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WO2018101261A1 - 進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤 - Google Patents

進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤 Download PDF

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WO2018101261A1
WO2018101261A1 PCT/JP2017/042629 JP2017042629W WO2018101261A1 WO 2018101261 A1 WO2018101261 A1 WO 2018101261A1 JP 2017042629 W JP2017042629 W JP 2017042629W WO 2018101261 A1 WO2018101261 A1 WO 2018101261A1
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WO
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cells
antibody
expression
zbtb20
eae
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PCT/JP2017/042629
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English (en)
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伸司 大木
山村　隆
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National Center of Neurology and Psychiatry
Original Assignee
National Center of Neurology and Psychiatry
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease

Definitions

  • the present invention relates to a preventive, suppressive or therapeutic agent for progressive immune demyelinating disease.
  • MS Multiple sclerosis
  • RR-MS relapsing-remitting MS
  • SP-MS secondary progressive MS
  • PR-MS progressive recurrent MS
  • RR-MS disease-modifying drugs are type 1 interferons, anti-inflammatory agents, immunosuppressive agents, and the like.
  • DMD RR-MS disease-modifying drugs
  • Symptomatic treatment such as intrathecal injection of baclofen and administration of continuous 4-aminopyridine preparation occupies an important position as a treatment policy for advanced MS.
  • Non-Patent Document 4 states that in the central nervous system (CNS) of SP-MS patients, a plurality of cells or tissues are damaged, and the damage extends not only to white matter but also to gray matter. Has been reported.
  • Non-Patent Document 4 shows that the expression level of the PAR2 receptor belonging to the PAR (Protease-activated receptor) receptor family is changed in the brain of a patient with multiple sclerosis, and the PAR2 receptor becomes a neuroinflammatory condition. It reports that it is involved.
  • EAE pathology In the NR4A2-deficient mice in which monophasic experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) was induced, the EAE pathology with normal limb paralysis was not observed in the early stage of induction, whereas the late stage (induction) It was found that EAE pathology (hereinafter also referred to as “late EAE pathology”) was observed about 28 days later) and that late EAE pathology became a model of progressive MS pathology (Patent Document 1). In addition, the present inventors consider that the late EAE pathology including neurodegeneration is caused by persistent neuronal damage caused by the release of granzyme B accompanying stimulation, and the PAR1 receptor is expressed using a PAR1 receptor antagonist or the like. It was found that the late EAE pathological condition was improved by the inhibition (Patent Document 2).
  • the present invention has been made in view of these circumstances, and has as its main object the prevention, the onset suppression, or the provision of a therapeutic agent for the treatment of progressive immune demyelinating disease. Another object of the present invention is to provide a method for preventing or suppressing progression to progressive immune demyelinating disease.
  • the present inventors induced the expression of Thome Eome molecule by stimulation with antigen-presenting cells derived from CNS, and the expression of Promesin produced by antigen-presenting cells is expressed by Eome molecules. Newly found to promote induction.
  • the present invention is based on these new findings. It is known that prolactin is produced not only from the pituitary gland but also from brain tissues other than the pituitary gland, mammary gland, papillary tissue, placenta, uterus, immune tissue (eg, lymphocytes, thymus, spleen). It has been. These prolactins are also called ectopic prolactins, in distinction from pituitary-derived prolactins.
  • the present invention provides the following (1) to (15).
  • a preventive, onset-suppressing, or therapeutic agent for progressive immune demyelinating disease which contains a substance that suppresses or inhibits the production of prolactin as an active ingredient.
  • the preventive, onset suppressing, or therapeutic agent for progressive immune demyelinating disease according to (1) wherein the substance includes a substance that suppresses or inhibits Zbtb20 production.
  • a method for preventing or suppressing progression to advanced immune demyelinating disease comprising administering to a subject a substance that suppresses or inhibits production of prolactin.
  • the substance includes a substance that suppresses or inhibits Zbtb20 production.
  • the substance comprises a dopamine receptor agonist or a dopamine receptor partial agonist.
  • a preventive, suppressive or therapeutic agent for progressive immune demyelinating disease which contains, as an active ingredient, a substance that suppresses or inhibits CX3CR1 receptor activation.
  • To diagnose progression to advanced immune demyelinating disease including collecting microglia from a human subject and measuring the expression level of at least one of IL-9, IFN- ⁇ and IFN- ⁇ 1 To collect data.
  • the present invention it is possible to prevent progressive immune demyelinating disease, to provide a suppressive or therapeutic agent, and to provide a method for preventing or suppressing progression to progressive immune demyelinating disease.
  • FIG. 10 is a cytogram showing CD107a and Eomes expression in Th cells co-cultured with antigen-presenting cells (CD19 + B cells and non-B / class II + cells) infiltrating into the CNS of NR4A2-deficient mice induced with single phase EAE.
  • FIG. 1 is a graph showing Eome expression levels of Th cells co-cultured with antigen-presenting cells (CD19 + B cells and non-B / class II + cells) infiltrating into the CNS of NR4A2-deficient mice induced with single phase EAE (FIG. 1). Summary data).
  • FIG. 10 is a cytogram showing CD107a and Eomes expression in Th cells co-cultured with antigen-presenting cells (CD19 + B cells and non-B / class II + cells) infiltrating into the CNS of NR4A2-deficient mice induced with single phase EAE.
  • FIG. 3 (a) is a graph showing the time when the brain and spinal cord were collected in each progression of EAE pathology, and the three dotted lines indicate the collection times corresponding to the initial EAE pathology, the middle EAE pathology, and the late EAE pathology, respectively.
  • FIG. 3 (b) is a graph showing the T cell cytogram and the ratio of Eomes + CD4 + T cells in each progression of EAE pathology.
  • 2 is a graph showing the cytogram of CD19 + B cells and CD19 ⁇ classII + cells and the ratio of each cell in each progression of EAE pathology.
  • FIG. 2 is a cytogram and a graph showing gene expression levels of IL-10 and Zbtb20 in B cells collected from CNS of mice with late EAE pathological conditions.
  • FIG. 2 is a cytogram and graph showing the gene expression level of Zbtb20 in non-B antigen-presenting cells collected from CNS of mice with late EAE disease state. It is a graph which shows the expression level of prolactin and growth hormone in a pituitary gland. It is a graph which shows the Eome expression level in the spleen origin Th cell cultured in the presence or absence of prolactin. It is a cytogram which shows Eomes expression in the spleen origin CD226 + Th cell cultured in the presence or absence of prolactin.
  • 2 is a graph showing the expression level of a prolactin gene after L-dopa administration.
  • FIG. 31 (a) and 31 (b) are graphs showing clinical scores of EAE pathological mice after administration of anti-CD20 antibody.
  • FIG. 31 (c) is a graph showing the expression of Zbtb20 protein after administration of anti-CD20 antibody. It is a graph which shows the expression of Eomes protein and Zbtb20 protein after anti-CD20 antibody administration.
  • progressive immune demyelinating disease refers to a disease caused by damage of the myelin sheath caused by an immune reaction and progressing continuously without remission.
  • the progressive immune demyelinating disease is preferably a progressive immune demyelinating disease of the central nervous system.
  • progressive immune demyelinating diseases include progressive multiple sclerosis such as PP-MS, SP-MS, and PR-MS.
  • NR4A2 gene is also called Nurr1 gene, NOT gene, or RNR1 gene, and is a kind of orphan nuclear receptor.
  • the main expression site of the NR4A2 gene is the central nervous system, and is particularly strongly expressed in the ventral midbrain, brainstem, and spinal cord.
  • NR4A2 is induced in response to prostaglandins, growth factors, inflammatory cytokines, and T cell receptor cross-linking, and directly binds to DNA in a ligand-dependent or ligand-independent manner to control transcription.
  • the accession number of NCBI Reference Sequence of the transcription product of human NR4A2 gene is NM_006186.3.
  • the Eomes gene also called Eomesodermin or Tbr2
  • Tbr2 is a member of the T-box transcription factor family and is a protein involved in vertebrate development and differentiation.
  • the Eomes gene is known to be expressed in CD8 + T cells (cytotoxic T cells, CTL) and NK cells. It is also known to directly induce perforin and granzyme B expression.
  • the NCBI Reference Sequence accession numbers for the transcripts of the human Eomes gene are NM_001278182.1 (variant 1), NM_005442.3 (variant 2), and NM_001278183.1 (variant 3).
  • Zbtb20 is a protein belonging to one of the subfamilies of zinc finger proteins including C2H2 Kruppel-type zinc finger proteins and BTB / POZ domains. Zbtb20 is bound to the promoter of the prolactin gene and promotes the transcriptional activity of prolactin. Zbtb20 is highly expressed in all mature endocrine cell lines of the anterior pituitary gland. Zbtb20 deficiency significantly reduces prolactin expression and secretion.
  • the preventive, onset suppressing, or therapeutic agent for progressive immune demyelinating disease contains a substance that suppresses or inhibits the production of prolactin as an active ingredient.
  • the progressive immune demyelinating disease is preferably a progressive immune demyelinating disease of the central nervous system, more preferably secondary progressive multiple sclerosis (SP-MS).
  • SP-MS secondary progressive multiple sclerosis
  • substances that suppress or inhibit the production of prolactin include, for example, expression suppressing substances that suppress the expression of the prolactin gene, dopamine receptor agonists, dopamine receptor partial agonists, dopamine reuptake inhibitors, dopamine degrading enzymes Inhibitors, dopamine analogs, or substances that suppress or inhibit the production of Zbtb20.
  • the dopamine receptor agonist or partial agonist is preferably a dopamine D2 receptor agonist or partial agonist.
  • the expression inhibitor that suppresses the expression of the prolactin gene may be any substance that can suppress the function of prolactin as a protein.
  • the expression-suppressing substance include a substance that can suppress the expression of the prolactin gene at the transcription level or the translation level, and a substance that can bind to a functional site of prolactin and suppress the functional expression.
  • Examples of the substance capable of suppressing the expression of the prolactin gene at the transcription level or the translation level may be a nucleic acid, peptide, sugar or glycoprotein that suppresses the expression of the prolactin gene, a low molecular compound having a molecular weight of 1000 or less, and the like.
  • Examples of the nucleic acid that suppresses gene expression of prolactin include at least one selected from the group consisting of an antisense oligonucleotide, siRNA, shRNA, miRNA, and ribozyme against the prolactin gene.
  • Examples of the substance that can bind to a functional site of prolactin and suppress functional expression include an anti-prolactin antibody or an antigen-binding fragment thereof (for example, neutralizing antibody).
  • An expression inhibitory substance that suppresses the expression of prolactin can be designed and manufactured by a method known in this technical field based on information such as the genome sequence, mRNA sequence, protein sequence, and protein three-dimensional structure of the prolactin gene.
  • Dopamine receptor agonists include, for example, dopamine, apomorphine, bromocriptine, cabergoline, ciladopa, dihydrexidine, dinapsoline, doxanthrin (doxanthrine), epicrilipin, , Pramipexole, propylapomorphine, quinagolide, talipexol, ropinirole, rotigotine, roxindole, sumanilol.
  • Dopamine receptor agonists include, for example, dopamine, apomorphine, bromocriptine, cabergoline, ciladopa, dihydrexidine, dinapsoline, doxanthrin (doxanthrine), epicrilipin, , Pramipexole, propylapomorphine, quinagolide, talipexol, ropinirole, rotigotine, roxindole, sumanilol.
  • dopamine receptor partial agonists examples include aripiprazole, brexpiprazole, phencyclidine, salvinorin A, and quinpyrrole.
  • dopamine reabsorption inhibitors include, for example, altropane, amponelic acid, amineptin, BTCP, DBL-583, difluoropine, GBR-12833, GBR-12935, GBR-13069, GBR-13098, GYKI-52895 Lometopane, methylphenidate, RTI-229, and vanoxerin.
  • dopamine degrading enzyme inhibitors examples include monoaminoxidase B inhibitors such as selegiline and zonisamide, and catechol-O-methyltransferase (COMT) inhibitors such as entacapone.
  • monoaminoxidase B inhibitors such as selegiline and zonisamide
  • catechol-O-methyltransferase (COMT) inhibitors such as entacapone.
  • Examples of the dopamine-like compound include L-dopa (levodopa, L-3,4-dihydroxyphenylalanine) and droxidopa (L-threo-dihydroxyphenylserine).
  • the expression suppressing substance that suppresses the expression of the Zbtb20 gene may be any substance that can suppress the function of Zbtb20 as a protein.
  • the expression suppressing substance include a substance that can suppress the expression of the Zbtb20 gene at the transcription level or the translation level, and a substance that can bind to a functional site of Zbtb20 and suppress the functional expression.
  • the substance capable of suppressing the expression of the Zbtb20 gene at the transcriptional level or the translational level may include nucleic acids, peptides, sugars or glycoproteins that suppress the expression of the Zbtb20 gene, low molecular weight compounds having a molecular weight of 1000 or less, and the like. .
  • nucleic acid that suppresses the gene expression of Zbtb20 examples include at least one selected from the group consisting of antisense oligonucleotides, siRNA, shRNA, miRNA, and ribozymes for the Zbtb20 gene.
  • substances that can bind to the functional site of Zbtb20 and suppress functional expression include nucleic acids, peptides, sugars or glycoproteins that bind to the functional site of Zbtb20 and suppress functional expression, and have a molecular weight of 1000 or less
  • examples thereof include a low molecular weight compound, an anti-Zbtb20 antibody (for example, neutralizing antibody), or an antigen-binding fragment thereof.
  • An expression-inhibiting substance that suppresses the expression of Zbtb20 can be designed and manufactured by a method known in this technical field based on information such as the genomic sequence, mRNA sequence, protein sequence, and protein three-dimensional structure of the Zbtb20 gene.
  • the expression inhibitor that suppresses the expression of Zbtb20 may be, for example, a substance that inhibits or suppresses the microRNA122 / CUX1 / microRNA214 / ZBTB20 pathway. It is known that when microRNA 214 or microRNA 214 is forcibly expressed, the expression of Zbtb20 gene is suppressed (Kojima et al. Nature communications 2011, 2: 338, 1-10).
  • an expression inhibitor that suppresses the expression of Zbtb20 for example, a substance that suppresses the expression of LMP2A (Lent membrane protein 2A) and / or IRF4 (Interferon regulatory factor 4) may be used.
  • LMP2A-expressing B cells the expression of the Irf4 and Zbtb20 genes is enhanced, and it is known that the protein IRF4 encoded by Irf4 binds to the Zbtb20 promoter and enhances the expression of the Zbtb20 gene (Minamitani et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 2015, 112, 37, 11612-11617).
  • the content of the active ingredient (substance that suppresses or inhibits the production of prolactin) in the preventive, onset suppressing or therapeutic agent for progressive immune demyelinating disease according to the present embodiment is not particularly limited, for example, It may be 0.001 to 100% by mass based on the total amount of the preventive, onset suppressing or therapeutic agent for progressive immune demyelinating disease.
  • the preventive, suppressive or therapeutic agent for progressive immune demyelinating disease may be composed of only the above-mentioned active ingredient, and in addition to the above-mentioned active ingredient, it is used in the prevention, suppressive or treatment of multiple sclerosis.
  • Other additives such as excipients, buffers, stabilizers, antioxidants, binders, disintegrants, fillers, emulsifiers and flow control agents commonly used in the field of pharmaceutical technology. May be.
  • medical agent exhibits a therapeutic effect by a mechanism different from suppression or inhibition of the signal transduction started from a prolactin receptor.
  • drugs include voltage-gated sodium channel inhibitors (e.g., lamotrigine), potassium channel blockers (e.g., fampridine), voltage-gated calcium channel inhibitors (e.g., gabapentin), Siponimod (BAF312, Siponmod), HMG-CoA inhibitors (eg, statins such as Simvastatin), S1P receptor antagonists (eg, Fingolimod, FTY720), c-kit receptor inhibitors (eg, machininib ( Masinitib)), MIS 416, Toeluna, potassium-sparing diuretics (eg, Amiloride) Riluzole, phosphodiesterase inhibitors (eg, ibudilast (MN-166)), cyclophosphoamides, steroids (eg, methylprednisolone, prednisone), topoisomerase II inhibitors (eg, mitoxantrone) , ELND002, MD1003, Ritalin, quetia
  • the dosage form of the preventive, onset suppressing or treating agent for progressive immune demyelinating disease according to the first embodiment is, for example, powder, pill, granule, tablet, syrup, troche, capsule, injection Any dosage form may be used.
  • the preventive, onset-suppressing or therapeutic agent for progressive immune demyelinating disease according to the first embodiment may be administered orally or parenterally.
  • a specific dose for example, when administered to a human adult male (body weight 60 kg), the daily dose of a preventive, onset-suppressing or therapeutic agent for progressive immune demyelinating disease is usually an active ingredient.
  • the amount is 0.0001 ⁇ g to 10,000 mg / day / person in terms of amount.
  • the first embodiment is a method for preventing or suppressing the progression to advanced immune demyelinating disease, which comprises the step of administering a substance that suppresses or inhibits the production of prolactin to a human subject in need thereof. You can also.
  • the method according to the first embodiment prevents or suppresses the progression from relapsing-remitting immune demyelinating disease to progressive immune demyelinating disease.
  • the preventive, suppressive or therapeutic agent for progressive immune demyelinating disease according to the second embodiment of the present invention contains an anti-CX3CR1 antibody or an antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.
  • the progressive immune demyelinating disease is preferably a progressive immune demyelinating disease of the central nervous system, more preferably secondary progressive multiple sclerosis (SP-MS).
  • SP-MS secondary progressive multiple sclerosis
  • the anti-CX3CR1 antibody or antigen-binding fragment thereof may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • the anti-CX3CR1 antibody may be any of a mouse antibody, rat antibody, guinea pig antibody, hamster antibody, rabbit antibody, monkey antibody, dog antibody, chimeric antibody, humanized antibody or human antibody.
  • the anti-CX3CR1 antibody may be subjected to chemical modification in order to improve physical properties such as retention in blood. Further, the anti-CX3CR1 antibody may be one to which a radionuclide, a toxin or the like is bound in order to enhance the therapeutic effect.
  • the anti-CX3CR1 antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • the anti-CX3CR1 antibody may be any of a mouse antibody, rat antibody, guinea pig antibody, hamster antibody, rabbit antibody, monkey antibody, dog antibody, chimeric antibody, humanized antibody or human antibody.
  • the anti-CX3CR1 antibody may be subjected to chemical modification in order to improve physical properties such as retention in blood. Further, the anti-CX3CR1 antibody may be one to which a radionuclide, a toxin or the like is bound in order to enhance the therapeutic effect.
  • the antigen-binding fragment may be an antibody fragment containing an antigen-binding site of an antibody, and examples thereof include Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , scFv, and diabody.
  • the content of the active ingredient (anti-CX3CR1 antibody or antigen-binding fragment thereof) in the preventive, onset-suppressing or therapeutic agent for progressive immune demyelinating disease according to the present embodiment is not particularly limited. It may be 0.001 to 100% by mass based on the total amount of preventive, suppressive or therapeutic agent for type I immune demyelinating disease.
  • the preventive, suppressive or therapeutic agent for progressive immune demyelinating disease may be composed of only the above-mentioned active ingredient, and in addition to the above-mentioned active ingredient, it is used in the prevention, suppressive or treatment of multiple sclerosis.
  • Other additives such as excipients, buffers, stabilizers, antioxidants, binders, disintegrants, fillers, emulsifiers and flow control agents commonly used in the field of pharmaceutical technology. May be.
  • medical agent exhibits a therapeutic effect by a mechanism different from suppression or inhibition of the signal transmission which starts from a CX3CR1 receptor.
  • Other drugs are the same as those shown in the first embodiment.
  • the dosage form of the preventive, onset suppression or therapeutic agent for progressive immune demyelinating disease according to the second embodiment is, for example, powder, pill, granule, tablet, syrup, troche, capsule, injection Any dosage form may be used.
  • the preventive, onset-suppressing or therapeutic agent for progressive immune demyelinating disease according to the second embodiment may be administered orally or parenterally.
  • a specific dose for example, when administered to a human adult male (body weight 60 kg), the daily dose of a preventive, onset-suppressing or therapeutic agent for progressive immune demyelinating disease is usually an active ingredient.
  • the amount is 0.0001 ⁇ g to 10,000 mg / day / person in terms of amount.
  • the second embodiment is a method for treating advanced immune demyelinating disease or a method for suppressing progression of a disease state, comprising a step of administering an anti-CX3CR1 antibody or an antigen-binding fragment thereof to a human subject in need thereof. You can also.
  • mold immune demyelinating disease, onset suppression, and the progress suppression effect of a disease state are judged by analyzing the increase amount of Eome expression on the Th cell surface.
  • Examples of the method for analyzing the amount of increase in the expression level of Eome on the Th cell surface include a method of detecting Eome + CD4 + T cells in a body fluid collected from a human subject and containing lymphocytes.
  • the body fluid collected from the human subject may be a body fluid containing lymphocytes.
  • body fluids collected from human subjects include blood and cerebrospinal fluid.
  • the blood may be peripheral blood.
  • the detection of Eome + CD4 + T cells can be performed according to a conventional method in this technical field.
  • Detection of Eome + CD4 + T cells is not limited to this, for example, a step of separating PBMC from a body fluid sample collected from a human subject according to a conventional method, such as labeled anti-CD3 antibody or Reacting the antigen-binding fragment, the labeled anti-CD4 antibody or the antigen-binding fragment thereof, and the labeled anti-Eomes antibody or the antigen-binding fragment thereof with PBMC and detecting Eome + CD4 + T cells with a flow cytometer. It can be implemented by a method.
  • the present invention also diagnoses progression to advanced immune demyelinating disease comprising collecting microglia from a human subject and measuring the expression level of at least one of IL-9, IFN- ⁇ and IFN- ⁇ 1 It also provides a way to collect data to do.
  • the expression level of IFN- ⁇ , IFN- ⁇ 1, and IL-9 in microglia increases markedly in the progression of EAE pathology when it becomes a middle stage EAE pathology. That is, the significant increase in the expression level of these cytokines in microglia of human subjects can collect data for determining the progression to advanced immune demyelinating disease.
  • the increase in cytokines means that it is greater than the threshold value determined based on the expression level of cytokines in microglia of human subjects or healthy adults who are not suspected of progressing to progressive immune demyelinating disease.
  • NR4A2cKO mice EAE analysis of NR4A2cKO mice
  • NR4A2 fl / fl mice were established using a targeting vector with the NR4A2 gene sandwiched between loxp sequences. That is, the NR4A2 transgene sandwiched between loxp sequences was introduced into C57BL / 6 embryonic stem cells by microinjection. The established strain was crossed with C57BL / 6 FLPe mice (RIKEN BioResource Center) and the strains from which the neomycin cassette was removed were crossed to produce homozygous NR4A2 fl / fl C57BL / 6 mice.
  • mice were crossed with C57BL / 6 CD4-Cre mice (Taconic) to establish CD4-specific NR4A2cKO C57BL / 6 mice (C57BL / 6 Cre-CD4 / NR4A2 fl ⁇ fl mice).
  • EAE induction single phase EAE 100 ⁇ g of peptide corresponding to MOG 35-55 residue (synthesized at Toray Research Center, Tokyo, Japan, hereinafter also referred to as “MOG peptide”) and 1 mg of Mycobacterium tuberculosis H37Ra (Difco, Kansas, USA) Emulsified with complete Freund's adjuvant (CFA) was mixed in an equal amount and emulsified with a homogenizer to prepare a MOG emulsion.
  • MOG peptide single phase EAE 100 ⁇ g of peptide corresponding to MOG 35-55 residue (synthesized at Toray Research Center, Tokyo, Japan, hereinafter also referred to as “MOG peptide”) and 1 mg of Mycobacterium tuberculosis H37Ra (Difco, Kansas, USA) Emulsified with complete Freund's adjuvant (CFA) was mixed in an equal amount and emulsified with a homogenizer to prepare a MOG
  • the resulting MOG emulsion was applied subcutaneously to the back of CD4-specific NR4A2cKO C57BL / 6 mice (Cre-CD4 / NR4A2 fl / fl C57BL / 6 mice, NR4A2cKO) and NR4A2 fl / fl C57BL / 6 mice (Control) as controls.
  • 200 ⁇ L of a 200 ng pertussis toxin (List Biological Laboratories, USA) PBS solution was injected into the abdominal cavity of mice on the 0th and 2nd days after immunization.
  • RPMI 1640 medium (Invitrogen) containing 1.4 mg / mL collagenase H and 100 ⁇ g / mL DNaseI (Roche) for 40 minutes at 37 ° C. Further decomposed.
  • the obtained tissue homogenate was passed through a 70 ⁇ m cell strainer (manufactured by GE Healthcare Science), and white blood cells were concentrated using a discontinuous Percoll density gradient centrifugation method (37% / 80%).
  • CD19 + B cells and non-B / class II + cells infiltrated into the CNS were separated by FACS sorting using FACS ARIA II (manufactured by BD Cytometry Systems).
  • CD19 + B cells and non-B / class II + cells were co-cultured with CD226 + Th cells derived from the spleen for 8 hours, respectively. After culturing, changes in the expression levels of Eomes and CD107a in the collected Th cells were analyzed with a flow cytometer.
  • Anti-CD3 antibody manufactured by Biolegend
  • anti-Eomes antibody manufactured by eBioscience
  • anti-CD107a antibody manufactured by Biolegend
  • Eomes expression at each degree of progression of EAE pathology In the same manner as in (2), from the wild-type C57BL / 6 mice in which monophasic EAE was induced, the brain and spinal cord were transferred 10 days after induction (early EAE pathology), 14 days after (mid-stage EAE pathology), and 18 days after (late EAE pathology).
  • the CD4 + T cells that were collected and infiltrated into the CNS were separated using a flow cytometer. Note that the collection time corresponds to the initial period, the middle period, and the latter period in the graph of FIG.
  • RPMI 1640 medium (Invitrogen) containing 1.4 mg / mL collagenase H and 100 ⁇ g / mL DNaseI (Roche) for 40 minutes at 37 ° C. Further decomposed.
  • the obtained tissue homogenate was passed through a 70 ⁇ m cell strainer (manufactured by GE Healthcare Science), and white blood cells were concentrated using a discontinuous Percoll density gradient centrifugation method (37% / 80%).
  • CD4 + T cells infiltrated into the CNS were separated by FACS sorting using FACS ARIA II (manufactured by BD Cytometry Systems).
  • FIG. 3 (b) shows the ratio (%) of Eome + T cells to CD4 + T cells at each degree of progression of the disease state. In late EAE pathology, it was observed that the proportion of Eomes + CD4 + T cells was significantly increased.
  • CD45 hi cells, CD19 + B cells, and CD19 ⁇ B cells infiltrated into the CNS were separated from the collected brain and spinal cord using a flow cytometer. Separated CD45 hi cells, CD19 + B cells, and CD19 ⁇ B cells were separated by FACS sorting.
  • Anti-CD45 antibody manufactured by Biolegend
  • anti-CD19 antibody manufactured by Biolegend
  • anti-TCR ⁇ antibody manufactured by Biolegend
  • anti-MHC class II antibody manufactured by Biolegend
  • EB means CD19 + B cells extracted in the early EAE state
  • ED means non-B / classII + cells extracted in the early EAE state
  • MB is mid-phase. It means the CD19 + B cells, which are extracted with EAE state
  • MD the medium-term EAE refers to the non-B / classII + cells that have been extracted in the state
  • LB is CD19 + B extracted by the late EAE state
  • LD means non-B / classII + cells extracted in late EAE state.
  • mice were anesthetized by intraperitoneal administration (ip) of a triple mixed anesthetic (medetomidine, midazolam, butorphanol).
  • a triple mixed anesthetic medetomidine, midazolam, butorphanol
  • an untreated mouse a mouse having an early EAE disease state, a mouse having an intermediate EAE disease state, or a mouse having a late EAE disease state was used.
  • the skin of the occipital region of each mouse was incised in an arrowhead shape, the subcutaneous tissue and muscle were carefully separated, and the surface of the dura mater covering the cisterna was exposed.
  • a glass capillary was punctured into the exposed dura mater, and CSF was collected using capillary action.
  • the obtained CSF was stored in a freezer at ⁇ 80 ° C.
  • the protein expression levels of prolactin (PRL) and growth hormone (GH) in the collected CSF were measured using a Luminex system (manufactured by Luminex Corporation).
  • FIG. 8A is a graph summarizing the ratio of Eomes + cells based on each flow cytogram shown in FIG.
  • FIG. 8B is a graph showing the relative expression level of prolactin protein in each cell. Also in FIG. 8, when cultured in the presence of 30 ng / mL prolactin, it was observed that the expression level of prolactin protein was increased.
  • FIG. 9 The results are shown in FIG. “EB”, “MB”, “LB”, “ED”, “MD”, and “LD” in FIG. 9 have the same definitions as in FIG. According to FIG. 9, it was observed that the gene expression levels of prolactin and Zbtb20 were increased in CNS-derived antigen-presenting cells in the late EAE state.
  • RPMI 1640 medium (Invitrogen) containing 1.4 mg / mL collagenase H and 100 ⁇ g / mL DNaseI (Roche) for 40 minutes at 37 ° C. was further decomposed.
  • the obtained tissue homogenate was passed through a 70 ⁇ m cell strainer (manufactured by GE Healthcare Science), and white blood cells were concentrated using a discontinuous Percoll density gradient centrifugation method (37% / 80%).
  • CD19 + B cells and non-B / class II + cells infiltrated into the CNS were analyzed using FACS CANTO II (manufactured by BD Cytometry Systems).
  • FIG. 11 (a) is a graph of the ratio of Zbtb20 + cells, and it was observed that Zbtb20 expression was significantly increased in the late EAE pathology.
  • FIG. 11 (b) when the expression level of the prolactin gene (Prl) in B cells and non-B antigen-presenting cells was measured, the relative expression level of the prolactin gene (Prl) was found in the late EAE pathology. A significant increase was observed.
  • B cells collected from the CNS of mice with late EAE disease were cultured for 6 hours in the presence of 10 ng / mL lipopolysaccharide (LPS) and BD GolgiPlug.
  • the cultured B cells were separated into four types of fractions (Fr1, Fr2, Fr3, Fr4) as shown in FIG. 12 (a) based on the staining state of the CD1d and CD5 genes.
  • the gene expression levels of IL-10 and Zbtb20 from each fraction were measured using a FACS plot. The result is shown in FIG.
  • Non-B antigen-presenting cells collected from the CNS of late EAE pathological mice were stained and subjected to FACS analysis.
  • Non-B antigen-presenting cells were separated into three fractions (Fr1, Fr2, Fr3) as shown in FIG. 13 (a) based on the staining state of CD11c and PDCA-1 genes.
  • the gene expression level of Zbtb20 from each fraction was measured using a FACS plot.
  • Anti-CD11c antibody manufactured by Biolegend
  • anti-PDCA-1 antibody manufactured by eBioscience
  • anti-zbtb20 antibody manufactured by Becton Dickinson
  • prolactin (PRL) and growth hormone (GH) in the serum were measured using a Luminex system. The result is shown in FIG. In all stages of EAE pathology, prolactin (PRL) levels in serum were observed to be significantly lower than that of untreated mice.
  • CD19 + B cells, PDCA-1 + CD11c + plasmacytoid dendritic cells (pDC), CD45 int CD11b + microglia from the CNS of untreated or early, intermediate or late EAE pathological mice using FACS ARIA Cells were purified and the expression levels of these prolactin genes (Prl) and zbtb20 genes were measured using quantitative real-time PCR.
  • the antibodies used for the detection were anti-CD19 antibody (manufactured by Biolegend), anti-PDCA-1 antibody (manufactured by eBioscience), anti-CD45 antibody (manufactured by Biolegend), anti-CD11c antibody (manufactured by Biolegend), anti-zbtb20 antibody (Becton Dickinson) was used.
  • a Mouse pituitary magnetic bead panel (Millipore) was used.
  • Quantitative real-time PCR was performed using commercially available primers (QuantiTect Primer Assay, QT01074332, manufactured by Qiagen).
  • the Eomes gene expression level was corrected based on the expression level of the GAPDH housekeeping gene.
  • FIG. 15 The results are shown in FIG. In FIG. 15, 1 indicates a culture without addition of prolactin, 2 indicates a culture in the presence of a low concentration of prolactin, and 3 indicates a culture in the presence of a high concentration of prolactin.
  • the vertical axis in FIG. 15 represents the relative expression level of Eome relative to the housekeeping gene ( ⁇ 2 microglobulin), and the Eome expression level increased depending on the concentration of prolactin.
  • Results are shown in FIG. The arrow in FIG. 17 indicates the day on which bromocriptine was administered. Administration of bromocriptine significantly suppressed the late EAE pathology.
  • the obtained tissue homogenate was passed through a 70 ⁇ m cell strainer (manufactured by GE Healthcare Science), and white blood cells were concentrated using a discontinuous Percoll density gradient centrifugation method (37% / 80%).
  • Th cells infiltrated into the CNS were separated by FACS sorting using FACS ARIA II (BD Cytometry Systems). Changes in the expression levels of Eomes and CD4 in the collected Th cells were analyzed with a flow cytometer.
  • Anti-CD4 antibody manufactured by Biolegend
  • anti-Eomes antibody manufactured by eBioscience
  • FIG. 19 is a graph showing changes in the ratio of Eome + CD4 + T cells and the actual number of cells.
  • CD19 + B cells and non-B / class II + cells were co-cultured with CD4 + Th cells derived from the spleen for 8 hours, respectively. After culturing, changes in the expression levels of Eomes and CD107a in the collected Th cells were analyzed with a flow cytometer.
  • anti-Eomes antibody manufactured by eBioscience
  • anti-CD107a antibody manufactured by Biolegend
  • the separated cells were co-cultured with CD4 + T cells separated by FACS sorting from spleens from untreated mice of the same gene lineage in the presence of FITC-conjugated anti-CD107a antibody. After co-culture for 8 hours, each cell was stained and analyzed for Eomes expression.
  • anti-CD4 antibody manufactured by Biolegend
  • anti-Eomes antibody manufactured by eBioscience
  • anti-CD45 antibody manufactured by Biolegend
  • FITC-conjugated anti-CD107a antibody manufactured by Biolegend
  • FIG. 22 (a) shows the gene expression level in CD19 + B cells
  • FIG. 22 (b) shows the gene expression level in CD19 ⁇ CD45 hi non-B / classII + antigen-presenting cells. In either case, it was observed that the expression levels of prolactin and Zbtb20 gene were significantly reduced by culturing in the presence of dopamine.
  • the EAE score of each mouse is shown in FIG. It was observed that the EAE score was significantly improved by repeated administration of L-dopa. In the right graph of FIG. 23, a dotted line shows a 95% confidence interval. Comparison of cumulative EAE scores also confirmed an improvement in EAE scores by repeated administration of L-Dopa.
  • CD4 + T cells, CD19 + B cells and CD19 ⁇ CD45 hi non-B / class II + antigen-presenting cells infiltrated into the CNS were collected as FACS ARIA II (BD Separation was performed by FACS sorting using Cytometry Systems. Each separated cell was stained and analyzed for expression of Eomes and Zbtb20 genes.
  • Anti-CD4 antibody manufactured by Biolegend
  • anti-Eomes antibody manufactured by eBioscience
  • anti-CD19 antibody manufactured by Biolegend
  • anti-Zbtb20 antibody manufactured by Becton Dickinson
  • results are shown in FIG. As shown in FIG. 26, administration of the anti-CX3CR1 antibody (CX3CR1) significantly improved the late EAE disease state compared to the case of isotype administration (Isotype).
  • CD4 + cells were separated.
  • CD4 + cells obtained were measured proportions and absolute quantities for CD4 + cells Eomes + CD4 + cells and Eomes ++ CD4 + cells (Eomes strongly positive CD4 + Th cells).
  • the vertical axis of the right graph in FIG. 28 indicates the cumulative clinical score. Control scrambled siRNA-administered mice had a clinical score comparable to that of untreated mice, whereas Zbtb20-specific siRNA-administered mice showed a marked decrease in clinical score.
  • the right graph in FIG. 28 is a graph showing the cumulative clinical score, and the dotted line indicates the 95% confidence interval.
  • Anti-CD4 antibody (manufactured by Biolegend), anti-Eomes antibody (manufactured by eBioscience), anti-CD19 antibody (manufactured by Biolegend), and anti-Zbtb20 antibody (manufactured by Becton Dickinson) were used as antibodies used for detection.
  • FIG. 29 (a) is a graph for comparing the ratio of cells expressing Eomes and Zbtb20 in each mouse group.
  • Antigen-presenting cells were isolated from CNS of late EAE pathological mice using untreated mice, mice treated with Zbtb20-specific siRNA and mice administered with control scrambled siRNA as in (1). From the obtained antigen-presenting cells, CD19 ⁇ CD45 hi non-B / classII + antigen-presenting cells were purified by FACS sorting using FACS ARIA II (manufactured by BD Cytometry Systems).
  • Purified cells were transduced with Zbtb20-specific siRNA or control scrambled siRNA and cultured for 24 hours in the presence of LPS, and then quantitative expression of Zbtb20 and prolactin (Prl) was measured using quantitative real-time PCR.
  • Anti-CD4 antibody manufactured by Biolegend
  • anti-Eomes antibody manufactured by eBioscience
  • anti-CD19 antibody manufactured by Biolegend
  • anti-CD45 antibody manufactured by Biolegend
  • Results are shown in FIGS. 31 (a) and (b).
  • the arrows in FIGS. 31 (a) and 31 (b) indicate the day on which the antibody was administered.
  • FIG. 31 (a) shows the result of administering the antibody 7 days before the induction
  • FIG. 31 (b) shows the result of administering the antibody 13 days after the induction.
  • administration of anti-CD20 antibody 13 days after induction significantly improved the clinical score.
  • the right graph in FIG. 31 (b) is a graph showing the cumulative clinical score, and the dotted line indicates the 95% confidence interval.
  • the antibodies used for the detection were anti-CD4 antibody (manufactured by Biolegend), anti-Eomes antibody (manufactured by eBioscience), anti-CD20 antibody (manufactured by Biolegend), anti-CD45 antibody (manufactured by Biolegend), anti-Zbtb20 antibody (Becton) Dickinson) was used.
  • FIGS. 31 (c) and 32 The results are shown in FIGS. 31 (c) and 32. As shown in FIG. 31 (c), it was observed that in the mice administered with anti-CD20 antibody, both the expression of the Eomes gene in CD4 + T cells and the expression of the Zbtb20 gene in B cells were remarkably suppressed.
  • FIG. 32 is a graph for comparing the ratio of cells expressing Eomes and Zbtb20 in each mouse group.
  • Changes in Zbtb20 gene expression by various cytokines (1) Changes in Zbtb20 gene expression by various cytokines Spleen-derived CD19 + B cells were isolated and purified by FACS sorting using FACS ARIA II (manufactured by BD Cytometry Systems). The purified B cells were cultured for 24 hours in the presence or absence of LPS in the presence or absence of cytokines shown in FIG. After the culture, the expression level of the Zbtb20 gene in each cell was measured. Anti-CD19 antibody (manufactured by Biolegend) and anti-Zbtb20 antibody (manufactured by Becton Dickinson) were used as the antibodies used for detection.
  • FIG. 33 (a) the expression level of the Zbtb20 gene in cells cultured in the absence of cytokines is shown by a gray graph, and the expression level when cultured in the presence of various cytokines is shown by a black line graph. It was observed that the expression of Zbtb20 gene increased when cultured in the presence of the indicated cytokines, and that the increase in expression of Zbtb20 gene was most remarkable when cultured in the presence of IFN ⁇ or IFN ⁇ 1.
  • FIG. 33 (b) is a graph of the ratio of Zbtb20 + cells under each condition.
  • FIG. 34 shows, by FACS plot, how many times the ratio of Zbtb20 + cells or Prl + cells has increased when cultured in the presence of various cytokines and in the absence of cytokines.
  • ProCartaPlex Mouse IFNa / b (manufactured by ThermoFisher) was used, and for detection of other cytokines, BioPlex Pro Cytokine GI 23-plex panel and BioPlex Pr Cytokine GIIIp17G8THR 8B Used).
  • FIGS. FIG. 35 shows the expression levels of IL-1 ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-6, IL-9, IL-12 (p40), IL-12 (p70), and IFN- ⁇ .
  • FIG. 35 (a) shows the expression levels of IFN- ⁇ and IFN- ⁇ .
  • FIG. 35 (b) shows the expression level of IFN ⁇ 2 or IFN ⁇ 1 in CNS-derived B cells, pDC, and microglia.
  • FIG. 35 (c) shows IL-6 and IL-9 in CNS-derived B cells, pDC, and microglia.
  • the expression level of Cxcl13 is shown.
  • FIGS. 35 (b) and (c) it was observed that the expression levels of IFN- ⁇ 2, IFN- ⁇ 1, and IL-9 were significantly increased in the microglia in the middle stage EAE pathology.

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Abstract

本発明は、プロラクチンの産生を抑制又は阻害する物質を有効成分として含有する、進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤を提供する。

Description

進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤
　本発明は、進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤に関する。
　多発性硬化症（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＭＳ）とは、自己免疫疾患のひとつで、髄鞘及び神経軸索を標的とする多発性炎症が惹起され、広汎な脱髄に起因する神経伝導障害を引き起こす疾患である。多発性硬化症の病態が進行すると、運動障害や視覚障害などの重篤な神経症状が現れる。
　多発性硬化症は、急性増悪と寛解を繰り返す再発寛解型ＭＳ（ＲＲ－ＭＳ）と、進行型ＭＳがある。進行型ＭＳには、一次進行型ＭＳ（ＰＰ－ＭＳ）と、ＲＲ－ＭＳ病態が一定期間続いた後に進行性の病態へと移行する二次進行型ＭＳ（ＳＰ－ＭＳ）、及び再発を繰り返しながら進行する進行再発型ＭＳ（ＰＲ－ＭＳ）が知られている（非特許文献１～３）。
　ＲＲ－ＭＳの疾患修飾性治療薬（ｄｉｓｅａｓｅ－ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ　ｄｒｕｇｓ：ＤＭＤ）として、１型インターフェロン、抗炎症剤、免疫抑制剤等が知られている。一方、進行型ＭＳに対してＲＲ－ＭＳのＤＭＤを適用しても効果がなく、現在のところ進行型ＭＳに対する有効なＤＭＤは知られていない。進行型ＭＳの治療方針としては、バクロフェンの髄注、持続性４－アミノピリジン製剤の投与等の対症療法が重要な位置を占めている。
　これまでのところ、進行型ＭＳ病態の形成機序は、ＲＲ－ＭＳ病態の形成機序との異同を含めて明らかではない。一方、非特許文献４には、ＳＰ－ＭＳ患者の中枢神経系（ＣＮＳ）では、複数の細胞又は組織において障害が生じており、またその障害が白質だけでなく灰白質にもおよんでいることが報告されている。また非特許文献４は、多発性硬化症患者の脳内において、ＰＡＲ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）受容体ファミリーに属するＰＡＲ２受容体の発現量が変化しており、ＰＡＲ２受容体が神経の炎症症状に関与していることを報告している。
　本発明者らは、単相型の実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウスでは、誘導初期に通常の四肢麻痺を伴うＥＡＥ病態が観察されない一方で、誘導後期（誘導後約２８日以降）にＥＡＥ病態（以下、「後期ＥＡＥ病態」ともいう。）が観察されること、及び後期ＥＡＥ病態が進行型ＭＳ病態のモデルになることを見出した（特許文献１）。また、本発明者らは、神経変性を含む後期ＥＡＥ病態が、刺激に伴うグランザイムＢの放出による持続的な神経細胞障害に起因するものと考え、ＰＡＲ１受容体アンタゴニスト等を用いてＰＡＲ１受容体を阻害することにより、後期ＥＡＥ病態が改善することを見出した（特許文献２）。
国際公開第２０１６／００２８２７号 国際公開第２０１６／１１４３８６号
Ｎａｔｕｒｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ　２０１２，８，６４７－６５６． Ｎａｔｕｒｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ　２０１３，９，４９６－５０３． Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　Ｊｏｕｒｎａｌ　２０１３，１９：　１４２８－１４３６． Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ　１８０２（２０１０），６６－７９．
　本発明は、これらの事情に鑑みてなされたものであり、進行型免疫性脱髄疾患治療の予防、発症抑制又は治療剤の提供を主な目的とする。本発明はまた、進行型免疫性脱髄疾患への進行を予防又は抑制する方法の提供も目的とする。
　本発明者らは、ＮＲ４Ａ２欠損マウスの後期ＥＡＥ病態において、ＣＮＳ由来の抗原提示細胞による刺激により、Ｔｈ細胞のＥｏｍｅｓ分子の発現が誘導されること、抗原提示細胞が産生するプロラクチンがＥｏｍｅｓ分子の発現誘導を促進することを新たに見出した。本発明は、これらの新規知見に基づくものである。なお、プロラクチンは、脳下垂体だけではなく、脳下垂体以外の脳組織、乳腺、乳頭組織、胎盤、子宮、免疫組織（例えば、リンパ球、胸腺、脾臓）等からも産生されることが知られている。これらのプロラクチンは、脳下垂体由来のプロラクチンと区別して、異所性プロラクチンとも呼ばれる。
　すなわち、本発明は、以下の（１）～（１５）を提供する。
（１）プロラクチンの産生を抑制又は阻害する物質を有効成分として含有する、進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤。
（２）上記物質が、Ｚｂｔｂ２０生成を抑制又は阻害する物質を含む、（１）に記載の進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤。
（３）上記物質が、ドパミン受容体アゴニスト又はドパミン受容体部分アゴニストを含む、（１）に記載の進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤。
（４）上記進行型免疫性脱髄疾患が二次進行型多発性硬化症である、（１）～（３）のいずれかに記載の進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤。
（５）プロラクチンの産生を抑制又は阻害する物質を対象に投与することを含む、進行型免疫性脱髄疾患への進行を予防又は抑制する方法。
（６）上記物質が、Ｚｂｔｂ２０生成を抑制又は阻害する物質を含む、（５）に記載の方法。
（７）上記物質が、ドパミン受容体アゴニスト又はドパミン受容体部分アゴニストを含む、（５）に記載の方法。
（８）上記進行型免疫性脱髄疾患が二次進行型多発性硬化症である、（５）～（７）のいずれかに記載の方法。
（９）進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤を製造するための、プロラクチンの産生を抑制又は阻害する物質の使用。
（１０）上記物質が、Ｚｂｔｂ２０生成を抑制又は阻害する物質を含む、（９）に記載の使用。
（１１）上記物質が、ドパミン受容体アゴニスト又はドパミン受容体部分アゴニストを含む、（９）に記載の使用。
（１２）上記進行型免疫性脱髄疾患が二次進行型多発性硬化症である、（９）～（１１）のいずれかに記載の使用。
（１３）ＣＸ３ＣＲ１受容体の活性化を抑制又は阻害する物質を有効成分として含有する、進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤。
（１４）上記物質が、抗ＣＸ３ＣＲ１抗体又はその抗原結合断片である、（１３）に記載の進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤。
（１５）ヒト対象からミクログリアを採取し、ＩＬ－９、ＩＦＮ－α及びＩＦＮ－β１の少なくとも１種の発現量を測定することを含む、進行型免疫性脱髄疾患への進行を診断するためのデータを収集する方法。
　本発明によれば、進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤の提供、および進行型免疫性脱髄疾患への進行を予防又は抑制する方法の提供が可能となる。
単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウスのＣＮＳへ浸潤した抗原提示細胞（ＣＤ１９＋Ｂ細胞及びｎｏｎ－Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋細胞）と共培養したＴｈ細胞におけるＣＤ１０７ａ及びＥｏｍｅｓ発現を示すサイトグラムである。 単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウスのＣＮＳへ浸潤した抗原提示細胞（ＣＤ１９＋Ｂ細胞及びｎｏｎ－Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋細胞）と共培養したＴｈ細胞のＥｏｍｅｓ発現量を示すグラフである（図１のサマリーデータ）。 図３（ａ）は、各進行度のＥＡＥ病態における脳及び脊髄を採取した時期を示すグラフであり、３つの点線は、それぞれ初期ＥＡＥ病態、中期ＥＡＥ病態、後期ＥＡＥ病態に相当する採取時期を示す。図３（ｂ）は、各進行度のＥＡＥ病態におけるＴ細胞のサイトグラム及びＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を示すグラフである。 各進行度のＥＡＥ病態におけるＣＤ１９＋Ｂ細胞及びＣＤ１９－ｃｌａｓｓＩＩ＋細胞のサイトグラム及び各細胞の割合を示すグラフである。 単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウスのＣＮＳへ浸潤した抗原提示細胞（ＣＤ１９＋Ｂ細胞及びｎｏｎ－Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋細胞）におけるプロラクチン及び成長ホルモンの発現量を示すグラフである。 各進行度のＥＡＥ病態におけるＣＳＦ中のプロラクチン及び成長ホルモンの発現量を示すグラフである。 プロラクチン共存下培養によるＥｏｍｅｓ発現への影響を示すグラフである。 プロラクチン共存下培養によるＥｏｍｅｓ発現への影響を示すグラフである。 単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウスのＣＮＳへ浸潤した抗原提示細胞におけるプロラクチン及びＺｂｔｂ２０の遺伝子発現量を示すグラフである。 単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウスのＣＮＳへ浸潤した抗原提示細胞におけるＺｂｔｂ２０のタンパク質発現を示すサイトグラムである。 単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウスのＣＮＳへ浸潤した抗原提示細胞におけるＺｂｔｂ２０およびプロラクチンのタンパク質発現を示すグラフである。 後期ＥＡＥ病態のマウスのＣＮＳから採取したＢ細胞におけるＩＬ－１０及びＺｂｔｂ２０の遺伝子発現レベルを示すサイトグラム及びグラフである。 後期ＥＡＥ病態のマウスのＣＮＳから採取したｎｏｎ－Ｂ抗原提示細胞におけるＺｂｔｂ２０の遺伝子発現レベルを示すサイトグラム及びグラフである。 脳下垂体におけるプロラクチン及び成長ホルモンの発現量を示すグラフである。 プロラクチン存在下又は非存在下で培養した脾臓由来Ｔｈ細胞におけるＥｏｍｅｓ発現量を示すグラフである。 プロラクチン存在下又は非存在下で培養した脾臓由来ＣＤ２２６＋Ｔｈ細胞でのＥｏｍｅｓ発現を示すサイトグラムである。 単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウスに、ブロモクリプチンを投与したときのＥＡＥスコアを示すグラフである。 単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウスに、ブロモクリプチンを投与したあとでＣＮＳへ浸潤したＴｈ細胞のＥｏｍｅｓ発現を示すグラフである。 ブロモクリプチン投与後のＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を示すグラフである。 単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウスにブロモクリプチンを投与したときの、ＣＮＳへ浸潤したＴｈ細胞におけるＣＤ１０７ａ及びＥｏｍｅｓ発現を示すサイトグラムである。 ブロモクリプチン投与後のＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合及びＣＤ１０７ａ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を示すグラフである。 ドパミン投与後のＥｏｍｅｓ遺伝子の発現を示すグラフである。 Ｌ－ドパ投与後のＥＡＥ病態マウスの臨床スコアを示すグラフである。 Ｌ－ドパ投与後のＥｏｍｅｓタンパク質及びＺｂｔｂ２０タンパク質の発現を示すグラフである。 Ｌ－ドパ投与後のプロラクチン遺伝子の発現レベルを示すグラフである。 単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウスに、抗ＣＸ３ＣＲ１抗体を投与したときのＥＡＥスコアを示すグラフである。 単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウスに、抗ＣＸ３ＣＲ１抗体を投与したときのＣＤ４＋Ｔｈ細胞に対するＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔｈ細胞の割合を示すグラフである。 Ｚｂｔｂ２０特異的ｓｉＲＮＡ投与後のＥＡＥ病態マウスの臨床スコアを示すグラフである。 Ｚｂｔｂ２０特異的ｓｉＲＮＡ投与後のＥｏｍｅｓタンパク質及びＺｂｔｂ２０タンパク質の発現を示すグラフである。 Ｚｂｔｂ２０特異的ｓｉＲＮＡ投与後のプロラクチン遺伝子及びＺｂｔｂ２０遺伝子の発現を示すグラフである。 図３１（ａ）及び（ｂ）は、抗ＣＤ２０抗体投与後のＥＡＥ病態マウスの臨床スコアを示すグラフである。図３１（ｃ）は、抗ＣＤ２０抗体投与後のＺｂｔｂ２０タンパク質の発現を示すグラフである。 抗ＣＤ２０抗体投与後のＥｏｍｅｓタンパク質及びＺｂｔｂ２０タンパク質の発現を示すグラフである。 各種サイトカイン存在下での培養におけるＺｂｔｂ２０タンパク質の発現を示すグラフである。 各種サイトカイン存在下での培養におけるＺｂｔｂ２０遺伝子及びプロラクチン遺伝子の発現を示すグラフである。 ＥＡＥ病態の進行に伴う各種サイトカイン発現の変化を示すグラフである。 ＥＡＥ病態の進行に伴う各種サイトカイン発現の変化を示すグラフである。 後期ＥＡＥ病態マウスから採取したミクログリア存在下での培養におけるプロラクチン遺伝子及びＺｂｔｂ２０遺伝子の発現を示すサイトグラム及びグラフである。 ＥＡＥ病態の進行に伴う各種サイトカイン発現の変化を示すグラフである。 ＥＡＥ病態の進行に伴う各種サイトカイン発現の変化を示すグラフである。 ＥＡＥ病態の進行に伴う各種ケモカイン発現の変化を示すグラフである。
〔定義〕
　本明細書において、「進行型免疫性脱髄疾患」とは、免疫反応に起因する髄鞘の障害により生じる疾患であって、寛解することなく持続的に進行する疾患を意味する。進行型免疫性脱髄疾患は、好ましくは中枢神経系の進行型免疫性脱髄疾患である。進行型免疫性脱髄疾患としては、例えば、ＰＰ－ＭＳ、ＳＰ－ＭＳ及びＰＲ－ＭＳ等の進行型多発性硬化症が挙げられる。
　ＮＲ４Ａ２遺伝子は、Ｎｕｒｒ１遺伝子、ＮＯＴ遺伝子、又はＲＮＲ１遺伝子とも呼ばれ、オーファン核内受容体の１種である。ＮＲ４Ａ２遺伝子の主な発現部位は、中枢神経系であり、特に中脳腹側、脳幹、脊髄に強く発現している。また、ＮＲ４Ａ２は，プロスタグランジン、増殖因子、炎症性サイトカイン、Ｔ細胞受容体架橋に応答して発現が誘導され、リガンド依存性又はリガンド非依存性にＤＮＡと直接結合して転写を制御する。ヒトＮＲ４Ａ２遺伝子の転写産物のＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅのアクセッション番号は、ＮＭ＿００６１８６．３である。
　Ｅｏｍｅｓ遺伝子は、Ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ又はＴｂｒ２とも呼ばれ、Ｔ－ｂｏｘ転写因子族の一種であり、脊椎動物の発生や分化に係るタンパク質である。Ｅｏｍｅｓ遺伝子は、ＣＤ８＋Ｔ細胞（細胞障害性Ｔ細胞，ＣＴＬ）及びＮＫ細胞で発現していることが知られている。また、パーフォリン及びグランザイムＢの発現を直接誘導することが知られている。ヒトＥｏｍｅｓ遺伝子の転写産物のＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅのアクセッション番号は、ＮＭ＿００１２７８１８２．１（バリアント１）、ＮＭ＿００５４４２．３（バリアント２）、及びＮＭ＿００１２７８１８３．１（バリアント３）である。
　Ｚｂｔｂ２０は、Ｃ２Ｈ２　Ｋｒｕｐｐｅｌ系ジンクフィンガータンパク及びＢＴＢ／ＰＯＺドメインを含むジンクフィンガータンパクのサブファミリの１つに属するタンパクである。また、Ｚｂｔｂ２０は、プロラクチン遺伝子のプロモーターに結合しており、プロラクチンの転写活性を促進させる。Ｚｂｔｂ２０は、下垂体前葉の全ての成熟内分泌細胞系に高発現している。Ｚｂｔｂ２０の欠損は、プロラクチンの発現及び分泌を顕著に減少させる。
〔進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤〕
　本発明の第一の実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤は、プロラクチンの産生を抑制又は阻害する物質を有効成分として含有する。
　進行型免疫性脱髄疾患は、好ましくは中枢神経系の進行型免疫性脱髄疾患であり、より好ましくは二次進行型多発性硬化症（ＳＰ－ＭＳ）である。
　プロラクチンの産生を抑制又は阻害する物質としては、例えば、プロラクチン遺伝子の発現を抑制する発現抑制物質、ドパミン受容体アゴニスト、ドパミン受容体部分アゴニスト、ドパミン再吸収阻害薬（Ｄｏｐａｍｉｎｅ　ｒｅｕｐｔａｋｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、ドパミン分解酵素阻害薬、ドパミン類似化合物、又は、Ｚｂｔｂ２０生成を抑制又は阻害する物質が挙げられる。ドパミン受容体アゴニスト又は部分アゴニストは、ドパミンＤ２受容体アゴニスト又は部分アゴニストであることが好ましい。
　プロラクチン遺伝子の発現を抑制する発現抑制物質は、プロラクチンがタンパク質として機能することを抑制できる物質であればよい。当該発現抑制物質としては、例えば、プロラクチン遺伝子を転写レベル又は翻訳レベルで発現抑制することができる物質、プロラクチンの機能性部位に結合して機能発現を抑制することができる物質が挙げられる。
　プロラクチン遺伝子を転写レベル又は翻訳レベルで発現抑制することができる物質としては、例えば、プロラクチンの遺伝子発現を抑制する核酸、ペプチド、糖又は糖タンパク質、分子量１０００以下の低分子化合物等であってもよい。プロラクチンの遺伝子発現を抑制する核酸としては、例えば、プロラクチン遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びリボザイムからなる群から選ばれる少なくとも１種が挙げられる。
　プロラクチンの機能性部位に結合して機能発現を抑制することができる物質としては、例えば、抗プロラクチン抗体又はその抗原結合性断片（例えば、中和抗体）等が挙げられる。
　プロラクチンの発現を抑制する発現抑制物質は、プロラクチン遺伝子のゲノム配列、ｍＲＮＡ配列、タンパク質配列、タンパク質の立体構造等の情報に基づいて、本技術分野で公知の方法により設計及び製造することができる。
　ドパミン受容体アゴニストとしては、例えば、ドパミン、アポモルヒネ、ブロモクリプチン、カベルゴリン、キラドパ（Ｃｉｌａｄｏｐａ）、ジヒドレキシジン（Ｄｉｈｙｄｒｅｘｉｄｉｎｅ）、ジナプソリン（Ｄｉｎａｐｓｏｌｉｎｅ）、ドキサントリン（Ｄｏｘａｎｔｈｒｉｎｅ）、エピクリプチン、リスリド（Ｌｉｓｕｒｉｄｅ）、ペルゴリド、ピリベジル（Ｐｉｒｉｂｅｄｉｌ）、プラミペキソール、プロピルアポモルヒネ、キナゴリド（Ｑｕｉｎａｇｏｌｉｄｅ）、タリペキソール、ロピニロール、ロチゴチン、ロキシンドール（Ｒｏｘｉｎｄｏｌｅ）、スマニロール（Ｓｕｍａｎｉｒｏｌｅ）が挙げられる。
　ドパミン受容体部分アゴニストとしては、例えば、アリピプラゾール、ブレクスピプラゾール、フェンシクリジン、サルビノリンＡ、クインピロールが挙げられる。
　ドパミン再吸収阻害薬としては、例えば、アルトロパン、アンフォネリック酸、アミネプチン、ＢＴＣＰ、ＤＢＬ－５８３、ジフルオロピン（Ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｉｎ）、ＧＢＲ－１２７８３、ＧＢＲ－１２９３５、ＧＢＲ－１３０６９、ＧＢＲ－１３０９８、ＧＹＫＩ－５２８９５、ロメトパン（ｌｏｍｅｔｏｐａｎｅ）、メチルフェニデート、ＲＴＩ－２２９、ヴァノキセリンが挙げられる。
　ドパミン分解酵素阻害薬としては、例えば、セレギリン、ゾニサミド等のモノアミノキシダーゼＢ阻害薬、エンタカポン等のカテコール－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害薬が挙げられる。
　ドパミン類似化合物としては、例えば、Ｌ－ドパ（レボドパ、Ｌ－３，４－ジヒドロキシフェニルアラニン）、ドロキシドパ（Ｌ－トレオ－ジヒドロキシフェニルセリン）が挙げられる。
　Ｚｂｔｂ２０遺伝子の発現を抑制する発現抑制物質は、Ｚｂｔｂ２０がタンパク質として機能することを抑制できる物質であればよい。当該発現抑制物質としては、例えば、Ｚｂｔｂ２０遺伝子を転写レベル又は翻訳レベルで発現抑制することができる物質、Ｚｂｔｂ２０の機能性部位に結合して機能発現を抑制することができる物質が挙げられる。Ｚｂｔｂ２０遺伝子を転写レベル又は翻訳レベルで発現抑制することができる物質としては、例えば、Ｚｂｔｂ２０の遺伝子発現を抑制する核酸、ペプチド、糖又は糖タンパク質、分子量１０００以下の低分子化合物等であってもよい。Ｚｂｔｂ２０の遺伝子発現を抑制する核酸としては、例えば、Ｚｂｔｂ２０遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びリボザイムからなる群から選ばれる少なくとも１種が挙げられる。Ｚｂｔｂ２０の機能性部位に結合して機能発現を抑制することができる物質としては、例えば、Ｚｂｔｂ２０の機能性部位に結合して機能発現を抑制する核酸、ペプチド、糖又は糖タンパク質、分子量１０００以下の低分子化合物、抗Ｚｂｔｂ２０抗体（例えば、中和抗体）又はその抗原結合性断片等が挙げられる。
　Ｚｂｔｂ２０の発現を抑制する発現抑制物質は、Ｚｂｔｂ２０遺伝子のゲノム配列、ｍＲＮＡ配列、タンパク質配列、タンパク質の立体構造等の情報に基づいて、本技術分野で公知の方法により設計及び製造することができる。Ｚｂｔｂ２０の発現を抑制する発現抑制物質としては、例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ１２２／ＣＵＸ１／ｍｉｃｒｏＲＮＡ２１４／ＺＢＴＢ２０経路を阻害又は抑制する物質であってもよい。ｍｉｃｒｏＲＮＡ２１４又はｍｉｃｒｏＲＮＡ２１４を強制発現させると、Ｚｂｔｂ２０遺伝子の発現が抑制されることが知られている（Ｋｏｊｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ　ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　２０１１，　２：３３８，１－１０）。また、Ｚｂｔｂ２０の発現を抑制する発現抑制物質としては、例えば、ＬＭＰ２Ａ（Ｌａｔｅｎｔ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２Ａ）及び／又はＩＲＦ４（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｆａｃｔｏｒ　４）の発現を抑制する物質であってもよい。ＬＭＰ２Ａ発現Ｂ細胞では、Ｉｒｆ４及びＺｂｔｂ２０遺伝子の発現が亢進されており、Ｉｒｆ４によってコードされるタンパクＩＲＦ４はＺｂｔｂ２０プロモーターに結合し、Ｚｂｔｂ２０遺伝子の発現を亢進させることが知られている（Ｍｉｎａｍｉｔａｎｉ　ｅｔ　ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０１５，１１２，３７，１１６１２－１１６１７）。
　本実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤における上記有効成分（プロラクチンの産生を抑制又は阻害する物質）の含有量は、特に制限されるものではなく、例えば、進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤全量を基準として、０．００１～１００質量％であってよい。
　進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤は、上記有効成分のみで構成されていてもよく、また上記有効成分以外に、多発性硬化症の予防、発症抑制又は治療において使用されうる他の薬剤、製剤技術分野において常用される賦形剤、緩衝剤、安定化剤、抗酸化剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤及び流動添加調節剤等の添加剤を含有していてもよい。また、上記他の薬剤は、プロラクチン受容体から始まるシグナル伝達の抑制又は阻害とは、異なるメカニズムで治療効果を発揮するものであることが好ましい。
　他の薬剤としては、電位依存性ナトリウムチャネル阻害剤（例えば、ラモトリジン（Ｌａｍｏｔｒｉｇｉｎｅ））、カリウムチャネルブロッカー（例えば、ファムプリジン（Ｆａｍｐｒｉｄｉｎｅ））、電位依存性カルシウムチャネル抑制剤（例えば、ガバペンチン（Ｇａｂａｐｅｎｔｉｎ））、シポニモド（ＢＡＦ３１２、Ｓｉｐｏｎｉｍｏｄ）、ＨＭＧ－ＣｏＡ阻害剤（例えば、シンバスタチン（Ｓｉｍｂａｓｔａｔｉｎ）等のスタチン）、Ｓ１Ｐ受容体アンタゴニスト（例えば、フィンゴリモド（Ｆｉｎｇｏｌｉｍｏｄ、ＦＴＹ７２０）、ｃ－ｋｉｔ受容体阻害剤（例えば、マシチニブ（Ｍａｓｉｔｉｎｉｂ））、ＭＩＳ４１６、トエルナ（Ｔｏｅｌｕｎａ）、カリウム保持性利尿薬（例えば、アミロリド（Ａｍｉｌｏｒｉｄｅ））、リルゾール（Ｒｉｌｕｚｏｌｅ）、ホスホジエステラーゼ阻害剤（例えば、イブジラスト（Ｉｂｕｄｉｌａｓｔ、ＭＮ－１６６））、シクロフォスフォアミド、ステロイド（例えば、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン）、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えば、ミトキサントロン（Ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ））、ＥＬＮＤ００２、ＭＤ１００３、リタリン（Ｒｉｔａｌｉｎ）、フマル酸クエチアピン（Ｑｕｅｔｉａｐｉｎｅ　ｆｕｍａｒａｔｅ）、ＮＭＤＡ受容体阻害剤（例えば、メマンチン（Ｍｅｍａｎｔｉｎｅ））、タクロリムス（Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ）、テリフルノミド（Ｔｅｒｉｆｌｕｎｏｍｉｄｅ、ＨＭＲ１７２６）、ＢＨＴ－３００９－０１、サンフェノンＥＧＣＧ（サンフェノンエピガロカテキンガレート）、ＣＳ－０７７７、グラチラマー酢酸塩（Ｃｏｐｏｘｏｎｅ（登録商標））、ＯＮＯ－４６４１、プリン代謝拮抗剤（例えば、クラドリビン（Ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ））、リポ酸、イノシン、カンナビス、ナビキシモルス（Ｎａｂｉｘｉｍｏｌｓ、Ｓａｔｉｖｅｘ（登録商標））、エリスロポイエチン、インターフェロンβ－１ｂ、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、エストリオール、合成ミエリン塩基性タンパク部分ペプチド（例えば、ジルコチド（Ｄｉｒｕｃｏｔｉｄｅ、ＭＢＰ８２９８））、モノクローナル抗ヒトＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ））、ヒト化モノクローナル抗α４インテグリン抗体（例えば、ナタリツマブ（Ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ、ＢＧ００００２））、モノクロ－ナル抗ＣＤ２５抗体（例えば、ダクリツマブ（Ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ））、ヒト化モノクローナル抗ＩＬ－１２抗体、モノクローナル抗ＩＬ－１２／２３抗体（例えば、ＡＢＴ－８７４（Ｂｒｉａｋｉｎｕｍａｂ））、ヒト化モノクローナルＮｏｇｏ－Ａ抗体（例えば、Ｏｚａｎｅｚｕｍａｂ、ＧＳＫ１２２３２４９）等が挙げられる。
　第一の実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤の剤形は、例えば、散剤、丸剤、顆粒剤、錠剤、シロップ剤、トローチ剤、カプセル剤、注射剤等のいずれの剤形であってもよい。
　第一の実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤は、経口投与されてもよく、非経口投与されてもよい。具体的な投与量の一例として、例えば、ヒト成人男子（体重６０ｋｇ）に投与する場合、一日当たりの進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤の投与量は、通常、有効成分量換算で、０．０００１μｇ～１００００ｍｇ／日／人である。
　上記第一の実施形態は、それを必要とするヒト対象にプロラクチンの産生を抑制又は阻害する物質を投与するステップを含む、進行型免疫性脱髄疾患への進行を予防又は抑制する方法ということもできる。例えば、上記第一の実施形態に係る方法は、再発寛解型免疫性脱髄疾患から進行型免疫性脱髄疾患への進行を予防又は抑制する。
　本発明の第二の実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤は、抗ＣＸ３ＣＲ１抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含有する。
　進行型免疫性脱髄疾患は、好ましくは中枢神経系の進行型免疫性脱髄疾患であり、より好ましくは二次進行型多発性硬化症（ＳＰ－ＭＳ）である。
　抗ＣＸ３ＣＲ１抗体又はその抗原結合断片としては、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。抗ＣＸ３ＣＲ１抗体は、マウス抗体、ラット抗体、モルモット抗体、ハムスター抗体、ウサギ抗体、サル抗体、イヌ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体のいずれであってもよい。抗ＣＸ３ＣＲ１抗体は、血中滞留性等の物性を改善するために化学修飾を施したものであってもよい。また、抗ＣＸ３ＣＲ１抗体は、治療効果を高めるために、放射性核種、毒素等が結合したものであってもよい。
　抗ＣＸ３ＣＲ１抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。また、抗ＣＸ３ＣＲ１抗体は、マウス抗体、ラット抗体、モルモット抗体、ハムスター抗体、ウサギ抗体、サル抗体、イヌ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体のいずれであってもよい。抗ＣＸ３ＣＲ１抗体は、血中滞留性等の物性を改善するために化学修飾を施したものであってもよい。また、抗ＣＸ３ＣＲ１抗体は、治療効果を高めるために、放射性核種、毒素等が結合したものであってもよい。
　抗原結合性断片としては、抗体の抗原結合部位を含む抗体断片であればよく、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ダイアボディ等が挙げられる。
　本実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤における上記有効成分（抗ＣＸ３ＣＲ１抗体又はその抗原結合断片）の含有量は、特に制限されるものではなく、例えば、進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤全量を基準として、０．００１～１００質量％であってよい。
　進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤は、上記有効成分のみで構成されていてもよく、また上記有効成分以外に、多発性硬化症の予防、発症抑制又は治療において使用されうる他の薬剤、製剤技術分野において常用される賦形剤、緩衝剤、安定化剤、抗酸化剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤及び流動添加調節剤等の添加剤を含有していてもよい。また、上記他の薬剤は、ＣＸ３ＣＲ１受容体から始まるシグナル伝達の抑制又は阻害とは、異なるメカニズムで治療効果を発揮するものであることが好ましい。他の薬剤は、第一実施形態で示した薬剤と同一である。
　第二の実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤の剤形は、例えば、散剤、丸剤、顆粒剤、錠剤、シロップ剤、トローチ剤、カプセル剤、注射剤等のいずれの剤形であってもよい。
　第二の実施形態に係る進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤は、経口投与されてもよく、非経口投与されてもよい。具体的な投与量の一例として、例えば、ヒト成人男子（体重６０ｋｇ）に投与する場合、一日当たりの進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤の投与量は、通常、有効成分量換算で、０．０００１μｇ～１００００ｍｇ／日／人である。
　上記第二の実施形態は、それを必要とするヒト対象に抗ＣＸ３ＣＲ１抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む、進行型免疫性脱髄疾患の治療方法、又は病態の進行抑制方法ということもできる。
　上記第一又は第二の実施形態において、進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制、病態の進行抑制効果は、Ｔｈ細胞表面のＥｏｍｅｓ発現量が増加量を解析することにより、判断することができる。Ｔｈ細胞表面のＥｏｍｅｓ発現量が増加量の解析方法としては、例えば、ヒト対象から採取された、リンパ球を含む体液中のＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を検出する方法が挙げられる。ヒト対象から採取された体液は、リンパ球を含む体液であればよい。ヒト対象から採取された体液としては、例えば、血液、脳脊髄液が挙げられる。血液は、末梢血であってよい。Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の検出は、本技術分野における常法に従って行うことができる。
　Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の検出は、これに限定されるものではないが、例えば、ヒト対象から採取された、リンパ球を含む体液サンプルから常法に従いＰＢＭＣを分離するステップ、標識抗ＣＤ３抗体又はその抗原結合性断片、標識抗ＣＤ４抗体又はその抗原結合性断片、及び標識抗Ｅｏｍｅｓ抗体又はその抗原結合性断片をＰＢＭＣと反応させ、フローサイトメーターでＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を検出するステップを含む方法により実施することができる。
　本発明はまた、ヒト対象からミクログリアを採取し、ＩＬ－９、ＩＦＮ－α及びＩＦＮ－β１の少なくとも１種の発現量を測定することを含む、進行型免疫性脱髄疾患への進行を診断するためのデータを収集する方法も提供する。
　図３６に示すように、ＥＡＥ病態の進行過程において、中期ＥＡＥ病態になるとミクログリア内のＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β１、ＩＬ－９の発現量が顕著に増加する。すなわち、ヒト対象のミクログリアにおいて、これらのサイトカインの発現量が顕著に増加することは、進行型免疫性脱髄疾患への進行を判断するためのデータを収集することができる。
　サイトカインの増加は、進行型免疫性脱髄疾患への進行が疑われていないヒト対象又は健康成人のミクログリア内のサイトカインの発現量に基づいて定められた閾値よりも多いことを意味する。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
１．ＮＲ４Ａ２ｃＫＯマウスのＥＡＥ解析
（１）動物
　使用したマウスはすべて６～８週齢で、特定病原体不在条件下で飼育した。ｌｏｘｐ配列でＮＲ４Ａ２遺伝子を挟んだターゲッティングベクターを用いて、ＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌマウスを樹立した。すなわち、ｌｏｘｐ配列に挟まれたＮＲ４Ａ２導入遺伝子をＣ５７ＢＬ／６胚性幹細胞にマイクロインジェクションにより導入した。樹立系統をＣ５７ＢＬ／６　ＦＬＰｅマウス（理研バイオリソースセンター）と交雑させてネオマイシンカセットを除去した系統同士を交配して、ホモ接合ＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌ　Ｃ５７ＢＬ／６マウスを作製した。得られたマウスをＣ５７ＢＬ／６　ＣＤ４－Ｃｒｅマウス（タコニック社）と交配させることにより、ＣＤ４特異的ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ　Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃ５７ＢＬ／６　Ｃｒｅ－ＣＤ４／ＮＲ４Ａ２ｆｌ＼ｆｌマウス）を樹立した。
（２）ＥＡＥ誘導（単相型ＥＡＥ）
　１００μｇのＭＯＧ３５－５５残基に相当するペプチド（東レリサーチセンター，日本，東京にて合成、以下、「ＭＯＧペプチド」ともいう。）と１ｍｇの結核菌Ｈ３７Ｒａ死菌（Ｄｉｆｃｏ，米国，カンザス州）を完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）で乳化したものを等量混和し、ホモジナイザーを用いて乳化させ、ＭＯＧエマルジョンを調製した。得られたＭＯＧエマルジョンを、ＣＤ４特異的ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ　Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｒｅ－ＣＤ４／ＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌ　Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ）及び対照としてＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌ　Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）の背部皮下に１～２か所注射し、免疫を付与した。さらに、免疫付与後０日目と２日目に、１匹あたり、２００ｎｇの百日咳毒素（Ｌｉｓｔ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，米国）のＰＢＳ溶液２００μＬを、マウスの腹腔内に注射した。
（３）中枢神経系へのＴ細胞の浸潤
　上記１．（２）と同様に単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウス（ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ）及びＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）から、誘導１０日後（初期ＥＡＥ病態に相当）、誘導１４日後（中期ＥＡＥ病態に相当）及び誘導１８日後（後期ＥＡＥ病態に相当）に脳及び脊髄を採取し、フローサイトメーターを用いて、ＣＮＳへ浸潤したＣＤ１９＋Ｂ細胞及びｎｏｎ－Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋細胞を分離した。具体的には、組織を小さい破片に切断した後、３７℃で４０分間、１．４ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＨ及び１００μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ社製）を含有したＲＰＭＩ　１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）において更に分解した。得られた組織のホモジネートを７０μｍ細胞濾過器（ＧＥヘルスケアサイエンス社製）に通し、不連続パーコール密度勾配遠心分離法（３７％／８０％）を用いて、白血球細胞を濃縮した。次いで、ＣＮＳへ浸潤したＣＤ１９＋Ｂ細胞及びｎｏｎ－Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋細胞をＦＡＣＳ　ＡＲＩＡ　ＩＩ（ＢＤ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いたＦＡＣＳソートで分離した。分離したＣＤ１９＋Ｂ細胞及びｎｏｎ－Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋細胞を、それぞれ脾臓由来のＣＤ２２６＋Ｔｈ細胞と８時間、共培養した。培養後、回収したＴｈ細胞のＥｏｍｅｓ及びＣＤ１０７ａの発現量の変化をフローサイトメーターで解析した。分離の際に使用した抗体は、抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗Ｅｏｍｅｓ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ＣＤ１０７ａ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を用いた。
　結果を図１及び図２に示す。図１によれば、誘導１８日後のＥＡＥ発症マウス（後期ＥＡＥ病態に相当）では、ＣＮＳ由来の抗原提示細胞が、Ｔｈ細胞に対する顕著なＥｏｍｅｓ発現誘導能を有することが認められた。
（４）ＥＡＥ病態の各進行度におけるＥｏｍｅｓ発現
　上記１．（２）と同様に単相型ＥＡＥを誘導した野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスから、誘導１０日後（初期ＥＡＥ病態）、１４日後（中期ＥＡＥ病態）、１８日後（後期ＥＡＥ病態）に脳及び脊髄を採取し、フローサイトメーターを用いて、ＣＮＳへ浸潤したＣＤ４＋Ｔ細胞を分離した。なお、採取時期は、図３（ａ）のグラフにおける初期、中期、後期に相当する。具体的には、組織を小さい破片に切断した後、３７℃で４０分間、１．４ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＨ及び１００μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ社製）を含有したＲＰＭＩ　１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）において更に分解した。得られた組織のホモジネートを７０μｍ細胞濾過器（ＧＥヘルスケアサイエンス社製）に通し、不連続パーコール密度勾配遠心分離法（３７％／８０％）を用いて、白血球細胞を濃縮した。次いで、ＣＮＳへ浸潤したＣＤ４＋Ｔ細胞をＦＡＣＳ　ＡＲＩＡ　ＩＩ（ＢＤ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いたＦＡＣＳソートで分離した。
　分離したＣＤ４＋Ｔ細胞のＥｏｍｅｓ発現量の変化をフローサイトメーターで解析した。検出の際に使用した抗体は、抗ＣＤ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗Ｅｏｍｅｓ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いた。
　次に、各ＣＤ４＋Ｔ細胞に対して、細胞内染色を行い、Ｅｏｍｅｓ発現量を測定した。結果を図３（ｂ）に示す。図３（ｂ）のグラフは、病態の各進行度における、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＥｏｍｅｓ＋Ｔ細胞の割合（％）を示したものである。後期ＥＡＥ病態において、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合が、顕著に増加していることが観測された。
　また、採取した脳及び脊髄から、フローサイトメーターを用いて、ＣＮＳへ浸潤したＣＤ４５ｈｉ細胞、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＣＤ１９－Ｂ細胞を分離した。分離したＣＤ４５ｈｉ細胞、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＣＤ１９－Ｂ細胞をそれぞれＦＡＣＳソートで分離した。検出の際に使用した抗体は、抗ＣＤ４５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ＣＤ１９抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ＴＣＲβ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ＭＨＣｃｌａｓｓＩＩ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を用いた。
　結果を図４に示す。中期ＥＡＥ病態において、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＣＤ１９－ｎｏｎ－Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋抗原提示細胞のＣＮＳへの浸潤が顕著に増加し、後期ＥＡＥ病態では、これらの細胞が中期ＥＡＥ病態と比較して減少することが観測された。
（５）ＥＡＥ病態におけるプロラクチン及び成長ホルモンの遺伝子発現量
　上記１．（３）と同様に、ＥＡＥ発症マウスのＣＮＳから経時的にＣＤ１９＋Ｂ細胞及びｎｏｎ－Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋細胞を抽出し、プロラクチン（Ｐｒｌ）及び成長ホルモン（Ｇｈ）の遺伝子発現量を定量ＰＣＲ法にて解析した。プロラクチン及び成長ホルモンのプライマーとして、それぞれＭｍ＿Ｐｒｌ＿１＿ＳＧ　ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ａｓｓａｙ及びＭｍ＿Ｇｈ＿１＿ＳＧ　ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ａｓｓａｙ（いずれもＱＩＡＧＥＮ社）を用いた。
　結果を図５に示す。図５中、「ＥＢ」は前期ＥＡＥ状態で抽出されたＣＤ１９＋Ｂ細胞を意味し、「ＥＤ」は前期ＥＡＥ状態で抽出されたｎｏｎ－Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋細胞を意味し、「ＭＢ」は中期ＥＡＥ状態で抽出されたＣＤ１９＋Ｂ細胞を意味し、「ＭＤ」は中期ＥＡＥ状態で抽出されたｎｏｎ－Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋細胞を意味し、「ＬＢ」は後期ＥＡＥ状態で抽出されたＣＤ１９＋Ｂ細胞を意味し、「ＬＤ」は後期ＥＡＥ状態で抽出されたｎｏｎ－Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋細胞を意味する。図５によれば、後期ＥＡＥ状態のＣＮＳ由来の抗原提示細胞において、プロラクチン及び成長ホルモンの発現量が顕著に増加していることが観測された。
（６）ＥＡＥ病態の各進行度におけるＣＳＦ中のプロラクチン及び成長ホルモンの発現
　三種混合麻酔薬（メデトミジン、ミダゾラム、ブトルファノール）を腹腔内投与（ｉｐ）することにより、マウスを麻酔した。マウスは、無処置マウス、早期ＥＡＥ病態のマウス、中期ＥＡＥ病態のマウス、後期ＥＡＥ病態のマウスを用いた。各マウスの後頭部の皮膚を矢尻状に切開し、皮下組織と筋肉を注意深く分離し、大槽を覆う硬膜の表面を露出させた。露出した硬膜にガラスキャピラリーを穿刺し、毛管現象を利用してＣＳＦを収集した。得られたＣＳＦを－８０℃の冷凍庫で保管した。
　採取したＣＳＦ中のプロラクチン（ＰＲＬ）及び成長ホルモン（ＧＨ）のタンパク発現量を、Ｌｕｍｉｎｅｘ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｕｍｉｎｅｘ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を用いて測定した。
　結果を図６に示す。中期ＥＡＥ病態では、成長ホルモンのタンパク発現量が増加し、後期ＥＡＥ病態では、プロラクチン及び成長ホルモンのタンパク発現量が増加していることが観測された。
（７）プロラクチン共存下培養によるＥｏｍｅｓ発現への影響
　未処置の野生型Ｂ６マウスから採取した脾臓由来ＣＤ２２６＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を、プロラクチンの非存在下又は特定量のプロラクチンの存在下において、４時間又は８時間培養した。培養後の各細胞のＥｏｍｅｓ発現量を、フローサイトメーター又は定量的リアルタイムＰＣＲを用いて測定した。検出の際に使用した抗体は、抗ＣＤ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗Ｅｏｍｅｓ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いた。
　結果を図７に示す。培養時間にかかわらず、３０、１００ｎｇ／ｍＬのプロラクチン存在下で培養すると、ＣＤ４＋Ｅｏｍｅｓ＋Ｔ細胞の割合が顕著に増加していることが観測された。図８（ａ）は、図７に示す各フローサイトグラムに基づき、Ｅｏｍｅｓ＋細胞の割合をグラフにまとめたものである。図８（ｂ）は、各細胞のプロラクチンタンパクの相対発現量をグラフ化したものである。図８においても、３０ｎｇ／ｍＬのプロラクチン存在下で培養すると、プロラクチンタンパクの発現量が増加していることが観測された。
（８）ＥＡＥ病態の進行に伴うプロラクチン及びＺｂｔｂ２０の遺伝子発現量の変化
　上記１．（３）と同様に、ＥＡＥ発症マウスのＣＮＳから経時的にＣＤ１９＋Ｂ細胞及びｎｏｎ－Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋細胞を抽出し、プロラクチン及びＺｂｔｂ２０の遺伝子発現量を定量ＰＣＲ法にて解析した。プロラクチン及びＺｂｔｂ２０のプライマーとして、それぞれＭｍ＿Ｐｒｌ＿１＿ＳＧ　ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ａｓｓａｙ及びＭｍ＿Ｚｂｔｂ２０＿１＿ＳＧ　ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ａｓｓａｙ（いずれもＱＩＡＧＥＮ社）を用いた。
　結果を図９に示す。図９中の「ＥＢ」、「ＭＢ」、「ＬＢ」、「ＥＤ」、「ＭＤ」及び「ＬＤ」はそれぞれ、図５における定義と同じである。図９によれば、後期ＥＡＥ状態のＣＮＳ由来の抗原提示細胞において、プロラクチン及びＺｂｔｂ２０の遺伝子発現量が増加していることが観測された。
（９）ＥＡＥ病態の進行に伴うプロラクチン及びＺｂｔｂ２０のタンパク質発現量の変化
　上記１．（２）と同様に単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウス（ＮＲ４Ａ２ｃＫＯ）及びＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）から、誘導９日後（初期ＥＡＥ病態に相当）及び誘導１９日後（後期ＥＡＥ病態に相当）に脳及び脊髄を採取し、フローサイトメーターを用いて、ＣＮＳへ浸潤したＣＤ１９＋Ｂ細胞及びｎｏｎ－Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋細胞を分離した。具体的には、組織を小さい破片に切断した後、３７℃で４０分間、１．４ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＨ及び１００μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ社製）を含有したＲＰＭＩ　１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）において更に分解した。得られた組織のホモジネートを７０μｍ細胞濾過器（ＧＥヘルスケアサイエンス社製）に通し、不連続パーコール密度勾配遠心分離法（３７％／８０％）を用いて、白血球細胞を濃縮した。次いで、ＣＮＳへ浸潤したＣＤ１９＋Ｂ細胞及びｎｏｎ－Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋細胞をＦＡＣＳ　ＣＡＮＴＯ　ＩＩ（ＢＤ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて解析した。分離したＣＤ１９＋Ｂ細胞及びｎｏｎ－Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋細胞のＺｂｔｂ２０の発現量の変化をフローサイトメーターで解析した。検出の際に使用した抗体は、抗Ｚｂｔｂ２０抗体（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いた。
　結果を図１０及び図１１に示す。図１０によれば、後期ＥＡＥ病態では、Ｚｂｔｂ２０の発現量が有意に増加していることが観測された。また、図１１（ａ）は、Ｚｂｔｂ２０＋細胞の割合をグラフ化したものであり、後期ＥＡＥ病態では、Ｚｂｔｂ２０発現が顕著に増加していることが観測された。また、図１１（ｂ）に示すように、Ｂ細胞及びｎｏｎ－Ｂ抗原提示細胞におけるプロラクチン遺伝子（Ｐｒｌ）の発現量を測定したところ、後期ＥＡＥ病態では、プロラクチン遺伝子（Ｐｒｌ）の相対発現量が顕著に増加していることが観測された。
　また、後期ＥＡＥ病態のマウスのＣＮＳから採取したＢ細胞を、１０ｎｇ／ｍＬのリポポリサッカライド（ＬＰＳ）とＢＤ　ＧｏｌｇｉＰｌｕｇの存在下、６時間培養した。培養したＢ細胞を、ＣＤ１ｄ及びＣＤ５遺伝子の染色状態に基づき、図１２（ａ）に示すように４種の分画（Ｆｒ１、Ｆｒ２、Ｆｒ３、Ｆｒ４）に分離した。各分画からのＩＬ－１０及びＺｂｔｂ２０の遺伝子発現レベルを、ＦＡＣＳプロットを用いて測定した。その結果を図１２（ｂ）に示す。
　さらに、後期ＥＡＥ病態のマウスのＣＮＳから採取したｎｏｎ－Ｂ抗原提示細胞を染色し、ＦＡＣＳ解析した。ｎｏｎ－Ｂ抗原提示細胞を、ＣＤ１１ｃ及びＰＤＣＡ－１遺伝子の染色状態に基づき、図１３（ａ）に示すように３種の分画（Ｆｒ１、Ｆｒ２、Ｆｒ３）に分離した。各分画からのＺｂｔｂ２０の遺伝子発現レベルを、ＦＡＣＳプロットを用いて測定した。検出の際に使用した抗体は、抗ＣＤ１１ｃ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ＰＤＣＡ－１抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ｚｂｔｂ２０抗体（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いた。
　その結果を図１３（ａ）に示す。また、各分画におけるＺｂｔｂ２０＋細胞の割合を図１３（ｂ）に示した。
（１０）脳下垂体におけるプロラクチン及び成長ホルモンの発現
　無処置又は早期、中期もしくは後期ＥＡＥ病態のマウスから、脳下垂体を切り出し、総ＲＮＡを単離した後、プロラクチン遺伝子（Ｐｒｌ）の発現レベルを、定量的リアルタイムＰＣＲを用いて測定した。その結果を図１４（ａ）に示す。
　また、マウスの血清を採取し、血清中のプロラクチン（ＰＲＬ）及び成長ホルモン（ＧＨ）のタンパクレベルを、Ｌｕｍｉｎｅｘ　ｓｙｓｔｅｍを用いて測定した。その結果を図１４（ｂ）に示す。いずれの進行度のＥＡＥ病態においても、血清中のプロラクチン（ＰＲＬ）レベルは、無処置マウスのものよりも顕著に低いことが観測された。
　さらに、無処置又は早期、中期もしくは後期ＥＡＥ病態のマウスのＣＮＳから、ＦＡＣＳ　ＡＲＩＡを用いて、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＰＤＣＡ－１＋ＣＤ１１ｃ＋形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）、ＣＤ４５ｉｎｔＣＤ１１ｂ＋ミクログリア細胞を精製し、これらのプロラクチン遺伝子（Ｐｒｌ）及びｚｂｔｂ２０遺伝子の発現レベルを、定量的リアルタイムＰＣＲを用いて測定した。検出の際に使用した抗体は、抗ＣＤ１９抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ＰＤＣＡ－１抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ＣＤ４５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ＣＤ１１ｃ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ｚｂｔｂ２０抗体（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いた。ＰｒｌおよびＧＨの定量には、Ｍｏｕｓｅ　ｐｉｔｕｉｔａｒｙ　ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｂｅａｄ　ｐａｎｅｌ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いた。
　結果を図１４（ｃ）に示す。後期ＥＡＥ病態では、ＣＤ１９＋Ｂ細胞及びＰＤＣＡ－１＋Ｂ２２０＋ｐＤＣにおいて、プロラクチン遺伝子の発現レベルが顕著に増加していたことが観測された。また、ＣＤ１９＋Ｂ細胞及びＣＤ４５ｉｎｔＣＤ１１ｂ＋ミクログリア細胞において、ｚｂｔｂ２０遺伝子の発現レベルがＥＡＥ病態の進行に伴い、増加していたことが観測された。
２．プロラクチンによる後期ＥＡＥ病態の変化
（１）プロラクチン添加とＥｏｍｅｓ遺伝子の発現増強１
　未処理マウスの脾臓由来のＴｈ細胞を、リコンビナントプロラクチン非存在下又は存在下にて８時間培養した。培養後、Ｔｈ細胞から総ＲＮＡを抽出した。得られた総ＲＮＡから、ファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（タカラ社製）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ装置で、Ｌｉｇｈｔ　Ｃｙｃｌｅｒ－ＦａｓｔＳｔａｒｔ　ＤＮＡマスターＳＹＢＲグリーンＩキット（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いた条件で、又はＡＢＩ　７３００リアルタイムＰＣＲ装置で、Ｐｏｗｅｒ　ＳＹＢＲグリーンマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた条件で、市販のプライマー（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ａｓｓａｙ，ＱＴ０１０７４３３２，Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用して定量リアルタイムＰＣＲを行った。Ｅｏｍｅｓ遺伝子発現量は、ＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子の発現量に基づいて補正した。
　結果を図１５に示す。図１５中、１はプロラクチンを添加せずに培養したもの、２は低濃度のプロラクチン存在下で培養したもの、３は、高濃度のプロラクチン存在下で培養したものを意味する。図１５の縦軸は、ハウスキーピング遺伝子（β２ミクログロブリン）に対するＥｏｍｅｓの相対発現量を表したものであり、プロラクチンの濃度依存的にＥｏｍｅｓ発現量が増加した。
（２）プロラクチン添加とＥｏｍｅｓタンパク質の発現増強２
　脾臓由来のＣＤ２２６＋Ｔｈ細胞を、プロラクチン非存在下又は存在下にて８時間または４８時間培養した。培養後、ＣＤ２２６＋Ｔｈ細胞を抗ＣＤ２２６抗体、抗Ｅｏｍｅｓ抗体で染色し、ＣＤ２２６＋Ｅｏｍｅｓ＋Ｔ細胞、ＣＤ２２６＋Ｅｏｍｅｓ－Ｔ細胞とＣＤ２２６－Ｔ細胞をＦＡＣＳ　ＣＡＮＴＯ　ＩＩ（ＢＤ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて解析した。解析の際に使用した抗体は、抗ＣＤ２２６抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、および抗Ｅｏｍｅｓ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）である。
　結果を図１６に示す。プロラクチン非存在下で培養した細胞に比べて、プロラクチン存在下で培養した細胞では、４８時間後のＥｏｍｅｓ発現量が顕著に増加した。
（３）Ｄ２受容体アゴニストによる後期ＥＡＥ病態の抑制
　上記１．（２）と同様に単相型ＥＡＥを誘導したＣＤ４－Ｃｒｅ／ＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌマウス及び対照マウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に、誘導４日後からブロモクリプチンを隔日で腹腔内注射した。注射した後、以下に示すＥＡＥ評価基準にしたがい、マウスのＥＡＥ病態を毎日、評価した。
＜ＥＡＥ評価基準＞
０：臨床徴候なし
１：尾の部分的麻痺
２：弛緩した尾
３：後肢の部分的麻痺
４：全後肢の麻痺
５：後肢及び前肢の麻痺
　結果を図１７に示す。図１７中の矢印は、ブロモクリプチンを投与した日を示す。ブロモクリプチンを投与することにより、後期ＥＡＥ病態は有意に抑制された。
（４）Ｄ２受容体アゴニスト（ブロモクリプチン）投与によるＥｏｍｅｓタンパク質の発現抑制１
　上記１．（２）と同様に単相型ＥＡＥを誘導したＣＤ４－Ｃｒｅ／ＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌマウスにおいて、誘導４日後からブロモクリプチンを隔日で静脈内注射したマウス及び注射しなかったマウスから脳及び脊髄を採取し、フローサイトメーターを用いて、ＣＮＳへ浸潤したＴｈ細胞を分離した。具体的には、組織を小さい破片に切断した後、３７℃で４０分間、１．４ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＨ及び１００μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ社製）を含有したＲＰＭＩ　１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）において更に分解した。得られた組織のホモジネートを７０μｍ細胞濾過器（ＧＥヘルスケアサイエンス社製）に通し、不連続パーコール密度勾配遠心分離法（３７％／８０％）を用いて、白血球細胞を濃縮した。次いで、ＣＮＳへ浸潤したＴｈ細胞をＦＡＣＳ　ＡＲＩＡ　ＩＩ（ＢＤ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いたＦＡＣＳソートで分離した。回収したＴｈ細胞のＥｏｍｅｓ及びＣＤ４の発現量の変化をフローサイトメーターで解析した。分離の際に使用した抗体は、抗ＣＤ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗Ｅｏｍｅｓ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いた。
　結果を図１８及び図１９に示す。図１８に示すように、ブロモクリプチンを投与することにより、ＣＮＳ浸潤Ｔｈ細胞におけるＥｏｍｅｓタンパク質の発現量は有意に抑制された。図１９は、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合と実際の細胞数の変化を示すグラフである。
（５）Ｄ２受容体アゴニスト（ブロモクリプチン）投与によるＥｏｍｅｓ遺伝子の発現抑制２
　上記１．（３）と同様に単相型ＥＡＥを誘導したＣＤ４－Ｃｒｅ／ＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌマウスにおいて、誘導４日後からブロモクリプチンを隔日で静脈内注射したマウス及び注射しなかったマウスから、誘導２７日後に脳及び脊髄を採取し、ＣＮＳへ浸潤したＣＤ１９＋Ｂ細胞及びｎｏｎ－Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋細胞をＦＡＣＳ　ＡＲＩＡ　ＩＩ（ＢＤ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いたＦＡＣＳソートで分離した。分離したＣＤ１９＋Ｂ細胞及びｎｏｎ－Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋細胞を、それぞれ脾臓由来のＣＤ４＋Ｔｈ細胞と８時間、共培養した。培養後、回収したＴｈ細胞のＥｏｍｅｓ及びＣＤ１０７ａの発現量の変化をフローサイトメーターで解析した。検出の際に使用した抗体は、抗Ｅｏｍｅｓ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ＣＤ１０７ａ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を用いた。
　結果を図２０に示す。図２０によれば、ブロモクリプチンを投与することにより、ＣＮＳ由来の抗原提示細胞のＴｈ細胞に対するＥｏｍｅｓタンパク質発現およびＣＤ１０７ａ発現誘導能は有意に抑制された。
（６）Ｄ２受容体アゴニスト（ブロモクリプチン）投与によるＥｏｍｅｓ遺伝子及びＣＤ１０７ａ遺伝子の発現
　上記１．（３）と同様に単相型ＥＡＥを誘導したＣＤ４－Ｃｒｅ／ＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌマウスに、誘導４日後からブロモクリプチン又はプラセボ（ＤＭＳＯ及びＰＢＳ）を隔日で腹腔内注射した。誘導３２日後に脳及び脊髄を採取し、ＣＮＳへ浸潤したＣＤ１９＋Ｂ細胞及びＣＤ１９－ＣＤ４５ｈｉｎｏｎ－Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋抗原提示細胞をＦＡＣＳ　ＡＲＩＡ　ＩＩ（ＢＤ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いたＦＡＣＳソートで分離した。分離した細胞を、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ１０７ａ抗体の存在下、類遺伝子系統の未処置マウス由来の脾臓からＦＡＣＳソートで分離したＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養した。８時間共培養した後、各細胞を染色して、Ｅｏｍｅｓ発現を解析した。検出の際に使用した抗体は、抗ＣＤ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗Ｅｏｍｅｓ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ＣＤ４５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ１０７ａ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を用いた。
　結果を図２１に示す。共培養したＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞表面のＥｏｍｅｓ遺伝子とＣＤ１０７ａ遺伝子の発現量は、ＣＤ１９＋Ｂ細胞及びＣＤ１９－ＣＤ４５ｈｉｎｏｎ－Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋抗原提示細胞のいずれと共培養した場合であっても、ブロモクリプチンの投与によって、減少していることが観測された。
（７）Ｄ２受容体アゴニスト（ドパミン）投与によるＥｏｍｅｓ遺伝子の発現抑制
　後期ＥＡＥ病態マウスから、ＦＡＣＳソートにより、ＣＤ１９＋Ｂ細胞及びＣＤ１９－ＣＤ４５ｈｉｎｏｎ－Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋抗原提示細胞を精製した。精製された各細胞を、ドパミンの非存在下又は特定量のドパミンの存在下、２４、４８、９６時間培養した。培養後の細胞を回収し、定量的リアルタイムＰＣＲを用いて、プロラクチン遺伝子（Ｐｒｌ）及びＺｂｔｂ２０遺伝子の発現量を解析した。
　結果を図２２に示す。図２２（ａ）は、ＣＤ１９＋Ｂ細胞における遺伝子発現量を示し、図２２（ｂ）は、ＣＤ１９－ＣＤ４５ｈｉｎｏｎ－Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋抗原提示細胞における遺伝子発現量を示す。いずれの場合にもドパミン共存かで培養することにより、プロラクチン及びＺｂｔｂ２０遺伝子の発現量は顕著に低下していることが観測された。
（８）ドパミン前駆物質（Ｌ－ドパ）投与によるＥｏｍｅｓ遺伝子の発現抑制
　上記１．（３）と同様に単相型ＥＡＥを誘導したＣＤ４－Ｃｒｅ／ＮＲ４Ａ２ｆｌ／ｆｌマウスに、誘導４日後からＬ－ドパ又はプラセボ（ＤＭＳＯ及びＰＢＳ）を隔日で腹腔内注射した。
　各マウスのＥＡＥスコアを図２３に示す。Ｌ－ドパを反復投与することにより、ＥＡＥスコアが顕著に改善していることが観測された。図２３の右グラフにおいて、点線は９５％信頼区間を示す。累積ＥＡＥスコアの比較においても、Ｌ－ドパの反復投与によるＥＡＥスコアの改善が確認された。
　次に、誘導３２日後に各マウスから脳及び脊髄を採取し、ＣＮＳへ浸潤したＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ１９＋Ｂ細胞及びＣＤ１９－ＣＤ４５ｈｉｎｏｎ－Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋抗原提示細胞をＦＡＣＳ　ＡＲＩＡ　ＩＩ（ＢＤ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いたＦＡＣＳソートで分離した。分離した各細胞を染色して、Ｅｏｍｅｓ及びＺｂｔｂ２０遺伝子の発現を解析した。検出の際に使用した抗体は、抗ＣＤ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗Ｅｏｍｅｓ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ＣＤ１９抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗Ｚｂｔｂ２０抗体（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いた。
　結果を図２４に示す。図２４（ａ）に示すように、ＣＤ４＋Ｔ細胞において、Ｌ－ドパの反復投与により、ＣＤ４＋Ｅｏｍｅｓ＋Ｔ細胞の割合が顕著に減少していることが観測された。また、図２４（ｂ）及び（ｃ）に示すように、ＣＤ１９＋Ｂ細胞及びＣＤ１９－ＣＤ４５ｈｉｎｏｎ－Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋抗原提示細胞において、Ｌ－ドパの反復投与により、Ｚｂｔｂ２０＋細胞の割合も減少していることが観測された。
　次に、Ｌ－ドパ投与マウス及び非投与マウスのＣＮＳ及び脾臓からそれぞれ分離したＣＤ１９＋Ｂ細胞及びＣＤ１９－ＣＤ４５ｈｉｎｏｎ－Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋抗原提示細胞におけるプロラクチン遺伝子（Ｐｒｌ）の発現レベルを、定量的リアルタイムＰＣＲを用いて解析した。検出の際に使用した抗体は、抗ＣＤ１９抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ＣＤ４５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を用いた。
　結果を図２５に示す。ＣＮＳ由来のＢ細胞及びｎｏｎ－Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋抗原提示細胞において、プロラクチン遺伝子の発現レベルが顕著に高く、Ｌ－ドパの反復投与によって、その発現レベルが低下していることが観測された。
３．抗ＣＸ３ＣＲ１抗体投与によるＥｏｍｅｓ遺伝子の発現抑制
　上記１．（３）と同様に単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウスに誘導１０日後（後期ＥＡＥ病態に相当）に、抗ＣＸ３ＣＲ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）又はそのアイソタイプ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を投与し、上述のＥＡＥ評価基準にしたがい、マウスのＥＡＥ病態を毎日、評価した。
　結果を図２６に示す。図２６に示すように、抗ＣＸ３ＣＲ１抗体を投与することで（ＣＸ３ＣＲ１）、アイソタイプを投与した場合と比べて（Ｉｓｏｔｙｐｅ）、後期ＥＡＥ病態が有意に改善された。
　また、誘導２２日後及び誘導２８日後に、抗ＣＸ３ＣＲ１抗体又はそのアイソタイプを投与されたマウスのＣＮＳを採取し、ＣＤ４＋細胞を分離した。得られたＣＤ４＋細胞における、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋細胞及びＥｏｍｅｓ＋＋ＣＤ４＋細胞（Ｅｏｍｅｓ強陽性ＣＤ４陽性Ｔｈ細胞）のＣＤ４＋細胞に対する割合及び絶対量を測定した。
　結果を図２７に示す。図２７に示すように、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋細胞及びＥｏｍｅｓ＋＋ＣＤ４＋細胞のいずれにおいても、抗ＣＸ３ＣＲ１抗体投与により、後期ＥＡＥ病態におけるＥｏｍｅｓ陽性Ｔｈ細胞のＣＤ４＋細胞に対する割合及び絶対量は有意に減少した。
４．Ｚｂｔｂ２０特異的ｓｉＲＮＡ投与によるＥｏｍｅｓ遺伝子の発現抑制
（１）ＥＡＥ病態の臨床スコアの変化
　上記１．（３）と同様に単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウスに誘導７日後（初期ＥＡＥ病態に相当）に、アテロコラーゲン基質で安定化されたＺｂｔｂ２０特異的ｓｉＲＮＡ（（株）高研製）又は対照スクランブルｓｉＲＮＡ（（株）高研製）を静脈内注射により投与し、上述のＥＡＥ評価基準にしたがい、マウスのＥＡＥ病態を毎日、評価した。
　その結果を図２８に示す。図２８の右グラフの縦軸は、累積臨床スコアを示す。対照スクランブルｓｉＲＮＡ投与マウスでは、未処置マウスと同等の臨床スコアであったのに対し、Ｚｂｔｂ２０特異的ｓｉＲＮＡ投与マウスでは、顕著に臨床スコアの低下が観測された。図２８の右グラフの右グラフは累積臨床スコアをグラフ化したものであり、点線は９５％信頼区間を示す。
（２）Ｚｂｔｂ２０特異的ｓｉＲＮＡ投与によるＥｏｍｅｓ及びＺｂｔｂ２０遺伝子の発現抑制
　上記４．（１）と同様に処置した未処置マウス、Ｚｂｔｂ２０特異的ｓｉＲＮＡ投与マウス及び対照スクランブルｓｉＲＮＡ投与マウスの脳及び脊髄を採取し、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＢ細胞を分離した。得られた各マウス群のＣＤ４＋Ｔ細胞及びＢ細胞におけるＥｏｍｅｓ又はＺｂｔｂ２０遺伝子の発現を、フローサイトメーターを用いて解析した。検出の際に使用した抗体は、抗ＣＤ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗Ｅｏｍｅｓ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ＣＤ１９抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗Ｚｂｔｂ２０抗体（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いた。
　結果を図２９に示す。図２９（ａ）に示すように、Ｚｂｔｂ２０特異的ｓｉＲＮＡ投与マウスでは、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＥｏｍｅｓ遺伝子の発現、Ｂ細胞におけるＺｂｔｂ２０遺伝子の発現がともに顕著に抑制されていたことが観測された。図２９（ｂ）は、各マウス群のＥｏｍｅｓ及びＺｂｔｂ２０の発現細胞の割合を比較するためにグラフ化したものである。
（３）Ｚｂｔｂ２０特異的ｓｉＲＮＡ投与によるプロラクチン遺伝子の発現抑制
　上記４．（１）と同様に処置した未処置マウス、Ｚｂｔｂ２０特異的ｓｉＲＮＡ投与マウス及び対照スクランブルｓｉＲＮＡ投与マウスを用いて、後期ＥＡＥ病態マウスのＣＮＳから抗原提示細胞を分離した。得られた抗原提示細胞から、ＦＡＣＳ　ＡＲＩＡ　ＩＩ（ＢＤ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いたＦＡＣＳソートでＣＤ１９－ＣＤ４５ｈｉｎｏｎ－Ｂ／ｃｌａｓｓＩＩ＋抗原提示細胞を精製した。精製した細胞にＺｂｔｂ２０特異的ｓｉＲＮＡ又は対照スクランブルｓｉＲＮＡを形質導入し、ＬＰＳの存在下２４時間培養した後、定量的リアルタイムＰＣＲを用いて、Ｚｂｔｂ２０及びプロラクチン（Ｐｒｌ）の発現レベルを測定した。検出の際に使用した抗体は、抗ＣＤ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗Ｅｏｍｅｓ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ＣＤ１９抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ＣＤ４５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を用いた。
　結果を図３０に示す。Ｚｂｔｂ２０特異的ｓｉＲＮＡの投与により、Ｚｂｔｂ２０遺伝子及びＰｒｌ遺伝子の発現レベルは顕著に低下していることが観測された。
５．抗ＣＤ２０抗体投与によるＥｏｍｅｓ遺伝子の発現抑制
（１）ＥＡＥ病態の臨床スコアの変化
　上記１．（３）と同様に単相型ＥＡＥを誘導したＮＲ４Ａ２欠損マウスにおいて、誘導７日前又は誘導１３日後（後期ＥＡＥ病態に相当）に、それぞれ抗ＣＤ２０抗体又は対照ＩｇＧを静脈内注射により投与し、上述のＥＡＥ評価基準にしたがい、マウスのＥＡＥ病態を毎日、評価した。
　結果を図３１（ａ）及び（ｂ）に示す。図３１（ａ）及び（ｂ）中の矢印は、抗体を投与した日を示す。図３１（ａ）は、誘導７日前に抗体を投与した結果を示し、図３１（ｂ）は誘導１３日後に抗体を投与した結果を示す。図３１（ｂ）に示すように、誘導１３日後に抗ＣＤ２０抗体を投与することにより、顕著に臨床スコアが改善した。図３１（ｂ）の右グラフは累積臨床スコアをグラフ化したものであり、点線は９５％信頼区間を示す。
（２）抗ＣＤ２０抗体によるＥｏｍｅｓ及びＺｂｔｂ２０遺伝子の発現抑制
　上記５．（１）と同様に処置した未処置マウス、抗ＣＤ２０抗体及び対照ＩｇＧ投与マウスの脳及び脊髄を採取し、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＢ細胞を分離した。得られた各マウス群のＣＤ４＋Ｔ細胞及びＢ細胞におけるＥｏｍｅｓ又はＺｂｔｂ２０遺伝子の発現をフローサイトメーターを用いて解析した。検出の際に使用した抗体は、抗ＣＤ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗Ｅｏｍｅｓ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、抗ＣＤ２０抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗ＣＤ４５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗Ｚｂｔｂ２０抗体（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いた。
　結果を図３１（ｃ）及び３２に示す。図３１（ｃ）に示すように、抗ＣＤ２０抗体投与マウスでは、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＥｏｍｅｓ遺伝子の発現、Ｂ細胞におけるＺｂｔｂ２０遺伝子の発現がともに顕著に抑制されていたことが観測された。図３２は、各マウス群のＥｏｍｅｓ及びＺｂｔｂ２０の発現細胞の割合を比較するためにグラフ化したものである。
６．各種サイトカインによるＺｂｔｂ２０遺伝子発現の変化
（１）各種サイトカインによるＺｂｔｂ２０遺伝子発現の変化
　脾臓由来ＣＤ１９＋Ｂ細胞を単離し、ＦＡＣＳ　ＡＲＩＡ　ＩＩ（ＢＤ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いたＦＡＣＳソートで精製した。精製したＢ細胞は、ＬＰＳの存在下、図３３（ａ）に示すサイトカインの共存下又は非共存下で２４時間培養した。培養後、各細胞におけるＺｂｔｂ２０遺伝子の発現レベルを測定した。検出の際に使用した抗体は、抗ＣＤ１９抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗Ｚｂｔｂ２０抗体（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いた。
　結果を図３３及び３４に示す。図３３（ａ）では、サイトカイン非共存下で培養した細胞のＺｂｔｂ２０遺伝子の発現レベルをグレーのグラフで示し、各種サイトカイン共存下で培養した場合の発現レベルを黒線グラフで示した。表示したサイトカイン共存下で培養すると、Ｚｂｔｂ２０遺伝子の発現が増加していること、ＩＦＮα又はＩＦＮβ１の共存下で培養するとＺｂｔｂ２０遺伝子の発現増加が最も顕著であることが観測された。図３３（ｂ）は、各条件におけるＺｂｔｂ２０＋細胞の割合をグラフ化したものである。図３４は、ＦＡＣＳプロットにより、各種サイトカイン共存下で培養した場合にサイトカイン非共存下で培養した場合に対して、Ｚｂｔｂ２０＋細胞又はＰｒｌ＋細胞の割合が何倍に増加したかを示す。
（２）ＥＡＥ病態の進行に伴う各種サイトカイン発現の変化１
　各進行度（初期ＥＡＥ病態、中期ＥＡＥ病態、後期ＥＡＥ病態）におけるマウスのＣＳＦ及び血漿を採取し、各種サイトカインの発現レベルをＬｕｍｉｎｅｘ　ｓｙｓｔｅｍを用いて測定した。また、同様にして、ＣＮＳ由来のＢ細胞、ｐＤＣ、ミクログリアにおける１型インターフェロン（ＩＦＮα２、ＩＦＮβ１）、ＩＬ－６、ＩＬ－９、Ｃｘｃｌ１３の発現レベルを、定量的リアルタイムＰＣＲを用いて測定した。ＩＦＮαおよびＩＦＮβの検出には、ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘ　Ｍｏｕｓｅ　ＩＦＮａ／ｂ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を用い、他のサイトカインの検出には、ＢｉｏＰｌｅｘ　Ｐｒｏ　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　ＧＩ　２３－ｐｌｅｘ　ｐａｎｅｌおよびＢｉｏＰｌｅｘ　Ｐｒ　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　ＧＩＩＩ　ＴＨ１７　８－ｐｌｅｘ　Ｂ　ｐａｎｅｌ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いた。
　結果を図３５、３６に示す。図３５は、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－９、ＩＬ－１２（ｐ４０）、ＩＬ－１２（ｐ７０）、ＩＦＮ－γの発現レベルを示す。図３５（ａ）は、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－βの発現レベルを示す。図３５（ｂ）は、ＣＮＳ由来のＢ細胞、ｐＤＣ、ミクログリアにおけるＩＦＮα２又はＩＦＮβ１の発現量を示し、図３５（ｃ）は、ＣＮＳ由来のＢ細胞、ｐＤＣ、ミクログリアにおけるＩＬ－６、ＩＬ－９、Ｃｘｃｌ１３の発現量を示す。図３５（ｂ）及び（ｃ）に示すように、中期ＥＡＥ病態になると、ミクログリア内においてＩＦＮ－α２、ＩＦＮ－β１、ＩＬ－９の発現量が顕著に増加していたことが観測された。
（３）後期ＥＡＥ病態マウス由来のミクログリアによるＺｂｔｂ２０発現への影響
　類遺伝子系統の未処置マウスの脾臓からＦＡＣＳソートにより、ＣＤ１９＋Ｂ細胞を分離し、未処置マウス又は後期ＥＡＥ病態マウス由来のミクログリア細胞とともに２４時間共培養した。培養後のＢ細胞におけるＺｂｔｂ２０遺伝子の発現量を、フローサイトメーターを用いて測定した。また、Ｂ細胞をＦＡＣＳソートで精製し、リアルタイムＰＣＲを用いてＺｂｔｂ２０及びＰｒｌのＲＮＡレベルを検出した。検出の際に使用した抗体は、抗ＣＤ１９抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、抗Ｚｂｔｂ２０抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いた。
　結果を図３７に示す。図３７（ａ）に示すように、ＣＤ１９＋Ｂ細胞を後期ＥＡＥ病態マウスのミクログリアと共培養すると、Ｚｂｔｂ２０遺伝子の発現が顕著に増強されていることが観測された。また、図３７（ｂ）に示すように、Ｚｂｔｂ２０及びＰｒｌのＲＮＡレベルも相対的に増加していたことが観測された。
（４）ＥＡＥ病態の進行に伴う各種サイトカイン発現の変化
　未処置又は各進行度のＥＡＥ病態マウスからＣＳＦ及び血漿を採取し、各種サイトカイン（ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－α、Ｅｏｔａｘｉｎ、ＫＣ、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１ｂ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ－１ａ）のタンパクレベルをＬｕｍｉｎｅｘ　ｓｙｓｔｅｍを用いて測定した。検出には、ＢｉｏＰｌｅｘ　Ｐｒｏ　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　ＧＩ　２３－ｐｌｅｘ　ｐａｎｅｌおよびＢｉｏＰｌｅｘ　Ｐｒ　Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　ＧＩＩＩ　ＴＨ１７　８－ｐｌｅｘ　Ｂ　ｐａｎｅｌ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いた。
　結果を図３８～４０に示す。

Claims (15)

  1. 　プロラクチンの産生を抑制又は阻害する物質を有効成分として含有する、進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤。
  2. 　上記物質が、Ｚｂｔｂ２０生成を抑制又は阻害する物質を含む、請求項１に記載の進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤。
  3. 　上記物質が、ドパミン受容体アゴニスト又はドパミン受容体部分アゴニストを含む、請求項１に記載の進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤。
  4. 　上記進行型免疫性脱髄疾患が二次進行型多発性硬化症である、請求項１～３のいずれか一項に記載の進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤。
  5. 　プロラクチンの産生を抑制又は阻害する物質を対象に投与することを含む、進行型免疫性脱髄疾患への進行を予防又は抑制する方法。
  6. 　上記物質が、Ｚｂｔｂ２０生成を抑制又は阻害する物質を含む、請求項５に記載の方法。
  7. 　上記物質が、ドパミン受容体アゴニスト又はドパミン受容体部分アゴニストを含む、請求項５に記載の方法。
  8. 　上記進行型免疫性脱髄疾患が二次進行型多発性硬化症である、請求項５～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤を製造するための、プロラクチンの産生を抑制又は阻害する物質の使用。
  10. 　上記物質が、Ｚｂｔｂ２０生成を抑制又は阻害する物質を含む、請求項９に記載の使用。
  11. 　上記物質が、ドパミン受容体アゴニスト又はドパミン受容体部分アゴニストを含む、請求項９に記載の使用。
  12. 　上記進行型免疫性脱髄疾患が二次進行型多発性硬化症である、請求項９～１１のいずれか一項に記載の使用。
  13. 　ＣＸ３ＣＲ１受容体の活性化を抑制又は阻害する物質を有効成分として含有する、進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤。
  14. 　上記物質が、抗ＣＸ３ＣＲ１抗体又はその抗原結合断片である、請求項１３に記載の進行型免疫性脱髄疾患の予防、発症抑制又は治療剤。
  15. 　ヒト対象からミクログリアを採取し、ＩＬ－９、ＩＦＮ－α及びＩＦＮ－β１の少なくとも１種の発現量を測定することを含む、進行型免疫性脱髄疾患への進行を診断するためのデータを収集する方法。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230104903A (ko) 2020-11-06 2023-07-11 고쿠리쯔겡뀨가이하쯔호징 고꾸리쯔 세이신ㆍ신께이 이료겡뀨센따 Eomes 양성 CD4 양성 T 세포의 증가에 기인하는 진행형 질환 치료제
WO2024135794A1 (ja) 2022-12-22 2024-06-27 株式会社カイオム・バイオサイエンス 抗ヒトｃｘ３ｃｒ１抗体

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009509943A (ja) * 2005-09-27 2009-03-12 ステム セル セラピューティクス コーポレイション プロラクチンにより制御される乏突起膠細胞前駆体細胞の増殖
WO2016002827A1 (ja) 2014-07-01 2016-01-07 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター 進行型免疫性脱髄疾患治療剤
WO2016114386A1 (ja) 2015-01-15 2016-07-21 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター 進行型免疫性脱髄疾患治療剤

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020192212A1 (en) * 2001-03-19 2002-12-19 Toshio Imai Uses of anti-CX3CR1 antibody, anti-fractalkine antibody and fractalkine
FR2936710B1 (fr) 2008-10-07 2011-01-07 Ceva Sante Animale Composition veterinaire antiprolactinique destinee aux ruminants
IL311502A (en) * 2012-02-27 2024-05-01 Ablynx Nv Cx3cr1-binding polypeptides

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009509943A (ja) * 2005-09-27 2009-03-12 ステム セル セラピューティクス コーポレイション プロラクチンにより制御される乏突起膠細胞前駆体細胞の増殖
WO2016002827A1 (ja) 2014-07-01 2016-01-07 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター 進行型免疫性脱髄疾患治療剤
WO2016114386A1 (ja) 2015-01-15 2016-07-21 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター 進行型免疫性脱髄疾患治療剤

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA, vol. 1802, 2010, pages 66 - 79
CAO, D. ET AL.: "ZBTB20 is required for anterior pituitary development and lactotrope specification", NATURE COMMUNICATIONS, vol. 7, no. 11121, 15 April 2016 (2016-04-15), pages 1 - 13, XP055490534, ISSN: 2041-1723 *
DIJKSTRA, C. D. ET AL.: "Therapeutic effect of the D2-dopamine agonist bromocriptine on acute and relapsing experimental allergic encephalomyelitis", PSYCHONEUROENDOCRINOLOGY, vol. 19, no. 2, 1994, pages 135 - 142, XP024386762, ISSN: 0306-4530 *
ESQUIFINO, A. I. ET AL.: "Experimental allergic encephalomyelitis in pituitary-grafted Lewis rats", JOURNAL OF NEUROINFLAMMATION, vol. 3, no. 1, 2006, pages 1 - 5, XP021019075, ISSN: 1742-2094 *
KOJIMA ET AL., NATURE COMMUNICATIONS, vol. 2, no. 338, 2011, pages 1 - 10
MCCOY, J. M. ET AL.: "Orphan nuclear receptor NR4A2 induces transcription of the immunomodulatory peptide hormone prolactin", JOURNAL OF INFLAMMATION, vol. 12, no. 1, 2015, pages 1 - 11, XP021211653, ISSN: 1476-9255 *
MINAMITANI ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI., vol. 112, no. 37, 2015, pages 11612 - 11617
MULTIPLE SCLEROSIS JOURNAL, vol. 19, 2013, pages 1428 - 1436
NAKATSUJI, YUJI: "Therapeutic strategy for multiple sclerosis and similar diseases: treatment for secondary-progressive multiple sclerosis (SPMS", MS FRONTIER, vol. 2, no. 1, 2013, pages 30 - 34, XP009514998, ISSN: 2187-3062 *
NATURE REVIEWS NEUROLOGY, vol. 8, 2012, pages 647 - 656
NATURE REVIEWS NEUROLOGY, vol. 9, 2013, pages 496 - 503

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230104903A (ko) 2020-11-06 2023-07-11 고쿠리쯔겡뀨가이하쯔호징 고꾸리쯔 세이신ㆍ신께이 이료겡뀨센따 Eomes 양성 CD4 양성 T 세포의 증가에 기인하는 진행형 질환 치료제
WO2024135794A1 (ja) 2022-12-22 2024-06-27 株式会社カイオム・バイオサイエンス 抗ヒトｃｘ３ｃｒ１抗体
KR20250126016A (ko) 2022-12-22 2025-08-22 치오메 바이오사이언스 가부시키가이샤 항인간 cx3cr1 항체
EP4640709A1 (en) 2022-12-22 2025-10-29 Chiome Bioscience Inc. Anti-human cx3cr1 antibody

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