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WO2018101611A1 - 막 필터를 이용한 고농도 사균의 제조방법 및 이의 제조방법으로 제조된 사균 - Google Patents

막 필터를 이용한 고농도 사균의 제조방법 및 이의 제조방법으로 제조된 사균 Download PDF

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WO2018101611A1
WO2018101611A1 PCT/KR2017/012086 KR2017012086W WO2018101611A1 WO 2018101611 A1 WO2018101611 A1 WO 2018101611A1 KR 2017012086 W KR2017012086 W KR 2017012086W WO 2018101611 A1 WO2018101611 A1 WO 2018101611A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
lactic acid
acid bacteria
bacteria
membrane filter
medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2017/012086
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English (en)
French (fr)
Inventor
정일선
윤종모
손민
김현수
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lactomason Co Ltd
Original Assignee
Lactomason Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lactomason Co Ltd filed Critical Lactomason Co Ltd
Priority to CN201780085192.2A priority Critical patent/CN111433346B/zh
Publication of WO2018101611A1 publication Critical patent/WO2018101611A1/ko
Priority to US16/426,319 priority patent/US11685896B2/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N1/005—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor after treatment of microbial biomass not covered by C12N1/02 - C12N1/08
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/065—Microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/02—Membranes; Filters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media

Definitions

  • the bacterium by batch culture has the following disadvantages.
  • Figure 7 is a graph comparing the size distribution of the lactic acid bacteria killed bacteria lactic acid bacteria and the lactic acid bacteria produced according to Comparative Example 1 according to an embodiment of the present application.
  • FIG. 13 is a graph showing the immunological activity of lactic acid bacteria according to an embodiment of the present application, the production of cytotoxicity (LDH) and nitric oxide (Nitric oxide) using a RAW264.7 cell line, a kind of macrophage (macrophage) It is a graph measuring the degree.
  • FIG. 14 is a graph showing the immune activity of the lactic acid bacteria bacterium according to an embodiment of the present application, using cytotoxicity (LDH) and TNF- ⁇ , INF- ⁇ , IL-12, IL- using mouse splenocytes. This is a graph measuring the degree of generation of 4.
  • LDH cytotoxicity
  • 15 is a photograph and graph showing the anti-obesity effect of the lactic acid bacteria bacteria according to an embodiment of the present application, a photograph showing that the fat accumulation in the adipocytes tested inversely proportional to the increase in the concentration of the treated lactic acid bacteria bacteria And graph.
  • the term "combination (s) thereof" included in the expression of a makushi form refers to one or more mixtures or combinations selected from the group consisting of components described in the expression of makushi form, It means to include one or more selected from the group consisting of the above components.
  • the "size of lactic acid bacteria” refers to the size of one lactic acid bacteria or one individual, and the specific measuring method is different depending on the type and form of lactic acid bacteria.
  • the lactic acid bacteria are bacillus, it does not mean the length of the bacillus, but means the thickness or width of the bacillus.
  • the lactic acid bacteria are cocci, it means the diameter of the cocci. In the case of other lactic acid bacteria such as lactic acid bacteria, it means the size measured on the basis of the size commonly used by those of ordinary skill.
  • the bioreactor includes a first membrane filter and a second membrane filter, thereby applying a shear force to the lactic acid bacteria live bacteria passing through the first membrane filter and the lactic acid bacteria bacteria passing through the second membrane filter.
  • Production method according to an embodiment of the present application by easily applying the shear force to the lactic acid bacteria live bacteria and lactic acid bacteria, the size of the lactic acid bacteria can be easily adjusted, in particular the size of the lactic acid bacteria can be adjusted small. Accordingly, lactic acid bacteria prepared by the manufacturing method according to an embodiment of the present application may not only be effectively absorbed into the body but also effectively absorbed into the body, thereby exhibiting an immunological activity and an anti-obesity effect.
  • Equation 1 j (the shear force of the fluid flowing along the tube), m (the viscosity of the fluid), Q (flow velocity of the fluid), r (radius of the tube) and L (length of the tube).
  • the flow rate of the fluid during the cultivation may act as an important factor to control the shear force.
  • the bioreactor including the incubator and the membrane filter may preferably include the incubator, the first membrane filter and the second membrane filter.
  • the bioreactor may include a structure in which the fluid added to the incubator is independently passed through the first membrane filter and the second membrane filter, respectively, and then delivered to the incubator.
  • FIG. 2A is a schematic diagram of a bioreactor in which the membrane filter 6 includes both the first membrane filter and the second membrane filter, and after the fluid is passed through the first membrane filter to the incubator The fluid may be delivered to the incubator through a second membrane filter.
  • the first membrane filter and the second membrane filter unlike in Figure 2 (a) may be present in a space independent of each other.
  • the bioreactor may further include a tank for producing a medium and a membrane filter for producing a medium.
  • the medium prepared in the medium production tank may be passed to the medium production tank again through the membrane filter for medium production or may be delivered to the incubator.
  • the medium passing through the membrane filter for producing the medium is delivered to the incubator, the medium may be directly passed to the incubator through the membrane filter for producing the medium.
  • the medium may be delivered to the incubator.
  • the first membrane filter may be a hollow fiber membrane filter including a pore having a diameter of the size of the lactic acid bacteria bacteria are not filtered while filtering the impurities contained in the medium inoculated with the lactic acid bacteria bacteria.
  • the pore diameter of the first membrane filter is, for example, 0.1 ⁇ m to 1.0 ⁇ m, 0.2 ⁇ m to 1.0 ⁇ m, 0.3 ⁇ m to 1.0 ⁇ m, 0.4 ⁇ m to 1.0 ⁇ m, 0.5 ⁇ m to 1.0 ⁇ m, 0.1 ⁇ m to 0.9 ⁇ m, 0.1 ⁇ m to 0.8 ⁇ m, 0.1 ⁇ m to 0.7 ⁇ m, 0.1 ⁇ m to 0.6 ⁇ m or 0.1 ⁇ m to 0.5 ⁇ m.
  • the size of the pore diameter of the first membrane filter is less than 0.1 ⁇ m, severe fouling phenomenon occurs during the culture of the lactic acid bacteria live bacteria, the flux of the culture solution is reduced. Accordingly, a problem may occur that the concentration efficiency of the lactic acid bacteria live bacteria is reduced.
  • the pore diameter of the first membrane filter is larger than 1.0 ⁇ m, the lactic acid bacteria may be filtered through the membrane together with impurities.
  • the first membrane filter and the second membrane filter may each independently include a hollow fiber membrane filter having a radius of 6.0 mm or less.
  • the radius of the hollow fiber membrane filter is 6.0 mm or less, according to Equation 1, it is possible to increase the shear force applied to the lactic acid bacteria live bacteria or dead bacteria. Accordingly, the size of the lactic acid bacteria live bacteria or dead bacteria can be adjusted small, and the degree of dispersion can be increased.
  • the bioreactor may include a pressure gauge and / or a flow meter.
  • the pressure gauge is to manage the fouling (fouling) phenomenon of the membrane filter
  • the flow meter is to measure the flow rate ( Q ) of the culture fluid through the membrane filter in real time to control the shear force applied to the lactic acid bacteria It is for.
  • the bioreactor may further include a tank for producing a medium and a membrane filter for producing a medium.
  • the medium serves to supply nutrients necessary for the culture of lactic acid bacteria live bacteria, can be prepared by sterilizing the medium solution.
  • Conventional medium is usually sterilized by steam, etc., by the steam sterilization, carbohydrates, proteins, etc. are generated carbonized by heat and remain in the medium, the quality of lactic acid bacteria powder may be degraded have.
  • the manufacturing method according to an embodiment of the present application can provide a high quality lactic acid bacteria raw material.
  • the membrane filter for preparing the medium may include a hollow fiber membrane filter including a diameter of a size capable of filtering impurities contained in the medium solution. The diameter may be 0.1 to 1 ⁇ m, but is not limited thereto.
  • the lactic acid bacteria may include those selected from the group consisting of bacilli, cocci, Bifido bacteria and combinations thereof.
  • bacilli cocci
  • Bifido bacteria for example, Lactobacillus plantarum , L. acidophilus , L. reuteri , L. gasseri , L. crispatus, L, rhamnosus , L. casei , L. sakei , L. curvatus , L. shirota , L. reuteri , L. fermentum , L. brevis Bacillus Bacillus and Lactococcus lactis , Lactococcus lactis subsp .
  • lactis Streptococcus thermophilus , Enterococcus aureus, such as faecium , Enterococcus facalis , and Bifidobacterium longum , B. lactis , B. lactis subsp . latis, B. infantis, B. breve, B. there may be mentioned a bipyridinium dogyun of aldolescence, and the like.
  • the effects of the present application may be more marked. .
  • the lactic acid bacteria live bacteria inoculated into the medium may be cultured through one or more culture steps.
  • the lactic acid bacteria live bacteria may be cultured through the step of species culture and intermediate culture.
  • the seed culture is preferably inoculated into a liquid medium of lactic acid bacteria, followed by 10 to 40 hours at a temperature of 20 °C to 40 °C, but is not limited thereto.
  • lactic acid bacteria can also be cultured in aerobic conditions.
  • the medium culture liquid medium may be adjusted to pH 4.0 to pH 8.0 prior to sterilization using an alkaline solution prepared in advance.
  • the composition (w / v%) of the intermediate culture medium was 2.0 to 10.0 w / v% hydrous glucose, 0.1 to 5.0 w / v% soy proteinase, 0.1 to 3.0 w / v% L-cysteine, 0.1 to 5.0 w / v% yeast extract, 0.01-3.0 w / v% potassium diphosphate, 0.1-5.0 w / v% magnesium sulfate, 0.01-0.1 w / v% manganese sulfate, 0.01-5.0 w / v% potassium citrate, 0.01 To 2.0 w / v% calcium chloride, 0.01 to 5.0 w / v% surfactant, but is not limited thereto.
  • the medium in which the lactic acid bacteria live bacteria are inoculated is prepared from the medium solution, the medium is to be produced by sterilization by filtering impurities or contaminants contained in the medium solution through the medium membrane filter Can be.
  • Conventional medium is usually sterilized with steam, etc., by the sterilization of the steam, such as carbohydrates, proteins, such as carbonized impurities are generated and remain in the medium, the quality of lactic acid bacteria powder may be degraded.
  • the impurities derived from medium, carbonization, etc. generated by conventional steam sterilization does not occur, it is possible to provide a high quality lactic acid bacteria raw material.
  • 0.1-5.0 w / v% yeast extract 0.01-3.0 w / v% potassium diphosphate
  • 0.1-5.0 w / v% magnesium sulfate 0.01-0.1 w / v% manganese sulfate
  • 0.01-2.0 w / v% It may include calcium chloride, or may include 0.1 to 10.0 w / v% whey powder and 0.1 to 10.0 w / v% chicory extract, but is not limited thereto.
  • the medium may further include 0.1 to 5.0 w / v% MgSO 4 and 0.01 to 0.5 w / v% CaCl 2 , but is not limited thereto.
  • the size of the lactic acid bacteria directly affects the absorption rate of the lactic acid bacteria, and in particular, the smaller the size of the lactic acid bacteria is, the higher the absorption rate of the lactic acid bacteria is and the biological efficacy is increased.
  • the size of the lactic acid bacteria live bacteria to be cultured can be easily adjusted.
  • the size of the live bacteria of the lactic acid bacteria to 1.0 ⁇ m or less, it is possible to maximize the absorption in the body.
  • the lactic acid bacteria living bacteria which are relatively small in size, are less aggregated in the subsequent sterilization process, and their sizes are relatively small, so that absorption in the body can be maximized.
  • the lactic acid bacteria live bacteria may be concentrated by filtering the impurities contained in the medium inoculated with the lactic acid bacteria live bacteria through the first membrane filter.
  • the size of the lactic acid bacteria living bacteria can be adjusted. Furthermore, impurities in the medium can be continuously removed, and lactic acid bacteria can be concentrated.
  • such impurities may be filtered through the first membrane filter, thereby exhibiting an effect of increasing the concentration of lactic acid bacteria or live bacteria. Furthermore, since such impurities are filtered, it is possible to simplify the washing process in the recovery process of lactic acid bacteria, it can also exhibit the effect of cost reduction and process simplification.
  • the medium in which the lactic acid bacteria live cells are inoculated may be maintained at pH 5.5 to 6.8 during the culture of the lactic acid bacteria live bacteria.
  • the optimal pH of the medium inoculated with the lactic acid bacteria may be different depending on the type of lactic acid bacteria.
  • a substance that maintains a constant pH may be added to the medium.
  • the material for maintaining the pH of the medium is, for example, sodium hydroxide (NaOH) solution, potassium hydroxide (KOH) solution, ammonia water or ammonia gas, but is not limited thereto.
  • lactic acid bacteria can be made by killing the lactic acid bacteria living cultured and concentrated as described above.
  • the lactic acid bacteria live bacteria may be sterilized by tines or heat treatment, but is not limited thereto.
  • the heat treatment may be performed for 3 to 15 minutes at a temperature of 80 °C to 121 °C.
  • the heat treatment may be performed by ultra high temperature sterilization 1 to 10 times.
  • the ultra high temperature sterilization may be performed at a temperature of 110 ° C to 130 ° C for 3.0 seconds to 10.0 seconds, for example, twice at 1.0 ° C to 10 seconds at 100 ° C and once at 1.0 ° C to 10.0 seconds at 121 ° C. It may be going.
  • the production method of lactic acid bacteria bacterium may further comprise adding a dispersant to the medium inoculated with the lactic acid bacteria live bacteria after the culture of the lactic acid bacteria live bacteria.
  • the dispersant may have an effect of preventing agglomeration which may occur during the sterilization process of the lactic acid bacteria live bacteria.
  • the dispersant may be added in an amount of 10.0% (w / w) to 80.0% (w / w) based on the pellet of the cultured and concentrated lactic acid bacteria.
  • the dispersant may be maltodextrin or trehalose, but is not limited thereto.
  • the lactic acid bacterium bacterium can be concentrated while passing through the second membrane filter a medium containing the sterilized lactic acid bacterium as described above.
  • the medium containing the lactic acid bacteria bacterium passes through the second membrane filter, the lactic acid bacteria bacterium, particularly, the lactic acid bacteria bacterium aggregated during the killing process of the lactic acid bacteria, may be exhibited by using the shear force applied to the medium. have. Further, by filtering the impurities contained in the medium, it can also exhibit the effect of washing the lactic acid bacteria.
  • the concentration of lactic acid bacteria can be preferably concentrated about 10 times, 9 times, 8 times, 7 times, 6 times or 5 times.
  • the lactic acid bacteria culture solution may be washed to filter impurities such as proteins, carbohydrates, lactic acid bacteria crushed products, except lactic acid bacteria.
  • the washing liquid for example, sterilized distilled water and distilled water containing 0.1 to 1.0 w / v% sodium chloride (NaCl) and the like, but is not limited thereto.
  • the washing solution may be added at 1.0 to 10 times the volume of the medium containing the concentrated lactic acid bacteria.
  • the drying may be lyophilization, fluidized bed drying or spray drying, but is not limited thereto.
  • the second aspect of the present application provides lactic acid bacteria killing bacteria produced by the above production method.
  • the third aspect of the present application provides an additive containing the above bacteria.
  • the lactic acid bacteria bacterium raw material prepared by the production method of the present application not only has a small particle size of lactic acid bacteria, but is evenly distributed and distributed. Furthermore, since a relatively small amount of impurities are present through the impurity filtration step by the first membrane filter and the second membrane filter, the production method according to the present invention may provide a high quality lactic acid bacteria raw material.
  • L. plantarum as used herein (LM1001) and L. plantarum (LM1004) was separated from Kimchi, a Korean traditional fermented food, at the Korea International University Department of Pharmaceutical Engineering [Address: 660-759, 965, Dongsan-ro, Munsan-eup, Jinju-si, Gyeongnam] L. plantarum (LM1001) and L.plantarum (LM1004) have been generally deposited with the Korean Culture Center of Microorganisms, respectively, KCCM 42959 (Deposit: November 12, 2010) and KCCM 43246 (Deposit: October 28, 2016).
  • the viable count of lactic acid bacteria increased during the culture was analyzed by colony counting method.
  • the medium used to analyze colonies of L. plantarum was MRS (Difco, USA) solid medium
  • the culture was analyzed by measuring the number of colonies generated after aerobic 48 hours at 37 °C.
  • the incubator used the JRS-150C model used previously.
  • the culture solution was diluted with peptone water to 10 7 , 10 8 , 10 9 multiples, and analyzed using a Pouring method while using 1.0 ml per Petri dish.
  • the composition (w / v%) of peptone water used for media dilution is as follows: 0.01 to 1.0 w / v% sodium chloride, 0.1 to 5.0 w / v% caseinase digest, 0.01 to 5.0 w / v% Sodium diphosphate, 0.01-1.0 w / v% potassium monophosphate was prepared and used after sterilization (121 ° C., 15 minutes).
  • the average number N avg was determined by measuring the number of dead bacteria in a total of 20 rooms of the hemocytometer using an optical microscope [BX 53F, Olympus, Japan] at 1,000 magnification. ml] were analyzed.
  • R is the dilution factor
  • HPLC Agilent Technology 1200, Agilent, USA
  • Amine-column NH 2, 300mm x 7.8mm, 9.0mm particle size, Bio-Rad, USA
  • 5 mM H 2 SO 4 solution 0.5 ml flow , respectively
  • the temperature of the column was maintained at 35 ° C. during the analysis, and samples were automatically injected through an autosampler (5.0 mL).
  • the analysis was performed using an Agilent Chemstation 1200 analysis program using a RI detector.
  • HK-probiotics Heat-killed probiotics
  • IL-4 interleukin -4
  • INF- ⁇ interferon-gamma
  • TNF- alpha TNF- ⁇
  • NO - Nitric oxide
  • viability viability
  • proliferative changes in the immune cells and the production were evaluated by analyzing.
  • L. plantarum (LM1001) was used to prepare lactic acid bacteria live bacteria and lactic acid bacteria dead bacteria samples prepared by the method of the present application.
  • Lactobacillus probiotic samples were analyzed by in-vivo test to measure the changes of cytokines in the blood of mice by oral administration of diluted live bacteria at a constant concentration.
  • the immunological activity of the bacterium was measured in mouse splenocytes and macrophages (RAW264.7). ) was carried out through in-vitro experiments to analyze changes in cytokines after treatment for each concentration by killing bacteria.
  • mice Six-week-old male Balb / c mice were used for sale at Samtaco Korea (Korea). Breeding environment was raised under a temperature of 22 ⁇ 2 °C, humidity 50 ⁇ 20%, 12 hours of illumination, the feed was fed a solid feed for mice, drinking water was unlimited drinking water. The animals were acclimated in the experimental animal room for one week before performing the experiment.
  • Lactobacillus probiotics of L. plantarum prepared by the preparation method of the present application was performed orally once daily for 10 days. 24 hours after the last oral administration, a blood sample was obtained from the experimental animals and stored at -80 ° C for use in the experiment. As a positive control, Con A was administered at 25 mg / kg.
  • Spleens are aseptically extracted from mice, washed with RPMI 1640 solution and then ground to liberate cells.
  • the separated cell suspension was passed through a 200 mesh stainless steel sieve and then centrifuged at 4 ° C. and 1,200 rpm for 3 minutes to suspend cell pellets in ACK buffer for 5 minutes to remove red blood cells.
  • Outflowed splenocytes were suspended in RPMI 1640 containing 10% fetal bovine serum and 1% penicillin-streptomycin, so that the concentration of cells was 1 ⁇ 10 6 cells / ml, and 500 ⁇ l was dispensed into 48 well plates.
  • Lactobacillus bacteria of L. plantarum prepared by the method of the present invention were treated by concentration. Lipopolysaccharide and Con A were sampled into positive controls and treated with cells.
  • Splenocytes and RAW 264.7 cells were cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum, 100 units / mL of streptomycin and penicillin at 37 ° C., 5% CO 2 , and their effects on NO and cell proliferation. It was used to find out.
  • HRP horseradish peroxidase
  • Macrophage lines RAW 264.7 cells were dispensed in 9 6 well plates at a concentration of 5 ⁇ 10 5 cells / ml and incubated for 24 hours, and then treated with 1 mg / ml of LPS as a positive control and phosphate buffer solution as a negative control. .
  • the L.plantarum (LM1001) bacterium sample prepared by the method of the present invention was treated and then incubated again for 24 hours.
  • the concentration of NO was measured using a Greases reagent system (Sigma, USA). 50 ⁇ l culture solution is added to a 96 well plate, and grease Reagent I (NED solution) and Grease Reagent II (sulfanylamide solution) are mixed in the same amount, and then reacted in a dark room for 10 minutes, and within 30 minutes, a microplate reader (Tecan, Austria) at 540 nm. The concentration of NO was calculated using a standard curve of sodium nitrite (0-100 micromol).
  • Proliferation of splenocytes and RAW 264.7 cells was determined by WST-1 assay. Splenocytes and RAW 264.7 cells were adjusted to a concentration of 5 ⁇ 10 5 cells / well and dispensed into 96 well plates, followed by incubation for 48 hours with treatment of samples and controls. 100 ⁇ l of WST-1 kit solution was added and incubated for 1 hour, and the absorbance was measured at 540 nm using an ELISA reader (Thermo, Germany).
  • LN is a logarithmic expression
  • t 1 represents the concentration of lactic acid bacteria live bacteria at a specific time t 1
  • t 2 represents the concentration of lactic acid bacteria living bacteria at a specific time t 2
  • t represents the elapsed time.
  • the total bacterium density of the lactic acid bacteria bacterium powder prepared by culturing according to the production method of the present application was 5.2E + 12 / g, and the total bacterial density of the lactic acid bacteria bacterium powder prepared through the batch culture was 2.9E + 12 / g. It was the end.
  • the cytotoxicity and nitric oxide production-inducing functions of lactic acid bacteria were investigated using RAW264.7 macrophages according to the procedure described in the above method.
  • the production capacity of NO was increased by about 6 times by LPS, a positive control, and it was confirmed that the concentrations were significantly increased in all of the treated lactic acid bacteria samples.
  • Figure 14 shows the effect of lactic acid bacteria bacterium powder in cytokine production using mouse spleen cells.
  • Figure 14 (A) shows that the splenocyte cytotoxicity does not appear below 0.1 to 10mg / ml treatment concentration of the lactic acid bacteria killing bacteria powder described above.
  • 14 (B), (C), (D), and (E) show that the treatment of the lactic acid bacteria killing powder increases the production of cytokines significantly in concentration.
  • the lactic acid bacteria of both species were found to be immune enhancing function in live bacteria and dead bacteria, it can be seen that it exhibits immune activity.
  • LM1004 has an effect of inhibiting lipid accumulation in adipocytes.

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Abstract

본원은, 배양기 및 막 필터를 포함하는 생물반응기를 이용한 유산균 사균의 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조된 사균에 관한 것이다.

Description

막 필터를 이용한 고농도 사균의 제조방법 및 이의 제조방법으로 제조된 사균
본원은, 배양기 및 막 필터를 포함하는 생물반응기를 이용한 유산균 사균의 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조된 사균에 관한 것이다.
국제보건기구(World Health Organization, WHO)에서 지정한 프로바이오틱스의 정의는 적절한 양으로 적용되었을 때 숙주에 건강 이익을 줄 수 있는 살아있는 미생물(A live microorganisms that, when administered in adequate amounts, confer a health benefit on the host)로 제한하고 있다. 그러나 최근 유산균의 프로바이오틱스의 상용화가 빠른 속도로 확대 증가하면서 프로바이오틱스 시장에서 사균체 또한 프로바이오틱스로 사용되고 있다.
사균체로서의 프로바이오틱스는 생균제 보다 다양한 장점을 가지고 있으며 일본과 미국에서는 이미 상용화되고 있는 실정에 있다. 사균제 프로바이오틱스는 생균제 보다는 안정적(stability)으로 사용이 가능하여 산업적 적용의 범위가 넓고, 유통과정에서 다루기가 쉽고, 일반식품에도 첨가되어 식품의 기능성을 강화하면서 면역조절기능에서 생균제와 동일한 효과를 보이는 등 최근 그 시장이 크게 증가되고 있다.
이러한 사균 제조방법의 종래기술로는, 회분식 배양방법이 있다. 상기 회분식 배양방법은, 통상적으로 대용량 배지에 유산균 성장용 배지와 유산균을 첨가하여 배양시킨 후에, 상기 배양된 유산균을 가열하여 사균화하는 단계를 포함한다(대한민국 공개특허 제10-2012-0047792호).
그러나, 이러한 회분식 배양에 의한 사균에는 다음과 같은 단점이 있다. 첫 번째로, 유산균의 배양 중에 유산균의 크기를 조절할 수 없으므로, 생체에 용이하게 흡수될 수 없는 크기까지 성장할 수 있다. 두 번째로는, 유산균의 배양 중에 발생하는 불순물을 신속하게 여과할 수 없으므로, 유산균을 세척하기 위한 별도의 공정을 필요로 하고, 유산균 배양 시간이 상대적으로 오래 걸릴 수 있다. 세 번째로, 배양중인 유산균이 포함된 배지 중에서 배지 자체의 불순물 또는 배양 중인 유산균이 생성한 불순문만을 선택적으로 제거할 수 없다. 따라서, 배양중인 유산균이 포함된 배지 중에서 유산균만을 선별하여 농축할 수 없으므로, 고농도 및 고품질의 유산균을 제조할 수 없다. 회분식 배양으로 제조된 유산균은 특히, 열처리 과정에서 유산균끼리 뭉치면서 입자의 크기가 증가한다. 이에 따라, 회분식 배양으로 제조한 유산균 원말이 식품 또는 음료에 첨가될 경우, 침전되어 현탁 현상을 일으킨다.
상기와 같은 종래기술의 단점을 해결하기 위하여, 본원은, 배양기 및 막 필터를 포함하는 생물반응기를 이용한 유산균 사균의 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조된 사균을 제공하고자 한다.
그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본원의 제 1 측면은, 배양기 및 막 필터를 포함하는 생물반응기를 이용한 유산균 사균의 제조방법으로서, 상기 막 필터는 제 1 막 필터 및 제 2 막 필터를 포함하고,상기 생물반응기는 상기 배양기에 첨가된 유체가 각각 독립적으로 상기 제 1 막 필터 및 상기 제 2 막 필터를 통과하여 다시 상기 배양기에 전달되는 구조를 포함하며, 유산균 생균이 접종된 배지를 상기 배양기에 첨가하고; 상기 유산균 생균이 접종된 배지를 상기 제 1 막 필터에 통과시키면서 상기 유산균 생균을 배양 및 농축하며; 상기 배양 및 농축된 유산균 생균을 사균화하여 유산균 사균을 만들고; 상기 유산균 사균이 포함된 배지를 상기 제 2 막 필터에 통과시키면서 상기 유산균 사균을 농축하며; 및 상기 농축된 유산균 사균을 건조시키고 분말화하는 것을 포함하는, 유산균 사균의 제조방법을 제공한다.
본원의 제 2 측면은, 상기의 제조방법으로 제조된 유산균 사균을 제공한다.
본원의 제 3 측면은, 상기의 사균을 포함하는 첨가제를 제공한다.
본원의 구현예들에 의하면, 상기 제 1 막 필터 및 제 2 막 필터를 이용하여 상기 유산균 생균에 전단력을 가함으로써, 상기 유산균의 크기를 용이하게 조절할 수 있으며, 특히 상기 유산균의 크기를 작게 조절할 수 있다. 이에 따라, 본원의 제조방법으로 제조된 유산균은 체내에 효과적으로 흡수될 뿐만 아니라, 체내에 효과적으로 흡수되어 면역활성 및 항-비만효과를 나타낼 수 있다.
그리고, 본원의 구현예들에 의하면, 상기 제 1 막 필터 및 제 2 막 필터를 이용하여 상기 유산균을 제외한 단백질, 탄수화물, 유산균 파쇄물 등의 불순물을 여과할 수 있으므로, 고농도의 유산균 사균을 제공할 수 있다.
나아가, 본원의 구현예들에 의할 경우, 유산균의 세척 공정을 간소화 하거나 별도의 세척 공정을 필요로 하지 않을 수 있으므로, 유산균 생균 및/또는 사균의 제조 시간을 단축시킬 수 있다.
또한, 본원의 구현예들에 의하면, 유산균 사균이 포함된 배지를 상기 제 2 막 필터에 통과시켜, 뭉쳐진 유산균 덩어리를 분산시킴으로써, 고품질의 유산균 사균을 제공할 수 있다. 이러한 고품질의 유산균을 포함하는 사균 원말은 식품, 기능성 식품 또는 사료에 첨가될 경우, 침전 현상을 일으키지 않으므로, 우수한 유통성 및 저장성의 효과를 나타낼 수 있다.
도 1은, 본원의 일 구현예에 따른 유산균 사균 제조방법의 개략도이다.
도 2는, 본원의 일 구현예에 따른 배양기 및 막 필터를 포함하는 생물반응기(a)와 종래의 회분식 유산균 배양기(b)의 구조를 비교한 개략도이다.
도 3은, 본원의 일 실시예에 따라 배양 및 농축된 유산균 생균(LM1001, LM1004)과 비교예 1 에 따라 배양된 유산균 생균의 생산성, 성장속도, 및 농도를 나타낸 그래프이다.
도 4는, 본원의 일 실시예에 따라 동결건조된 유산균 사균과 비교예 1 에 따라 제조된 유산균 사균을 주사형 전자형미경사진을 비교한 것이다(SEM, X10,000).
도 5a는, 본원의 일 실시예에 따라 배양 및 농축된 유산균 생균(우측)과 비교예 1에 따라 배양된 유산균 생균(좌측)의 크기를 비교한 것이다(광학, X1,000).
도 5b는, 본원의 일 실시예에 따라 사균화된 유산균 사균(우측)과 비교예 1에 따라 제조된 유산균 사균(좌측)의 크기를 비교한 것이다(광학, X 1,000).
도 6은, 본원의 일 실시예에 따라 배양 및 농축된 유산균 생균과 비교예 1 에 따라 배양된 유산균 생균의 크기 분포를 비교한 그래프이다.
도 7은, 본원의 일 실시예에 따라 사균화된 유산균 사균과 비교예 1 에 따라 제조된 유산균 사균의 크기 분포를 비교한 그래프이다.
도 8은, 본원의 일 실시예에 따른 제조방법에서, 유산균 생균(좌측: LM1001, 우측: LM1004)의 배양 및 농축 직후(첫째줄), 사균화 직후(둘째줄), 및 농축 및 세척 직후(셋째줄) 각각의 유산균 크기를 나타낸 것이다(광학, X 1,000).
도 9는, 본원의 일 실시예에 따라 제조된 유산균 사균을 제 2 막 필터에 통과시키기 전, 후의 크기 변화를 비교한 그래프이다.
도 10은, 본원의 일 실시예(좌측) 및 비교예(우측)에 따라 제조된 유산균 사균의 원말의 성상, 즉 색도를 비교한 사진이다.
도 11은, 본원의 일 실시예(11b, 11d) 및 비교예(11a, 11c)에 따라 제조된 유산균 사균의 원말을 증류수에 현탁시킨 결과를 비교하여 나타낸 것이다.
도 12는, 본원의 일 실시예에 따른 유산균 생균의 면역 활성을 나타낸 그래프이다.
도 13은, 본원의 일 실시예에 따른 유산균 사균의 면역활성을 나타낸 그래프로서, 대식세포(macrophage)의 일종인 RAW264.7세포주를 이용하여 세포독성(LDH)과 일산화질소(Nitric oxide)의 생성정도를 측정한 그래프이다.
도 14는, 본원의 일 실시예에 따른 유산균 사균의 면역활성을 나타낸 그래프로서, 마우스 비장세포(Splenocyte)를 이용하여 세포 독성(LDH)과 TNF-α, INF-γ, IL-12, IL-4의 생성정도를 측정한 그래프이다.
도 15는, 본원의 일 구현예에 따른 유산균 사균의 항 비만효과를 나타낸 사진 및 그래프로서, 처리된 유산균 사균의 농도증가에 반비례적으로 실험된 지방세포 내에서 지방축적이 감소되고 있음을 보이는 사진과 그래프이다.
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 “연결”되어 있다고 할 때, 이는 “직접적으로 연결”되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 “전기적으로 연결”되어 있는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 “상에” 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 “포함” 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “약”, “실질적으로” 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “~(하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~ 를 위한 단계”를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 “이들의 조합(들)”의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, “A 및/또는 B”의 기재는 “A 또는 B, 또는 A 및 B”를 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "생물반응기"의 기재는 "유산균 등의 미생물을 제조할 수 있는 통상의 시스템 전체"를 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "배양액"의 기재는 "유산균을 포함하는 배지"를 의미하며, "유산균 생균이 접종된 배지", "유산균 사균이 포함된 배지", "막필터를 이용하여 배양 및 농축된 유산균이 포함된 배지", "막필터를 이용하여 농축, 분산 및 세척된 유산균이 포함된 배지"를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원 명세서 전체에서, "유산균의 크기" 기재는 유산균 한 마리 또는 한 개체의 크기를 의미하며, 유산균의 종류 및 형태에 따라 구체적인 측정방법이 상이하다. 상기 유산균이 간균인 경우, 간균의 길이를 의미하는 것이 아니라, 간균의 두께 혹은 폭을 의미한다. 상기 유산균이 구균인 경우, 구균의 직경을 의미한다. 비피도 유산균 등 기타 유산균의 경우, 통상의 기술자에게 통용되는 크기의 기준으로 측정한 크기를 의미하는 것이다.
이하, 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 1 측면은, 배양기 및 막 필터를 포함하는 생물반응기를 이용한 유산균 사균의 제조방법으로서, 상기 막 필터는 제 1 막 필터 및 제 2 막 필터를 포함하고, 상기 생물반응기는 상기 배양기에 첨가된 유체가 각각 독립적으로 상기 제 1 막 필터 및 상기 제 2 막 필터를 통과하여 다시 상기 배양기에 전달되는 구조를 포함하며, 유산균 생균이 접종된 배지를 상기 배양기에 첨가하고; 상기 유산균 생균이 접종된 배지를 상기 제 1 막 필터에 통과시키면서 상기 유산균 생균을 배양 및 농축하며; 상기 배양 및 농축된 유산균 생균을 사균화하여 유산균 사균을 만들고; 상기 유산균 사균이 포함된 배지를 상기 제 2 막 필터에 통과시키면서 상기 유산균 사균을 농축하며; 및 상기 농축된 유산균 사균을 건조시키고 분말화하는 것을 포함하는, 유산균 사균의 제조방법을 제공한다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 생물반응기는 제 1 막 필터 및 제 2 막 필터를 포함함으로써, 제 1 막 필터를 통과하는 유산균 생균 및 제 2 막 필터를 통과하는 유산균 사균에 전단력을 가할 수 있다. 본원의 일 구현예에 따른 제조방법은 상기 유산균 생균 및 유산균 사균에 전단력을 가함으로써, 상기 유산균의 크기를 용이하게 조절할 수 있으며, 특히 상기 유산균의 크기를 작게 조절할 수 있다. 이에 따라, 본원의 일 구현예에 따른 제조방법으로 제조된 유산균은 체내에 효과적으로 흡수될 뿐만 아니라, 체내에 효과적으로 흡수되어 면역활성 및 항-비만효과를 나타낼 수 있다.
여기에서, 상기 막 필터를 통과하는 유체에 가해지는 전단력의 크기는 하기 식 1의 Hargen-Poiseuiller의 방정식으로 표현될 수 있다.
[식 1]
Figure PCTKR2017012086-appb-I000001
상기 식 1에서, j (관을 따라 흐르는 유체의 전단력), m (유체의 점도), Q (유체의 흐름 속도), r (관의 반경) 그리고 L (관의 길이)를 나타낸다. 또한 배양 중에 상기 유체의 흐름속도는 전단력을 조절하는 중요인자로 작용 할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 배양기 및 막 필터를 포함하는 생물반응기는 바람직하게는 배양기, 제 1 막 필터 및 제 2 막 필터를 포함할 수 있다. 여기에서, 상기 생물반응기는 상기 배양기에 첨가된 유체가 상기 제 1 막 필터 및 제 2 막 필터를 각각 독립적으로 통과하여 다시 상기 배양기에 전달되는 구조를 포함할 수 있다. 도 2의 (a)는, 막 필터(⑥)가 제 1 막 필터 및 제 2 막 필터를 모두 포함하는 생물반응기의 일 개략도이며, 상기 유체가 제 1 막 필터를 통과하여 상기 배양기에 전달된 후에, 상기 유체가 제 2 막 필터를 통과하여 상기 배양기에 전달될 수 있다. 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 제 1 막 필터와 제 2 막 필터는 도 2의 (a)에서와 달리, 상호 독립적인 공간에 존재할 수 있다.
나아가, 상기 생물반응기는 배지 제조용 탱크 및 배지 제조용 막 필터를 추가로 포함할 수 있다. 여기에서, 상기 배지 제조용 탱크에서 제조된 배지는 상기 배지 제조용 막 필터를 통과하여 다시 배지 제조용 탱크에 전달될 수 있거나 상기 배양기에 전달될 수 있다. 상기 배지 제조용 막 필터를 통과한 배지가 배양기에 전달되는 경우, 상기 배지가 배지 제조용 막 필터를 통과하여 직접 배양기에 전달되 수 있다. 또한, 도 2의 (a)에서와 같이, 상기 배지가 배양기에 전달되기 전에 저장용 탱크(③)에 저장된 후에, 상기 배양기에 전달될 수 있다.
상기 유산균 생균이 접종된 배지를 제 1 막 필터에 통과 시킴으로써, 상기 유산균 생균을 배양 및 농축할 수 있다. 그리고, 상기 배양 및 농축된 상기 유산균 생균을 사균화하여 제조된 유산균 사균이 포함된 배지를 상기 제 2 막 필터에 통과시킴으로써, 상기 유산균 사균을 농축, 분산시킬 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 제 1 막 필터는 상기 유산균 생균이 접종된 배지에 포함된 불순물을 여과시키면서 유산균 생균은 여과시키지 않는 크기의 직경을 가지는 포어를 포함하는 중공사막 필터일 수 있다. 상기 제 1 막 필터의 포어 직경의 크기는, 예를 들어, 0.1 ㎛ 내지 1.0 ㎛, 0.2 ㎛ 내지 1.0 ㎛, 0.3 ㎛ 내지 1.0 ㎛, 0.4 ㎛ 내지 1.0 ㎛, 0.5 ㎛ 내지 1.0 ㎛, 0.1 ㎛ 내지 0.9 ㎛, 0.1 ㎛ 내지 0.8 ㎛, 0.1 ㎛ 내지 0.7 ㎛, 0.1 ㎛ 내지 0.6 ㎛ 또는 0.1 ㎛ 내지 0.5 ㎛ 일 수 있다. 상기 제 1 막 필터의 포어 직경의 크기가 0.1 ㎛ 미만일 경우, 상기 유산균 생균의 배양 과정에서 극심한 파울링 현상이 발생하여, 배양액의 플럭스가 감소하게 된다. 이에 따라, 상기 유산균 생균의 농축 효율이 감소하는 문제가 발생할 수 있다. 상기 제 1 막 필터의 포어 직경의 크기가 1.0 ㎛ 초과일 경우, 상기 유산균 생균이 불순물과 함께 막을 통하여 여과되는 문제가 발생할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 제 2 막 필터는 상기 유산균 생균의 배양 및 농축 과정 및/또는 사균화 과정에서 크기가 작아진 유산균을 농축할 수 있는 크기의 직경을 가지는 포어를 포함하는 중공사막 필터일 수 있다. 상기 제 2 막 필터의 포어 직경의 크기는, 예를 들어, 0.01 ㎛ 내지 0.1 ㎛, 0.02 ㎛ 내지 0.1 ㎛, 0.03 ㎛ 내지 0.1 ㎛, 0.04 ㎛ 내지 0.1 ㎛, 0.05 ㎛ 내지 0.1 ㎛, 0.01 ㎛ 내지 0.09 ㎛, 0.01 ㎛ 내지 0.08 ㎛, 0.01 ㎛ 내지 0.07 ㎛, 0.01 ㎛ 내지 0.06 ㎛ 또는 0.01 ㎛ 내지 0.05 ㎛ 일 수 있다. 상기 제 2 막 필터의 포어 직경의 크기가 0.01 ㎛ 미만일 경우, 상기 유산균 사균의 농축 과정에서 극심한 파울링 현상이 발생하여, 배양액의 플럭스가 감소하게 된다. 이에 따라, 상기 유산균 사균의 농축 효율이 감소하는 문제가 발생할 수 있다. 상기 제 2 막 필터의 포어 직경의 크기가 0.1 ㎛ 초과일 경우, 상기 유산균 사균이 불순물과 함께 막을 통하여 여과되는 문제가 발생할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 제 1 막 필터 및 제 2 막 필터는 각각 독립적으로, 6.0 mm 이하의 반경을 가지는 중공사막 필터를 포함할 수 있다. 상기 중공사막 필터의 반경이 6.0 mm 이하인 경우, 상기 식 1 에 따라, 유산균 생균 또는 사균에 가해지는 전단력을 증가시킬 수 있다. 이에 따라, 상기 유산균 생균 또는 사균의 크기를 작게 조절할 수 있고, 분산도를 증가시킬 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 제 2 막 필터는 50,000 달톤 내지 100,000 달톤의 분자량을 가지는 물질을 여과할 수 있는 중공사막필터를 포함할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 생물반응기는 압력계 및/또는 유량계를 포함할 수 있다. 여기에서, 상기 압력계는 막 필터의 파울링(fouling) 현상을 관리하기 위한 것이며, 상기 유량계는 유산균에 가해지는 전단력을 조절하기 위하여 막 필터를 통과하는 배양액의 흐름속도(Q)를 실시간으로 측정하기 위한 것이다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 생물반응기는 배지 제조용 탱크 및 배지 제조용 막 필터를 추가로 포함할 수 있다. 상기 배지는 유산균 생균의 배양에 필요한 영양분을 공급하는 역할을 하며, 배지 용액을 살균하여 제조할 수 있다. 종래의 배지는 통상적으로 스팀 등으로 살균되었는데, 상기 스팀 등의 살균에 의할 경우, 탄수화물, 단백질 등이 열에 의해 탄화된 불순물이 발생하여 배지 내에 잔존함으로써, 유산균 분말의 품질이 떨어지는 문제가 발생할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 생물반응기가 배지 제조용 탱크 및 배지 제조용 막 필터를 포함하는 경우, 상기 배지 제조용 막 필터를 이용하여 배지 용액에 포함된 불순물을 여과함으로써, 배지 용액 내에 탄화에 의한 불순물의 생성을 방지할 수 있다. 이에 따라, 본원의 일 구현예에 따른 제조 방법은 고품질의 유산균 원말을 제공할 수 있다. 여기에서, 상기 배지 제조용 막 필터는 배지 용액에 포함된 불순물을 여과할 수 있는 크기의 직경을 포함하는 중공사막 필터를 포함할 수 있다. 상기 직경은 0.1 내지 1 ㎛ 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유산균은 간균, 구균, 비피도균 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어서, Lactobacillus plantarum, L. acidophilus, L. reuteri , L. gasseri , L. crispatus, L, rhamnosus, L. casei, L. sakei, L. curvatus, L. shirota, L. reuteri, L. fermentum , L. brevis 등의 간균과 Lactococcus lactis, Lactococcus lactis subsp . lactis, Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecium, Enterococcus facalis등의 구균, 그리고 Bifidobacterium longum, B. lactis, B. lactis subsp . latis, B. infantis, B. breve, B. aldolescence, 등의 비피도균을 예시할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유산균이 L. plantarum(LM1001, 기탁 번호 KCCM 42959) 또는 L. plantarum(LM1004, 기탁 번호 KCCM 43246) 를 포함하는 경우, 본원의 효과가 보다 더 현저하게 나타날 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 배지에 접종되는 유산균 생균은, 1 단계 이상의 배양 단계를 거쳐서 배양된 것일 수 있다. 예를 들어서, 상기 유산균 생균은 종배양 및 중간배양의 단계를 거쳐서 배양된 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 종배양은 유산균 생균을 액체 배지에 접종시킨 다음에, 20℃ 내지 40℃ 의 온도에서 10 시간 내지 40 시간 동안 이루어지는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 여기에서, 상기 유산균의 종류에 따라 비호기 조건으로 종배양 할 수도 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 종배양의 액체 배지는 미리 제조된 알칼리용액을 이용하여 살균전에 pH 4.0 내지 pH 8.0으로 조정될 수 있다. 상기 종배양배지의 조성(w/v%)은, 2.0 내지 10.0 w/v% 함수결정포도당, 0.1 내지 5.0 w/v% 대두단백효소분해물, 0.1 내지 5.0 w/v% 카제인효소분해물, 0.1 내지 5.0 w/v% 효모추출물, 0.01 내지 3.0 w/v% 제2인산칼륨, 0.1 내지 5.0 w/v% 황산마그네슘, 0.01 내지 1.0 w/v% 염화칼슘, 0.01 내지 0.1 w/v% 황산망간, 0.01 내지 5.0 w/v% 초산나트륨을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 중간배양은 상기 종배양된 유산균 생균을 양적으로 증가시키는 배양으로서, 상기 종배양과 제 1 막필터를 이용한 유산균 생균의 배양 및 농축 사이에 진행될 수 있다. 상기 중간배양은 종배양의 조건과 동일한 조건으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 중간배양은, 상기 종배양배지 0.1 v/v% 내지 5.0 v/v%을 중간배양배지에 접종하면서 시작될 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 중간배양의 액체 배지는 미리 제조된 알칼리 용액을 이용하여 살균 전에 pH 4.0 내지 pH 8.0으로 조정될 수 있다. 상기 중간배양배지의 조성(w/v%)은 2.0 내지 10.0 w/v% 함수결정포도당, 0.1 내지 5.0 w/v% 대두단백효소분해물, 0.1 내지 3.0 w/v% L-시스테인, 0.1 내지 5.0 w/v% 효모추출물, 0.01 내지 3.0 w/v% 제2인산칼륨, 0.1 내지 5.0 w/v% 황산마그네슘, 0.01 내지 0.1 w/v% 황산망간, 0.01 내지 5.0 w/v% 구연산포타슘, 0.01 내지 2.0 w/v% 염화칼슘, 0.01 내지 5.0 w/v% 계면활성제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 1 단계 이상의 배양 단계를 거쳐서 배양된 유산균 생균 또는 상기 1 단계 이상의 배양 단계를 거치지 않은 유산균 생균을 배지에 접종시킨 후에, 상기 유산균 생균이 접종된 배지를 상기 배양기에 첨가한다. 이후, 상기 유산균 생균이 접종된 배지를 제 1 막 필터에 통과시키면서 상기 유산균 생균을 배양함과 동시에 농축할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유산균 생균이 접종되는 배지는 배지 용액으로부터 제조되는 것이며, 상기 배지는 상기 배지 용액에 포함된 불순물 또는 오염균등이 상기 배지 막 필터를 통하여 여과됨으로써 살균되어 제조되는 것일 수 있다. 종래의 배지는 통상적으로 스팀 등으로 살균되었는데, 상기 스팀 등의 살균에 의할 경우, 탄수화물, 단백질 등이 탄화된 불순물이 발생하여 배지 내에 잔존함으로써, 유산균 분말의 품질이 떨어지는 문제가 발생할 수 있다. 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 배지 막 필터를 통하여 배지를 살균하는 과정에서 종래의 스팀살균으로 발생하는 배지 유래 불순물, 탄화 등에 의한 불순물이 발생하지 않으므로, 고품질의 유산균 원말을 제공할 수 있다.
여기에서, 상기 배지 유래 불순물은 열에 의해 변성된 비 수용성 단백질, 열에 의해 파괴된 비타민 또는 영양 성분, 열에 의해 분해되거나 갈변화된 포도당 성분들일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유산균 생균이 접종되는 배지는 상기 유산균 생균이 성장 및/또는 배양될 수 있는 것이면 충분한 것이고, 예를 들어서, 1.0 내지 10.0 w/v% 함수결정포도당, 0.1 내지 5.0 w/v% 대두단백효소분해물, 0.1 내지 5.0 w/v% 효모추출물, 0.01 내지 3.0 w/v% 제2인산칼륨, 0.1 내지 5.0 w/v% 황산마그네슘, 0.01 내지 0.1 w/v% 황산망간, 0.01 내지 2.0 w/v% 염화칼슘을 포함할 수 있거나, 0.1 내지 10.0 w/v% 유청분말과 0.1 내지 10.0 w/v% 치커리추출물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 나아가, 상기 배지는 추가로 0.1 내지 5.0 w/v% MgSO4와 0.01 내지 0.5 w/v% CaCl2 을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유산균 생균의 크기는, 상기 유산균 생균이 접종된 배지가 상기 제 1 막 필터를 통과하는 동안 상기 배지에 가해진 전단력에 의해서 조절될 수 있다. 상기 전단력은 유산균 생균이 접종된 배지의 흐름 속도에 의해서 조절되는 것일 수 있다. 상기 전단력은, 상기 유산균 생균이 접종된 배지가 통과하는 제 1 막 필터의 중공사막 내부의 채널크기(반경), 배지의 점도 및 흐름 속도 등으로 제어할 수 있다(상기 식 1 참조).
종래의 회분식 유산균 배양법에 의하면, 유산균의 크기를 작게 조절하는 것이 용이하지 않는 문제점이 있었다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 본원은 상기 유산균이 포함된 배지에 전단력을 가하여 배양중인 유산균에 스트레스를 가함으로써, 상기 유산균의 크기를 용이하게 조절할 수 있다.
상기 유산균의 크기는 유산균의 체내 흡수율에 직접적으로 영향을 미친다고 알려져 있으며, 특히 그 크기가 작을수록 유산균의 체내 흡수율이 높아지며 생물학적 효능이 증가한다고 알려져 있다.
본원의 제조방법에 의할 경우, 상기 식 1에서 나타낸 바와 같이, 제1 막 필터를 통과하는 배지의 흐름속도를 통제함으로써, 상기 배지에 가해지는 전단력을 조절할 수 있다. 이에 따라, 배양되는 유산균 생균의 크기를 용이하게 조절할 수 있다. 바람직하게는, 상기 유산균의 생균의 크기를 1.0 ㎛ 이하로 조절하여, 체내 흡수율을 극대화할 수 있다. 상기와 같이 크기가 상대적으로 작게 조절된 유산균 생균은, 이후 사균화 과정에서도 덜 뭉치고, 그 크기가 상대적으로 작아져서, 체내 흡수가 극대화될 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유산균 생균은, 상기 유산균 생균이 접종된 배지에 포함된 불순물이 상기 제 1막 필터를 통하여 여과됨으로써 농축되는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유산균 생균을 제 1 막 필터에 통과시킴으로써, 상기 유산균 생균의 크기를 조절할 수 있다. 나아가, 상기 배지 내의 불순물을 연속적으로 제거할 수 있고, 유산균 생균을 농축할 수 있다.
통상의 회분식 유산균 배양 과정에서는, 상기 유산균 생균이 접종된 배지에 단백질, 탄수화물, 유기산, 균체 파쇄물 등의 불순물이 배지에 축적되어, 유산균을 공격하여 유산균의 성장을 제한함으로써, 유산균의 최종 농도를 떨어뜨리는 문제를 발생시키게 된다.
그러나, 본원의 제조방법에 의할 경우, 이러한 불순물은 상기 제 1 막 필터를 통하여 여과됨으로써, 유산균 생균 또는 사균의 농도를 높이는 효과를 나타낼 수 있다. 나아가, 이러한 불순물이 여과됨으로써, 유산균의 회수 과정에서 세척 공정을 단순화 시킬 수 있으므로, 비용 절감 및 공정 단순화의 효과도 나타낼 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유산균 생균이 접종된 배지가 상기 유산균 생균의 배양 동안 pH 5.5 내지 6.8 으로 유지되는 것일 수 있다. 상기 유산균 생균이 접종된 배지의 최적 pH 는 유산균의 종류에 따라 상이할 수 있다. 본원의 일 구현예에 있어서, 배양 중에 유산균에 의해 생산되는 유기산이 상기 배지의 pH를 낮추는 경우, pH를 일정하게 유지하는 물질을 배지에 첨가할 수 있다. 상기 배지의 pH를 일정하게 유지하는 물질은, 예를 들어, 수산화나트륨(NaOH)용액, 수산화칼륨(KOH)용액, 암모니아수 또는 암모니아가스 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기와 같이 배양 및 농축된 유산균 생균을 사균화하여 유산균 사균을 만들 수 있다. 상기 유산균 생균은 틴들 또는 열처리에 의하여 사균화 될 수 있으나, 이제 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 열처리는 80℃ 내지 121℃의 온도에서 3 분 내지 15 분 동안 진행되는 것일 수 있다. 또한, 상기 열처리는 1 회 내지 10 회의 초고온살균(ultra high temperature sterilization)으로 진행될 수 있다. 상기 초고온살균은 110℃ 내지 130℃의 온도에서 3.0 초 내지 10.0 초 동안 진행되는 것일 수 있으며, 예를 들어서, 100℃에서 1.0 초 내지 10 초 동안 2 회, 121℃에서 1.0 내지 10.0 초 동안 1 회 진행되는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 유산균 사균의 제조방법은, 상기 유산균 생균의 배양 이후에, 분산제를 상기 유산균 생균이 접종된 배지에 첨가하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 분산제는, 상기 유산균 생균의 사균화 과정 중에서 발생할 수 있는 뭉침 현상을 예방하는 효과를 나타낼 수 있다.
상기 분산제는 상기 배양 및 농축된 유산균 생균의 펠렛에 대하여 10.0% (w/w) 내지 80.0% (w/w)로 첨가하는 것일 수 있다. 상기 분산제로는, 말토덱스트린 또는 트레할로스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현에에 있어서, 상기와 같이 사균화된 유산균 사균이 포함된 배지를 제 2 막 필터에 통과시키면서 상기 유산균 사균을 농축 할 수 있다. 상기 유산균 사균이 포함된 배지가 제 2 막 필터를 통과하게 되면, 상기 배지에 가해진 전단력을 이용하여 유산균 사균, 특히, 상기 유산균의 사균화 과정에서 뭉쳐진 유산균 사균 덩어리를 분산시킬 수 있는 효과를 나타낼 수 있다. 나아가, 배지에 포함된 불순물이 여과됨으로써, 상기 유산균 사균을 세척할 수 있는 효과도 나타낼 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유산균 사균이 포함된 배지를 제 2 막 필터에 통과시키면, 상기 유산균 사균의 세척 및 농축을 극대화시킬 수 있다. 이러한 제조방법에 의할 경우, 유산균 사균의 농도를 바람직하게는 약 10 배, 9 배, 8 배, 7 배, 6 배 또는 5 배 농축시킬 수 있다.
이후, 상기 유산균 사균은 세척된 후에, 건조시켜서 분말화되는 것일 수 있다. 본원의 제조방법에 따라 제조된 유산균 사균의 분말은 용매에서 침전현상을 발생시키지 않는 효과를 나타낼 수 있다. 본원의 제조방법에 의할 경우, 상기 유산균 생균은 제 1 막 필터를 통과하면서 전단력에 의하여 크기가 조절될 수 있다. 상기 크기가 조절된 유산균 생균은 사균화 과정에서 뭉쳐서 덩어리를 형성할 수 있지만, 상기 유산균 사균 덩어리는 제 2 막 필터를 통과하면서 전단력에 의하여 분산될 수 있다. 따라서, 상기 분산된 유산균 사균을 분말화하더라도 유산균 사균의 뭉침현상이 발생하지 않으므로, 용매에서의 침전현상을 예방할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 유산균 배양액은 유산균을 제외한 단백질, 탄수화물, 유산균 파쇄물 등의 불순물을 여과하기 위하여 세척될 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 제 2 막 필터에 의한 유산균 세척의 효과를 극대화 하기 위하여, 세척액을 배양기에 첨가한 후에 상기 사균을 제 2 막 필터에 통과시킬 수 있다. 여기에서, 상기 세척액은, 예를 들어, 멸균된 증류수와 0.1내지 1.0 w/v% 염화나트륨(NaCl)를 포함하는 증류수 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 세척액은 상기 농축된 유산균 사균이 포함된 배지 부피의 1.0 내지10 배로 첨가될 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 건조는 동결건조, 유동층건조 또는 분무건조일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 실시예에 있어서, 상기 분말화된 유산균 사균은 0.01 ㎛ 내지 3.0㎛, 0.1 ㎛ 내지 3.0 ㎛, 또는 0.5 ㎛ 내지 3.0 ㎛ 의 크기를 포함할 수 있다. 여기에서, 상기 분말화된 유산균 사균의 40% 내지 100% 의 크기가 1.0 ㎛ 이하인 것일 수 있다.
본원의 제 2 측면은, 상기의 제조방법으로 제조된 유산균 사균을 제공한다.
본원의 제 3 측면은, 상기의 사균을 포함하는 첨가제를 제공한다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 첨가제는 식품, 기능성 식품 또는 사료에 첨가될 수 있는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 제조방법으로 제조된 유산균 사균 원말은 유산균 사균의 입자 크기가 작을 뿐만 아니라, 유산균 사균이 고르게 분산되어 분포하게 된다. 나아가, 상기 제 1 막 필터 및 제 2 막 필터에 의한 불순물 여과 단계를 거쳐서 불순물이 상대적으로 미량 존재하므로, 본원에 따른 제조방법은 고품질의 유산균 사균 원말을 제공할 수 있다.
이러한 고품질의 유산균 사균 원말은 상기 식품, 기능성 식품 또는 사료에 첨가될 경우, 침전현상을 일으키지 않으므로, 우수한 유통성 및 저장성의 효과를 나타낼 수 있다.
이하, 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나, 본원이 이에 제한되지 않을 수 있다.
[ 실시예 ]
1. 유산균의 기원(Origin)
본원에서 사용된 L. plantarum (LM1001) 과 L. plantarum (LM1004)는 한국국제대학교 제약공학과[주소: 660-759, 경남 진주시 문산읍 동부로 965]에서 한국의 전통발효 식품인 김치로부터 분리되었다. 상기 L. plantarum (LM1001) 및 L.plantarum (LM1004) 는 한국미생물보존센터(Korean culture center of microorganisms)에 일반 기탁하였으며, 각각 신규의 KCCM 42959 (기탁일: 2010년 11월 12일) 및 KCCM 43246 (기탁일: 2016년 10월 28일)로 명명되었다.
이하의 실시예 또는 실험예에서 사용된 모든 유산균은 별도의 언급이 없는 한 L.plantarum (LM1001)과 L.plantarum (LM1004)이다.
2. 분석 방법
2-1. 생균수 분석
배양 중에 증가하는 유산균의 생균수는 콜로니카운팅(Colony counting) 방법으로 분석하였다. 이때 L. plantarum의 콜로니를 분석하기 위해 사용된 배지는 MRS(Difco, USA) 고형배지였으며, 배양은 37℃에서 48 시간 비호기적으로 실시한 후 생성된 콜로니의 숫자를 측정함으로써 분석하였다. 배양기는 앞서 사용한 JRS-150C모델을 사용하였다.
배양액은 107, 108, 109 배수까지 펩톤수를 이용하여 희석 한 후, 페트리디쉬(Petri-dish)당 1.0 ml씩 사용하면서 푸어링(Pouring) 방법을 사용하면서 분석되었다.
이때 배지희석을 위해 사용된 펩톤수의 조성(w/v%)은 다음과 같다: 0.01 내지 1.0 w/v% 염화나트륨, 0.1 내지 5.0 w/v% 카제인효소분해물, 0.01 내지 5.0 w/v% 제2인산나트륨, 0.01 내지 1.0 w/v% 제1인산칼륨을 제조 후 살균(121℃, 15분)하여 사용하였다.
2-2. 총균수 분석
배양액의 살균 후, 배양액 중의 사균체 수는 혈구계 Hemocytometer[Marienfeld, Germany]를 사용하여 분석하였다. 1,000 배율의 광학현미경[BX 53F, Olympus, Japan] 을 통해 혈구계의 총 20 개의 방에 있는 사균수를 측정하여 평균치 Navg 를 구한 후 하기 [식 2]를 통하여 총균수[No/g 원말 또는 ml]를 분석하였다.
[식 2]
Figure PCTKR2017012086-appb-I000002
여기에서, R 은 희석배수이다.
사균 원말에 존재하는 총균수 분석을 위하여, 1.0g 건조원말을 10ml의 증류수에 녹인 후, 잘 현탁하여 108, 109, 1010 배수로 멸균된 증류수에 희석하여 측정하였다.
2-3. 포도당, 젖산의 HPLC 분석
배양 동안 포도당과 젖산 등의 유기산 분석을 위해 HPLC(Agilent Technology 1200, Agilent, USA)을 사용하였다. 정지상(Stationery phase) 와 운동상(Mobile phase) 를 위해 각각 아민-컬럼(NH2, 300mm X 7.8mm, 9.0mm particle size, Bio-Rad, USA)과 5 mM H2SO4용액(0.5 ml flow rate)을 사용하였다. 분석 동안 컬럼의 온도는 35℃로 유지하였으며, 샘플은 오토샘플러(5.0m L)를 통해 자동으로 주사(Inject)하였다. 분석은 R.I detector를 사용하면서 Agilent Chemstation 1200 분석 프로그램을 이용하여 실시하였다.
2-4. 면역활성 분석방법
유산균 사균(Heat-killed probiotics, HK-probiotics)의 면역활성과 세포독성은 대식세포(RAW 264.7)와 마우스비장(spleen)내의 면역세포(Splenocytes)들을 이용한 in-vitro 분석에서 인터류킨-12(IL-12), 인터류킨-4(IL-4), 인터페론-감마(INF-γ), TNF-알파(TNF-α), NO-(Nitric oxide)생산량의 변화와 면역세포의 생존능(viability) 과 증식성을 분석함으로써 평가하였다.
2-4-1. 시료확보
L. plantarum(LM1001)를 이용하여 본원의 제조방법으로 제조한 유산균 생균과 유산균 사균 시료를 제조하였다.
유산균 생균 시료는 희석한 생균을 일정 농도로 구강 투여 하여 마우스 혈중에서 사이토카인들의 변화를 측정하는 in-vivo 테스트로 분석하였으며, 사균의 면역활성은 마우스 비장세포(splenocytes)와 대식세포주(RAW264.7)를 이용하여 사균을 농도별로 처리 후 사이토카인의 변화를 분석하는 in-vitro 실험을 통하여 실시하였다.
2-4-2. 실험동물 및 처리
6 주령의 웅성 Balb/c 마우스를 ㈜샘타코코리아(한국)에서 분양 받아 사용하였다. 사육환경은 온도 22±2℃ , 습도 50±20%, 12 시간 조명하에 사육하였으며, 사료는 마우스용 고형사료를, 음수는 상수도수를 제한 없이 섭취시켰다. 동물은 1주일 동안 실험 동물실에서 적응시킨 후 실험을 수행하였다.
본원의 제조방법으로 제조한 L. plantarum (LM1001)의 유산균 생균을 농도별로 10 일간 매일 1 회 구강 투여를 수행하였다. 마지막 구강 투여 후 24 시간에 실험동물로부터 혈액시료를 확보 한 후 -80℃에 보관하면서 실험에 사용하였다. 양성 대조군으로 Con A 25 mg/kg으로 정맥투여 하였다.
2-4-3. 마우스 비장세포 분리 및 배양
마우스로부터 비장을 무균적으로 적출하며, RPMI 1640 용액으로 세척한 다음 분쇄하여 세포를 유리하였다. 분리된 세포 현탁액을 200 메쉬 스태인리스 스틸 체 에 통과시킨 후 4℃, 1,200 rpm에서 3 분간 원심분리하여 세포 펠릿을 ACK 버퍼에 5 분간 현탁시켜 적혈구를 제거하였다. 유출된 비장세포는 10% 소태아혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하고 있는 RPMI 1640에 세포의 농도가 1×106 cell/㎖이 되도록 현탁하여 48 웰 플레이트에 각각 500 ㎕을 분주하였으며, 본원의 제조방법으로 제조된 L. plantarum의 유산균 사균을 농도별로 처리하였다. 리포폴리사카라이드 및 Con A 을 양성대조군으로 시료를 구분하여 세포에 처리하였다.
위와 같이 처리된 세포군들을 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 3시간 내지 72시간 배양하였고, 상기 배양액의 상층액을 -20℃에 보관하여 사이토카인 생성량 측정을 위해 사용하였다.
2-4-4. 세포 배양
비장세포 및 RAW 264.7 세포를 10% 소태아혈청과, 100 유닛/mL의 스트렙토마이신과 페니실린이 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하고 NO 및 세포 증식률에 미치는 영향을 알아보기 위하여 사용하였다.
2-4-5. 사이토카인( IFN -γ, TNF -α, IL-12) 분비능 측정
비장세포을 배양시킨 다음 배양 상층액으로 부터 분비되는 사이토카인 (TNF-α, IFN-γ, IL-12) 분비량을 측정하였다. 본원의 제조방법으로 제조된 L.plantarum(LM1001) 사균 시료를 양성대조군인 LPS 및 Con A와 함께 일정 시간 처리 한 후 배양액에 유리된 사토카인의 농도를 효소결합면역흡착검사 (Enzyme linked immumosorbent assay, ELISA)법을 이용하여 측정하였다 (ELISA kit, R&D system, USA).
즉, 사이토카인의 항체가 코팅되어 있는 96웰 플레이트에 상층액 시료 100 ㎕을 넣어 상온에서 2 시간 반응시킨 후, 상층용액을 제거하고 인산염환충용액와 트윈-20 (Sigma)을 섞어 만든 세척액으로 3회 이상 세척하였다.
다시 2 차 항체를 포함하는 용액을 넣어 1차 항체와 반응시킨 후, 아비딘(Avidin) 과 결합된 홀스래디쉬 퍼옥시다아제(Horseradish Peroxidase, HRP) 효소를 넣어 상온에서 15 분 반응시켰다. 이후, HRP 효소에 대한 기질로 TMB 용액을 넣어 반응시켜 색상의 변화를 확인하였다.
시료에 존재하는 사이토카인의 농도에 따라 색상의 변화가 나타나므로, 이 변화를 통해 시료 중에 사이토카인의 생성 유무를 알 수 있었다. 상기 HRP 효소와 TMB 기질의 반응을 황산(1.0 M)을 넣어 종결시킨 후, 마이크로플레이트 리더기 (Thermo)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
2-4-6. NO 측정
대식세포주 RAW 264.7 세포를 5×105 cell/㎖의 농도로 9 6웰 플레이트에 분주하여 24 시간 배양 시킨 후 양성대조군으로 LPS를 1 mg/㎖로 처리하고, 음성대조군으로 인산염완충용액을 처리하였다. 본원의 제조방법으로 제조된 L.plantarum (LM1001) 사균 시료를 처리한 다음 24 시간 동안 다시 배양하였다.
상기 NO의 농도는 그리스 리에이전트 시스템(Griess reagent system , Sigma, USA) 을 사용하여 측정하였다. 96 웰 플레이트에 50 ㎕ 배양액을 넣고 그리스 리에이전트 I(NED 용액)과 그리스 리에이전트 II (술파닐아미드 용액)를 동량으로 혼합한 후, 암실에서 10 분간 반응하고 30 분 이내에 마이크로플레이트 리더기(Tecan, Austria) 를 이용하여 540 nm에서 측정하였다. 상기 NO의 농도는 아질산나트륨의 표준곡선(0~100 마이크로몰)을 이용하여 계산하였다.
2-4-7. 세포 증식률 측정
비장세포 및 RAW 264.7 세포의 증식률은 WST-1 분석법으로 측정하였다. 비장세포 및 RAW 264.7 세포를 5×105 세포/웰의 농도로 조정하여 96 웰 플레이트에 분주 후 시료와 대조군을 처리하여 48 시간 배양하였다. WST-1 키트 용액을 100 ㎕씩 첨가하여 1 시간 동안 배양하여 ELISA 판독기(Thermo, Germany)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 하기 [식 3]으로 나타내었다.
[식 3]
Figure PCTKR2017012086-appb-I000003
여기에서, N(%)는 세포증식 비, Cp는 사균처리 후 흡광도, Cs는 무처리 후의 흡광도를 나타낸다.
2-4-8. 통계처리
이상의 실험에서 얻어진 결과는 SPSS 21 매뉴얼(Statistical Package for Social Sciences, IBM, Armonk, NY, USA)을 이용하여 일원배치 분산분석 테스트(one way ANOVA test)로 분석하였으며, 시료 간의 유의성은 스튜던트 투 테일드 T테스트로 P<0.05 수준에서 비교하였다.
2-5. 유산균 항 비만효과 분석
지방전구세포 (3T3-L1 cell)에서 성숙한 지방세포로의 분화를 유도하면서 구현예에 따라 제조된 유산균 사균 샘플을 농도별로 처리한 후, 지방 세포 내 지방축적 억제 효과 확인을 위해 오일 레드 오(Oil red O) 염색 및 세포내 중성지방 함량(TG kit)을 측정하여 세포내 지방 축적 정도를 확인하였다.
2-5-1. 지방전구세포 성장저해 효과
유산균의 항 비만효과를 분석하기 위하여 지방전구세포 3T3-L1(Mouse Embryonic Fibroblast-Adipose like cell line) 배양액에 유산균 사균체의 세포독성을 분석하기 위하여 MTT 분석법(Methylthiazolinyldiphenyl tetrazolium bromide assay)을 실시하였다.
3T3-L1 지방세포를 96-웰 플레이트 (96-웰 플레이트)에 4×104 세포/ml로 분주하여 24 시간 동안 5% CO2, 37℃ 인큐베이터 (incubator)에서 배양하였다. 배양 후 배양액을 제거하고 DMEM 배지와 유산균 사균체 분말을 농도별로(0, 100, 250, 500 ㎍/ml) 24 시간 동안 처리하였다. 이후 용매 DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1X)에 5 ㎎/㎖로 용해한 MTT (3-[4,5-dimethyl-thiazol]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) 용액을 각 웰 (well) 마다 120 ㎕씩 처리하여 4 시간 동안 5% CO2, 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다.
배양 이후 배양액을 제거한 뒤 각 웰마다 디메틸설폭사이드 (DMSO; dimethyl sulfoxide)를 200 ㎕/well로 넣으면서 피펫을 이용해 잘 섞어주었다. 그 후 ELISA reader로 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
2-5-2. 지방세포 지질축적 저해활성 측정 (Oil Red O staining analysis)
3T3-L1 지방세포를 6-웰 플레이트(6-웰 플레이트)에 7×104 세포/ml 밀도로 분주하고 8 일 동안 지방세포를 분화시키면서 동시에 유산균 사균 분말을 농도별로(100, 250, 500 ㎍/ml) 처리하였다. 8일 후 세포의 배양액을 버리고 인산완충식염수(PBS; phosphate buffered saline)로 씻어주었다. 이후 각 웰에 10% 포름알데하이드(formaldehyde)를 500 ㎕씩 각 웰에 넣고 4℃ 에서 1 시간 동안 고정 시키고, 포름알데하이드를 제거한 후에 인산완충식염수로 3 번 씻어낸 후 CO2 인큐베이터에서 건조하였다.
이후 플레이트(plate)가 다 마르면 오일 레드 오 염색약을 500 ㎕씩 넣고 상온에서 어두운 상태로 30 분간 염색한 후 인산완충식염수로 3번 씻어내었다. 염색이 된 세포는 현미경으로 관찰하였으며, 관찰 후 웰당 300 ㎕의 이소-프로판올로 지방세포 내 염색된 염색약을 추출하여 ELISA 리더기로 500 ㎚에서 광학밀도값(OD값; optical density)을 측정하였다.
오일 레드 오 염색약은 오일 레드 오 염색약 500 mg을 이소-프로판올(iso-propanol) 100 ml에 녹인 용액을 증류수와 6:4의 비율로 섞은 후 0.45 ㎛ 필터(filter)로 여과한 후 사용하였다.
2-5-3. 지방세포 내 중성지방( Tri - glycerides ) 함량 분석
3T3-L1 지방세포를 6-웰 플레이트(6-웰 플레이트)에 7×104 세포/ml 밀도로 분주하고 8 일 동안 지방세포를 분화시키면서 동시에, 유산균 사균분말을 농도별로(100, 250, 500 ㎍/ml) 처리하였다.
8일 후 각 웰을 인산완충식염수로 세척한 후 스크라퍼(cell scraper, SPL)를 이용하여 세포를 모은 후 초음파 분쇄기(SONIFIER 450, BRANSON)를 이용하여 세포 내 중성지방을 추출하여 트리글리세리드 키트(TG-S, 아산제약)를 이용하여 중성지방의 함량을 측정하였다.
실시예 1. 유산균 생균의 배양 및 농축
1-1. 유산균 생균의 보관
본원의 실시예에서 사용할 유산균은 먼저 37℃ 에서 MRS (Difco. USA) 고형배지를 이용하여 48 시간 동안 혐기적 조건에서 배양하였다. 48 시간 후, 배지에 나타난 유산균 군집은 무균밴치에서 수확되어 인산염완충용액(Phosphate buffered saline; PBS, pH 6.8)을 이용하여 3 번 세척한 후, 적절한 동결보호제(25% 글리세린 + 10% 탈지분유)를 첨가 현탁하여 -70℃ 초저온냉동고에서 동결하기에 앞서 크리오-바이알(Cryo-vial, 1.2 ml, Simport, Canada)에 0.2ml씩 분주하였다.
상기 동결된 바이알(Defreezed vial, DF vial)들은 최대 6 개월 동안 보관하면서, 필요할 때마다 꺼내 녹여서 사용하였다. 모든 실험은 오염을 최소한으로 줄이기 위하여 무균상태에서 진행하였다.
1-2. 유산균 생균의 종배양
초저온 냉동고에서 상기 바이알을 꺼내 녹인 후에 유산균 생균의 종배양을 실시하였다.
1 차적으로, DF-바이알(0.2 ml)들을 살균된 15 ml MRS(Difco, USA) 액체배지(18f, 실험관) 에 접종하였으며, 37℃에서 12 시간 동안 배양기[JSBI-150C, JSR Korea]에서 비호기적으로 배양하였다.
2 차적으로, 12 시간 동안 배양된 15ml 유산균액을 다시 1.0 L 종배양 배지 LTMS-PR-SM (2.0 L 삼각플라스크, 4개)로 접종하였으며, 37℃에서 10 시간 동안 비호기적인 조건으로 배양기[JSRB-150C, JSR Korea]에서 정체배양 하였다.
이때 사용된 종 배양 배지 LTMS-PR-SM 조성(w/v%)은 아래와 같다: 2.0 내지 10.0 w/v% 함수결정포도당, 0.1 내지 5.0 w/v% 대두단백효소분해물, 0.1 내지 5.0 w/v% 카제인효소분해물, 0.1 내지 5.0 w/v% 효모추출물, 0.01 내지 3.0 w/v% 제2인산칼륨, 0.1 내지 5.0 w/v% 황산마그네슘, 0.01 내지 1.0 w/v% 염화칼슘, 0.01 내지 0.1 w/v% 황산망간, 0.01 내지 5.0 w/v% 초산나트륨 등이 포함하며, 살 균전에 NaOH(10.0 M)를 이용하여 pH 6.8로 조정되었다.
1-3. 유산균 생균의 중간배양
상기 종 배양에서 배양된 1.5 L 종배양액을 80 L 중간배양 배지 LTMS-PR-MM (100L발효기, 코바이오택)에 접종하기 위해 사용하였다. 이러한, 중간배양은 32℃에서 약간의 교반과 함께 12시간 동안 실시하였으며, 배양액의 pH를 pH 5.0 내지 pH 7.0로 조정하기 위해 필요할 때마다 암모니아가스를 주기적으로 첨가하였다.
이 때 사용된 상기 중간배양 배지의 조성(w/v%)은 아래와 같다: 2.0 내지 10.0 w/v% 함수결정포도당, 0.1 내지 5.0 w/v% 대두단백효소분해물, 0.1 내지 3.0 w/v% L-시스테인, 0.1 내지 5.0 w/v% 효모추출물, 0.01 내지 3.0 w/v% 제2인산칼륨, 0.1 내지 5.0 w/v% 황산마그네슘, 0.01 내지 0.1 w/v% 황산망간, 0.01 내지 5.0 w/v% 구연산포타슘, 0.01 내지 2.0 w/v% 염화칼슘, 0.01 내지 5.0 w/v% 트윈-80 을 포함하며, 살균 전에 NaOH(10.0 M)를 이용하여 pH 6.8로 조정되었다.
1-4. 유산균 생균의 제 1 막 필터를 이용한 배양 및 농축
본원의 제조 방법에서 사용되는 생물반응기는 제 1 막 필터(0.5 ㎛ 직경의 포어 사이즈 및 6 mm 채널반경을 가지는 중공사막 필터, Al-Al 세라믹 중공사막 필터) 와 배양기를 포함하는 것으로서, 상기 막 필터가 배양기의 외부에 위치하며, 배양액은 배양기에 먼저 접종된 후에 강제무균순환펌프(Q=9.0 m3/h, Hmax=41 m, 5.0 bar, 120℃)에 의하여 상기 막 필터와 상기 배양기를 순환하게 된다.
먼저, 상기 종배양 및 중간배양을 거쳐서 배양된 유산균 생균이 접종된 배지 20 L를 배양기에 접종시켰다. 이후, 상기 유산균 생균이 포함된 배지를 강제무균순환펌프를 이용하여 상기 제 1 막 필터에 통과시킴으로써 농축 및 여과하면서 배양하였다.
상기의 농축 및 여과 과정을 통하여, 중간배양 배지를 여과함과 동시에, 새로운 배지를 배양기에 첨가하였다. 상기 새로이 접종된 배지의 조성(w/v%)은 다음과 같다: 2.0 내지 10.0 w/v% 함수결정포도당, 0.1 내지 5.0 w/v% 대두단백효소분해물, 0.1 내지 5.0 w/v% 효모추출물, 0.01 내지 3.0 w/v% 제2인산칼륨, 0.1 내지 5.0 w/v% 황산마그네슘, 0.01 내지 0.1 w/v% 황산망간, 0.01 내지 2.0 w/v% 염화칼슘. 상기 새로이 접종된 배지는 배양기로 첨가되기 전에 배지필터(0.2 ㎛ 직경의 포어 사이즈 및 6 mm 채널반경을 가지는 Al-Al 세라믹 중공사막 필터)를 통해 미리 살균하였다.
상기 중간배양 배지를 새로이 첨가한 배지로 전량 교체한 후에, 배양기를 18℃ 이하로 냉각하였으며, 상기 제1막 필터를 따라 흐르는 배양액의 흐름을 최소한으로 유지하였다. 상기 유산균 생균의 배양 및 농축을 시작하기 전까지 5시간 동안 배지의 pH 를 5.0내지 6.8(1:1=20 w/v% 암모니아수:증류수)으로 유지하였다.
이 후, 상기 유산균 생균의 배양 및 농축을 시작하기 전 생물반응기의 온도를 32℃로 높여, 상기 유산균 생균이 접종된 배지를 포함하는 배양액을 제 1 막 필터에 통과시키면서, 상기 유산균 생균을 배양 및 농축하는 실질적인 배양을 개시하였다. 이 때, 제 1 막 필터를 통과하면서 배양액의 부피가 일정한 속도로 감소하게 되는데, 상기 새로이 접종된 배지를 펌프(YZ15, Leadfluid, China, Max=20.0L/h)를 이용하여 배양기에 무균적으로 계속하여 공급하였다.
그리고, 상기 제 1 막 필터를 따라 순환하는 배지의 흐름속도는 상기 강제무균순환펌프를 이용하여 50.0 L/h 내지 300.0 L/h로 조절하였으며, 생물반응기 내부를 암모니아수 (1:1=20 w/v% 암모니아수: 증류수)를 이용하여 pH 5.0 내지 pH 7.0상태로 유지하였으며, 비호기적인 상태를 유지하기 위하여 질소가스를 이용하여 발효기의 내압을 0.1 내지 0.5 kg/cm2상태로 유지하였다.
실시예 2. 유산균 생균의 사균화
본원의 일 실시예에서, 상기 실시예 1에서 수득한 유산균 생균의 사균화에 앞서 상기 유산균 생균이 접종된 배지에 분산제를 첨가하지 않은 그룹 1 과 분산제로서 0.1 내지 80.0 중량%의 말토덱스트린 및 0.1 내지 80.0 중량%의 트레할로스를 각각 첨가한 그룹 2 및 그룹 3 을 제조하였다.
본원의 일 실시예에서, 상기 실시예 1에서 수득한 유산균 생균을 초고온연속살균기를 이용하여 121℃에서 3 초간 3 회 순환처리하여, 유산균 사균을 제조하였다(실시예 2-1).
본원의 일 실시예에서, 상기 실시예 1에서 수득한 유산균 생균을 초고온연속살균기를 이용하여 110℃에서 5 분간 순환처리하여, 유산균 사균을 제조하였다(실시예 2-2, 도 5b).
본원의 일 실시예에서, 상기 실시예 1에서 수득한 유산균 생균을 초고온연속살균기를 이용하여 65℃, 85℃ 및 120℃에서 3 분간 순환처리하여, 유산균 사균을 제조하였다(실시예 2-3, 도 7).
본원의 일 실시예에서, 상기 실시예 1에서 수득한 유산균 생균을 80℃에서 각각 0 분, 30 분, 60 분, 90 분, 120 분 순환처리하여, 유산균 사균을 제조하였다(실시예 2-4, 도 9).
실시예 3. 유산균 사균의 제 2 막 필터를 이용한 농축, 세척 및 분산
상기 실시예 2-1에서 수득한 유산균 사균이 포함된 배지를 제 2 막 필터(0.01 ㎛ 내지 0.1 ㎛ 직경의 포어 사이즈 및 3 mm 채널반경을 가지는 폴리술폰 중공사막 필터)에 통과시켜 유산균 사균을 2 내지 10 배로 농축하였다. 상기 제 2 막 필터를 사용하면서, 실시예 2의 사균화 과정에서 뭉친 유산균 배양액에 전단력을 가하여 유산균 사균을 분산시켰다.
추가적으로, 상기 제 2 막 필터에 의한 유산균 분산의 효과를 극대화하기 위하여, 분산제를 배지에 첨가하여 실시하였으며, 모든 결과를 하기의 표 2 및 도 8, 도 9 에 나타내었다.
도 8 에 나타낸 바와 같이, 유산균 사균을 제 2 막 필터를 이용하여 농축, 세척 할 경우, 열처리 단계에서 뭉쳐진 유산균 사균이 분산 및 농축되어 회수됨을 알 수 있었다. 나아가, 상기 제2 막 필터를 이용하는 경우에도, 제 1 막 필터에서와 같이 불순물들이 배양액으로부터 여과 및 제거되는 것은 통상의 기술자에게 자명한 사실이다.
전술한 바와 같이, 유산균은 사균화 과정에서 여러 마리가 뭉쳐서 유산균 사균 덩어리를 형성하게 된다. 본 실시예에서 유산균의 사균화 직후 형성된 유산균 사균 덩어리의 크기는 20 ㎛ 내지 200 ㎛ 으로 측정되었다(도 9). 상기 사균화된 직후의 유산균 사균 또는 유산균 사균 덩어리를 상기 제 2 막 필터를 통과시킴으로써, 뭉친 유산균 사균 덩어리를 분산시켰다. 이렇게 분산된 유산균 사균의 크기는 0.5 ㎛ 내지 3.0 ㎛ 이하로 측정되었다(도 9).
실시예 4. 유산균 사균의 세척, 건조 및 분말화
상기 실시예 3 에 따른 유산균 사균의 농축 후에, 세척액으로서 살균된 증류수를 배양기에 첨가하였고, 제 2 막 필터에 통과시킴으로써 상기 유산균 사균액을 세척하였다.
살균된 증류수를 농축된 유산균 사균이 포함된 배지의 2 배 부피로 첨가한 후에, 다시 제 2 막 필터를 통과시키면서 희석된 배지를 희석전의 부피로 농축하는 과정을 3 회 반복하였다. 그 결과, 상기 농축된 사균이 포함된 배지의 총 6 배 부피의 살균된 증류수로 농축된 사균을 세척하는 효과를 나타내었다.
상기의 방법으로 세척된 유산균 사균을 동결건조기에서 총 96 시간 동안 건조시켜 분말화하였다.
위와 같이 세척, 건조 및 분말화된 유산균 사균의 크기 분포를 측정하여 도 9 에 나타내었다. 도 9 에 나타낸 바와 같이, 분말화된 사균의 크기가 0.5 ㎛ 내지 3.0㎛ 의 크기 분포를 나타내었고, 나아가 상기 분말화된 사균의 60% 내지 100% 의 크기가 1.0 ㎛ 이하로 나타나는 것을 알 수 있었다. 이는, 상기 열처리 과정에서 40 내지 200 ㎛ 크기로 형성된 유산균 사균 덩어리가 제 2 막 필터에 의하여 배양액에 가해진 전단력으로 분산되었기 때문이다.
비교예 1. 회분식 배양을 이용한 유산균 사균의 제조
유산균의 회분식 배양은 100 L 발효조(코바이오택)에서 배양액의 총량 80L로 실시 하였다. 먼저, 상기 발효조에 상기 종배양 거쳐서 배양된 유산균 생균을 포함하는 배양액 4.0L(5.0 w/v%)를 100 L 발효조에 접종하였다.
회분식 배양기에서 배양 중에 교반속도는 30 rpm, 온도는 32℃를 유지하였다. 또한, 질소가스를 이용하여 비호기적인 상태를 유지하였으며, 배양중에 pH는 암모니아 가스를 이용하면서 pH 5.0 내지 pH 7.0으로 유지하였다. 이러한 회분식 배양 동안 일정간격으로 상기 유산균의 생균을 샘플링하여 특성을 분석하였다.
이후에, 본원의 일 실시예에서, 상기 유산균의 생균을 110℃에서 5 분 동안 열처리 하여 사균화 하였다(비교예 1-1, 도 5). 도 5 에 나타낸 바와 같이, 종래의 회분식 배양을 이용하여 제조된 유산균 사균은, 본 발명에 따른 유산균 사균에 비하여 크기가 크고 덜 농축되었음을 알 수 있었다.
이후에, 본원의 일 실시예에서, 상기 유산균의 생균을 120℃에서 3 초 동안 3 번 순환처리 하여 사균화 하였다(비교예 1-2, 도 7). 도 7 에 나타낸 바와 같이, 종래의 회분식 배양을 이용하여 제조된 유산균 사균은, 본 발명에 따른 유산균 사균에 비하여 크기가 큰 것으로 관찰되었다.
추가적으로, 실시예 4 와 동일한 방법으로 유산균 사균을 건조 및 분말화 하였다.
[ 실험예 ]
실험예 1. 유산균 생균의 생산성 및 성장속도 평가
실시예 1 및 비교예 1 에 따른 유산균 생균의 생산성 및 성장속도를 비교하여 아래의 표 1 에 나타내었다. 상기 유산균 생균의 생산성은 펠렛의 양으로 나타내었으며, 상기 유산균 생균의 성장속도(Specific growth rate, m)는 하기의 식 4 로 나타내었다.
[식 4]
Figure PCTKR2017012086-appb-I000004
여기에서, LN은 로그함수식이며 t1은 특정 시간 t1에서의 유산균 생균의 농도, t2는 특정시간 t2에서의 유산균 생균의 농도를 나타내며, t는 경과된 시간을 나타내는 것이다.
Figure PCTKR2017012086-appb-T000001
여기서 피딩속도(feeding rate, h-1)는, 실시예 1 에서 상기 중간배양 이후 상기 제 1 막 필터에 의한 유산균 생균의 배양 및 농축 전에, 상기 새로이 접종된 배지가 배양기에 공급되는 속도를 의미하며, 아래의 식 5에 따라 분석되었다.
[식 5]
Figure PCTKR2017012086-appb-I000005
여기에서, Qh는 1 시간에 소비되는 배지의 양(L)이었으며, V는 생물반응기의 전체부피(L)이다.
상기 표 1 에서 살펴본 바와 같이, 비교예 1 에 따른 유산균 생균은 펠렛 양이 각각 18.3 g/L(LM1001) 및 15.2 g/L(LM1004) 인데 반하여, 실시예 1 에 따른 유산균 생균은 펠렛의 양이 각각 205.8 g/L(LM1001) 및 170.0 g/L(LM1004) 으로 뛰어난 생산성을 나타냄을 알 수 있었다.
또한, 비교예 1 에 따른 유산균 생균의 배양액은 젖산의 농도가 각각 478.1 mM(LM1001) 및 534.1 mM(LM1004) 인데 반하여, 실시예 1에 따른 유산균 생균의 배양액은 젖산의 농도가 각각 324.3 mM(LM1001) 및 369.2 mM(LM1004) 을 나타내었다.
이를 통하여, 실시예 1에 따른 제조방법에 의할 경우, 젖산 등의 불순물이 제 1 막 필터를 통하여 계속 여과 및 제거되어 배양 동안 일정하게 유지됨을 알 수 있었다. 이에 따라, 상기 불순물이 일정농도로 유지됨으로써 비교예 1에 비하여 유산균의 최종 생산양을 증가시킨다는 것을 알 수 있었다.
실험예 2. 유산균 생균의 크기 조절 평가
실시예 1 및 비교예 1 에 따른 유산균 생균을 회수하여 건조 분말화시킨 후에, 분말에 존재하는 유산균 생균을 주사형전자현미경(Scanning ElectroMicroscope, SEM, X10,000)로 찍은 사진을 도 4 에 나타내었으며, 광학현미경(X 1,000) 으로 찍은 사진을 도 5 에 나타내었다.
그리고, 상기 실시예 1 및 비교예 1 에 따른 유산균 생균의 크기 분포를 측정하여 도 6 에 나타내었다.
도 4 및 도 5 에 나타낸 바와 같이, 실시예 1 에 따른 유산균 생균은 비교예 1 에 비하여, 유산균 생균의 크기가 작을 뿐만 아니라, 더욱 농축되어 있음을 알 수 있었다.
나아가, 도 6에 나타낸 바와 같이, 비교예 1 에 따른 유산균 생균의 크기는 최대 6.3 ㎛의 크기를 갖는 분포를 보인 반면에, 실시예 1 에 따른 유산균 생균의 크기는 최대 4.0 ㎛의 더 작은 크기의 분포를 나타내었다. 또한, 실시예 1 에 따른 유산균 생균을 열처리 사균화 하게 되면 그 크기가 3.0 ㎛까지 감소하였으며, 이는 비교예 1 의 4.0 ㎛ 보다 현저히 작은 수치임을 나타내는 것이다.
실험예 3. 유산균 사균의 크기 조절 평가
상기 실시예 2-1 에 따른 유산균 사균의 회수 과정에서, 실시예 3 에 따른 제 2 막 필터를 이용한 특성 및 비교예로서 원심분리를 이용한 특성을 비교하여 아래의 표 2 에 나타내었다.
Figure PCTKR2017012086-appb-T000002
상기 표 2 에서 나타낸 바와 같이, 실시예 3 에 의할 경우, 누적수율이 115.2%(그룹 1), 148.5%(그룹 2) 그리고 168.7%(그룹 3)까지 증가함을 알 수 있었다. 그러나, 비교예에 의한 원심분리로 유산균 사균을 회수할 경우, 균의 뭉침현상이 더욱 심해져서, 누적수율이 26.4%로 급격히 감소함을 알 수 있었다.
실험예 4. 유산균 사균의 현탁성 평가
실시예 4 및 비교예 1-1 에 따른 유산균 사균 원말의 수용 현탁상태 안정성을 관찰하기 위하여 본 실험을 진행하였다.
실험은 Lactobacillus plantarum (LM1001) 유산균을 이용하여 실시예 4 및 비교예 1-1 에 따른 유산균 사균 원말을 1.0E+12/g 원말로 제조하였다. 이후, 실시예 4 의 사균 유래 사균 원말은 1.0E+8/ml 농도 및 비교예 1-1의 사균 유래 사균 원말은 1.0E+7/ml의 농도로 멸균된 증류수에 현탁하여 실온에서 4 일 동안 침전 상태를 관찰하였다(도 11).
상기 본원의 제조방법에 따른 배양을 실시하여 제조된 유산균 사균 원말의 총균밀도는 5.2E+12/g 원말이었으며, 상기 회분식 배양을 통해 제조된 유산균 사균 원말의 총균밀도는 2.9E+12/g 원말이었다.
도 11 에 나타낸 바와 같이, 회분식 배양에 의할 경우 현탁 1시간 만에 현탁의 일부분이 침전되는 현상은 나타낸 반면에, 본원의 제조방법에 의할 경우 현탁 후 4일 동안에도 안정적으로 현탁상태를 유지하고 나타냄을 알 수 있다.
실험예 5. 유산균 생균의 면역활성 분석
본원의 제조방법으로 제조된 두 종의 L. plantarum 의 생균 및 사균 각각에 대하여 면역활성을 분석하였다.
상기 유산균 생균의 면역활성은 다음과 같이 분석하였다: 유산균 생균이 포함된 사료를 마우스에 공급한 후에, 상기 마우스 혈액 내의 사이토카인(TNF-α, INF-γ, IL-12) 농도변화를 측정하는 in-vivo 테스트를 실시하여 도 12에 나타내었다.
구체적으로, 6 주령 웅성 Balb/c 마우스에 유산균 생균 2 종을 농도별 (10, 100 mg/kg)로 10 일간 매일 1 회 구강 투여하였다. 마지막 구강 투여 24 시간 후에 실험동물로부터 혈액시료를 확보한 후 -80℃ 에 보관 후 실험에 사용하였다. 양성 대조군으로 Con A 25 mg/kg 으로 정맥투여 하였다.
도 12 에 나타낸 바와 같이, 10 일간 유산균을 처리 후 혈청 사이토카인의 양을 ELISA assay를 이용하여 측정하였다. 양성 Con A (25 mg/kg)에 비하여 사이토카인 TNF-α, IFN-γ, 및 IL-12 가 모두 유의적으로 증가하였다.
실험예 6. 유산균 사균의 면역활성 분석
본원의 제조방법으로 제조된 두 종의 L. plantarum 의 사균에 대하여 면역활성을 분석하였다.
상기 유산균 사균의 면역활성은 다음과 같이 분석하였다: RAW264.7 대식세포를 이용한 세포독성 실험과 NO-(Nitric oxide) 생성, 그리고 마우스 비장세포(splenocytes)에 의한 사이토카인((TNF-α, INF-γ, IL-12, IL-6) 생성을 측정하는 in-vitro 테스트를 실시하여 도 13에 나타내었다.
앞서 분석방법에서 기술한 절차에 따라 RAW264.7 대식세포를 이용하여 유산균 사균의 세포독성과 Nitric oxide 생산유도 기능이 탐색되었다.
도13(A) 는 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포에서 유산균의 세포 처리 농도를 설정하기 위하여 유산균 시료를 48 시간까지 처리한 후 세포독성을 실험한 결과를 나타낸 것이며, 10 ㎍/ml의 농도 이하에서 세포독성이 나타나지 않음을 나타내고 있다. 따라서 세포 독성이 나타나지 않는 농도 (0.1 내지 10 ㎍/㎖ 이하)에서 유산균 시료의 면역 활성 효능을 측정하였다. 세포 독성은 유리된 락테이트 디하이드로게네이스(Lactate dehydrogenase) 의 활성도로 측정하였다.
도 13(B)는 유산균 사균분말 처리가 마우스 대식세포주인 Raw 264.7 세포에서 NO 생성능에 미치는 영향에 관하여 평가하기 위하여, 상기 RAW 264.7 세포에 유산균 시료를 0.1, 1, 10 ug/ml 농도로 48 시간까지 처리 한 후 배양배지로 유리된 NO의 활성을 그리즈 리에이전트 시스템(Griess reagent system) 방법을 사용하여 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 양성 대조군인 LPS에 의해서 NO의 생성능이 6 배 정도 증가 하였으며, 처리한 유산균 시료 모두에서 농도 의존적으로 유의하게 증가함을 확인할 수 있었다.
도 14는 마우스 비장세포를 이용하여 사이토카인 생산에서 유산균 사균 분말의 효과를 나타낸 것이다. 도 14(A)는 전술된 유산균 사균 분말 0.1 내지 10mg/ml 처리 농도 이하에서 비장세포 세포독성이 나타나지 않음을 나타내는 것이다. 그리고, 도 14(B), (C), (D) 및 (E)는 각각 유산균 사균 분말의 처리가 농도 유의적으로 사이토카인의 생산량을 높이고 있음을 나타내는 것이다.
도 12 내지 도 14에서 나타낸 바와 같이, 두 종의 유산균 모두 생균과 사균에서 면역강화기능이 발견되었으며, 면역활성을 나타냄을 알 수 있었다.
실험예 7. 유산균 사균의 항 비만효과
유산균 사균의 항 비만효과를 관찰하기 위하여, 지방세포 내 지방축적 억제 실험을 수행하였다. 구체적으로, 지방세포에 지방축적 유도물질인 25 mg/ml con A 를 첨가한 후에, L. planatrum(LM1004)의 유산균 사균 분말을 농도별로 (0, 100, 250, 500 ㎍/ml) 처리하였으며, 감소된 지방축적 양을 측정하였다. 대조군으로서 상기 지방축적 유도물질을 처리하지 않은 군과, 상기 지방축적 유도물질을 처리한 후에 유산균 사균 분말을 처리하지 않은 군을 사용하였다. 도 15에 나타낸 바와 같이, 유산균 사균 분말의 처리농도(0, 100, 250, 500 ㎍/ml)에 따라, 지방세포에 축적된 지질의 양이 농도 의존적으로 감소하는 것을 현미경으로 관찰할 수 있었다(도 15A).
특히 500 ㎍/ml 농도에서, 양성대조군(Con A)과 비교하였을 때 지방세포 내 지질이 약 46% 정도 감소하는 것을 오일레드 오 염색방법을 통하여 확인할 수 있었다(도 15C).
또한 처리농도(0, 250, 500 ㎍/ml)에 따라, 지방세포에 축적된 중성지방의 양이 감소하는 것을 확인하였으며, 특히 500 ㎍/ml 농도에서, 양성대조군(Con A)과 비교하였을 때 지방세포 내 중성지방(TG)의 양이 약 81% 정도 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 15D).
실험예 7을 통하여, LM1004는 지방 세포내에 지질축적을 억제하는 효과까지 나타냄을 알 수 있었다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
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Claims (20)

  1. 배양기 및 막 필터를 포함하는 생물반응기를 이용한 유산균 사균의 제조방법으로서,
    상기 막 필터는 제 1 막 필터 및 제 2 막 필터를 포함하고,
    상기 생물반응기는 상기 배양기에 첨가된 유체가 각각 독립적으로 상기 제 1 막 필터 및 상기 제 2 막 필터를 통과하여, 다시 상기 배양기에 전달되는 구조를 포함하며,
    유산균 생균이 접종된 배지를 상기 배양기에 첨가하고;
    상기 유산균 생균이 접종된 배지를 상기 제 1 막 필터에 통과시키면서 상기 유산균 생균을 배양 및 농축하며;
    상기 배양 및 농축된 유산균 생균을 사균화하여 유산균 사균을 만들고;
    상기 유산균 사균이 포함된 배지를 상기 제 2 막 필터에 통과시키면서 상기 유산균 사균을 농축하며; 및
    상기 농축된 유산균 사균을 건조시키고 분말화하는 것;
    을 포함하는, 유산균 사균의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 배지에 접종된 유산균 생균은, 1 단계 이상의 배양 단계를 거쳐서 배양된 것인,
    유산균 사균의 제조방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 생물반응기는 배지 제조용 탱크 및 배지 제조용 막 필터를 추가로 포함하고,
    상기 생물반응기는 상기 배지 제조용 탱크에 첨가된 배지 용액이 상기 배지 제조용 막 필터를 통과하여 다시 상기 배지 제조용 탱크 또는 상기 배양기에 전달되는 구조를 포함하며,
    상기 배지는 배지 용액을 상기 배지 제조용 막 필터에 통과시키는 것을 포함하여 제조되는 것이며,
    상기 배지 용액에 포함된 불순물이 상기 배지 제조용 막 필터를 통하여 여과됨으로써 상기 배지 용액이 살균되는 것인,
    유산균 사균의 제조방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 배지 제조용 막 필터는 0.1 ㎛ 내지 1 ㎛의 직경을 가지는 포어를 포함하는 중공사막 필터를 포함하는 것인,
    유산균 사균의 제조방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 유산균 생균의 크기는, 상기 유산균 생균이 상기 제 1 막 필터를 통과함으로써 조절되는 것이고;
    상기 유산균 생균의 크기 조절은, 상기 배지에 가해진 전단력에 의해서 통제되는 것이며;
    상기 전단력은 상기 유산균 배지의 흐름 속도에 의해서 통제되는 것인,
    유산균 사균의 제조방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 유산균 생균은, 상기 유산균 생균이 접종된 배지에 포함된 불순물이 상기 멤브레인 필터를 통하여 여과됨으로써 농축되는 것인,
    유산균 사균의 제조방법
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 유산균 생균이 접종된 배지가 상기 유산균 생균의 배양 및 농축 동안 pH 가 5.0 내지 7.0으로 유지되는 것을 포함하는 것인,
    유산균 사균의 제조방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 사균화는 80℃ 내지 121℃의 온도에서 3 분 내지 15 분 동안의 처리를 포함하는 것인,
    유산균 사균의 제조방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 사균화는 1 회 내지 10 회의 초고온살균(ultra high temperature sterilization)으로 진행되는 것을 포함하며,
    상기 초고온살균은 110℃ 내지 130℃의 온도에서 3.0 초 내지 10.0 초 동안의 처리를 포함하는 것인,
    유산균 사균의 제조방법.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 유산균 사균은 상기 제 2 막 필터를 통과함으로써 농축, 분산되고, 세척되는 것인,
    유산균 사균의 제조방법.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 제 1 막 필터는 0.1 ㎛ 내지 1 ㎛의 직경을 가지는 포어를 포함하는 중공사막 필터를 포함하고,
    상기 제 2 막 필터는 0.01 ㎛ 내지 0.1 ㎛의 직경을 가지는 포어를 포함하는 중공사막 필터를 포함하는 것인,
    유산균 사균의 제조방법.
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 제 2 막 필터는 50,000 달톤 내지 100,000 달톤의 분자량을 가지는 물질을 여과하는 중공사막필터를 포함하는 것인,
    유산균 사균의 제조방법.
  13. 제 1 항에 있어서,
    상기 유산균 생균의 배양 및 농축 이후에, 상기 유산균 생균이 접종된 배지에 분산제를 첨가하는 것을 추가로 포함하는,
    유산균 사균의 제조방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 분산제는 상기 배양 및 농축된 유산균 생균의 펠렛에 대하여 0.1%(w/w) 내지 80.0%(w/w)로 첨가하는 것인,
    유산균 사균의 제조방법.
  15. 제 1 항에 있어서,
    상기 분말화된 유산균 사균의 크기가 0.01 ㎛ 내지 3.0 ㎛를 포함하는 것인,
    유산균 사균의 제조방법.
  16. 제 1 항에 있어서,
    상기 분말화된 유산균 사균의 40% 내지 100%의 크기가 1.0 ㎛ 이하를 포함하는 것인,
    유산균 사균의 제조방법.
  17. 제 1 항에 있어서,
    상기 유산균은 간균, 구균, 비피도균 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것인,
    유산균 사균의 제조방법.
  18. 제 1 항에 있어서,
    상기 유산균은 Lactobacillus plantarum 을 포함하는 것인,
    유산균 사균의 제조방법.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 제조 방법으로 제조된 유산균 사균.
  20. 제 19 항의 유산균 사균을 포함하는 첨가제로서,
    상기 첨가제는 식품, 기능성 식품 또는 사료에 첨가될 수 있는 것인,
    첨가제.
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