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WO2018186717A1 - 혈중 반감기 향상을 위한 항체 Fc 변이체들 - Google Patents

혈중 반감기 향상을 위한 항체 Fc 변이체들 Download PDF

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Publication number
WO2018186717A1
WO2018186717A1 PCT/KR2018/004104 KR2018004104W WO2018186717A1 WO 2018186717 A1 WO2018186717 A1 WO 2018186717A1 KR 2018004104 W KR2018004104 W KR 2018004104W WO 2018186717 A1 WO2018186717 A1 WO 2018186717A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
polypeptide
amino acid
variant
variants
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2018/004104
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
정상택
고상환
이태규
최소영
이수한
손명호
김수진
박소라
박종식
임명신
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kookmin University
Osong Medical Innovation Foundation
Original Assignee
Kookmin University
Osong Medical Innovation Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority claimed from KR1020170047822A external-priority patent/KR101792191B1/ko
Priority claimed from KR1020170047821A external-priority patent/KR101792205B1/ko
Priority to JP2020504084A priority Critical patent/JP7264381B2/ja
Application filed by Kookmin University, Osong Medical Innovation Foundation filed Critical Kookmin University
Priority to EP23211824.0A priority patent/EP4342541A3/en
Priority to CN201880023946.6A priority patent/CN110691796B/zh
Priority to CA3059199A priority patent/CA3059199C/en
Priority to AU2018249796A priority patent/AU2018249796B2/en
Priority to EP18781667.3A priority patent/EP3608339B1/en
Priority to US16/603,273 priority patent/US11492415B2/en
Publication of WO2018186717A1 publication Critical patent/WO2018186717A1/ko
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Priority to US17/881,819 priority patent/US20230061390A1/en
Ceased legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Definitions

  • the present invention relates to novel antibody Fc variants with improved half-life in blood and methods for their preparation.
  • the therapeutic antibody is considered to be one of the most effective cancer treatment methods because it shows very high specificity to the target compared to the existing low molecular weight drugs, low biotoxicity and fewer side effects, and excellent blood half-life of about three weeks.
  • major pharmaceutical companies and research institutes around the world are speeding up research and development of therapeutic antibodies that specifically bind to and effectively eliminate cancer cells, including cancer-causing agents.
  • Pharmaceutical companies such as Roche, Amgen, Johnson & Johnson, Abbott, and BMS are the main development companies for therapeutic antibody medicines.
  • Roche is a herceptin, Avastin and Rituxan for anticancer treatment.
  • the three major therapeutic antibodies which generate revenues of approximately $ 19.5 billion in 2012, are leading the world's antibody market.
  • the Fc region of the antibody recruits immune leukocytes or serum complement molecules to serve to remove damaged cells such as cancer cells or infected cells.
  • the site on the Fc between the C ⁇ 2 and C ⁇ 3 domains mediates interaction with the neonatal receptor FcRn, the binding of which recirculates the intracellularly introduced antibody from the endosome to the bloodstream (Raghavan et al. , 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12: 181-220; Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18: 739-766).
  • This process is associated with a decrease in body clearance by kidney filtration, due to the large size of full-length IgG antibody molecules, resulting in favorable antibody serum half-lives ranging from one to three weeks. serum half-life).
  • binding of Fc to FcRn plays an important role in antibody transport.
  • the Fc region plays an essential role in maintaining prolonged serum persistence by circulating antibodies through intracellular trafficking and recycling mechanisms.
  • the present invention was completed by identifying a method capable of maximizing blood half-life while retaining excellent activity of a protein or antibody therapeutic agent by optimizing some amino acid sequences of wild-type Fc domains with other amino acid sequences.
  • polypeptide comprising an Fc variant in which some of the amino acid sequences of a human antibody Fc domain are substituted with other amino acid sequences.
  • Another object of the present invention to provide an antibody comprising the polypeptide.
  • Still another object of the present invention is to provide a nucleic acid molecule encoding the polypeptide.
  • Still another object of the present invention is to provide a vector containing the nucleic acid molecule.
  • Another object of the present invention to provide a host cell comprising the vector.
  • Another object of the present invention to provide a composition comprising the polypeptide, antibody, nucleic acid molecule or vector.
  • Another object of the present invention to provide a method for producing the polypeptide or antibody.
  • Another object of the present invention to provide a method for screening the polypeptide.
  • the invention provides a polypeptide comprising an Fc variant in which part of the amino acid sequence of a human antibody Fc domain is substituted with another amino acid sequence.
  • the invention provides an increase in blood half-life of an antibody or protein therapeutic comprising a polypeptide comprising a Fc variant in which some of the amino acid sequences of the human antibody Fc domain are substituted with other amino acid sequences. It provides a composition for.
  • the present inventors prepared a Fc variant by substituting and optimizing some amino acid sequences of wild-type Fc domains with other amino acid sequences in a method for efficiently increasing the half-life of an existing protein or antibody therapeutic agent, thereby including a protein or antibody therapeutic agent. We wanted to find a way to maximize the half-life of.
  • Antibodies are proteins that specifically bind to specific antigens, and natural antibodies are usually about 150,000 Daltons heterodimeric glycoproteins, consisting of two identical light chains (L) and two identical heavy chains (H).
  • the human antibodies used in the present invention have five main classes of IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, preferably IgG.
  • Papain digestion of antibodies forms two Fab fragments and one Fc fragment, and in human IgG molecules, the Fc region is produced by papain digesting the N-terminus of Cys 226 (Deisenhofer, Biochemistry 20: 2361-2370, 1981). .
  • the antibody Fc domain may be the Fc domain of an IgA, IgM, IgE, IgD, or IgG antibody, or a modification thereof.
  • the domain is an Fc domain of an IgG antibody (eg, an Fc domain of an IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, or IgG4 antibody).
  • the Fc domain may be an IgG1 Fc domain (eg, an Fc domain of an antiHER2 antibody, preferably an Fc domain of trastuzumab, more preferably an Fc domain of SEQ ID NO: 28).
  • Polypeptides comprising the Fc domain of the present invention may be partially or fully glycosylated in the polypeptide.
  • the polypeptide may also include one or more regions derived from the antibody in addition to the Fc domain.
  • the polypeptide may include an antigen binding domain derived from an antibody, and a plurality of polypeptides may form an antibody or an antibody-type protein.
  • amino acid residue number of the antibody Fc domain herein is according to the Kabat EU numbering system commonly used in the art (Kabat et al., In “Sequences of Proteins of Immunological Interest” 5th Ed., US EU numbering as described in the Kabat et al. (1991) as in the Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991.
  • the substituted Fc variants of the invention comprise the amino acid substitution of M428L according to the Kabat EU numbering system.
  • substituted Fc variants of the invention comprise the following amino acid substitutions according to the Kabat EU numbering system: a) M428L; And b) Q311R or L309G.
  • the substituted Fc variants of the invention comprise amino acid substitutions of P228L and M428L according to the Kabat EU numbering system.
  • the Fc variant comprising the P228L and M428L amino acid substitutions of the present invention are 234, 264, 269, 292, 309, 342, 359, 364, 368, 388, according to the Kabat EU numbering system.
  • Said additional amino acid substitutions may be L309R and N434S.
  • the additional amino acid substitutions can be V264M, L368Q, E388D, V422D and P445S.
  • Said additional amino acid substitutions may be R292L, T359A and S364G.
  • Said additional amino acid substitutions may be L234F, E269D, Q342L, E388D and T394A.
  • substituted Fc variants of the invention comprise the following amino acid substitutions according to the Kabat EU numbering system: a) M428L; And b) P230Q or P230S.
  • the a) M428L of the present invention; And b) an Fc variant comprising an amino acid substitution at the P230Q or P230S position comprises at least one additional amino acid substitution selected from the group consisting of amino acids 243, 246, 295, 320, 356, 361, 384 and 405 according to the Kabat EU numbering system. It includes.
  • Said additional amino acid substitutions may be F243Y, K246E, N361S and N384I.
  • Said additional amino acid substitutions may be Q295L, K320M, D356E and F405I.
  • the present invention relates to Fc variants comprising amino acid substitutions that regulate binding and dissociation to neonatal Fc receptors (FcRn).
  • FcRn neonatal Fc receptors
  • it includes Fc variants that exhibit increased binding affinity for FcRn at acidic conditions (pH conditions lower than pH 7) and very low FcRn binding capacity at neutral pH conditions, or functional variants thereof.
  • the "antibody therapeutic agent" to increase the half-life herein is not particularly limited, and may be a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, a minibody, a domain antibody, a bispecific antibody, an antibody mimetic, a chimeric antibody, Antibody conjugates, human antibodies or humanized antibodies or fragments thereof.
  • human antibodies such as panitumumab (Vectibix), opatumumab (Azera), golimumab (symphony), and pyrimumab (honey); Tocilizumab (actemra), trastuzumab (herceptin), bevacizumab (avastin), omalizumab (zole), mepolizumab (bosatria), gemtuzumab ozogamycin (mylotarg), palivizumab
  • Humanized antibodies such as (sinazis), ranibizumab (Lucentis), certolizumab (Simzia), orellilizumab, mogamulizumab (potelgio), eculizumab (Soliris);
  • chimeric antibodies such as rituximab (rituxan), cetuximab (erbitux), infliximab (reduced), and basil
  • a "protein therapeutic agent" to increase the half-life is not particularly limited, and cytokines such as hormones such as insulin, growth factor, interferon, interleukin, erythropoietin, neutrophil growth factor, and transforming growth factor.
  • Fc such as Itanercept (Enbrel), Apribercept (Iria, Saltrap), Avatarcept (Orencia), Allerpacept (Amebib), Bellatacept (Nurologics), Lilonacept (Alkalist) Fusion Proteins, Terriparatide (Porteo), Exenatide (Vieta), Liraglutide (Victoza), Llanretide (Somatulin), Pramline Tide (Simelin), Enpulbletide (Pugeon) And peptides for all or part of cell surface receptors such as peptide therapeutic agents, VEGF receptors, Her2 receptors, G-protein-linked receptors, ion channels and the like.
  • the antibody or protein therapeutic agent may be conjugated to a polypeptide of the present invention or a nucleic acid encoding the same, or inserted into a vector for expressing the nucleic acid, thereby being useful for increasing their half-life.
  • the Fc variant has a binding affinity for FcRn at pH 5.6 to 6.4 (preferably pH 5.8 to 6.2) of at least 10%, 20% compared to the wild type Fc domain. At least, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90% or at least 100%, or at least two times, at least three times, or at least four times the wild-type Fc domain.
  • the Fc variant has the same or substantially dissociated from the neonatal Fc receptor (FcRn) at pH 7.0 to 7.8 (preferably pH 7.2 to 7.6) as compared to the wild type Fc domain. May not be changed.
  • FcRn neonatal Fc receptor
  • the substituted Fc variants of the present invention exhibited significantly improved binding affinity at weakly acidic conditions (eg pH 5.8 to 6.2) compared to wild type Fc or other developed Fc variants. In neutral conditions (eg pH 7.4), the same, substantially equivalent or higher levels of dissociation were shown (Examples 4 and 8).
  • the substituted Fc variant of the present invention has an increased half-life compared to the wild type.
  • the half-life of the substituted Fc variants of the invention is at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, 90% as compared to the wild type Fc domain. Or at least 100% or at least 2 times, at least 3 times, at least 4 times, at least 5 times, at least 6 times, at least 7 times, at least 8 times, at least 9 times, or at least 10 times more than the wild-type Fc domain. have.
  • the substituted Fc variant of the present invention showed significantly improved in vivo half-life compared to wild type (Example 11, Table 3).
  • Fc gamma receptor or “Fc ⁇ R” refers to any member of the protein family that binds to the IgG antibody Fc region and is encoded by the Fc ⁇ R gene. Examples thereof include Fc ⁇ RI (CD64) including Fc ⁇ RIa, Fc ⁇ RIb and Fc ⁇ RIc; Fc ⁇ RII (CD32), including Fc ⁇ RIIa, Fc ⁇ RIIb and Fc ⁇ RIIc; And Fc ⁇ RIII (CD16), including Fc ⁇ RIIIa and Fc ⁇ RIIIb, and any undiscovered Fc ⁇ R or Fc ⁇ R.
  • Fc ⁇ R includes humans, mice, rats, rabbits, and monkeys, but may be derived from any other organism.
  • FcRn or “neonatal Fc receptor” refers to a protein that binds to an IgG antibody Fc region and is at least partially encoded by the FcRn gene.
  • the FcRn includes humans, mice, mice, rabbits and monkeys, but may be derived from any organism.
  • Functional FcRn proteins include two polypeptides called light and heavy chains. The light chain is beta-2-microglobulin and the heavy chain is encoded by the FcRn gene.
  • the invention provides an antibody comprising the polypeptide.
  • antibody herein refers to polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, minibodies, domain antibodies, bispecific antibodies, antibody mimetics, chimeric antibodies, antibody conjugates, human antibodies or humanized antibodies. Or a fragment thereof (eg, an antibody fragment that binds an antigen).
  • the present invention can maximize the half-life of the Fc domain or polypeptide comprising the same through optimization of the antibody Fc region (eg, M428L and Q311R; or M428L and L309G, etc.).
  • the antibody Fc region eg, M428L and Q311R; or M428L and L309G, etc.
  • the present invention provides a nucleic acid molecule encoding the polypeptide, a vector comprising the nucleic acid molecule or a host cell comprising the vector.
  • Nucleic acid molecules of the invention can be isolated or recombinant and include single and double stranded DNA and RNA as well as corresponding complementarity sequences.
  • An "isolated nucleic acid” is a nucleic acid isolated from a naturally occurring source, from a surrounding genetic sequence present in the genome of the individual from which the nucleic acid is isolated. In the case of nucleic acids, such as PCR products, cDNA molecules, or oligonucleotides synthesized enzymatically or chemically from a template, the nucleic acid resulting from this procedure can be understood as an isolated nucleic acid molecule.
  • Isolated nucleic acid molecules refer to nucleic acid molecules in the form of separate fragments or as components of larger nucleic acid constructs.
  • Nucleic acids are “operably linked” when placed in a functional relationship with other nucleic acid sequences.
  • the DNA of a presequence or secretion leader is operably linked to the DNA of a polypeptide when expressed as a preprotein, which is the form before the polypeptide is secreted, and the promoter or enhancer is a polypeptide sequence.
  • Operably linked to a coding sequence when affecting the transcription of the ribosome binding site, or when the ribosome binding site is arranged to facilitate translation.
  • "operably linked” means that the DNA sequences to be linked are located contiguously, and in the case of a secretory leader, they are present within adjacent identical reading frames. However, enhancers do not have to be contiguous. Linking is accomplished by ligation at convenient restriction enzyme sites. If such sites do not exist, the synthetic oligonucleotide adapters or linkers are used in accordance with conventional methods.
  • vector refers to a carrier capable of inserting a nucleic acid sequence for introduction into a cell capable of replicating the nucleic acid sequence.
  • Nucleic acid sequences can be exogenous or heterologous.
  • Vectors include, but are not limited to, plasmids, cosmids and viruses (eg bacteriophages).
  • plasmids include, but are not limited to, plasmids, cosmids and viruses (eg bacteriophages).
  • viruses eg bacteriophages.
  • One skilled in the art can construct vectors by standard recombinant techniques (Maniatis, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988; and Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology , John, Wiley & Sons, Inc, NY, 1994, etc.).
  • expression vector refers to a vector comprising a nucleic acid sequence encoding at least a portion of the gene product being transcribed. In some cases, RNA molecules are then translated into proteins, polypeptides, or peptides. Expression vectors can include various regulatory sequences. In addition to regulatory sequences that regulate transcription and translation, vectors and expression vectors can also include nucleic acid sequences that provide additional functionality.
  • the term "host cell” refers to any transgenic organism that includes eukaryotes and prokaryotes and is capable of replicating the vector or expressing a gene encoded by the vector.
  • the host cell may be transfected or transformed by the vector, which means a process in which exogenous nucleic acid molecules are delivered or introduced into the host cell.
  • the host cell of the present invention preferably includes bacterial cells, CHO cells, HeLa cells, HEK293 cells, BHK-21 cells, COS7 cells, COP5 cells, A549 cells, NIH3T3 cells and the like, but is not limited thereto. no.
  • the invention provides a method for producing a polypeptide comprising a human antibody Fc variant comprising the steps of:
  • the present invention provides a method for producing an antibody comprising the following steps:
  • purification of the antibody may include filtration, HPLC, anion exchange or cation exchange, high performance liquid chromatography (HPLC), affinity chromatography, or a combination thereof, preferably Protein Affinity chromatography using A can be used.
  • the invention provides a method for screening a polypeptide comprising Fc variants comprising the following steps:
  • Fc variants comprising the M428L mutation of the invention may comprise additional amino acid substitutions.
  • further amino acid substitutions of the invention comprise a Q311R or L309G mutation.
  • additional amino acid substitutions of the invention comprise a P228L mutation.
  • Fc variants comprising the P228L mutation of the invention may comprise additional amino acid substitutions.
  • the additional amino acid substitutions are not particularly limited and are preferably composed of amino acids 234, 264, 269, 292, 309, 342, 359, 364, 368, 388, 394, 422, 434 and 445 according to the Kabat EU numbering system. Mutations in one or more amino acids selected from the group.
  • further amino acid substitutions of the invention comprise a P230Q or P230S mutation.
  • Fc variants comprising a mutation at the P230 position of the invention may comprise additional amino acid substitutions.
  • the additional amino acid substitutions are not particularly limited and preferably include mutations in at least one amino acid selected from the group consisting of amino acids 243, 246, 295, 320, 356, 361, 384 and 405 according to the Kabat EU numbering system. .
  • the screening methods of the present invention can use fluorescence labeled cell separation (FACS) screening, or other automated flow cytometry techniques.
  • FACS fluorescence labeled cell separation
  • Instruments for performing flow cytometry are known to those skilled in the art. Examples of such devices are FACSAria, FACS Sta Plus, FACScan and FACSort devices (Becton Dickinson, Foster City, CA), Epics C (Coulter Epics Division, Hialeah, FL), MOFLO (Cytomation, Colorado Springs, Colo.), MOFLO -XDP (Beckman Coulter, Indianapolis, IN).
  • Flow cytometry techniques generally include the separation of cells or other particles in a liquid sample.
  • a flow cytometer typically the purpose of a flow cytometer is to analyze the separated particles for their one or more properties (eg the presence of labeled ligands or other molecules). Particles are passed one by one by the sensor and are classified based on size, refraction, light scattering, opacity, roughness, shape, fluorescence, and the like.
  • the invention provides a composition comprising the polypeptide, the antibody, the nucleic acid molecule or the vector comprising an Fc variant comprising the amino acid substitution.
  • the composition of the present invention is a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer.
  • the pharmaceutical composition (or polypeptide, antibody, nucleic acid molecule or vector) of the invention recognizes a cancer antigen.
  • the Fc variant of the present invention exhibits equivalent or more antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity compared to the control (eg, trastuzumab), resulting in high anti-cancer activity in addition to the significant half-life increase. (Example 13, FIG. 18).
  • ADCC antibody dependent cellular cytotoxicity
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises (a) a polypeptide, an antibody, a nucleic acid molecule encoding the polypeptide or a vector comprising the nucleic acid molecule; And (b) a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer, comprising administering the pharmaceutical composition to a subject.
  • the type of cancer to be prevented or treated by the present invention is not limited, leukemias and acute lymphocytic leukemia, acute nonlymphocytic leukemias, chronic lymphocytic leukemia, chronic lymphocytic leukemia Lymphomas, brain tumors, neuroblastoma, such as myelogenous leukemia, Hodgkin's Disease, non-Hodgkin's lymphomas, and multiple myeloma Childhood solid tumors such as retinoblastoma, Wilms Tumor, bone tumors and soft-tissue sarcomas, lung cancer, breast cancer cancer, prostate cancer, urinary cancers, uterine cancers, oral cancers, pancreatic cancer, melanoma and other skin cance rs, stomach cancer, ovarian cancer, brain tumors, liver cancer, laryngeal cancer, thyroid cancer, esophageal cancer and testicular cancer It may be administered to treat a number of cancers, including common solid tumors of adults
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical compositions of the present invention are those commonly used in the preparation, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like It doesn't happen.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • a lubricant e.g., talc, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, a kaolin, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mann
  • compositions of the present invention may be administered orally or parenterally, preferably parenterally, for example, by intravenous infusion, topical infusion and intraperitoneal infusion.
  • Subject of administration of the pharmaceutical composition of the present invention is not limited, but preferably, vertebrates, more preferably humans, primates including chimpanzees, pets such as dogs, cats, cattle, horses, sheep, goats, etc. Is understood to include mammals such as rodents such as domestic animals, mice, and rats.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the invention vary depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, condition of food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to reaction, Usually a skilled practitioner can easily determine and prescribe a dosage effective for the desired treatment or prophylaxis.
  • the daily dose of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.0001-100 mg / kg.
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dosage form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or an aqueous medium, or may be in the form of extracts, powders, granules, tablets or capsules, and may further include a dispersant or stabilizer.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be used as a single therapy, but may also be used in combination with other conventional chemotherapy or radiation therapy, and when the combination therapy is performed, cancer treatment may be more effectively performed.
  • Chemotherapeutic agents that can be used with the compositions of the present invention are cisplatin, carboplatin, procarbazine, mechlorethamine, cyclophosphamide, phospho Ifosfamide, melphalan, chlorambucil, bisulfan, nitrosourea, diactinomycin, daunorubicin, doxorubicin , Bleomycin, plecomycin, mitomycin, etoposide, tamoxifen, taxol, transplatinum, 5-fluoro 5-fluorouracil, vincristin, vinblastin, methotrexate, and the like.
  • Radiation therapy that can be used with the composition of the present invention is X-ray irradiation and ⁇ -ray irradiation and the
  • the present invention provides a polypeptide comprising an Fc variant in which a part of the amino acid sequence of the human antibody Fc domain is substituted with another amino acid sequence, or an antibody comprising the same.
  • the present invention also provides a method for producing the polypeptide or antibody.
  • the Fc variant of the present invention can maximize half-life in the body through optimization of some amino acid sequences, and can be usefully used for the treatment of cancer.
  • Figure 1 shows the expression vector and purification SDS-PAGE gel photograph for the expression and purification of terameric FcRn and dimeric FcRn.
  • Figure 2 shows a library schematic for making 18 amino acids in M252 and M428.
  • 3 shows the 2M library search process and selected M428L variants.
  • FIG. 4 shows a schematic diagram of an error library and a point library produced based on M428L.
  • FIG. 5 shows the results of FACS fluorescence intensity measurement of the variants found in the Error library (FIG. 5A) and the point library (FIG. 5B).
  • FIG. 6 shows plasmids for expressing trastuzumab heavy and light chains in animal cells.
  • Figure 9 shows the results of the comparison of the properties of the commercial trastuzumab and trastuzumab produced in the laboratory by N-Glycan profiling.
  • FIG. 13 shows a result of measuring binding force between trastuzumab Fc variant and hFcRn at pH 6.0 and 7.4 by BiaCore (a: pH 6.0 (capture method) b: measurement of binding force at pH 7.4 (Avid Format)).
  • FIG. 14 shows the pharmacokinetic comparison of commercial and laboratory-made trastuzumab in normal mice (C57BL / 6J (B6)) and human FcRn Tg mice.
  • Figure 16 shows the results of Fc ⁇ Rs binding force measurement of trastuzumab Fc variant using ELISA.
  • Figure 17 shows the result of comparing the Effector Function of the trastuzumab Fc variant compared to the normal IgG and the control (trastuzumab) (ADCC assay).
  • FIG. 18 shows Effector Function (ADCC) comparison results of Trastuzumab Fc variants.
  • Figure 19 shows the results of measuring the C1q binding force of the trastuzumab Fc variant using ELISA.
  • Expression vector was prepared to perform the expression and purification of terameric FcRn and dimeric FcRn in order to search for Fc variants with enhanced pH-dependent binding to FcRn (Fig. 1).
  • a DNA plasmid of pMAZ- ⁇ 2 microglobulin-GSlinker-FcRn ⁇ -chain-streptavidin-His was obtained. This DNA was co-transfected into HEK 293F cells and transiently expressed on a 300 ml scale. The culture solution was removed by centrifugation at 7000 rpm for 10 minutes, the supernatant was taken and equilibrated with 25x PBS.
  • E. coli Jude1 ((F '[Tn 10 ( Tet r ) proAB + lacI q ⁇ ( lacZ ) M15] mcrA ⁇ ( mrr - hsdRMS - mcrBC ) ⁇ 80d lac Z ⁇ M15 ⁇ lacX74 deoR recA1 araD139 ⁇ ( ara leu ) 7697 galU galKrpupGend ) was transformed to construct a large Fc variant 2M library (library size: 1 ⁇ 10 9 ).
  • the cells were collected and harvested by centrifugation for 1 minute at 14000 rpm for 1 minute by OD600 normalize. 1 ml of 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) was added to resuspend the cells and centrifuged for 1 minute. The outer membrane was removed by resuspending with 1 ml of STE [0.5 M sucrose, 10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA (pH 8.0)] and rotating at 37 ° C. for 30 minutes.
  • STE 0.5 M sucrose, 10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA (pH 8.0)
  • the supernatant was removed, resuspended in 1 ml of PBS, 300 ⁇ l was taken, and 700 ⁇ l of PBS and a fluorescently labeled tetrameric Fc ⁇ RIIIa-Alexa 488 flour probe were put together and rotated at room temperature to label the fluorescent probe on spheroplast.
  • the cells were washed once with 1 ml of PBS and sorted to recover the top 3% cells with high fluorescence using a flow cytometry (S3 sortor (Bio-rad)). Selected cells were resorted again to increase the purity of these high cells.
  • Two additional libraries were produced using the excavated M428L as a template.
  • error libraries were prepared by introducing mutations into Fc using error prone PCR. Error rate was a library (library size: 2 ⁇ 10 8 ) using ep-Fc-Fw, ep-Fc-Rv primers so that 0.3% error (2.04 bp) in Fc (680 bp).
  • the second library uses M428L as a template, selects Fc and FcRn binding sites, and introduces pMopac12-seq-Fw, pMopac12-seq-Rv, Fc-Sub # 0-Rv, and Fc-Sub to randomly introduce mutations into the sites.
  • Example 4 Fc variant error and point library search using bacterial culture and flow cytometry and variant selection such as PFc3, PFc29, PFc41, EFc29, EFc41, EFc82, EFc88
  • Mutation sites are EU indices such as Kabat EU numbering system (Kabat et al., In “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5th Ed., US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991). According to the number.
  • the wild-type trastuzumab gene was synthesized (Genscript) from the amino acid sequence of the Drug Bank (http://www.drugbank.ca/) by the mammalian codon optimization at the same time.
  • the synthesized trastuzumab heavy chain gene was subcloned to the pOptiVEC-Fc vector and the trastuzumab light chain gene to the pDNA3.3 vector, respectively (FIG. 6).
  • Animal cell expression plasmids encoding the trastuzumab heavy and light chains were prepared, respectively, and expressed and purified in HEK293 cells.
  • wild-type trastuzumab was purified using Protein A affinity chromatography (AKTA prime plus, cat # 11001313) and gel filtration chromatography (HiTrap MabselectSure, GE, cat # 11-0034-95), 7.7 mg of high purity wild type trastuzumab was obtained from 300 ml culture (FIG. 7).
  • the in-house trastuzumab produced in the laboratory was produced by HEK293, so before incorporating selected Fc-variants to analyze its function, The basic characteristics of the form were analyzed. Analysis by Capillary Electrophoresis (PA800 Plus, Beckman coulter) was performed using Pharmalyte 3-10 carrier ampholytes (GE Healthcare, 17-0456-01) to form gradients of pH 3-10. Was analyzed.
  • Glycan analysis was performed by removing N-glycan from proteins using PNGase F (NEB, 186007990-1) and labeling using RapiFluor-MS reagent (Waters, 186007989-1), followed by UPLC system (Acquity UPLC I class, Waters, Analysis was performed using an FLR detector. Glycan analysis showed that the sugar pattern was similar, but only the difference in the content of each composition showed that the oxidation by sialic acid was not the cause, and that it was caused by the difference of production cell lines, and that there was no significant effect on the binding and pharmacokinetic analysis. (Data not shown) Produced by introducing selected Fc variants.
  • HEK293F animal cells were transfected into HEK 293F animal cells. It was. One day before transfection, HEK293F cells were passaged 300 ml at a density of 1 ⁇ 10 6 cells / ml and transfected with Polyethylenimine (PEI, Polyscience, 23966) the next day.
  • PEI Polyethylenimine
  • the heavy and light chain genes of the variants were first mixed at a ratio of 2: 1, followed by PEI: variant genes at a ratio of 1: 2, and left at room temperature for 20 minutes.
  • the cells were subcultured and mixed for 6 days at 37 ° C., 125 rpm, and 8% CO 2 in a shaking CO 2 incubator, followed by centrifugation to extract only the supernatant.
  • Protein purification from the supernatant was performed by affinity chromatography using AKTA prime plus equipped with a HiTrap MabselectSure column. 300 ml of the supernatant was flowed at a rate of 3 ml per minute, washed with 100 ml of 1xPBS, and then collected 6 sections of 5 ml of IgG Elution buffer (Thermo scientific, 21009) at a rate of 5 ml per minute and 1M. After neutralizing by mixing 500 ul of Tris (pH 9.0), each section was taken to a new tube by identifying proteins with Bradford (BioRad, 5000001) solution. Purified variants were concentrated using a 30K Amicon ultra centrifugal filter (UFC903096) and then analyzed for physical properties (FIGS. 10 and 11).
  • ELISA measurements were carried out to determine the Fc ⁇ Rs, C1q binding ability to express the FcRn pH-dependent binding capacity and effect function of the previously prepared variants.
  • 50 ⁇ l of IgG Fc variants diluted to 4 ⁇ g / ml in 0.05 M Na 2 CO 3 pH 9.6 were used to determine pH-dependent binding to FcRn at 4 ° C and 16 ° C on a Flat Bottom Polystyrene High Bind 96 well microplate (costar). After immobilization for 100 hours, 100 ⁇ l of 4% skim milk (GenomicBase) (in 0.05% PBST pH 5.8 / pH 7.4) was blocked at room temperature for 2 hours.
  • the K D values were measured and compared using the Biacore T200 (GE Healthcare) equipment to compare the differences between the commercial and laboratory-produced trastuzumab and other selected Fc variants with human FcRn according to pH. .
  • human FcRn was used as analyte by antigen-mediated antibody capture method according to Yeung YA. et al. , J. Immunol, 2009. Diluted Fc variant in running buffer (50 mM Phosphate, pH 6.0, 150 mM NaCl, 0.005% surfactant P20, pH 6.0) with ligand as a Fc variant on the surface of CM5 chip with HER2 ECD domain fixed at ⁇ 3,000 response units (RU) level.
  • running buffer 50 mM Phosphate, pH 6.0, 150 mM NaCl, 0.005% surfactant P20, pH 6.0
  • ligand as a Fc variant on the surface of CM5 chip with HER2 ECD domain fixed at ⁇ 3,000
  • Capture was by injection at 300 RU level.
  • Monomeric monomeric FcRn (Sinobiological inc., CT009-H08H) was sequentially diluted from 125 nM to FcRn running buffer, injected at 30 ul / min flow rate for 2 minutes, and dissociated for 2 minutes to measure binding force. In each cycle, regeneration was performed for 30 seconds at a flow rate of 30 ml / min of 10 mM Glycine (pH 1.5). Sensogram was analyzed by applying 1: 1 binding model in BIAevaluation software (Biacore).
  • the Fc variant had better binding than commercial trastuzumab (15 nM) used as a control and laboratory-made trastuzumab (16.9 nM) and 428L (9 nM) used as a backbone (PFc 3: 5.6 nM, PFc29: 6.8 nM, PFc 41: 5.9 nM, etc.), YTE (5.7 nM) and LS (4.1 nM), the world's best, the binding force was slightly lower, but the difference in the value was found to be similar within the margin of error.
  • the bound Fc variants were dissociated for 2 minutes and at the end of each cycle the chip surface was regenerated to 100 mM Tris (pH 9.0) (conatat time 30 seconds; flow rate 30 ul / min).
  • Tris pH 9.0
  • two Fc variants PFc29 and PFc41
  • PFc29 and PFc41 maintain high binding capacity at pH 6.0 and dissociate faster than YTE and LS at pH 7.4 (consistent with ELISA results).
  • Expected (FIG. 13) in vivo pharmacokinetic experiments were conducted in real human FcRn Tg mice.
  • PK analysis of B6 mice Central Laboratory Animal Center, C57BL / 6J (B6) with the same genetic background as human FcRn Tg mice showed that the affinity of normal mouse FcRn with Fc of human antibodies was FcRn and human antibodies were confirmed to be higher than Fc.
  • PK values in normal mice showed variations between laboratory and commercial antibodies and laboratory antibodies were unstable. Although the AUC is somewhat lower, the pharmacokinetic trends between laboratory and commercial antibodies were similarly measured. Therefore, it was confirmed that there was no problem in experimental measurement of laboratory-derived Fc variants produced in HEK293 in actual in vivo pharmacokinetic analysis in Tg mice (FIG. 14).
  • T max time at maximal concentration
  • C 0 extrapolated zero time concentration
  • C max maximal concentration
  • AUC last area under the curve from administration to the last measured concentration
  • AUC inf area under the curve from administration to infinity
  • AUC % Extrap percentage of the extrapolated area under the curve at the total area under the curve
  • V z volume of distribution
  • CL clearance.
  • Immobilized IgG Fc variants diluted to 4 ⁇ g / ml in 0.05 M Na 2 CO 3 pH 9.6 to measure binding to Fc ⁇ Rs were immobilized on a Flat Bottom Polystyrene High Bind 96 well microplate (costar) at 4 ° C. for 16 hours. After blocking, 100 ⁇ l of 4% skim milk (GenomicBase) (in 0.05% PBST pH 7.4) was blocked at room temperature for 2 hours. After washing four times with 180 ⁇ l of 0.05% PBST (pH 7.4), Fc ⁇ Rs serially dilution with 1% skim milk (in 0.05% PBST pH 7.4) were dispensed into 50 ⁇ l of each well for 1 hour at room temperature. .
  • FcRs were subjected to antibody reaction at room temperature for 1 hour using anti-GST-HRP conjugate (GE Healthcare) at 50 ⁇ l each, followed by washing. 50 ⁇ l of 1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution (Thermo Fisher Scientific) was added and developed. Then, 50 ⁇ l of 2 MH 2 SO 4 was added to terminate the reaction, and analyzed using Epoch Microplate Spectrophotometer (BioTek).
  • ADCC Antibody dependent cell-mediated cytotoxicity activity of Trastuzumab Fc variant was assessed using the ADCC reporter bioassay kit (Promega, G7010). Specifically, SKBR-3 used as target cells was dispensed into each well of a 96-well tissue culture plate by 5 ⁇ 10 3 cells / 100 ⁇ l and incubated for 20 hours in a 37 ° C. CO 2 incubator. After 20 hours, 95 ⁇ l of the culture medium was removed from each well of the plate using a multi-pipette, and 25 ⁇ l of ADCC assay buffer provided in the ADCC Reporter Bioassay Kit was dispensed into each well.
  • ADCC reporter bioassay kit Promega, G7010
  • Normal IgG, trastuzumab and trastuzumab Fc variants were prepared by diluting them in ADCC assay buffer at different concentrations, aliquoting 25 ⁇ l per well of the 96-well tissue culture plate containing the cells and adding effector cells. Placed at room temperature.
  • the effector cells provided in the kit were dissolved for 2-3 minutes in a 37 ° C. constant temperature water bath, and 630 ⁇ l of the effector cells were mixed with 3.6 mL of ADCC assay buffer.
  • the effector cells prepared on the plate containing the target cells and the antibody dilution were dispensed 25 ⁇ l per well and reacted for 6 hours in a 37 ° C. CO 2 incubator.
  • ADCC activity of trastuzumab and trastuzumab Fc variants (LS, YTE, PFC29 and PFC41) against SKBR-3 was compared (FIG. 17).
  • ADCC activity of each test substance was about 1.5 times higher for LS, 1.18 times higher for PFc29, and 1.27 times higher for PFc41, compared to positive control, Trastuzumab.
  • Pear showed low activity.
  • the two trastuzumab Fc variants (PFc29 and PFc41) and the control variant LS showed 1.18-1.5-fold improved ADCC activity compared to the conventional control (Trastuzumab).
  • Immobilized IgG Fc variants diluted to 4 ⁇ g / ml in 0.05 M Na 2 CO 3 pH 9.6 to measure binding to C1q were immobilized on a Flat Bottom Polystyrene High Bind 96 well microplate (costar) at 4 ° C for 16 hours. Thereafter, 100 ⁇ l of 4% skim milk (GenomicBase) (in 0.05% PBST pH 7.4) was blocked at room temperature for 2 hours. After washing 4 times with 180 ⁇ l of 0.05% PBST (pH 7.4), 50 ⁇ l of each well of serially diluted Complement C1q Human (Millipore) with 1% skim milk (in 0.05% PBST pH 7.4) was dispensed at room temperature.
  • the reaction was carried out for 1 hour. After the washing process, the anti-C1q-HRP conjugate (Invitrogen) was used for 50 ⁇ l each to carry out the antibody reaction at room temperature for 1 hour and the washing process was performed. 50 ⁇ l of 1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution (Thermo Fisher Scientific) was added and developed. 50 ⁇ l of 2 MH 2 SO 4 was added to terminate the reaction. The reaction was analyzed using Epoch Microplate Spectrophotometer (BioTek). As a result of the analysis, the binding force of PFc29 found in this study was higher than that of LS and YTE in C1q binding force (Fig. 19).

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Abstract

본 발명은 인간 항체 Fc 도메인의 아미노산 서열 중 일부가 다른 아미노산 서열로 치환된 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 이를 포함하는 항체에 관한 것이다. 본 발명의 Fc 변이체는 광범위한 항체 및 Fc 융합체 산물에 있어서의 용도를 가질 수 있다. 일면에 있어서, 본 발명의 항체 또는 Fc 융합체는 치료용, 진단용, 또는 연구용 시약(reagent), 바람직하게는 치료용 시약이다. 본 발명의 Fc 변이체는 일부 아미노산 서열의 최적화를 통하여 체 내 반감기를 극대화 할 수 있으며, 암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 항체 및 Fc 융합체는 표적 항원, 예를 들어, 암 세포를 함유하는 표적 세포를 죽이는 데에 사용된다. 대안적으로, 본 발명의 항체 및 Fc 융합체는, 예를 들어 사이토카인 또는 사이토카인 수용체에 대하여 길항 작용하기 위하여, 표적 항원을 블로킹하거나, 길항 작용하거나, 또는 방해하는 데 사용된다.

Description

혈중 반감기 향상을 위한 항체 Fc 변이체들
본 발명은 혈중 반감기가 향상된 신규한 항체 Fc 변이체들 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
전 세계적으로 유전자 재조합, 세포 배양 등 생명공학기술의 발달에 따라 단백질의 구조와 기능에 대한 연구가 활발히 진행되어왔으며, 이는 생명현상에 대한 이해를 높일 뿐만 아니라, 각종 질병들의 발병 기작을 규명하는데 결정적 역할을 함으로써 효과적인 질병 진단과 치료의 길을 마련해 삶의 질 향상에 크게 기여 하고 있다. 특히, 1975년에 B 세포(B Cell)와 골수암 세포(Myeoloma cell)를 융합하여 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 기술(Hybridoma technology)이 개발(Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497, 1975)되면서 암, 자가면역질환, 염증, 심혈관 질환, 감염 등의 임상 분야에서 치료용 항체를 이용한 면역 치료(Immunotherapy)에 대한 연구개발이 활발히 이루어지고 있다.
치료용 항체는 기존의 저분자 약물에 비해 타깃에 매우 높은 특이성을 보이며, 생체 독성이 낮고 부작용이 적을 뿐만 아니라, 약 3주의 우수한 혈중 반감기를 가지기 때문에 가장 효과적인 암 치료방법 중의 하나로 여겨지고 있다. 실제로 전 세계의 거대 제약회사들과 연구소들에서 암 발병 원인인자를 비롯한 암세포에 특이적으로 결합하여 효과적으로 제거하는 치료용 항체의 연구 개발에 박차를 가하고 있다. 치료용 항체 의약품 개발 기업으로는 로슈, 암젠, 존슨앤존슨, 애보트, 비엠에스 등의 제약 기업이 주를 이루고 있으며, 특히 로슈는 항암 치료 목적의 허셉틴 (Herceptin), 아바스틴 (Avastin), 리툭산 (Rituxan) 등이 대표적 상품으로 이 세 가지 치료용 항체로 2012년 세계시장에서 약 195억 달러의 매출을 달성하는 등 큰 이윤을 창출하고 있을 뿐 아니라, 세계의 항체 의약품 시장을 이끌고 있다. 레미케이드(Remicade)를 개발한 존슨앤존슨 역시 매출의 증가로 세계 항체 시장에서 빠르게 성장해나가고 있으며, 애보트와 비엠에스 등의 제약 기업 역시 개발 막바지 단계의 치료용 항체를 다수 보유하고 있는 것으로 알려져 있다. 이에 따른 결과로 저분자 의약품이 주도권을 가지고 있던 세계 제약 시장에서 질병 타깃에 특이적이고 부작용이 낮은 치료용 항체를 포함한 바이오 의약품이 빠르게 그 자리를 대체해 나가고 있다.
항체의 Fc 부위는 면역 백혈구 또는 혈청 보체 분자를 모집하여, 암세포 또는 감염된 세포와 같은 손상된 세포들이 제거될 수 있도록 역할을 한다. Cγ2 및 Cγ3 도메인 사이의 Fc 상의 부위는 신생(neonatal) 수용체 FcRn과의 상호 작용을 매개하며, 그의 결합은 엔도솜(endosome)으로부터 혈류(bloodstream)로 세포내 이입된 항체를 재순환시킨다(Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12: 181-220; Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18: 739-766). 이 과정은, 전체 길이 IgG (full-length IgG) 항체 분자의 거대한 크기에 기인하여, 신장 여과(kidney filtration)에 의한 체내 제거 감소와 연관되어, 1주 내지 3주 범위의 유리한 항체 혈청 반감기(antibody serum half-life)를 갖는다. 또한, FcRn에 대한 Fc의 결합은 항체 운반에 있어서도 중요한 역할을 담당한다. 따라서, Fc 부위는 세포 내 수송(intracellular trafficking) 및 리사이클 기작을 통하여 항체가 순환되어 연장된 혈청 지속성(prolonged serum persistence)을 유지하는데 필수적인 역할을 한다.
치료제로서 항체 또는 Fc 융합 단백질의 투여는 반감기의 특성을 고려하여, 정해진 빈도의 주사를 필요로 한다. 생체 내에서 더욱 긴 반감기는 더욱 낮은 빈도의 주사 또는 더욱 적은 투여량을 가능하게 하는 명백한 장점이 있다. 이에 따라, 현재 진행되고 있는 많은 임상연구에서 항체의 반감기를 증가시키기 위해 Fc 부위에 돌연변이를 도입하거나 ADCC 효과를 극대화시키기 위해 변이를 도입한 Fc 도메인을 통해 차세대 항암 항체 치료제나 항암 단백질 치료제 개발에 많은 노력을 쏟고 있다 (Modified from Cancer Immunol Res. 2015 / Thomson Reuters).
하지만, 상기 연구진에서 Fc 도메인에 일부 돌연변이를 도입하여 증가된 FcRn 결합 친화성 및 생체 내 반감기를 갖는 일부 단백질 및 항체를 발굴하기 위해 노력하고 있지만, 아직까지 생체 내 반감기를 크게 향상시키지 못하고 있는 것이 현실이며, 보다 최적화된 돌연변이를 도입한 항체의 개발이 절실히 요구되는 상황이다.
상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 될 것이다.
본 발명자들은 기존의 단백질 또는 항체 치료제의 체 내 반감기를 효율적으로 증가시키기 위한 예의 노력을 하였다. 그 결과, 야생형 Fc 도메인의 일부 아미노산 서열을 다른 아미노산 서열로 치환하여 최적화함으로써, 단백질 또는 항체 치료제의 우수한 활성을 보유하면서 혈중 반감기를 극대화 시킬 수 있는 방법을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 인간 항체 Fc 도메인의 아미노산 서열 중 일부가 다른 아미노산 서열로 치환된 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산분자를 포함하는 벡터를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드, 항체, 핵산분자 또는 벡터를 포함하는 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드 또는 항체의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리펩타이드의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 인간 항체 Fc 도메인의 아미노산 서열 중 일부가 다른 아미노산 서열로 치환된 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 인간 항체 Fc 도메인의 아미노산 서열 중 일부가 다른 아미노산 서열로 치환된 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 항체 또는 단백질 치료제의 혈중 반감기(Half-life) 증가용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 기존의 단백질 또는 항체 치료제의 체 내 반감기를 효율적으로 증가시키기 위한 방법으로 야생형 Fc 도메인의 일부 아미노산 서열을 다른 아미노산 서열로 치환 및 최적화하여 Fc 변이체를 제조함으로써, 이를 포함하는 단백질 또는 항체 치료제의 반감기를 극대화 시킬 수 있는 방법을 찾고자 하였다.
항체는 특정 항원에 특이적으로 결합을 나타내는 단백질로, 천연 항체는 통상 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된, 약 150,000 달톤의 헤테로다이머 당단백질이다.
본 발명에서 사용되는 인간 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개의 주요 클래스가 있으며, 바람직하게는 IgG이다. 항체의 파파인 분해는 2개의 Fab 단편과 1개의 Fc 단편을 형성하며, 인간 IgG 분자에서, Fc 영역은 Cys 226의 N-말단을 파파인 분해함으로써 생성된다(Deisenhofer, Biochemistry 20: 2361-2370, 1981).
항체 Fc 도메인은 IgA, IgM, IgE, IgD, 또는 IgG 항체의 Fc 도메인, 혹은 이들의 변형일 수 있다. 일 실시 양태에 있어서는 상기 도메인은 IgG 항체의 Fc 도메인(예를 들면 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, 또는 IgG4 항체의 Fc 도메인)이다. 일 실시 양태에 있어서는 상기 Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인(예를 들면 항HER2 항체의 Fc 도메인, 바람직하게는 트라스트주맙의 Fc 도메인, 보다 바람직하게는 서열목록 제28서열의 Fc 도메인)일 수 있다. 본 발명의 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드는 폴리펩타이드 일부 또는 전체가 당화되어 있지 않거나 당화되어 있을 수 있다. 또한, 폴리펩타이드에 Fc 도메인에 더해 항체에서 유래하는 하나 이상의 영역이 포함될 수도 있다. 추가적으로, 상기 폴리펩타이드에는 항체 유래의 항원 결합 도메인(antigen binding domain)이 포함될 수도 있으며, 복수의 폴리펩타이드가 항체 또는 항체형 단백질을 형성할 수도 있다.
본 명세서에서 항체 Fc 도메인의 아미노산 잔기 번호는 당업계에서 통상적으로 사용되는 카밧 EU 넘버링 시스템(Kabat EU numbering system)에 따른다(Kabat et al., in "Sequences of Proteins of Immunological Interest" 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991에서와 같은 EU 지수번호)(EU numbering as described in the Kabat et al. (1991)과 같은 의미).
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 치환된 Fc 변이체는 카밧 EU 넘버링 시스템에 따른 M428L의 아미노산 치환을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 치환된 Fc 변이체는 카밧 EU 넘버링 시스템에 따른 하기의 아미노산 치환을 포함한다: a) M428L; 및 b) Q311R 또는 L309G.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 치환된 Fc 변이체는 카밧 EU 넘버링 시스템에 따른 P228L 및 M428L의 아미노산 치환을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 상기 P228L 및 M428L 아미노산 치환을 포함하는 Fc 변이체는 카밧 EU 넘버링 시스템에 따른 234, 264, 269, 292, 309, 342, 359, 364, 368, 388, 394, 422, 434 및 445번 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 추가적인 아미노산 치환을 포함한다.
상기 추가적인 아미노산 치환은 L309R 및 N434S일 수 있다.
상기 추가적인 아미노산 치환은 V264M, L368Q, E388D, V422D 및 P445S일 수 있다.
상기 추가적인 아미노산 치환은 R292L, T359A 및 S364G일 수 있다.
상기 추가적인 아미노산 치환은 L234F, E269D, Q342L, E388D 및 T394A일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 치환된 Fc 변이체는 카밧 EU 넘버링 시스템에 따른 하기의 아미노산 치환을 포함한다: a) M428L; 및 b) P230Q 또는 P230S.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 상기 a) M428L; 및 b) P230Q 또는 P230S 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 Fc 변이체는 카밧 EU 넘버링 시스템에 따른 243, 246, 295, 320, 356, 361, 384 및 405번 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 추가적인 아미노산 치환을 포함한다.
상기 추가적인 아미노산 치환은 F243Y, K246E, N361S 및 N384I일 수 있다.
상기 추가적인 아미노산 치환은 Q295L, K320M, D356E 및 F405I일 수 있다.
본 발명은 FcRn(neonatal Fc receptor)에 대한 결합 및 해리를 조정하는 아미노산 치환을 포함하는 Fc 변이체에 관한 것이다. 특히, 산성 조건 (pH 7 보다 낮은 pH 조건)에서 FcRn에 대한 증가된 결합 친화도(binding affinity)를 나타내고, 중성 pH 조건 에서는 매우 낮은 FcRn 결합력을 보이는 Fc 변이체, 또는 그의 기능적 변이체를 포함한다.
본 명세서에서 반감기를 증가시키고자 하는“항체 치료제"는 특별히 제한되지 않으며, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 미니바디(minibody), 도메인 항체, 이중특이적 항체, 항체 모방체, 키메라 항체, 항체 접합체(conjugate), 인간항체 또는 인간화 항체이거나 이의 단편을 포함한다.
모노클로날 항체로서는, 예를 들어 파니투무맙(벡티빅스), 오파투무맙(아르제라), 골리무맙(심포니), 이피리무맙(여보이) 등의 인간 항체; 토실리주맙(악템라), 트라스투주맙(허셉틴), 베바시주맙(아바스틴), 오말리주맙(졸레어), 메폴리주맙(보사트리아), 겜투주맙 오조가마이신(마일로타그), 팔리비주맙(시나지스), 라니비주맙(루센티스), 서톨리주맙(심지아), 오크렐리주맙, 모가물리주맙(포텔리지오), 에쿨리주맙(솔리리스) 등의 인간화 항체; 리툭시맙(리툭산), 세툭시맙(얼비툭스), 인플릭시맙(레미케이드), 바실리시맙(시뮬렉트) 등의 키메라 항체 등을 들 수 있다.
본 명세서에서 반감기를 증가시키고자 하는"단백질 치료제"는 특별히 제한되지 않으며, 인슐린 등의 호르몬, 성장인자(Growth Factor), 인터페론, 인터류킨, 에리트로포이에틴, 호중구 증식인자, 변형성 성장인자 등의 사이토카인, 이타너셉트 (엔브렐), 어프리버셉트 (아이리아, 잘트랩), 아바타셉트 (오렌시아), 알러파셉트 (아메비브), 벨라타셉트 (뉴로직스), 릴로나셉트 (알카리스트) 등의 Fc 융합 단백질, 테리파라타이드 (포르테오), 엑세나타이드 (비예타), 리라그루타이드 (빅토자), 란레오타이드 (소마툴린), 프람린타이드 (시믈린), 엔풀블타이드 (푸제온) 등의 펩타이드 치료제, VEGF 수용체, Her2 수용체, G-단백질 연결 수용체, 이온체널 등의 세포표면 수용체 전체 혹은 부분의 폴리펩타이드 등을 포함한다.
상기 항체 또는 단백질 치료제는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이를 코딩하는 핵산에 결합되거나, 상기 핵산을 발현시키기 위한 벡터에 같이 삽입되어 이들의 반감기 증가에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 Fc 변이체는 pH 5.6 내지 6.4(바람직하게는 pH 5.8 내지 6.2)에서 FcRn에 대한 결합 친화도(binding affinity)가 야생형 Fc 도메인과 비교하여 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 100% 이상 증가되거나, 야생형 Fc 도메인 보다 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8배 이상, 9배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 90배 이상 또는 100배 이상 증가될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 Fc 변이체는 pH 7.0 내지 7.8(바람직하게는 pH 7.2 내지 7.6)에서 FcRn(neonatal Fc receptor)으로부터 해리(dissociation)되는 정도가 야생형 Fc 도메인과 비교하여 동일하거나 실질적으로 변화되지 않을 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 치환된 Fc 변이체는 야생형 Fc 또는 기 개발된 타 Fc 변이체와 비교하여 약산성 조건(예를 들어, pH 5.8 내지 6.2)에서는 매우 향상된 결합 친화도를 나타내었으며, 중성 조건(예를 들어, pH 7.4)에서는 동일하거나 실질적으로 동등 또는 그 이상의 수준의 해리 정도를 나타내었다(실시예 4 및 8).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 치환된 Fc 변이체는 야생형과 비교하여 반감기 (Half-life)가 증가된 것이다.
본 발명의 치환된 Fc 변이체의 반감기는 야생형 Fc 도메인과 비교하여 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 100% 이상 증가되거나, 야생형 Fc 도메인보다 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 7배 이상, 8배 이상, 9배 이상 또는 10배 이상 증가될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 치환된 Fc 변이체는 야생형과 비교하여 월등히 향상된 체 내 반감기를 나타내었다(실시예 11, 표 3).
본 명세서에서, “Fc 감마 수용체”또는 “FcγR” 은 IgG 항체 Fc 영역에 결합하는 단백질 계통의 임의의 구성원을 의미하고, FcγR 유전자에 의해 인코딩된다. 이의 예로서, FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc을 포함하는 FcγRI(CD64); FcγRIIa, FcγRIIb 및 FcγRIIc를 포함하는 FcγRII(CD32); 그리고 FcγRIIIa 및 FcγRIIIb를 포함하는 FcγRIII(CD16), 그리고 임의의 발견되지 않은 FcγR 또는 FcγR이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. FcγR은 인간, 생쥐, 쥐, 토끼 및 원숭이가 포함되지만 기타 다른 임의의 생물체로부터 유래될 수도 있다.
본 명세서에서, “FcRn” 또는 “neonatal Fc receptor”는 IgG 항체 Fc 영역에 결합하는 단백질을 의미하고, 적어도 부분적으로 FcRn 유전자에 의해 인코딩된다. 상기 FcRn은 인간, 생쥐, 쥐, 토끼 및 원숭이가 포함되지만 임의의 생물체로부터 유래될 수도 있다. 기능적 FcRn 단백질은 경쇄 및 중쇄로 지칭되는 2개의 폴리펩티드를 포함한다. 경쇄는 베타-2-마이크로글로불린이고, 중쇄는 FcRn 유전자에 의해 인코딩된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 제공한다.
본 명세서에서 용어"항체"는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 미니바디(minibody), 도메인 항체, 이중특이적 항체, 항체 모방체, 키메라 항체, 항체 접합체(conjugate), 인간항체 또는 인간화 항체이거나 이의 단편(예를 들어, 항원에 결합하는 항체 단편)을 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 항체 Fc 영역의 최적화 (예를 들어, M428L 및 Q311R; 또는 M428L 및 L309G 등)를 통해 Fc 도메인 또는 이를 포함하는 폴리펩타이드의 반감기를 극대화할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자, 상기 핵산분자를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 핵산분자는 단리된 것이거나 재조합된 것일 수 있으며, 단일쇄 및 이중쇄 형태의 DNA 및 RNA뿐만 아니라 대응하는 상보성 서열이 포함된다. "단리된 핵산"은 천연 생성 원천에서 단리된 핵산의 경우, 핵산이 단리된 개체의 게놈에 존재하는 주변 유전 서열로부터 분리된 핵산이다. 주형으로부터 효소적으로 또는 화학적으로 합성된 핵산, 예컨대 PCR 산물, cDNA 분자, 또는 올리고뉴클레오타이드의 경우, 이러한 절차로부터 생성된 핵산이 단리된 핵산분자로 이해될 수 있다. 단리된 핵산분자는 별도 단편의 형태 또는 더 큰 핵산 구축물의 성분으로서의 핵산 분자를 나타낸다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때"작동가능하게 연결"된다. 예를 들면, 전서열 또는 분비 리더(leader)의 DNA는 폴리펩타이드가 분비되기 전의 형태인 전단백질(preprotein)로서 발현되는 경우 폴리펩타이드의 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 폴리펩타이드 서열의 전사에 영향을 주는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며, 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 배치될 때 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로"작동가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우 인접하여 동일한 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접하여 위치할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 통상적인 방법에 따라 사용한다.
본 명세서에서 용어"벡터"는 핵산 서열을 복제할 수 있는 세포로의 도입을 위해서 핵산 서열을 삽입할 수 있는 전달체를 의미한다. 핵산 서열은 외생 (exogenous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다. 벡터로서는 플라스미드, 코스미드 및 바이러스(예를 들면 박테리오파지)를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 당업자는 표준적인 재조합 기술에 의해 벡터를 구축할 수 있다(Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988; 및 Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, John, Wiley & Sons, Inc, NY, 1994 등).
본 명세서에서 용어"발현 벡터"는 전사되는 유전자 산물 중 적어도 일부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한 벡터를 의미한다. 일부의 경우에는 그 후 RNA 분자가 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드로 번역된다. 발현 벡터에는 다양한 조절서열을 포함할 수 있다. 전사 및 번역을 조절하는 조절서열과 함께 벡터 및 발현 벡터에는 또 다른 기능도 제공하는 핵산 서열도 포함될 수 있다.
본 명세서에서 용어"숙주세포"는 진핵생물 및 원핵생물을 포함하며, 상기 벡터를 복제할 수 있거나 벡터에 의해 코딩되는 유전자를 발현할 수 있는 임의의 형질 전환 가능한 생물을 의미한다. 숙주세포는 상기 벡터에 의해 형질감염(transfected) 또는 형질전환(transformed) 될 수 있으며, 이는 외생의 핵산분자가 숙주세포 내에 전달되거나 도입되는 과정을 의미한다.
본 발명의 숙주세포는 바람직하게는 세균(bacteria)세포, CHO 세포, HeLa 세포, HEK293 세포, BHK-21 세포, COS7 세포, COP5 세포, A549 세포, NIH3T3 세포 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 인간 항체 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드의 제조방법을 제공한다:
a) 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및
b) 상기 숙주세포에 의해 발현된 폴리펩타이드를 회수하는 단계.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 항체의 제조방법을 제공한다:
a) 상기 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 발현하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및
b) 상기 숙주세포로부터 발현된 항체를 정제하는 단계.
본 발명의 제조방법에 있어서, 항체의 정제는 여과, HPLC, 음이온 교환 또는 양이온 교환, 고속 액체 크로마토그래피(HPLC), 친화도 크로마토그래피, 또는 이들의 조합을 하는 것이 포함될 수 있으며, 바람직하게는 Protein A를 사용하는 친화 크로마토그래피를 이용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드의 스크리닝 방법을 제공한다:
a) 카밧 EU 넘버링 시스템에 따른 M428L 돌연변이를 포함하는 Fc 변이체 라이브러리를 구축하는 단계; 및
b) 상기 M428L 돌연변이를 포함하는 Fc 변이체들 중 pH 5.6 내지 6.4에서 FcRn에 대한 친화도가 야생형 보다 높은 Fc 변이체를 선별하는 단계.
본 발명의 M428L 돌연변이를 포함하는 Fc 변이체는 추가적인 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 추가적인 아미노산 치환은 Q311R 또는 L309G 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 추가적인 아미노산 치환은 P228L 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 P228L 돌연변이를 포함하는 Fc 변이체는 추가적인 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
상기 추가적인 아미노산 치환은 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는 카밧 EU 넘버링 시스템에 따른 234, 264, 269, 292, 309, 342, 359, 364, 368, 388, 394, 422, 434 및 445번 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산에서 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 추가적인 아미노산 치환은 P230Q 또는 P230S 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 P230 위치에 돌연변이를 포함하는 Fc 변이체는 추가적인 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
상기 추가적인 아미노산 치환은 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는 카밧 EU 넘버링 시스템에 따른 243, 246, 295, 320, 356, 361, 384 및 405번 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 아미노산에서 돌연변이를 포함한다.
본 발명의 스크리닝 방법은 형광표지세포분리 (FACS) 스크리닝, 또는 다른 자동화된 유세포 분석 기술을 사용할 수 있다. 유세포 분석기를 실시하기 위한 기기는 당업자에게 공지이다. 그러한 기기의 예로는 FACSAria, FACS Sta r Plus, FACScan 및 FACSort 기기 (Becton Dickinson, Foster City, CA), Epics C(Coulter Epics Division, Hialeah, FL), MOFLO (Cytomation, Colorado Springs, Colo.), MOFLO-XDP (Beckman Coulter, Indianapolis, IN)를 들 수 있다. 일반적으로 유세포 분석기 기술에는 액체 시료 중의 세포 또는 다른 입자의 분리가 포함된다. 전형적으로는 유세포 분석기의 목적은 분리된 입자를 이들의 하나 이상의 특성(예를 들면 표지된 리간드 또는 다른 분자의 존재)에 대해서 분석하는 것이다. 입자는 센서에 의해 하나씩 통과되며, 크기, 굴절, 광산란, 불투명도, 조도, 형상, 형광 등에 기초하여 분류된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 아미노산 치환을 포함하는 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드, 상기 항체, 상기 핵산분자 또는 상기 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물(또는 폴리펩타이드, 항체, 핵산분자 또는 벡터)은 암 항원을 인식한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 Fc 변이체는 대조군(예를 들어, 트라스트주맙) 대비 동등 또는 그 이상의 ADCC(antibody dependent cellular cytotoxicity) 활성을 나타내어, 상기 현저한 반감기 증가와 더불어 높은 항암활성을 갖는다(실시예 13, 도 18).
본 발명의 약제학적 조성물은 (a) 상기 폴리펩타이드, 항체, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자 또는 상기 핵산분자를 포함하는 벡터; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 대상(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명이 예방 또는 치료하고자 하는 암의 종류는 제한되지 않으며, 백혈병(leukemias) 및 급성 림프구 백혈병(acute lymphocytic leukemia), 급성 비림프구 백혈병(acute nonlymphocytic leukemias), 만성 림프구 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 만성 골수 백혈병(chronic myelogenous leukemia), 호지킨 병(Hodgkin's Disease), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphomas) 및 다발 골수종(multiple myeloma) 등과 같은 림프종(lymphomas), 뇌종양(brain tumors), 신경모세포종(neuroblastoma), 망막모세포종(retinoblastoma), 윌름즈종양(Wilms Tumor), 골종양(bone tumors) 및 연부조직육종(soft-tissue sarcomas) 등과 같은 소아 고형 종양(childhood solid tumors), 폐암(lung cancer), 유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer), 요로암(urinary cancers), 자궁암(uterine cancers), 구강암(oral cancers), 췌장암(pancreatic cancer), 흑색종(melanoma) 및 기타 피부암(skin cancers), 위암(stomach cancer), 난소암(ovarian cancer), 뇌종양(brain tumors), 간암(liver cancer), 후두암(laryngeal cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 식도암(esophageal cancer) 및 고환암(testicular cancer) 등과 같은 성인들의 통상의 고형 종양(common solid tumors)들을 포함하여 다수의 암들을 치료하도록 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구 투여이며, 예컨대, 정맥 내 주입, 국소 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물 투여의 대상(subject)은 제한되지 않으나, 바람직하게는 척추동물, 보다 바람직하게는 인간, 침팬지를 포함한 영장류, 개, 고양이 등의 애완동물, 소, 말, 양, 염소 등의 가축동물, 마우스, 래트 등의 설치류 등의 포유동물을 포함하는 의미로 해석된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 화학 요법 또는 방사 요법과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 암 치료를 할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 화학 요법제는 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 프로카르바진(procarbazine), 메클로레타민(mechlorethamine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 비술판(bisulfan), 니트로소우레아(nitrosourea), 디악티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 탁목시펜(tamoxifen), 택솔(taxol), 트랜스플라티눔(transplatinum), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 빈크리스틴(vincristin), 빈블라스틴(vinblastin) 및 메토트렉세이트(methotrexate) 등을 포함한다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사 및 γ-선 조사 등이다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 인간 항체 Fc 도메인의 아미노산 서열 중 일부가 다른 아미노산 서열로 치환된 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 또는 이를 포함하는 항체를 제공한다.
(ii) 또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드 또는 항체의 제조방법을 제공한다.
(iii) 본 발명의 Fc 변이체는 일부 아미노산 서열의 최적화를 통하여 체 내 반감기를 극대화 할 수 있으며, 암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 terameric FcRn과 dimeric FcRn의 발현 및 정제를 위한 발현용 vector 및 정제 후 SDS-PAGE 겔 사진을 나타낸다.
도 2는 M252 및 M428에 18가지의 아미노산이 들어 갈 수 있도록 제작하기 위한 라이브러리 모식도를 나타낸다.
도 3은 2M 라이브러리 탐색 과정 및 선별된 M428L 변이체를 나타낸다.
도 4는 M428L을 기본으로 하여 제작된 error 라이브러리와 point 라이브러리의 모식도를 나타낸다.
도 5는 Error 라이브러리(도 5a) 및 point 라이브러리(도 5b)에서 발굴한 변이체들의 FACS 형광세기 측정 결과를 나타낸다.
도 6은 트라스트주맙 중쇄 및 경쇄를 동물세포 내에서 발현하기 위한 플라스미드를 나타낸다.
도 7은 야생형 트라스트주맙의 발현 및 정제 결과를 나타낸다.
도 8은 상업용 트라스트주맙 및 연구실에서 제작한 트라스트주맙의 물성 비교 결과를 나타낸다(a: CE-cIEF, b: SEC).
도 9는 N-Glycan profiling에 의한 상업용 트라스트주맙 및 연구실에서 제작한 트라스트주맙의 물성 비교 결과를 나타낸다.
도 10은 10종의 트라스트주맙 Fc 변이체 발현 및 정제 결과를 나타낸다(a: Affinity Chromatography, b: SDS-PAGE Analysis, c: List of Final Yield).
도 11은 트라스트주맙 Fc 변이체의 SEC 특성분석 결과를 나타낸다.
도 12는 ELISA를 이용한 트라스트주맙 Fc 변이체의 FcRn 결합력 측정 결과를 나타낸다.
도 13은 BiaCore에 의한 pH 6.0과 7.4에서의 트라스트주맙 Fc변이체와 hFcRn과의 결합력 측정결과를 나타낸다(a: pH 6.0(capture method) b: pH 7.4(Avid Format)에서의 결합력 측정).
도 14는 일반 마우스(C57BL/6J (B6))와 인간 FcRn Tg 마우스에서의 상업용 및 연구실 제작 트라스트주맙의 약동학 비교 결과를 나타낸다.
도 15는 인간 FcRn Tg 마우스에서 Fc 변이체의 약동학 분석결과를 나타낸다(정맥주사로 각 변이체 5 mg/kg 주사, n=5).
도 16은 ELISA를 이용한 트라스트주맙 Fc 변이체의 FcγRs 결합력 측정결과를 나타낸다.
도 17은 Normal IgG 와 대조군(트라스트주맙) 대비 트라스트주맙 Fc 변이체의 Effector Function 비교결과를 나타낸다(ADCC assay).
도 18은 트라스트주맙 Fc 변이체의 Effector Function(ADCC) 비교 결과를 나타낸다.
도 19는 ELISA를 이용한 트라스트주맙 Fc 변이체의 C1q 결합력 측정결과를 나타낸다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1. Fc 변이체 라이브러리 탐색을 하기 위한 FcRn(neonatal Fc receptor) 발현 및 정제
FcRn에 pH-의존적 결합력이 향상된 Fc 변이체를 탐색하기 위하여 terameric FcRn과 dimeric FcRn의 발현 및 정제를 수행하기 위하여 발현용 벡터를 준비하였다(도 1). Tetrameric FcRn을 얻기 위해서 pMAZ-β2microglobulin-GSlinker-FcRnα-chain-streptavidin-His의 DNA 플라스미드를 확보하였다. 이 DNA를 HEK 293F 세포에 co-transfection하고 300 ml 규모로 임시발현하였다. 배양이 끝난 배양액은 7000 rpm, 10분간 원심분리를 통해 제거하고 상등액을 취해 25x PBS를 이용해 평형을 맞추었다. bottle top filter를 이용해 0.2 μm filter(Merck Millipore)로 여과하였다. PBS로 평형을 맞춘 후 Ni-NTA resin(Qiagen)을 넣어주어 16시간 동안 4℃에서 FcRn과 레진을 결합하게 하였다. 컬럼에 FcRn과 결합한 레진을 흘려 주고 50 ml wash-1 buffer(PBS), 25 ml wash-2 buffer(PBS + 10 mM imidazole), 25 ml wash-3 buffer(PBS + 20 mM imidazole), 200 μl wash-4 buffer(PBS + 250 mM imidazole)를 흘려주어 tFcRn 이외의 단백질을 제거하였다. 그리고 2.5 ml elution buffer(PBS + 250 mM imidazole)를 흘려주어 tFcRn을 얻었다. 그리고 buffer를 바꾸기 위하여 centrifugal filter units(Merck Millipore)을 사용하였다. Dimeric FcRn을 얻기 위해서 Oslo 대학교에서 받은 pcDNA-FcRnα-chain-GST-β2 microglobulin 플라스미드를 확보하였다. 이 DNA를 HEK 293F 세포에 co-transfection하고 300 ml 규모로 임시발현하였다. 배양이 끝난 배양액은 7000 rpm, 10분간 원심분리를 통해 제거하고 상등액을 취해 25x PBS를 이용해 평형을 맞추었다. bottle top filter를 이용해 0.2 μm filter(Merck Millipore)로 여과하였다. PBS로 평형을 맞춘 후 Glutathione agarose 4B(incospharm) 레진을 넣어주어 16시간 동안 4℃에서 FcRn과 레진을 결합하게 하였다. 컬럼에 FcRn과 결합한레진을 흘려 주고 10 ml wash buffer(PBS)를 흘려주어 dFcRn 이외의 단백질을 제거하였다. 그리고 2.5 ml elution buffer(50 mM Tris-HCl + 10 mM GSH pH 8.0)를 흘려주고 buffer를 바꾸기 위하여 centrifugal filter units 3K(Merck Millipore)을 사용하였다. 정제 후 SDS-PAGE 겔을 이용하여 크기를 확인 하였다(도 1). 정제된 terameric FcRn과 dimeric FcRn에 형광 신호를 낼 수 있도록 Alexa 488를 이용하여 형광 표지를 하였다.
실시예 2. Fc 변이체 2M 라이브러리(library) 제작
트라스트주맙(Trastzumab)에 있는 Fc 부분의 유전자(서열목록 제29서열)를 SfiI 제한효소를 이용하여 pMopac12-NlpA-Fc-FLAG를 제작하였다. 제작된 벡터를 기반으로 Fc 내에 두 개의 Met부분을 cys과 Met을 제외한 나머지 18가지의 다른 아미노산으로 치환될 수 있도록 pMopac12-seq-Fw, Fc-M252-1-Rv, Fc-M252-2-Rv, Fc-M252-3-Rv, Fc-M428-Fw, Fc-M428-1-Rv, Fc-M428-2-Rv, Fc-M428-3-Rv, Fc-M428-frg3-Fw, pMopac12-seq-Rv 프라이머를 이용하여 라이브러리 insert를 제작하였다(표 1, 도 2). 제작된 insert를 SfiI 제한효소 처리하여 같은 SfiI으로 처리된 벡터와 라이게이션하였다. 그 후 대장균 Jude1((F'[Tn10(Tetr )proAB+ lacI qΔ(lacZ)M15] mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)Φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 deoR recA1 araD139Δ(ara leu)7697 galU galKrpsLendA1nupG)에 형질전환하여 거대 Fc 변이체 2M 라이브러리(라이브러리 크기: 1x109)를 구축하였다.
Figure PCTKR2018004104-appb-T000001
클로닝에 사용된 프라이머들(서열목록 제1서열 내지 제27서열)
실시예 3. 박테리아배양 및 유세포 분리기(flow cytometry)를 이용한 Fc 변이체 2M 라이브러리 탐색
구축된 2M Fc 변이체 라이브러리 탐색을 위하여 대장균 Jude1 세포에 형질전환되어 있는 Fc 변이체 라이브러리 세포 1 ml을 37℃ 250 rpm shaking 조건으로 2%(w/v) 글루코오스에 항생제는 클로람페니콜(40 μg/mL)이 포함된 Terrific Broth(TB) 배지에 넣어 주고 4시간 배양을 하였다. 진탕배양된 라이브러리 세포를 TB 배지에 1:100으로 접종한 후 37℃ 250 rpm shaking으로 OD600가 0.5에 도달할 때 까지 배양하였다. 그 후 cooling을 위해 20분 동안 25℃에서 배양한 후 1 mM isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside(IPTG)를 넣어 발현유도를 하였다. 배양이 끝난 후 세포를 회수하여 OD600 normalize를 통해 균일한 양 만큼씩 14000 rpm, 1분간 원심분리를 통해 세포를 수확하였다. 1 ml의 10 mM Tris-HCl(pH 8.0)을 첨가해 세포를 재현탁(resuspension)하고 1분간 원심분리하는 세척과정을 2회 반복하였다. 1 ml의 STE[0.5 M 수크로오스, 10 mM Tris-HCl, 10mM EDTA(pH 8.0)]로 재현탁하여 37℃, 30분간 회전시켜 세포 외막을 제거하였다. 원심분리하여 상등액을 버린 후 1 ml의 Solution A[0.5 M 수크로오스, 20 mM MgCl2, 10 mM MOPS pH 6.8]을 첨가해 재현탁과 원심분리를 하였다. 1 ml의 SolutionA와 50 mg/ml lysozyme solution 20 μl를 혼합한 용액을 1 ml 첨가해 재현탁한 뒤 37℃, 15분 간 회전시켜 펩티도글라이칸 층을 제거하였다. 원심분리 후 상등액을 제거하고 1 ml의 PBS로 재현탁한 뒤 300 μl를 취해 700 μl의 PBS와 형광 표지된 tetrameric FcγRIIIa-Alexa 488 flour 프로브를 함께 넣고 상온에서 회전시켜 spheroplast에 형광 프로브를 라벨링하였다. 라벨링후 1 ml의 PBS로 1회 세척한 후 유세포 분리기(Flow cytometry: S3 sortor (Bio-rad))를 이용하여 높은 형광을 보이는 상위 3% 세포들을 회수하기 위해 선별(sorting) 작업을 진행 하였고 형광이 높은 세포들의 순도를 높이기 위해서 선별된 세포들을 다시 재선별 (resorting)하였다. 재선별된 샘플을 pMopac12-seq-Fw와 pMopac12-seq-Rv 프라이머로 Taq 폴리머레이즈(Biosesang)를 이용해 PCR로 유전자를 증폭하고 SfiI 제한효소 처리, 라이게이션, 형질전환 과정을 거쳐 sorting된 세포의 유전자들이 증폭된 서브라이브러리를 제작하였다. 이 과정을 총 2라운드에 걸쳐 반복한 후, 40여개의 개별 클론들을 각각 분석하여 야생형 Fc 보다 pH 5.8에서 FcRn과 높은 친화도를 보이는 M428L 변이체를 선별하였다(도 3).
실시예 3. Fc 변이체 error 라이브러리 및 point 라이브러리 제작
발굴된 M428L을 주형으로 하여 추가로 두 가지 라이브러리를 제작하였다. 첫 번째 라이브러리는 error prone PCR 기법을 이용하여 Fc에 변이를 도입하여 error 라이브러리를 제작하였다. Error rate은 Fc(680 bp)에 0.3% error(2.04 bp)가 들어 갈 수 있도록 ep-Fc-Fw, ep-Fc-Rv 프라이머를 이용하여 라이브러리(라이브러리 크기: 2x108)를 제조하였다. 두 번째 라이브러리는 M428L을 주형으로 하고 Fc와 FcRn결합 부위를 선정하여 해당 부위에 무작위적으로 돌연변이가 도입되도록 pMopac12-seq-Fw, pMopac12-seq-Rv, Fc-Sub#0-Rv, Fc-Sub#1-1-Fw, Fc-Sub#1-2-Fw, Fc-Sub#1-3-Fw, Fc-Sub#1-4-Fw, Fc-Sub#1-5-Fw, Fc-Sub#1-Rv, Fc-Sub#2-1-Fw, Fc-Sub#2-2-Fw, Fc-Sub#2-3-Fw, Fc-Sub#2-Rv, Fc-Sub#3-1-Fw, Fc-Sub#3-2-Fw, Fc-Sub#3-3-Fw, Fc-Sub#3-4-Fw 프라이머를 이용하여 point 라이브러리를 제작하였다(도 4). 그 후 위와 같은 방법으로 Jude1에 형질전환하여 Fc 변이체 라이브러리를 구축하였다.
실시예 4. 박테리아배양 및 유세포 분리기(flow cytometry)를 이용한 Fc 변이체 error 및 point 라이브러리 탐색과 PFc3, PFc29, PFc41, EFc29, EFc41, EFc82, EFc88 등의 변이체 선별
앞서 발굴된 M428L을 기본으로 하여 추가적으로 제작된 error 라이브러리와 point 라이브러리를 위와 같은 방법으로 선별 및 재선별 작업을 진행하였다. error 라이브러리는 5 라운드에 거쳐 반복하였고, point 라이브러리는 1회에 거쳐 선별을 진행한 후 두 가지 라이브러리에서 나온 그룹에서 각각 100여개의 개별 클론들을 분석하여 pH 5.8에서 FcRn에 높은 친화도를 보이고 pH 7.4에서는 낮은 친화도를 보이는 Fc 변이체들을 선별하였다. FACS를 이용하여 각각을 분석한 결과 error 라이브러리에서 발굴된 EFc6, EFc29, EFc41, EFc46, EFc70, EFc90 EFc82, EFc88은 야생형 Fc 보다 pH 5.8에서 높은 형광세기를 보였지만 선행연구에서 발굴된 메디이뮨(Medimmune)의 YTE (Gabriel J. Robbie et al., Antimicrob Agents Chemother. 2013 Dec; 57(12): 6147-6153)나 젠코(Xencor)의 LS(미국 특허등록번호 제8,324,351호) 보다 pH 5.8에서 높은 형광 세기를 나타내었으며, pH 7.4에서 LS보다 낮은 형광을 나타내는 변이체는 EFc6, EFc29, EFc41, EFc82, EFc88 이라는 것을 확인하였다. 또한 point 라이브러리에서 발굴된 변이체 PFc3, PFc29, PFc41는 YTE나 LS 보다 pH 5.8에서 높은 형광 세기를 보였지만 PFc30은 낮은 형광세기를 보였다. 그리고 PFc29, PFc41은 pH 7.4에서 LS 보다 낮은 형광을 나타내는 것을 확인하였다. 최종적으로 혈중 반감기를 향상 시킬 것으로 예상되는 EFc6, EFc29, EFc41, EFc82, EFc88, PFc3, PFc29, PFc41을 선정하였다(표 2, 도 5).
Figure PCTKR2018004104-appb-T000002
발굴한 변이체의 점 돌연변이
돌연변이위치는 Kabat EU 넘버링시스템(Kabat et al., in “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991)에서와 같은 EU 지수번호에 따름.
실시예 5. Fc 변이체 도입을 위한 대조군 트라스트주맙 생산 및 정제
본 발명에서는 IgG1 치료용 항체 중 대표적인 트라스트주맙(trastuzumab, Herceptinⓡ)을 선정하여, 발굴된 Fc 변이체를 도입하고 향후 대조군으로 사용하고자 하였다.
야생형 트라스트주맙 유전자는 Drug Bank(http://www.drugbank.ca/)의 아미노산 서열로부터 back-translation과 동시에 mammalian codon optimization을 통해 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 각각을 합성(Genscript) 하였다. 합성된 트라스트주맙 중쇄 유전자는 pOptiVEC-Fc 벡터에 트라스트주맙 경쇄 유전자는 pDNA3.3 벡터에 각각 서브클로닝하였다(도 6). 트라스트주맙 중쇄 및 경쇄를 코딩하고 있는 동물세포 발현용 플라스미드들을 각각 제조하여 HEK293세포에서 발현 및 정제하였다.
HEK 293F에서 배양 후 Protein A 친화도 크로마토크래피(AKTA prime plus, cat # 11001313)와 젤여과 크로마토그래피(HiTrap MabselectSure, GE, cat #11-0034-95)를 이용하여 야생형 트라스트주맙을 정제하였고, 300 ml 배양액으로부터 7.7 mg의 고순도 야생형 트라스트주맙을 확보하였다(도 7).
실시예 6. 연구실 제작( in-house ) 및 상업용( commercial ) 트라스트주맙 물성 비교 분석
CHO suspension 배양으로 생산된 상업용(commercial) 트라스트주맙과 달리 연구실에서 제작(in-house)한 in-house 트라스트주맙은 HEK293에서 생산하였기 때문에 선별된 Fc-변이체를 도입하여 그 기능을 분석 하기 전 두 가지 형태의 기본 특성 분석을 하였다. CE(Capillary Electrophoresis: PA800 Plus, Beckman coulter)에 의한 분석은 pH 3-10의 구배를 형성하는 Pharmalyte 3-10 carrier ampholytes(GE Healthcare, 17-0456-01)를 사용하여 시료의 pI값 및 Charge variants를 분석하였다. 분석 결과 SEC(Size Exclusion Chromatography :Tskgel G3000swxl, Tosoh)에 의한 impurity는 없었으며, CE(Capillary Electrophoresis: PA800 Plus, Beckman coulter)에 의한 charge variant에 의한 pI값은 상업용의 경우 8.27-8.74이고 main peak의 PI가 8.62이며, 자체 생산한 트라스트주맙의 PI는 8.29-8.78, main peak은 8.65로 둘 다 거의 유사하였다(도 8). 그러나 cIEF 분석 결과 연구실에서 제작한 트라스트주맙에서 main peak외 나머지 peak에서의 약간의 함량차이가 관찰되었고 이것은 상업용의 경우 CHO에서 생산되나, 연구실에서 제작한 트라스트주맙의 생산 세포주가 HEK293으로 Glycan pattern이 달라 sialic acid등으로 인한 oxdation일 가능성도 있어 Glycan 분석도 진행 하였다(도 9).
Glycan 분석은 단백질에서 PNGase F(NEB, 186007990-1)를 이용하여 N-glycan을 떼어낸 후 RapiFluor-MS reagent(Waters, 186007989-1)를 이용하여 라벨링 후 UPLC 시스템(Acquity UPLC I class, Waters, FLR detector)을 이용하여 분석 실시하였다. Glycan 분석 결과 당 패턴은 유사하나 각 조성 당의 함량 차이만 보여 이는 sialic acid에 의한 oxidation이 원인은 아닌 것으로 보이며, 생산 세포주 차이에 의해 나타나는 것으로 보였고, 결합력 분석 및 약동학 분석에는 큰 영향이 없음을 확인하여(Data not shown) 선별된 Fc 변이체들을 도입하여 생산하였다.
실시예 7. Fc 변이체 생산, 정제 및 물성 분석
상업용과 연구실에서 제작한 야생형 외에 LS(XenCor), YTE(MedImmune), 428L등의 대조군 변이체 5종과 PFc29, PFc41, EFc29, EFc41 및 EFc82 등 5종의 선별된 변이체를 HEK 293F 동물세포에 형질주입하였다. 형질주입 하루 전날 HEK293F cell을 1x106 cells/ml의 밀도로 300 ml 계대배양하고 다음날 Polyethylenimine(PEI, Polyscience, 23966)을 이용하여 형질주입하였다. Freestyle 293 expression 배양액(Gibco, 12338-018) 30 ml에 변이체들의 중쇄유전자와 경쇄유전자를 2:1의 비율로 먼저 섞고, 다음으로 PEI : 변이체유전자 = 1:2 비율로 섞어 상온에서 20분간 두었다가 전날 계대배양 해 놓은 세포에 섞고 shaking CO2 인큐베이터에서 37℃, 125 rpm, 8 %　CO2 조건으로 6일간 배양한 후 원심 분리하여 상등액만 취하였다.
상등액으로부터의 단백질 정제는 HiTrap MabselectSure 칼럼을 장착한 AKTA prime plus를 이용하여 친화 크로마토그래피로 수행하였다. 상등액 300 ml을 분당 3 ml의 속도로 흘려주고, 100 ml의 1xPBS로 씻어준 후 IgG Elution buffer(Thermo scientific , 21009)를 분당 5 ml의 속도로 5 ml 씩 6개의 절편(fraction)을 수집하고 1M Tris (pH9.0) 500 ul를 섞어 중화시켜준 후, 각 절편을 Bradford (BioRad, 5000001) 용액으로 단백질을 확인하여 새 튜브에 취하였다. 30K Amicon ultra centrifugal filter(UFC903096)를 이용하여 정제된 변이체들을 농축한 다음 물성 분석하였다(도 10 및 11).
연구실 제작 야생형 트라스트주맙 외 각 Fc 변이체들을 protein A로 정제 후 SDS-PAGE에 의해 순도 90% 이상 순도 및 분자량을 확인하였고, 효능평가 및 순도 분석에 요구되는 고순도 단백질 시료 확보(순도 97% 이상)를 위해 SEC-HPLC(도 11a) 실험을 진행하였다. isocratic condition(이동상 1X PBS pH 7.0, 1 ml/min 유속)에서 분석한 결과, Fc 변이체 모두 main peak에 대한 retention time이 동일하며 분자량 예측 결과 예상 분자량으로 확인 하였다(도 11b).
실시예 8. ELISA를 통한 Fc 변이체의 FcRn 결합력 측정
앞서 준비된 변이체들의 FcRn pH-의존적 결합력과 effect function을 나타낼 수 있도록 하는 FcγRs, C1q와의 결합력을 측정해 보기 위하여 ELISA 측정을 진행하였다. 먼저 FcRn에 pH-의존적 결합력을 보기 위하여 0.05 M Na2CO3 pH 9.6에 4 μg/ml로 희석한 IgG Fc 변이체를 각각 50 μl 씩 Flat Bottom Polystyrene High Bind 96 well microplate(costar)에 4℃, 16시간 동안 고정화 한 후 100 μl의 4% skim milk(GenomicBase)(in 0.05% PBST pH 5.8/pH 7.4)로 상온에서 2 시간 동안 블로킹하였다. 0.05% PBST (pH 5.8/pH 7.4) 180 μl로 4회 씩 세척 과정을 진행한 뒤 1% skim milk(in 0.05% PBST pH 5.8/pH 7.4)으로 serially dilution된 FcRn를 50 μl 각 웰에 분주하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척 과정 후 anti-GST-HRP conjugate(GE Healthcare) 50 μl 씩을 이용해 상온에서 1시간 동안 항체 반응을 진행하고 세척 과정을 수행하였다. 1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution(Thermo Fisher Scientific) 50 μl 씩 첨가해 발색 한 뒤 2 M H2SO4 50 μl 씩 넣어주어 반응을 종료 시킨 다음 Epoch Microplate Spectrophotometer(BioTek)을 이용해 분석하였다. 발굴한 변이체는 FcRn에 대해서 pH 5.8에서는 LS 변이체와 비슷한 결합력을 가지고 pH 7.4에서는 LS 보다 더 잘 해리가 되는 것을 볼 수 있었다(도 12).
실시예 9. pH 6.0과 pH 7.4에서 트라스트주맙 Fc 변이체들과 monomeric hFcRn과의 결합력 측정 비교 분석
이와 같이, 물성 분석으로 확인된 상업용과 연구실 제작 트라스트주맙 외 선별된 Fc 변이체들의 pH에 따른 인간 FcRn과의 결합력 차이를 비교하기 위해 Biacore T200(GE Healthcare) 장비를 이용하여 KD값을 측정 비교하였다. pH 6.0 조건에서는 문헌(Yeung YA. et al., J. Immunol,2009)에 따라 antigen-mediated antibody capture 방식으로 인간 FcRn을 analyte로 사용하였다. HER2 ECD domain이 ∼3,000 response units(RU) 수준으로 고정된 CM5 chip 표면에 Fc 변이체를 리간드로 running buffer(50 mM Phosphate, pH 6.0, 150 mM NaCl, 0.005% surfactant P20, pH 6.0)에 희석하여 ~300 RU 수준으로 주입하여 capture하였다. Analyte인 monomeric FcRn(Sinobiological inc., CT009-H08H)은 125 nM에서부터 FcRn running buffer에 순차적으로 희석하여 30 ul/min 유속으로 2분 동안 injection하고, 2분 동안 dissociation하여 결합력을 측정하였다. 각 cycle 마다 10 mM Glycine(pH1.5) 30 ml/min의 유속으로 30초간 regeneration을 수행하였다. Sensogram은 BIAevaluation software(Biacore)에서 1:1 binding model을 적용하여 분석하였다. 그 결과, Fc 변이체가 대조군으로 사용된 상업용 트라스트주맙(15 nM) 및 연구실 제작 트라스트주맙(16.9 nM)과 backbone으로 사용된 428L(9 nM)보다는 결합력이 좋아졌지만(PFc 3: 5.6 nM, PFc29 : 6.8 nM, PFc 41: 5.9 nM 등), 세계 최고로 알려진 YTE(5.7 nM)와 LS(4.1 nM)보다는 결합력이 다소 낮았으나 그 값의 차이가 거의 오차범위내로 비슷함을 확인하였다. pH 7.0 조건에서는 리간드와 analytes가 잘 결합하지 않으므로 monomeric hFcRn을 direct immobilization 한 다음 Fc 변이체들을 농도별로 주입하는 avid format(Zalevsky J et al. Nat. Biotechnol,2010)으로 측정하였다. 인간 FcRn ECD doamin(Sino Biological)을 CM5 chip 표면에 ∼1,500 RU 수준으로 고정화하였다. FcRn이 고정된 chip 표면에 Fc 변이체들을 3000 nM에서부터 HBS-EP(pH 7.4)에 순차적으로 희석하여 5 ml/min의 유속으로 2분간 injection하였다. 결합한 Fc 변이체들은 2분 동안 해리시켰으며, 각 cycle이 끝나면 chip 표면을 100 mM Tris(pH 9.0)로 regeneration 하였다(conatat time 30초; 유속 30 ul/min). 이중, Fc 변이체들 2종 (PFc29, PFc41)이 pH 6.0 조건에서 높은 결합력을 유지하면서 pH 7.4 조건에서는 YTE와 LS보다 빠르게 해리되는 것 (ELISA 결과와 일치)으로 보아 반감기 증가 효과를 기대할 수 있음을 예상하였고(도 13), 실제 인간 FcRn Tg 마우스에서 체내 약동학실험을 진행하였다.
실시예 10. 일반 B6 마우스와 hFcRn Tg 마우스에서 상업용 및 연구실 제작 트라스트주맙 생체 내( in vivo ) PK 실험비교 분석
인간 FcRn Tg 마우스와 유전적 background가 동일한 B6 일반 마우스(중앙실험동물센터, C57BL/6J(B6))에서의 PK분석 결과, 논문에서 보고된 것과 같이 일반 마우스 FcRn과 인간 항체의 Fc와의 친화력이 인간 FcRn과 인간항체 Fc보다 높게 나옴을 확인하였다. 그러나, 일반 마우스에서의 PK값은 연구실 제작 및 상업용 항체간의 variation이 보였고 연구실 제작 항체가 unstable해 보였으나, Tg 마우스(B6.Cg-Fcgrttm1Dcr Prkdcscid Tg(Jackson lab, CAGFCGRT)276Dcr/DcrJ)에선 일반 마우스보다는 AUC가 다소 낮으나 연구실 제작 및 상업용 항체간의 약동학 경향은 비슷하게 측정됨이 확인되었다. 따라서, Tg 마우스에서의 실제 체내 약동학 분석에 HEK293에서 생산한 연구실 제작 유래 Fc 변이체들의 실험 측정에 문제가 없음을 확인하였다(도 14).
실시예 11. LS, YTE 외 두 종 변이체(PFc29 및 PFc41)등 4종에 대한 hFcRn Tg 마우스 약동학
ELISA 와 BiaCore장비로 pH 6.0 및 pH 7.4에서 측정했던 결합력 결과가 일관성 있게 나와 이를 토대로 pH 6.0 acidic 조건에서 LS 만큼 결합력이 좋고 pH 7.4에서 해리력이 LS보다 더 좋았던, PFc29와 PFc41의 2 종류를 선별하였다. 이와 동시에, 현 세계 최고라고 알려진 XenCor의 LS mutant와 MedImmune의 YTE를 대조군으로 총 4종의 트라스트주맙 Fc 변이체를 인간 FcRn Tg 마우스 20마리(각 군당 5마리씩 5 mg/kg을 I.V (미정맥)로 주사 후 facial vein에서 채혈(총 12회 → 0, 30min, 1, 6, 24hr, 3, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 50day))에서 얻어진 혈액을 이용하여 ELISA로 농도분석한 후 WinNonlin으로 non-compartmental analysis (NCA) 실시하였다. ELISA와 BiaCore 분석 결과에서 예상했던 대로, Fc 변이체 2종 (PFc29 및 PFc41) 모두 체내 반감기 증가 효과를 보여주었으며, 특히 PFc29의 경우 선행연구에서 발굴된 LS보다 높은 반감기 효과를 보였다(도 15, 표 3).
Figure PCTKR2018004104-appb-T000003
마우스 정맥 투여 (5 mg/kg) 후 트라스트주맙 Fc 변이체의 비구획적 약동학 파라미터 분석(Data are expressed as mean ±SD (n = 5))
t1/2, terminal half-life; Tmax, time at maximal concentration; C0, extrapolated zero time concentration; Cmax, maximal concentration; AUClast, area under the curve from administration to the last measured concentration; AUCinf, area under the curve from administration to infinity; AUC%Extrap, percentage of the extrapolated area under the curve at the total area under the curve;Vz, volume of distribution; CL, clearance.
실시예 12. ELISA를 통한 Fc 변이체의 FcγRs 결합력 측정
FcγRs와의 결합력을 측정하기 위하여 0.05 M Na2CO3 pH 9.6에 4 μg/ml로 희석한 IgG Fc 변이체를 각각 50 μl 씩 Flat Bottom Polystyrene High Bind 96 well microplate(costar)에 4℃, 16시간 동안 고정화 한 후 100 μl의 4% skim milk (GenomicBase)(in 0.05% PBST pH 7.4)로 상온에서 2시간 동안 블로킹하였다. 0.05% PBST(pH 7.4) 180 μl로 4 회씩 세척 과정을 진행한 뒤 1% skim milk(in 0.05% PBST pH 7.4)으로 serially dilution된 FcγRs를 50 μl 각 웰에 분주하여 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 세척 과정 후 FcRs는 anti-GST-HRP conjugate (GE Healthcare) 50 μl씩을 이용해 상온에서 1 시간 동안 항체 반응을 진행하고 세척 과정을 수행하였다. 1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution(Thermo Fisher Scientific) 50 μl씩 첨가해 발색 한 뒤 2 M H2SO4 50 μl씩 넣어주어 반응을 종료 시킨 다음 Epoch Microplate Spectrophotometer(BioTek)을 이용해 분석하였다. 각 실험은 모두 duplicate으로 진행하였으며 ELISA 결과 각각의 FcγRs[FcγRI, FcγRIIa(H), FcγRIIa(R), FcγRIIb, FcγRIIIa(V), FcγRIIIa(F))에 대한 결합력을 확인할 수 있었다(도 16).
실시예 13. Fc 변이체의 항체 의존성 세포-매개의 세포독성 (ADCC)에 의한 작동체 기능 (Effector Function) 측정
트라스트주맙 Fc 변이체의 항체 의존성 세포-매개의 세포독성 ADCC(Antibody-dependent cellular cytotoxicity) 활성은 ADCC 리포터 바이오어세이 키트(reporter bioassay kit, Promega, G7010)을 사용하여 평가하였다. 구체적으로, 표적 세포(Target cells)로 사용되는 SKBR-3을 96-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 5X103 cells/100 ㎕ 씩 분주한 후 37℃ CO2 배양기에서 20시간동안 배양하였다. 20시간 경과 후 멀티 피펫을 이용하여 플레이트의 각 웰에서 95 ㎕의 배양 배지를 제거하고 ADCC 리포터 바이오어세이 키트 에서 제공된 ADCC assay buffer 25 ㎕를 각 웰에 분주하였다. Normal IgG, 트라스트주맙과 트라스트주맙 Fc 변이체는 ADCC assay buffer에 농도 별로 희석하여 준비한 후, 세포가 있는 96-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰당 25 ㎕씩 분주하고 효과기 세포 (effector cells)를 첨가할 때까지 상온에 두었다. 키트에서 제공하는 효과기 세포는 37℃ 항온수조에서 2-3분간 녹인 후 630 ㎕를 취하여 ADCC assay buffer 3.6 mL과 혼합하였다. 표적 세포와 항체 희석물을 포함하는 플레이트에 준비된 효과기 세포를 웰당 25 ㎕씩 분주한 후 37 ℃ CO2 배양기에서 6시간 동안 반응시켰다. 시간이 경과되면 플레이트를 꺼내 15분간 상온에 둔 후, Bio-GloTMLuciferase assay reagent를 웰 당 75 ㎕ 씩 첨가하고 5분간 상온에서 반응시켰다. 반응 후 루미노미터(luminometer, Enspire multimode plate reader)를 이용하여 각 웰의 루미네센스(luminescence)를 측정하였다. 각 시험 항체들의 ADCC 활성도는 실험한 결과의 평균값을 Fold induction으로 표시하였고, 다음 식을 사용하여 결정되었다:
Fold induction =
RLU(induced1-background2)/RLU(noantibodycontrol3-background)
1.induced: 표적세포, 시험 항체 그리고 효과기 세포가 혼합된 시료로부터 획득된 RLU 값
2. background: ADCC assay buffer에서 획득한 RLU 값
3. no antibody control: 표적세포와 효과기 세포만 혼합된 시료에서 획득한 RLU 값.
SKBR-3에 대한 트라스트주맙과 트라스트주맙 Fc 변이체(LS, YTE, PFC29 및 PFC41)의 ADCC 활성을 상호 비교하였다(도 17). 그 결과, 가장 높은 농도에서의 최대 활성값을 기준으로 각 시험물질의 ADCC 활성은 양성 대조물질인 트라스트주맙에 비해 LS는 약 1.5배, PFc29는 1.18배 그리고 PFc41은 1.27배 높았으나, YTE는 4.2배 낮은 활성을 보였다. 결과적으로, 트라스트주맙 Fc 변이체 2종(PFc29 및 PFc41)과 대조 변이체 LS는 기존 대조약 (Trastuzumab) 대비 1.18-1.5배 향상된 ADCC 활성을 보였다. 그러나, 다음 그림에서 보는 바와 같이 측정된 변이체 각각의 EC50 값을 보았을 때, 대조군 LS (EC50=0.05575 ug/mL) 보다 본 발명에서 찾은 Fc 변이체 PFc29 (EC50=0.04543 ug/mL)와 PFc41 (EC50=0.05405 ug/mL)가 더 안정된 효능을 보임을 확인하였다(도 18).
실시예 14. ELISA를 통한 Fc 변이체의 C1q 결합력 측정
C1q와의 결합력을 측정하기 위하여 0.05 M Na2CO3 pH 9.6에 4 μg/ml로 희석한 IgG Fc 변이체를 각각 50 μl 씩 Flat Bottom Polystyrene High Bind 96 well microplate(costar)에 4℃, 16시간 동안 고정화 한 후 100 μl의 4% skim milk(GenomicBase)(in 0.05% PBST pH 7.4)로 상온에서 2시간 동안 블로킹하였다. 0.05% PBST(pH 7.4) 180 μl로 4 회씩 세척 과정을 진행한 뒤 1% skim milk(in 0.05% PBST pH 7.4)으로 serially dilution된 Complement C1q Human (Millipore)를 50 μl 각 웰에 분주하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척 과정 후 anti-C1q-HRP conjugate(Invitrogen) 50 μl 씩을 이용해 상온에서 1시간 동안 항체 반응을 진행하고 세척 과정을 수행하였다. 1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution(Thermo Fisher Scientific) 50 μl 씩 첨가해 발색 한 뒤 2 M H2SO4 50 μl씩 넣어주어 반응을 종료 시킨 다음 Epoch Microplate Spectrophotometer(BioTek)을 이용해 분석하였다. 분석 결과 C1q 결합력이 선행연구에서 발굴된 LS와 YTE 보다 본 연구에서 발굴한 PFc29이 높은 결합력을 보였다(도 19).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (23)

  1. 인간 항체 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드로서, 상기 Fc 변이체는 야생형(wild type) 인간 항체 Fc 도메인에서 카밧 EU 넘버링 시스템 (Kabat EU numbering system)에 따른 M428L 및 하기의 아미노산 치환을 포함하며, 야생형과 비교하여 반감기(Half-life)가 증가된 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드:
    a) Q311R 또는 L309G;
    b) P228L; 또는
    c) P230Q 또는 P230S.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 Fc 변이체는 234, 264, 269, 292, 309, 342, 359, 364, 368, 388, 394, 422, 434 및 445번 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 추가적인 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 추가적인 아미노산 치환은 L309R 및 N434S인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 추가적인 아미노산 치환은 V264M, L368Q, E388D, V422D 및 P445S인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  5. 제 2 항에 있어서, 상기 추가적인 아미노산 치환은 R292L, T359A 및 S364G인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  6. 제 2 항에 있어서, 상기 추가적인 아미노산 치환은 L234F, E269D, Q342L, E388D 및 T394A인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 Fc 변이체는 243, 246, 295, 320, 356, 361, 384 및 405번 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상의 추가적인 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 추가적인 아미노산 치환은 F243Y, K246E, N361S 및 N384I인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 추가적인 아미노산 치환은 Q295L, K320M, D356E 및 F405I인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 항체는 IgG 항체인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
  11. 제 1 항의 폴리펩타이드를 포함하는 항체.
  12. 제 11 항에 있어서 상기 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 미니바디(minibody), 도메인 항체, 이중특이적 항체, 항체 모방체, 키메라 항체, 항체 접합체(conjugate), 인간항체 또는 인간화 항체이거나 이의 단편인 것을 특징으로 하는 항체.
  13. 제 1 항의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자.
  14. 제 13 항의 핵산분자를 포함하는 벡터.
  15. 제 14 항의 벡터를 포함하는 숙주세포.
  16. 제 1 항의 폴리펩타이드, 제 11 항의 항체, 제 13 항의 핵산분자 또는 제 14 항의 벡터를 포함하는 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 조성물은 항체 또는 단백질 치료제의 혈중 반감기(Half-life) 증가용 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제 16 항에 있어서, 상기 조성물은 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 조성물은 암 항원을 인식하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  20. 제 18 항의 약제학적 조성물을 대상(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법.
  21. 하기의 단계를 포함하는 야생형과 비교하여 반감기가 증가된 인간 항체 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드의 제조방법:
    a) 제 1 항의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및
    b) 상기 숙주세포에 의해 발현된 폴리펩타이드를 회수하는 단계.
  22. 하기의 단계를 포함하는 야생형과 비교하여 반감기가 증가된 항체의 제조방법:
    a) 제 1 항의 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 발현하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및
    b) 상기 숙주세포로부터 발현된 항체를 정제하는 단계.
  23. 하기의 단계를 포함하는 야생형과 비교하여 반감기가 증가된 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩타이드의 스크리닝 방법:
    a) 카밧 EU 넘버링 시스템에 따른 M428L 위치 및 추가적인 위치에 돌연변이를 포함하는 Fc 변이체 라이브러리를 구축하는 단계로서, 상기 추가적인 위치는 i) Q311R 또는 L309G; ii) P228L; 또는 iii) P230Q 또는 P230S이며; 및
    b) 상기 Fc 변이체들 중 pH 5.6 내지 6.4에서 FcRn에 대한 친화도가 야생형 보다 높은 Fc 변이체를 선별하는 단계.
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