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WO2018100083A1 - Luminescence detector arrangement, fluorescence microscope and method for detecting a luminescence signal - Google Patents

Luminescence detector arrangement, fluorescence microscope and method for detecting a luminescence signal Download PDF

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Publication number
WO2018100083A1
WO2018100083A1 PCT/EP2017/081023 EP2017081023W WO2018100083A1 WO 2018100083 A1 WO2018100083 A1 WO 2018100083A1 EP 2017081023 W EP2017081023 W EP 2017081023W WO 2018100083 A1 WO2018100083 A1 WO 2018100083A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
time interval
luminescence
light source
emission light
memory cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2017/081023
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Christian Schumann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Leica Microsystems CMS GmbH
Original Assignee
Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Leica Microsystems CMS GmbH filed Critical Leica Microsystems CMS GmbH
Publication of WO2018100083A1 publication Critical patent/WO2018100083A1/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/16—Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G01N2021/6419—Excitation at two or more wavelengths
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2201/00—Features of devices classified in G01N21/00
    • G01N2201/06—Illumination; Optics
    • G01N2201/069—Supply of sources
    • G01N2201/0696—Pulsed

Definitions

  • Luminescence detector arrangement fluorescence microscope and method for detecting a luminescence signal
  • the present invention relates to a luminescence detector arrangement
  • Fluorescence microscope and a method for detecting a luminescence signal are particularly in the field of fluorescence microscopy, in particular in the field of wide-field microscopy.
  • monochrome cameras ie color-sensitive cameras
  • monochrome cameras are often used in this type of microscopy, since they are typically available with a higher sensitivity and / or a faster readability than other camera systems which also offer a color resolution.
  • various methods can be used. For example, for this purpose changing devices for assemblies with excitation spectral filters, a dichroic beam splitter and a
  • Emission spectral filters used which can be combined in so-called fluorescence filter cubes. These fluorescence filter cubes can then be used for
  • dichroic multiband beam splitters with matching emission and excitation filter sets have been used. These often have relatively small filters, which can be moved, for example, by means of fast filter wheels, so that a filter change can possibly be carried out faster than when changing from fluorescence filter cubes. However, even such a mechanical change process still takes considerable time.
  • a disadvantage may also result from the fact that the images of different fluorophores at
  • multi-camera methods can be used. However, these are often cost-intensive and expensive, since several cameras must be purchased and the different cameras also synchronized and their images must be overlapped, which can often be associated with tolerance-related different lateral layers and geometric distortions with a great deal of effort.
  • camera splitters are known in which a microscopic field of view is spectrally divided and imaged on different areas of the same sensor. Such systems are often non-telecentric and also suffer from overlap problems, such as the multiple camera methods mentioned above.
  • multi-pixel taps or area sensors is known, i.
  • Cameras with so-called multitap or two-tap pixels such camera systems being used, for example, as FLIM cameras (pco.flim, PCO AG, MEMFLIM, TELEDYNE DALSA PROFESSIONAL IMAGING) or as time-of-flight cameras (epc660, ESPROS PHOTONICS CORPORATION ) are known.
  • FLIM cameras pco.flim, PCO AG, MEMFLIM, TELEDYNE DALSA PROFESSIONAL IMAGING
  • time-of-flight cameras epc660, ESPROS PHOTONICS CORPORATION
  • an electrical charge resulting from the detection process in a detector pixel is collected in two or more memory cells, wherein the
  • Integration time per memory cell in a fixed phase range of a high-frequency modulation frequency (pixel switching frequency) is located.
  • pixel switching frequency a high-frequency modulation frequency
  • Fluorescence lifetime microscopy used. It is therefore the object of the invention to provide a luminescence detector arrangement, a fluorescence microscope and a method for detecting a luminescence signal, which enable a simplified detection of luminescence signals at different excitation wavelengths at short time intervals.
  • a luminescence detector arrangement a luminescence detector arrangement
  • the invention in a first aspect, relates to a luminescence detector arrangement for detecting a luminescence signal, which has a sensor element with at least one multitap pixel having at least a first memory cell and a second memory cell, wherein the sensor element is adapted to the multitap pixel in a first time interval by means of read the first memory cell and read in a second time interval different from the first time interval by means of the second memory cell.
  • the luminescence detector arrangement has a light source which is set up to emit a first emission light in at least one first spectral range and independently emit a second emission light in a second spectral range, wherein the first spectral range and the second spectral range are at least partially different from one another ( Overlaps not excluded).
  • the light source is synchronized with the sensor element to the first in the first time interval
  • the luminescence detecting device is further configured to be one through the first emission light and through the second emission light
  • the invention relates to a fluorescence microscope with a luminescence detector arrangement according to the invention, wherein the
  • Fluorescence microscope is adapted to at least partially optically excite an object to be examined by means of the light source and at least partially detect a fluorescence signal generated by the optically excited object to be examined as a luminescence signal.
  • the invention relates to a method for detecting a luminescence signal with the steps of a) providing a sensor element having at least one multitap pixel with at least one first memory cell and a second memory cell; b) providing a light source; c) emitting a first emission light in at least a first spectral range by means of the light source in a first time interval and reading out the at least one multitap pixel by means of the first memory cell in the first time interval; and d) emitting a second emission light in at least a second spectral range by means of the light source in a second time interval and reading out the at least one multitap pixel by means of the second memory cell in the second time interval.
  • a first emission light in at least a first spectral range by means of the light source in a first time interval and reading out the at least one multitap pixel by means of the first memory cell in the first time interval
  • a second emission light in at least a second spectral range by means of the light source in a second time interval
  • Time interval and the second time interval different from each other and the first spectral range and the second spectral range are at least partially different from each other.
  • An emission light is preferably in particular
  • the first Sepktral Scheme and the second spectral range are at least partially different from each other, ie, the first and the second Sepktral Scheme do not overlap each other completely, with a partial spectral overlap is possible but not mandatory.
  • a luminescence signal can have, for example, a fluorescence signal and / or a phosphorescence signal, which can be detected, for example, by an optical signal Excitation of a to be examined, fluorescent and / or phosphorescent object occurs or is emitted from the object.
  • multitap pixels can be pixels which are connected to a plurality of memory cells in order to be read out at different times from in each case one of the several memory cells. This can serve, for example, to accelerate the read-out process of the multitap pixel compared to the read-out process of conventional pixels with only one memory cell.
  • a multi-tap pixel may be in the form of a two-tap pixel having two memory cells.
  • other embodiments of multitap pixels may also have any other number greater than 1 of memory cells, for example 3, 4, 8 or 16 memory cells.
  • a light source As a light source is to be understood a source of electromagnetic radiation. Accordingly, as light or emission light
  • electromagnetic radiation This may, but not necessarily, be in the visible optical spectral range, but may
  • the spectral range is a wavelength range or
  • Frequency range of the frequencies of the electromagnetic radiation understood which may be single wavelengths or frequencies in the case of monochromatic light or in the case of more or less broadband
  • the invention offers the advantage that for the detection of the luminescence not necessarily spectral filters, such as excitation spectral filters for selecting the excitation wavelength (s) and / or emission spectral filters for selecting the wavelength (s) to be detected must be used. This can
  • a time-consuming change of spectral filters omitted whereby the measurement time can be shortened and in particular several in very short Time intervals successive measurements in different spectral ranges can be made. For example, this can make it possible to carry out detections of luminescence in different spectral ranges within a few microseconds or milliseconds.
  • the invention makes it possible to emit only emission light of the desired spectral range at certain time intervals and to detect the luminescence produced thereby and, at other specific time intervals, emission light of another desired one
  • Emission radiation and the detection means of the sensor element are synchronized such that a preferably complete assignability of the detected signal to a specific emission radiation or excitation radiation is possible, although the sensor element is optionally color insensitive, in particular none
  • Excitation spectral or emission spectral filters are used.
  • a luminescence detector arrangement can be provided which can be operated without a cost-intensive spectral filter and which can be operated in particular without mechanically changing spectral filters and / or without manipulating filter wheels.
  • the invention offers the advantage that no color-sensitive cameras must be used, but a use of a monochrome sensor element is sufficient. This allows, especially sensitive and / or very quickly readable
  • the first time interval and the second time interval each pass at least twice. That is to say, during a measurement, at least twice the first emission light and the second emission light are emitted and the at least one multitap pixel is read out at least twice by means of the first and by the second memory cell.
  • the measurement takes place over a measurement period or a measurement duration which is such that a lifetime or decay time of the luminescence of the object to be measured, which depends, for example, on a decay time of the fluorescence of the fluorophores in the object to be examined, Detection of luminescence or the measurement signal is not substantially affected.
  • a measurement duration can be selected which is longer, in particular significantly longer, than an average decay time of the
  • Luminescence of the object to be detected is.
  • the radiative lifetime is on the time scale of a few nanoseconds, so that a measurement period in the microsecond range is unaffected by the radiofrequency life of the fluorophore, on the time scale of cellular processes in the
  • the sensor element has a plurality of multitap pixels, which are preferably arranged in a matrix.
  • This offers the advantage that a spatial resolution of the detected luminescence signal can be achieved.
  • the provision of optical elements may be advantageous in order, for example, to image the luminescence signal onto the sensor element.
  • the sensor element may have a CMOS matrix in which a plurality of multitap pixels is arranged, for example, in a rectangular matrix.
  • the sensor element may comprise a matrix comprising 1008 ⁇ 1008 multitap pixels, wherein also other matrix sizes and / or
  • the luminescence detector arrangement is preferably set up to synchronize the sensor element and the light source by means of an externally provided synchronization signal.
  • the synchronization signal can be provided, for example, by an electrical signal transmitter and / or an electric pulse generator. This has the advantage that the readout of the memory cells and the Emitting the emission light can be synchronized by the light source in a particularly simple manner.
  • the luminescence detector arrangement can have a synchronization signal generator, which is preferably set up to provide a synchronization signal.
  • the synchronization signal may in particular be adapted to the
  • the sensor element may comprise the synchronization signal generator.
  • the synchronization signal generator is optionally integrated in the sensor element. This has the advantage that, for example, the sensor element an internal
  • Synchronization signal provides to control the reading of the memory cells, which can also be used externally for the synchronization of other components, such as the light source.
  • the light source is modulated.
  • the light source is preferably configured to emit the first emission light and / or the second emission light in response to the synchronization signal.
  • the light source can have one or more emission elements.
  • the light source can be designed such that it has a single emission element for the first and the second emission light, or that it has a separate emission element for each emission light. This offers the advantage that with a single light source, the first emission light and the second emission light can be provided or emitted and not necessarily multiple light sources must be provided. This can on the one hand a compact structure of
  • Luminescence detector arrangement can be achieved. On the other hand, this can be advantageous with regard to the synchronization of the light source with the sensor element, since this way, only a single light source needs to be synchronized with the sensor element.
  • the synchronization signal comprises a periodic signal, which preferably has a repetition frequency which is in a range of 100 Hz to 100 MHz, preferably in a range of 1 kHz to 10 MHz, most preferably in a range of 10 kHz to 1 MHz ,
  • a periodic signal which preferably has a repetition frequency which is in a range of 100 Hz to 100 MHz, preferably in a range of 1 kHz to 10 MHz, most preferably in a range of 10 kHz to 1 MHz ,
  • Synchronization signal be designed as an electrical voltage signal or include such.
  • the synchronization signal may have a sinusoidal and / or rectangular and / or sawtooth-shaped voltage signal.
  • the amplitudes of the voltage signal can be between 0.1 V and 20 V, for example.
  • the sensor element and / or the light source can be set up such that they are triggered by the synchronization signal at times when the synchronization signal has a rising edge and / or a falling edge. This has the advantage that the synchronization signal can be provided in a simple and reliable manner, without requiring high demands on the hardware of a synchronization signal generator.
  • the light source preferably has at least one semiconductor light source.
  • At least one emission element of the light source can have a semiconductor light source.
  • the semiconductor light source may have at least one light emitting diode (LED) or light emitting diode and / or a laser diode and / or a diode laser.
  • LED light emitting diode
  • a plurality of semiconductor light sources may be provided, which in mutually different colors or
  • Emit emission spectra a plurality of different types of semiconductor light sources are integrated in the light source.
  • the use of semiconductor light sources offers the advantage that they can be modulated particularly quickly in comparison to other light sources, ie, they can be switched on and off particularly quickly. This can be advantageous, in particular in the case of particularly short and / or rapidly successive measurement intervals, in order to achieve a fast Transition of emission light of the first spectral range to reach emission light of the second spectral range.
  • the individual semiconductor light sources may further include bandpass filters for adjusting the emitted spectral range.
  • a fluorescence microscope according to the invention is set up such that the optical excitation of the object to be examined takes place without the use of an excitation spectral filter. More preferably, the fluorescence microscope is set up such that the fluorescence signal generated by the optically excited object to be examined is carried out without the use of a luminescence spectral filter.
  • Luminescence spectral filters need not be replaced during a measurement, so that no disadvantages caused thereby arise.
  • the readout of the at least one multitap pixel by means of the first memory cell is synchronized with the emission of the first emission light and the reading of the at least one multitap pixel by means of the second memory cell is synchronized with the emission of the second emission light.
  • the at least one multitap pixel may also be more as two memory cells and the light source more than two different types of emission light, ie emission light in more than two different
  • the readout of the multitap pixel by a specific memory cell particularly preferably takes place synchronously with the emission of determined emission light by the light source.
  • steps c) and d) are repeated alternately, preferably at a repetition frequency ranging from 100 Hz to 100 MHz, preferably in a range from 1 kHz to 10 MHz, most preferably in a range from 10 kHz to 1 MHz is.
  • the steps c) and d) are particularly preferably run through at least twice. This has the advantage that it can be measured over a longer period, i. that optional also faint
  • Luminescences can be detected and, in particular, short-lived
  • Luminescences can be detected time-dependent. Furthermore, by an alternating or alternating excitation and detection at different
  • FIG. 1 shows a schematic illustration of a fluorescence microscope according to a preferred embodiment.
  • FIG. 2 shows an exemplary chronological sequence of events of a
  • FIG. 1 shows a schematic representation of a fluorescence microscope 100 according to a preferred embodiment.
  • the fluorescence microscope 100 is set up to detect the luminescence or fluorescence of an object 102 to be examined, in particular in a time-dependent or time-resolved manner.
  • the fluorescence microscope 100 has a light source 104, by means of which emission light, which can serve in particular as excitation light and / or as illumination light for optically exciting or illuminating the object to be examined, can be emitted in at least a first and a second spectral range.
  • the emission light is emitted in such a way that the emission light propagates at least partially along an illumination beam path 106.
  • an excitation spectral filter 108 may be arranged in the illumination beam path 106 in order to optionally perform a spectral filtering of the emission light in the first and / or the second spectral range.
  • the emission light is at a beam splitter 1 10 at least partially reflected in the direction of an objective 1 12.
  • the beam splitter 1 10 is formed as a multi-band beam splitter, so that preferably the emission light in both the first spectral range and in the second
  • the beam splitter 110 can be set up to also reflect the further spectral ranges with the highest possible reflectivity.
  • the beam splitter 110 may be configured not to reflect light in spectral regions other than the emission light but to transmit it with the greatest possible transmissivity.
  • the beam splitter 110 may be configured as a dichroic multiband beam splitter.
  • the emission light reflected by the beam splitter 110 is at least partially focused by the objective 1 12 onto a region of the object 102 to be examined, so that possibly present fluorescence and / or phosphorescence can be excited in the region to be examined.
  • the lens 1 12 is preferably designed as a microscope objective and is also used for the collection of light or luminescence of the object 102 for microscopic evaluation. The collected by the lens 1 12 luminescent light or
  • Fluorescent light which is optionally emitted after excitation of the object 102 with the emission light from the object 102, is collected by the lens 1 10 and propagates in the direction of the beam splitter 1 10, wherein the beam splitter 1 10 is adapted to that of the lens be collected
  • an emission filter 14 may optionally be arranged in order to spectrally filter the luminescent light collected by the lens 12, if necessary.
  • the emission spectral filter 1 14 may be formed as a multi-band spectral filter.
  • the luminescent light is focused by means of an optical element 1 16 on a sensor element 1 18 or optically imaged along the beam path 1 16a.
  • the optical element 1 16 can do this For example, be designed as a convex optical lens or a converging lens, in particular as a tube lens or more generally a tube optic.
  • the sensor element 118 may be formed as a camera, which preferably has a plurality of multitap pixels arranged in a matrix. According to the embodiment shown, the sensor element 118 and the light source 104 are controlled by means of a control unit 120. It can the
  • Receive control unit in particular the received or detected by the sensor element 1 18 18 or read from the memory cells encompassed signals and optionally further processed and / or store.
  • a synchronization signal can be provided by the control unit 120 in order to temporally synchronize the light source with the sensor element.
  • the control unit 120 may provide one provided by the sensor element 118
  • FIG. 2 shows an exemplary, schematic time sequence of operations of a method according to the invention according to a preferred embodiment, which are plotted against the time t.
  • the uppermost graph shows a progression of the pixel switching frequency 201 with a period length 202, an emission of the first emission light in the first spectral range 203, an emission of the second
  • Image pickup 207 Preferably, the pixel switching frequency in frequency and phase corresponds to the synchronization signal.
  • the applied amplitudes claim no quantitative comparability, but the graphs are intended to illustrate only a relative, temporal sequence. For example, in the graphs 203, 204, 205 and 206, a large amplitude value means that the corresponding emission light is emitted or the corresponding memory cell is read out, while the small amplitude value means that the corresponding emission light is not emitted or the corresponding memory cell is not read out.
  • Image acquisition takes place and no image acquisition takes place at a small amplitude value.
  • the dashed lines indicate the first time interval 208 and the second time interval 209 in a period 202.
  • the pixel switching frequency 201 is set such that complete exposure and detection of the overall image, i. the entire period of an image acquisition 207 or the acquisition of an image, a plurality of complete cycles or periods 202 of the pixel switching frequency 201, or longer, preferably, more than two cycles.
  • complete exposure and detection of the overall image i. the entire period of an image acquisition 207 or the acquisition of an image, a plurality of complete cycles or periods 202 of the pixel switching frequency 201, or longer, preferably, more than two cycles.
  • the pixel switching frequency 201 so low or the period 202 chosen so large that an influence of changes due to a decay of the
  • the pixel switching frequency 201 is chosen such that a suitable compromise results from a total measurement duration which is long enough to neglect temporal changes in the fluorescence or luminescence, but nevertheless to perform a plurality of measurement cycles in order to obtain a sufficient time To ensure integration to obtain signal intensity with quasi-simultaneity ("real time").
  • the pixel switching frequency may be in the range between 10 kHz and 1 MHz.
  • the emission of the first and second emission light 203, 204 of the modulatable light source 104 may be in the range between 10 kHz and 1 MHz.
  • Readout of the second memory cell 206 is set.
  • semiconductor light sources such as diode lasers or light-emitting diodes (LEDs) are suitable as correspondingly rapidly modulated light sources 104, so that the method is preferred for inter alia
  • Epifluorescence microscopy in TIRF microscopy, in structured illumination microscopy, in light-sheet microscopy, in multifocal microscopy
  • the modulation of the light source 203, 204 may, for example, also take place separately from the pixel switching frequency 201.
  • a modulation of a light source which emits light continuously over time can be effected by electro-optical and / or acousto-optical and / or electromechanical (eg chopper) or other methods.
  • the readout of the memory cells 205, 206 is preferably carried out such that the signal is integrated over more than two complete cycles or periods 202 of the pixel switching frequency 201, so that the shortest possible time interval between the
  • Excitation wavelengths can be done. This can be done by means of a conventional, simple mutual synchronization of the illumination to the exposure time of the camera, i. in a complete image pickup 207 with the first emission light and only then a complete image pickup 207 with the second
  • Pixel switching frequency 201 is selected within a total exposure time of the image pickup 207, the lower the effects of the time-dependent changes of the object to be examined and the better the comparability of measurements with emission light or excitation light in different spectral ranges.

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Abstract

The invention relates to a luminescence detector arrangement for detecting a luminescence signal, having a sensor element (118) with at least one multi-tap pixel with at least one first memory cell and one second memory cell, wherein the sensor element (118) is configured to read the multi-tap pixel by means of the first memory cell in a first time interval (208) and by means of the second memory cell in a second time interval (209) that differs from the first time interval (208). Further, the luminescence detector arrangement has a light source (104), which is configured to emit a first emission light in at least one first spectral range and, independently thereof, emit a second emission light in a second spectral range, wherein the first spectral range and the second spectral range are at least partly different from one another, wherein the light source (104) is synchronized with the sensor element (118) in order to emit the first emission light in the first time interval (208) and in order to emit the second emission light in the second time interval (209); and wherein the luminescence detector arrangement is further configured to detect using the sensor element (118) a luminescence signal caused by the first emission light and by the second emission light. In a further aspect, the invention relates to a fluorescence microscope and a method for detecting a luminescence signal.

Description

Lumineszenzdetektoranordnung, Fluoreszenzmikroskop und Verfahren zum Detektieren eines Lumineszenzsignals  Luminescence detector arrangement, fluorescence microscope and method for detecting a luminescence signal

Beschreibung description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Lumineszenzdetektoranordnung, ein The present invention relates to a luminescence detector arrangement

Fluoreszenzmikroskop und ein Verfahren zum Detektieren eines Lumineszenzsignals. Die Erfindung liegt dabei insbesondere auf dem Gebiet der Fluoreszenzmikroskopie, insbesondere auf dem Gebiet der Weitfeld-Mikroskopie. Fluorescence microscope and a method for detecting a luminescence signal. The invention is particularly in the field of fluorescence microscopy, in particular in the field of wide-field microscopy.

Stand der Technik State of the art

Im Bereich der Weitfeld-Mikroskopie, insbesondere in der Fluoreszenzmikroskopie mit Weitfeld-Detektion, ist oftmals die gleichzeitige Abbildung mehrerer lumineszierender Objekte, insbesondere mehrerer Fluorophore mit unterschiedlichen spektralen Eigenschaften, von zentralem Interesse, um strukturelle und funktionale Korrelationen zwischen unterschiedlichen Strukturen zu erforschen. Um eine ausreichende In the field of far-field microscopy, in particular in fluorescence microscopy with far field detection, the simultaneous imaging of several luminescent objects, in particular several fluorophores with different spectral properties, is often of central interest in order to investigate structural and functional correlations between different structures. To get a sufficient

Sensitivität für Fluoreszenzabbildungen zu erreichen, werden bei dieser Art der Mikroskopie oftmals monochrome Kameras, d.h. farbinsensitive Kameras, verwendet, da diese typischerweise mit einer höheren Sensitivität und/oder einer schnelleren Auslesbarkeit zur Verfügung stehen, als andere Kamerasysteme, welche auch ein Farbauflösung bieten. Um dennoch mit monochromen Kameras farbsensitive Messungen durchführen zu können, bzw. um Messungen in unterschiedlichen spektralen Bereichen durchführen zu können, können herkömmlicherweise verschiedene Verfahren Anwendung finden. Beispielsweise werden zu diesem Zweck Wechselvorrichtungen für Baugruppen mit Anregungsspektralfiltern, einem dichroitischen Strahlteiler und einem To achieve sensitivity for fluorescence imaging, monochrome cameras, ie color-sensitive cameras, are often used in this type of microscopy, since they are typically available with a higher sensitivity and / or a faster readability than other camera systems which also offer a color resolution. However, in order to be able to carry out color-sensitive measurements with monochrome cameras or to be able to carry out measurements in different spectral ranges, conventionally various methods can be used. For example, for this purpose changing devices for assemblies with excitation spectral filters, a dichroic beam splitter and a

Emissionsspektralfilter verwendet, welche in sogenannten Fluoreszenzfilterwürfeln kombiniert werden können. Diese Fluoreszenzfilterwürfel können sodann für Emission spectral filters used, which can be combined in so-called fluorescence filter cubes. These fluorescence filter cubes can then be used for

Messungen in unterschiedlichen Spektralbereichen, bspw. für optische Anregungen und/oder Detektionen bei unterschiedlichen Wellenlängen, entsprechend den jeweiligen Bedürfnissen ausgetauscht werden. Dies kann den Nachteil aufweisen, dass ein Tausch von solchen Fluoreszenzfilterwürfeln zeitaufwändig sein kann, Measurements in different spectral ranges, for example, for optical excitations and / or detections at different wavelengths, to be exchanged according to the respective needs. This can have the disadvantage that a replacement of such fluorescence filter cubes can be time-consuming,

insbesondere wenn die auszutauschenden Fluoreszenzfilterwürfel eine große Masse aufweisen. especially when the fluorescent filter cubes to be replaced have a large mass.

Ferner finden herkömmlicherweise dichroitische Multiband-Strahlteiler mit dazu passenden Emissions- und Anregungsfiltersätzen Verwendung. Diese weisen oftmals relativ kleine Filter auf, welche beispielsweise mittels schneller Filterräder bewegt werden können, so dass ein Filterwechsel unter Umständen schneller durchgeführt werden kann als beim Wechsel von Fluoreszenzfilterwürfeln. Jedoch nimmt auch ein derartiger, mechanischer Wechselvorgang noch erhebliche Zeit in Anspruch. Zudem kann sich bei beiden herkömmlichen Methoden für manche Messungen ein Nachteil auch daraus ergeben, dass die Bilder unterschiedlicher Fluorophore bei Furthermore, conventionally, dichroic multiband beam splitters with matching emission and excitation filter sets have been used. These often have relatively small filters, which can be moved, for example, by means of fast filter wheels, so that a filter change can possibly be carried out faster than when changing from fluorescence filter cubes. However, even such a mechanical change process still takes considerable time. In addition, in both conventional methods for some measurements, a disadvantage may also result from the fact that the images of different fluorophores at

unterschiedlichen spektralen Anregungsbereichen und/oder Lumineszenzbereichen zu unterschiedlichen Zeitpunkten aufgenommen werden und dadurch eine different spectral excitation regions and / or luminescence areas are recorded at different times and thereby a

Vergleichbarkeit der Messdaten von unterschiedlichen Spektralbereichen reduziert sein kann. Insbesondere bei schnellen Prozessen kann dies die Interpretation von räumlichen Korrelationen der untersuchten Objekte erschweren. Auch ist die Verwendung von Multiband-Filtersätzen und Farbkameras bekannt. Dabei kann jedoch oftmals die Trennung der einzelnen Farbkanäle stark kompromittiert sein. Weiterhin kann durch die Verwendung von Bayer-Masken für Farbsensoren die Sensitivität durch deren Filterwirkung reduziert sein, da die Intensitätswerte des Signals von einzelnen Pixeln teilweise rechnerisch aus den benachbarten Pixeln ermittelt werden, was eine quantitative, wissenschaftliche Auswertung der Comparability of the measured data from different spectral ranges can be reduced. Especially with fast processes this can complicate the interpretation of spatial correlations of the examined objects. Also, the use of multiband filter sets and color cameras is known. However, often the separation of the individual color channels can be severely compromised. Furthermore, the use of Bayer masks for color sensors can reduce the sensitivity due to their filter effect, since the intensity values of the signal from individual pixels are determined in some cases mathematically from the neighboring pixels, which is a quantitative, scientific evaluation of the

Detektorsignale häufig erschweren kann Detector signals can often complicate

Auch können Mehrkamera-Methoden zum Einsatz kommen. Diese sind jedoch oftmals kostenintensiv und aufwändig, da mehrere Kameras angeschafft werden müssen und die verschiedenen Kameras zudem synchronisiert und deren Bilder zum Überlapp gebracht werden müssen, was bei toleranzbedingten unterschiedlichen lateralen Bildlagen und geometrischen Verzerrungen oftmals mit einem sehr großen Aufwand verbunden sein kann. Also multi-camera methods can be used. However, these are often cost-intensive and expensive, since several cameras must be purchased and the different cameras also synchronized and their images must be overlapped, which can often be associated with tolerance-related different lateral layers and geometric distortions with a great deal of effort.

Des Weiteren sind Kamera-Teiler bekannt, bei denen ein mikroskopisches Sehfeld spektral geteilt wird und auf unterschiedliche Bereiche desselben Sensors abgebildet wird. Solche Systeme sind oftmals nicht telezentrisch und leiden ebenfalls unter Überlapp-Problemen wie die oben erwähnten Mehrkamera-Methoden. Furthermore, camera splitters are known in which a microscopic field of view is spectrally divided and imaged on different areas of the same sensor. Such systems are often non-telecentric and also suffer from overlap problems, such as the multiple camera methods mentioned above.

Zusätzlich ist die Verwendung von Kameras bzw. Flächensensoren mit mehreren Pixel-Anzapfungen bekannt, d.h. Kameras mit sogenannten Multitap- oder Two-Tap- Pixeln, wobei derartige Kamerasysteme beispielsweise als FLIM-Kameras (pco.flim, PCO AG; MEMFLIM, TELEDYNE DALSA PROFESSIONAL IMAGING) oder als Time- of-Flight-Kameras (epc660, ESPROS PHOTONICS CORPORATION) bekannt sind. Dabei wird eine durch den Detektionsprozess in einem Detektorpixel entstehende elektrische Ladung in zwei oder mehreren Speicherzellen gesammelt, wobei dieIn addition, the use of multi-pixel taps or area sensors is known, i. Cameras with so-called multitap or two-tap pixels, such camera systems being used, for example, as FLIM cameras (pco.flim, PCO AG, MEMFLIM, TELEDYNE DALSA PROFESSIONAL IMAGING) or as time-of-flight cameras (epc660, ESPROS PHOTONICS CORPORATION ) are known. In this case, an electrical charge resulting from the detection process in a detector pixel is collected in two or more memory cells, wherein the

Integrationszeit pro Speicherzelle in einem festen Phasenbereich einer hochfrequenten Modulationsfrequenz (Pixelschaltfrequenz) liegt. Beispielsweise werden derartige Kameras meist für Entfernungsmessungen und für Messungen mittels Integration time per memory cell in a fixed phase range of a high-frequency modulation frequency (pixel switching frequency) is located. For example, such cameras are usually for distance measurements and for measurements using

Fluoreszenzlebensdauermikroskopie verwendet. Es ist daher die Aufgabe der Erfindung, eine Lumineszenzdetektoranordnung, ein Fluoreszenzmikroskop und ein Verfahren zum Detektieren eines Lumineszenzsignals bereitzustellen, welche eine vereinfachte Detektion von Lumineszenzsignalen bei verschiedenen Anregungswellenlängen in kurzen Zeitabständen ermöglichen. Fluorescence lifetime microscopy used. It is therefore the object of the invention to provide a luminescence detector arrangement, a fluorescence microscope and a method for detecting a luminescence signal, which enable a simplified detection of luminescence signals at different excitation wavelengths at short time intervals.

Offenbarung der Erfindung Disclosure of the invention

Erfindungsgemäß werden eine Lumineszenzdetektoranordnung, ein According to the invention, a luminescence detector arrangement, a

Fluoreszenzmikroskop und ein Verfahren zum Detektieren eines Lumineszenzsignals mit den Merkmalen der unabhängigen Patentansprüche vorgeschlagen. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der jeweiligen Unteransprüche sowie der nachfolgenden Beschreibung. Fluorescence microscope and a method for detecting a luminescence signal with the features of the independent claims proposed. Advantageous embodiments are the subject of the respective subclaims and the following description.

In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung eine Lumineszenzdetektoranordnung zum Detektieren eines Lumineszenzsignals, welcher ein Sensorelement mit zumindest einem Multitap-Pixel mit zumindest einer ersten Speicherzelle und einer zweiten Speicherzelle aufweist, wobei das Sensorelement dazu eingerichtet ist, das Multitap- Pixel in einem ersten Zeitintervall mittels der ersten Speicherzelle auszulesen und in einem vom ersten Zeitintervall verschiedenen zweiten Zeitintervall mittels der zweiten Speicherzelle auszulesen. Ferner weist die Lumineszenzdetektoranordnung eine Lichtquelle auf, welche dazu eingerichtet ist, ein erstes Emissionslicht in zumindest einem ersten Spektralbereich zu emittieren und unabhängig davon ein zweites Emissionslicht in einem zweiten Spektralbereich zu emittieren, wobei der erste Spektralbereich und der zweite Spektralbereich zumindest teilweise voneinander verschieden sind (Überlappungen nicht ausgeschlossen). Dabei ist die Lichtquelle mit dem Sensorelement synchronisiert, um in dem ersten Zeitintervall das erste In a first aspect, the invention relates to a luminescence detector arrangement for detecting a luminescence signal, which has a sensor element with at least one multitap pixel having at least a first memory cell and a second memory cell, wherein the sensor element is adapted to the multitap pixel in a first time interval by means of read the first memory cell and read in a second time interval different from the first time interval by means of the second memory cell. Furthermore, the luminescence detector arrangement has a light source which is set up to emit a first emission light in at least one first spectral range and independently emit a second emission light in a second spectral range, wherein the first spectral range and the second spectral range are at least partially different from one another ( Overlaps not excluded). In this case, the light source is synchronized with the sensor element to the first in the first time interval

Emissionslicht zu emittieren und in dem zweiten Zeitintervall das zweite Emissionslicht zu emittieren. Auch ist die Lumineszenzdetektoranordnung ferner dazu eingerichtet, ein durch das erste Emissionslicht und durch das zweite Emissionslicht Emitting emission light and emitting the second emission light in the second time interval. Also, the luminescence detecting device is further configured to be one through the first emission light and through the second emission light

hervorgerufenes Lumineszenzsignal mit dem Sensorelement zu detektieren. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Fluoreszenzmikroskop mit einer erfindungsgemäßen Lumineszenzdetektoranordnung, wobei das caused luminescence signal with the sensor element to detect. In a further aspect, the invention relates to a fluorescence microscope with a luminescence detector arrangement according to the invention, wherein the

Fluoreszenzmikroskop dazu eingerichtet ist, ein zu untersuchendes Objekt mittels der Lichtquelle zumindest teilweise optisch anzuregen und ein von dem optisch angeregten zu untersuchenden Objekt erzeugtes Fluoreszenzsignal zumindest teilweise als Lumineszenzsignal zu detektieren. Fluorescence microscope is adapted to at least partially optically excite an object to be examined by means of the light source and at least partially detect a fluorescence signal generated by the optically excited object to be examined as a luminescence signal.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Detektieren eines Lumineszenzsignals mit den Schritten a) Bereitstellen eines Sensorelements mit zumindest einem Multitap-Pixel mit zumindest einer ersten Speicherzelle und einer zweiten Speicherzelle; b) Bereitstellen einer Lichtquelle; c) Emittieren eines ersten Emissionslichts in zumindest einem ersten Spektralbereich mittels der Lichtquelle in einem ersten Zeitintervall und Auslesen des zumindest einen Multitap-Pixels mittels der ersten Speicherzelle in dem ersten Zeitintervall; und d) Emittieren eines zweiten Emissionslichts in zumindest einem zweiten Spektralbereich mittels der Lichtquelle in einem zweiten Zeitintervall und Auslesen des zumindest einen Multitap-Pixels mittels der zweiten Speicherzelle in dem zweiten Zeitintervall. Dabei sind das erste In a further aspect, the invention relates to a method for detecting a luminescence signal with the steps of a) providing a sensor element having at least one multitap pixel with at least one first memory cell and a second memory cell; b) providing a light source; c) emitting a first emission light in at least a first spectral range by means of the light source in a first time interval and reading out the at least one multitap pixel by means of the first memory cell in the first time interval; and d) emitting a second emission light in at least a second spectral range by means of the light source in a second time interval and reading out the at least one multitap pixel by means of the second memory cell in the second time interval. Here are the first

Zeitintervall und das zweite Zeitintervall voneinander verschieden und der erste Spektralbereich und der zweite Spektralbereich sind zumindest teilweise voneinander verschieden. Time interval and the second time interval different from each other and the first spectral range and the second spectral range are at least partially different from each other.

Bei einem Emissionslicht handelt es sich vorzugsweise insbesondere um An emission light is preferably in particular

Anregungslicht zur Anregung eines zu untersuchenden Objekts bzw. von Fluorophoren in dem zu untersuchenden Objekt und/oder um Beleuchtungslicht zum Beleuchten des zu untersuchenden Objekts. Der erste Sepktralbereich und der zweite Spektralbereich sind dabei zumindest teilweise voneinander verschieden, d.h. der erste und der zweite Sepktralbereich überlappen einander nicht vollständig, wobei ein teilweises spektrales Überlappen möglich aber nicht zwingend erforderlich ist. Ein Lumineszenzsignal kann beispielsweise ein Fluoreszenzsignal und/oder ein Phosphoreszenzsignal aufweisen, welches beispielsweise durch eine optische Anregung eines zu untersuchenden, fluoreszenten und/oder phosphoreszenten Objektes auftritt bzw. von dem Objekt emittiert wird. Excitation light for excitation of an object to be examined or of fluorophores in the object to be examined and / or illumination light for illuminating the object to be examined. The first Sepktralbereich and the second spectral range are at least partially different from each other, ie, the first and the second Sepktralbereich do not overlap each other completely, with a partial spectral overlap is possible but not mandatory. A luminescence signal can have, for example, a fluorescence signal and / or a phosphorescence signal, which can be detected, for example, by an optical signal Excitation of a to be examined, fluorescent and / or phosphorescent object occurs or is emitted from the object.

Multitap-Pixel können dabei Pixel sein, welche mit mehreren Speicherzellen verbunden sind, um zu verschiedenen Zeitpunkten von jeweils einer der mehreren Speicherzellen ausgelesen zu werden. Dies kann beispielsweise dazu dienen, den Ausleseprozess des Multitap-Pixels gegenüber dem Ausleseprozess von herkömmlichen Pixeln mit nur einer Speicherzelle zu beschleunigen. Beispielsweise kann ein Multitap-Pixel in Form eines Two-Tap-Pixels vorliegen, welcher über zwei Speicherzellen verfügt. Andere Ausführungsformen von Multitap-Pixeln können jedoch auch eine beliebige andere Anzahl größer als 1 von Speicherzellen aufweisen, beispielsweise 3, 4, 8 oder 16 Speicherzellen. In this case, multitap pixels can be pixels which are connected to a plurality of memory cells in order to be read out at different times from in each case one of the several memory cells. This can serve, for example, to accelerate the read-out process of the multitap pixel compared to the read-out process of conventional pixels with only one memory cell. For example, a multi-tap pixel may be in the form of a two-tap pixel having two memory cells. However, other embodiments of multitap pixels may also have any other number greater than 1 of memory cells, for example 3, 4, 8 or 16 memory cells.

Als eine Lichtquelle soll dabei eine Quelle von elektromagnetischer Strahlung verstanden werden. Entsprechend soll als Licht bzw. Emissionslicht As a light source is to be understood a source of electromagnetic radiation. Accordingly, as light or emission light

elektromagnetische Strahlung verstanden werden. Dies kann, muss aber nicht zwingend, im sichtbaren optischen Spektralbereich liegen, sondern kann electromagnetic radiation. This may, but not necessarily, be in the visible optical spectral range, but may

beispielsweise auch ultraviolette und/oder infrarote und/oder Röntgenstrahlung umfassen. Als Spektralbereich wird dabei ein Wellenlängenbereich bzw. For example, also include ultraviolet and / or infrared and / or X-rays. The spectral range is a wavelength range or

Frequenzbereich der Frequenzen der elektromagnetischen Strahlung verstanden, wobei es sich im Falle von monochromatischem Licht um einzelne Wellenlängen bzw. Frequenzen handeln kann oder im Falle von mehr oder weniger breitbandiger Frequency range of the frequencies of the electromagnetic radiation understood, which may be single wavelengths or frequencies in the case of monochromatic light or in the case of more or less broadband

Strahlung um einen kontinuierlichen Wellenlängenbereich bzw. Frequenzbereich, über welchen sich das Spektrum der elektromagnetischen Strahlung erstreckt. Radiation around a continuous wavelength range or frequency range over which extends the spectrum of the electromagnetic radiation.

Die Erfindung bietet den Vorteil, dass für die Detektion der Lumineszenz nicht notwendigerweise Spektralfilter, wie etwa Anregungsspektralfilter zur Selektion der Anregungswellenlänge(n) und/oder Emissionsspektralfilter zur Selektion der zu detektierenden Wellenlänge(n) verwendet werden müssen. Dadurch kann The invention offers the advantage that for the detection of the luminescence not necessarily spectral filters, such as excitation spectral filters for selecting the excitation wavelength (s) and / or emission spectral filters for selecting the wavelength (s) to be detected must be used. This can

insbesondere ein zeitaufwändiger Wechsel von Spektralfiltern entfallen, wodurch die Messdauer verkürzt werden kann und insbesondere mehrere in sehr kurzen Zeitabständen aufeinanderfolgende Messungen in unterschiedlichen Spektralbereichen erfolgen können. Beispielsweise kann dies ermöglichen, innerhalb von wenigen Mikrosekunden oder Millisekunden Detektionen von Lumineszenz in unterschiedlichen Spektralbereichen durchzuführen. Insbesondere ermöglicht die Erfindung, in bestimmten Zeitintervallen nur Emissionslicht des gewünschten Spektralbereichs zu emittieren und die dadurch hervorgerufene Lumineszenz zu detektieren und in anderen bestimmten Zeitintervallen Emissionslicht eines anderen gewünschten In particular, a time-consuming change of spectral filters omitted, whereby the measurement time can be shortened and in particular several in very short Time intervals successive measurements in different spectral ranges can be made. For example, this can make it possible to carry out detections of luminescence in different spectral ranges within a few microseconds or milliseconds. In particular, the invention makes it possible to emit only emission light of the desired spectral range at certain time intervals and to detect the luminescence produced thereby and, at other specific time intervals, emission light of another desired one

Spektralbereichs zu emittieren und die dadurch hervorgerufene Lumineszenz zu detektieren. Mit anderen Worten kann die Emission von bestimmter To emit spectral range and to detect the luminescence caused thereby. In other words, the emission of certain

Emissionsstrahlung und die Detektion mittels des Sensorelements derart synchronisiert werden, dass eine vorzugsweise vollständige Zuordenbarkeit des detektierten Signals zu einer bestimmten Emissionsstrahlung bzw. Anregungsstrahlung möglich ist, wenngleich das Sensorelement optional farbinsensitiv ist, insbesondere keine Emission radiation and the detection means of the sensor element are synchronized such that a preferably complete assignability of the detected signal to a specific emission radiation or excitation radiation is possible, although the sensor element is optionally color insensitive, in particular none

Farbfiltermatrix aufweist und auch eine spektrale Filterung des Anregungslichts und/oder der Lumineszenzstrahlung nicht stattfindet und insbesondere keine Has color filter matrix and also a spectral filtering of the excitation light and / or the luminescence does not take place and in particular no

Anregungsspektralfilter oder Emissionsspektralfilter verwendet werden. Excitation spectral or emission spectral filters are used.

Dies bietet den Vorteil, dass eine Lumineszenzdetektoranordnung bereitgestellt werden kann, welcher ohne kostenintensiven Spektralfilter betrieben werden kann und welcher insbesondere ohne ein mechanisches Wechseln von Spektralfiltern und/oder ohne ein Manipulieren von Filterrädern betrieben werden kann. Ferner bietet die Erfindung den Vorteil, dass keine farbsensitiven Kameras verwendet werden müssen, sondern eine Verwendung eines monochromen Sensorelements ausreichend ist. Dies ermöglicht, besonders sensitive und/oder besonders schnell auslesbare This offers the advantage that a luminescence detector arrangement can be provided which can be operated without a cost-intensive spectral filter and which can be operated in particular without mechanically changing spectral filters and / or without manipulating filter wheels. Furthermore, the invention offers the advantage that no color-sensitive cameras must be used, but a use of a monochrome sensor element is sufficient. This allows, especially sensitive and / or very quickly readable

Sensorelemente zu verwenden. To use sensor elements.

Vorzugsweise werden während einer Messung das erste Zeitintervall und das zweite Zeitintervall jeweils zumindest zweimal durchlaufen. D.h. während einer Messung wird jeweils zumindest zweimal das erste Emissionslicht und das zweite Emissionslicht emittiert und das zumindest eine Multitap-Pixel jeweils zumindest zweimal mittels der ersten sowie mittels der zweiten Speicherzelle ausgelesen. Besonders bevorzugt erfolgt andererseits die Messung über einen Messzeitraum bzw. eine Messdauer, welcher bzw. welche derart bemessen ist, dass eine Lebensdauer bzw. Abklingdauer der zu messenden Lumineszenz des Objekts, welche beispielsweise von einer Abklingdauer der Fluoreszenz der Fluorophore in dem zu untersuchenden Objekt abhängt, die Detektion der Lumineszenz bzw. das Messsignal im Wesentlichen nicht beeinflusst. Beispielsweise kann dazu eine Messdauer gewählt werden, welche länger, insbesondere wesentlich länger, als eine durchschnittliche Abklingdauer der Preferably, during a measurement, the first time interval and the second time interval each pass at least twice. That is to say, during a measurement, at least twice the first emission light and the second emission light are emitted and the at least one multitap pixel is read out at least twice by means of the first and by the second memory cell. Especially preferred On the other hand, the measurement takes place over a measurement period or a measurement duration which is such that a lifetime or decay time of the luminescence of the object to be measured, which depends, for example, on a decay time of the fluorescence of the fluorophores in the object to be examined, Detection of luminescence or the measurement signal is not substantially affected. For example, a measurement duration can be selected which is longer, in particular significantly longer, than an average decay time of the

Lumineszenz des zu detektierenden Objektes ist. Im Falle von Fluoreszenzprozessen liegt die strahlende Lebensdauer auf der Zeitskala von wenigen Nanosekunden, so dass eine Messdauer im Mikrosekundenbereich unbeeinflusst von der strahlenden Lebensdauer des Fluorophors ist, auf der Zeitskala zellulärer Vorgänge im Luminescence of the object to be detected is. In the case of fluorescence processes, the radiative lifetime is on the time scale of a few nanoseconds, so that a measurement period in the microsecond range is unaffected by the radiofrequency life of the fluorophore, on the time scale of cellular processes in the

Millisekundenbereich jedoch weiterhin quasi simultane Detektion mehrerer Fluorophore zulässt. Vorzugsweise weist das Sensorelement eine Mehrzahl von Multitap-Pixeln auf, welche vorzugsweise in einer Matrix angeordnet sind. Dies bietet den Vorteil, dass auch eine räumliche Auflösung des detektierten Lumineszenzsignals erzielt werden kann. Dabei kann beispielsweise die Bereitstellung von optischen Elementen vorteilhaft sein, um beispielsweise das Lumineszenzsignal auf das Sensorelement abzubilden. Millisecond range, however, still allows quasi-simultaneous detection of multiple fluorophores. Preferably, the sensor element has a plurality of multitap pixels, which are preferably arranged in a matrix. This offers the advantage that a spatial resolution of the detected luminescence signal can be achieved. In this case, for example, the provision of optical elements may be advantageous in order, for example, to image the luminescence signal onto the sensor element.

Beispielsweise kann das Sensorelement eine CMOS-Matrix aufweisen, in welcher eine Mehrzahl von Multitap-Pixeln beispielsweise in einer rechteckigen Matrix angeordnet ist. Beispielsweise kann das Sensorelement eine Matrix umfassend 1008x1008 Multitap-Pixel aufweisen, wobei auch andere Matrixgrößen und/oder By way of example, the sensor element may have a CMOS matrix in which a plurality of multitap pixels is arranged, for example, in a rectangular matrix. For example, the sensor element may comprise a matrix comprising 1008 × 1008 multitap pixels, wherein also other matrix sizes and / or

Sensorelementgrößen möglich sind. Sensor element sizes are possible.

Vorzugsweise ist die Lumineszenzdetektoranordnung dazu eingerichtet, mittels eines extern bereitgestellten Synchronisationssignals das Sensorelement und die Lichtquelle zu synchronisieren. Das Synchronisationssignal kann beispielsweise von einem elektrischen Signalgeber und/oder einem elektrischen Impulsgeber bereitgestellt werden. Dies hat den Vorteil, dass das Auslesen der Speicherzellen und das Emittieren des Emissionslichts durch die Lichtquelle auf besonders einfache Weise synchronisiert werden können. The luminescence detector arrangement is preferably set up to synchronize the sensor element and the light source by means of an externally provided synchronization signal. The synchronization signal can be provided, for example, by an electrical signal transmitter and / or an electric pulse generator. This has the advantage that the readout of the memory cells and the Emitting the emission light can be synchronized by the light source in a particularly simple manner.

Alternativ oder zusätzlich kann die Lumineszenzdetektoranordnung gemäß einer bevorzugten Ausführungsform einen Synchronisationssignalgeber aufweisen, welcher vorzugsweise dazu eingerichtet ist, ein Synchronisationssignal bereitzustellen. Das Synchronisationssignal kann insbesondere dazu eingerichtet sein, um das Alternatively or additionally, in accordance with a preferred embodiment, the luminescence detector arrangement can have a synchronization signal generator, which is preferably set up to provide a synchronization signal. The synchronization signal may in particular be adapted to the

Sensorelement und die Lichtquelle mittels des Synchronisationssignals zu Sensor element and the light source by means of the synchronization signal to

synchronisieren. Dies hat den Vorteil, dass gegebenenfalls auf die Bereitstellung eines Synchronisationssignals durch eine externe Synchronisationssignalquelle bzw. einen externen Synchronisationssignalgeber verzichtet werden kann. Beispielsweise kann das Sensorelement den Synchronisationssignalgeber aufweisen. Mit anderen Worten ist der Synchronisationssignalgeber optional in das Sensorelement integriert. Dies hat den Vorteil, dass beispielsweise das Sensorelement ein internes synchronize. This has the advantage that it may be possible to dispense with the provision of a synchronization signal by an external synchronization signal source or an external synchronization signal generator. For example, the sensor element may comprise the synchronization signal generator. In other words, the synchronization signal generator is optionally integrated in the sensor element. This has the advantage that, for example, the sensor element an internal

Synchronisationssignal bereitstellt um das Auslesen der Speicherzellen zu steuern, welches auch extern für die Synchronisierung anderer Komponenten, wie etwa der Lichtquelle, verwendet werden kann. Synchronization signal provides to control the reading of the memory cells, which can also be used externally for the synchronization of other components, such as the light source.

Vorzugsweise ist die Lichtquelle modulierbar. Ferner ist die Lichtquelle vorzugsweise dazu eingerichtet, in Reaktion auf das Synchronisationssignal das erste Emissionslicht und/oder das zweite Emissionslicht zu emittieren. Dabei kann die Lichtquelle ein oder mehrere Emissionselemente aufweisen. Insbesondere kann die Lichtquelle derart ausgestaltet sein, dass sie für das erste und das zweite Emissionslicht ein einziges Emissionselement aufweist, oder dass sie für jedes Emissionslicht ein separates Emissionselement aufweist. Dies bietet den Vorteil, dass mit einer einzigen Lichtquelle das erste Emissionslicht und das zweite Emissionslicht bereitgestellt bzw. emittiert werden können und nicht notwendigerweise mehrere Lichtquellen bereitgestellt werden müssen. Dadurch kann zum einen ein kompakter Aufbau der Preferably, the light source is modulated. Furthermore, the light source is preferably configured to emit the first emission light and / or the second emission light in response to the synchronization signal. In this case, the light source can have one or more emission elements. In particular, the light source can be designed such that it has a single emission element for the first and the second emission light, or that it has a separate emission element for each emission light. This offers the advantage that with a single light source, the first emission light and the second emission light can be provided or emitted and not necessarily multiple light sources must be provided. This can on the one hand a compact structure of

Lumineszenzdetektoranordnung erreicht werden. Zum anderen kann dies vorteilhaft hinsichtlich der Synchronisierung der Lichtquelle mit dem Sensorelement sein, da auf diese Weise nur eine einzige Lichtquelle mit den Sensorelement synchronisiert werden muss. Luminescence detector arrangement can be achieved. On the other hand, this can be advantageous with regard to the synchronization of the light source with the sensor element, since this way, only a single light source needs to be synchronized with the sensor element.

Vorzugsweise weist das Synchronisationssignal ein periodisches Signal auf, welches vorzugsweise eine Wiederholfrequenz aufweist, die in einem Bereich von 100 Hz bis 100 MHz , bevorzugt in einem Bereich von 1 kHz bis 10 MHz, am meisten bevorzugt in einem Bereich von 10 kHz bis 1 MHz liegt. Beispielsweise kann das Preferably, the synchronization signal comprises a periodic signal, which preferably has a repetition frequency which is in a range of 100 Hz to 100 MHz, preferably in a range of 1 kHz to 10 MHz, most preferably in a range of 10 kHz to 1 MHz , For example, that can

Synchronisationssignal als ein elektrisches Spannungssignal ausgestaltet sein oder ein solches umfassen. Insbesondere kann das Synchronisationssignal ein sinusförmiges und/oder rechteckförmiges und/oder sägezahnförmiges Spannungssignal aufweisen. Die Amplituden des Spannungssignals können dabei beispielsweise zwischen 0,1 V und 20 V liegen. Beispielsweise können das Sensorelement und/oder die Lichtquelle derart eingerichtet sein, dass diese durch das Synchronisationssignal zu Zeitpunkten ausgelöst werden, wenn das Synchronisationssignal eine steigende Flanke und/oder eine fallende Flanke aufweist. Dies hat den Vorteil, dass das Synchronisationssignal mit einfachen Mitteln und auf zuverlässige Weise bereitgestellt werden kann, ohne dass dafür hohe Anforderungen an die Hardware eines Synchronisationssignalgebers erforderlich sind. Vorzugsweise weist die Lichtquelle zumindest eine Halbleiter-Lichtquelle auf. Synchronization signal be designed as an electrical voltage signal or include such. In particular, the synchronization signal may have a sinusoidal and / or rectangular and / or sawtooth-shaped voltage signal. The amplitudes of the voltage signal can be between 0.1 V and 20 V, for example. For example, the sensor element and / or the light source can be set up such that they are triggered by the synchronization signal at times when the synchronization signal has a rising edge and / or a falling edge. This has the advantage that the synchronization signal can be provided in a simple and reliable manner, without requiring high demands on the hardware of a synchronization signal generator. The light source preferably has at least one semiconductor light source.

Insbesondere kann zumindest ein Emissionselement der Lichtquelle eine Halbleiter- Lichtquelle aufweisen. Beispielsweise kann die Halbleiter-Lichtquelle zumindest eine lichtemittierende Diode (LED) bzw. Leuchtdiode und/oder eine Laserdiode und/oder einen Diodenlaser aufweisen. Beispielsweise können mehrere Halbleiterlichtquellen bereitgestellt sein, welche bei voneinander verschiedenen Farben bzw.  In particular, at least one emission element of the light source can have a semiconductor light source. For example, the semiconductor light source may have at least one light emitting diode (LED) or light emitting diode and / or a laser diode and / or a diode laser. For example, a plurality of semiconductor light sources may be provided, which in mutually different colors or

Emissionsspektren emittieren. Besonders bevorzugt sind mehrere verschiedenartige Halbleiter-Lichtquellen in der Lichtquelle integriert. Die Verwendung von Halbleiter- Lichtquellen bietet den Vorteil, dass diese im Vergleich zu anderen Lichtquellen besonders schnell moduliert werden können, d.h. besonders schnell ein- und ausgeschaltet werden können. Dies kann insbesondere bei besonders kurzen und/oder schnell aufeinanderfolgenden Messintervallen vorteilhaft sein, um einen schnellen Übergang von Emissionslicht des ersten Spektralbereichs zu Emissionslicht des zweiten Spektralbereichs zu erreichen. Die einzelnen Halbleiterlichtquellen können weiterhin Bandpassfilter zur Anpassung des emittierten Spektralbereichs beinhalten. Vorzugsweise ist ein erfindungsgemäßes Fluoreszenzmikroskop derart eingerichtet, dass die optische Anregung des zu untersuchenden Objekts ohne Verwendung eines Anregungsspektralfilters erfolgt. Weiter bevorzugt ist das Fluoreszenzmikroskop derart eingerichtet, dass das von dem optisch angeregten zu untersuchenden Objekt erzeugte Fluoreszenzsignal ohne Verwendung eines Lumineszenzspektralfilters erfolgt. Wenngleich die Verwendung von derartigen Spektralfiltern nicht Emit emission spectra. Particularly preferably, a plurality of different types of semiconductor light sources are integrated in the light source. The use of semiconductor light sources offers the advantage that they can be modulated particularly quickly in comparison to other light sources, ie, they can be switched on and off particularly quickly. This can be advantageous, in particular in the case of particularly short and / or rapidly successive measurement intervals, in order to achieve a fast Transition of emission light of the first spectral range to reach emission light of the second spectral range. The individual semiconductor light sources may further include bandpass filters for adjusting the emitted spectral range. Preferably, a fluorescence microscope according to the invention is set up such that the optical excitation of the object to be examined takes place without the use of an excitation spectral filter. More preferably, the fluorescence microscope is set up such that the fluorescence signal generated by the optically excited object to be examined is carried out without the use of a luminescence spectral filter. Although the use of such spectral filters is not

ausgeschlossen ist, ist es dennoch vorteilhaft, dass auf derartige Filter verzichtet werden kann. Dies bietet den Vorteil, dass auf eine kostenintensive Anschaffung derartiger Spektralfilter verzichtet werden kann. Auch entfällt die Notwendigkeit, zeitaufwendige Filterwechsel zwischen Messungen bei unterschiedlichen is excluded, it is still advantageous that can be dispensed with such a filter. This offers the advantage that it is possible to dispense with cost-intensive acquisition of such spectral filters. Also eliminates the need for time-consuming filter changes between measurements at different

Spektralbereichen durchzuführen. Darüber hinaus bietet dies den Vorteil, dass zwischen Messungen bei unterschiedlichen Spektralbereichen Vibrationen und/oder mechanischen Erschütterungen, welche mit einem mechanischen Wechsel der Spektralfilter einher gehen und negative Auswirkungen auf die mikroskopische Perform spectral ranges. In addition, this offers the advantage that between measurements at different spectral ranges vibrations and / or mechanical shocks, which go hand in hand with a mechanical change of the spectral filter and negative effects on the microscopic

Messung haben können, vermieden werden können. Es ist aber auch möglich, Lumineszenzspektralfilter zu verwenden, welche den Überlappbereich der Measurement can be avoided. But it is also possible to use luminescence spectral filters, which the overlap range of

Lumineszenzspektren der einzelnen Fluorophore blockieren, und somit unter Verzicht auf das Signal aus dem spektralen Überlappbereich die Zuordenbarkeit der einzelnen Lummineszenzsignale zu den einzelnen Fluorophoren verbessern. Solche  Blocking the luminescence spectra of the individual fluorophores, thus improving the assignability of the individual Lummineszenzsignale to the individual fluorophores waiving the signal from the spectral overlap region. Such

Lumineszenzspektralfilter müssen während einer Messung nicht ausgetauscht werden, so dass keine dadurch hervorgerufenen Nachteile entstehen. Luminescence spectral filters need not be replaced during a measurement, so that no disadvantages caused thereby arise.

Vorzugsweise ist das Auslesen des zumindest einen Multitap-Pixels mittels der ersten Speicherzelle mit dem Emittieren des ersten Emissionslichts synchronisiert ist und das Auslesen des zumindest einen Multitap-Pixels mittels der zweiten Speicherzelle mit dem Emittieren des zweiten Emissionslichts synchronisiert. Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen kann das zumindest eine Multitap-Pixel auch mehr als zwei Speicherzellen aufweisen und die Lichtquelle mehr als zwei verschiedene Arten von Emissionslicht, d.h. Emissionslicht in mehr als zwei verschiedenen Preferably, the readout of the at least one multitap pixel by means of the first memory cell is synchronized with the emission of the first emission light and the reading of the at least one multitap pixel by means of the second memory cell is synchronized with the emission of the second emission light. According to further preferred embodiments, the at least one multitap pixel may also be more as two memory cells and the light source more than two different types of emission light, ie emission light in more than two different

Spektralbereichen emittieren. Besonders bevorzugt erfolgt das Auslesen des Multitap- Pixels durch eine bestimmte Speicherzelle synchron mit der Emission von bestimmtem Emissionslicht durch die Lichtquelle. Dies hat den Vorteil, dass in sehr kurzem zeitlichen Abstand Messungen bei verschiedenen Anregungsspektralbereichen durchgeführt werden können und ein selektives Detektieren der dabei entstehenden Lumineszenz ermöglicht wird. Vorzugsweise werden die Schritte c) und d) einander abwechselnd wiederholt, vorzugsweise mit einer Wiederholfrequenz, die in einem Bereich von 100 Hz bis 100 MHz , bevorzugt in einem Bereich von 1 kHz bis 10 MHz, am meisten bevorzugt in einem Bereich von 10 kHz bis 1 MHz liegt. Besonders bevorzugt werden für eine vollständige Detektion die Schritte c) und d) jeweils zumindest zweimal durchlaufen. Dies hat den Vorteil, dass über einen längeren Zeitraum gemessen werden kann, d.h. dass optional auch lichtschwache Emit spectral regions. The readout of the multitap pixel by a specific memory cell particularly preferably takes place synchronously with the emission of determined emission light by the light source. This has the advantage that measurements can be carried out at different excitation spectral ranges in a very short time interval and a selective detection of the resulting luminescence is made possible. Preferably, steps c) and d) are repeated alternately, preferably at a repetition frequency ranging from 100 Hz to 100 MHz, preferably in a range from 1 kHz to 10 MHz, most preferably in a range from 10 kHz to 1 MHz is. For complete detection, the steps c) and d) are particularly preferably run through at least twice. This has the advantage that it can be measured over a longer period, i. that optional also faint

Lumineszenzen detektiert werden können und insbesondere kurzlebige Luminescences can be detected and, in particular, short-lived

Lumineszenzen zeitabhängig detektiert werden können. Ferner können durch eine alternierende bzw. abwechselnde Anregung und Detektion bei verschiedenen Luminescences can be detected time-dependent. Furthermore, by an alternating or alternating excitation and detection at different

Spektralbereichen ein quasi gleichzeitige aber separate Messungen erzielt werden, da die Zeitunterschiede zwischen den Messungen bei den unterschiedlichen  Spectral ranges a quasi simultaneous but separate measurements are achieved, since the time differences between the measurements at the different

Emissionslichtern in sehr kurzem Zeitabstand erfolgen. Dies bietet den Vorteil, dass der Einfluss von eventuell auftretenden zeitlichen Veränderungen des zu Emission lights in a very short time interval. This offers the advantage that the influence of possibly occurring temporal changes of the

untersuchenden Objektes auf die Messung so gering wie möglich gehalten werden können examining object can be kept as low as possible on the measurement

Weitere Vorteile und Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus der Further advantages and embodiments of the invention will become apparent from the

Beschreibung und den beiliegenden Zeichnungen. Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen. Description and the accompanying drawings. It is understood that the features mentioned above and those yet to be explained below can be used not only in the particular combination given, but also in other combinations or in isolation, without departing from the scope of the present invention.

Die Erfindung ist anhand eines Ausführungsbeispiels in den Zeichnungen schematisch dargestellt und wird im Folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnung beschrieben. The invention is illustrated schematically with reference to an embodiment in the drawings and will be described below with reference to the drawing.

Figurenbeschreibung figure description

Figur 1 zeigt in einer schematischen Darstellung ein Fluoreszenzmikroskop gemäß einer bevorzugten Ausführungsform. FIG. 1 shows a schematic illustration of a fluorescence microscope according to a preferred embodiment.

Figur 2 zeigt eine beispielhafte zeitliche Abfolge von Vorgängen eines FIG. 2 shows an exemplary chronological sequence of events of a

erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß einer bevorzugten inventive method according to a preferred

Ausführungsform. Embodiment.

Figur 1 zeigt in einer schematischen Darstellung ein Fluoreszenzmikroskop 100 gemäß einer bevorzugten Ausführungsform. Das Fluoreszenzmikroskop 100 ist dazu eingerichtet, die Lumineszenz bzw. Fluoreszenz eines zu untersuchenden Objektes 102, insbesondere zeitabhängig bzw. zeitaufgelöst zu detektieren. Dazu weist das Fluoreszenzmikroskop 100 eine Lichtquelle 104 auf, mittels welcher Emissionslicht, welches insbesondere als Anregungslicht und/oder als Beleuchtungslicht zum optischen Anregen bzw. Beleuchten des zu untersuchenden Objektes dienen kann, in zumindest einem ersten und einem zweiten Spektralbereich emittiert werden kann. Insbesondere wird das Emissionslicht derart emittiert, dass sich das Emissionslicht zumindest teilweise entlang eines Beleuchtungsstrahlengangs 106 ausbreitet. Optional kann dabei ein Anregungsspektralfilter 108 im Beleuchtungsstrahlengang 106 angeordnet sein, um gegebenenfalls eine spektrale Filterung des Emissionslichts in dem ersten und/oder dem zweiten Spektralbereich vorzunehmen. Dem FIG. 1 shows a schematic representation of a fluorescence microscope 100 according to a preferred embodiment. The fluorescence microscope 100 is set up to detect the luminescence or fluorescence of an object 102 to be examined, in particular in a time-dependent or time-resolved manner. For this purpose, the fluorescence microscope 100 has a light source 104, by means of which emission light, which can serve in particular as excitation light and / or as illumination light for optically exciting or illuminating the object to be examined, can be emitted in at least a first and a second spectral range. In particular, the emission light is emitted in such a way that the emission light propagates at least partially along an illumination beam path 106. Optionally, an excitation spectral filter 108 may be arranged in the illumination beam path 106 in order to optionally perform a spectral filtering of the emission light in the first and / or the second spectral range. the

Beleuchtungsstrahlengang 106 folgend wird das Emissionslicht an einem Strahlteiler 1 10 zumindest teilweise in Richtung eines Objektivs 1 12 reflektiert. Vorzugsweise ist der Strahlteiler 1 10 als ein Multiband-Strahlteiler ausgebildet, so dass vorzugsweise das Emissionslicht sowohl im ersten Spektralbereich als auch im zweiten Following illumination beam path 106, the emission light is at a beam splitter 1 10 at least partially reflected in the direction of an objective 1 12. Preferably, the beam splitter 1 10 is formed as a multi-band beam splitter, so that preferably the emission light in both the first spectral range and in the second

Spektralbereich mit einer möglichst hohen Reflektivitätsrate reflektiert wird. Sofern das Emissionslicht in mehr als zwei unterschiedlichen Spektralbereichen emittiert wird, kann der Strahlteiler 1 10 dazu eingerichtet sein, auch die weiteren Spektralbereiche mit möglichst hoher Reflektivität zu reflektieren. Insbesondere kann der Strahlteiler 1 10 dazu eingerichtet sein, Licht in anderen Spektralbereichen als das Emissionslicht nicht zu reflektieren, sondern mit einer möglichst großen Transmittivität zu transmittieren. Beispielsweise kann der Strahlteiler 1 10 als ein dichroitischer Multiband-Strahlteiler ausgestaltet sein. Spectral region is reflected with the highest possible rate of reflectivity. If the emission light is emitted in more than two different spectral ranges, the beam splitter 110 can be set up to also reflect the further spectral ranges with the highest possible reflectivity. In particular, the beam splitter 110 may be configured not to reflect light in spectral regions other than the emission light but to transmit it with the greatest possible transmissivity. For example, the beam splitter 110 may be configured as a dichroic multiband beam splitter.

Das von dem Strahlteiler 1 10 reflektierte Emissionslicht wird durch das Objektiv 1 12 auf einen zu untersuchenden Bereich des Objektes 102 zumindest teilweise fokussiert, so dass in dem zu untersuchenden Bereich gegebenenfalls vorhandene Fluoreszenz und/oder Phosphoreszenz angeregt werden kann. Das Objektiv 1 12 ist dabei vorzugsweise als Mikroskopobjektiv ausgestaltet und wird ferner für das Sammeln von Licht bzw. Lumineszenz des Objektes 102 zur mikroskopischen Auswertung verwendet. Das von dem Objektiv 1 12 aufgesammelte Lumineszenzlicht bzw. The emission light reflected by the beam splitter 110 is at least partially focused by the objective 1 12 onto a region of the object 102 to be examined, so that possibly present fluorescence and / or phosphorescence can be excited in the region to be examined. The lens 1 12 is preferably designed as a microscope objective and is also used for the collection of light or luminescence of the object 102 for microscopic evaluation. The collected by the lens 1 12 luminescent light or

Fluoreszenzlicht, welches gegebenenfalls nach Anregung des Objektes 102 mit dem Emissionslicht von dem Objekt 102 emittiert wird, wird durch das Objektiv 1 10 aufgesammelt und breitet sich in Richtung des Strahlteilers 1 10 aus, wobei der Strahlteiler 1 10 dazu eingerichtet ist, das von dem Objektiv aufgesammelte Fluorescent light, which is optionally emitted after excitation of the object 102 with the emission light from the object 102, is collected by the lens 1 10 and propagates in the direction of the beam splitter 1 10, wherein the beam splitter 1 10 is adapted to that of the lens be collected

Lumineszenzlicht bzw. Fluoreszenzlicht zu transmittieren. Nach dem Strahlteiler 1 10 kann optional ein Emissionsfilter 1 14 angeordnet sein, um gegebenenfalls das durch das Objektiv 1 12 aufgesammelte Lumineszenzlicht spektral zu filtern. Beispielsweise kann der Emissionsspektralfilter 1 14 als ein Multiband-Spektralfilter ausgebildet sein. Ferner wird gemäß der gezeigten Ausführungsform das Lumineszenzlicht mittels eines optischen Elements 1 16 auf ein Sensorelement 1 18 fokussiert oder entlang des Strahlengangs 1 16a darauf optisch abgebildet. Das optische Element 1 16 kann dazu beispielsweise als eine konvexe optische Linse bzw. eine Sammellinse ausgebildet sein, insbesondere als eine Tubuslinse oder allgemeiner eine Tubusoptik. To transmit luminescent light or fluorescent light. After the beam splitter 110, an emission filter 14 may optionally be arranged in order to spectrally filter the luminescent light collected by the lens 12, if necessary. For example, the emission spectral filter 1 14 may be formed as a multi-band spectral filter. Further, according to the embodiment shown, the luminescent light is focused by means of an optical element 1 16 on a sensor element 1 18 or optically imaged along the beam path 1 16a. The optical element 1 16 can do this For example, be designed as a convex optical lens or a converging lens, in particular as a tube lens or more generally a tube optic.

Das Sensorelement 1 18 kann beispielsweise als eine Kamera ausgebildet sein, welche vorzugsweise eine Mehrzahl von in einer Matrix angeordneten Multitap-Pixeln aufweist. Gemäß der gezeigten Ausführungsform werden das Sensorelement 1 18 und die Lichtquelle 104 mittels einer Kontrolleinheit 120 gesteuert. Dabei kann die The sensor element 118, for example, may be formed as a camera, which preferably has a plurality of multitap pixels arranged in a matrix. According to the embodiment shown, the sensor element 118 and the light source 104 are controlled by means of a control unit 120. It can the

Kontrolleinheit insbesondere die von dem Sensorelement 1 18 empfangenen bzw. detektierten bzw. von den davon umfassten Speicherzellen ausgelesenen Signale empfangen und gegebenenfalls weiterverarbeiten und/oder speichern. Insbesondere kann durch die Kontrolleinheit 120 ein Synchronisationssignal bereitgestellt werden, um die Lichtquelle mit dem Sensorelement zeitlich zu synchronisieren. Alternativ kann die Kontrolleinheit 120 ein von dem Sensorelement 1 18 bereitgestelltes Receive control unit in particular the received or detected by the sensor element 1 18 18 or read from the memory cells encompassed signals and optionally further processed and / or store. In particular, a synchronization signal can be provided by the control unit 120 in order to temporally synchronize the light source with the sensor element. Alternatively, the control unit 120 may provide one provided by the sensor element 118

Synchronisationssignal empfangen und direkt oder nach einer optionalen Bearbeitung an die Lichtquelle 104 weiterleiten. Optional kann das Sensorelement 1 18 zum Receive synchronization signal and forward directly or after an optional processing to the light source 104. Optionally, the sensor element 1 18 to

Bereitstellen des Synchronisationssignals einen Synchronisationssignalgeber 121 aufweisen. Providing the synchronization signal having a synchronization signal generator 121.

Figur 2 zeigt eine beispielhafte, schematische zeitliche Abfolge von Vorgängen eines erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß einer bevorzugten Ausführungsform, welche gegen die Zeit t aufgetragen sind. Dabei zeigen der oberste Graph einen Verlauf der Pixelschaltfrequenz 201 mit einer Periodenlänge 202, eine Emission des ersten Emissionslichts im ersten Spektralbereich 203, eine Emission des zweiten FIG. 2 shows an exemplary, schematic time sequence of operations of a method according to the invention according to a preferred embodiment, which are plotted against the time t. The uppermost graph shows a progression of the pixel switching frequency 201 with a period length 202, an emission of the first emission light in the first spectral range 203, an emission of the second

Emissionslichts im zweiten Spektralbereich 204, ein Auslesen der ersten Speicherzelle 205, ein Auslesen der zweiten Speicherzelle 206, sowie einen Zeitraum einer Emission light in the second spectral range 204, a readout of the first memory cell 205, a readout of the second memory cell 206, and a period of a

Bildaufnahme 207. Vorzugsweise entspricht die Pixelschaltfrequenz in Frequenz und Phase dem Synchronisationssignal. Die aufgetragenen Amplituden beanspruchen dabei keine quantitative Vergleichbarkeit, sondern die Graphen sollen lediglich eine relative, zeitliche Abfolge veranschaulichen. Beispielsweise bedeutet dabei in den Graphen 203, 204, 205 und 206 ein großer Amplitudenwert, dass das entsprechende Emissionslicht emittiert wird bzw. die entsprechende Speicherzelle ausgelesen wird, während der kleine Amplitudenwert bedeutet, dass das entsprechende Emissionslicht nicht emittiert wird bzw. die entsprechende Speicherzelle nicht ausgelesen wird. Image pickup 207. Preferably, the pixel switching frequency in frequency and phase corresponds to the synchronization signal. The applied amplitudes claim no quantitative comparability, but the graphs are intended to illustrate only a relative, temporal sequence. For example, in the graphs 203, 204, 205 and 206, a large amplitude value means that the corresponding emission light is emitted or the corresponding memory cell is read out, while the small amplitude value means that the corresponding emission light is not emitted or the corresponding memory cell is not read out.

Analog gilt für den Graphen 207, dass bei einem großen Amplitudenwert eine Similarly, for the graph 207, with a large amplitude value, a

Bildaufnahme erfolgt und bei einem kleinen Amplitudenwert keine Bildaufnahme erfolgt. Die gestrichelten Linien indizieren dabei das erste Zeitintervall 208 und das zweite Zeitintervall 209 in einer Periode 202. Image acquisition takes place and no image acquisition takes place at a small amplitude value. The dashed lines indicate the first time interval 208 and the second time interval 209 in a period 202.

Wie bei herkömmlichen Verfahren zur Fluoreszenzlebensdauermikroskopie wird gemäß der gezeigten Ausführungsform der Erfindung die Pixelschaltfrequenz 201 derart festgelegt, dass eine komplette Belichtung und Detektion des Gesamtbildes, d.h. der gesamte Zeitraum einer Bildaufnahme 207 bzw. der Aufnahme eines Bildes, eine Mehrzahl von vollständigen Zyklen bzw. Perioden 202 der Pixelschaltfrequenz 201 umfasst bzw. überdauert, vorzugsweise mehr als zwei Zyklen. Jedoch wird As with conventional fluorescence lifetime microscopy techniques, in accordance with the illustrated embodiment of the invention, the pixel switching frequency 201 is set such that complete exposure and detection of the overall image, i. the entire period of an image acquisition 207 or the acquisition of an image, a plurality of complete cycles or periods 202 of the pixel switching frequency 201, or longer, preferably, more than two cycles. However, it will

vorzugsweise die Pixelschaltfrequenz 201 so niedrig bzw. die Periode 202 so groß gewählt, dass ein Einfluss von Veränderungen aufgrund eines Abklingens der Preferably, the pixel switching frequency 201 so low or the period 202 chosen so large that an influence of changes due to a decay of the

Fluoreszenzlebensdauer von Fluorophoren in dem untersuchten Objekt keinen wesentlichen Einfluss auf die Abbildungseigenschaften bzw. die Messung hat und somit vernachlässigt werden kann. Mit anderen Worten wird die Pixelschaltfrequenz 201 derart gewählt, dass sich ein geeigneter Kompromiss aus einer Gesamtmessdauer ergibt, welche lang genug ist um zeitliche Veränderungen in der Fluoreszenz bzw. Lumineszenz vernachlässigen zu können, aber um dennoch eine Mehrzahl von Messzyklen durchzuführen, um eine ausreichende zeitliche Integration zur Erlangung von Signalintensität bei Quasi-Gleichzeitigkeit ("Echtzeit") sicherzustellen. Fluorescence lifetime of fluorophores in the examined object has no significant influence on the imaging properties or the measurement and thus can be neglected. In other words, the pixel switching frequency 201 is chosen such that a suitable compromise results from a total measurement duration which is long enough to neglect temporal changes in the fluorescence or luminescence, but nevertheless to perform a plurality of measurement cycles in order to obtain a sufficient time To ensure integration to obtain signal intensity with quasi-simultaneity ("real time").

Beispielsweise kann die Pixelschaltfrequenz im Bereich zwischen 10 kHz und 1 MHz liegen. Weiterhin wird gemäß der gezeigten Ausführungsform die Emission des ersten und zweiten Emissionslichts 203, 204 der modulierbaren Lichtquelle 104 For example, the pixel switching frequency may be in the range between 10 kHz and 1 MHz. Furthermore, according to the embodiment shown, the emission of the first and second emission light 203, 204 of the modulatable light source 104

phasensynchron zur Detektion des Lichts durch die unterschiedlichen Speicherzellen der Multitap-Pixel, bzw. zum Auslesen der ersten Speicherzelle 205 bzw. zum phase-synchronous to the detection of the light by the different memory cells of the multi-tap pixels, or to read out the first memory cell 205 or to

Auslesen der zweiten Speicherzelle 206 eingestellt. Als entsprechend schnell modulierbare Lichtquellen 104 bieten sich beispielsweise Halbleiter-Lichtquellen, wie etwa Diodenlaser oder Leuchtdioden (LEDs) an, so dass das Verfahren für vorzugsweise unter anderem für Readout of the second memory cell 206 is set. For example, semiconductor light sources, such as diode lasers or light-emitting diodes (LEDs), are suitable as correspondingly rapidly modulated light sources 104, so that the method is preferred for inter alia

Weitfeldfluoreszenzmikroskopiemethoden mit kohärenter und/oder inkohärenter Beleuchtung unterschiedlichen geometrischen Flusses bereitstellen kann. Dies bietet zudem die Möglichkeit, die Erfindung gegebenenfalls auch bei der  Wide field fluorescence microscopy methods with coherent and / or incoherent illumination can provide different geometric flux. This also offers the possibility of the invention, possibly also in the

Epifluoreszenzmikroskopie, bei der TIRF-Mikroskopie, bei der Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung, bei der Lichtblattmikroskopie, bei der multifokalen Epifluorescence microscopy, in TIRF microscopy, in structured illumination microscopy, in light-sheet microscopy, in multifocal microscopy

Konfokalmikroskopie (z. B. per Spinning Disk) und bei der multifokalen Confocal microscopy (eg by spinning disk) and in the multifocal

Multiphotonenmikroskopie einzusetzen. Use multiphoton microscopy.

Die Modulation der Lichtquelle 203, 204 kann beispielsweise auch getrennt von der Pixelschaltfrequenz 201 erfolgen. Beispielsweise kann eine Modulation einer zeitlich kontinuierlich emittierenden Lichtquelle durch elektrooptische und/oder akustooptische und/oder elektromechanische (z. B. Zerhacker) oder andere Methoden erfolgen. Das Auslesen der Speicherzellen 205, 206 erfolgt vorzugsweise derart, dass das Signal über mehr als zwei komplette Zyklen bzw. Perioden 202 der Pixelschaltfrequenz 201 integriert wird, so dass ein möglichst kurzer zeitlicher Abstand zwischen den The modulation of the light source 203, 204 may, for example, also take place separately from the pixel switching frequency 201. For example, a modulation of a light source which emits light continuously over time can be effected by electro-optical and / or acousto-optical and / or electromechanical (eg chopper) or other methods. The readout of the memory cells 205, 206 is preferably carried out such that the signal is integrated over more than two complete cycles or periods 202 of the pixel switching frequency 201, so that the shortest possible time interval between the

Messungen bei unterschiedlichen optischen Anregungen vorliegt und dadurch eine möglichst gleichzeitige Messung bei unterschiedlichen Emissionslichtarten bzw. Measurements are available at different optical excitations and thereby a possible simultaneous measurement at different emission light types or

Anregungswellenlängen erfolgen kann. Dies kann mittels einer herkömmlichen, einfachen wechselseitigen Synchronisation der Beleuchtung zur Belichtungszeit der Kamera, d.h. bei einer kompletten Bildaufnahme 207 mit dem ersten Emissionslicht und erst anschließend einer kompletten Bildaufnahme 207 mit dem zweiten Excitation wavelengths can be done. This can be done by means of a conventional, simple mutual synchronization of the illumination to the exposure time of the camera, i. in a complete image pickup 207 with the first emission light and only then a complete image pickup 207 with the second

Emissionslicht, nicht erreicht werden. Je höher die Anzahl der Zyklen der Emission light, can not be achieved. The higher the number of cycles the

Pixelschaltfrequenz 201 innerhalb einer Gesamtbelichtungszeit der Bildaufnahme 207 gewählt wird, umso geringer werden die Einflüsse der zeitabhängigen Veränderungen des zu untersuchenden Objekts und umso besser ist die Vergleichbarkeit der Messungen mit Emissionslicht bzw. Anregungslicht in unterschiedlichen spektralen Bereichen. Bezugszeichen Pixel switching frequency 201 is selected within a total exposure time of the image pickup 207, the lower the effects of the time-dependent changes of the object to be examined and the better the comparability of measurements with emission light or excitation light in different spectral ranges. reference numeral

100 Fluoreszenzmikroskop 100 fluorescence microscope

102 Objekt  102 object

104 Lichtquelle  104 light source

106 Beleuchtungsstrahlengangs  106 illumination beam path

108 Anregungsspektralfilter  108 excitation spectral filter

1 10 Strahlteiler  1 10 beam splitter

1 12 Objektiv  1 12 lens

1 14 Emissionsspektralfilter  1 14 emission spectral filter

1 16 optisches Element, Tubusoptik 1 16 optical element, tube optics

1 16a Strahlengang 1 16a beam path

1 18 Sensorelement  1 18 sensor element

120 Kontrolleinheit  120 control unit

121 Synchronisationssignalgeber 121 synchronization signal generator

201 Pixelschaltfrequenz 201 pixel switching frequency

202 Periode der Pixelschaltfrequenz 202 period of pixel switching frequency

203 Emission des ersten Emissionslichts203 Emission of the first emission light

204 Emission des zweiten Emissionslichts204 Emission of the second emission light

205 Auslesen der ersten Speicherzelle205 Readout of the first memory cell

206 Auslesen der zweiten Speicherzelle206 readout of the second memory cell

207 Bildaufnahme 207 image capture

Claims

Patentansprüche claims 1 . Lumineszenzdetektoranordnung zum Detektieren eines Lumineszenzsignals, aufweisend: 1 . A luminescence detector arrangement for detecting a luminescence signal, comprising: ein Sensorelement (1 18) mit zumindest einem Multitap-Pixel mit zumindest einer ersten Speicherzelle und einer zweiten Speicherzelle, wobei das Sensorelement (1 18) dazu eingerichtet ist, das Multitap-Pixel in einem ersten Zeitintervall (208) mittels der ersten Speicherzelle auszulesen und in einem vom ersten Zeitintervall (208) verschiedenen zweiten Zeitintervall (209) mittels der zweiten Speicherzelle auszulesen;  a sensor element (1 18) with at least one multitap pixel having at least a first memory cell and a second memory cell, wherein the sensor element (1 18) is adapted to read the multitap pixel in a first time interval (208) by means of the first memory cell and in a second time interval (209) different from the first time interval (208) by means of the second memory cell; eine Lichtquelle (104), welche dazu eingerichtet, ein erstes Emissionslicht in zumindest einem ersten Spektralbereich zu emittieren und unabhängig davon ein zweites Emissionslicht in einem zweiten Spektralbereich zu emittieren, wobei der erste Spektralbereich und der zweite Spektralbereich zumindest teilweise voneinander verschieden sind;  a light source (104) adapted to emit a first emission light in at least a first spectral range and independently emitting a second emission light in a second spectral range, the first spectral range and the second spectral range being at least partially different from each other; wobei die Lichtquelle (104) mit dem Sensorelement (1 18) synchronisiert ist, um in dem ersten Zeitintervall (208) das erste Emissionslicht zu emittieren und in dem zweiten Zeitintervall (209) das zweite Emissionslicht zu emittieren; und wobei die Lumineszenzdetektoranordnung ferner dazu eingerichtet ist, ein durch das erste Emissionslicht und durch das zweite Emissionslicht hervorgerufenes Lumineszenzsignal mit dem Sensorelement (1 18) zu detektieren.  wherein the light source (104) is synchronized with the sensor element (1 18) to emit the first emission light in the first time interval (208) and to emit the second emission light in the second time interval (209); and wherein the luminescence detector arrangement is further configured to detect a luminescence signal caused by the first emission light and by the second emission light with the sensor element (1 18). 2. Lumineszenzdetektoranordnung nach Anspruch 1 , wobei die 2. Lumineszenzdetektoranordnung according to claim 1, wherein the Lumineszenzdetektoranordnung dazu eingerichtet ist, das erste Zeitintervall und das zweite Zeitintervall jeweils zumindest zweimal, insbesondere abwechselnd, zu durchlaufen.  Lumineszenzdetektoranordnung is adapted to the first time interval and the second time interval in each case at least twice, in particular alternately to go through. 3. Lumineszenzdetektoranordnung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das 3. Lumineszenzdetektoranordnung according to claim 1 or 2, wherein the Sensorelement (1 18) eine Mehrzahl von Multitap-Pixeln aufweist, welche vorzugsweise in einer Matrix angeordnet sind. Sensor element (1 18) comprises a plurality of multi-tap pixels, which are preferably arranged in a matrix. 4. Lumineszenzdetektoranordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Lumineszenzdetektoranordnung dazu eingerichtet ist, mittels eines extern bereitgestellten Synchronisationssignals das Sensorelement (1 18) und die Lichtquelle (104) zu synchronisieren. 4. Luminescence detector arrangement according to one of the preceding claims, wherein the luminescence detector arrangement is adapted to synchronize the sensor element (1 18) and the light source (104) by means of an externally provided synchronization signal. 5. Lumineszenzdetektoranordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, ferner 5. Luminescence detector arrangement according to one of claims 1 to 3, further umfassend einen Synchronisationssignalgeber (121 ), welcher dazu eingerichtet ist, ein Synchronisationssignal bereitzustellen, wobei das Synchronisationssignal dazu eingerichtet ist, das Sensorelement (1 18) und die Lichtquelle (104) mittels des Synchronisationssignals zu synchronisieren.  comprising a synchronization signal generator (121) which is adapted to provide a synchronization signal, wherein the synchronization signal is adapted to synchronize the sensor element (1 18) and the light source (104) by means of the synchronization signal. 6. Lumineszenzdetektoranordnung nach Anspruch 5, wobei das Sensorelement (1 18) den Synchronisationssignalgeber (121 ) aufweist. 6. Lumineszenzdetektoranordnung according to claim 5, wherein the sensor element (1 18) comprises the synchronization signal generator (121). 7. Lumineszenzdetektoranordnung nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei die Lichtquelle (104) modulierbar ist und dazu eingerichtet ist, in Reaktion auf das Synchronisationssignal das erste Emissionslicht und/oder das zweite 7. Luminescence detector arrangement according to one of claims 4 to 6, wherein the light source (104) is modulated and is adapted to, in response to the synchronization signal, the first emission light and / or the second Emissionslicht zu emittieren.  Emit emission light. 8. Lumineszenzdetektoranordnung nach einem der Ansprüche 4 bis 7, wobei das Synchronisationssignal ein periodisches Signal aufweist, welches vorzugsweise eine Wiederholfrequenz aufweist, die in einem Bereich von 100 Hz bis 100 MHz , bevorzugt in einem Bereich von 1 kHz bis 10 MHz, am meisten bevorzugt in einem Bereich von 10 kHz bis 1 MHz liegt. The luminescence detector device according to any one of claims 4 to 7, wherein the synchronization signal comprises a periodic signal which preferably has a repetition frequency which is most preferable in a range of 100 Hz to 100 MHz, preferably in a range of 1 kHz to 10 MHz in a range of 10 kHz to 1 MHz. 9. Lumineszenzdetektoranordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Lichtquelle (104) zumindest eine Halbleiter-Lichtquelle aufweist. 9. Luminescence detector arrangement according to one of the preceding claims, wherein the light source (104) comprises at least one semiconductor light source. 10. Fluoreszenzmikroskop (100) mit einer Lumineszenzdetektoranordnung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Fluoreszenzmikroskop (100) dazu eingerichtet ist, ein zu untersuchendes Objekt (102) mittels der Lichtquelle (104) zumindest teilweise optisch anzuregen und ein von dem optisch angeregten zu untersuchenden Objekt erzeugtes Fluoreszenzsignal zumindest teilweise als Lumineszenzsignal zu detektieren. 10. A fluorescence microscope (100) with a luminescence detector arrangement according to one of the preceding claims, wherein the fluorescence microscope (100) is adapted to at least partially optically excite an object to be examined (102) by means of the light source (104) and to at least partially detect a fluorescence signal generated by the optically excited object to be examined as a luminescence signal. 1 1 . Fluoreszenzmikroskop (100) nach Anspruch 10, wobei das 1 1. Fluorescence microscope (100) according to claim 10, wherein the Fluoreszenzmikroskop (100) derart eingerichtet ist, dass die optische Anregung des zu untersuchenden Objekts (102) ohne Verwendung eines  Fluorescence microscope (100) is arranged such that the optical excitation of the object to be examined (102) without the use of a Anregungsspektralfilters (108) erfolgt und/oder wobei das Fluoreszenzmikroskop (100) derart eingerichtet ist, dass das von dem optisch angeregten zu untersuchenden Objekt (102) erzeugte Fluoreszenzsignal ohne Verwendung eines Emissionsspektralfilters (1 14) detektiert wird.  Excitation spectral filter (108) takes place and / or wherein the fluorescence microscope (100) is arranged such that the fluorescence signal generated by the optically excited object to be examined (102) is detected without the use of an emission spectral filter (1 14). 12. Verfahren zum Detektieren eines Lumineszenzsignals, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen eines Sensorelements (1 18) mit zumindest einem Multitap- Pixel mit zumindest einer ersten Speicherzelle und einer zweiten Speicherzelle; 12. A method for detecting a luminescence signal, comprising the steps of: a) providing a sensor element (1 18) with at least one multitap pixel having at least a first memory cell and a second memory cell; b) Bereitstellen einer Lichtquelle (104);  b) providing a light source (104); c) Emittieren eines ersten Emissionslichts in zumindest einem ersten  c) emitting a first emission light in at least a first one Spektralbereich mittels der Lichtquelle in einem ersten Zeitintervall (208) und Auslesen des zumindest einen Multitap-Pixels mittels der ersten Speicherzelle in dem ersten Zeitintervall (208);  Spectral range by means of the light source in a first time interval (208) and reading out of the at least one multitap pixel by means of the first memory cell in the first time interval (208); d) Emittieren eines zweiten Emissionslichts in zumindest einem zweiten  d) emitting a second emission light in at least a second one Spektralbereich mittels der Lichtquelle in einem zweiten Zeitintervall (209) und Auslesen des zumindest einen Multitap-Pixels mittels der zweiten Speicherzelle in dem zweiten Zeitintervall (209);  Spectral range by means of the light source in a second time interval (209) and reading out of the at least one multitap pixel by means of the second memory cell in the second time interval (209); wobei das erste Zeitintervall (208) und das zweite Zeitintervall (209) voneinander verschieden sind und wobei der erste Spektralbereich und der zweite  wherein the first time interval (208) and the second time interval (209) are different from one another and wherein the first spectral range and the second Spektralbereich zumindest teilweise voneinander verschieden sind. Spectral range are at least partially different from each other. 13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Auslesen des zumindest einen Multitap- Pixels mittels der ersten Speicherzelle mit dem Emittieren des ersten 13. The method of claim 12, wherein the reading of the at least one multitap pixel by means of the first memory cell with the emitting of the first Emissionslichts synchronisiert ist und wobei das Auslesen des zumindest einen Multitap-Pixels mittels der zweiten Speicherzelle mit dem Emittieren des zweiten Emissionslichts synchronisiert ist.  Emission light is synchronized and wherein the reading of the at least one multitap pixel is synchronized by means of the second memory cell with the emission of the second emission light. 14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei die Schritte c) und d) einander 14. The method of claim 12 or 13, wherein the steps c) and d) each other abwechselnd wiederholt werden und vorzugsweise mit einer Wiederholfrequenz in einem Bereich von 100 Hz bis 100 MHz , bevorzugt in einem Bereich von 1 kHz bis 10 MHz, am meisten bevorzugt in einem Bereich von 10 kHz bis 1 MHz wiederholt werden.  are alternately repeated and preferably repeated at a repetition frequency in a range of 100 Hz to 100 MHz, preferably in a range of 1 kHz to 10 MHz, most preferably in a range of 10 kHz to 1 MHz. 15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei für eine vollständige Detektion die Schritte c) und d) jeweils zumindest zweimal durchlaufen werden. 15. The method of claim 14, wherein for a complete detection, the steps c) and d) are each passed at least twice.
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