＨＣＯ３溶液５０ｍＬを加えた。得られた溶液のＡｃＯＥｔ３０ｍＬで３回抽出した後、抽出液を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過し、減圧下濃縮した。濃縮残渣をシリカゲルを担体としたカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物２４を薄緑色の液体として１．０３ｇ、収率７６％で得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ1.21 (t, J = 7.3 Hz, 3H); 3.37 (t, J = 4.4 Hz, 2H); 3.55 (q, J = 7.3 Hz, 2H); 3.60-3.70 (m, 6H); 6.72 (d, J = 9.5 Hz, 2H); 7.71 (d, J = 8.9 Hz, 2H); 9.73 (s, 1H).　13C-NMR (75 MHz, CDCl3): δ 12.0, 45.8, 50.1, 50.7, 68.8, 70.2, 110.8, 125.1, 132.2, 152.3, 190.0.　HRMS (ESI+): m/z calcd for C13H18N4NaO2, [M+Na]+, 285.13274; found 285.13462 (-1.87 mmu).
（７）２－（２－（Ｎ－エチル－Ｎ－（４－ジメトキシメチルフェニル）アミノ）エトキシ）エチル　アジド（化合物２５）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000057
　化合物２４のアセタール保護は、化合物１３の合成に示した手法を用いて行った。化合物２４（１．１６ｇ、６．３３ｍｍｏｌ）、トリメチルオルトホルメート（２．０８ｍＬ、１９．０ｍｍｏｌ）、ｃ．ＨＣｌ（１０滴）を用い、化合物２５を淡褐色液体として収率１００％で得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ1.15 (t, J = 7.3 Hz, 3H); 3.31 (s, 6H); 3.33-3.65 (m, 10H); 5.28 (s, 1H); 6.65 (d, J = 8.8 Hz, 2H); 7.20 (d, J = 8.8 Hz, 2H).　13C-NMR (75 MHz, CDCl3): δ 12.0, 45.4, 49.7, 50.0, 50.7 .52.6, 52.8, 53.8, 68.9, 70.0, 103.6, 110.8, 111.1, 125.1, 127.6, 147.7.　HRMS (ESI+): m/z calcd for C15H24N4NaO3, [M+Na]+, 331.17461; found 331.17097 (-3.64 mmu).
（８）２－（２－（Ｎ－エチル－Ｎ－（４－ジメトキシメチルフェニル）アミノ）エトキシ）エチルアミン（化合物２６）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000058
　化合物２５のアジド基の還元は，上に示した化合物１４の合成法に則り、合成した。化合物２５（８２３ｍｇ、２．６７ｍｍｏｌ）、ＬｉＡｌＨ４（２０３ｍｇ、５．３４ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ１０ｍＬを用い、化合物２６を無色液体として６２９ｍｇ、収率８３％で得た。
1H-NMR (300 MHz, CD2Cl2): δ1.14 (t, J = 7.3 Hz, 3H); 1.41 (br, 2H); 2.77 (t, J = 5.9 Hz, 2H); 3.26 (s, 6H); 3.40-3.50 (m, 6H); 3.59 (t, J = 6.6 Hz, 2H); 5.23 (s, 1H); 6.66 (d, J = 8.8 Hz, 2H); 7.20 (d, J = 8.8 Hz, 2H).　13C-NMR (75 MHz, CD2Cl2): δ 12.3, 42.3, 45.7, 50.5, 52.8, 69.0, 74.1, 104.1, 111.4, 125.7, 128.0, 148.4.　HRMS (ESI+): m/z calcd for C14H23N2O2, [M-OCH3]+, 251.1795; found 251.17451 (-1.45 mmu).
（９）２－（２－（Ｎ－エチル－Ｎ－（４－ホルミルフェニル）アミノ）エトキシ）エチル－３－メチル－４－（６－ヒドロキシキサンテン－３－オン－９－イル）－ベンズアミド（Ｐｒｏｂｅ５）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000059
　化合物２６は、上に示したｐｒｏｂｅ　４の合成法に則り、合成した。化合物２９（２１．４ｍｇ、７５μｍｏｌ）、２－Ｍｅ４－ＣＯＯＨ　ＴＧ（２０ｍｇ、５８μｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（２６ｍｇ、６９μｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（２２ｍＬ、１７３μｍｏｌ）を用い、Ｐｒｏｂｅ５を橙色固体として１５ｍｇ、収率４９％で得た。
1H-NMR (300 MHz, CD3OD): δ 1.19 (t, J = 7.3 Hz, 3H); 2.11 (s, 3H); 3.56-3.73 (m, 11H); 6.70-6.73 (m, 4H); 6.83 (d, J = 8.8 Hz, 2H); 7.32 (d, J = 8.0 Hz, 1H); 7.65 (d, J = 8.8 Hz, 2H); 7.79 (d, 6.6 Hz, 1H); 7.87 (br, 1H); 9.53 (s, 1H). HRMS (ESI+): m/z calcd for C34H33N2O6, [M+H]+, 565.2386 ; found 565.23793.
［参考例１～３］
　上記で合成したＰｒｏｂｅ１～３についてＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＡＬＤＨ３Ａ１に対する反応性を調べた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000060
　ヒトｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＡＬＤＨ１Ａ１／１Ａ３／３Ａ１を購入し、Ｔｒｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ、ｐＨ７．５）にＫＣＬ　１００ｍＭ、ＤＴＴ　２ｍＭ、ＮＡＤ（Ｐ）１ｍＭおよび各ＡＬＤＨ１０～１００ｎＭ、各化合物１０～８０μＭを混和し３７℃、３０分反応させ等量のアセトニトリルを加え反応を停止させた。反応液はＵＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ）で解析した。ＵＰＣＬクロマトグラムは５％アセトニトリル　０．０１Ｍギ酸アンモニウム／水から９５％アセトニトリル　０．０１Ｍギ酸アンモニウム／水のリニアグラジエントを流速＝８００μＬ／分で５分かけて行った。アルデヒド型およびカルボン酸型プローブは５０４ｎｍの波長における吸光で検出し、それぞれのピークにおけるＭＳスペクトルのｍ／ｚが予想されるｍ／ｚと合致していることを確認した。
　また、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲに関してはＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＬＤＨ１Ａ３に反応することは既知であるため、ＡＬＤＨ３Ａ１に関してのみ行った。結果を表２に示す。
　ベンズアルデヒドを反応部とする化合物１は実験を行った３つのアイソフォームすべてに反応したが、化合物２はＡＬＤＨ１Ａ１としか反応性を示さなかった。一方、ＤＥＡＢを反応部とした化合物３はＡＬＤＨ１Ａ１とＡＬＤＨ３Ａ１に反応し、３つのプローブのなかでは最もＡＤＬＨ３Ａ１に特異的といえる結果であった。また、予想された通り、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲはＡＬＤＨ３Ａ１には反応性を示さなかった。
表２　Ｐｒｏｂｅ１～３の各ＡＬＤＨアイソフォームに対する反応性
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000061
　ＡＬＤＨ３Ａ１に反応性を示したＰｒｏｂｅ１とＰｒｏｂｅ３を用いて細胞イメージングを行った。細胞はＡＬＤＨ３Ａ１高発現細胞である食道扁平上皮癌細胞株（ＯＥ２１　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ）を用いた。様々なＰｒｏｂｅ濃度および反応時間でイメージングを試みたがＡＬＤＨ３Ａ１特異的インヒビター（ＣＢ７）を用いた陰性コントロールに対し明らかな輝度の差は認めなかった。また、Ｐｒｏｂｅ２はＡＬＤＨ１高活性細胞を検出可能なＡＬＤＥＦＬＵＯＲと同様の使用が可能であると考えられたためＡＬＤＥＦＬＵＯＲでＡＬＤＨ１Ａ１高活性細胞が検出可能であると文献的に報告があるＡ５４９細胞を用いてイメージングを行ったが、陰性コントロールに対し明らかな輝度の差は認めなかった。
［実施例１及び参考例４］
　次に、上記で合成したＰｒｏｂｅ４及び５についてＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＡＬＤＨ３Ａ１に対する反応性を調べた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000062
　Ｐｒｏｂｅ１～３について意図した結果が得られなかった原因として過剰な膜透過性が原因であると考えた。ＢＯＤＩＰＹは疎水性プローブであるが、Ｐｒｏｂｅ１～３はＡＬＤＥＦＬＵＯＲの反応部に含まれる短鎖脂肪族アルデヒドと違い疎水性の強い芳香族アルデヒドである。つまり、疎水性同士の組み合わせがプローブ全体としての水溶性を疎水性側にシフトさせており、カルボン酸型となっても膜非透過となるほどには親水性にはならないと考えた。そこで、Ｐｒｏｂｅ４及び５では、プローブをより親水性にするために、ＢＯＤＩＰＹよりも親水性である蛍光団を使用することとし、蛍光団としてＴｏｋｙｏ　Ｇｒｅｅｎ（ＴＧ）を使用した。反応部はＡＬＤＨ３Ａ１に対する特異性が比較的高かったＤＥＡＢを用いることとした。また、Ｐｒｏｂｅ１、２の結果より、結合部もＡＬＤＨに対する反応性に影響を及ぼしていたことから、Ｐｒｏｂｅ４及び５では結合部の長さが違う２種類のリンカーを用いた。
　ＡＬＤＨに対する反応性を確認したところ、Ｐｒｏｂｅ４は全く反応性を示さなくなったが、Ｐｒｏｂｅ５はＰｒｏｂｅ３と同様にＡＬＤＨ１Ａ１とＡＬＤＨ３Ａ１に反応性を示した。以上作成した５つのプローブとＡＬＤＥＦＬＵＯＲの膜透過性を比較するためにＬＣ／ＭＳによる中性条件下での水溶性を検証した。それぞれのプローブを適切なアイソフォーム・濃度のＡＬＤＨを用いてカルボン酸型とアルデヒド型がともに存在する程度にまで反応を進行させた後に反応を停止させＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ　１２００／６１３０　ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ　ＬＣ／ＭＳシステム）にて解析した。カラムはＣ１８カラム（ＨＰ　３μｍ、内径：２．１ｍｍ、長さ：１５０ｍｍ、ジーエル　サイエンス）を用いた。ＨＰＣＬクロマトグラムは溶媒Ａを０．０１Ｍギ酸アンモニウム／水、溶媒Ｂを８０％アセトニトリル　０．０１Ｍギ酸アンモニウム／水とし、２０％Ｂ　２．５分に続いて２０％から１００％　Ｂ、５分間のリニアグラジエント（流速５００μｌ／ｍｉｎ）の条件で行った。ＢＯＤＩＰＹを含むプローブを５０４ｎｍ、ＴＧを含むプローブを４９５ｎｍの波長における吸光で検出し、それぞれのピークにおけるＭＳスペクトルのｍ／ｚが予想されるｍ／ｚと合致していることを確認した。３回の独立した実験を行い平均±Ｓ．Ｄ．を算出した。得られたデータを表３及び図２に示す。化合物１、２、３のアルデヒド型プローブは８分以降に検出されたが、アルデヒド型のＰｒｏｂｅ４、５およびＡＬＤＥＦＬＵＯＲは７分台前半で検出された。一方でカルボン酸型のＰｒｏｂｅ１、２、３のなかで最も検出時間が早かったＰｒｏｂｅ１は７．０９８分であったが、カルボン酸型のＡＬＤＥＦＬＵＯＲは６．７４１分でカルボン酸型のＰｒｏｂｅ５はさらにそれより早い時間に検出された。Ｐｒｏｂｅ１のイメージングが成功していないことから、この６．７４１分から７．０９８分の間（図２の帯）に膜透過性が急激に変化する閾値が存在すると考えられた。
表２　Ｐｒｏｂｅ４及び５の各ＡＬＤＨに対する反応
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000063
表３　各プローブにおけるアルデヒド型およびカルボン酸型の保持時間
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000064
（プローブの速度論的特性）
　各プローブにおいて反応性を示した各ＡＬＤＨアイソフォームについてＭｉｃｈａｅｌｉｓ－Ｍｅｎｔｅｎ式におけるＫｍ，　Ｋｃａｔを求めた。反応はＴｒｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ　（１００ｍＭ、ｐＨ７．５）にＫＣＬ　１００ｍＭ、ＤＴＴ　２ｍＭ、ＮＡＤ（Ｐ）１ｍＭおよび各ＡＬＤＨ１０～１００ｎＭ、各プローブ０．１～８０μＭの範囲で５～６点での濃度を選択、混和し３７℃、５分反応させ等量のアセトニトリルを加え反応を停止させた。アルデヒド型／カルボン酸型プローブの検出はＵＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳにて前述と同様の方法で行った。得られた各プローブ濃度における反応速度をＭｉｃｈａｅｌｉｓ－Ｍｅｎｔｅｎ式にフィッティングさせることでＫｍ，　Ｋｃａｔを算出した。フィッティングにはＫａｌｅｉｄａ　Ｇｒａｐｈ　ｖｅｒ．４．１（ＨＵＬＩＮＫＳ　ｉｎｃ．）を用いた。得られたデータを表４に示す。
　Ｋｍが比較的小さいことから実際のプローブ使用濃度ではプローブの反応速度はＶｍａｘに近いと考えられたため、ＡＬＤＨ１Ａ１／ＡＬＤＨ３Ａ１の特異性の指標としてＰｒｏｂｅ１、Ｐｒｏｂｅ３、Ｐｒｏｂｅ５に関してＫｃａｔ比（ＡＬＤＨ３Ａ１のＫｃａｔ／ＡＬＤＨ１Ａ１のＫｃａｔ）を算出した（表５）。Ｐｒｏｂｅ５はＡＬＤＨの濃度が同一条件下、反応速度がＶｍａｘに近いプローブ濃度下ではＡＬＤＨ１Ａ１に比べＡＬＤＨ３Ａ１の方が約６倍反応性が高いことになり、よりＡＬＤＨ３Ａ１に対し特異性の高いプローブとなった。
表４　各プローブの速度論的な特徴
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000065
表５　Probe 1,3,5のKcat比(ALDH3A1のKcat/ALDH1A1のKcat)
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000066
［実施例２］
（Ｐｒｏｂｅ５を用いた細胞イメージング）
　Ｐｒｏｂｅ５、及び、ＡＬＤＨ３Ａ１高発現細胞である食道扁平上皮癌細胞株（ＯＥ２１　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ）を用いてイメージングを行った。培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ、１５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、Ｐｈｅｎｏｌ　Ｒｅｄフリー）に４０μＭのＰｒｏｂｅ５を加え３７℃、９０分培養した後、氷冷した培地で細胞を洗浄し、共焦点顕微鏡下で観察した。特異的ＡＬＤＨ３Ａ１インヒビター（１－［（４－Ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ｓｕｌｆｏｎｙｌ］－２－ｍｅｔｈｙｌ－１Ｈ－　ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ＣＢ７１０μＭ）を添加したサンプルを陰性コントロールとした。４８８ｎｍのレーザーで励起し、検出は５００～５７０ｎｍの波長で観察を行った。図３に示すように陰性コントロールに対し、高輝度な細胞を観察できた。
［実施例３］
（Ｐｒｏｂｅ５を用いたフローサイトメトリー）
　Ｐｒｏｂｅ５、および、ＯＥ２１細胞を用いフローサイトメトリーを行った。細胞をトリプシン処理し、セルストレイナー（４０μｍ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に通した後に細胞密度を計測した。４０μＭのＰｒｏｂｅ５を含む培地に２．５～５×１０５／ｍｌとなるように５００μｌの細胞懸濁液を作成し、３７℃、９０分培養した。反応後に１５００ｒｐｍ、３分間遠心し上清を除去した後、氷冷した培地で細胞を洗浄、遠心し、培地を除去した。１００μｌの培地に再度細胞を懸濁し死細胞除去目的でＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｒｅｄ　ｄｅａｄ　ｃｅｌｌ　ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ）を４μｌ添加し、氷上で５分間静置後、培地を１５０μｌ加えた。陰性コントロールにはＣＢ７（１０μＭ）を加えたサンプルを用いた。解析はＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて行った。Ｂｌｕｅ　ｌａｙｓｅｒ（４８８ｎｍ）で励起し、ＦＩＴＣチャンネル（５１５～５４５ｎｍ）で各細胞におけるＰｒｏｂｅ５の輝度を検出した。各サンプルはダブレットの除去、死細胞の除去を行った上で３０，０００個程度の細胞を解析した。陽性ゲートはＡＬＤＥＦＬＵＯＲアッセイにならい、陰性コントロールにおける輝度の上限付近からそれ以上の領域に設定し、陰性コントロールサンプルでゲート内に存在する細胞が高くとも３％を下回るようにした。独立した実験を３回行った。図４に示すように陽性率１０～１５％を示した。
［実施例４］
（ＡＬＤＨ３Ａ１ノックダウンによるフローサイトメトリー）
ＯＥ２１細胞と化合物５を用いたフローサイトメトリーにおける陽性群がＡＬＤＨ３Ａ１の活性によることを確認する目的でｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いたＡＬＤＨ３Ａ１のノックダウンを行い、フローサイトメトリーを行った。ｓｉＲＮＡはＴｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社より有効性が確認されているものを２つ（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ、ｓ１２４３およびｓ１２４４）、および、陰性コントロール（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）Ｎｅｇａｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ＃１）を購入した。Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ＲｅａｇｅｎｔとしてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ(登録商標）　ＲＮＡｉＭＡＸ、希釈液としてＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）をＴｈｏｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒより購入した。手順書に従い、ｓｉＲＮＡを１０ｎＭ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを３％となるように手順書にしたがってｓｉＲＮＡ－Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ｃｏｍｐｌｅｘを３００μｌ作成し、そのうち２５０μｌとＯＥ２１細胞懸濁液２．５ｍｌを混合し、６　ｗｅｌｌ　ｄｉｓｈに播種した。ノックダウンの効果は６日後にウエスタン・ブロッティングにより確認した（Ｆｉｇｕｒｅ　６ａ）。この条件下でＰｒｏｂｅ　５を用いて前述の条件と同様の条件でフローサイトメトリーを行ったところ、ＡＬＤＨ３Ａ１ノックダウン群で陽性率が著明に低下し、Ｐｒｏｂｅ　５陽性細胞がＡＬＤＨ３Ａ１の活性によることが示された（図５）。
［実施例５］
（ソート・アウトによるＡＬＤＨ３Ａ１発現量の確認）
　ＡＬＤＨの活性は発現量により調節されている。ＡＬＤＥＦＬＵＯＲアッセイでは少なくともＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＡＬＤＨ２の活性を区別なく検出してしまうためソート・アウトした際には目的のＡＬＤＨアイソフォームに対する抗体を用いてウエスタン・ブロッティングを行うのが通例である。これに倣いＰｒｏｂｅ５とＯＥ２１細胞を用いて高輝度群と低輝度群をソート・アウトしウエスタン・ブロッティングを行った。セル・ソーターはＦＡＣＳ　Ａｒｉａ　ＩＩ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた。通常のフローサイトメトリーと同様にアッセイし、陽性ゲート（Ｔｏｐ）、および、低輝
度側下位１０～１５％にゲート（Ｂｏｔｔｏｍ）を設置し、細胞をソート・アウトした。
得られた細胞からライセートを作成し、ウエスタン・ブロッティングを行った。各バンドは発光法によりＩｍａｇｅＱｕａｎｔ　ＬＡＳ　４０００ｍｉｎｉ（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて検出・定量した。ハウスキーピング遺伝子であるＡＣＴＢでＡＬＤＨ３Ａ１の発現量を標準化し、ＴｏｐとＢｏｔｔｏｍでのＡＬＤＨ３Ａ１の発現量を比較した。図６に示すように予想に反しそれほどの発現量の差は認めなかった。
［実施例６］
（Ｐｒｏｂｅの細胞外能動排出とその制御による最適化）
　細胞は細胞内の物質に対する能動排出機構を有しており、同じｃｅｌｌ　ｌｉｎｅであっても能動排出機能は細胞により異なることが知られている。能動排出を考慮し、イメージングおよびフローサイトメトリーでは氷冷した培地を用いていたが、能動排出を評価するため３７℃の条件下で同一視野の経時的観察を行った（図７ａ）。
　その結果、観察開始から１０分程度経過した時点で著名な蛍光輝度の低下がみられた。
ＴＧはフルオレセインの誘導体であるが、フルオレセインはトランスポーターであるｍｕｌｔｉｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＲＰ）の働きにより細胞外に排出されることが知られている。ＭＲＰの阻害剤はこの能動排出を抑制するとの報告があることから幾つかのＭＲＰ阻害剤を用いて、化合物５の輝度低下が抑制されるか実験を試みた。ＭＫ－５７１はＭＲＰの複数のアイソフォームを阻害する薬剤である。ＭＫ－５７１を２００μＭの濃度で用いたところＰｒｏｂｅ５の能動排出が著明に抑制された（図７ｂ）。そこで、ＭＫ－５７１（２００μＭ）を添加した状態でフローサイトメトリーを行ったところ（図７ｃ）、陽性率が９０％程度と著明な改善が得られた。
［実施例７］
（ＭＫ－５７１を併用したＡＬＤＨ３Ａ１ノックダウン細胞によるフローサイトメトリー）
　ＭＫ－５７１を併用したフローサイトメトリーでは陽性率が著名に改善したが、この陽性細胞がＡＬＤＨ３Ａ１の活性によるものであることを確認するためｓｉＲＮＡを用いてＯＥ２１細胞のＡＬＤＨ３Ａ１をノックダウンしフローサイトメトリーを行った（図８）。ＭＫ－５７１　２００μＭ、Ｐｒｏｂｅ５　５０μＭ、陰性コントロールのＣＢ７を２０μＭとしアッセイを行ったところ、陰性コントロールｓｉＲＮＡで処理した細胞では陽性率が９０％程度であったものが、ノックダウンにより１０％台と著名に低下したことからＭＫ－５７１を用いて陽性率が著名に改善したアッセイにおける陽性細胞がＡＬＤＨ３Ａ１の活性に由来することが確認された。
［実施例８］
（陽性細胞陰性細胞の分離とソートアウト）
　陽性細胞と陰性細胞を分離・ソート・アウト可能であることを示すためｓｈｏｒｔ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）により恒常的にＡＬＤＨ３Ａ１がノックダウンされた細胞を作成した。ＡＬＤＨ３Ａに対するｓｈＲＮＡおよび陰性コントロールとしてＮｏｎ－ｔａｒｇｅｔ　ｓｈＲＮＡをレンチウイルスを用いてＯＥ２１細胞に導入した。ＡＬＤＨ３Ａ１がノックダウンされていない陰性コントロール細胞（ｃｔｒｌ）とＡＬＤＨ３Ａ１が恒常的にノックダウンされた細胞（ＫＤ）を用いてライセートを作成しウエスタン・ブロッティングを行い、ＡＬＤＨ３Ａ１が著名にノックダウンされていることを確認した（図９ａ）。この細胞を用いてＭＫ－５７１、Ｐｒｏｂｅ５を用いたフローサイトメトリーを前述と同様のプロトコールで行った（図９ｂ）ところ、ノックダウン細胞（ＫＤ）ではＣＢ７を用いた時とほぼ同程度の陽性率となり、さらに、ノックダウン細胞（ＫＤ）と非ノックダウン細胞（ｃｔｒｌ）を１：１で混和したサンプルの解析ではＰｒｏｂｅ５の陽性・陰性率は約１：１となった。なお、同時に行ったＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｒｅｄ　ｄｅａｄ　ｃｅｌｌ　ｓｔａｉｎによるアッセイでは死細胞はほとんど認めず、プローブなどの影響による細胞死はほとんど起きていないことを確認した。この陽性と陰性がよく分離されたサンプルを用いて蛍光輝度の上位２５％（Ｔｏｐ）と下位２５％（Ｂｏｔｔｏｍ）をＦＡＣＳ　Ａｒｉａ　ＩＩを用いてソート・アウトした。それぞれのライセートを作成し、それらを用いてウエスタン・ブロッティングを行いＡＬＤＨ３Ａ１の発現量を比較検討した（図９ｃ）。するとフローサイトメトリーの結果と一致してＰｒｏｂｅ　５陽性群でＡＬＤＨ３Ａ１の著名な発現を認め、陰性群ではＡＬＤＨ３Ａ１はほとんど認めなかった。
　以上より、化合物５はＭＲＰ阻害剤と併用することによってＡＬＤＨ３Ａ１高活性細胞を検出可能であることが示された。また、セル・ソーターを用いることで、ＡＬＤＨ３Ａ１高活性細胞／低活性細胞をそれぞれ分取可能で、連続して生物学的実験に使用可能である。

Claims (11)

  1. 　以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩であって、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
    （式中、
    Ｒａは、水素原子又は炭素数１～４のアルキル基を表し；
    Ｔは、以下の二価の基：
    －Ｎ（Ｒｂ）－、
    －Ｃ（Ｒｃ）２－
    －Ｏ－
    から選択され（Ｒｂは、炭素数１～４のアルキル基を表し、Ｒｃは、水素原子又は炭素数１～４のアルキル基を表し、各々のＲｃは、同じであってもこ異なっていてもよい）；
    Ｌは、リンカーを表し；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
    は、蛍光団を表し、
    前記蛍光団は、キサンテン系色素、ＢＯＤＩＰＹ系蛍光団又はシアニン系蛍光団から選択される）
    以下の条件で測定したＨＰＬＣクロマトグラムの保持時間は、当該化合物のアルデヒド型の場合においては６．９分より大きく、当該化合物のカルボン酸型の場合においては６．９分以下である、前記化合物又はその塩。
    （ＨＰＬＣ条件：溶媒Ａを０．０１Ｍギ酸アンモニウム／水、溶媒Ｂを８０％アセトニトリル　０．０１Ｍギ酸アンモニウム／水とし、２０％の溶媒Ｂで２．５分に続いて２０％から１００％の溶媒Ｂ、５分間のリニアグラジエント（流速５００μｌ／分）の条件で行う。）
  2. 　前記リンカーが、Ｙ－（Ｓ）で表され、Ｙは結合基を表し、Ｓは存在する場合は架橋基を表す、請求項１に記載の化合物又はその塩。
  3. 　前記結合基が、－ＣＯＮＨ－、－Ｒ－ＣＯＮＨ－、－ＣＯＯ－、－Ｒ－ＣＯＯ－、－ＲＯ－又は－Ｒ－ＣＯ－（ここで、Ｒは炭化水素基を表す）から選択される、請求項２に記載の化合物又はその塩。
  4. 　前記架橋基が、炭素数１～６の置換又は無置換のアルキレン基、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｍ－（ｍは１又は２である）、又はこれらの組合せから選択される、請求項２又は３に記載の化合物又はその塩。
  5. 　式（Ｉ）における
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
    は、以下の式（ＩＩ）で表される、請求項１～４のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
    Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４個の同一又は異なる一価の置換基を示し；
    Ｒ２は、水素原子、一価の置換基又は結合を示し； 
    Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基、ハロゲン原子又は結合を示し；
    Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基、アリール基又は結合を示し、但し、Ｘが酸素原子の場合は存在しない；
    Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基、ハロゲン原子又は結合を示し；
    Ｘは、酸素原子又は珪素原子を示し；
    ＊は、ベンゼン環上の任意の位置における式（Ｉ）のＬとの結合箇所を表し、
    ここで、Ｌは、ベンゼン環上の任意の位置、Ｒ２～Ｒ８のいずれかの位置から選択される少なくとも１つの位置において結合する。）
  6. 　以下の式（ＩＩａ）で表される、請求項５に記載の化合物又はその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
    （式中、Ｒａ、Ｒｂ及びＬは式（Ｉ）で定義した通りであり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７、Ｒ８は、式（ＩＩ）で定義した通りである。）
  7. 　式（Ｉ）における
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
    は、以下の式（ＩＩＩ）で表される、請求項１～４のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
    （式中、Ｒ１～Ｒ８、Ｘは、式（ＩＩ）で定義した通りであり；
    Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～３個のアルキル基又は結合を示し、
    Ｒ９及びＲ１０は一緒になってＲ９及びＲ１０が結合している窒素原子を含む４～７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
    Ｒ９又はＲ１０は、或いは、Ｒ９及びＲ１０の両方は、夫々、Ｒ４又はＲ８と一緒になって、Ｒ９又はＲ１０が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１～６個のアルキル、炭素数２～６個のアルケニル、又は炭素数２～６個のアルキニル、炭素数６～１０個のアラルキル基、炭素数６～１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
    ＊は、ベンゼン環上の任意の位置における式（Ｉ）のＬとの結合箇所を表し、
    ここで、Ｌは、ベンゼン環上の任意の位置、Ｒ２～Ｒ１０のいずれかの位置から選択される少なくとも１つの位置において結合する）
  8. 　式（Ｉ）における
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
    は、以下の式（ＩＶ）で表される、請求項１～４のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
    （式中、Ｒ１～Ｒ８、Ｘは、式（ＩＩ）で定義した通りであり；
    Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１～６個のアルキル基を示し、
    Ｒ９及びＲ１０は一緒になってＲ９及びＲ１０が結合している窒素原子を含む４～７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
    Ｒ９又はＲ１０は、或いは、Ｒ９及びＲ１０の両方は、夫々、Ｒ３又はＲ７と一緒になって、Ｒ９又はＲ１０が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１～６個のアルキル、炭素数２～６個のアルケニル、又は炭素数２～６個のアルキニル、炭素数６～１０個のアラルキル基、炭素数６～１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
    Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～３個のアルキル基又は結合を示し、
    Ｒ１１及びＲ１２は一緒になってＲ１１及びＲ１２が結合している窒素原子を含む４～７員のヘテロシクリルを形成していてもよく、
    Ｒ１１又はＲ１２は、或いは、Ｒ１１及びＲ１２の両方は、夫々、Ｒ４又はＲ８と一緒になって、Ｒ１１又はＲ１２が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１～６個のアルキル、炭素数２～６個のアルケニル、又は炭素数２～６個のアルキニル、炭素数６～１０個のアラルキル基、炭素数６～１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
    ＊は、ベンゼン環上の任意の位置における式（Ｉ）のＬとの結合箇所を表し、
    ここで、Ｌは、ベンゼン環上の任意の位置、Ｒ２～Ｒ１２のいずれかの位置から選択される少なくとも１つの位置において結合する。）
  9. 　式（Ｉ）における
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
    は、以下の式（Ｖ）で表される、請求項１～４のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011
    （式中、
    Ｒ１３およびＲ１４は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１～６個のアルキル基を示し；
    Ｒ１５は、それぞれ独立に、水素原子、カルボキシル基又はスルホン酸基を示し：
    ｎは、１～３の整数を示し；
    ＊は、式（Ｉ）のＬとの結合箇所を表す。）
  10. 　式（Ｉ）における
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012
    は、以下の式（ＶＩ）で表される、請求項１～４のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013
    （式中、Ｒ１６～Ｒ２２は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基、カルボニル基、アリル基、アリール基、ピロール基、チオフェン基、 フラン基、スルホン酸基、スルホニルアミド基、カルボキシル基、メトキシ基又は結合を示し；
    Ｌは、Ｒ１６～Ｒ２２のいずれかの位置から選択される少なくとも１つの位置において結合する。）
  11. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む、ＡＬＤＨ３Ａ１検出蛍光プローブ。
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