[go: up one dir, main page]

WO2018198598A1 - ゲノム解析用液滴の単離方法、およびゲノム解析方法 - Google Patents

ゲノム解析用液滴の単離方法、およびゲノム解析方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2018198598A1
WO2018198598A1 PCT/JP2018/010970 JP2018010970W WO2018198598A1 WO 2018198598 A1 WO2018198598 A1 WO 2018198598A1 JP 2018010970 W JP2018010970 W JP 2018010970W WO 2018198598 A1 WO2018198598 A1 WO 2018198598A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
genome
droplet
amplification
analysis
target
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2018/010970
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
伸也 砂永
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Enplas Corp
Original Assignee
Enplas Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Enplas Corp filed Critical Enplas Corp
Publication of WO2018198598A1 publication Critical patent/WO2018198598A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology

Definitions

  • the present invention relates to a method for isolating a droplet for genome analysis and a method for genome analysis.
  • sorting In the case where target cells are isolated from samples containing various cells and the target genome is analyzed, cell sorting has become common in recent years as a method for isolating target cells. In particular, in the method of forming droplets (droplets) containing cells by emulsification, sorting (sorting) of droplets containing target cells is performed using nucleic acid amplification.
  • a sample containing cells is emulsified to form droplets in the emulsion.
  • a short chain sequence derived from the target cell is amplified by a nucleic acid amplification method such as PCR, and the presence or absence of the amplification is detected using a probe or the like.
  • the droplet by which amplification was confirmed is fractionated as a droplet containing a target cell, and this is made into samples, such as a genome analysis (nonpatent literature 1).
  • the target genome of the target cell is further subjected to nucleic acid amplification, and the obtained target genome amplification product is subjected to next-generation sequencing (NGS) and assembled.
  • NGS next-generation sequencing
  • the target genome of the target cell can be analyzed (Non-patent Document 2).
  • Nucleic acid amplification in the cell sorting is aimed at confirming the presence or absence of cells in the droplets. Therefore, as described above, for example, a short region in the genome (for example, about 80 to 300 bp) is set and amplification is performed. Done.
  • the droplets collected by amplification detection contain a large amount of short-chain amplification products by cell sorting, and the amount is compared to the cell-derived genome contained in the droplets. Very many. For this reason, even if nucleic acid amplification of the target genome is further performed on the collected droplets for genome analysis, in addition to target amplification products derived from the target genome, samples to be analyzed are not subject to analysis. There is a problem that these short-chain amplification products are sequenced while a large amount of short-chain amplification products are not mixed, and the analysis result of the target genome of the target cell is affected.
  • an object of the present invention is to provide a method for isolating a droplet that can be subjected to genome analysis without affecting subsequent genome analysis, and a method for genome analysis.
  • the present invention is a method for isolating a droplet for genome analysis, Including an emulsion formation step, a nucleic acid amplification step, a detection step, and a fractionation step
  • the emulsion forming step includes A step of contacting a sample containing cells with an emulsion-forming solvent to form a plurality of droplets containing cells in the sample in the emulsion-forming solvent;
  • the nucleic acid amplification step includes The step of amplifying the target genome contained in the target cell for the droplet,
  • the detection step includes Detecting the presence or absence of amplification of the target genome in the droplet,
  • the preparative step is In this step, the droplet in which the amplification of the target genome is detected is sorted as a genome analysis droplet containing an amplification product derived from the target genome.
  • the present invention is a genome analysis method derived from a target cell, Including a step of isolating a droplet for genome analysis containing an amplification product derived from a target genome, and an analysis step,
  • the isolation step includes A step of isolating a droplet for genome analysis containing an amplification product derived from a target genome of a target cell from a sample containing cells by the isolation method of the present invention,
  • the analysis step includes The amplification product contained in the isolated droplet for genome analysis is a step of performing genome analysis.
  • the present invention in the isolation of a droplet for genome analysis, in order to amplify a target genome to be analyzed later in confirming the presence or absence of cells in the droplet, for example, as described above, Short-chain amplification products that are not subject to analysis are not included. For this reason, if the droplets for genome analysis obtained by the isolation method of the present invention are used, for example, the influence of the short amplification product is avoided, and the genome analysis is performed by sequencing and assembly as it is. It can be carried out.
  • the method for isolating a droplet for genome analysis of the present invention includes, for example, forming a droplet in the presence of the reagent for amplification of the target genome in the emulsion formation step, and including the droplet in the nucleic acid amplification step.
  • the target genome is amplified using the amplification reagent.
  • droplets are formed in the absence of the amplification reagent for the target genome, and in the nucleic acid amplification step, the amplification reagent And the target genome is amplified.
  • the detection reagent for detection of amplification coexists in the amplification reagent, and the amplification reagent amplifies the target genome.
  • the detection reagent includes an intercalator or a probe.
  • the method for isolating a droplet for genome analysis of the present invention further includes, for example, an analysis step, and the analysis step analyzes an amplification product derived from a target genome contained in the analysis droplet.
  • the emulsion-forming solvent contains a water-insoluble solvent, and the plurality of droplets are formed in the water-insoluble solvent.
  • the plurality of droplets are water-soluble droplets containing the sample.
  • a device having a flow path is used, and the emulsion formation process, the amplification process, and the detection process are performed in the flow path.
  • the sorting step is further performed in the channel.
  • the point is to amplify the target genome to be subjected to genome analysis as nucleic acid amplification for sorting the droplets for genome analysis.
  • isolation method and analysis method of the present invention will be described by way of examples.
  • the isolation method and analysis method of the present invention are not limited or restricted by the following embodiments. Moreover, the description of each embodiment can mutually be used.
  • the isolation method of the present invention is a method for isolating droplets for genome analysis, Including an emulsion formation step, a nucleic acid amplification step, a detection step, and a fractionation step,
  • the emulsion forming step includes A step of contacting a sample containing cells with an emulsion-forming solvent to form a plurality of droplets containing cells in the sample in the emulsion-forming solvent;
  • the nucleic acid amplification step includes The step of amplifying the target genome contained in the target cell for the droplet,
  • the detection step includes Detecting the presence or absence of amplification of the target genome in the droplet,
  • the preparative step is In this step, the droplet in which the amplification of the target genome is detected is sorted as a genome analysis droplet containing an amplification product derived from the target genome.
  • the emulsion forming step is a step of bringing a sample containing cells into contact with an emulsion forming solvent to form a plurality of droplets containing cells in the sample in the emulsion forming solvent.
  • the sample can be divided and divided into a plurality of droplets. Then, various cells in the sample are distributed to each of the droplets.
  • the type of the sample is not limited at all, and examples include samples that are considered to contain cells.
  • Examples of the sample include a biological sample, and specific examples include blood, lymph, cerebrospinal fluid, semen, urine, nasal discharge, nasal swab, and the like.
  • the species of the living body is not particularly limited, and examples thereof include humans; non-human mammals such as cows, pigs, sheep, mice, rats, rabbits and horses; birds; and animals such as fish.
  • the emulsion-forming solvent is not particularly limited as long as it can form droplets containing the sample therein.
  • the emulsion-forming solvent is, for example, a water-insoluble solvent, and water-soluble droplets containing the sample can be formed in the water-insoluble solvent.
  • water-insoluble solvent examples include oil, mineral oil, chloroform, and aromatic compounds.
  • the water-insoluble solvent for example, one kind may be used alone, or two or more kinds may be used in combination.
  • a water-soluble solvent may be further present.
  • the water-soluble solvent include water, a buffer solution, and a water-soluble polymer solution.
  • the water-soluble solvent for example, one kind may be used alone, or two or more kinds may be used in combination.
  • a reagent used in an amplification step described later may coexist.
  • the droplet containing the said reagent is formed, in the amplification process mentioned later, the amplification reaction in an amplification process can be performed, without adding a reagent newly, for example.
  • the reagent will be described later.
  • the size of the droplets to be formed is not particularly limited, and the average volume has a lower limit of, for example, 4 pL or more and an upper limit of, for example, 10 nL or less.
  • the number of cells contained in the droplet is not particularly limited.
  • the number of cells contained in one droplet is, for example, 5 or less, 2 or less, and preferably 1 cell.
  • the method for forming droplets in the emulsion forming solvent is not particularly limited, and a plurality of droplets can be formed in the emulsion forming solvent by bringing the emulsion forming solvent into contact with the sample.
  • the sample may be brought into contact with the emulsion-forming solvent, or the emulsion-forming solvent may be brought into contact with the sample.
  • a known droplet manufacturing method can be applied as the droplet forming method.
  • an emulsification device having a microchannel can be used.
  • the device includes, as the microchannel, for example, a sample channel, an emulsion-forming solvent channel, a connecting portion thereof, and a lead-out channel derived from the connecting portion.
  • droplets are formed as follows. First, the emulsion forming solvent is introduced into the connecting portion from the emulsion forming solvent flow path, and then toward the connecting portion into which the emulsion forming solvent is introduced, from the sample flow path, The sample (eg, optionally containing the water-soluble solvent) is introduced.
  • the emulsion-forming solvent and the sample come into contact with each other to be emulsified, and from the connecting portion to the outlet channel, an emulsion (a state in which droplets are dispersed in the emulsion-forming solvent) Derived.
  • the sample and the water-soluble solvent may be introduced into the channel of the device as a mixed liquid mixed in advance as described above, or may be separately introduced into the channel. In the latter case, the sample channel and the reagent channel are provided upstream of the connecting portion, and the sample is introduced from the sample channel toward the connecting portion, and the reagent channel. To the water-soluble solvent and optionally the reagent or the like.
  • the amplification step is a step of amplifying the target genome contained in the target cell with respect to the droplets formed in the emulsion formation step as described above.
  • the target genome to be amplified is not particularly limited and can be appropriately determined according to the purpose of genome analysis.
  • the present invention apart from the purpose of genome analysis, the present invention is not intended to amplify short-chain sequences but only to detect the presence or absence of cells in the droplets. The point is to amplify the genome. Therefore, the genome to be amplified in the amplification step is a target genome to be analyzed later, and the region to be amplified in the target genome is a region necessary for so-called genome analysis.
  • genome analysis is performed by amplifying a plurality of regions where a part of a target genome overlaps, decoding the sequence, assembling the decoded sequence results, and analyzing the entire target genome.
  • the amplification of the target genome in the amplification step is preferably amplification of a plurality of regions necessary for genome analysis.
  • the length of each region to be amplified in the target genome is, for example, 400 bp to 60 kbp, and the total length to be analyzed is, for example, 246 bp to 1.5 ⁇ 107 bp.
  • Examples of genome analysis in the present invention include whole genome analysis. In this case, for example, a plurality of regions including a plurality of gene loci may be amplified, or the full length or partial region of each gene may be amplified for all genes.
  • the nucleic acid amplification method is not particularly limited, and a known method such as a PCR method can be employed.
  • the amplification reagent is not particularly limited, and examples thereof include a polymerase, a primer, and dNTP.
  • the amplification reagent used in the amplification step may be previously contained in the droplet, for example, or may be added to the droplet during the amplification step, and the operation is easy. preferable.
  • a droplet is formed in the presence of the amplification reagent, and in the nucleic acid amplification step, the amplification reagent contained in the droplet is used to form the target genome.
  • Amplification may be performed.
  • droplets are formed in the absence of the amplification reagent, and in the nucleic acid amplification step, the amplification reagent is added to amplify the target genome. Just do it.
  • the amplification step is preferably performed in the microchannel of the device as well.
  • the device has, for example, an amplification channel connected downstream of the outlet channel, and the amplification can be performed in the amplification channel.
  • the detection step is a step of detecting the presence or absence of amplification of the target genome in the droplet as described above.
  • the method for detecting the presence or absence of the amplification is not particularly limited, and can be appropriately set depending on, for example, the amplification method, the type of the amplification reagent used, and the like.
  • the presence / absence of the amplification is detected for each droplet, for example.
  • the method for detecting the presence or absence of amplification is not particularly limited, and examples thereof include a general intercalator method and probe method.
  • a detection reagent such as an intercalator or a probe can be used according to the detection method.
  • the type of the probe is not particularly limited, and for example, a TaqMan (registered trademark) probe or the like can be used.
  • the detection reagent may coexist with the amplification reagent, for example.
  • the detection reagent used in the detection step may be previously contained in the droplet, for example, or may be added to the droplet during the detection step, and is easy to operate. preferable.
  • a droplet is formed in the presence of the amplification reagent and the detection reagent, and in the nucleic acid amplification step, the amplification reagent contained in the droplet is used.
  • the target genome may be amplified, and in the detection step, the presence or absence of the amplification may be detected using the detection reagent contained in the droplet.
  • droplets are formed in the absence of the amplification reagent and the detection reagent, and in the nucleic acid amplification step, the amplification reagent is added, and the target Amplification of the genome is performed, and in the detection step, the detection reagent may be dropped to detect the presence or absence of the amplification.
  • the detection step is preferably performed in the microchannel of the device as well.
  • the device has a detection channel downstream of the amplification channel, and can perform the amplification in the detection channel.
  • the amplification step and the detection step may be performed sequentially, for example, but can be performed simultaneously. In the latter case, for example, the amplification step and the detection step may be performed in the presence of the amplification reagent and the detection reagent.
  • the device When using a device having the microchannel, the device has, for example, an amplification channel connected downstream of the outlet channel, and performs the amplification and the detection in the amplification channel. be able to.
  • the sorting step is a step of sorting the droplet in which the amplification of the target genome is detected as a genome analysis droplet containing an amplification product derived from the target genome of the target cell.
  • the detection process when the detection process is performed using the device, it can be isolated by, for example, deriving the droplet from the device and collecting it in another container (such as a microtube). .
  • the present invention releases intracellular components such as nucleic acids from the cells contained in the droplets in the emulsion after the emulsion formation step, before the nucleic acid amplification step, or simultaneously with the nucleic acid amplification step.
  • the release of the intracellular component is not particularly limited, and for example, a general cell lysis reagent can be used.
  • the cell lysis reagent for example, may be added to the droplets in the emulsion after the emulsion formation step, or in the emulsion formation step, by contacting the sample and the emulsion formation solvent, You may make it contain in the droplet in the said emulsion formation solvent.
  • the reagent examples include a solution containing a surfactant, a salt, and a solvent.
  • the surfactant include anionic surfactants such as sodium deoxycholate and sodium lauryl sulfate.
  • the salt examples include sodium chloride.
  • the solvent include various buffers. Liquid. Specific examples of the composition of the reagent include, for example, 50 mmol / L Tris-HCl, 150 mmol / L NaCl, 0.5 w / v% sodium deoxycholate, 0.1 w / v% sodium lauryl sulfate, and 1.0 w / An example is v% NIP-40.
  • the present invention may further include an analysis step.
  • the analysis step is, for example, a step of analyzing an amplification product derived from a target genome contained in the analysis droplet. The analysis will be described later.
  • the analysis method of the present invention is a genome analysis method derived from a target cell, Including a step of isolating a droplet for genome analysis containing an amplification product derived from a target genome, and an analysis step,
  • the isolation step includes A step of isolating a droplet for genome analysis containing an amplification product derived from a target genome of a target cell from a sample containing cells by the isolation method of the present invention,
  • the analysis step includes The amplification product contained in the isolated droplet for genome analysis is a step of performing genome analysis.
  • the point of the analysis method of the present invention is that the droplet for genome analysis is isolated by the isolation method of the present invention, and other steps and conditions are not particularly limited.
  • the description of the method for isolating a droplet for genome analysis of the present invention can be used as the isolation method of the isolation step.
  • the target genome for analysis is amplified in the isolation step, and the isolated droplet for genome analysis is subjected to, for example, sequencing without further amplification processing. Can be analyzed. And since the sequence which is not the object of analysis is not amplified in the said isolation process, the target genome analysis can be performed avoiding the influence of the amplification product of a short chain like the past.
  • the analysis step is a step of performing genome analysis on the amplification product contained in the isolated genome analysis droplet.
  • the genome analysis include known methods, and specific examples include Fluorescence In Situ Hybridization (FISH), G-Band, Next-Generation Sequencing (NGS), and the like.
  • the target genome to be analyzed later is amplified. Does not include short-chain amplification products that are not subject to genome analysis. For this reason, if the droplets for genome analysis obtained by the isolation method of the present invention are used, for example, the influence of the short amplification product is avoided, and the genome analysis is performed by sequencing and assembly as it is. It can be carried out.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

後のゲノム解析に影響を与えることなく、ゲノム解析に供する液滴を単離する方法、およびゲノム解析方法を提供する。　本発明は、ゲノム解析用液滴の単離方法であり、 エマルション形成工程と、核酸増幅工程と、検出工程と、分取工程とを含み、 前記エマルション形成工程は、　細胞を含む試料と、エマルション形成溶媒とを接触させて、前記エマルション形成溶媒中に、前記試料中の細胞を含む複数の液滴を形成する工程であり、 前記核酸増幅工程は、　前記液滴について、ターゲット細胞に含まれるターゲットゲノムの増幅を行う工程であり、 前記検出工程は、　前記液滴における前記ターゲットゲノムの増幅の有無を検出する工程であり、 前記分取工程は、　前記ターゲットゲノムの増幅が検出された液滴を、前記ターゲット細胞のターゲットゲノム由来の増幅産物を含むゲノム解析用液滴として分取する工程であることを特徴とする。

Description

ゲノム解析用液滴の単離方法、およびゲノム解析方法
　本発明は、ゲノム解析用液滴の単離方法、およびゲノム解析方法に関する。
　様々な細胞を含む試料から、ターゲット細胞を単離して、ターゲットゲノムについての解析を行う場合、ターゲット細胞の単離方法として、近年、セルソーティングが一般的になっている。中でも、エマルション化により細胞を含む液滴（ドロップレット）を形成する方法では、核酸増幅を利用して、ターゲット細胞を含む液滴の分取（ソーティング）が行われている。
　セルソーティングの具体的な方法としては、例えば、まず、細胞を含む試料についてエマルション化を行い、前記エマルション中に液滴を形成する。そして、前記エマルション中の液滴について、ＰＣＲ等の核酸増幅法により、ターゲット細胞に由来する短鎖の配列を増幅させ、プローブ等を用いて、前記増幅の有無を検出する。そして、増幅が確認された液滴を、ターゲット細胞を含む液滴として分取し、これを、ゲノム解析等の試料とする（非特許文献１）。ゲノム解析においては、例えば、前記液滴について、さらに、前記ターゲット細胞のターゲットゲノムの核酸増幅を行い、得られたターゲットゲノムの増幅産物を次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に供し、アッセンブリングすることで、前記ターゲット細胞のターゲットゲノムを解析できる（非特許文献２）。
Dennis J. Eastburn, et al., 「Identification and genetic analysis of cancer cells with PCR-activated cell sorting」Nucleic　Acids　Research,　2014,　Vol. 42,　No. 16　e128 Yong Hou,　et al., 「Comparison of variations detectionbetween whole-genome amplification methods used in single-cell resequencing」 GIGA Science, 2015, 4:37
　前記セルソーティングにおける核酸増幅は、前記液滴中の細胞の有無の確認を目的とするため、前述のように、例えば、ゲノムにおける短い領域（例えば、８０～３００ｂｐ程度）を設定して、増幅が行われる。しかしながら、増幅の検出により分取された液滴には、セルソーティングでの短鎖の増幅産物が大量に混入されており、その量は、液滴中に含まれる細胞由来のゲノムと比較して非常に多い。このため、ゲノム解析のために、前記分取した液滴について、さらに、ターゲットゲノムの核酸増幅を行っても、ゲノム解析に供する試料には、ターゲットゲノム由来の増幅産物の他に、解析対象ではない大量の短鎖の増幅産物が混入されたままで、これらの短鎖の増幅産物がシーケンシングされ、ターゲット細胞のターゲットゲノムの解析結果に影響を与えるという問題がある。
　そこで、本発明は、後のゲノム解析に影響を与えることなく、ゲノム解析に供することができる液滴を単離する方法、およびゲノム解析方法を提供することを目的とする。
　前記目的を達成するために、本発明は、ゲノム解析用液滴の単離方法であり、
エマルション形成工程と、核酸増幅工程と、検出工程と、分取工程とを含み、
前記エマルション形成工程は、
　細胞を含む試料と、エマルション形成溶媒とを接触させて、前記エマルション形成溶媒中に、前記試料中の細胞を含む複数の液滴を形成する工程であり、
前記核酸増幅工程は、
　前記液滴について、ターゲット細胞に含まれるターゲットゲノムの増幅を行う工程であり、
前記検出工程は、
　前記液滴における前記ターゲットゲノムの増幅の有無を検出する工程であり、
前記分取工程は、
　前記ターゲットゲノムの増幅が検出された液滴を、前記ターゲットゲノム由来の増幅産物を含むゲノム解析用液滴として分取する工程であることを特徴とする。
　本発明は、ターゲット細胞由来のゲノム解析方法であり、
ターゲットゲノム由来の増幅産物を含むゲノム解析用液滴の単離工程と、解析工程とを含み、
前記単離工程は、
　細胞を含む試料から、前記本発明の単離方法により、ターゲット細胞のターゲットゲノム由来の増幅産物を含むゲノム解析用液滴を単離する工程であり、
前記解析工程は、
　前記単離されたゲノム解析用液滴に含まれる前記増幅産物について、ゲノム解析を行う工程であることを特徴とする。
　本発明によれば、ゲノム解析用液滴の単離において、液滴中の細胞の有無を確認するにあたって、後の解析対象となるターゲットゲノムを増幅するため、例えば、前述のように、ターゲットゲノムの解析対象ではない短鎖の増幅産物は含まれない。このため、本発明の単離方法により得られたゲノム解析用液滴を用いれば、例えば、前記短鎖の増幅産物の影響を回避して、そのまま、シーケンシングとアッセンブリングとにより、ゲノム解析を行うことができる。
　本発明のゲノム解析用液滴の単離方法は、例えば、前記エマルション形成工程において、前記ターゲットゲノムの増幅用試薬の存在下、液滴を形成し、前記核酸増幅工程において、前記液滴に含まれる前記増幅用試薬を用いて、前記ターゲットゲノムの増幅を行う。
　本発明のゲノム解析用液滴の単離方法は、例えば、前記エマルション形成工程において、前記ターゲットゲノムの増幅用試薬の非存在下、液滴を形成し、前記核酸増幅工程において、前記増幅用試薬を添加し、前記ターゲットゲノムの増幅を行う。
　本発明のゲノム解析用液滴の単離方法は、例えば、前記増幅用試薬に、前記増幅の検出のための検出試薬を共存させ、前記増幅用試薬が、前記ターゲットゲノムを増幅するためのプライマーを含み、前記検出試薬が、インターカレータまたはプローブを含む。
　本発明のゲノム解析用液滴の単離方法は、例えば、さらに、解析工程を含み、前記解析工程は、前記解析用液滴に含まれるターゲットゲノム由来の増幅産物について、解析を行う。
　本発明のゲノム解析用液滴の単離方法は、例えば、前記エマルション形成工程において、前記エマルション形成溶媒は、非水溶性溶媒を含み、前記非水溶性溶媒中に、前記複数の液滴が形成され、前記複数の液滴は、前記試料を含む水溶性の液滴である。
　本発明のゲノム解析用液滴の単離方法は、例えば、流路を有するデバイスを使用し、前記流路内で、前記エマルション形成工程、前記増幅工程および前記検出工程を行う。
　本発明のゲノム解析用液滴の単離方法は、例えば、前記流路内で、さらに、前記分取工程を行う。
　本発明の単離方法および解析方法は、ゲノム解析用液滴の分取のための核酸増幅として、ゲノム解析の対象となるターゲットゲノムの増幅を行うことがポイントであり、その他の工程や条件は、特に制限されない。
　以下、本発明の単離方法および解析方法の実施形態について、例をあげて説明する。本発明の単離方法および解析方法は、下記の実施形態によって何ら限定および制限されない。また、各実施形態の記載は、それぞれ互いに援用できる。
（ゲノム解析用液滴の単離方法）
　本発明の単離方法は、前述のように、ゲノム解析用液滴の単離方法であり、
エマルション形成工程と、核酸増幅工程と、検出工程と、分取工程とを含み、
前記エマルション形成工程は、
　細胞を含む試料と、エマルション形成溶媒とを接触させて、前記エマルション形成溶媒中に、前記試料中の細胞を含む複数の液滴を形成する工程であり、
前記核酸増幅工程は、
　前記液滴について、ターゲット細胞に含まれるターゲットゲノムの増幅を行う工程であり、
前記検出工程は、
　前記液滴における前記ターゲットゲノムの増幅の有無を検出する工程であり、
前記分取工程は、
　前記ターゲットゲノムの増幅が検出された液滴を、前記ターゲットゲノム由来の増幅産物を含むゲノム解析用液滴として分取する工程であることを特徴とする。
　前記エマルション形成工程は、前述のように、細胞を含む試料と、エマルション形成溶媒とを接触させて、前記エマルション形成溶媒中に、前記試料中の細胞を含む複数の液滴を形成する工程である。前記エマルション形成溶媒中における前記液滴の形成によって、前記試料を、複数の液滴に分割して区画することができる。そして、前記液滴のそれぞれに、前記試料中の様々な細胞が、分配されることになる。
　前記試料の種類は、何ら制限されず、細胞が存在すると考えられる試料があげられる。前記試料は、例えば、生体試料があげられ、具体例としては、血液、リンパ液、脳脊髄液、精液、尿、鼻水、鼻腔ぬぐい液（スワブ）等である。前記生体の種は、特に制限されず、例えば、ヒト；ウシ、ブタ、ヒツジ、マウス、ラット、ウサギおよびウマ等の非ヒト哺乳類；鳥類；魚類等の動物があげられる。
　前記エマルション形成溶媒は、特に制限されず、その中に、前記試料を含む液滴を形成できるものであればよい。前記エマルション形成溶媒は、例えば、非水溶性溶媒であり、前記非水溶性溶媒中に、前記試料を含む水溶性の液滴が形成できる。
　前記非水溶性溶媒は、例えば、油、ミネラルオイル、クロロホルム、芳香族化合物等があげられる。前記非水溶性溶媒は、例えば、一種類を単独で使用してもよいし、二種類以上を併用してもよい。
　前記液滴の形成においては、例えば、さらに、水溶性溶媒を共存させてもよい。前記水溶性溶媒は、例えば、水、緩衝液、水溶性高分子溶液等があげられる。前記水溶性溶媒は、例えば、一種類を単独で使用してもよいし、二種類以上を併用してもよい。
　前記液滴の形成においては、例えば、後述する増幅工程において使用する試薬を共存させてもよい。これにより、前記試薬を含有する液滴が形成されるため、例えば、後述する増幅工程において、新たに試薬を添加することなく、増幅工程における増幅反応を行うことができる。前記試薬に関しては、後述する。
　前記形成する液滴の大きさは、特に制限されず、その平均体積は、下限が、例えば、４ｐＬ以上であり、上限が、例えば、１０ｎＬ以下である。
　前記液滴に含まれる細胞の個数は、特に制限されない。前記液滴１個に含まれる細胞数は、例えば、５個以下、２個以下、好ましくは１個である。
　前記エマルション形成溶媒中における液滴の形成方法は、特に制限されず、前記エマルション形成溶媒と、前記試料とを接触させることで、前記エマルション形成溶媒中に、複数の液滴を形成できる。前記接触は、例えば、前記エマルション形成溶媒に、前記試料を接触させてもよいし、前記試料に、前記エマルション形成溶媒を接触させてもよい。前記液滴の形成方法は、例えば、公知のドロップレット作製方法が適用できる。
　前記液滴の形成には、例えば、マイクロ流路を有するエマルション化デバイスを使用できる。前記デバイスは、前記マイクロ流路として、例えば、サンプル用流路と、エマルション形成溶媒用流路と、これらの連結部と、前記連結部から導出される導出流路とを含む。このデバイスを用いた場合、例えば、以下のように液滴が形成される。まず、前記連結部には、前記エマルション形成溶媒用流路から、前記エマルション形成溶媒が導入され、つぎに、前記エマルション形成溶媒が導入された前記連結部に向かって、前記サンプル用流路から、前記試料（例えば、任意で前記水溶性溶媒を含む）が導入される。そして、前記連結部において、前記エマルション形成溶媒と前記試料とが接触し、エマルション化され、前記連結部から前記導出流路に、エマルション（前記エマルション形成溶媒中に液滴が分散された状態）として導出される。なお、前記試料と前記水溶性溶媒とは、例えば、前述のように、予め混合した混合液として、前記デバイスの流路に導入してもよいし、別々に流路に導入してもよい。後者の場合、前記連結部の上流において、前記サンプル用流路と試薬用流路とを有し、前記連結部に向かって、前記サンプル用流路から前記試料が導入され、前記試薬用流路から前記水溶性溶媒や任意で前記試薬等が導入されてもよい。
　前記増幅工程は、前述のように、前記エマルション形成工程で形成された液滴について、ターゲット細胞に含まれるターゲットゲノムの増幅を行う工程である。
　前記増幅工程において、増幅する対象のターゲットゲノムは、特に制限されず、ゲノム解析の目的に応じて適宜決定できる。本発明は、従来のように、ゲノム解析の目的とは別に、前記液滴中の細胞の有無を検出することのみを目的として、短鎖の配列を増幅するのではなく、後にゲノム解析する対象のゲノムを増幅することがポイントである。このため、前記増幅工程において、増幅させるゲノムは、後の解析対象のターゲットゲノムであり、また、前記ターゲットゲノムにおける増幅させる領域は、いわゆるゲノム解析に必要な領域である。ゲノム解析は、一般的に、ターゲットゲノムの一部が重複する複数の領域を増幅させ、配列を解読し、解読した配列結果をアッセンブリして、ターゲットゲノム全体を解析する。したがって、本発明の単離方法も、前記増幅工程におけるターゲットゲノムの増幅は、ゲノム解析に必要となる複数の領域の増幅であることが好ましい。この場合、ターゲットゲノムにおいて、増幅させる各領域の長さは、例えば、４００ｂｐ～６０ｋｂｐであり、解析する全体の長さは、例えば、２４６ｂｐ～１．５×１０７ｂｐである。本発明におけるゲノム解析は、例えば、ホールゲノム解析があげられる。この場合、例えば、複数の遺伝子座を含む複数の領域を増幅させてもよいし、全遺伝子について、各遺伝子の全長または部分領域を増幅させてもよい。
　前記増幅工程において、前記核酸増幅の方法は、特に制限されず、ＰＣＲ法等の公知の手法が採用できる。前記増幅用試薬は、特に制限されず、例えば、ポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰ等があげられる。
　前記増幅工程で使用する前記増幅用試薬は、例えば、予め前記液滴に含有させてもよいし、前記増幅工程時に前記液滴に添加してもよく、操作が容易であることから、前者が好ましい。前者の場合、例えば、前記エマルション形成工程において、前記増幅用試薬の存在下、液滴を形成し、前記核酸増幅工程において、前記液滴に含まれる前記増幅用試薬を用いて、前記ターゲットゲノムの増幅を行えばよい。また、後者の場合、例えば、前記エマルション形成工程において、前記増幅用試薬の非存在下、液滴を形成し、前記核酸増幅工程において、前記増幅用試薬を添加し、前記ターゲットゲノムの増幅を行えばよい。
　前述のように、前記エマルション形成工程は、マイクロ流路を有するデバイスを用いて行えることから、前記増幅工程も、同様に、前記デバイスのマイクロ流路内で行うことが好ましい。この場合、前記デバイスは、例えば、前記導出流路の下流に連結された増幅流路を有し、前記増幅流路内で前記増幅を行うことができる。
　前記検出工程は、前述のように、前記液滴における前記ターゲットゲノムの増幅の有無を検出する工程である。前記増幅の有無を検出する方法は、特に制限されず、例えば、前記増幅方法、使用した前記増幅用試薬の種類等に応じて、適宜設定できる。前記検出工程において、前記増幅の有無の検出は、例えば、前記液滴ごとに行う。
　前記増幅の有無を検出する方法は、特に制限されず、例えば、一般的な、インターカレータ法、プローブ法等があげられる。前記検出には、例えば、前記検出方法に応じて、インターカレータ、プローブ等の検出用試薬が使用できる。前記プローブの種類は、特に制限されず、例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ等が使用できる。前記検出用試薬は、例えば、前記増幅用試薬と共存させてもよい。
　前記検出工程で使用する前記検出用試薬は、例えば、予め前記液滴に含有させてもよいし、前記検出工程時に前記液滴に添加してもよく、操作が容易であることから、前者が好ましい。前者の場合、例えば、前記エマルション形成工程において、前記増幅用試薬および前記検出用試薬の存在下、液滴を形成し、前記核酸増幅工程において、前記液滴に含まれる前記増幅用試薬を用いて、前記ターゲットゲノムの増幅を行い、前記検出工程において、前記液滴に含まれる前記検出用試薬を用いて、前記増幅の有無を検出すればよい。また、後者の場合、例えば、前記エマルション形成工程において、前記増幅用試薬および前記検出用試薬の非存在下、液滴を形成し、前記核酸増幅工程において、前記増幅用試薬を添加し、前記ターゲットゲノムの増幅を行い、前記検出工程において、前記検出用試薬を滴下し、前記増幅の有無を検出すればよい。
　前述のように、前記エマルション形成工程および前記増幅工程は、マイクロ流路を有するデバイスを用いて行えることから、前記検出工程も、同様に、前記デバイスのマイクロ流路内で行うことが好ましい。この場合、前記デバイスは、例えば、前記増幅流路の下流に検出流路を有し、前記検出流路内で前記増幅を行うことができる。
　本発明において、前記増幅工程と前記検出工程は、例えば、順番に行ってもよいが、同時に行うこともできる。後者の場合、例えば、前記増幅用試薬と前記検出用試薬の共存下で、前記増幅工程と前記検出工程とを行えばよい。また、前記マイクロ流路を有するデバイスを用いる場合、前記デバイスは、例えば、前記導出流路の下流に連結された増幅流路を有し、前記増幅流路内で前記増幅と前記検出とを行うことができる。
　前記分取工程は、前述のように、前記ターゲットゲノムの増幅が検出された液滴を、前記ターゲット細胞のターゲットゲノム由来の増幅産物を含むゲノム解析用液滴として分取する工程である。前記核酸増幅後の液滴から、増幅が検出された液滴を選択して分取することにより、例えば、後述するように、これを用いて、ゲノム解析を行うことができる。
　前述のように、前記デバイスを用いて前記検出工程までを行った場合には、例えば、前記デバイスから、前記液滴を導出させ、別の容器（マイクロチューブ等）に回収することで単離できる。
　本発明は、例えば、前記エマルション形成工程の後、前記核酸増幅工程の前、または前記核酸増幅工程と同時に、前記エマルション内の前記液滴に含まれる細胞について、核酸等の細胞内成分を放出する処理を行う。前記細胞内成分の放出は、特に制限されず、例えば、一般的な細胞溶解試薬を用いることができる。前記細胞溶解試薬は、例えば、前記エマルション形成工程の後、前記エマルション内の前記液滴に添加してもよいし、前記エマルション形成工程において、前記試料と前記エマルション形成溶媒とに接触させることで、前記エマルション形成溶媒中の液滴に含有させてもよい。前記試薬としては、例えば、界面活性剤と、塩と、溶媒とを含む溶液があげられる。前記界面活性剤としては、例えば、デオキシコール酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤等があげられ、前記塩としては、例えば、塩化ナトリウム等があげられ、前記溶媒としては、各種緩衝液があげられる。前記試薬の組成の具体例としては、例えば、５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、０．５ｗ／ｖ％デオキシコール酸ナトリウム、０．１ｗ／ｖ％ラウリル硫酸ナトリウム、および１．０ｗ／ｖ％　ＮＩＰ－４０等が例示できる。前記細胞溶解試薬を前記液滴に含有させることによって、例えば、前記液滴中で、前記細胞から、核酸等の細胞内成分を放出させることができる。前記液滴中で前記細胞から前記細胞内成分を放出させる際、その処理条件は、特に制限されない。
　本発明は、さらに、解析工程を含んでもよい。前記解析工程は、例えば、前記解析用液滴に含まれるターゲットゲノム由来の増幅産物について、解析を行う工程である。前記解析については、後述する。
（ターゲット細胞由来のゲノム解析方法）
　本発明の解析方法は、前述のように、ターゲット細胞由来のゲノム解析方法であり、
ターゲットゲノム由来の増幅産物を含むゲノム解析用液滴の単離工程と、解析工程とを含み、
前記単離工程は、
　細胞を含む試料から、前記本発明の単離方法により、ターゲット細胞のターゲットゲノム由来の増幅産物を含むゲノム解析用液滴を単離する工程であり、
前記解析工程は、
　前記単離されたゲノム解析用液滴に含まれる前記増幅産物について、ゲノム解析を行う工程であることを特徴とする。
　本発明の解析方法は、本発明の単離方法によってゲノム解析用液滴を単離することがポイントであり、その他の工程や条件は、特に制限されない。本発明の解析方法において、前記単離工程の単離方法は、前記本発明のゲノム解析用液滴の単離方法の記載を援用できる。
　本発明の解析方法は、前記単離工程において、解析目的のターゲットゲノムの増幅を行っており、単離した前記ゲノム解析用液滴については、さらに増幅処理を行うことなく、例えば、シーケンシング等の解析を行うことができる。そして、前記単離工程において、解析の対象ではない配列の増幅を行っていないことから、従来のように、短鎖の増幅産物の影響を回避して、目的のゲノム解析を行うことができる。
　前記解析工程は、前述のように、前記単離されたゲノム解析用液滴に含まれる前記増幅産物について、ゲノム解析を行う工程である。前記ゲノム解析は、例えば、公知の方法があげられ、具体例としては、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｉｎ　Ｓｉｔｕ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＦＩＳＨ）、Ｇ－Ｂａｎｄ、Ｎｅｘｔ―Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＮＧＳ）等である。
　以上、実施形態および実施例を参照して、本発明を説明したが、本発明は、上記発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。また、本明細書で引用する特許文献および学術文献等の文献に記載の内容は、全て引用により本明細書に取り込むものとする。
　この出願は、２０１７年４月２６日に出願された日本出願特願２０１７－０８７２３５を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。
　本発明によれば、ゲノム解析用液滴の単離において、液滴中の細胞の有無を確認するにあたって、後の解析対象となるターゲットゲノムの増幅を行うため、例えば、前述のように、ターゲットゲノムの解析対象ではない短鎖の増幅産物が含まれない。このため、本発明の単離方法により得られたゲノム解析用液滴を用いれば、例えば、前記短鎖の増幅産物の影響を回避して、そのまま、シーケンシングとアッセンブリングとにより、ゲノム解析を行うことができる。

Claims (9)

  1. エマルション形成工程と、核酸増幅工程と、検出工程と、分取工程とを含み、
    前記エマルション形成工程は、
    　細胞を含む試料と、エマルション形成溶媒とを接触させて、前記エマルション形成溶媒中に、前記試料中の細胞を含む複数の液滴を形成する工程であり、
    前記核酸増幅工程は、
    　前記液滴について、ターゲット細胞に含まれるターゲットゲノムの増幅を行う工程であり、
    前記検出工程は、
    　前記液滴における前記ターゲットゲノムの増幅の有無を検出する工程であり、
    前記分取工程は、
    　前記ターゲットゲノムの増幅が検出された液滴を、前記ターゲットゲノム由来の増幅産物を含むゲノム解析用液滴として分取する工程であることを特徴とするゲノム解析用液滴の単離方法。
  2. 前記エマルション形成工程において、前記ターゲットゲノムの増幅用試薬の存在下、液滴を形成し、
    前記核酸増幅工程において、前記液滴に含まれる前記増幅用試薬を用いて、前記ターゲットゲノムの増幅を行う、請求項１記載のゲノム解析用液滴の単離方法。
  3. 前記エマルション形成工程において、前記ターゲットゲノムの増幅用試薬の非存在下、液滴を形成し、
    前記核酸増幅工程において、前記増幅用試薬を添加し、前記ターゲットゲノムの増幅を行う、請求項１記載のゲノム解析用液滴の単離方法。
  4. 前記増幅用試薬に、前記増幅の検出のための検出試薬を共存させ、
    前記増幅用試薬が、前記ターゲットゲノムを増幅するためのプライマーを含み、
    前記検出試薬が、インターカレータまたはプローブを含む、請求項２または３記載のゲノム解析用液滴の単離方法。
  5. さらに、解析工程を含み、
    前記解析工程は、前記解析用液滴に含まれるターゲットゲノム由来の増幅産物について、解析を行う、請求項１から４のいずれか一項に記載のゲノム解析用液滴の単離方法。
  6. 前記エマルション形成工程において、
    　前記エマルション形成溶媒は、非水溶性溶媒を含み、
    　前記非水溶性溶媒中に、前記複数の液滴が形成され、
    　前記複数の液滴は、前記試料を含む水溶性の液滴である、請求項１から５のいずれか一項に記載のゲノム解析用液滴の単離方法。
  7. 流路を有するデバイスを使用し、
    前記流路内で、前記エマルション形成工程、前記増幅工程および前記検出工程を行う、請求項１から６のいずれか一項に記載のゲノム解析用液滴の単離方法。
  8. 前記流路内で、さらに、前記分取工程を行う、請求項７記載のゲノム解析用液滴の単離方法。
  9. ターゲットゲノム由来の増幅産物を含むゲノム解析用液滴の単離工程と、解析工程とを含み、
    前記単離工程は、
    　細胞を含む試料から、請求項１から８のいずれか一項に記載の単離方法により、ターゲット細胞のターゲットゲノム由来の増幅産物を含むゲノム解析用液滴を単離する工程であり、
    前記解析工程は、
    　前記単離されたゲノム解析用液滴に含まれる前記増幅産物について、ゲノム解析を行う工程であることを特徴とするターゲット細胞由来のゲノム解析方法。
     

     
PCT/JP2018/010970 2017-04-26 2018-03-20 ゲノム解析用液滴の単離方法、およびゲノム解析方法 Ceased WO2018198598A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017087235A JP2018183096A (ja) 2017-04-26 2017-04-26 ゲノム解析用液滴の単離方法、およびゲノム解析方法
JP2017-087235 2017-04-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018198598A1 true WO2018198598A1 (ja) 2018-11-01

Family

ID=63918934

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2018/010970 Ceased WO2018198598A1 (ja) 2017-04-26 2018-03-20 ゲノム解析用液滴の単離方法、およびゲノム解析方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP2018183096A (ja)
WO (1) WO2018198598A1 (ja)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016182034A1 (ja) * 2015-05-12 2016-11-17 株式会社オンチップ・バイオテクノロジーズ 単一粒子解析方法およびその解析のためのシステム

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016182034A1 (ja) * 2015-05-12 2016-11-17 株式会社オンチップ・バイオテクノロジーズ 単一粒子解析方法およびその解析のためのシステム

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EASTBURN D.J. ET AL.: "Identification and genetic analysis of cancer cells with PCR-activated cell sorting", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 42, no. 16, 15 September 2014 (2014-09-15), pages 1 - 10, XP055527394, ISSN: 0305-1048 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2018183096A (ja) 2018-11-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240392282A1 (en) Microfluidic device for extracting, isolating, and analyzing dna from cells
US20200399680A1 (en) Nucleotide sequence exclusion enrichment by droplet sorting (needls)
KR102755843B1 (ko) 개별 세포 또는 세포 개체군으로부터 핵산을 분석하는 방법
Benítez et al. Microfluidic extraction, stretching and analysis of human chromosomal DNA from single cells
EP3387148A1 (en) Method for transcriptome analysis of single cells
KR20200138183A (ko) 핵산 증폭을 위한 방법
US20230063190A1 (en) Single cell analysis
US11572584B2 (en) Targeted enrichment of long nucleotide sequences using microfluidic partitioning
WO2013177206A2 (en) Single-particle analysis of particle populations
CA3149201A1 (en) Genetic mutational analysis
EP3268125A1 (en) Determination of cells using amplification
WO2018198599A1 (ja) 細胞由来の解析用液滴の単離方法、および細胞の解析方法
WO2018198598A1 (ja) ゲノム解析用液滴の単離方法、およびゲノム解析方法
KR101162422B1 (ko) 핵산 증폭용 조성물
HK40064506A (en) Single cell analysis
JP4187057B2 (ja) 核酸合成法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18791280

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 18791280

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1