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WO2018186700A1 - 실크 피브로인으로 코팅되어 장내 정착성이 향상된 유산균을 포함하는 조성물 - Google Patents

실크 피브로인으로 코팅되어 장내 정착성이 향상된 유산균을 포함하는 조성물 Download PDF

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WO2018186700A1
WO2018186700A1 PCT/KR2018/004026 KR2018004026W WO2018186700A1 WO 2018186700 A1 WO2018186700 A1 WO 2018186700A1 KR 2018004026 W KR2018004026 W KR 2018004026W WO 2018186700 A1 WO2018186700 A1 WO 2018186700A1
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WO
WIPO (PCT)
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lactic acid
acid bacteria
silk fibroin
lactobacillus
composition
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PCT/KR2018/004026
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English (en)
French (fr)
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허보혜
김유일
김우리
서민호
김병국
최인석
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CKD Bio Corp
Original Assignee
CKD Bio Corp
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Publication date
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    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/32—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on the health of the digestive tract
    • A23V2200/3204—Probiotics, living bacteria to be ingested for action in the digestive tract
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    • C12N2500/14—Calcium; Ca chelators; Calcitonin

Definitions

  • the present invention has been made by the task number PJ01128701 under the support of the Rural Development Administration, the research and management agency of the task is the Rural Development Administration, the research project name is "next generation Bio Green 21 project”, the research title is "industrial of the food material lowering cholesterol Production Process Development ", Host Organization: Chong Kun Dang Bio, Research Period 2015.01.15-2017.12.31. to be.
  • the present invention relates to a method for improving the survival rate, storage stability, acid resistance or bile resistance and intestinal epithelial cell adhesion of lactic acid bacteria by coating silk fibroin on the surface of lactic acid bacteria, and a lactic acid composition prepared through the same.
  • Lactic acid bacteria are bacteria that produce lactic acid using sugars as energy sources. Lactic acid bacteria are found in the digestive tract, oral cavity, and vagina of humans and mammals, and are widely distributed in nature such as various fermented foods. Lactic acid bacteria are one of the most widely used microorganisms for a long time, and do not produce harmful substances to the intestines of humans or animals and have a pure function of preventing decay in the intestines.
  • lactic acid bacteria are classified into 12 genera ( Lactobacillus, Carnobacterium , Atopobium , Lactococcus, Pediococcus , Tetragenococcus , Leuconostoc , Shoeslla , Oenococcus , Enterococcus, Streptococcus, Vagococcus ).
  • Lactobacillus sp. The aureus genus Lactococcus (Lactococcus sp .), Streptococcus sp ., Leuconostoc sp ., and Pedicoccus sp . sp .) and the like (BioWave, 2009, Vol. 11, No. 7, pp. 1-20).
  • probiotics are living microorganisms or foods containing live microorganisms that benefit the host when ingested in an appropriate amount (FAO / WHO 2001), which helps maintain and control the human intestinal microorganisms at normal levels.
  • Representative probiotics are Lactobacillus and Bifidobacterium , and other yeasts ( Saccharomyces) cerevisiae , Saccharomyces boulardii ) and filamentous fungus ( Aspergillus) oryzae ) are also included in probiotics.
  • probiotics include antibacterial activity, improvement of antibiotic-related diarrhea, reduction of lactose intolerance, anticancer effect, lowering blood cholesterol, suppressing Helicobacter pylori bacteria in stomach, irritable colitis, alleviation of Crohn's disease, ulcerative colitis, immune function control And the like are known (International Dairy Journal, 2007, Vol. 17, pp. 1262-1277).
  • Probiotics can be divided into probiotics, which are human medicines, probiotics as feed additives, and lactobacillus foods, which are a kind of health food.
  • Lactic acid bacteria food is a mixture of live bacteria such as lactobacillus, lactobacillus, bifidus and the like in the food and is made of powder, granules, tablets, capsules, etc. to be stable and easy to consume.
  • lactic acid bacteria food is divided into stages such as lactic acid bacteria culture, cell recovery, lyophilization, grinding and commercialization.
  • lactic acid bacteria are exposed to various physical and chemical stresses. Specifically, lactic acid bacteria are affected by osmotic pressure due to concentration during cell recovery, and in the freeze-drying process, temperature and osmotic pressure are simultaneously affected by ice crystals and dehydration. In addition, it may be exposed to high temperature and high pressure during the milling and commercialization process, and the exposure to air decreases the survival rate due to oxidation of lipids constituting the cell membrane (Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2004, Vol. 3, 117-124; Curr. Issues Intest. Microbiol., 2004, Vol. 5, pp. 1-8; Letters in Applied Microbiology, 1996, Vol. 22, No. 1, pp. 3438).
  • probiotic probiotics In addition, exposure to high temperatures, humidity, and aerobic conditions during the storage or distribution of probiotic probiotics significantly affects the survival and growth of probiotics (Journal of Functional Foods, 2014, Vol. 9, pp. 225- 241).
  • probiotics products are exposed to various stresses in the human body after reaching the intestine after ingestion because they use live bacteria.
  • the stomach is exposed to a strong acidic environment of pH 2 and various digestive enzymes, and when the small intestine is reached, the digestive enzymes and bile acids secreted by the small intestine are affected.
  • ingested probiotic lactic acid bacteria should inhibit growth by various intestinal harmful components and active oxygen even when they reach the intestine, and must adhere to intestinal epithelial cells while competing with various existing microorganisms settled in the intestine. (Immunology and Cell Biology, 2000, Vol. 78, pp. 8088; American Journal of Clinical Nutrition (AJCN), 2001, Vol. 73, pp. 393S398S (suppl); Probiotic Bacteria and Enteric Infections, 2011, Chap. 2, pp. 41- 63).
  • the lactic acid bacterium coating technology as described above has a problem in that the surface of the lactic acid bacteria is not completely coated and still the heat resistance, acid resistance and bile resistance of the lactic acid bacteria are not sufficiently excellent.
  • multi-coating by adding edible oil to the triple coating (Korean Patent Application No. 10-2011-0093074), or adding a water-soluble polymer, hyaluronic acid, a coating having a porous particle and a coating method (four) (Korean Patent Application No.
  • Korean Patent No. 10-1605516 has proposed an effective method to increase the storage stability, acid resistance and bile resistance of a product by adding proline during the manufacturing process, but lactic acid bacteria are added to the small and large intestine after ingestion. There was a problem that can not determine the effects associated with the ability to adhere to the intestinal epithelial cells that can reach efficacy.
  • the present inventors have improved the intestinal epithelial cell adhesion ability of the lactic acid bacteria which can maximize the physiological activity of the probiotic lactic acid bacteria in the intestinal environment after ingestion, as well as improving the stability of the prepared lactic acid bacteria probiotic. Efforts have been made to develop.
  • Another object of the present invention is to provide a composition comprising lactic acid bacteria coated with silk fibroin and cellulose.
  • Another object of the present invention to provide a method for promoting the culture of lactic acid bacteria comprising the step of culturing the lactic acid bacteria in silk fibroin addition medium (medium).
  • Another object of the present invention is to provide a method for increasing the survival rate, storage stability, acid or bile resistance, and intestinal epithelial cell adhesion of lactic acid bacteria:
  • the present invention provides the following compositions or methods.
  • composition comprising lactic acid bacteria coated with silk fibroin.
  • composition of 1 above wherein the lactic acid bacteria are coated with silk fibroin and cellulose.
  • the lactic acid bacteria Lactobacillus ( Lactobacillus ), Lactococcus ( Lactococcus ), Enterococcus ( Genococcus ), Streptococcus ( Gen ), Bifidobacterium ( Bifidobacterium ) Composition characterized in that the lactic acid bacteria selected from the group consisting of.
  • the lactic acid bacteria Lactobacillus ashophilus Lactobacillus acidophilus
  • Lactobacillus plantarum Lactobacillus plantarum
  • Lactobacillus vulgaris Lactobacillus delbrueckii) ssp bulgaricus
  • Lactococcus lactis Enterococcus faecium
  • Enterococcus fecalis Streptococcus thermophilus
  • Bifidobacterium bifidum is a composition characterized in that the lactic acid bacteria selected from the group consisting of.
  • the lactic acid bacteria Lactobacillus ashophilus Lactobacillus acidophilus
  • CKDB007 Accession Number: KCTC13117BP
  • Enterococcus faecium Accession Number: KCTC13115BP
  • Streptoto Streptococcus thermophilus CKDB021 Accession Number: KCTC13118BP
  • Bifidobacterium Bifidobacterium bifidum) CKDB001 accesion Number: KCTC13114BP
  • Bifidobacterium lactis Bifidobacterium lactis
  • a composition characterized in that the lactic acid bacteria selected from the group consisting of CKDB005 Accession Number: KCTC13116BP).
  • compositions according to the above 1 to 7, wherein the composition is selected from the group consisting of food compositions, probiotic compositions, pharmaceutical compositions, and feed compositions.
  • a method of promoting the cultivation of lactic acid bacteria comprising the step of culturing the lactic acid bacteria in medium added silk fibroin.
  • a method for producing a silk fibroin-coated lactobacillus probiotic comprising culturing a lactic acid bacterium in a culture medium for lactobacillus comprising silk fibroin.
  • lactic acid bacteria culture medium further comprises water-soluble calcium.
  • a method of increasing the survival rate, storage stability, acid or bile resistance, and intestinal epithelial cell adhesion of the lactic acid bacteria comprising culturing the lactic acid bacteria in a culture medium for lactic acid bacteria containing silk fibroin.
  • Lactobacillus bacteria Lactobacillus bacteria (Lactobacillus) genus Lactococcus (Lactococcus) genus Enterococcus (Enterococcus) genus Streptococcus (Streptococcus) genus
  • Bifidobacterium Bifidobacterium Method characterized in that the lactic acid bacteria selected from the group consisting of genus.
  • a method of increasing the survival rate, storage stability, acid or bile resistance, and intestinal epithelial cell adhesion of lactic acid bacteria comprising culturing the lactic acid bacteria in a medium for culturing lactic acid bacteria including silk fibroin.
  • the present invention provides a composition comprising lactic acid bacteria coated with silk fibroin.
  • the present invention provides a composition comprising lactic acid bacteria coated with silk fibroin and cellulose.
  • the present inventors confirmed that the addition of silk fibroin in the lactic acid bacteria culture process promotes the cultivation of lactic acid bacteria and shortens the incubation time. Additionally, when silk fibroin is added during or after the culture of lactic acid bacteria, the freeze-drying survival rate and the harsh conditions It was confirmed that the stability was improved.
  • the present inventors recover the culture cells after the completion of the lactic acid bacteria culture and coating the lactic acid cells using the optimized silk fibroin under various treatment conditions significantly increase the resistance to stress, acid resistance and bile resistance, and intestinal epithelial cell adhesion It was confirmed that the performance was greatly improved.
  • silk fibroin refers to an amino acid composite organism produced by live silkworm through extrusion.
  • the molecular weight of silk fibroin is about 84,000 g / mol, and the amino acids glycine, alanine, and serine are distributed in a ratio of 3: 2: 1, and they account for 70 to 80% of all amino acids.
  • tyrosine, valine, aspartic acid, glutamic acid and other amino acids make up about 13% of the total amino acids.
  • Such silk fibroin has been widely used in various fields such as surgical sutures, drug carriers and histological use, burn treatment, and enzyme immobilization with FDA approval.
  • the silk fibroin may be prepared by acid hydrolysis or enzymatic digestion from silkworm cocoon, but may be used without limitation as long as it is commonly used in the art to prepare silk fibroin.
  • the silk fibroin may be silk fibroin pretreated with 85% (v / v) or more of ethanol.
  • more than 85% of the ethanol is specifically fermented alcohol.
  • fermented alcohol is fermented starch or sugar-containing water and distilled to 85 or more alcohol content, and glycosylated enzyme is added to starch (grain, sweet potato, tapioca) or sugar (sugar-) raw materials. After fermentation, it is made by distillation by continuous distillation method and used as a raw material to make dilute shochu.
  • Silk fibroin is also composed of two types, silk I and silk II types.
  • Silk I has ⁇ -helix structure and silk II has ⁇ -sheet structure.
  • silk II has ⁇ -sheet structure.
  • silk is known to increase the strength and elasticity of protein when it is rearranged into ⁇ -sheet structure in an amorphous state, and various methods of pretreatment of silk protein have been studied based on this (Nature, 2003, Vol. 424, pp. 1057-1061).
  • silk fibroin was added at a ratio of 1 to 10% (w / v) relative to the volume of the lactic acid bacteria concentrate, but is not limited thereto.
  • cellulose is the most abundant polymer on the planet, and is a polymer polysaccharide in which glucose is formed by ⁇ -1,4 bonds.
  • Cellulose is currently used in various fields, including the paper and spinning industry, and is also used for tourniquets, skin substitutes, and dietary fibers (Biowave, 2007, Vol. 9, No. 7, pp. 1-11).
  • Food additives allowed by the KFDA include methyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, carboxymethyl cellulose calcium, hydroxypropylmethyl cellulose, methyl cellulose, ethyl cellulose and hydroxypropyl cellulose, and phthalic acid widely used as an enteric coating material.
  • Hydroxymethyl cellulose HydroPropyl MethylCellulose Phthalate, HPMCP has been used as a pharmaceutical additive since 1971.
  • HPMCP is a polymer having a pH-dependent solubility made from natural pulp as a raw material by chemical synthesis. Disintegration and elution do not occur in gastric fluids with low carboxyl groups substituted with cellulose rings. Elution occurs quickly.
  • the cellulose is coated on the lactic acid bacteria coated with silk fibroin, so that disintegration and elution do not occur under artificial gastric juice conditions, but disintegration and elution occurs rapidly under serous conditions at neutral pH.
  • the present invention provides a method for promoting the culture of lactic acid bacteria comprising the step of culturing the lactic acid bacteria in silk fibroin addition medium (medium).
  • Lactic acid bacteria culture in the present invention is carried out in conventional known lactic acid culture medium and culture conditions.
  • Silk fibroin is classified as a high-purity protein (97%) among the components present in nature, and consists of various amino acids and peptide combinations of amino acids that are components of human protein. .
  • glycine, alanine, and serine which make up the largest proportion of silk fibroin, make up 70 ⁇ 80% of the total amino acids, and other components of tyrosine, valine, aspartic acid, glutamic acid, and other amino acids. As it occupies, it can be used as an important nitrogen source component in lactic acid bacteria culture.
  • the silk fibroin addition medium of the present invention is 0.001 to 5% (w / v), 0.001 to 4% (w / v), 0.001 to 3% of silk fibroin based on the volume of the medium (w / v), 0.001 to 2% (w / v), 0.001 to 1% (w / v), 0.01 to 5% (w / v), 0.01 to 4% (w / v), 0.01 to 3% (w / v), 0.01 to 2% (w / v), 0.01 to 1% (w / v), 0.01 to 0.5% (w / v), 0.01 to 0.4% (w / v), 0.01 to 0.3% (w / v), 0.01 to 0.2% (w / v), 0.1 to 5% (w / v), 0.1 to 4% (w / v), 0.1 to 3% (w / v), 0.01 to 0.2% (w / v), 0.1 to 5% (w
  • the lactic acid bacteria cultured by the method of the present invention can be seen that the growth is accelerated to shorten the incubation time.
  • the lactic acid bacteria culture medium of the present invention may further include water-soluble calcium.
  • the water-soluble calcium may be used calcium citrate, calcium hydroxide, calcium chloride, calcium lactate, dibasic calcium phosphate, monobasic calcium phosphate as food additives.
  • the concentration of the water-soluble calcium is 0.001 to 5% (w / v), 0.001 to 4% (w / v), 0.001 to 3% (w / v), 0.001 to 2% (w / v), 0.001 To 1% (w / v), 0.01 to 5% (w / v), 0.01 to 4% (w / v), 0.01 to 3% (w / v), 0.01 to 2% (w / v), 0.01 To 1% (w / v), 0.01 to 0.5% (w / v), 0.01 to 0.4% (w / v), 0.01 to 0.3% (w / v), and 0.01 to 0.2% (w / v ), Most specifically, 0.1% (w / v), but is not limited thereto.
  • the lactic acid bacteria culture medium of the present invention may further include cellulose.
  • the cellulose is methyl cellulose, carboxymethyl cellulose sodium, carboxymethyl cellulose calcium, hydroxypropyl methyl cellulose, methyl cellulose, ethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose and phthalic acid hydroxymethyl cellulose (Hydroxypropyl methylcellulose phthalate) which are allowed as food additives by the Food and Drug Administration. , HPMCP) may be used, but is not limited thereto.
  • the present invention the survival rate, storage stability, acid resistance or bile resistance, and enteric epithelial cell adhesion of lactic acid bacteria comprising the step of culturing the lactic acid bacteria in the culture medium for lactic acid bacteria containing silk fibroin It provides a way to increase performance.
  • lactic acid produced by lactic acid bacteria forms salts with water-soluble calcium and silk fibroin and coagulates with lactic acid bacteria. It can be coated more stably in the culturing and concentration step.
  • the lactic acid bacteria coated with silk fibroin of the present invention can confirm the effect of increasing cell hydrophobicity and mucin adhesion, intestinal epithelial cell adhesion, and when ingesting the lactic acid bacteria probiotic prepared in this way It can be stably attached to the intestinal epithelial cells to enhance the bioactive effect of lactic acid bacteria.
  • the lactic acid bacteria complex coated with silk fibroin and cellulose it can be confirmed that the cell hydrophobicity and mucin adhesion ability, intestinal epithelial cell adhesion ability is excellent.
  • the lactic acid bacterium composition of the present invention is excellent in acid resistance, bile resistance test conditions for determining the intestinal environmental stability of existing probiotic probiotics, and freeze-dried survival rate and harsh test conditions for determining storage stability It shows stability (survival rate).
  • the term "resistance against acid” refers to a property in which the lactic acid bacteria of the present invention well withstand acids below pH 7.
  • acid resistance means resistance of lactic acid bacteria to artificial gastric juice of pH 1-3, for example, pH 2.0 or 2.5, and is measured by viability by comparing the viable cell count of lactic acid bacteria before and after contact with artificial gastric juice. This is possible.
  • the artificial gastric juice is prepared by adjusting the pH of 1N hydrochloric acid (HCl) aqueous solution to 2.0 or 2.5, if necessary, a certain concentration (1-2) of the gastric secretion enzyme pepsin (pepsin) %) But is not limited thereto.
  • bile resistance means resistance to bile (gallbladder) of the lactic acid bacteria of the present invention.
  • biliary resistance refers to resistance of lactic acid bacteria to artificial serous solutions including artificial serous fluid (artificial bile juice), for example, 0.1-1% of bile acids (oxygal, oxigall), before and after contact with artificial serous fluid. Survival rate can be measured by comparing the number of live bacteria of lactic acid bacteria.
  • the artificial intestinal fluid is prepared by adding 0.5% bile acid (oxygal, oxigall) to the liquid medium, but may be prepared by adding a bile extract (bile extract), but is not limited thereto. .
  • freeze-drying is a freeze-drying method mainly used as a long-term preservation method of lactic acid bacteria, and is generally performed at -20 ° C to -80 ° C.
  • lactic acid bacteria are reduced in cell activity and viability due to physical and biochemical stress.
  • Freeze-dried survival rate is measured by viability comparison of the live cell count of lactic acid bacteria before and after lyophilization.
  • the cells are recovered and frozen at 0 to -45 ° C, specifically -20 ° C to -45 ° C, dried in a freeze dryer, pulverized and powdered and cultured again in a medium Lactobacillus (cfu) of the sample is measured by comparing the number of lactic acid bacteria of the sample before lyophilization, but is not limited thereto.
  • a medium Lactobacillus (cfu) of the sample is measured by comparing the number of lactic acid bacteria of the sample before lyophilization, but is not limited thereto.
  • the term "severity test conditions” refers to a condition for measuring resistance to external conditions of lactic acid bacteria, mainly means resistance to high temperature and high humidity. According to one embodiment of the invention, the harsh test conditions can be measured at 40 °C, humidity 70-75%, but is not limited thereto.
  • Adhesion of the lactic acid bacteria to intestinal epithelial cells is affected by the survival rate of the lactic acid bacteria, adhesion of the host cells and correlation with other cells, and in particular, it is known that the lactic acid bacteria are greatly affected by the cell surface characteristics of the lactic acid bacteria. .
  • the cell surface characteristics affecting the adherence of lactic acid cells are largely related to the electrostatic balance, van der Waals force and hydrophobicity of the cell surface.
  • cell surface hydrophobicity is an indicator that correlates with the adhesion ability between bacterial cells and intestinal epithelial cells, and is used as an important indicator for confirming the adhesion ability of lactic acid strains including Lactobacillus and Bifidobacterium (Letters in Applied Microbiology, 1998, Vol. .27, pp. 307-310).
  • Beta-sheet ( ⁇ -sheet) structure has a very strong heat characteristics compared to the alpha helix structure can improve the stability when used as a coating and exhibits a hydrophobic characteristic.
  • Lactic acid bacteria used in the present invention is not particularly limited, and the lactic acid bacteria, for example Lactobacillus bacteria (Lactobacillus) genus Lactococcus (Lactococcus) genus Enterococcus (Enterococcus) genus Streptococcus (Streptococcus) genus, and Bifidobacterium It may be a lactic acid bacterium selected from the group consisting of Bifidobacterium genus.
  • Lactobacillus bacteria Lactobacillus
  • Lactococcus Lactococcus
  • Enterococcus Enterococcus
  • Streptococcus Streptococcus
  • Bifidobacterium It may be a lactic acid bacterium selected from the group consisting of Bifidobacterium genus.
  • the lactic acid bacteria is specifically Lactobacillus acidophilus ( Lactobacillus acidophilus ), Lactobacillus plantarum ( Lactobacillus plantarum ), Lactobacillus vulgaris ( Lactobacillus delbrueckii) ssp bulgaricus ), Lactococcus lactis ), Enterococcus faecium , Enterococcus pecalis fecalis ), Streptococcus thermophilus , Bifidobacterium bifidum , and Bifidobacterium lactis .
  • the lactic acid bacterium is most specifically Lactobacillus acidophilus ( Lactobacillus acidophilus ) CKDB007 (Accession Number: KCTC13117BP), Enterococcus ( Enterococcus) faecium ) CKDB003 (Accession Number: KCTC13115BP), Streptococcus thermophilus CKDB021 (Accession Number: KCTC13118BP), Bifidobacterium Bifidobacterium bifidum ) CKDB001 (Accession No .: KCTC13114BP), and Bifidobacterium lactis CKDB005 (Accession No .: KCTC13116BP).
  • the composition characterized in that the lactic acid bacteria of the present invention may be selected from the group consisting of food composition, probiotic composition and feed composition.
  • composition of the present invention is made of a food composition
  • lactic acid bacteria as an active ingredient
  • additives include, for example, proteins, carbohydrates, fats, nutrients, seasonings and flavoring agents.
  • Such carbohydrates include monosaccharides (eg, glucose, fructose, etc.), disaccharides (eg, maltose, sucrose, oligosaccharides, etc.) and polysaccharides (eg, dextrins, cyclodextrins, etc.).
  • Sugars and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, erythritol, etc.
  • flavoring agents natural flavoring agents (tauumatin, stevia extract (e.g., rebaudioside A, glycyrginine, etc.)) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspar) Tom, etc.) can be used.
  • citric acid liquid fructose, sugar, glucose, acetic acid, malic acid, fruit juice, jujube extract or licorice extract may be further included. have.
  • the food composition of the present invention includes processed forms of all natural materials such as food, functional food, nutritional supplement, health food and food additives.
  • Food compositions of this type can be prepared in various forms according to conventional methods known in the art.
  • the health food may be prepared by drinking the lactic acid bacteria itself in the form of tea, juice and drinks, or may be ingested by granulation, encapsulation and powdering.
  • foods include beverages (including alcoholic beverages), fruits and processed foods (e.g. canned fruit, canned foods, jams, marmalade, etc.), fish, meat and processed foods (e.g. ham, sausage cornbeans, etc.). ), Breads and noodles (e.g. udon, soba, ramen, spaghetti, macaroni, etc.), fruit juices, various drinks, cookies, syrups, dairy products (e.g.
  • lactic acid bacteria of the present invention can be prepared by adding the lactic acid bacteria of the present invention.
  • various seasonings eg, miso, soy sauce, sauce, etc.
  • the lactic acid bacteria of the present invention in the form of food additives can be prepared in powder or concentrate form.
  • the pharmaceutical composition of the present invention includes a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical compositions of the present invention are those commonly used in the preparation, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like. It doesn't happen.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and preferably applied by oral administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated in various oral or parenteral dosage forms as follows, but is not limited thereto.
  • Formulations for oral administration include, for example, tablets, pills, hard / soft capsules, solutions, suspensions, emulsifiers, syrups. Granules, elixirs, and the like, these formulations may be used one or more diluents or excipients, such as fillers, extenders, wetting agents, disintegrants, lubricants, binders, surfactants, etc. that are commonly used in addition to the active ingredient.
  • a disintegrant agar, starch, alginic acid or its sodium salt, calcium monohydrogen phosphate anhydride, etc. may be used, and as lubricant, silica, talc, stearic acid or its magnesium salt or calcium salt, polyethylene glycol, etc.
  • magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, tragacanth, methyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, polyvinylpyrrolidine, low-substituted hydroxypropyl cellulose, and the like may be used.
  • lactose dextrose, sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose.
  • Glycine or the like may be used as a diluent, and in some cases, generally known boiling mixtures, absorbents, colorants, flavors, sweeteners, and the like may be used together.
  • the composition may be sterile or contain preservatives, stabilizers, hydrating or emulsifiers, salts for controlling osmotic pressure, buffers and other auxiliaries and other therapeutically useful materials, which are conventional methods of mixing, granulating or coating methods. It can be formulated accordingly.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may vary depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, condition of food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to response of the patient. Can be.
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dosage form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of solutions, suspensions, syrups or emulsions in oils or aqueous media, or in the form of extracts, powders, powders, granules, tablets or capsules, and may further comprise dispersants or stabilizers.
  • Lactobacillus coated with the silk fibroin of the present invention and a composition comprising the same, and a method for promoting the culture of lactic acid bacteria by adding silk fibroin to the culture medium for lactic acid bacteria, a method for producing lactic acid bacteria coated with silk fibroin, survival rate of lactic acid bacteria, It may be applied in cross manner with each other in a method of increasing storage stability, acid resistance or bile resistance, and intestinal epithelial cell adhesion. Lactic acid bacteria composition prepared by the above technique can be applied to food compositions, nutraceuticals and pharmaceutical compositions. About the content of overlapping range, the description is abbreviate
  • the present invention provides a composition comprising lactic acid bacteria coated with silk fibroin, or lactic acid bacteria coated with silk fibroin and cellulose.
  • the present invention also provides a method for promoting the cultivation of lactic acid bacteria comprising the step of culturing the lactic acid bacteria (medium) medium added silk fibroin.
  • the present invention also provides a method for increasing the survival rate, storage stability, acid or bile resistance, and intestinal epithelial cell adhesion of lactic acid bacteria.
  • the present invention improves the survival rate and storage stability of lactic acid bacteria by coating the lactic acid bacteria using silk fibroin prepared through various treatment methods, and confirmed the effect of increasing acid resistance or bile resistance and intestinal epithelial cell adhesion ability. It was.
  • FIG. 1 is a diagram showing a process for producing a probiotic lactic acid bacteria using silk fibroin.
  • Figures 2a and 2b is a view showing a comparison of the consumption pattern and culture of the carbon source when using silk fibroin as a lactic acid bacteria medium.
  • Figure 3 is a photograph of the properties of the lactic acid bacteria probiotic prepared using silk fibroin and cellulose using an EBSD / FE-SEM (scanning electron detector).
  • Figure 4 is a diagram showing a comparison of the zeta-potential according to the artificial gastric juice and artificial intestinal conditions of the probiotic lactic acid bacteria coated with silk fibroin.
  • 5 is a view showing a comparison of the binding capacity of mucin and each coating condition using silk fibroin and cellulose.
  • Figure 6 is a view showing a comparison of the binding capacity of the intestinal epithelial cells (HT-29) under each coating condition using silk fibroin and cellulose.
  • % used to indicate the concentration of a particular substance is solid / solid (weight / weight)%, solid / liquid (weight / volume)%, and Liquid / liquid is (volume / volume)%.
  • the inventors performed the following experiment to confirm the effect of the addition and coating of silk fibroin of the present invention on lactic acid bacteria.
  • 1 is a process chart showing the sequence and contents of the experiment performed by the inventors.
  • Example 1 of the present invention silk Isolation and Purification of Fibroin Components
  • Silk is a natural protein that can be obtained naturally, and silk fibroin is composed of 18 kinds of amino acids among the 20 amino acids that make up human proteins.
  • the liquid silk biosynthesized from silkworm silk glands composed of 18 kinds of natural amino acids forms a highly crystallized fibrous array due to silkworm sedimentation, and contains about 75% fibroin and about 25% sericin. It consists of two components.
  • Silk fibroin can be broadly classified into (i) acid hydrolysis and (ii) protein hydrolysis by calcium chloride solution and enzyme.
  • Silk fibroin used for lactobacillus coating in the present invention was obtained through a refining process of separating and removing the sericin component from the cocoon obtained by breeding silkworms (Bombyx Hori).
  • the purified water was warmed (95 ° C.), and then sodium oleate and Na 2 CO 3 were added, and when completely dissolved, the cocoon was boiled for about 40 minutes, followed by dehydration. .
  • the cocoon was added at a concentration of 1.84% (w / v) with respect to purified water, and sodium oleate was refined by adding 0.0092% (w / v) and Na 2 CO 3 at a concentration of 0.0055% (w / v). do. 2N HCl, which is commonly used for acid hydrolysis, was added thereto, acid hydrolyzed at 110 ° C.
  • the decomposed solution was filtered to neutralize with an aqueous NaOH solution.
  • the salts generated during the neutralization process were removed using a dialysis tubing cellulose membrane, thereby preparing purified acid hydrolyzed silk fibroin.
  • the average molecular weight of the peptide obtained through acid hydrolysis is about 200-10,000 to obtain silk fibroin of a relatively small peptide.
  • silkworm cocoons were refined in the same manner as in Example 1-1. Subsequently, Alcalase, Delvorase, Flavorzyme, Protamax (known as protease produced by Bacillus licheniformis, Bacillus steamorphophilus or Aspergillus niger) ) (Pavision Biochem Co., Ltd.) and Papain T100 (Vision Biochem Co., Ltd.) recovered from Papaya were added at 5% concentration for about 6-10 hours at 60-80 °C Treated. The decomposed silk fibroin solution was exposed to high temperature conditions of 95 ° C. for 2 hours prior to use in the lactic acid bacteria coating process to inactivate proteolytic enzymes. Silk fibroin prepared by the above enzymatic decomposition method is known to have high solubility and high body absorption rate.
  • each of the silk fibroin (acid hydrolysis and enzymatic degradation) prepared by the above method was recovered to be described later
  • Help Enterococcus faecium ) CKDB003 (Accession No .: KCTC13115BP), Lactobacillus acidophilus CKDB007 (Accession No .: KCTC13117BP), Streptococcus thermophilus CKDB021 (Accession No .: KCTC13118bac), Lactobacillus acidophilus Tees (Bifidobacterium lactis) CKDB005 (accession number: KCTC13116BP) and Bifidobacterium Bifidobacterium bonus (Bifidobacterium bifidum ) CKDB001 (Accession Number: KCTC13114BP) was applied to the culture and coating process of
  • Silk protein the major component of sericin and fibroin recovered from cocoon, is composed of 75% fibroin protein, 25% sericin protein, and about 3% mineral carbohydrates.
  • Silk fibroin is classified as a high-purity protein (97%) among the components present in nature, and consists of various amino acids and peptide combinations of amino acids that are components of human protein. .
  • Silk fibroin constituent amino acids The above components are known as amino acid components constituting collagen. Therefore, the silk fibroin has the same rigid properties as collagen and the constituent amino acids can be used as an important nitrogen source component in the culture of lactic acid bacteria.
  • Example 2-1 As lactic acid bacteria culture ingredient Silk fibroin Use
  • the silk fibroin component of the present invention acts as an important factor (growth factor) of lactic acid bacteria growth, thereby promoting the culture of lactic acid bacteria and reducing the incubation time.
  • growth factor growth factor
  • Example 2-2 Water-soluble calcium and lactic acid bacteria silk Use of Fibroin
  • the silk fibroin used in the culture was used a dry powder prepared through the method of Example 1, the addition concentration was added at a rate of 0 ⁇ 3% (w / v) of the culture volume.
  • additional water-soluble calcium, calcium citrate, calcium hydroxide, calcium chloride, calcium lactate, calcium phosphate, and calcium monophosphate allowed as food additives were used, and the concentrations of the additives were 0, 0.1, and 0.5% (w / v, respectively).
  • the lyophilized survival rate and the survival rate under severe conditions (40 ° C., humidity 70-75%) of the prepared lactic acid bacteria probiotics were compared.
  • the cell recovery and lyophilization process parts were subjected to conventional methods (freeze-drying under lyophilization conditions between 0 ° C and -45 ° C by rapid freezing in a -40 ° C freezer after cell recovery through centrifugation), and lyophilization survival rate.
  • the percentage of viable bacteria after freeze-drying was divided by the number of viable cells before freeze-drying.
  • the cultured cells were cultured and concentrated using the optimized culture medium, and there was no separate coating process.
  • silk fibroin and water-soluble calcium were added together as a medium component in the culture of lactic acid bacteria. After incubation and concentration it was coated with silk fibroin.
  • the lactic acid bacteria coating process was applied to the conventional method (Example 2-2), and was applied to the experimental example of Example 4 after grinding the lactic acid bacteria probiotic using a grinder.
  • Example 3 Fermented alcohol Preprocessed silk Fibroin Coatings-Preparation of Lactic Acid Bacteria Probiotics
  • the inventors have discovered the optimal silk fibroin for coating on the lactic acid bacteria, and in order to determine the effect on the coating quality of the lactic acid bacteria according to the conditions of the applied silk fibroin, the silk fibroin was pretreated with fermentation alcohol. Specifically, the silk fibroin prepared by the enzymatic digestion method of Example 1-2 of the present invention, the fermentation spirits were mixed at a rate of 30%, homogenized under aseptic conditions and room temperature (25 °C) conditions for 18 to 24 hours It was political.
  • Example 3 lactic acid bacteria were cultured and coated in the same manner as in Example 2-2, except that silk fibroin, which had been pretreated with fermentation alcohol, was used instead of silk fibroin that had not been pretreated.
  • the present inventors prepared the lactic acid bacteria probiotic coated with a combination of cellulose used as a conventional enteric coating material with the silk fibroin of the present invention in order to improve the properties of the lactic acid bacteria probiotic coated with the silk fibroin and the intestinal environment, etc. .
  • the silk fibroin for coating the lactic acid bacteria probiotic was used dry powder prepared through the method of Example 1, 1 to 10% (w / v) at the rate of addition.
  • the food additives allowed by the KFDA are methyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, calcium carboxymethyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, methyl cellulose, ethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose and hydroxymethyl cellulose (Hydroxypropyl methylcellulose phthalate). , Hereinafter HPMCP) was applied as a coating.
  • HPMCP Any Coast, Samsung Fine Chemicals
  • sodium carboxymethylcellulose Sudsung Fine Chemicals
  • the present inventors carried out the following experiment to check the properties of lactic acid bacteria probiotics according to the presence and absence of the coating method and silk fibroin prepared in Examples 2 to 4.
  • Example 2-3 No addition (uncoated control) Experiment group 1
  • Example 2-3 Silk Fibroin Coating
  • Example 3 Fermentation Alcohol Pretreatment-Silk Fibroin Coating
  • Example 4 Fermentation Alcohol Pretreatment-Silk Fibroin and Cellulose Composite Coating
  • Example 3 the control (Example 2-3, lactobacillus probiotics of the uncoated control), Experimental Group 1 (Example 2-3, silk fibroin coating-lactic acid bacteria probiotic), Experimental Group 2 (Example 3, fermented alcohol pretreatment Silk fibroin-coated-lactic acid bacteria probiotics), and samples of Experiment Group 3 (Example 4, fermented alcohol pre-treated silk fibroin and cellulose composite coating-lactic acid bacteria probiotics) were fixed to the metal plate using carbon tape, respectively, and platinum with a plastic sputter After coating, it was observed using an EBSD / FE-SEM (scanning electron detector) at an acceleration voltage of 10 kV.
  • EBSD EBSD / FE-SEM
  • the fermentation alcohol treatment causes silk fibroin to be regenerated and processed into a ⁇ -sheet structure, and inactivates the enzyme used in the enzymatic digestion method to decompose the lactic acid bacteria and silk fibroin by the enzyme in the coating process. This is to prevent.
  • Cell surface hydrophobicity is an indirect indicator of the intestinal adhesion ability of lactic acid bacteria in vitro and is used as one of the primary screening methods to confirm the adhesion ability of lactic acid bacteria including Lactobacillus and Bifidobacterium .
  • the experiment was conducted in the following manner to confirm the hydrophobicity of the lactic acid bacteria probiotic coated with silk fibroin.
  • the suspension prepared lactic acid bacteria sample was mixed with toluene and then mixed for 20 minutes in a water bath at 37 ° C., toluene was removed, and the OD 600 value of the aqueous layer was measured.
  • the hydrophobicity of the lactic acid bacteria probiotic was calculated by the following formula.
  • the hydrophobicity of the cells was improved compared to the uncoated control group.
  • the hydrophobicity of lactic acid bacteria probiotic was generally high when the lactic acid bacteria were coated using silk fibroin prepared by enzymatic decomposition rather than silk fibroin prepared by acid hydrolysis.
  • the silk fibroin was pretreated with fermented alcohol. When coating the sieve it was confirmed that the hydrophobicity of the cells further improved.
  • the zeta potential refers to the potential difference across the fluidized bed of an electrical double layer caused by an electrokinetic phenomenon.
  • the potential of the membrane surface cannot be measured directly, but instead, the zeta potential can be measured experimentally to determine the electrochemical properties of the surface (Chemistry of the solid-water interface, John Wiley & Sons, Inc, 1992).
  • This zeta potential acts as an important parameter for determining the stability or aggregation of dispersed particles and may have an important meaning in confirming the effect of the product in the body when ingesting the probiotic lactic acid bacteria.
  • the average value of the analysis results measured five times using a zeta potential analyzer using a phase analysis light scattering (PALS) technique was calculated and used.
  • each uncoated (control), silk fibroin coating (experimental zone 1), fermentation spirit pretreatment silk fibroin coating (experimental zone 2), and silk fibroin and cellulose composite coating (experimental zone 3) artificially intestinal environment Prepared in the aqueous solution of the experimental conditions that mimics the zeta potential value was confirmed.
  • the silk fibroin and cellulose complex coated lactic acid bacteria probiotic of the present invention can increase the survival rate of lactic acid bacteria through strong cohesive force under artificial gastric juice conditions, and at the point of reaching the small intestine and the large intestine, the absolute value of zeta potential is increased. As it is lowered, it was confirmed experimentally by measuring the zeta potential value that the intestinal fixability of the silk probroin-coated lactic acid bacteria increases and thus the survival rate in the intestinal environment is high.
  • the ability of the microorganism to adhere is related to the electrostatic balance of the cell walls, van der Waals bonds and hydrophobicity. Hydrophobicity is known to be an important factor for bacterial cells to adhere to mucosal or epithelial cells (Environ Microbiol, 2000, Vol. 66 (6), pp. 2548-2554; International Dairy Journal, 2005, Vol. 15, pp. 1289-1297 ).
  • intestinal epithelial cells form a gel-like substance called mucin to form a membrane to protect the barrier.
  • mucin the intestinal mucosa component
  • lactic acid bacteria having high hydrophobic characteristics are also expected to have excellent intestinal adhesion.
  • the binding ability of mucin and lactic acid bacteria was confirmed by evaluating the adhesion ability of each of the lactic acid bacteria to mucin, the intestinal mucosa. Mucin adhesion capacity test method was applied to Munoz-Provencio (Gastroenterology. 1998, Vol. 115, pp 874-882).
  • mucin binding ability was increased in the order of control group, experimental group 1, experimental group 3, and experimental group 2, and the mucin binding ability was greatly increased by pretreatment of silk fibroin. It was confirmed that a slight decrease compared to the mucin binding ability of the lactic acid bacteria probiotic coated with the prepared silk fibroin.
  • the adhesion capacity of the lactic acid bacteria was confirmed using the human colon sarcoma cell line HT-29.
  • FCS Fecal calf serum
  • antibiotics 100 U / ml penicillin, 100 U / ml streptomycin
  • DMED medium 10% Fecal calf serum
  • antibiotics 100 U / ml penicillin, 100 U / ml streptomycin
  • 29 cells were washed with PBS buffer and then aliquoted into 6-well plates to 5 ⁇ 10 8 cells / ml.
  • Each lactic acid bacteria probiotic was suspended in PBS to a concentration of 1 ⁇ 10 9 / ml, and then inoculated in well plates, respectively, and incubated with HT-29 cells under CO 2 5% and 37 ° C. for 2 hours.
  • the lactic acid bacteria were removed by washing 5 times with PBS and then treated with 0.05% trypsin-0.02% EDTA for 2 minutes to separate HT-29 cells and lactic acid bacteria attached to the well plate.
  • the isolated cells were diluted by dilution with dilution water, cultured in MRS or BL agar plates, and the viable cell count was measured (Trends. Food. Sci. Technol., 1999, Vol. 10, pp 405-410; Soc.Food.Sci.Nutr., 2016, Vol. 45, pp 12-19).
  • Epithelial cell adhesion rate was calculated using the following equation.
  • lactic acid bacteria were fluorescently stained using a LIVE / DEAD® BacLight TM Bacterial Viability kit to visually confirm the degree of adhesion of intestinal epithelial cells and lactic acid cells, and then observed under an optical microscope.
  • the adhesion of HT-29 cell line was increased when silk fibroin was coated than the control, and the silk fibroin coating after the pretreatment was further increased.
  • the composite coating of silk fibroin and cellulose applied with the pretreatment process was applied, it was confirmed that the adhesion ability to HT-29 cells was slightly decreased compared to the lactic acid bacteria probiotics prepared by coating with the silk fibroin applied with the pretreatment process.
  • the probiotic was exposed to artificial gastric juice conditions of pH 2.5 and pH 2.0, and the viable cell count was analyzed. Specifically, artificial gastric juice conditions were adjusted to final pH 2.0, pH 2.5 using artificial gastric juice conditions (2.0 g sodium chloride, 24.0 ml / L dilute hydrochloric acid, pH 1.2) on the food disintegration test, and then the probiotic powder was adjusted to 10% concentration. By exposure. In consideration of gastric contraction, 100 reciprocating movements per minute were performed using Dancing Machine (BMS) to expose the gastrointestinal tract to conditions similar to those of the gastrointestinal tract. Was carried out. The experimental group exposed to the gastric juice conditions were readjusted according to the conventional viable cell count after adjusting the pH to 7.0.
  • BMS Dancing Machine
  • bile resistance was used aseptically added medium to filter the bile acid 0.5%, and the number of viable cells was measured according to a conventional method after the reaction for 2 hours by adding probiotic powder at a 10% concentration.
  • lactic acid bacteria probiotics In the case of lactic acid bacteria probiotics, a certain number of live bacteria should be maintained and preserved for a short period of 12 months and a long period of 24 months.
  • Enterococcus series of Enterococcus Passage Titanium E. faecium
  • Enterococcus faecalis For ssanggugyun the body such as lactic acid bacteria (E. faecalis) temperature, look for high stability when exposed to humid conditions, most of the lactic acid bacteria body In case of, the stability tends to decrease significantly when exposed to high temperature and humidity conditions.
  • FIG filler's (L.acidophilus) species of the coating process using the silk fibroin through was determined that this increased significantly stable in harsh conditions, other than Bifidobacterium bipyridinium bushes (B. bifidum), Streptococcus Thermo filler's (S.thermophilus) species also make slightly improved results in stability in harsh conditions It was.

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Abstract

본 발명은 실크 피브로인을 유산균의 표면에 코팅함으로써 유산균의 생존율, 저장안정성, 내산성 또는 내담즙성, 및 장 상피세포 부착능을 향상시키는 방법과 이를 통해 제조된 유산균 조성물에 관한 것이다. 종래 기술이 다단계 코팅을 통하여 유산균체 외부에 물리적인 방어벽만을 구축함으로써 섭취 시 유산균의 장 상피세포 부착능에 대한 효과를 확인할 수 없다는 한계가 있었으나, 본 발명은 누에고치에서 추출한 실크 피브로인을 이용하여 유산균을 코팅함으로써 보관, 유통 조건에서 안정성을 높일 뿐만 아니라, 특히 장관환경 내 안정성 및 장 정착능을 현저히 증가시키는 방법이다.

Description

실크 피브로인으로 코팅되어 장내 정착성이 향상된 유산균을 포함하는 조성물
본 발명은 농촌진흥청의 지원 하에서 과제번호 PJ01128701에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리 전문기관은 농촌진흥청, 연구사업명은 "차세대바이오그린21 사업", 연구과제명은 "콜레스테롤 저하 건강기능식품 소재의 산업적 생산공정 개발", 주관기관은 (주)종근당바이오, 연구기간은 2015.01.15-2017.12.31. 이다.
본 특허출원은 2017년 4월 7일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2017-0045326호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 실크 피브로인을 유산균의 표면에 코팅함으로써 유산균의 생존율, 저장안정성, 내산성 또는 내담즙성 및 장 상피세포 부착능을 향상시키는 방법과 이를 통해 제조된 유산균 조성물에 관한 것이다.
유산균(lactic acid bacteria)은 당류를 에너지원으로 사용하여 유산을 생성하는 세균이다. 유산균은 사람이나 포유동물의 소화관, 구강 및 질 등에서 발견되며 각종 발효식품 등 자연계에 널리 분포되어 있다. 유산균은 인류가 가장 오랫동안 광범위하게 활용하고 있는 미생물 중 하나로서, 사람이나 동물의 장에 해로운 물질을 생성하지 않으며 장내에서 부패를 방지하는 순기능을 가진 미생물이다.
현재 유산균은 12개 속(Lactobacillus, Carnobacterium , Atopobium , Lactococcus, Pediococcus , Tetragenococcus , Leuconostoc , Weisella , Oenococcus , Enterococcus, Streptococcus, Vagococcus)으로 분류된다. 일반적으로 우리가 사용하고 있는 유산균은 간균인 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 구균인 락토코커스 속(Lactococcus sp.), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.), 그리고 페디오코커스 속(Pedicoccus sp.) 균 등이 있다 (BioWave, 2009, Vol.11, No. 7, pp. 1-20).
한편, 프로바이오틱스(Probiotics)란 적당량을 섭취했을 때 숙주에 이로움을 주는 살아있는 미생물 또는 살아있는 미생물이 함유된 식품을 말하며(FAO/WHO 2001), 인체의 장내 미생물을 정상적인 수준으로 유지하고 조절하는데 도움을 준다. 대표적인 프로바이오틱스로는 유산균과 비피더스균(Bifidobacterium)이 있으며 그 외 효모(Saccharomyces cerevisiae , Saccharomyces boulardii)와 사상균(Aspergillus oryzae) 등도 프로바이오틱스에 포함된다.
프로바이오틱스의 대표적인 효능으로는 항균활성, 항생제 관련 설사개선, 유당불내증 경감, 항암 효과, 혈중 콜레스테롤 저하, 위 내 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori) 균 억제, 과민성 대장염, 크론병, 궤양성 대장염 경감, 면역 기능 조절 등이 알려져 있다(International Dairy Journal, 2007, Vol.17, pp. 1262-1277). 프로바이오틱스는 인체 의약품인 정장제나 유산균 제제, 사료첨가제로서의 생균제 및 건강식품의 일종인 유산균 식품으로 구분할 수 있다. 유산균 식품은 유산간균, 유산구균, 비피더스균 등의 생균을 식품에 혼합한 것으로 안정적이고 섭취가 용이하도록 분말, 과립, 정제, 캡슐 등으로 만든 것을 말한다.
이와 같은 유산균 식품을 제조하는 공정은 유산균 배양, 균체 회수, 동결건조, 분쇄 및 제품화 등의 단계로 구분된다. 유산균 식품의 제조 과정에서 유산균은 다양한 물리적 및 화학적 스트레스에 노출된다. 구체적으로 유산균은 균체 회수시 농축에 따른 삼투압의 영향을 받으며 동결건조 과정에서는 얼음 결정 및 탈수(dehydration) 현상으로 인하여 온도와 삼투압의 영향을 동시에 받게 된다. 또한, 분쇄 및 제품화 과정에서 고온, 고압에 노출될 수 있으며, 공기 중에 노출됨으로 인하여 세포막을 구성하고 있는 지질의 산화로 생존율이 감소한다(Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2004, Vol.3, pp. 117-124; Curr. Issues Intest. Microbiol., 2004, Vol.5, pp. 1-8; Letters in Applied Microbiology, 1996, Vol.22, No. 1, pp. 3438).
또한, 유산균 생균제를 보관 또는 유통하는 기간 동안 높은 온도와 습도 그리고 호기적인 조건에 노출될 시 프로바이오틱스의 생존과 성장에 큰 영향을 미치게 된다(Journal of Functional Foods, 2014, Vol.9, pp. 225-241).
한편, 다른 산업용 미생물 발효 산물과 달리 프로바이오틱스 제품은 생균을 이용하기 때문에 섭취 후 장에 도달하기 전 인체 내에서 다양한 스트레스에 노출된다. 예를 들면, 위장에서는 pH 2 정도의 강한 산성 환경과 다양한 소화 효소에 노출되고, 소장에 도달하였을 때는 소장에서 분비되는 소화 효소와 담즙산 등의 영향을 받게 된다. 나아가, 섭취한 프로바이오틱스 유산균체는 장에 도달하더라도 각종 장내 유해성분과 활성산소 등에 의한 생육 저해가 일어나고, 동시에 장내에 정착한 기존의 다양한 미생물들과 경쟁하면서 장 상피 세포에 부착해야 한다.(Immunology and Cell Biology, 2000, Vol.78, pp. 8088; American Journal of Clinical Nutrition(AJCN), 2001, Vol.73, pp. 393S398S(suppl); Probiotic Bacteria and Enteric Infections, 2011, Chap. 2, pp. 41-63).
따라서 유산균을 제조하고 보관 및 유통하는 조건에서 삼투압, 온도, 압력, 습도 또는 공기 중 노출과 같은 환경으로 인한 생균제의 안정성 감소뿐만 아니라 섭취 후 장관환경에 노출됨으로써 발생하는 스트레스로 사멸하는 균체를 최소화하고, 장 내에서의 생육 저해 문제를 해결하는 방법이 절실히 필요하다.
상기와 같은 문제점을 해결하고자 유산균을 코팅하는 다양한 방법이 개발되었다. 초기에는 캡슐제를 이용한 장용 코팅제와, 젤라틴, 다당류, 검류 등을 이용한 마이크로캡슐화 방법이 개발되었다. 그러나 위 방법들은 고가의 코팅제를 사용하거나 공정이 추가되는 문제점이 있다. 이를 개선하기 위해 고농도의 유산균이 살아있는 이중 구조의 젤리를 제조하는 방법 또는 단백질과 다당류로 이중 코팅하는 방법을 도입하거나(대한민국 특허출원 제10-2003-0020375, 대한민국 특허출원 제10-2001-0010397) 단백질과 다당류 코팅에 나노 입자를 추가한 삼중 코팅방법이 도입되기도 하였다(대한민국 특허출원 제10-2008-0008267). 그러나 상기와 같은 유산균 코팅 기술은 유산균의 표면을 완전히 코팅하지 못하여 여전히 유산균의 내열성, 내산성 및 내담즙성이 충분히 우수하지 못하다는 문제점이 있었다. 또한 삼중 코팅에 식용유지를 추가하여 다중코팅 하거나(대한민국 특허출원 제10-2011-0093074), 수용성 폴리머, 히알루론산, 다공성 입자를 가지는 코팅제 및 단백질을 추가하여 4중 코팅하는 방법(대한민국 특허출원 제10-2011-0134486) 등도 경쟁적으로 개발되어 왔지만 상기의 유산균 코팅 기술은 통상의 방법으로 배양된 유산균체를 회수한 다음 코팅제 조성물을 혼합하여 교반하는 다단계 공정을 수행하기 때문에 생균제로서 무균 조작이 어렵다는 문제가 있고, 특히 산업적인 대량생산에 있어 경제성이 떨어지는 단점이 있었다. 이에 대한민국 등록특허 제10-1605516호는 제조공정 중 프롤린을 첨가하는 방법을 이용하여 제품의 저장 안정성, 내산성 및 내담즙성을 증가시킬 수 있는 효과적인 방법을 제시하였으나, 섭취 후 유산균이 소장 및 대장에 도달하여 효능을 발휘할 수 있는 장 상피세포 부착능과 관련된 효과를 확인할 수 없다는 문제점이 있었다. 이러한 문제를 해결하기 위해 본 발명자들은 제조한 유산균 생균제의 가공 및 유통조건에서의 안정성 향상뿐만 아니라, 섭취 후 장관환경에서 프로바이오틱스 유산균의 생리활성을 극대화할 수 있는 유산균의 장 상피세포 부착능 향상 방법을 개발하고자 노력하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명의 목적은 실크 피브로인(silk fibroin)으로 코팅된 유산균을 포함하는 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 실크 피브로인 및 셀룰로오스로 코팅된 유산균을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 유산균을 실크 피브로인 첨가 배지(medium)에 배양하는 단계를 포함하는 것으로 유산균의 배양을 촉진하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 유산균의 생존율, 저장안정성, 내산성 또는 내담즙성, 및 장 상피세포 부착능을 증가시키는 방법을 제공한다:
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명은 다음의 조성물 또는 방법을 제공한다.
1. 실크 피브로인(silk fibroin)으로 코팅된 유산균을 포함하는 조성물.
2. 상기 1.에 있어서, 상기 유산균은 실크 피브로인 및 셀룰로오스로 코팅된 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 상기 1. 및 2.에 있어서, 상기 실크피브로인은 에탄올로 전처리한 실크피브로인인 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 상기 3.에 있어서, 상기 에탄올은 85%(v/v) 이상의 농도인 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 상기 1. 내지 4. 에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 락토코커스(Lactococcus) 속, 엔테로코커스(Enterococcus) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 및 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속으로 이루어진 군으로부터 선택된 유산균인 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 상기 1. 내지 5. 에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium), 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus fecalis), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 및 비피도 박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis)로 이루어진 군으로부터 선택된 유산균인 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 상기 1. 내지 6.에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) CKDB007 (수탁번호: KCTC13117BP), 엔테로코터스 페시움(Enterococcus faecium) CKDB003 (수탁번호: KCTC13115BP), 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus) CKDB021 (수탁번호: KCTC13118BP), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) CKDB001 (수탁번호: KCTC13114BP), 및 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) CKDB005 (수탁번호: KCTC13116BP)으로 이루어진 군으로부터 선택된 유산균인 것을 특징으로 하는 조성물.
8. 상기 1. 내지 7.에 있어서, 상기 조성물은 식품조성물, 프로바이오틱스 조성물, 약제학적 조성물, 및 사료용 조성물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
9. 유산균을 실크 피브로인을 첨가한 배지(medium)에 배양하는 단계를 포함하는 유산균의 배양을 촉진하는 방법.
10. 유산균을 실크피브로인을 포함하는 유산균 배양용 배지에 배양하는 단계를 포함하는, 실크 피브로인이 코팅된 유산균 생균제의 제조방법.
11. 상기 10.에 있어서, 상기 유산균 배양용 배지는 수용성 칼슘을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 상기 11.에 있어서, 상기 수용성 칼슘은 유산균 배양용 배지의 부피에 대해서 0.01 내지 5 %(w/v)의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 상기 10. 내지 12. 에 있어서, 상기 유산균 배양용 배지는 셀룰로오스를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 유산균을 실크피브로인을 포함하는 유산균 배양용 배지에 배양하는 단계를 포함하는 유산균의 생존율, 저장안정성, 내산성 또는 내담즙성, 및 장 상피세포 부착능을 증가시키는 방법.
15. 상기 9., 10., 또는 14.에 있어서, 상기 실크피브로인을 첨가한 배지, 도는 실크피브로인을 포함하는 유산균 배양용 배지는 수용성 칼슘을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 상기 15.에 있어서, 상기 수용성 칼슘은 유산균 배양용 배지의 부피에 대해서 0.01 내지 5 중량%의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 상기 14.에 있어서, 상기 유산균 배양용 배지는 셀룰로오스를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 상기 10. 내지 17.에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 락토코커스(Lactococcus) 속, 엔테로코커스(Enterococcus) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 및 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속으로 이루어진 군으로부터 선택된 유산균인 것을 특징으로 하는 방법.
19. 상기 10. 내지 18.에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium), 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus fecalis), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 및 비피도 박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis)로 이루어진 군으로부터 선택된 유산균인 것을 특징으로 하는 방법.
20. 상기 10. 내지 19. 에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) CKDB007 (수탁번호: KCTC13117BP), 엔테로코터스 페시움(Enterococcus faecium) CKDB003 (수탁번호: KCTC13115BP), 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus) CKDB021 (수탁번호: KCTC13118BP), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) CKDB001 (수탁번호: KCTC13114BP), 및 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) CKDB005 (수탁번호: KCTC13116BP)으로 이루어진 군으로부터 선택된 유산균인 것을 특징으로 하는 방법.
21. 유산균을 실크피브로인을 포함하는 유산균 배양용 배지에 배양하는 단계를 포함하는 유산균의 생존율, 저장안정성, 내산성 또는 내담즙성, 및 장 상피세포 부착능을 증가시키는 방법.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 실크 피브로인(silk fibroin)으로 코팅된 유산균을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 실크 피브로인 및 셀룰로오스로 코팅된 유산균을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 유산균 배양 공정에서 실크 피브로인을 첨가하면 유산균의 배양이 촉진되어 배양 시간을 단축하는 효과가 있음을 확인하였으며, 추가적으로 실크 피브로인을 유산균 배양 중 또는 배양 후에 첨가하면 동결건조 생존율 및 가혹 조건에서의 안정성이 향상되는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 유산균 배양 완료 후 배양 균체를 회수하고 다양한 처리 조건에서 최적화된 실크 피브로인을 사용하여 유산균체를 코팅하면 스트레스에 대한 저항성 지표인 내산성, 내담즙성이 크게 증가하고, 장 상피세포 부착능이 크게 향상되는 것을 확인하였다.
본 명세서에서 용어 “실크 피브로인”은 살아있는 누에가 압출가공(extrusion)을 통하여 제조한 아미노산 복합 유기체를 말한다. 실크 피브로인의 분자량은 약 84,000 g/mol으로 아미노산인 글라이신, 알라닌, 세린이 3:2:1의 비율로 분포하고, 이들이 전체 아미노산의 70~80%를 차지하고 있다. 또한 타이로신, 발린, 아스파트산, 글루타믹산 및 기타 아미노산이 전체 아미노산의 13% 정도를 차지한다. 이러한 실크 피브로인은 FDA로부터 승인을 받아 수술용 봉합사, 약물 전달체 및 조직학적 이용 및 화상 치료 및 효소 고정화 등 다양한 분야에서 널리 이용되고 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 실크 피브로인은 누에고치로부터 산가수분해법 또는 효소분해법에 의하여 제조된 것일 수 있으나, 당 업계에서 통상적으로 실크 피브로인을 제조하는데 사용되는 방법이라면 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 실크피브로인은 85%(v/v) 이상의 에탄올로 전처리한 실크피브로인 일 수 있다. 여기에서 상기 85% 이상의 에탄올은 구체적으로 발효주정이다. 주세법에 따르면 발효주정은 전분이 함유된 물료 또는 당분이 함유된 물료를 발효시켜 알코올분 85도 이상으로 증류한 것으로, 전분질(곡류, 고구마, 타피오카) 또는 당질(사탕-) 원료에 당화 효소를 투입해 발효시킨 후 연속식 증류방식으로 증류해서 만들어지고, 희석식 소주를 만드는 원료로 사용된다.
많은 단백질은 하나의 폴리펩티드 사슬에서 α-helix와 β-sheet 부위를 함께 가지고 있다. 실크 피브로인 또한 silk Ⅰ, silk Ⅱ type의 두 가지 형태로 구성되어 있으며, silk Ⅰ의 경우 α-helix 구조, silk Ⅱ의 경우 β-sheet 구조로 구성되어 있다. 한편, 실크는 무정형의 상태에서 β-sheet 구조로 재편되었을 시 강도와 단백질의 탄성이 높아진다고 알려져 있으며, 여기에 착안하여 실크 단백질을 전처리하는 다양한 공법들이 연구되었다(Nature, 2003, Vol.424, pp. 1057-1061).
본 발명에서는 발효 주정을 사용하여 실크 단백질을 전처리함으로써 실크 단백질의 구조를 β-sheet로 유도한 후 실크 단백질의 안정성과 소수성을 높이는 공정을 추가하였고, 이를 통해 유산균 생균제의 소수성을 높여 장 점막세포에 대한 정착능을 높이고 안정성을 향상시킨 유산균 생균제를 제조하였다.
본 발명에서는 유산균 생균제를 코팅하기 위하여, 실크 피브로인을 유산균 농축액의 부피 대비 1 ~ 10%(w/v)의 비율로 첨가하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 용어 “셀룰로오스”는 지구상에서 가장 풍부하게 존재하는 고분자로서, 글루코스가 β-1,4 결합에 의해 이루어진 고분자 다당류이다. 셀룰로오스는 현재 제지 및 방적 산업을 비롯한 다양한 분야에서 사용되고 있으며, 지혈대, 피부 치환제, 식이섬유 등의 용도로서도 이용되고 있다(Biowave, 2007, Vol. 9, No.7, pp. 1-11).
식약처에서 허용된 식품첨가물로는 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스가 있으며, 장용성 코팅소재로 널리 이용되고 있는 프탈산히드록시메틸셀룰로오스(HydroxyPropyl MethylCellulose Phthalate, 이하 HPMCP)는 1971년부터 의약품 첨가제로 이용되어왔다.
해외에서는 이미 정제, 과립제, 캡슐의 장용 코팅제로 의약 및 건강기능식품의 첨가물로 셀룰로오스를 다양하게 이용하고 있다. 특히 HPMCP는 천연 펄프를 원료로 하여 화학적 합성방법에 의해 만들어진 pH 의존적 용해도를 지닌 고분자로서, 셀룰로오스 고리에 치환된 카르복실기가 pH가 낮은 위액에서는 붕해 및 용출이 일어나지 않고 pH가 중성에 가까운 장액에서는 붕해 및 용출이 빠르게 일어나는 특성을 가지고 있다.
본 발명에서는 실크 피브로인으로 코팅한 유산균체에 복합적으로 셀룰로오스를 코팅함으로써 인공 위액조건에서는 붕해 및 용출이 일어나지 않고 중성의 pH인 장액 조건에서 붕해 및 용출이 빠르게 일어나도록 하였다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 유산균을 실크 피브로인 첨가 배지(medium)에서 배양하는 단계를 포함하는 것으로 유산균의 배양을 촉진하는 방법을 제공한다.
본 발명에서의 유산균 배양은 종래에 공지된 통상적인 유산균 배양배지 및 배양 조건에서 실시된다.
실크 피브로인은 자연계에 존재하고 있는 성분 중 순도가 높은 단백질(97%)로 분류되며, 인체 단백질의 구성요소인 다양한 아미노산(amino acid)과 그 아미노산의 결합체가 혼재된 펩타이드(peptide)로 구성되어 있다. 특히, 실크 피브로인 성분 중 가장 많은 비중을 차지하고 있는 글라이신, 알라닌, 세린 성분은 전체 아미노산의 70~80%를 차지하고 있으며, 그 외 타이로신, 발린, 아스파트산, 글루타믹산 및 기타 아미노산 성분들이 나머지 비중을 차지하고 있어 유산균 배양에 있어 중요한 질소원 성분으로 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 실크 피브로인 첨가 배지는 배지의 부피를 기준으로 실크 피브로인을 0.001 내지 5 %(w/v), 0.001 내지 4 %(w/v), 0.001 내지 3 %(w/v), 0.001 내지 2 %(w/v), 0.001 내지 1 %(w/v), 0.01 내지 5 %(w/v), 0.01 내지 4 %(w/v), 0.01 내지 3 %(w/v), 0.01 내지 2 %(w/v), 0.01 내지 1 %(w/v), 0.01 내지 0.5 %(w/v), 0.01 내지 0.4 %(w/v), 0.01 내지 0.3 %(w/v) 일 수 있으며, 0.01 내지 0.2 %(w/v), 0.1 내지 5 %(w/v), 0.1 내지 4 %(w/v), 0.1 내지 3 %(w/v), 0.1 내지 2 %(w/v), 0.1 내지 1 %(w/v), 1 내지 5 %(w/v), 1 내지 4 %(w/v), 1 내지 3 %(w/v), 1 내지 2 %(w/v), 2 내지 5 %(w/v), 2 내지 4 %(w/v), 2 내지 3 %(w/v), 3 내지 5 %(w/v), 3 내지 4 %(w/v), 또는 4 내지 5 %(w/v)의 농도로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
하기 실시예에서 검증된 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 배양된 유산균은 성장이 촉진되어 배양시간이 단축되는 것을 알 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 유산균 배양용 배지는 수용성 칼슘을 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 수용성 칼슘은 식품 첨가물로 허용된 구연산칼슘, 수산화칼슘, 염화칼슘, 젖산칼슘, 제이인산칼슘, 제일인산칼슘을 이용할 수 있다. 또한, 상기 수용성 칼슘의 첨가 농도는 0.001 내지 5 %(w/v), 0.001 내지 4 %(w/v), 0.001 내지 3 %(w/v), 0.001 내지 2 %(w/v), 0.001 내지 1 %(w/v), 0.01 내지 5 %(w/v), 0.01 내지 4 %(w/v), 0.01 내지 3 %(w/v), 0.01 내지 2 %(w/v), 0.01 내지 1 %(w/v), 0.01 내지 0.5 %(w/v), 0.01 내지 0.4 %(w/v), 0.01 내지 0.3 %(w/v) 일 수 있으며, 0.01 내지 0.2 %(w/v), 가장 구체적으로는 0.1 %(w/v) 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 유산균 배양용 배지는 셀룰로오스를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 셀룰로오스는 식약처에서 식품첨가물로 허용한 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 및 프탈산히드록시메틸셀룰로오스(Hydroxypropyl methylcellulose phthalate, 이하 HPMCP)가 이용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 유산균을 실크피브로인을 포함하는 유산균 배양용 배지에 배양하는 단계를 포함하는 유산균의 생존율, 저장안정성, 내산성 또는 내담즙성, 및 장 상피세포 부착능을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 유산균 배양을 위한 배지 성분으로 실크 피브로인과 함께 상기 수용성 칼슘을 추가적으로 첨가하는 경우, 유산균이 생산하는 젖산(lactic acid)이 수용성 칼슘 및 실크 피브로인과 함께 염을 형성하고 응고되면서 유산균의 배양 및 농축 단계에서 보다 안정적으로 코팅할 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 실크 피브로인으로 코팅된 유산균은 세포 소수성 및 뮤신 부착능, 장 상피 세포 부착능 증가효과를 확인할 수 있으며, 이러한 방법으로 제조한 유산균 생균제를 섭취하였을 경우 유산균이 장 상피 세포에 안정적으로 부착되어 유산균의 생리활성 효과를 증진시킬 수 있다.
본 발명의 다른 구체적인 구현예에 따르면, 실크 피브로인 및 셀룰로오스로 복합 코팅된 유산균은, 세포 소수성 및 뮤신 부착능, 장 상피 세포 부착능이 우수함을 확인할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 유산균 조성물은 기존 유산균 생균제의 장관환경 안정성을 판단하는 내산성, 내담즙성 시험 조건과, 저장 안정성을 판단하는 동결건조 생존율 및 가혹 시험 조건에서 우수한 안정성(생존율)을 나타낸다.
본 명세서에서 "내산성(resistance against acid)"은 본 발명의 유산균이 pH 7 이하의 산(acid)에 잘 견디어 내는 성질을 의미한다. 구체적으로 본 명세서에서 내산성은 pH 1-3의 인공 위액, 예를 들어 pH 2.0 또는 2.5의 인공 위액에 대한 유산균의 내성을 의미하여, 인공 위액과 접촉 전후의 유산균의 생균수 비교를 통한 생존율로 측정이 가능하다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 인공 위액은 1N 농도의 염산(HCl) 수용액의 pH를 2.0 또는 2.5로 조절하여 제조되며, 필요한 경우 위내 분비 효소인 펩신(pepsin)을 일정 농도(1-2%)로 첨가하여 제조된 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 "내담즙성"은 본 발명의 유산균의 답즙(쓸개즙)에 대한 내성을 의미한다. 구체적으로 본 명세서에서 내담즙성은 인공 장액(인공 담즙액), 예를 들어 0.1-1%의 담즙산(옥시갈, oxigall)을 포함하는 인공 장액에 대한 유산균의 내성을 의미하며, 인공 장액과 접촉 전후의 유산균의 생균수 비교를 통한 생존율로 측정이 가능하다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 인공 장액은 0.5%의 담즙산(옥시갈, oxigall)을 액체배지에 첨가하여 제조되며, 담즙 추출물(bile extract)를 첨가하여 제조되기도 하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 "동결건조"는 유산균의 장기 보존 방법으로 주로 사용되는 냉동건조 방법으로서, 일반적으로 -20℃ 내지 -80℃에서 수행된다. 상기 동결건조 과정에서 유산균은 물리적, 생화학적인 스트레스로 인하여 세포의 활성과 생존율이 감소하게 된다. "동결건조 생존율"은 동결건조 전후의 유산균의 생균수 비교를 통한 생존율로 측정된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 균체를 회수하여 0 내지 -45℃, 구체적으로 -20℃ 내지 -45℃에서 동결시킨 후, 동결건조기에서 건조 후, 분쇄 및 분말화하여 다시 배지에서 배양한 유산균 시료의 유산균수(cfu)와 동결건조 전 시료의 유산균수를 비교하여 측정되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 "가혹 시험 조건"은 유산균의 외부 조건에 대한 내성을 측정하기 위한 조건으로 주로 고온 및 고습에 대한 내성을 의미한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 가혹 시험 조건은 40℃, 습도 70-75%에서 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유산균의 장 상피 세포에 대한 부착능은 유산균의 생존율, 숙주 세포의 접착능 및 기타 다른 균체와의 상관관계에 따라 영향을 받으며 특히, 유산균체의 세포 표면 특징에 의해 큰 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 유산균체의 부착능력에 영향을 미치는 세포 표면의 특징은 크게 균체 표면의 정전기적인 균형, van der Waals force 및 소수성과 관련이 있다. 특히 세포 표면 소수성은 박테리아 세포와 장 상피세포 간의 부착능력과 상관관계가 있는 지표로서 Lactobacillus와 Bifidobacterium 등을 포함하는 유산균주의 부착능력을 확인하는데 있어 중요한 지표로 사용되고 있다(Letters in Applied Microbiology, 1998, Vol.27, pp. 307-310).
본 발명에서는 유산균체에 실크 피브로인을 코팅함으로써 세포 표면의 소수성을 부여하고자 하였다. 특히 발효주정으로 상기 실크 피브로인을 전처리함으로써 실크 피브로인의 구조를 베타 시트(β-sheet) 구조로 유도하여 실크 피브로인이 코팅된 유산균체 표면의 소수성을 높여 장 점막세포에 대한 부착능력을 향상시켰다. 베타 시트(β-sheet) 구조는 알파나선 구조에 비해 열에 매우 강한 특징을 가지고 있어 코팅제로 이용할 시 안정성을 향상시킬 수 있고 소수성의 특징을 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 유산균은 특별히 제한되지 않으며, 상기 유산균은 예를 들어 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 락토코커스(Lactococcus) 속, 엔테로코커스(Enterococcus) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 및 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속으로 이루어진 군으로부터 선택된 유산균일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 유산균은 구체적으로 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium), 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus fecalis), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 및 비피도 박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis)로 이루어진 군으로부터 선택된 유산균일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 유산균은 가장 구체적으로는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) CKDB007 (수탁번호: KCTC13117BP), 엔테로코터스 페시움(Enterococcus faecium) CKDB003 (수탁번호: KCTC13115BP), 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus) CKDB021 (수탁번호: KCTC13118BP), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) CKDB001 (수탁번호: KCTC13114BP), 및 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) CKDB005 (수탁번호: KCTC13116BP)으로 이루어진 군으로부터 선택된 유산균일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 유산균인 것을 특징으로 하는 조성물은 식품조성물, 프로바이오틱스 조성물 및 사료용 조성물로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 상기 유산균 뿐 만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있다. 상기 첨가성분은 예컨대 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상기 탄수화물로는 모노사카라이드(예를 들어, 포도당, 과당 등), 디사카라이드(예를 들어 말토스, 수크로스, 올리고당 등) 및 폴리사카라이드(예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스 파르탐 등)를 사용할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분인 상기 균주 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 대추 추출액 또는 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명의 식품조성물은 식품, 기능성 식품(functional food), 영양보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 천연소재의 가공 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조될 수 있다.
예를 들면, 건강식품으로는 상기 유산균 자체를 차, 주스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등 본 발명의 유산균을 첨가하여 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 유산균을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여 방식으로 적용된다. 본 발명의 약제학적 조성물은 하기의 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제. 과립제, 엘릭시르제 등이 있는데, 이들 제형은 상기 유효성분 이외에 통상적으로 사용되는 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 활택제, 결합제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 1종 이상 사용할 수 있다. 붕해제로는 한천, 전분, 알긴산 또는 이의 나트륨염, 무수인산일수소 칼슘염 등이 사용될 수 있고, 활택제로는 실리카, 탈크, 스테아르산 또는 이의 마그네슘염 또는 칼슘염, 폴리에틸렌 글리콜 등이 사용될 수 있으며, 결합제로는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로오스, 나트륨카복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리딘, 저치환도 하이드록시프로필셀룰로오스 등이 사용될 수 있다. 이외에도 락토즈, 덱스트로오스, 수크로오스, 만니톨, 소르비톨, 셀룰로오스. 글리신 등을 희석제로 사용할 수 있으며, 경우에 따라서는 일반적으로 알려진 비등 혼합물, 흡수제, 착색제, 향미제, 감미제 등을 함께 사용할 수 있다.
상기 조성물은 멸균되거나 또는 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염, 완충제 등의 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 실크 피브로인으로 코팅된 유산균, 및 이를 포함하는 조성물과, 실크 피브로인을 유산균 배양용 배지에 첨가하여 유산균의 배양을 촉진하는 방법, 실크피브로인으로 코팅된 유산균의 제조방법, 유산균의 생존율, 저장안정성, 내산성 또는 내담즙성, 및 장 상피세포 부착능을 증가시키는 방법 중 서로 교차하여 적용될 수 있다. 상기의 기술로 제조한 유산균 조성물의 경우 식품 조성물, 건강기능식품 및 약제학적 조성물로 응용될 수 있다. 중복되는 범위의 내용에 대해서는 명세서의 복잡성을 방지하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 실크 피브로인(silk fibroin)으로 코팅된 유산균, 또는 실크 피브로인 및 셀룰로오스로 코팅된 유산균을 포함하는 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 유산균을 실크 피브로인을 첨가한 배지(medium)에 배양하는 단계를 포함하는 유산균의 배양을 촉진하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 유산균의 생존율, 저장안정성, 내산성 또는 내담즙성, 및 장 상피세포 부착능을 증가시키는 방법을 제공한다.
(ii) 본 발명은 다양한 처리 방법을 통하여 제조한 실크 피브로인을 이용하여 유산균체를 코팅함으로써 유산균체의 생존율과 저장안정성을 향상시키고, 우수한 내산성 또는 내담즙성 및 장 상피세포 부착능 증가 효과를 확인하였다.
도 1은 실크 피브로인을 이용하여 유산균 생균제를 제조하는 공정도를 타낸 도이다.
도 2a 및 도 2b는 유산균 배지로 실크 피브로인을 이용하는 경우의 탄소원의 소모 패턴 및 배양성을 비교하여 나타낸 도이다.
도 3은 실크 피브로인 및 셀룰로오스를 이용하여 제조한 유산균 생균제의 성상을 EBSD/FE-SEM(주사 전자검출기)를 이용하여 관찰한 사진이다.
도 4는 실크 피브로인을 이용하여 코팅한 유산균 생균제의 인공위액 및 인공장액 조건에 따른 제타-전위를 비교하여 나타낸 도이다.
도 5는 실크 피브로인과 셀룰로오스를 이용한 각각의 코팅조건에서 뮤신과의 결합능력을 비교하여 나타낸 도이다.
도 6은 실크 피브로인과 셀룰로오스를 이용한 각각의 코팅조건에서 장 상피세포(HT-29)와의 결합능력을 비교하여 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%“는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
실시예
본 발명자들은 본 발명의 실크 피브로인의 첨가 및 코팅이 유산균에 미치는 영향을 확인하기 위하여 아래와 같은 실험을 수행하였다. 도 1은 본 발명자들이 수행한 실험의 순서와 내용을 도시한 공정도이다.
실시예 1: 본 발명의 실크 피브로인 성분의 분리 및 정제
실크는 천연에서 얻을 수 있는 거대 단백질로, 실크 피브로인의 구성 성분은 인체 단백질을 구성하는 20종의 아미노산 중 18종류의 아미노산으로 구성되어 있다. 18종의 천연 아미노산으로 구성된 누에의 견사선에서 생합성된 액상의 실크는, 누에의 토사에 의하여 결정화도가 높은 섬유배열이 형성되고, 약 75%의 피브로인(fibroin)과 약 25%의 세리신(sericin)의 두 가지 성분으로 이루어진다.
실크 피브로인은 크게 (i) 산 가수분해법과 (ii) 염화 칼슘용액 및 효소에 의한 단백질 가수분해법을 통해 수득하는 방법으로 분류될 수 있다. 본 발명에서 유산균체 코팅에 사용한 실크 피브로인은 누에(Bombyx Hori)를 사육하고 얻은 누에고치(cocoon)로부터, 상기 세리신 성분을 분리 제거하는 정련과정을 거쳐 수득하였다.
실시예 1-1. 산 가수분해법
실크 피브로인을 분리하기 위하여, 정제수를 가온(95℃)한 후 sodium oleate, Na2CO3을 첨가한 후 완전히 용해되면 누에고치를 첨가하여 약 40분간 끓여준 후 탈수과정을 수행하여 누에고치를 정련하였다. 구체적으로 상기 누에고치는 정제수에 대하여 1.84%(w/v)의 농도로 첨가하였고, sodium oleate는 0.0092%(w/v), Na2CO3 는 0.0055%(w/v)의 농도로 첨가하여 정련한다. 여기에 산 가수분해 시 통상적으로 이용하는 2N HCl을 첨가하고 110℃의 온도조건에서 2시간 동안 산 가수분해 시킨 다음 분해된 용액을 여과하여 NaOH 수용액으로 중화시켰다. 중화과정에서 생긴 염은 투석막(Dialysis tubing cellulose membrane)을 이용하여 제거하였고, 이를 통해 정제된 산 가수분해 실크 피브로인을 제조하였다. 일반적으로 산 가수분해를 통하여 얻어지는 펩타이드의 평균 분자량은 약 200-10,000으로 비교적 작은 펩타이드의 실크 피브로인을 획득할 수 있다고 알려져 있다.
실시예 1-2. 효소분해법
실크 피브로인을 분리하기 위하여, 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 누에 고치를 정련하였다. 이어서, 바실러스 리체니포미스, 바실러스 스테아로서모필러스 또는 아스퍼질러스 나이저가 생산한 단백질 분해 효소로 알려진 알칼레이즈(Alcalase), 델보레이즈(Delvorase), 플라보자임(Flavourzyme), 프로타맥스(Protamax) ((주) 비젼바이오켐)과 파파야(Papapya)에서 회수한 파파인(Papain) T100((주) 비젼바이오켐)을 5% 농도로 첨가하여 60-80℃의 온도 조건에서 6-10시간 정도 처리하였다. 분해된 실크 피브로인 용액은 유산균 코팅공정에 이용하기 전 95℃의 고온 조건에 2시간 노출하여 단백질 분해 효소를 불활성화 시켰다. 위와 같은 효소분해법으로 제조된 실크 피브로인은 용해도가 높으며 체내 흡수율이 높은 특징을 가지고 있다고 알려져 있다.
본 발명의 실크 피브로인의 유산균체에 대한 배양촉진 효과 및 균체코팅으로 인한 효과를 확인하기 위하여, 상기의 방법으로 제조한 실크 피브로인(산 가수분해 및 효소분해)을 각각 회수하여 후술할 엔테로코터스 페시움(Enterococcus faecium) CKDB003 (수탁번호: KCTC13115BP), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) CKDB007 (수탁번호: KCTC13117BP), 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus) CKDB021 (수탁번호: KCTC13118BP), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) CKDB005 (수탁번호: KCTC13116BP) 및 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) CKDB001 (수탁번호: KCTC13114BP) 균체의 배양 및 코팅 공정에 적용하였다.
실시예 2. 본 발명의 실크 피브로인 성분의 이용
누에고치에서 회수한 세리신과 피브로인의 주요 성분인 실크 단백질은 75%의 피브로인 단백질과 25%의 세리신 단백질, 약 3% 내외의 무기질 탄수화물로 구성된다.
실크 피브로인은 자연계에 존재하고 있는 성분 중 순도가 높은 단백질(97%)로 분류되며, 인체 단백질의 구성요소인 다양한 아미노산(amino acid)과 그 아미노산의 결합체가 혼재된 펩타이드(peptide)로 구성되어 있다.
특히, 실크 피브로인 성분 중 가장 많은 비중을 차지하고 있는 글라이신과 알라닌, 세린 성분이 전체 아미노산의 70~80%를 차지하고 있으며 실크피브로인 구성 아미노산 상기의 성분들은 콜라겐을 구성하는 아미노산 성분으로 알려져 있다. 따라서 이러한 실크 피브로인은 콜라겐과 마찬가지로 견고한 특성을 가지며 구성 아미노산들은 유산균 배양 시 중요한 질소원 성분으로 이용될 수 있다.
실시예 2-1. 유산균 배양성분으로서 실크피브로인의 이용
본 발명의 실크 피브로인을 유산균 배양 성분으로 이용할 시, 유산균의 배양성에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 각각의 균종에 대하여 알려진 최적화된 배지와 배양조건을 사용하였다. 상기 최적 배지조성에서 배양한 유산균을 대조군(control)으로 하고, 동일한 배양조건을 사용하여 실크 피브로인을 첨가하여 배양한 유산균을 실험군으로 하여 시간에 따른 탄소원의 소모율(carbon source consumption rate, %) 및 살아있는 균체의 수(viable cell count)를 비교하였다.
결과는 도 2a 및 도 2b에 나타내었다.
도 2a 및 도 2b에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실크 피브로인을 첨가하여 배양하는 경우, 실크피브로인을 첨가하지 않은 경우의 유산균보다 배양 초기 당을 소모하는 속도가 매우 빠른 것을 확인하였다(도 2a). 또한, 본 발명의 실크 피브로인을 첨가하여 배양하는 경우, 배양 후기에 최대 배양성을 나타내는 시점 또한 단축되는 것을 확인하였다(도 2b)
따라서, 상기 결과로부터 본 발명의 실크 피브로인 성분이 유산균 성장의 중요한 인자(growth factor)로 작용함으로써 유산균의 배양을 촉진시키고, 배양 시간을 단축할 수 있는 효과가 있음을 알 수 있다. 상기 도 1의 결과는 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) CKDB005 (수탁번호: KCTC13116BP) 균종에 대한 배양성의 결과를 나타낸 것이고, 다른 균종에 대한 결과는 도시하지 않았으나, 상기 비피도박테리움 락티스 균종과 유사한 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 2-2. 유산균 배양성분으로 수용성 칼슘과 실크 피브로인의 이용
본 발명자들은 실크 피브로인과 함께 수용성 칼슘을 유산균 배양을 위한 배지 성분으로 제공하는 경우 유산균의 배양성이 향상될 뿐만 아니라, 유산균이 생산하는 젖산(lactic acid)이 수용성 칼슘 및 실크 피브로인과 함께 염을 형성하고 응고되면서 유산균이 배양 및 농축과정 중에 안정적으로 코팅될 수 있음을 확인하였다. 나아가, 실크 피브로인을 유산균 균체의 표면에 코팅하기 위한 최적 조건을 확립하고, 실크 피브로인의 코팅 여부가 유산균의 안정성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 다음과 같은 실험을 수행하였다.
먼저, 배양에 이용한 실크 피브로인은 상기 실시예 1의 방법을 통하여 제조한 건조 분말을 사용하였고, 첨가 농도는 배양액 부피의 0 ~ 3%(w/v)의 비율로 첨가하였다. 또한 추가로 첨가되는 수용성 칼슘으로는 식품 첨가물로 허용된 구연산칼슘, 수산화칼슘, 염화칼슘, 젖산칼슘, 제이인산칼슘, 제일인산칼슘을 이용하였으며, 첨가 농도는 각각 0, 0.1, 및 0.5 %(w/v)로 하여 유산균을 배양함으로써 실크피브로인이 코팅된 유산균 생균제를 제조하였다.
다음으로, 제조된 유산균 생균제의 동결건조 생존율 및 가혹조건(40℃, 습도 70-75%)에서의 생존율을 비교하였다. 균체 회수 및 동결건조 공정부분은 통상적인 방법(원심분리를 통한 균체회수 후 -40℃ 냉동고에서 급속 동결하여 0℃에서 -45℃ 사이의 동결건조 조건에서 동결건조 수행)을 적용하였으며, 동결건조 생존율은 동결건조 후 생존균 수를 동결건조 전 생균수로 나눈 값의 백분율로 확인하였다.
한편 가혹조건에서의 생존율은 유산균 생균제를 가혹조건(40℃, 습도 75%)에 4주간 보관한 다음 생균수를 확인하였다.
동결건조 생존율(%)
　균주 칼슘 농도, %(w/v)
0 0.1 1
E. faecium CKDB003 64 71 68
S. thermophilus CKDB021 50 55 51
B. lactis CKDB005 26 31 28
B. bifidum CKDB001 20 24 20
L.acidophilus CKDB007 22 30 24
가혹 조건 시(온도 40℃, 습도 70%) 안정성
균주 CFU/g 생존율(%)
칼슘 농도, %(w/v) 칼슘 농도, %(w/v)
0 0.1 0.5 0 0.1 0.5
E.faecium CKDB003 1.75E+11 2.03E+11 1.94E+11 76 81 76
S.thermophilus CKDB021 8.82E+10 1.20E+11 1.09E+11 42 45 43
B.lactis CKDB005 3.00E+10 5.25E+10 5.04E+10 27 31 28
B.bifidum CKDB001 9.00E+09 1.32E+10 1.21E+10 20 24 20
L.acidophilus CKDB007 1.65E+10 3.75E+10 3.04E+10 18 25 22
상기 표 1과 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실크 피브로인과 함께 수용성 칼슘을 첨가하는 경우 동결건조 생존율 및 가혹조건에서의 생존율이 우수하게 나타났으며, 특히 칼슘 농도가 0.1 %(w/v)인 경우에 유산균의 생존율이 가장 우수하게 나타나는 것을 확인하였다.
실시예 2-3. 실크 피브로인의 배양 및 코팅에 이용
상기 실시예 2-1, 실시예 2-2에서 확인한 바와 같이 실크 피브로인과 수용성 칼슘을 유산균 배양을 위한 배지로 이용하였을 시 유산균의 배양성 및 안정성이 향상되는 효과를 확인한 후 다음과 같이 유산균 생균제를 제조하였다.
대조군(비코팅)을 제조하기 위하여 최적화된 배양 배지를 이용하여 균체를 배양 및 농축 후 별도의 코팅공정을 거치지 않았으며, 실험군의 경우에는 유산균 배양 시 실크 피브로인과 수용성 칼슘을 함께 배지 성분으로 첨가하고 배양 및 농축 후 실크 피브로인으로 코팅하였다.
유산균 코팅 공정은 통상적인 방법(실시예 2-2)을 적용하였으며, 분쇄기를 이용하여 유산균 생균제를 분쇄 후 각각 실시예 4의 실험예에 적용하였다.
실시예 3: 발효주정으로 전처리한 실크 피브로인 코팅-유산균 생균제의 제조
본 발명자들은 유산균체에 코팅하기 위한 최적의 실크 피브로인을 발굴하고, 적용된 실크 피브로인의 조건에 따라 유산균의 코팅 품질에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 실크 피브로인을 발효주정으로 전처리하였다. 구체적으로 본 발명의 상기 실시예 1-2의 효소분해 방법으로 제조한 실크 피브로인에, 발효 주정을 30%의 비율로 혼합하고, 무균조건 및 실온(25℃) 조건에서 균질화하여 18~24 시간 동안 정치하였다.
본 실시예 3에서는 전처리를 거치지 않은 실크 피브로인 대신 상기와 같이 발효주정으로 전처리한 실크 피브로인을 사용한 점을 제외하고는 실시예 2-2와 동일한 방법으로 유산균체를 배양 및 코팅하였다.
실시예 4: 실크 피브로인 및 셀룰로오스를 복합 코팅한 유산균 생균제 제조
본 발명자들은 상기 실크 피브로인으로 코팅한 유산균 생균제의 특성 및 장관 내 환경 등에 대한 저항성을 개선하기 위하여, 본 발명의 실크 피브로인과 함께 종래 장용성 코팅소재로 사용되는 셀룰로오스를 복합하여 코팅한 유산균 생균제를 제조하였다.
구체적으로 유산균 생균제를 코팅하기 위한 실크 피브로인은 상기 실시예 1의 방법을 통하여 제조한 건조 분말을 사용하였고, 실시예 3과 같이 발효주정 처리한 실크 피브로인을 유산균 농축액 부피 대비 1 ~ 10%(w/v)의 비율로 첨가하였다. 셀룰로오스의 경우 식약처에서 허용된 식품첨가물로 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 및 프탈산히드록시메틸셀룰로오스(Hydroxypropyl methylcellulose phthalate, 이하 HPMCP)를 코팅제로 적용하였다. 그 결과, 하기 실험예에서 후술한 바와 같이 HPMCP(의약용 브랜드 명칭(Any Coast), 삼성정밀화학)와 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨(삼성정밀화학)을 유산균 농축액 부피 대비 1 ~ 10%의 비율로 첨가하여 유산균 생균제를 코팅하는 경우 유산균의 동결건조 생존율 및 가혹조건(40℃, 습도 70%)에서의 생존율이 향상됨을 확인하였다.
실험예
본 발명자들은 상기 실시예 2 내지 4에서 제조한 실크 피브로인의 코팅 유무 및 방법에 따른 유산균 생균제의 특성을 확인하기 위하여 아래와 같은 실험을 수행하였다.
아래의 실험예에서 사용된 각각의 대조군 및 실험군은 표 3에 나타내었다.
구 분 유산균 코팅 방법
대조구 실시예 2-3: 미첨가 (비코팅 대조군)
실험군 1 실시예 2-3: 실크 피브로인 코팅
실험군 2 실시예 3: 발효주정 전처리-실크 피브로인 코팅
실험군 3 실시예 4: 발효주정 전처리-실크 피브로인 및 셀룰로오스 복합코팅
실험예 1: 실크 피브로인 코팅 조건에 따른 유산균 생균제의 코팅 효율 확인
상기 표 3과 같이 대조구(실시예 2-3, 비코팅 대조군의 유산균 생균제), 실험군 1(실시예 2-3, 실크 피브로인 코팅-유산균 생균제), 실험군 2(실시예 3, 발효주정으로 전처리한 실크 피브로인 코팅-유산균 생균제), 및 실험군 3(실시예 4, 발효주정으로 전처리한 실크 피브로인 및 셀룰로오스 복합 코팅-유산균 생균제)의 시료들을 카본테이프를 이용하여 각각 금속판에 고정하고, 플라즘 스퍼터로 백금 코팅한 후 가속전압 10 kV에서 EBSD/FE-SEM(주사 전자검출기)를 이용하여 관찰하였다.
결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 실크 피브로인만으로 유산균체를 코팅하여 제조한 생균제(실험군 1)의 경우, 대조구(비코팅)보다 코팅 피복 형상이 양호하게 관찰되었으나, 부분적으로 균체가 코팅되지 않은 부분이 관찰되었다. 또한, 발효주정 전처리 공정을 추가하여 제조한 실크피브로인으로 코팅한 유산균 생균제(실험군 2)의 경우 전체적으로 균일하게 균체를 감싸고 있는 모습이 확인되었으며, 발효주정으로 처리한 실크 피브로인 및 셀룰로오스로 복합 코팅한 유산균 생균제(실험군 3)의 경우 실크 피브로인 만으로 코팅한 유산균 생균제(실험군 2)보다 더욱 균일하게 균체가 코팅된 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 대조구보다는 실험군 1이, 실험군 1보다는 실험군 2가, 실험군 2보다는 실험군 3의 생균제에서 코팅 품질이 가장 우수함을 알 수 있었다.
본 실시예에서 상기 발효 주정의 처리는 실크 피브로인을 β-sheet 구조로 재생, 처리되도록 유도하고, 효소분해 공법에 이용되었던 효소를 불활성화시켜 코팅 공정에서 유산균 및 실크 피브로인이 효소에 의해 분해되는 것을 방지하기 위함이다.
실험예 2: 실크 피브로인 코팅방법에 따른 유산균체의 표면 소수성
세포 표면 소수성은 in vitro상에서 유산균의 장내 부착능력을 간접적으로 알 수 있는 지표로서 Lactobacillus와 Bifidobacterium 등을 포함하는 유산균의 부착능력을 확인하는 1차 선별 방법 중 하나로 사용되고 있다. 본 발명에서는 실크 피브로인으로 코팅한 유산균 생균제의 소수성을 확인하기 위해 하기의 방법으로 실험을 진행하였다.
구체적으로, 비코팅 유산균 생균제 대조군과 각각의 코팅조건으로 제조한 유산균 생균제 실험군을 1X PBS(phosphate buffered saline, pH 7.2)를 이용하여 2번 세척한 후 균체의 OD600 = 0.5가 되도록 1X PBS로 현탁하였다. 현탁 제조한 유산균 시료는 톨루엔을 첨가하여 혼합(mixing)한 후 37℃의 항온수조(water bath)에서 20분 동안 처리한 다음, 톨루엔을 제거하고 수용액 층의 OD600 값을 측정하였다. 유산균 생균제의 소수성은 하기의 식에 의하여 산출하였다.
Figure PCTKR2018004026-appb-I000001
결과는 표 4에 나타내었다.
　균 주 세포 표면 소수성(%)
비코팅 실크 피브로인 코팅 (산가수분해) 실크 피브로인 코팅 (효소분해) 실크 피브로인 코팅(효소 분해 후 발효 주정 전처리공정 추가)
E. faecium CKDB003 49 52 64 72
S. thermophilus CKDB021 57 57 61 67
B. lactis CKDB005 65 68 70 78
B. bifidum CKDB001 35 33 38 43
L.acidophilus CKDB007 50 48 50 52
표 4에 나타낸 바와 같이, 실크 피브로인으로 유산균을 코팅하였을 시 비코팅 대조군 대비 균체의 소수성이 향상되는 효과를 확인하였다. 또한 산 가수분해법으로 제조한 실크 피브로인 보다는 효소 분해법으로 제조한 실크 피브로인을 이용하여 유산균체를 코팅할 시 유산균 생균제의 소수성이 전반적으로 높게 나타났으며, 특히 발효 주정을 이용하여 전처리한 실크 피브로인으로 유산균체를 코팅할 경우 균체의 소수성이 더욱 향상되는 것을 확인하였다.
실험예 3: 실크 피브로인 코팅방법에 따른 유산균체의 표면 제타-전위
계면동전위(electrokinetic potential)라고 불리는 제타전위(zeta potential)는 전기동역학적 현상으로 인하여 발생하는 전기적 이중층의 유동층을 통과하는 전위차를 말한다. 막 표면의 전위를 직접적으로 측정할 수 없지만 대신 이러한 제타전위를 실험을 통하여 측정함으로써 표면의 전기화학적 특성을 파악할 수 있다(Chemistry of the solid-water interface, John Wiley & Sons, Inc, 1992). 이러한 제타 전위는 분산 상태 입자의 안정성 또는 응집을 판단하는 중요한 파라미터로서 작용하며 유산균 생균제를 섭취하였을 시 체내에서 제품의 효과를 확인하는데 중요한 의미를 가질 수 있다. 미립자나 콜로이드의 경우 제타전위의 절대치가 증가하면 입자간의 반발력이 강해져 입자의 안정성이 높아지는 반면 제타전위가 0에 가까워지면 입자는 응집하기 쉬워진다. 본 발명에서는 위상분석광산란(phase analysis light scattering, PALS) 기술을 이용한 제타포텐셜 분석기(zeta potential analyzer)를 이용하여 5번 측정한 분석 결과의 평균값을 산출하여 사용하였다.
구체적으로 각각의 비코팅(대조구), 실크 피브로인 코팅(실험구 1), 발효주정 전처리 실크 피브로인 코팅(실험구 2), 및 실크피브로인 및 셀룰로오스 복합 코팅(실험구 3) 유산균 생균제를 인공적으로 장관환경을 모방한 실험조건인 수용액 상태로 제조하고 제타전위 값을 확인하였다.
결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에서 나타낸 바와 같이 인공위액 조건(염화나트륨 2.0 g, 묽은 염산 24.0 ㎖/L, pH 1.2 조건의 수용액)에서는 대조군 대비 실크 피브로인 또는 발효주정 전처리 실크 피브로인으로 코팅한 유산균 생균제에서 제타전위 값이 작아지고(실험군 1, 실험군 2), 전처리 실크 피브로인 및 셀룰로스 복합 코팅 유산균 생균제에서는 더욱 낮아지는 것을 확인하였다(실험군 3).
그리고 인공 장액 조건(담즙산 0.3%가 포함된 pH 7.0 조건의 수용액)에서는 모든 실험군의 제타전위가 음수 값을 나타내었다. 대조군 대비 실크 피브로인 또는 발효주정 전처리 실크 피브로인으로 코팅한 유산균 생균제에서 제타전위 절대값이 단계적으로 작아지지만(실험군 1, 실험군 2), 전처리 실크 피브로인 및 셀룰로스 복합 코팅한 유산균 생균제에서는 제타전위 절대값이 오히려 커짐을 확인하였다. 이러한 결과는 인공장액조건에서 실크 피브로인으로 코팅한 유산균체의 소수성이 증가하고, 셀룰로오스 복합 코팅 시에는 소수성이 감소하는 것을 간접적으로 보여주는 결과이다.
따라서, 본 발명의 실크 피브로인과 셀룰로오스로 복합 코팅 유산균 생균제는 인공 위액 조건에서는 강한 응집력을 통해 유산균체의 생존율이 높아질 수 있고, 소장 및 대장에 도달하는 시점에는 셀룰로오스 층이 용출되어 제타전위 절대값이 낮아지므로 실크 프브로인 코팅 유산균의 장 정착성이 증가하여 장관 환경에서 안정적으로 생존할 가능성이 높음을 제타전위 값 측정을 통해 실험적으로 확인하였다.
실험예 4: 실크 피브로인 코팅방법에 따른 유산균체의 뮤신 결합능
미생물의 부착 능력은 세포벽의 정전기적인 균형 , 반데르 발스 결합 및 소수성과 관련이 있다. 소수성은 박테리아 세포가 점막 또는 상피세포 부착하는 중요한 요소로 알려져 있다(Environ Microbiol, 2000, Vol.66(6), pp. 2548-2554; International Dairy Journal, 2005, Vol.15, pp. 1289-1297).
특히, 장 상피세포는 뮤신이라는 젤과 같은 물질을 만들어 장벽을 보호하는 막을 형성하는데, 장 점막 성분인 뮤신은 유산균과 소수성 결합이 가능하므로 소수성 특징이 높은 유산균은 장내 부착능 또한 우수할 것으로 예상된다. 이에 본 발명에서는 상기 각 유산균들의 장 점막성분인 뮤신에 대한 부착능을 평가하여 뮤신과 유산균체의 결합능을 확인하였다. 뮤신 부착능 실험 방법은 Munoz-Provencio(Gastroenterology. 1998, Vol.115, pp 874-882)을 응용하여 적용하였다.
먼저, ELISA 플레이트로 알려진 Maxisorb 플레이트에 porcine stomach mucin, type Ⅱ(sigma)를 200 μL씩 분주하여 4℃에서 24 시간 동안 부착시켰다. 다음으로, 표 3과 같이 실크 피브로인으로 코팅한 유산균 생균제와 비코팅 생균제를 OD600 = 0.5이 되도록 현탁한 후 뮤신으로 코팅한 Maxisorb 플레이트에 각각 200 μL씩 분주하여 4℃에서 하룻밤 동안(12시간 이상) 반응시켰다. 반응 후 뮤신에 부착되지 않은 유산균체는 PBS 완충액을 이용하여 5번 세척하여 제거하고 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색한 후 OD620 에서의 흡광도를 측정하였다.
결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 대조군, 실험군 1, 실험군 3, 및 실험군 2의 순으로 뮤신결합능이 증가하였으며, 실크 피브로인을 전처리 함으로써 뮤신 결합능이 큰폭으로 증가하였고, 셀룰로오스를 복합적으로 적용하였을 시 전처리 공정으로 제조한 실크 피브로인으로 코팅한 유산균 생균제의 뮤신 결합능에 비해 소폭 감소하는 것을 확인하였다.
실험예 5: 실크 피브로인 코팅방법에 따른 유산균체의 장 상피세포 부착능
실크 피브로인 코팅 방법을 통하여 제조한 유산균 생균제의 장 상피세포 부착능력을 확인하기 위하여, 사람 결장 육종 세포주 HT-29를 이용하여 이에 대한 유산균의 부착능을 확인하였다.
DMED 배지에 10%의 FCS(fetal calf serum)및 항생제(100 U/ml 페니실린, 100 U/ml 스트렙토마이신)를 첨가하여 HT-29 세포주 배양 배지로 사용하였으며, 이 배지에서 Monolayer를 형성한 HT-29 세포를 PBS 완충액으로 세척한 다음 세포수 5 x 108 개/ml가 되도록 6-웰 플레이트에 분주하였다. 각각의 유산균 생균제를 1 x 109/ml의 농도가 되도록 PBS에 현탁한 다음 각각 웰 플레이트에 접종하여 CO2 5%, 37℃ 조건에서 HT-29 세포와 2시간 동안 배양하였다. 배양 종료 후, PBS로 5회 세척하여 부착되지 않은 유산균을 제거한 다음 0.05 % 트립신- 0.02% EDTA를 2분간 처리하여 웰 플레이트에 부착되어 있는 HT-29세포와 유산균을 분리하였다. 분리한 세포는 희석수를 이용하여 10진법으로 희석하고 MRS 또는 BL 아가 플레이트에서 배양한 후 생균수를 측정하였다(Trends. Food. Sci. Technol., 1999, Vol.10, pp 405-410; Korean Soc. Food. Sci. Nutr., 2016, Vol.45, pp 12-19).
상피세포 부착율은 하기의 식을 이용하여 계산하였다.
Figure PCTKR2018004026-appb-I000002
추가적으로, 장 상피세포와 유산균체의 부착 정도를 시각적으로 확인하기 위해 LIVE/DEADⓡ BacLight™Bacterial Viability kit를 이용하여 유산균체를 형광 염색한 후 광학 현미경으로 관찰하였다.
장 상피세포 부착율의 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이 대조군보다는 실크피브로인 코팅 시 HT-29 세포주 부착능이 증가하였으며 전처리 공정을 거친 실크 피브로인 코팅 시에는 더욱 증가하는 결과를 확인하였다. 하지만 전처리 공정을 적용한 실크 피브로인과 셀룰로오스를 함께 복합 코팅하는 경우 전처리 공정을 적용한 실크 피브로인으로 코팅하여 제조한 유산균 생균제의 대비 HT-29 세포에 대한 부착능이 소폭 감소하는 결과를 확인하였다.
실험예 6: 실크 피브로인 코팅방법에 따른 유산균체의 장관환경 안정성
실크 피브로인 코팅방법에 따른 유산균 생균제의 장관환경 안정성을 평가하기 위하여 각각 원말의 내산성과 내담즙성을 실험하였다.
내산성을 측정하기 위하여 생균제를 pH 2.5와 pH 2.0의 인공위액 조건에 노출시킨 후 생균수를 분석하였다. 구체적으로, 인공위액 조건은 식품 붕해도 시험 상의 인공위액 조건(염화나트륨 2.0 g, 묽은 염산 24.0 ㎖/L, pH 1.2)을 사용하여 최종 pH 2.0, pH 2.5로 맞춘 후, 생균제 분말을 10% 농도로 첨가하여 노출시켰다. 위 수축 운동을 고려하여 Dancing machine((주)BMS) 기기를 이용하여 분당 100회의 왕복 운동을 실시하여 위장관 환경과 유사한 조건에서 노출되도록 하였고, 노출 시간은 위를 통과하는 시간을 고려하여 2시간으로 실시하였다. 인공위액 조건에 노출한 실험군은 pH를 7.0으로 재조정한 후 통상적인 생균수 측정방법에 따라 분석하였다.
한편, 내담즙성은 담즙산 0.5%를 여과하여 무균적으로 첨가한 배지를 사용하였으며, 10% 농도로 생균제 분말을 첨가하여 2시간 동안 반응시킨 후 통상적인 방법에 따라 생균수를 측정하였다.
결과는 표 5(유산균 코팅 방법에 따른 장관환경 생존율(%))에 나타내었다.
균주 유산균 코팅 방법 내산성 내담즙성
인공위액 pH 2.0 인공위액 pH 2.5 인공장액 (0.5% oxigall)
E. faecium CKDB003 비코팅 38 49 41
실험군 1 42 62 62
실험군 2 51 73 65
실험군 3 78 92 72
S. thermophilus CKDB021 비코팅 18 24 32
실험군 1 43 59 38
실험군 2 58 73 50
실험군 3 72 88 53
B. lactis CKDB005 비코팅 34 45 47
실험군 1 58 53 65
실험군 2 64 73 78
실험군 3 81 94 73
B. bifidum CKDB001 비코팅 30 41 46
실험군 1 46 58 58
실험군 2 48 61 64
실험군 3 61 72 65
L. acidophilus CKDB007 비코팅 34 38 60
실험군 1 42 61 68
실험군 2 58 75 78
실험군 3 79 94 75
표 5에 나타낸 바와 같이, 발효주정 실크 피브로인으로 유산균을 코팅함으로써 유산균 생균제의 내산성과 내담즙성이 전반적으로 증가하는 결과를 확인하였다. pH 2.0 조건에서 S. thermophilus CKDB021 균주와 B. bifidum CKDB001, E. faecium CKDB003, B. lactis CKDB005, L. acidophilus CKDB007 균주 모두 실험군 3에서 비코팅 대비 최대 2배 이상의 내산성 증가 효과를 확인하였다. 인공장액 조건에서 내담즙성도 실크 피브로인 코팅에 의해 전반적으로 증가하는 경향을 보였으며, B. lactis CKDB005, L. acidophilus CKDB007 균주의 경우 실험군 2의 조건으로 코팅하였을 시 생존율이 가장 우수하였다. 이를 통하여 실크피브로인 또는 발효주정으로 전처리한 실크피브로인을 코팅하거나 여기에 셀룰로오스를 복합적으로 코팅할 경우 유산균 생균제의 내산성 또는 내담즙성이 크게 높아짐을 확인하였다.
실험예 7: 실크 피브로인 코팅방법에 따른 유산균체의 저장 안정성
유산균 생균제의 경우 짧게는 12개월, 길게는 24개월의 유통기간 동안 일정한 수 이상의 생균이 유지, 보존되어야 한다.
통상적으로 엔테로코커스 계열의 엔테로코커스 페시움(E. faecium), 엔테로코커스 페칼리스(E. faecalis)와 같은 쌍구균인 유산균체의 경우 고온, 다습한 조건에 노출되었을 시 높은 안정성을 보이나 대부분의 유산균체의 경우 높은 온도와 습도의 조건에 노출되었을 시 안정성이 현저히 감소하는 경향을 보인다.
본 발명에서는 유산균 생균제의 저장 안정성을 확인하기 위해 50g 단위로 Polyethylene bag (inner) & aluminum bag (outer)에 각각 소분하여 가혹조건(45℃, 습도 75%)에 보관면서 저장 시간대별로 시료를 수거하여 생균수를 확인하였다.
결과는 표 6(유산균 코팅 방법에 따른 저장안정성 (%))에 나타내었다.
실크 피브로인 유산균 코팅 방법 가혹조건 ( 40℃,75% )
보관기간에 따른생존율 ( % )
4주 8주 12주
E. faecium CKDB003 대조군 76 52 43
실험군 1 92 81 72
실험군 2 96 92 89
실험군 3 99 96 95
S. thermophilus CKDB021 대조군 42 33 20
실험군 1 48 40 27
실험군 2 62 51 48
실험군 3 83 72 68
B. lactis CKDB005 대조군 27 21 18
실험군 1 53 48 45
실험군 2 96 95 95
실험군 3 99 96 95
B. bifidum CKDB001 대조군 20 18 16
실험군 1 34 28 20
실험군 2 61 55 52
실험군 3 89 72 54
L.acidophilus CKDB007 대조군 18 18 15
실험군 1 43 38 38
실험군 2 85 78 77
실험군 3 92 90 85
표 6에 나타낸 바와 같이, 비피도박테리움 락티스(B. lactis), 엔테로코커스 페시움(E. faecium), 락토바실러스 애시도필러스(L.acidophilus) 균종의 경우 실크 피브로인을 이용한 코팅 공정을 통해 가혹 조건에서 안정성이 큰 폭으로 증가함을 확인하였으며, 이외 비피도박테리움 비피덤(B. bifidum), 스트렙토코커스 써모필러스(S.thermophilus) 균종 또한 가혹 조건에서 안정성이 소폭 향상된 결과를 확인하였다.
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Claims (14)

  1. 실크 피브로인(silk fibroin)으로 코팅된 유산균을 포함하는 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 유산균은 실크 피브로인 및 셀룰로오스로 코팅된 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 실크피브로인은 에탄올로 전처리한 실크피브로인인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 에탄올은 85%(v/v) 이상의 농도인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 락토코커스(Lactococcus) 속, 엔테로코커스(Enterococcus) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 및 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속으로 이루어진 군으로부터 선택된 유산균인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium), 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus fecalis), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 및 비피도 박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis)로 이루어진 군으로부터 선택된 유산균인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) CKDB007 (수탁번호: KCTC13117BP), 엔테로코터스 페시움(Enterococcus faecium) CKDB003 (수탁번호: KCTC13115BP), 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus) CKDB021 (수탁번호: KCTC13118BP), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) CKDB001 (수탁번호: KCTC13114BP), 및 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis) CKDB005 (수탁번호: KCTC13116BP)으로 이루어진 군으로부터 선택된 유산균인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 식품조성물, 프로바이오틱스 조성물, 약제학적 조성물, 및 사료용 조성물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 유산균을 실크 피브로인을 첨가한 배지(medium)에 배양하는 단계를 포함하는 유산균의 배양을 촉진하는 방법.
  10. 유산균을 실크피브로인을 포함하는 유산균 배양용 배지에 배양하는 단계를 포함하는, 실크 피브로인이 코팅된 유산균 생균제의 제조방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 유산균 배양용 배지는 수용성 칼슘을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 수용성 칼슘은 유산균 배양용 배지의 부피에 대해서 0.01 내지 5 %(w/v)의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 10 항에 있어서,
    상기 유산균 배양용 배지는 셀룰로오스를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 유산균을 실크피브로인을 포함하는 유산균 배양용 배지에 배양하는 단계를 포함하는 유산균의 생존율, 저장안정성, 내산성 또는 내담즙성, 및 장 상피세포 부착능을 증가시키는 방법.
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