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WO2018186222A1 - 多孔質セルロースビーズおよび吸着体 - Google Patents

多孔質セルロースビーズおよび吸着体 Download PDF

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Publication number
WO2018186222A1
WO2018186222A1 PCT/JP2018/012221 JP2018012221W WO2018186222A1 WO 2018186222 A1 WO2018186222 A1 WO 2018186222A1 JP 2018012221 W JP2018012221 W JP 2018012221W WO 2018186222 A1 WO2018186222 A1 WO 2018186222A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cellulose
beads
dope
porous cellulose
adsorbent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2018/012221
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
義和 河井
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kaneka Corp
Original Assignee
Kaneka Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kaneka Corp filed Critical Kaneka Corp
Priority to JP2019511163A priority Critical patent/JPWO2018186222A1/ja
Publication of WO2018186222A1 publication Critical patent/WO2018186222A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B01J20/24—Naturally occurring macromolecular compounds, e.g. humic acids or their derivatives
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/282—Porous sorbents
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B1/00—Preparatory treatment of cellulose for making derivatives thereof, e.g. pre-treatment, pre-soaking, activation
    • C08B1/08—Alkali cellulose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B15/00—Preparation of other cellulose derivatives or modified cellulose, e.g. complexes
    • C08B15/10—Crosslinking of cellulose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J9/00—Working-up of macromolecular substances to porous or cellular articles or materials; After-treatment thereof
    • C08J9/26—Working-up of macromolecular substances to porous or cellular articles or materials; After-treatment thereof by elimination of a solid phase from a macromolecular composition or article, e.g. leaching out

Definitions

  • the present invention relates to a porous cellulose bead and an adsorbent.
  • adsorbents for purification of polymer drugs such as medical adsorbents and antibody drugs
  • polysaccharides such as agarose and cellulose with less nonspecific adsorption are preferred.
  • Porous cellulose beads are difficult to be crushed due to their relatively high mechanical strength, and they contain various hydroxyl groups that can be used to introduce ligands that interact with the target substance to be adsorbed. It is used as a base material for various adsorbents such as adsorbents and affinity adsorbers.
  • affinity adsorbents have been used as adsorbents for medical treatment and pharmaceutical purification because they can efficiently purify target substances or reduce the concentration of unwanted substances.
  • an adsorbent in which protein A is immobilized on a porous carrier using an affinity ligand is attracting attention as an adsorbent for treating rheumatism, hemophilia, dilated cardiomyopathy, or an adsorbent for purifying antibody drugs (eg, non-patent literature). 1, 2).
  • porous cellulose beads often involves complicated steps compared to general synthetic polymer beads because it is difficult to dissolve cellulose in a general solvent.
  • a cellulose solution is prepared by dissolving it in a highly corrosive and highly difficult solvent, such as a 60% high-concentration calcium thiocyanate aqueous solution.
  • Patent Document 1 It is known that the cellulose solution used in this method exhibits unique behavior, and the porous cellulose beads obtained by this method have considerably large pores and a wide pore size distribution ( For example, Non-Patent Document 3).
  • porous cellulose beads obtained by the method are used as an adsorbent such as an antibody, the specific surface area is expected to be small, and high adsorption performance cannot be expected.
  • a method of giving a substituent to the hydroxyl group of cellulose, dissolving in a general-purpose solvent, granulating, and removing the substituent after granulation to obtain a porous cellulose carrier Is exemplified (for example, Patent Document 2), but the process is complicated.
  • Patent Document 3 discloses cellulose that is soluble in an alkaline solution.
  • the microfibril has a fiber diameter of 1 ⁇ m or less, further 500 nm or less, and is subjected to special fine processing. Yes.
  • microbial cellulose is dissolved in an alkaline solution to prepare a cellulose solution. After adding a continuous phase solvent, the cellulose solution is made into droplets, and then the microbial cellulose particles are frozen and then washed. Although a method for obtaining cellulose beads is disclosed, energy is required to freeze the cellulose solution together with the continuous phase solvent. Moreover, microbial cellulose is a special raw material, and it is difficult at present to stably obtain a large amount thereof.
  • Patent Document 5 reported that a cellulose dope can be produced at a relatively high temperature using an aqueous solution containing sodium hydroxide and urea, and that porous beads can be obtained from this cellulose dope. Yes.
  • Patent Document 6 a high-performance porous cellulose bead and an adsorbent using the same can be obtained by adding a certain additive to a cellulose dispersion obtained by treating a general-purpose cellulose raw material with a slightly low-temperature alkaline aqueous solution. It has been reported that it can be obtained.
  • Non-Patent Document 4 adsorption using a target substance that is fluorescently labeled is used.
  • a behavioral analysis method has been shown, and it has been reported that a site that is easily adsorbed in a certain adsorbent particle varies depending on ionic strength. In other words, it is possible to obtain the optimum ion intensity in advance by preliminary examination using such transmission observation, which is very significant.
  • Non-Patent Document 5 the time-dependent change in the adsorption behavior into the adsorbent particles is observed and it is shown that the adsorption proceeds to the center of the beads in about 40 minutes. That is, the optimum adsorption time can be obtained by preliminary examination using such transmission observation.
  • Non-Patent Document 6 reports a method for obtaining mass transfer characteristics by analyzing an experiment in which a fluorescently labeled antibody is adsorbed on a protein A-immobilized adsorbent using a fluorescence microscope. From this result, a precise purification method is reported. It is suggested that can be constructed.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned problems of the prior art, and does not use a corrosive or highly toxic auxiliary material, and does not go through complicated steps that are industrially disadvantageous. In order to obtain high-performance porous cellulose beads that form a homogeneous transmission observation image at low cost.
  • Porous cellulose comprising a step of cooling a cellulose dope prepared by mixing an alkaline aqueous solution and raw material cellulose powder to a temperature lower than ⁇ 12 ° C., and a step of adjusting the cellulose dope to a temperature higher than 15 ° C.
  • the manufacturing method of the porous cellulose bead characterized by including.
  • a method for purifying a target compound comprising: A step of producing an adsorbent by immobilizing a ligand that binds to a target substance on crosslinked porous cellulose beads by the production method according to [9] above; and A method comprising a step of bringing a solution containing a target substance into contact with an adsorbent.
  • FIG. 6 is a transmission observation image of beads obtained in Comparative Example 4.
  • 18 is a transmission observation image of beads obtained in Comparative Example 14.
  • 3 is a transmission observation image of beads obtained in Example 2.
  • FIG. It is a related figure of the cellulose concentration in dope in each granulation example, and solid content after granulation.
  • 10 is a transmission observation image of beads obtained in Comparative Example 21.
  • 2 is a pressure flow rate characteristic diagram of a crosslinked porous cellulose bead having a median particle diameter of 90 ⁇ m and a 20% compression stress of 0.11 MPa and an adsorbent of Reference Example 1.
  • FIG. 2 is a K av measurement result of the crosslinked porous cellulose beads and the adsorbent of Reference Example 1.
  • a cellulose dope prepared by mixing an alkaline aqueous solution and raw material cellulose powder is cooled to a temperature lower than ⁇ 12 ° C., and the cellulose dope is adjusted to a temperature higher than 15 ° C. after the cooling step.
  • It is a manufacturing method of the porous cellulose bead characterized by including a process.
  • Patent Document 6 and the like for producing a cellulose bead by dispersing cellulose in a low temperature sodium hydroxide aqueous solution and making it porous, but a specific example having the above-mentioned characteristics has not yet been seen. It has not been issued.
  • the present inventor has started development of porous cellulose beads having a homogeneous transmission observation image with an optical microscope in a method using a low-temperature alkaline aqueous solution.
  • the homogeneity of the transmission observation image means that, when observed at an appropriate magnification, an average of two or less portions that look like foreign matters having a length of 10 ⁇ m or more are in the beads.
  • the present inventor produced porous cellulose beads by lowering the temperature at which the dope was cooled than in the example of Patent Document 6. As a result, it was found that the transmission observation image of the dope by the optical microscope tends to be homogenized as the temperature for cooling the dope is lowered.
  • a method for producing porous cellulose beads comprising a step of cooling a cellulose dope produced by mixing an alkaline aqueous solution and raw material cellulose powder to a temperature lower than ⁇ 12 ° C. After cooling, it discovered that said subject could be solved by including the process of adjusting a cellulose dope to temperature higher than 15 degreeC before emulsification and porosification.
  • cellulose is dispersed in a low-temperature alkaline aqueous solution to obtain a cellulose dope. Then, by adjusting the temperature of the cellulose dope to above 15 ° C., porous cellulose beads exhibiting high adsorption performance It has also been found that can be obtained.
  • the present inventor can use an optical microscope as long as the value of [solid content of porous cellulose beads after granulation] / [solid content other than auxiliary materials in dope] is less than 1.35. It has been found that porous cellulose beads having a uniform transmission observation image and exhibiting high adsorption performance can be easily obtained.
  • the value of [Solid content of porous cellulose beads after granulation] / [Solid content other than auxiliary materials in dope] is more preferably 0.7 or more and less than 1.35. When the value is 0.7 or more, porous cellulose beads having excellent mechanical strength and a large specific surface area can be easily obtained.
  • the present inventors have found that when the value is less than 1.35, it is easy to obtain porous cellulose beads having a narrow pore size distribution.
  • the value is more preferably 0.8 or more and less than 1.31, and most preferably 0.9 or more and less than 1.28.
  • “granulation” means emulsification of cellulose dope and obtaining cellulose cellulose porous beads by contacting cellulose dope droplets in the emulsion with a coagulation solvent
  • “after granulation” refers to the situation in which no special operation has been performed after the step of making porous, which involves a change in the mass of the solid content of the bead. Refers to the dry weight per volume completely settled.
  • Solid content in dope refers to a component that is solid at room temperature alone before the dope preparation, and among these, “sub-material” refers to a porous process, a washing process, a crosslinking process, a ligand after the dope preparation. It refers to what is removed in the immobilization process, purification process, etc. For example, sodium hydroxide is considered a secondary material.
  • the temperature for cooling the cellulose dope is more preferably ⁇ 15 ° C. or lower. Further, if the temperature for cooling the cellulose dope is ⁇ 20 ° C. or higher, it is preferable from the viewpoint of energy cost required for cooling and equipment cost required for stirring.
  • “cellulose dope” refers to a dispersion in which fine cellulose particles or cellulose fibers are dispersed in an alkaline aqueous solution. The length of fine cellulose particles or cellulose fibers in the cellulose dope is ideally 10 ⁇ m or less.
  • the time for cooling the cellulose dope at a temperature lower than ⁇ 12 ° C. is not particularly limited, but if it is 30 minutes or longer, there is a tendency to obtain a more homogeneous porous cellulose bead with a transmission observation image obtained by an optical microscope. preferable. Moreover, if it is 60 minutes or more, a more preferable porous cellulose bead can be obtained. In addition, if the cooling is continued for a considerably long time, the cellulose dope tends to discolor, the viscosity increases, or gelation tends to occur. Therefore, the cooling time is preferably 48 hours or less, and 16 hours.
  • the above time can be defined as the time after the temperature of the cellulose dope reaches a predetermined temperature of ⁇ 12 ° C. or lower.
  • the cellulose dope temperature before the cooling step is preferably 25 ° C. or lower. If the said temperature is 25 degrees C or less, coloring of a cellulose dope will decrease and defects, such as generation
  • the temperature before the cooling step is more preferably ⁇ 5 ° C. or higher, more preferably ⁇ 2 ° C. or higher, particularly preferably ⁇ 1 ° C. or higher. Most preferably. Especially, 15 degrees C or less is more preferable, and 10 degrees C or less is still more preferable.
  • the alkali used in the present invention can be used without particular limitation as long as it shows alkalinity when it becomes an aqueous solution.
  • Lithium hydroxide, sodium hydroxide and potassium hydroxide are preferable from the viewpoint of availability, and sodium hydroxide is most preferable from the viewpoint of product safety and price.
  • the alkali concentration of the aqueous alkali solution is not particularly limited, but is preferably 3% by mass or more and 20% by mass or less. If the alkali concentration is within this range, the dispersibility / swellability of cellulose in an alkaline aqueous solution is increased, which is preferable.
  • the concentration of alkali is more preferably 5% by mass or more and 15% by mass or less, and further preferably 7% by mass or more and 10% by mass or less.
  • the “auxiliary agent” refers to an agent that promotes dispersion of cellulose in an alkaline aqueous solution or stabilizes the cellulose dope.
  • the concentration of the auxiliary agent in the dope is preferably 3% by mass or more and 30% by weight or less. If the concentration of the auxiliary agent is within this range, the homogeneity of the dope is preferably increased.
  • the concentration of the auxiliary agent is more preferably 8% by mass or more and 30% by mass or less, further preferably 10% by mass or more and 20% by mass or less, and most preferably 12% by mass or more and 15% by mass or less.
  • the type of cellulose is not particularly limited. Since the present applicant has developed a method for obtaining porous cellulose beads without completely dissolving cellulose as shown in Patent Document 6, cellulose introduced with a substituent for increasing solubility is disclosed. For example, it is not necessary to use substituted cellulose, and ordinary unsubstituted cellulose is used as a raw material. However, in order to efficiently disperse the cellulose in the alkaline aqueous solution, it is preferable to use cellulose powder as the cellulose.
  • the molecular weight of the cellulose raw material used is not particularly limited, but the degree of polymerization is preferably 1000 or less. When the degree of polymerization is 1000 or less, the dispersibility / swellability in an aqueous alkali solution is increased, which is preferable. Moreover, since the mechanical strength of the obtained porous cellulose bead will become large if a polymerization degree is 10 or more, it is preferable.
  • a more preferable range of the degree of polymerization is 50 or more and 500 or less, further preferably 100 or more and 400 or less, particularly preferably 200 or more and 350 or less, and most preferably 250 or more and 350 or less.
  • the concentration of cellulose in the cellulose dope is not particularly limited and may be appropriately adjusted.
  • the concentration may be about 1% by mass or more and 20% by mass or less.
  • the concentration is preferably 2% by mass or more, more preferably 3% by mass or more, particularly preferably 3.8% by mass or more, and most preferably 4.0% by mass or more from the viewpoint of the mechanical strength of the porous beads. It is. Further, from the viewpoint of adsorption performance and dope homogeneity, it is preferably 10% by mass or less, more preferably 8% by mass or less, particularly preferably 6% by mass or less, and most preferably 5% by mass or less.
  • the method for preparing the cellulose dope may be according to a conventional method. For example, what is necessary is just to stir, maintaining the mixture of aqueous alkali solution and a cellulose at low temperature.
  • the cellulose dope according to the present invention it is preferable to filter the cellulose dope according to the present invention because the homogeneity of the dope is further improved and porous cellulose beads showing a more uniform transmission observation image tend to be obtained. From the viewpoint of quality control in the medical and pharmaceutical fields, it is preferable to perform filtration because a step of filtering the dope may be required.
  • the cellulose dope of Patent Document 6 is quite difficult to filter, and the state of the obtained porous cellulose beads is greatly different depending on the presence or absence of filtration.
  • the cellulose dope concerning this invention can implement filtration with a very simple instrument. Even if the cellulose concentration in the dope is a relatively high concentration such as 4% by weight or 5% by weight, the filtration can be carried out easily.
  • the filtration method and filter medium that can be used in the present invention, and an appropriate method / apparatus may be used.
  • the pore diameter of the filter medium There is no particular limitation on the pore diameter of the filter medium.
  • beads for affinity chromatography for industrial use are often 50 ⁇ m or more, and if foreign matter larger than this is mixed, removal after granulation becomes difficult. Therefore, the pore size of the filter medium is preferably 50 ⁇ m or less. . In small scale / high speed refining, a small particle size is often used. In this case, a filter medium having a pore size of 40 ⁇ m or less can be used. When it is desired to widen the particle size distribution, smaller beads may be included, and the pore size of the filter medium is preferably 30 ⁇ m or less.
  • the pore diameter of the filter medium is 0.1 ⁇ m or more, it is preferable because liquid feeding can be performed smoothly, more preferably 1 ⁇ m or more, still more preferably 5 ⁇ m or more, and most preferably 10 ⁇ m or more.
  • the pore diameter of the filter medium refers to the average pore diameter.
  • the material and properties of the filter medium can be used without any particular limitation.
  • the said filtration may be performed with respect to the cellulose dope after the said cooling process, and may be performed with respect to the cellulose dope after the temperature adjustment process of a postscript.
  • the temperature of the cellulose dope is adjusted to be higher than 15 ° C.
  • this process may be abbreviated as “temperature adjustment process”. If the said temperature is higher than 15 degreeC, there will be no limitation in particular. If the temperature is higher than 15 ° C., the value of [solid content of porous cellulose beads after granulation] / [solid content other than auxiliary materials in dope] tends to be smaller. Further, when the temperature is increased, the value of [solid content of the porous cellulose beads after granulation] / [solid content other than the auxiliary material in the dope] is further decreased. Preferably, it is more preferably 25 ° C or higher.
  • the temperature of the step of adjusting the cellulose dope to a temperature higher than 15 ° C is preferably higher than 25 ° C, more preferably 30 ° C or higher, further preferably 35 ° C or higher, and 40 ° C or higher. It is particularly preferred.
  • the said temperature is less than 60 degreeC, it becomes easy to maintain the sphericity of a porous cellulose, and since the mechanical strength of a bead is hard to fall, it is preferable. Moreover, it is still more preferable that it is 50 degrees C or less.
  • the temperature at a temperature just before the start of the porosification is water-based, if alcohol or the like is used for making the pores, heat is generated during mixing and the temperature rises by several degrees C., but the temperature described above is the temperature before this rise. It is convenient and preferable to manage.
  • the time of the temperature adjustment step is not particularly limited and may be adjusted as appropriate. For example, after adjusting the temperature of the cellulose dope to a predetermined temperature of 15 ° C. or higher, stirring may be continued for 1 minute or longer. Although the upper limit of the said time is not specifically limited, For example, it can be 60 minutes or less. From the viewpoint of the homogeneity and storage stability of the cellulose dope, the time is preferably 5 minutes or more, more preferably 10 minutes or more, still more preferably 15 minutes or more, more preferably 45 minutes or less, and more preferably 30 minutes or less. Preferably, 25 minutes or less is even more preferable.
  • the method for obtaining the porous cellulose beads from the cellulose dope according to the present invention is not particularly limited, and a conventionally known method can be used. Especially, the manufacturing method including the emulsification process which throws a cellulose dope into a continuous phase solvent and makes it a droplet is preferable from the point of the simplicity of an installation.
  • Examples of the continuous phase solvent constituting the emulsion include animal and vegetable oils and fats, hydrogenated animal and vegetable oils and fats, fatty acid glycerides, aliphatic hydrocarbon solvents, and aromatic hydrocarbon solvents.
  • a surfactant such as a nonionic surfactant may be used.
  • animal and vegetable oils and fats palm oil, shea fat, monkey fat, iripe fat, pork fat, beef tallow, rapeseed oil, rice oil, peanut oil, olive oil, corn oil, soybean oil, perilla oil, cottonseed oil, sunflower oil, evening primrose oil, Sesame oil, safflower oil, coconut oil, cacao butter, palm kernel oil, fish oil, wakame oil, kombu oil and the like can be mentioned.
  • the fatty acid glyceride may be any of tri-, di-, and mono-glycerides, and examples thereof include stearic glyceride, palmitic glyceride, and lauric glyceride.
  • the aliphatic hydrocarbon solvent include beeswax, candelilla wax, rice bran wax and the like.
  • the aromatic hydrocarbon solvent include benzene, toluene, chlorobenzene, dichlorobenzene and the like.
  • a surfactant In order to prepare an emulsion, an appropriate amount of a surfactant may be added.
  • the surfactant include sorbitan fatty acid esters such as sorbitan laurate, sorbitan stearate, sorbitan oleate, and sorbitan trioleate.
  • the amount of the continuous phase solvent used may be an amount capable of sufficiently dispersing the cellulose dope droplets. For example, it can be 1 mass times or more with respect to the cellulose dope. On the other hand, if the amount of the continuous phase solvent is too large, the amount of waste liquid may increase excessively, and the ratio is preferably 10 times by mass or less. Moreover, 7 mass times or less are more preferable, and 5 mass times or less are still more preferable. In addition, when the amount of the continuous phase solvent is small relative to the cellulose dope, it becomes an O / W / O emulsion in which the continuous phase solvent enters the droplets of the cellulose dope, and as a result, porous beads having a homogeneous structure cannot be obtained. Therefore, the ratio is preferably 2 times or more, more preferably 3 times or more, and particularly preferably 4 or more.
  • the emulsion may be prepared by a conventional method. For example, it can prepare by stirring the liquid mixture containing the said cellulose dope, a continuous phase solvent, and surfactant.
  • Porous cellulose beads having a value of the solid content of the porous cellulose beads] / [the solid content other than the auxiliary material in the dope] of less than 1.35 are preferred because they tend to be easily obtained.
  • Porous cellulose beads are obtained by adding a coagulation solvent to the emulsion and extracting the solvent in the cellulose dope droplets.
  • the coagulation solvent is not particularly limited as long as it has an affinity for the solvent of the cellulose dope, and examples thereof include alcohol solvents and mixed solvents of water and alcohol solvents.
  • the alcohol solvent include C 1-4 alcohols such as methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, s-butanol, and t-butanol.
  • the amount of the coagulation solvent used is not particularly limited and may be adjusted as appropriate. For example, it can be about 20 v / w% or more and 150 v / w% or less with respect to the cellulose dope.
  • the coagulation method is not particularly limited, but when a step of emulsification is included, it is preferable to add the coagulation solvent in a state of being appropriately stirred so that the droplets are not bonded to each other.
  • the coagulated porous cellulose beads may be separated by filtration or centrifugation, and washed with water or alcohol.
  • the obtained porous cellulose beads may be classified using a sieve or the like in order to make the particle diameter uniform.
  • the porous cellulose beads of the present invention are preferably crosslinked porous cellulose beads obtained by allowing a crosslinking agent to act, because it is easy to provide an adsorbent suitable for high-speed purification.
  • a crosslinking agent for example, the method described in WO2008 / 146906 can be used.
  • the crosslinking step may be performed by adding a crosslinking agent to the cellulose dope following the temperature adjustment step, or the porous cellulose beads may be crosslinked by acting a crosslinking agent.
  • crosslinking agent examples include halohydrins such as epichlorohydrin, epibromohydrin and dichlorohydrin; bifunctional bisepoxides (bisoxiranes); and polyfunctional polyepoxides (polyoxiranes).
  • a crosslinking agent may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together.
  • the solvent for the reaction for cross-linking the porous cellulose beads with a cross-linking agent may be selected as appropriate.
  • water miscibility such as alcohol solvents such as methanol, ethanol and isopropanol, and nitrile solvents such as acetonitrile, etc. Mention may be made of organic solvents. Further, two or more crosslinking reaction solvents may be mixed and used.
  • the crosslinking reaction may be performed a plurality of times, and the reaction solvent and the crosslinking agent may be changed each time.
  • the first crosslinking reaction may be performed in a water-miscible organic solvent
  • the final crosslinking reaction may be performed in water.
  • the intermediate solvent composition may be the same as or different from either the first time or the last time, or may be an intermediate composition thereof.
  • all rounds may be carried out in an aqueous solvent. The same applies to the crosslinking agent.
  • a base may be added to the reaction solution.
  • bases include alkali metal hydroxides such as sodium hydroxide and potassium hydroxide; alkali metal hydrogen carbonates such as sodium hydrogen carbonate and potassium hydrogen carbonate; alkali metal carbonates such as sodium carbonate and potassium carbonate; triethylamine and pyridine.
  • organic bases such as
  • the crosslinked porous cellulose beads are insoluble, and may be washed with a solvent such as water.
  • the porous cellulose beads according to the present invention can be used as an adsorbent by immobilizing a ligand that interacts with a target substance. Since the adsorbent that can be obtained in the present invention has the characteristic that there is little nonspecific adsorption, it is possible to provide highly safe drugs and treatments, and also save labor in the intermediate washing step during purification and treatment. Can be realized. In addition, since the porous cellulose beads of the present invention have high alkali resistance, an adsorbent capable of alkali cleaning can be obtained by immobilizing an alkali resistant ligand.
  • the “ligand” in the present invention refers to an affinity ligand that has a specific affinity for a target substance to be purified by adsorbing to an adsorbent and interacts with the target substance.
  • the target substance is an antibody, an antigen, protein, or peptide fragment that specifically interacts with the antibody
  • the target compound is a ligand of the enzyme, an enzyme using the ligand as a substrate
  • the target compound is the antigen
  • an antibody against the target antigen can be mentioned.
  • the ligand that can be used for the adsorbent according to the present invention is not particularly limited as long as it has a specific affinity for the target substance to be purified using the adsorbent according to the present invention.
  • the method for immobilizing the ligand on the porous cellulose beads according to the present invention is not particularly limited, and a conventional method can be used.
  • a conventional method can be used.
  • cyanogen bromide method, trichlorotriazine method, epoxy Method immobilization of amino group-containing ligands using methods such as tresyl chloride method, periodate oxidation method, divinyl sulfonic acid method, benzoquinone method, carbonyldiimidazole method, acyl azide method; epoxy method, diazo coupling method, etc.
  • a method of immobilizing a hydroxyl group-containing ligand using a method a method of immobilizing a thiol group-containing ligand using an epoxy method, a tresyl chloride method, a divinyl sulfonic acid method, etc .; a carboxylic acid-containing ligand or a formyl group on an amination carrier
  • immobilization methods such as a method of immobilizing the contained ligand can be mentioned. The entire contents of this document are incorporated herein by reference.
  • the adsorbent according to the present invention can be used as an adsorbent for purification, but can also be used as an adsorbent for purifying antibody drugs and a medical adsorbent that have attracted attention in recent years.
  • the ligand when used in adsorbents for antibody drug purification, for example, antigens and proteins highly specific for antibodies, protein A, protein G, protein L and their variants, antibodies Examples thereof include amino group-containing ligands such as peptides having binding activity.
  • an adsorbent capable of specifically adsorbing immunoglobulin (IgG) an adsorbent obtained by immobilizing protein A, protein G, or a variant thereof as a ligand on a porous carrier has attracted attention.
  • the protein A or the like that can be used in the present invention is not particularly limited, and natural products and genetically modified products can be used without limitation.
  • antibody binding domains, mutants thereof, those containing oligomers thereof, fusion proteins, and the like may be used.
  • the number of polymerizations of the oligomer can be 2 or more and 10 or less.
  • the adsorbent of the present invention in which protein A is immobilized can also be used as a therapeutic adsorbent that can be used for the treatment of dilated cardiomyopathy and the like.
  • the adsorbent of the present invention in which dextran sulfate or the like is immobilized can be used as an adsorbent for treating hypercholesterolemia.
  • the method for introducing the ligand into the porous cellulose beads can be selected from the various immobilization methods described above, but more preferably, the reaction between the formyl group contained in the porous particles and the amino group of the ligand is performed.
  • the amount of ligand immobilized on the adsorbent of the present invention is not particularly limited, and can be, for example, 1 mg or more and 300 mg or less per mL of porous cellulose beads. If the said ratio is 1 mg or more, since the adsorption amount with respect to a target substance becomes large, it is preferable since it can suppress manufacturing cost if it is 300 mg or less.
  • the amount of ligand immobilized is preferably 2 mg or more, more preferably 4 mg or more, particularly preferably 5 mg or more, more preferably 100 mg or less, further preferably 50 mg or less, particularly preferably 30 mg or less, per mL of porous cellulose beads. 20 mg or less is most preferable.
  • the use of the adsorbent of the present invention is not particularly limited, but it is suitable for a medical adsorbent, especially a therapeutic adsorbent that adsorbs and removes large-sized pathogenic substances (such as LDL cholesterol) because the surface porosity can be improved. Can be used. Moreover, it can be used as various chromatographic carriers, especially industrial chromatographic carriers packed in large-diameter columns. In particular, when used as an adsorbent for antibody drug purification, which has been in great demand in recent years, the effect can be exhibited. From such a viewpoint, it can be suitably used as an adsorbent obtained by introducing protein A, protein G, or protein L into the porous beads of the present invention.
  • the present invention can provide a porous cellulose bead that can be easily adjusted in particle size, has good trueness, and exhibits an appropriate compressive stress, and therefore accurately meets the need for column fabrication that is relatively difficult to fabricate.
  • the appropriate compressive stress is not particularly limited as long as it can be appropriately filled and used according to the application, but the stress when the settled beads are compressed by 20% is 0.01 MPa or more. If it is less than 1.0 MPa, it is preferable because good adsorption performance can be imparted.
  • a method for adjusting the compressive stress include a method of adjusting the cellulose concentration in the cellulose dope and the degree of crosslinking.
  • the target substance can be purified using the adsorbent according to the present invention.
  • the adsorbent of the present invention may be brought into contact with a solution containing the target substance.
  • the contact method is not particularly limited, and the adsorbent according to the present invention may be added to a solution containing the target substance.
  • the column is filled with the adsorbent of the present invention, and the solution containing the target substance is prepared.
  • the target substance may be selectively adsorbed to the adsorbent of the present invention by passing the liquid. Since the adsorbent according to the present invention has high strength, particularly when packed in a column, liquid can be passed at a high speed, and the target substance can be purified efficiently.
  • the adsorbent of the present invention on which the target substance is selectively adsorbed is separated from the solution by filtration or centrifugation.
  • the adsorbent and the solution are easily separated.
  • the target substance and other substances can be separated.
  • the target substance is separated from the adsorbent of the present invention using the eluate.
  • the eluate for example, an acidic buffer having a pH of about 2.5 or more and 4.5 or less can be used.
  • a long intermediate washing step may be required as a pre-elution step, but the porous cellulose beads of the present invention do not necessarily require such an intermediate washing step. do not do.
  • porous cellulose beads of the present invention have high alkali resistance, they can be washed with an alkaline washing liquid that can be prepared inexpensively and easily.
  • sodium hydroxide When sodium hydroxide is used, it can be washed without problems even if its concentration is 0.1 N, and it can be used even if it is 0.5 N or more if the alkali resistance of the ligand is high.
  • Test Example 1 Measurement of dynamic adsorption amount (1) Solution preparation The following A to E solutions and neutralization solutions were prepared and defoamed before use.
  • Solution A A PBS buffer solution having a pH of 7.4 was prepared using “Phosphor buffered saline” manufactured by Sigma and distilled water.
  • Liquid B A 35 mM aqueous sodium acetate solution having a pH of 3.5 was prepared using acetic acid, sodium acetate, and distilled water.
  • C liquid 1M acetic acid aqueous solution was prepared using acetic acid and distilled water.
  • Solution D An aqueous IgG solution having a concentration of 3 mg / mL was prepared using a polyclonal antibody (“Gamma Guard” manufactured by Baxter) and the solution A.
  • Solution E An aqueous solution in which the concentrations of sodium hydroxide and sodium chloride manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. were 0.1N sodium hydroxide and 1M sodium chloride, respectively, was prepared and used as an alkaline cleaning solution.
  • Neutralization solution A 2M tris (hydroxymethyl) aminomethane aqueous solution was prepared with tris (hydroxymethyl) aminomethane and ultrapure water.
  • the dynamic adsorption amount of IgG was determined from the amount of IgG adsorbed on the adsorbent and the adsorbent volume until IgG broke through 5%.
  • the dynamic adsorption amount is referred to as 5% DBC.
  • Static adsorption amount The static adsorption amount of IgG was calculated
  • the static adsorption amount is referred to as SBC.
  • Test Example 2 Measurement of 20% compressive stress (1) Sample preparation Pure water was added to sample beads to prepare a slurry having a concentration of about 50% by volume. A homogenization / defoaming operation consisting of homogenization by stirring the slurry and subsequent defoaming by depressurization for 30 minutes or more was repeated three times to obtain a defoamed slurry. Separately from this operation, the object to be treated was changed to pure water, and the above homogenous / demethod operation was performed for 90 minutes or more to obtain defoamed water.
  • Test Example 3 K av: Measurement porous cellulose beads 22.8mL of gel phase distribution coefficient was dispersed in distilled water, and degassed for 30 minutes.
  • the column (“Tricorn 10/300” manufactured by GE Healthcare Japan) was packed with the degassed porous cellulose beads. Size exclusion chromatography system (“DGU-20A3”, “RID-10A”, “LC-20AD”, “SIL-20AC”, “CTO-20AC”) manufactured by Shimadzu Corporation, and “LCSolution” as software Measurement).
  • the following dextran or glucose was used by dissolving in 50 mM phosphate buffer (pH 7.5) containing 1 M NaCl.
  • V R represents the liquid passing amount (mL) to peak from the injection of the marker solution is observed
  • V 0 is injected peaks from observation dextran solution having a molecular weight of 4 ⁇ 10 7
  • Test Example 4 Measurement of solid content About 5 mL of sample beads were placed in a 15 mL centrifuge tube, and vibration was applied until the sample bead volume was not reduced any more, and the volume at that time was accurately measured. Hereinafter, such a volume is referred to as a “sedimentation volume”. Next, the beads in the centrifuge tube were transferred to a 3G glass filter and filtered. Note that the weight of the 3G glass filter was measured in advance by drying overnight in a 122 ° C. oven. Then, it was dried overnight in an oven at 122 ° C. and weighed. The solid content of the bead sample was calculated by dividing the weight by the volume.
  • Test Example 5 Measurement of pressure flow rate characteristics Beads having a predetermined column volume and the same sedimentation volume were prepared, and water was added thereto to prepare a 50% slurry. This 50% slurry was put into a column and allowed to stand for 2 hours or more. Next, water was passed from the top, and the flow rate was increased until the bead surface reached a predetermined column volume. The measurement was performed using AK Health Pure AKTA Pure 150 or AKTA Pilot, and the relationship between the linear velocity and the column differential pressure was examined.
  • Test Example 6 Measurement of median particle size The median particle size of beads and adsorbents was determined using a laser diffraction / scattering particle size distribution analyzer ("Partica LA950" manufactured by HORIBA, Ltd.).
  • Example 1 Production of Porous Cellulose Beads (1) Compound to be used As cellulose, crystalline cellulose “PH-F20JP” manufactured by Asahi Kasei Chemicals Corporation was used. Urea manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. was used. The alkaline aqueous solution was prepared using sodium hydroxide and distilled water manufactured by Wako Pure Chemical Industries. As a dispersion medium, o-dichlorobenzene manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. was used. As a surfactant, sorbitan monooleate (span 80 equivalent) manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. was used.
  • Denacol EX321 manufactured by Nagase ChemteX Corporation was used as a water-soluble crosslinking agent to be added to the dope.
  • As the crosslinking agent after granulation epichlorohydrin manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. was used. Other reagents were used without purification unless otherwise specified.
  • the cellulose dope was charged into 979.8 g of o-dichlorobenzene solution in which 9.8 g of sorbitan monooleate was dissolved, and after cooling at 600 rpm for 15 minutes, as shown in Table 2
  • the cellulose droplets were dispersed by stirring at the adjusted temperature.
  • As a solidifying solvent 87 mL of methanol adjusted to the same temperature as the adjusted temperature after cooling shown in Table 2 was added, and stirred at 600 rpm for 20 minutes. Thereafter, 14 g of acetic acid was added and neutralized by stirring at 600 rpm for 10 minutes.
  • the solution was filtered through a glass filter “26G-3” manufactured by TOP, and then washed with ethanol and water to collect porous cellulose beads.
  • Epoxy ring-opening treatment The resulting crosslinked beads and 50% slurry of water were heated in an autoclave at 121 ° C. for 60 minutes to open the epoxy groups to form diol groups. The disappearance of the epoxy group can be confirmed with a phenolphthalein indicator.
  • Example 2 Preparation of adsorbent with immobilized ligand (1) Aldehydation reaction (1-1) Preparation of buffer 0.165 g of citric acid monohydrate and 0.0646 g of trisodium citrate dihydrate and water was added to make 100 mL, and a pH 3.4 buffer was prepared.
  • FIG. 1 shows a transmission observation image of the beads obtained in Comparative Example 4.
  • This granulation example is particularly deeply related to the example of Patent Document 6 that is considered to have high adsorption performance, but as described above, a homogeneous transmission observation image cannot be obtained, and the length in the bead is 10 ⁇ m.
  • the above-mentioned average number of foreign matters is also over 2, and there is a possibility that the analysis as in Non-Patent Document 6 becomes difficult.
  • the transmission observation images had the same tendency.
  • FIG. 2 shows a transmission observation image of the beads obtained in Comparative Example 14 of the granulation example. Although the average number of foreign substances was reduced, an image was obtained as if there was a structure with low permeability in the beads. In addition, the number of foreign matters could not be measured due to the structure having a low transmittance. Similar observation images were also obtained in Comparative Examples 12, 13, and 15-19. As shown in Table 2, Comparative Examples 12 to 15 were those in which the dope cooling temperature was ⁇ 15 ° C. in order to reduce the number of foreign matters, but all were [solid content of porous cellulose beads after granulation] / The value of [Solid content other than auxiliary materials in dope] was large.
  • cellulose is dispersed in a low-temperature alkaline aqueous solution. Therefore, the present inventor considered that the lower the cooling process temperature, the more inhomogeneous observation images due to foreign matters in the beads are eliminated and the analysis as in Non-Patent Document 6 becomes possible. As shown in FIG. 2, an unfavorable observation image different from inhomogeneity due to foreign matter or the like was obtained.
  • FIG. 3 shows a transmission observation image of the beads obtained in Example 2.
  • the dope cooling temperature was set to ⁇ 15 ° C., and then the dope temperature was raised to 25 ° C., but as shown in FIG. 3, the transmission observation images were good.
  • the value of [Solid content of porous cellulose beads after granulation] / [Solid content other than auxiliary materials in dope] was good. It is believed that some of the condensation effects described above may have been mitigated.
  • Example 2 is similar to Comparative Example 4 and [Solid content of porous cellulose beads after granulation] / [Solid content other than auxiliary material in dope, which is closely related to Patent Document 6 which is considered to have high adsorption performance.
  • FIG. 4 shows the relationship between the cellulose concentration in the dope and the solid content after granulation in each granulation example. It is proved that a series of main granulation examples have found an example in which the value of [solid content of porous cellulose beads after granulation] / [solid content other than auxiliary materials in dope] can be skillfully controlled. It was done.
  • Test Example 7 Observation of dope A small amount of the cellulose dope being produced was extracted in the middle of the cooling step in the same manner as in Example 2 and observed under a microscope, and the number of foreign matters was measured. The results are shown in Table 3.
  • Comparative Example 20 A cellulose dope was prepared in the same manner as in Comparative Example 4, and the dope was subjected to centrifugal filtration at 2500 ° C. at 4 ° C. The dope supernatant was used to emulsify and make porous as in Comparative Example 4 to obtain porous cellulose beads. As a result of permeation observation of the obtained porous cellulose beads, an observation image similar to that in FIG. 1 was obtained. The solid content of the beads was 3.8 w / v%.
  • Test Example 8 Filtration Example of Cellulose Dope A cellulose dope was prepared in the same manner as in Example 2, and a glass filter (“26G-3” manufactured by TOP, pore size: 16 to 40 ⁇ m) and an aspirator (“AS-01” manufactured by ASONE, Inc.) And suction filtration was carried out in a 25 ° C. atmosphere. Filtration was performed smoothly.
  • Example 5 Porous cellulose beads were obtained in the same manner as in Example 2 except that the cellulose dope filtered in Test Example 8 was used. The physical properties of the obtained porous cellulose beads were also the same as in Example 2. It can be said that beads were obtained through a production method preferable from the viewpoint of removing foreign substances required for adsorbents for pharmaceutical purification and adsorbents for medical use. Further, when applied to the analysis as in Non-Patent Document 6, it can be expected that a more precise test can be performed.
  • the dope supernatant obtained in the same manner as in Comparative Example 7 was filtered in the same manner as in Comparative Example 1 to obtain porous cellulose beads by the same method as in Comparative Example 20.
  • the solid content of the beads was 3.1 w / v%, which was smaller than those of Comparative Example 4 and Comparative Example 20, an observation image with extremely low transmittance was obtained as shown in FIG.
  • the cellulose dope produced by a conventionally known method is difficult to filter. It can also be seen that the effect of achieving the object of the present invention cannot be obtained even if the centrifugation of the foreign matter is attempted. Furthermore, when the supernatant obtained by centrifuging a conventional cellulose dope was filtered, it was found that the observed image was further deteriorated.
  • Test Example 9 Pressure Flow Rate Characteristics of Crosslinked Porous Cellulose Beads
  • Crosslinked porous cellulose beads having a median particle size of 90 ⁇ m were obtained from Comparative Example 4, Crosslinking Examples, and Classification Examples.
  • the 20% compressive stress of this crosslinked porous cellulose bead was 0.11 MPa.
  • Reference Example 1 MabSelect SuRe LX manufactured by GE Healthcare, which is well known as a high-adsorption type agarose protein A resin for large columns, was used.
  • FIG. 6 shows a comparison of the pressure flow characteristics of the two.
  • the column used had an inner diameter of 5 cm, a packed bed height of 5 cm, and the amount of packed beads was 98.1 mL in terms of sedimentation volume. As shown in FIG.
  • the crosslinked porous cellulose beads according to the present granulation example, the crosslinking example, and the classification example are equal to or more than the reference example 1 if the median particle size is 90 ⁇ m or more and the 20% compression stress is 0.11 MPa or more. It can be seen that the pressure flow rate characteristic is shown.
  • Test Example 10 Adsorption performance of adsorbent Table 4 shows the adsorption performance and 20% compressive stress value of the adsorbent using crosslinked porous cellulose beads having a particle size adjusted to 90 ⁇ m.
  • the adsorbent having a median particle size of 90 ⁇ m obtained from Example 2 relating to the present invention has a 20% compressive stress of 0.11 MPa, which is equivalent to Reference Example 1 known for large columns. It is suggested to show pressure flow characteristics. Also, the adsorption performance was inferior to that of Comparative Example 4 reported as a highly adsorbent cellulose protein A resin. Moreover, although this adsorption
  • the porous cellulose beads of the present invention since the porous cellulose beads of the present invention have a good permeation observation image, it can contribute to labor saving in the optimization study of the purification method. Also, from the results of the adsorbent obtained from a series of granulation examples, if the value of [solid content of porous cellulose beads after granulation] / [solid content other than auxiliary materials in dope] is too large, It was also found that the adsorption performance, particularly SBC, tends to be low.
  • Test Example 11 Adsorption performance of adsorbent Table 5 shows the adsorption performance of an adsorbent using crosslinked porous cellulose beads having a particle size adjusted to 50 ⁇ m.
  • Reference Example 2 shows the results of TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F manufactured by Tosoh Corporation, which is attracting attention as a small particle size protein A resin for a continuous chromatographic system.
  • the adsorbent having a median particle size of 50 ⁇ m obtained from Example 2 relating to the present invention has an adsorption characteristic equal to or higher than that of the protein A resin of Reference Example 2 which is attracting attention for use in a continuous chromatographic system.
  • the present invention an excellent porous cellulose bead that can provide an adsorbent for a continuous chromatographic purification system can be provided.
  • Test Example 12 K av inverse of the crosslinked porous beads obtained in the measurement 7 in each granulation example plot of K av measurements of the adsorbent of the method and the cross-linking porous cellulose beads crosslinked with Reference Example 1
  • the curve of size exclusion chromatography (ISEC) is shown. If the value of K av is large, the pore volume in the marker molecule is large. When the slope of this curve is steep, the pore size distribution is relatively sharp, and when the slope is gentle, the pore size distribution is broad. In general, the former tends to have a larger particle specific surface area and saturated adsorption amount.
  • the sufficiently small marker molecule K av can be regarded as the intraparticle porosity of the bead.

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Abstract

本発明は透過観察像が良好且つ高吸着量を発現する細孔特性を有した非特異的吸着の少ない多孔質セルロースビーズを毒性や腐食性が少なく簡便な方法で提供すること、さらにはこれを用いた架橋多孔質セルロースビーズ、およびこれらを用いた吸着体、これらを用いたカラム、およびこれらを用いた精製方法を提供することを課題とする。アルカリ水溶液と原料セルロース粉末とを混合して作製したセルロースドープを－１２℃より低い温度に冷却する工程と、セルロースドープを１５℃より高い温度に調整する工程を含むことを特徴とする、多孔質セルロースビーズの製造方法を発明することで、上記課題を解決することができた。

Description

多孔質セルロースビーズおよび吸着体
　本発明は、多孔質セルロースビーズおよび吸着体に関する。
　医療用吸着体や抗体医薬品等の高分子医薬品精製用の吸着体の材質には、非特異吸着の少ないアガロースやセルロース等の多糖類が好まれている。多孔質セルロースビーズは、機械的強度が比較的大きいことから破砕され難く、また吸着すべき標的物質と相互作用するリガンドを導入するのに利用できる水酸基を多く含有する等の利点から、各種クロマトグラフィー用吸着体やアフィニティー吸着体などの各種吸着体用の基材として用いられている。特に、アフィニティー吸着体は、効率よく標的物質を精製、または不要物濃度を低減できることから、医療用吸着体や医薬品精製用吸着体として利用されてきている。特に、プロテインＡをアフィニティーリガンドとして多孔質担体に固定化した吸着体がリウマチ、血友病、拡張型心筋症の治療用吸着体または抗体医薬品精製用吸着体として注目されている（例えば非特許文献１，２）。
　多孔質セルロースビーズの製造は、セルロースを一般的な溶媒に溶解させることが困難であるため、一般的な合成高分子ビーズと比べて煩雑な工程を含むものが多い。その一つとして、６０％もの高濃度のチオシアン酸カルシウム水溶液など、腐食性が高く、設備化の難易度を高くしてしまう溶媒に溶解してセルロース溶液を作製し、これを液滴化して凝固する方法が開示されている（例えば特許文献１）。この方法で用いられるセルロース溶液が特異な挙動を示し、また、この方法で得られる多孔質セルロースビーズは、かなり大きい細孔を有しており、また細孔径分布も広いことが知られている（例えば非特許文献３）。よって、当該方法で得られた多孔質セルロースビーズを抗体などの吸着体として用いる場合、比表面積が小さくなることが予想され、高い吸着性能を示すことは期待できない。一方、セルロースの溶解性を上げるためにセルロースの水酸基に置換基を付与し、汎用の溶媒に溶解させて造粒を行い、造粒後に置換基を脱離させて多孔質セルロース系担体を得る方法が例示されている（例えば特許文献２）が、工程が煩雑である。
　安価、安全且つ簡便にセルロース溶液を作製する方法として、低温のアルカリ水溶液を溶媒とする方法が知られている。しかしながら、一般的にこの方法は完全にセルロースを溶解させることが難しく、特殊なセルロースを用いる場合が多い。例えば、特許文献３にはアルカリ溶液に溶解性を示すセルロースが開示されているが、当該セルロースには、ミクロフィブリルの繊維径が１μｍ以下、さらには５００ｎｍ以下に、特殊な微細加工が施されている。
　特許文献４に示されるように、微生物セルロースをアルカリ溶液に溶解してセルロース溶液を作製し、連続相溶媒を添加後にセルロース溶液を液滴化した後、微生物セルロース粒子を凍結させ、次に洗浄することによりセルロースビーズを得る方法が開示されているが、連続相溶媒ごとセルロース溶液を凍結するのに、エネルギーを要する。また、微生物セルロースは特殊な原料であり、これを安定的に大量に入手することは現時点では困難である。
　ごく最近、特許文献５にて、水酸化ナトリウムと尿素を含有する水溶液を用いつつ、比較的高い温度でセルロースドープが作製できること、更にはこのセルロースドープから多孔質ビーズが得られることが報告されている。また特許文献６にて、汎用のセルロース原料をやや低温のアルカリ水溶液で処理したセルロース分散液に、ある種の添加剤を加えることで、高性能な多孔質セルロースビーズおよびそれを用いた吸着体が得られることが報告されている。
　これら吸着体の評価方法としては、目的とする物質の吸着量を直接測定する方法が主流であったが、近年、例えば、非特許文献４では、蛍光標識化された目的吸着物質を用いた吸着挙動の解析方法が示されており、イオン強度によって、ある吸着体粒子内で吸着されやすい部位が異なることが報告されている。つまり、こういった透過観察を用いた予備検討により、最適なイオン強度を予め求めることが可能となっており、これは非常に意義がある。また、非特許文献５においては、吸着体粒子内への吸着挙動の経時変化を透過観察しており、約４０分間でビーズの中央部まで吸着が進行することが示されている。つまり、こういった透過観察を用いた予備検討により、最適な吸着時間を求めることができる。また非特許文献６では、プロテインＡ固定化吸着体に蛍光標識化抗体を吸着させる実験を蛍光顕微鏡を使って解析し、物質移動特性を求める手法が報告されており、この結果から緻密な精製方法を構築できることが示唆される。
　特許文献５，６で得られる多孔質ビーズは、光学顕微鏡で透過観察を行った場合、不均質な構造が観察される場合があり、吸着性能やビーズの機械的強度等の品質が安定しない懸念がある。また、透過観察像が良好でない場合、非特許文献４，５のような透過観察から得られる精製方法の最適化という点で懸念があり、精製工程の最適化に莫大な労力と資源を要する可能性がある。
米国特許第８６６４１５２号明細書 国際公開第２００６／０２５３７１号パンフレット 特開平９－１２４７０２号公報 特開２０１０―２３６９７５号公報 特開２０１１－２３１１５２号公報 国際公開第２０１６／１６７２６８号パンフレット
Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００５，Ｖｏｌ．１０５１，ｐ．６３５－６４６ Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｈｅａｒｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．１５２，Ｎｕｍｂｅｒ　４，２００６，ｐ．７１２ｅ１－７１２ｅ６ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，１９５，１９８０，ｐ．２２１－２３０ Ｄｚｉｅｎｎｉｋ，Ｓ．Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００，２００３，ｐ．４２０ Ｓｔｏｎｅ，Ｍ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，１１６０，２００７，ｐ．２０６． 勝田ら、化学工学会年会研究発表講演要旨集、Ｖｏｌ．８１st，Ｆ２０７，２０１６
　本発明は従来の技術が有する上記課題を鑑みてなされたものであり、腐食性や毒性の大きい副原料を用いず、工業的に不利である煩雑な工程を経ることなく、光学顕微鏡で透過観察を行った場合に均質な透過観察像となる高性能な多孔質セルロースビーズを安価に得るためのものである。
　アルカリ水溶液と原料セルロース粉末とを混合して作製したセルロースドープを－１２℃より低い温度に冷却する工程と、セルロースドープを１５℃より高い温度に調整する工程を含むことを特徴とする多孔質セルロースビーズの製造方法を提供することにより、上記課題を解決できた。
　本発明を以下に示す。
　［１］　アルカリ水溶液と原料セルロース粉末とを混合して作製したセルロースドープを－１２℃より低い温度に冷却する工程と、前記冷却する工程の後に、セルロースドープを１５℃より高い温度に調整する工程を含むことを特徴とする多孔質セルロースビーズの製造方法。
　［２］　セルロースドープを冷却する温度が－２０℃以上、－１５℃以下であることを特徴とする、上記［１］に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
　［３］　セルロースドープを－１２℃より低い温度で冷却する時間が３０分間以上であることを特徴とする、上記［１］または［２］のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
　［４］　［造粒後の多孔質セルロースビーズの固形分含量］／［ドープ中の副原料以外の固形分含量］の値が１．３５未満となることを特徴とする、上記［１］～［３］のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
　［５］　セルロースドープに助剤が含まれていることを特徴とする、上記［１］～［４］のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
　［６］　セルロースドープを１５℃より高い温度に調整する工程の温度が６０℃未満であることを特徴とする、上記［１］～［５］のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
　［７］　セルロースドープを孔径が５０μｍ以下の濾材で濾過する工程を含むことを特徴とする、上記［１］～［６］のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
　［８］　上記［１］～［７］のいずれか一項に記載の製造方法により多孔質セルロースビーズを製造する工程、および、
　架橋剤を用いて多孔質セルロースビーズを架橋する工程を含むことを特徴とする架橋多孔質セルロースビーズの製造方法。
　［９］　上記［８］に記載の製造方法により架橋多孔質セルロースビーズを製造する工程、および、
　架橋多孔質セルロースビーズにリガンドを固定化する工程を含むことを特徴とする吸着体の製造方法。
　［１０］　標的化合物を精製する方法であって、
　上記［９］に記載の製造方法により、標的物質に結合するリガンドを架橋多孔質セルロースビーズに固定化して吸着体を製造する工程、および、
　標的物質を含む溶液と吸着体とを接触させる工程を含むことを特徴とする方法。
　［１１］　吸着体をカラムに充填し、標的物質を含む溶液を当該カラムに通液する上記請求項［１０］に記載の方法。
　本発明によれば、毒性、腐食性が高い副原料を使わず、工業的に不利である煩雑な工程を経ることなく、光学顕微鏡で透過観察を行った場合に均質な透過観察像となる高性能な多孔質セルロースビーズを安価、安全且つ簡便に得ることができる。
比較例４で得られたビーズの透過観察像である。 比較例１４で得られたビーズの透過観察像である。 実施例２で得られたビーズの透過観察像である。 各造粒例におけるドープ中のセルロース濃度と造粒後固形分含量の関係図である。 比較例２１で得られたビーズの透過観察像である。 メディアン粒径が９０μｍ、２０％圧縮応力が０．１１ＭＰａの架橋多孔質セルロースビーズと参考例１の吸着体の圧流速特性図である。 架橋多孔質セルロースビーズと参考例１の吸着体のＫav測定結果である。
　本発明は、アルカリ水溶液と原料セルロース粉末とを混合して作製したセルロースドープを－１２℃より低い温度に冷却する工程と、前記冷却する工程の後に、セルロースドープを１５℃より高い温度に調整する工程を含むことを特徴とする多孔質セルロースビーズの製造方法である。低温の水酸化ナトリウム水溶液にセルロースを分散させてドープを作製し、これを多孔質化してセルロースビーズを得ることは、特許文献６などの例があるが、上記の特徴を有する具体例は未だ見出されていない。
　本発明者は、低温のアルカリ水溶液を用いる方法において、光学顕微鏡による透過観察像が均質な多孔質セルロースビーズの開発に着手した。ここで、透過観察像が均質とは、適切な倍率で観察した場合に、長さ１０μｍ以上の異物のように見える部分が、ビーズ内に平均２個以下であることを目安とする。まず、本発明者は、ドープを冷却する温度を、特許文献６の実施例より低くして多孔質セルロースビーズを作製した。その結果、ドープを冷却する温度を低下させるほど、光学顕微鏡によるドープの透過観察像が均質化する傾向を見出すことができた。特に－１２℃よりドープを冷却する温度が低い場合において、この傾向が顕著であった。この－１２℃より低い温度で冷却する工程を加えた以外は、特許文献６の実施例を参考に多孔質セルロースビーズを製造したが、特許文献６より吸着性能が低下した。その原因を調査した結果、理由は定かではないが、セルロースドープの冷却温度を－１２℃より低くする工程を含む場合、得られる多孔質セルロースビーズの固形分含量が特許文献６より大きくなる傾向にあることが分かった。
　そこで、本発明者は鋭意検討の結果、アルカリ水溶液と原料セルロース粉末とを混合して作製したセルロースドープを－１２℃より低い温度に冷却する工程を含む多孔質セルロースビーズの製造方法において、ドープを冷却後、エマルション化や多孔質化の前にセルロースドープを１５℃より高い温度に調整する工程を含むことで、上記の課題を解決できることを見出した。本発明に関わる製造方法では、セルロースを低温のアルカリ水溶液中に分散させてセルロースドープを得るが、その後、セルロースドープの温度を１５℃超に調整することにより、高吸着性能を示す多孔質セルロースビーズが得られることも見出した。
　本発明者は、［造粒後の多孔質セルロースビーズの固形分含量］／［ドープ中の副原料以外の固形分含量］の値が１.３５未満の多孔質セルロースビーズであれば、光学顕微鏡による透過観察像が均質で、高吸着性能を示す多孔質セルロースビーズが得られやすいことを見出した。［造粒後の多孔質セルロースビーズの固形分含量］／［ドープ中の副原料以外の固形分含量］の値は、より好ましくは０．７以上１.３５未満である。当該値が０．７以上であれば機械的強度に優れ、比表面積が大きい多孔質セルロースビーズが得られやすい。また当該値が１.３５未満であれば、細孔径分布が狭い多孔質セルロースビーズを得られやすい傾向にあることを本発明者は見出した。当該値は、更に好ましくは０．８以上１.３１未満、もっとも好ましくは０．９以上１．２８未満である。
　ここで、「造粒」とは、セルロースドープのエマルション化と、当該エマルション中のセルロースドープ液滴を凝固溶媒に接触させることにより多孔質なセルロースビーズを得ることを示し、「造粒後」とは、多孔質化される工程の後に、ビーズの固形分の質量変化が伴うような特別な操作が成されていない状況を指し、「固形分含量」とは、振動を与える等しながらビーズを完全に沈降させた体積当たりの乾燥重量を指す。「ドープ中の固形分」とは、ドープ作製前に常温且つ単独で固体である成分を指し、このうち「副原料」とは、ドープ作製後の多孔質化工程や洗浄工程、架橋工程、リガンド固定化工程、精製工程等で除去されるものを指す。例えば、水酸化ナトリウムは副原料と見なされる。
　本発明に関するセルロースドープにおいては、－１２℃に近い温度では、熱エネルギー的に相変化のような挙動が見られる場合があり、セルロースドープの温度が速やかに安定しない傾向にある。これらのことから、セルロースドープを冷却する温度は－１５℃以下であることがより好ましい。また、セルロースドープを冷却する温度が－２０℃以上であれば、冷却に要するエネルギーコストや、撹拌に要する設備コストの観点から好ましい。なお、本開示において「セルロースドープ」とは、微細なセルロース粒子またはセルロース繊維がアルカリ水溶液に分散した分散液をいうものとする。また、セルロースドープ中の微細なセルロース粒子またはセルロース繊維の長さは、理想的には１０μｍ以下であることが好ましい。
　また、セルロースドープを－１２℃より低い温度で冷却する時間に特に限定は無いが、３０分間以上であれば光学顕微鏡による透過観察像が更に均質な多孔質セルロースビーズを得られる傾向にあることから好ましい。また６０分間以上であれば、より好ましい多孔質セルロースビーズを得ることができる。また、かなりの長時間冷却を続けると、セルロースドープが変色したり、粘度が上昇したり、ゲル化しやすくなったりする傾向にあることから、冷却時間は４８時間以下であることが好ましく、１６時間以下であれば更に好ましく、生産性の観点から５時間以下であることが好ましく、２時間未満であることが最も好ましい。また、当該冷却工程においては、撹拌を維持することも、品質安定性の面から好ましい。なお、上記時間は、セルロースドープの温度が－１２℃以下の所定温度に達してからの時間とすることができる。
　当該冷却工程より前のセルロースドープ温度は２５℃以下であることが好ましい。当該温度が２５℃以下であればセルロースドープの着色が少なくなり、またダマの発生等の不具合が起こり難い。また上記冷却工程前の温度が－１２℃より高ければ、撹拌を維持しやすいため好ましい。冷却工程前の温度としては、－５℃以上がより好ましく、－２℃以上がさらに好ましく、－１℃以上が特に好ましく、セルロースドープに用いる水のハンドリング性や温度調整の簡便さから０℃以上であることが最も好ましい。中でも、１５℃以下がより好ましく、１０℃以下がさらに好ましい。
　本発明で用いるアルカリは、水溶液となった際にアルカリ性を示すものであれば特に限定なく用いることができる。入手のしやすさから水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが好ましく、製品安全性や価格の面から水酸化ナトリウムが最も好ましい。
　前記アルカリ水溶液のアルカリ濃度に特に限定は無いが、３質量％以上、２０質量％以下であることが好ましい。アルカリの濃度がこの範囲であれば、セルロースのアルカリ水溶液への分散性・膨潤性が高くなるため好ましい。より好ましいアルカリの濃度は５質量％以上、１５質量％以下であり、さらに好ましくは７質量％以上、１０質量％以下である。
　また本発明のセルロースドープには尿素やポリエチレングリコール等の助剤を用いることも好ましい。本開示において「助剤」とは、セルロースのアルカリ水溶液中への分散を促進したり、セルロースドープを安定化するものをいう。助剤のドープ中の濃度は３質量％以上、３０重量％以下であることが好ましい。助剤の濃度がこの範囲であれば、ドープの均質性が高くなるため好ましい。より好ましい助剤の濃度は８質量％以上３０質量％以下であり、さらに好ましくは１０質量％以上、２０質量％以下であり、最も好ましくは１２質量％以上、１５質量％以下である。
　前記セルロースの種類には特に限定は無い。本出願人は、特許文献６で示しているように、セルロースを完全に溶解させずとも多孔質セルロースビーズを得る方法を開発していることから、溶解性を上げるための置換基を導入したセルロースなど、置換セルロースを用いる必要はなく、通常の無置換セルロースを原料として用いている。但し、セルロースをアルカリ水溶液に効率的に分散させるために、セルロースとしてはセルロース粉末を用いることが好ましい。
　用いるセルロース原料の分子量は特に制限されないが、重合度としては１０００以下であることが好ましい。重合度が１０００以下であれば、アルカリ水溶液への分散性・膨潤性が高くなり、好ましい。また重合度が１０以上であれば、得られる多孔質セルロースビーズの機械的強度が大きくなるため好ましい。より好ましい重合度の範囲は５０以上、５００以下、さらに好ましくは１００以上、４００以下、特に好ましくは２００以上、３５０以下、最も好ましくは２５０以上、３５０以下である。
　セルロースドープにおけるセルロースの濃度は特に制限されず適宜調整すればよいが、例えば、１質量％以上、２０質量％以下程度とすればよい。当該濃度としては、多孔質ビーズの機械的強度の観点から、２質量％以上が好ましく、３質量％以上がさらに好ましく、３．８質量％以上が特に好ましく、最も好ましくは４．０質量％以上である。また吸着性能やドープの均質性の観点から、１０質量％以下が好ましく、８質量％以下がさらに好ましく、６質量％以下であることが特に好ましく、最も好ましくは５質量％以下である。
　セルロースドープの調製方法は、常法に従えばよい。例えば、アルカリ水溶液とセルロースとの混合物を、低温に維持しつつ、攪拌すればよい。
　本発明に関するセルロースドープを濾過すると、更にドープの均質性が向上し、より均質な透過観察像を示す多孔質セルロースビーズが得られる傾向にあることから好ましい。医療や医薬品分野における品質管理上の観点から、ドープを濾過する工程が必要とされる場合があるため、濾過を行うことが好ましい。特許文献６のセルロースドープは、濾過がかなり困難で、更に得られる多孔質セルロースビーズの状態が、濾過有無によって大きく異なっていた。これに対し、本発明に関するセルロースドープは、極めて簡便な器具で濾過を実施することができる。ドープ中のセルロース濃度が４重量％や５重量％のような、比較的高濃度であっても、簡便に濾過を実施できる。本発明で用いることのできる濾過方法や濾材には特に限定は無く、適切な方法・器具を用いれば良い。濾材の孔径については特に限定は無い。しかし、産業用途のアフィニティークロマトグラフィー用ビーズは５０μｍ以上であることが多く、これより大きな異物が混入すると、造粒後の除去が困難となることから、濾材の孔径は５０μｍ以下であることが好ましい。また、小スケール・ハイスピード精製においては、しばしば小さい粒径が用いられる場合があるので、その場合は孔径が４０μｍ以下の濾材を用いることができる。粒度分布を広げたい場合は、より小さいビーズを含む場合があり、濾材の孔径は３０μｍ以下であることが好ましい。また、濾過材の孔径は０．１μｍ以上であれば、送液がスムーズに行えることから好ましく、より好ましくは１μｍ以上、更に好ましくは５μｍ以上、最も好ましくは１０μｍ以上である。ここで濾過材の孔径とは平均孔径を指す。また、濾過材の材質や性質についても、特に限定無く用いることができる。なお、上記濾過は、前記冷却工程後のセルロースドープに対して行ってもよいし、後記の温度調整工程後のセルロースドープに対して行ってもよい。
　本発明では、前記冷却工程に続いて、セルロースドープの温度を１５℃より高く調整する。以下、かかる工程を「温度調整工程」と略記する場合がある。当該温度は１５℃より高ければ特に限定は無い。当該温度が１５℃より高ければ、［造粒後の多孔質セルロースビーズの固形分含量］／［ドープ中の副原料以外の固形分含量］の値が、より小さくなる傾向にある。また当該温度が高くなると、［造粒後の多孔質セルロースビーズの固形分含量］／［ドープ中の副原料以外の固形分含量］の値が更に小さくなることから、２０℃以上であることが好ましく、２５℃以上であることが更に好ましい。またビーズの機械的強度や細孔径分布を調整する目的でドープ中のセルロース濃度を比較的大きくした場合において、当該温度を大きくすることは特に効果的である。ここで、ドープ中のセルロース濃度が比較的大きいとは、目安として４質量％より大きいことを意味する。この場合、セルロースドープを１５℃より高い温度に調整する工程の温度は２５℃より高いことが好ましく、３０℃以上であることがより好ましく、３５℃以上であることが更に好ましく、４０℃以上であることが特に好ましい。また当該温度が６０℃未満であれば、多孔質セルロースの真球性を保ちやすくなったり、ビーズの機械的強度が低下し難いことから好ましい。また、５０℃以下であることが更に好ましい。
　当該温度については、多孔質化開始直前の温度で管理することが好ましい。例えば、本発明に関するセルロースドープは水系であるので、多孔質化にアルコール等を用いると、混合時に熱が発生して温度が数℃上昇するが、上記で説明した温度はこの上昇前の温度で管理することが簡便で好ましい。
　温度調整工程の時間は特に制限されず、適宜調整すればよいが、例えば、セルロースドープの温度を１５℃以上の所定温度に調整した後、１分間以上攪拌を継続すればよい。当該時間の上限は特に制限されないが、例えば６０分以下とすることができる。セルロースドープの均質性と貯蔵安定性の観点から、当該時間は５分間以上が好ましく、１０分間以上がより好ましく、１５分間以上がより更に好ましく、また、４５分間以下が好ましく、３０分間以下がより好ましく、２５分間以下がより更に好ましい。
　本発明に関するセルロースドープから多孔質セルロースビーズを得る方法については特に限定は無く、従来公知の手法を用いることができる。なかでも、セルロースドープを連続相溶媒中に投入し、液滴化するエマルション化工程を含む製法が、設備の簡便さの点から好ましい。
　エマルションを構成する連続相溶媒としては、例えば、動植物油脂、水素添加動植物油脂、脂肪酸グリセリド、脂肪族炭化水素系溶媒、芳香族炭化水素系溶媒を挙げることができる。また、非イオン界面活性剤などの界面活性剤を用いてもよい。動植物油脂としては、パーム油、シア脂、サル脂、イリッペ脂、豚脂、牛脂、ナタネ油、米油、落花生油、オリーブ油、コーン油、大豆油、シソ油、綿実油、ヒマワリ油、月見草油、ゴマ油、サフラワー油、ヤシ油、カカオ脂、パーム核油、魚油、ワカメ油、コンブ油などを挙げることができる。水素添加動植物油脂としては、パーム硬化油、パーム極度硬化油、ナタネ硬化油、ナタネ極度硬化油、大豆硬化油、豚脂硬化油、魚油硬化油などを挙げることができる。脂肪酸グリセリドとしては、トリ－、ジ－、モノ－グリセリドのいずれでもよく、ステアリングリセリド、パルミチングリセリド、ラウリングリセリドなどを挙げることができる。脂肪族炭化水素系溶媒としては、ミツロウ、キャンデリラロウ、米ぬかロウなどを挙げることができる。芳香族炭化水素系溶媒としては、ベンゼン、トルエン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼンなどを挙げることができる。
　エマルション作製のために、さらに界面活性剤を適量添加してもよい。界面活性剤としては、ソルビタンラウレート、ソルビタンステアレート、ソルビタンオレエート、ソルビタントリオレエートなどのソルビタン脂肪酸エステルなどを挙げることができる。
　連続相溶媒の使用量は、前記セルロースドープの液滴を十分に分散できる量とすればよい。例えば、前記セルロースドープに対して１質量倍以上とすることができる。一方、連続相溶媒の量が多過ぎると廃液量が過剰に増えるおそれがあり得るので、当該割合としては１０質量倍以下が好ましい。また、７質量倍以下がより好ましく、５質量倍以下がさらに好ましい。また、セルロースドープに対して連続相溶媒の量が少ないと、セルロースドープの液滴中に連続相溶媒が入るＯ／Ｗ／Ｏエマルションとなり、結果として均質な構造の多孔質ビーズが得られない場合があることから、当該割合としては、２質量倍以上が好ましく、３質量倍以上がより好ましく、４質量以上が特に好ましい。
　エマルションは、常法により調製すればよい。例えば、前記セルロースドープ、連続相溶媒および界面活性剤を含む混合液を攪拌することにより調製することができる。
　多孔質化の方法や種類には特に限定は無いが、エマルション工程や多孔質化工程における温度が先に述べた温度調整工程と同様の温度範囲を満たしていることが、［造粒後の多孔質セルロースビーズの固形分含量］／［ドープ中の副原料以外の固形分含量］の値が１.３５未満である多孔質セルロースビーズを容易に得られる傾向にあるため好ましい。
　上記エマルションに凝固溶媒を添加し、セルロースドープ液滴中の溶媒を抽出することにより、多孔質セルロースビーズが得られる。凝固溶媒は、セルロースドープの溶媒に親和性を示すものであれば特に制限されないが、例えば、アルコール系溶媒、および水とアルコール系溶媒との混合溶媒を挙げることができる。アルコール系溶媒としては、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール、イソブタノール、ｓ－ブタノール、ｔ－ブタノールなどのＣ1-4アルコールを挙げることができる。アルコール水溶液における水とアルコール系溶媒の割合は、例えば、体積比で水：アルコール系溶媒＝８０：２０～５：９５とすることができる。
　凝固溶媒の使用量は特に制限されず適宜調整すればよいが、例えば、セルロースドープに対して２０ｖ／ｗ％以上、１５０ｖ／ｗ％以下程度とすることができる。
　凝固方法は特に制限されないが、エマルション化する工程を含む場合、液滴同士が結合しないよう適切に攪拌した状態で凝固溶媒を添加することが好ましい。
　凝固溶媒を添加した後は、凝固した多孔質セルロースビーズを濾過や遠心分離などにより分離し、水やアルコールなどで洗浄すればよい。得られた多孔質セルロースビーズは、粒径を揃えるため、篩などを用いて分級してもよい。
　また、本発明の多孔質セルロースビーズは架橋剤を作用させて得られる架橋多孔質セルロースビーズであることが、高速精製に適した吸着体を提供しやすいことから好ましい。架橋の条件や架橋剤に特に限定は無い。例えばＷＯ２００８/１４６９０６に記載の方法を用いることができる。例えば、上述した様に温度調整工程に続いてセルロースドープに架橋剤を添加して架橋化工程を行ってもよいし、多孔質セルロースビーズに架橋剤を作用させて架橋してもよい。
　架橋剤としては、例えば、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、ジクロロヒドリンなどのハロヒドリン；２官能性ビスエポキシド（ビスオキシラン）；多官能性ポリエポキシド（ポリオキシラン）を挙げることができる。架橋剤は、一種のみを単独で用いてもよいし、二種以上を併用してもよい。
　多孔質セルロースビーズを架橋剤により架橋する反応の溶媒は適宜選択すればよいが、例えば、水の他、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどのアルコール系溶媒や、アセトニトリルなどのニトリル系溶媒などの水混和性有機溶媒を挙げることができる。また、架橋反応溶媒は、２以上を混合して用いてもよい。
　架橋反応は、複数回実施してもよく、各回で反応溶媒や架橋剤を変更してもよい。例えば、１回目の架橋反応を水混和性有機溶媒中で行い、最終回の架橋反応を水中で行ってもよい。この場合、途中の溶媒組成は、１回目と最終回のどちらかと同じであっても異なっていてもよく、それらの中間組成であってもよい。さらには全ての回を水溶媒中で実施してもよい。架橋剤についても同様である。なお、架橋反応を複数回繰り返す場合、各架橋反応の間では、架橋多孔質セルロースを水などで洗浄して架橋剤を除去することが好ましい。
　架橋反応を促進するために、反応液には塩基を添加してもよい。かかる塩基としては、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどのアルカリ金属水酸化物；炭酸水素ナトリウムや炭酸水素カリウムなどアルカリ金属の炭酸水素塩；炭酸ナトリウムや炭酸カリウムなどアルカリ金属の炭酸塩；トリエチルアミンやピリジンなどの有機塩基を挙げることができる。
　架橋反応後は、架橋多孔質セルロースビーズは不溶性であることから、水などの溶媒で洗浄すればよい。
　本発明に係る多孔質セルロースビーズは、標的物質と相互作用するリガンドを固定化することにより、吸着体とすることができる。本発明で得ることができる吸着体は非特異吸着が少ないといった特性を有していることから、安全性が高い薬や治療の提供が可能で、さらには精製や治療時に中間洗浄工程等を省力化することが可能となる。また、本発明の多孔質セルロースビーズはアルカリ耐性が高いことから、アルカリ耐性リガンドを固定化することにより、アルカリ洗浄が可能な吸着体を得ることができる。
　本発明における「リガンド」とは、吸着体に吸着させることにより精製すべき標的物質に対して特異的な親和力を有し、標的物質と相互作用するアフィニティーリガンドをいう。例えば、標的物質が抗体である場合、抗体に特異的に相互作用する抗原、タンパク質、ペプチド断片；標的化合物が酵素のリガンドである場合には、リガンドを基質とする酵素；標的化合物が抗原である場合には、標的抗原に対する抗体などを挙げることができる。本発明に係る吸着体のために用いることができるリガンドは、本発明に係る吸着体を用いて精製すべき標的物質に特異的な親和性を有するものであれば特に制限されない。
　本発明に係る多孔質セルロースビーズにリガンドを固定化する方法は特に制限されず、常法を用いることができる。例えば、笠井献一ら著，「アフィニティークロマトグラフィー」東京化学同人，１９９１年の表８・１、表８・２、図８・１５に示されるような、臭化シアン法、トリクロロトリアジン法、エポキシ法、トレシルクロリド法、過ヨウ素酸酸化法、ジビニルスルホン酸法、ベンゾキノン法、カルボニルジイミダゾール法、アシルアジド法等を用いてアミノ基含有リガンドを固定化する方法；エポキシ法、ジアゾカップリング法等を用いて水酸基含有リガンドを固定化する方法；エポキシ法、トレシルクロリド法、ジビニルスルホン酸法等を用いて、チオール基含有リガンドを固定化する方法；アミノ化担体にカルボン酸含有リガンドやホルミル基含有リガンドを固定化する方法等の様々な固定化方法を挙げることができる。当該文献の全内容が、本願に参考のため援用される。
　本発明に係る吸着体は、精製用吸着体として用いることが可能であるが、近年注目されている抗体医薬品精製用吸着体や医療用吸着体としても用いることが可能である。抗体医薬品精製用吸着体などに用いられる場合のリガンドとしては、特に限定は無いが、例えば、抗体に特異性の高い抗原やタンパク質や、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬやそれらの変異体、抗体結合活性を有するペプチド等のアミノ基含有リガンドを挙げることができる。
　特に、免疫グロブリン（ＩｇＧ）を特異的に吸着できる吸着体として、プロテインＡ、プロテインＧ、またはそれらの変異体をリガンドとして多孔質担体に固定化した吸着体が注目されている。本発明に用いることができる上記プロテインＡ等には特に限定は無く、天然物や遺伝子組み換え物等を制限なく使用することができる。また、抗体結合ドメイン、その変異体、それらのオリゴマーを含むもの、融合タンパク質等であってもよい。かかるオリゴマーの重合数としては、２以上、１０以下とすることができる。また、菌体抽出物もしくは培養上清より、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー及び膜分離技術を用いた分子量分画、分画沈殿法等の手法から選択される精製法を組合せ、および／または繰り返すことにより製造された、プロテインＡ等を用いることもできる。特に、国際公開特許公報ＷＯ２００６／００４０６７や米国特許公報ＵＳ５１５１３５０、ＷＯ２００３／０８０６５５、特開２００６－３０４６３３、ＷＯ２０１０／１１０２８８、ＷＯ２０１２／１３３３４９に記載されている方法で得られたプロテインＡであることが好ましい。これら公報の全内容が、本願に参考のため援用される。プロテインＡを固定化した本発明の吸着体は、拡張性心筋症などの治療に使用できる治療用吸着体として利用することもできる。また、デキストラン硫酸などを固定化した本発明の吸着体は、高コレステロール血症治療用吸着体として利用することができる。
　リガンドを多孔質セルロースビーズに導入する方法としては、前述の様々な固定化方法から選択することができるが、より好ましいのは多孔質粒子が含有するホルミル基と、リガンドのアミノ基との反応を利用して固定化を行う方法である。例えば、ＷＯ２０１０／０６４４３７に記載の方法がある。当該公報の全内容が、本願に参考のため援用される。
　本発明の吸着体のリガンドの固定化量は特に制限されないが、例えば、多孔質セルロースビーズ１ｍＬ当り、１ｍｇ以上、３００ｍｇ以下とすることができる。当該割合が１ｍｇ以上であれば、標的物質に対する吸着量が大きくなるため好ましく、３００ｍｇ以下であれば、製造コストを抑制できるため好ましい。リガンドの固定量としては、多孔質セルロースビーズ１ｍＬ当り、２ｍｇ以上がより好ましく、４ｍｇ以上がさらに好ましく、５ｍｇ以上が特に好ましく、また、１００ｍｇ以下がより好ましく、５０ｍｇ以下がさらに好ましく、３０ｍｇ以下が特に好ましく、２０ｍｇ以下が最も好ましい。
　本発明の吸着体の用途に特に限定は無いが、医療用吸着体、中でも表面開孔度を向上できることから、サイズの大きい病因物質（ＬＤＬコレステロール等）を吸着除去する治療用吸着体に好適に用いることができる。また、各種クロマト担体、なかでも大径カラムに充填される産業用クロマト担体として用いることができる。特に近年需要が旺盛な抗体医薬品精製用吸着体として用いる場合に、その効果を発揮することができる。このような観点から、本発明の多孔質ビーズにプロテインＡやプロテインＧ、プロテインＬを導入した吸着体として好適に用いることができる。
　また、近年、連続クロマトシステム用として、メディアン粒径が３６μｍ以上、６４μｍ以下の比較的小さい多孔質ビーズと、これらを充填した比較的カラム高が低いカラムが望まれている。本発明は、容易に粒径を調製でき、真玉性が良好で、適切な圧縮応力を示す多孔質セルロースビーズを提供できることから、比較的作製の難易度が高いカラム作製へのニーズに的確に応えることができる。ここで、適切な圧縮応力とは、その用途に応じて適切に充填・使用が可能であれば、特に限定は無いが、沈降したビーズを２０％圧縮した時の応力が０．０１ＭＰａ以上であれば、圧密化に伴うカラム閉塞が生じ難いため好ましく、１．０ＭＰａ未満であれば良好な吸着性能を付与できることから好ましい。より好ましくは０．０４ＭＰａ以上、０．５ＭＰａ以下、更に好ましくは０．０６ＭＰａ以上、０．２５ＭＰａ以下、特に好ましくは０．０９ＭＰａ以上、０．２ＭＰａ以下、最も好ましくは０．１０ＭＰａ以上、０．１６ＭＰａ以下である。圧縮応力を調製する方法としては、セルロースドープ中のセルロース濃度や、架橋度により調整する手法が挙げられる。
　本発明に係る吸着体を用いて、標的物質を精製することができる。具体的には、本発明の吸着体と、標的物質を含む溶液とを接触させればよい。接触方法は特に制限されず、標的物質を含む溶液中に本発明に係る吸着体を添加してもよいし、上記のようにカラムに本発明の吸着体を充填し、標的物質を含む溶液を通液することにより、本発明の吸着体に標的物質を選択的に吸着させればよい。本発明に係る吸着体は強度が高いため、特にカラムに充填する場合、高速度での通液が可能になり、標的物質を効率的に精製することができる。
　次に、標的物質が選択的に吸着した本発明の吸着体を、濾過や遠心分離などにより溶液から分離する。カラムを用いる場合には、吸着体と溶液との分離は容易である。この工程により、標的物質とその他の物質を分離することができる。さらに、溶出液を用い、標的物質を本発明吸着体から分離する。溶出液としては、例えば、ｐＨが２．５以上、４．５以下程度の酸性緩衝液を用いることができる。また、非特異的吸着が大きい吸着体においては、溶出の前段階として、長大な中間洗浄工程が必要な場合があるが、本発明の多孔質セルロースビーズはこのような中間洗浄工程を必ずしも必要としない。また、本発明の多孔質セルロースビーズはアルカリ耐性が高いため、安価・簡便に調製可能なアルカリ性の洗浄液で洗浄することができる。水酸化ナトリウムを用いる場合、その濃度が０．１Ｎであっても問題なく洗浄することができるし、リガンドのアルカリ耐性が高ければ０．５Ｎ以上であっても用いることができる。
　本願は、２０１７年４月３日に出願された日本国特許出願第２０１７－７４０３４号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１７年４月３日に出願された日本国特許出願第２０１７－７４０３４号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
　以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。先ず、製造された多孔質セルロースビーズの物性の試験方法につき説明する。
　試験例１：　動的吸着量の測定
　（１）　溶液調製
　下記Ａ～Ｅ液及び中和液を調製し、使用前に脱泡した。
　Ａ液：　シグマ社製「Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ」と蒸留水を用いてｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液を調製した。
　Ｂ液：　酢酸、酢酸ナトリウム、および蒸留水を用いてｐＨ３．５の３５ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液を調製した。
　Ｃ液：　酢酸と蒸留水を用いて１Ｍ酢酸水溶液を調製した。
　Ｄ液：　ポリクロナール抗体（「ガンマガード」バクスター社製）と前記Ａ液を用いて濃度３ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ水溶液を調製した。
　Ｅ液：　和光純薬社製の水酸化ナトリウムと塩化ナトリウムの濃度が、それぞれ０．１Ｎ水酸化ナトリウムと１Ｍ塩化ナトリウムとなる水溶液を作製し、アルカリ洗浄液とした。
　中和液：　トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと超純水で２Ｍのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン水溶液を調製した。
　（２）　充填、準備
　カラムクロマトグラフィー用装置としてＡＫＴＡ　Ｐｕｒｅ　１５０（ＧＥヘルスケア社製）を用い、内径０．５ｃｍのカラムに吸着体試料を３ｍＬ入れ、吸着体層高さを１５ｃｍとした。塩化ナトリウムと蒸留水から調製した０．２ＭのＮａＣｌ水溶液を流速３ｍＬ／分で１０分間通液して吸着体をカラムに充填した。フラクションコレクターに１５ｍＬの採取用チューブをセットし、溶出液の採取用チューブにはあらかじめ中和液を入れておいた。
　（３）　ＩｇＧ精製
　前記カラムにＡ液を１５ｍＬ通液し、次いでＤ液を必要量通液した。次いで、Ａ液を１２ｍＬ通液後、Ｂ液を１２ｍＬ通液してＩｇＧを溶出させた。次にＣ液を９ｍＬ、Ａ液を１５ｍＬ、Ｅ液を９ｍＬ、Ａ液を１５ｍＬ通液した。なお流速はＤ液以外は１ｍＬ／ｍｉｎとし、Ｄ液の流速は所定の滞留時間（ＲＴ）に合わせた。例えばＲＴ６分の流速は０．５ｍＬ／ｍｉｎに調整した。
　（４）　動的吸着量
　ＩｇＧが５％破過するまでに吸着体に吸着したＩｇＧ量と吸着体体積からＩｇＧの動的吸着量を求めた。当該動的吸着量を５％ＤＢＣという。
　（５）　静的吸着量
　ＲＴ３ｍｉｎとＲＴ６ｍｉｎのそれぞれのＩｇＧの破過曲線が交わった時のＩｇＧ負荷量と吸着体体積からＩｇＧの静的吸着量を求めた。当該静的吸着量をＳＢＣという。
　試験例２：　２０％圧縮応力の測定
　（１）　試料調製
　試料ビーズに純水を加え、濃度約５０体積％のスラリーを調製した。このスラリーの攪拌による均質化と、それに続く３０分以上の減圧による脱泡とからなる均質・脱泡操作を３回繰り返して実施し、脱泡スラリーを得た。この操作とは別に、処理対象を純水に変えて、前記均質・脱法操作を９０分以上実施し、脱泡水を得た。
　（２）　ビーズ充填シリンジ調製
　２．５ｍＬのディスポーザブルシリンジ（商標名「ＮＯＲＭ－ＪＥＣＴ」ＨＡＮＫＥ　ＳＡＳＳ　ＷＯＬＦ社製）の先端に親水性ディスポーザブルフィルター（孔径５．０μｍ）を取り付けた。シリンジのピストンを外し、シリンジ後端側から脱泡水を約２ｍＬ投入し、この脱泡水が０ｍLの標線を下回らないうちに、脱泡スラリーを投入した。ディスポーザブルフィルターの２次側にアスピレーターを接続し、液面がビーズ面を下まわらない様に注意しながら、前記脱泡スラリーを吸引した。ビーズ面の約０．５ｍＬ上まで液面が下がったところで吸引を停止した。以降の作業は、液面がビーズ面を下回らないよう、前記脱泡水を適宜追加しながら実施した。振動を与えながら前記脱泡スラリーを追加またはビーズを除去し、ビーズ面を１．５ｍＬの標線に合わせ、振動を与えてもビーズ面が低下しないことを確認した。ビーズが舞わないようゆっくりと脱泡水をシリンジから溢れるまで追加し、気泡が入らないように注意しながらピストンを挿入した。以下、このシリンジを「ビーズ充填シリンジ」という。
　（３）　測定
　レオテック社のＦＵＤＯＨ　ＲＨＥＯ　ＭＥＴＥＲに１０Ｋのロードセルを取り付け、変位速度のダイヤルを２ｃｍ／ｍｉｎに合わせ、前記ビーズ充填シリンジをセットし、ピストンの変位を開始した。変位と応力との関係を記録し、下記式に基づき、２０％圧縮応力を求めた。
　　２０％圧縮応力＝［充填ビーズが２０％圧縮された時の応力］－［ピストンがビーズを押す前に水を通液している時の応力］
　試験例３：　Ｋav：ゲル相分配係数の測定
　多孔質セルロースビーズ２２．８ｍＬを蒸留水に分散させ、３０分間脱気した。脱気した多孔質セルロースビーズをカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製「Ｔｒｉｃｏｒｎ　１０／３００」）に充填した。島津製作所社製のサイズ排除クロマトグラフィーシステム（「ＤＧＵ－２０Ａ３」、「ＲＩＤ－１０Ａ」、「ＬＣ－２０ＡＤ」、「ＳＩＬ－２０ＡＣ」、「ＣＴＯ－２０ＡＣ」を含み、ソフトウェアとしては「ＬＣＳｏｌｕｔｉｏｎ」を使用）を用いて測定を行った。
　マーカーとしては、以下のデキストランまたはグルコースを、１Ｍ　ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸バッファ（ｐＨ７．５）に溶解して用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　カラムに１Ｍ　ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸バッファ（ｐＨ７．５）を流速０．６ｍＬ／ｍｉｎで通液しながら、先ず、カラム中のビーズ部分以外の体積を求めるために、分子量４×１０7のデキストランの溶液を注入し、注入からＲＩモニターでピークが観測されるまでの通液量を求めた。分子量４×１０7のデキストランの溶液の濃度は１０ｍｇ／ｍＬ、注入量は４０μＬとした。次いで、各マーカーの溶液でも同様に通液量を求めた。測定値を下記式に代入し、Ｋavの値を算出した。
　　Ｋav＝（ＶR－Ｖ0）／（Ｖt－Ｖ0）
［式中、ＶRは各マーカー溶液を注入してからピークが観測されるまでの通液量（ｍＬ）を示し、Ｖ0は分子量４×１０7のデキストラン溶液を注入してからピークが観測されるまでの通液量（ｍＬ）を示し、Ｖtはカラム内のビーズの体積（ｍＬ）を示す］
　試験例４：　固形分含量の測定
　試料ビーズ約５ｍＬを１５ｍＬの遠沈管内に入れ、試料ビーズ体積がそれ以上低減されなくなるまで振動を付与し、その際の体積を正確に測定した。以下、かかる体積を「沈降体積」という。次に遠沈管内のビーズを３Ｇガラスフィルターに移し、濾過した。なお、３Ｇガラフィルターの重量は、事前に１２２℃のオーブン内で一晩乾燥させ、測定しておいた。次いで１２２℃のオーブン内で一晩乾燥させ、重量を測定した。ビーズ試料の固形分含量は、上記重量を上記体積で除することで算出した。
　試験例５：　圧流速特性の測定
　所定のカラムボリュームと沈降体積が同量のビーズを用意し、これに水を加えて５０％スラリーを作製した。この５０％スラリーをカラムに投入し、２時間以上静置した。次いで、上部から水を通液し、ビーズ面が所定のカラムボリュームになるまで流速を上げた。測定はＧＥヘルスケア社のＡＫＴＡ　Ｐｕｒｅ　１５０またはＡＫＴＡ　Ｐｉｌｏｔを使用し、線速度とカラム差圧の関係を調べた。
　試験例６：　メディアン粒径の測定
　レーザ回折／散乱式粒子径分布測定装置（「Ｐａｒｔｉｃａ　ＬＡ９５０」堀場製作所製）を用いて、ビーズおよび吸着体のメディアン粒径を求めた。
　実施例１：　多孔質セルロースビーズの製造
　（１）用いる化合物
　セルロースは旭化成ケミカルズ社製結晶セルロース「ＰＨ－Ｆ２０ＪＰ」を用いた。尿素は和光純薬社製を用いた。アルカリ水溶液は和光純薬社製水酸化ナトリウムと蒸留水を用いて作製した。分散媒には和光純薬社製ｏ－ジクロロベンゼンを用いた。界面活性剤として和光純薬社製ソルビタンモノオレエート（ｓｐａｎ８０相当品）を用いた。ドープに添加する水溶性架橋剤としてナガセケムテックス社製のデナコールＥＸ３２１を用いた。造粒後の架橋剤は和光純薬社製のエピクロロヒドリンを用いた。その他の試薬は特に記載が無い限り和光純薬社製を精製することなく使用した。
　（２）アルカリ水溶液の作製
　和光純薬社製の水酸化ナトリウムと純水１２．７ｇを用いて、水酸化ナトリウム水溶液を作製し、その温度を４℃に調整した。尚、水酸化ナトリウム量は、仕上がりセルロースドープ中、［水酸化ナトリウム重量］／［水酸化ナトリウム重量＋尿素重量＋水重量］＝０．０７となるように調整した。
　（３）セルロースドープの作製
　セパラブルフラスコに所定量の蒸留水と所定量のセルロースと所定量の尿素を投入し、２段ディスクタービン（ｒｕｓｈｔｏｎ　ｔｕｒｂｉｎｅ）翼を用いてスラリーの温度が４℃になるまで、１５０～２００ｒｐｍで３０分間攪拌した。尚、尿素量は、仕上がりセルロースドープ中、［尿素重量］／［水酸化ナトリウム重量＋尿素重量＋水重量］＝０．１２となるように調整した。次いで、４℃に冷却した上記水酸化ナトリウム水溶液を添加し、３００ｒｐｍの速度で攪拌しながら３０分間保持した。その後、冷却工程として、表２に記載の温度に調整し、表２に記載の時間３００ｒｐｍで攪拌を続けた。次いで、表２に記載の冷却後調整温度に調整した後、７．１ｇのデナコールＥＸ３２１を添加し、３００ｒｐｍの速度で１５分間撹拌を行った。
　（４）エマルション化と多孔質化
　上記セルロースドープを、９．８ｇのソルビタンモノオレエートが溶解した９７９．８ｇのｏ－ジクロロベンゼン溶液に投入し、６００ｒｐｍ、１５分間、表２に記載の冷却後調整温度で撹拌することでセルロース液滴を分散させた。凝固溶剤として表２に記載の冷却後調整温度と同じ温度に調整したメタノールを８７ｍＬ添加し、６００ｒｐｍ、２０分間攪拌した。その後、酢酸を１４ｇ投入し、６００ｒｐｍ、１０分間攪拌し中和を行った。ＴＯＰ社製ガラスフィルター「２６Ｇ－３」で溶液を濾過し、次いでエタノールと水で洗浄を行い、多孔質セルロースビーズを回収した。
　（５）セルロースビーズの分級
　３８μｍ～２１２μｍの篩を用いて湿式分級を６０分間行った。
　（６）セルロースビーズの架橋
　（６－１）第１架橋工程
　洗浄したセルロースビーズ９６ｍＬを用意した。ビーズが足りない場合は上記分級までの操作を繰り返した。用意したビーズをガラスフィルターの上に乗せ、エタノールでリパルプした後、このエタノールを吸引除去する溶媒置換操作を４回実施した。エタノール量は、溶媒置換操作１回目～３回目：２３３ｍＬ、溶媒置換操作４回目：１６７ｍＬとした。溶媒置換操作後、エタノールを加えて全体が９７ｇになる様に調整しながら５００ｍＬのセパラブルフラスコに移した後、水を２８ｇ添加した。さらにエピクロロヒドリンを８０ｍＬ加え、回転数２００ｒｐｍで３０分撹拌した。次いで１７ＭのＮａＯＨ水溶液１０ｍＬと水８６ｍＬからなる混合液を添加し、温度を４０℃に保ったまま回転数３５０ｒｐｍで１時間３０分撹拌することでセルロース多孔質ビーズを架橋収縮させた。さらに１７ＭのＮａＯＨ水溶液を９．６ｍＬ加えて回転数３５０ｒｐｍで１．５時間撹拌する追加処理を３回実施した後、濾過し、ついで水で洗浄することによって途中架橋ビーズを得た。
　（６－２）第２架橋工程
　得られた途中架橋ビーズ全量に水を加えて全体の容量を１１７ｍＬに調整し、温度４０℃に加温した。硫酸ナトリウムを３８ｇ加え、回転数１５０ｒｐｍで１０分間撹拌した後、エピクロロヒドリン３３ｍＬを加え、回転数２５０ｒｐｍで１０分間撹拌した。次いで１７ＭのＮａＯＨ水溶液を２１ｍＬ加えて回転数３００ｒｐｍで２．５時間撹拌し、最後に１７ＭのＮａＯＨ水溶液５．１ｍＬを追加してさらに２．５時間撹拌した。反応物を濾過し、濾過物を水洗することによって架橋ビーズを得た。
　（７）エポキシ開環処理
　得られた架橋ビーズと水の５０％スラリーをオートクレーブにて１２１℃、６０分間加熱することでエポキシ基を開環し、ジオール基とした。エポキシ基が無くなっていることは、フェノールフタレイン指示薬にて確認することができる。
　（８）再分級
　所定の篩を複数用いて湿式分級を９０分間実施した。得られた各粒径のビーズを混合し所定の粒径の架橋セルロースビーズを得た。
　実施例２：　リガンドが固定化された吸着体の調製
　（１）アルデヒド化反応
　（１－１）バッファー作製
　クエン酸一水和物０．１６５ｇとクエン酸三ナトリウム二水和物０．０６４６ｇに水を加えて１００ｍＬとし、ｐＨ３．４のバッファーを作製した。
　（１－２）反応
　架橋後のセルロースビーズ３．５ｍＬに対して上記バッファーを３倍量以上用いて液体部分を上記バッファーで置換し、更に上記バッファーを加えて総量を６．０ｍＬとした。１１．２ｍｇ／ｍＬの過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を２．０１ｍＬ投入し、２５℃で３５分間攪拌した。その後、＃３のグラスフィルターにて濾過を行ない、蒸留水で濾液の電気伝導度が１μＳ／ｃｍ以下となるまで洗浄し、アルデヒド基含有ビーズを得た。洗浄濾液の電気伝導度は、導電率計（「ＥＣＴｅｓｔｅｒ１０　Ｐｕｒｅ＋」ＥＵＴＥＣＨ　ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ社製）で測定した。本反応条件にて、架橋多孔質セルロースビーズ１ｍＬあたり約３０μｍｏｌのアルデヒド基が導入される。
　（２）プロテインＡ固定化反応
　（２－１）配向制御型アルカリ耐性プロテインＡの調製
　ＷＯ２０１２／１３３３４９を参照して、配向制御型アルカリ耐性プロテインＡとして、ＷＯ２０１２／１３３３４９に記載の改変Ｃドメイン５連結体を調製した。配向制御型アルカリ耐性プロテインＡは、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する。なお、このＷＯ２０１２／１３３３４９の全内容が、本願に参考のため援用される。以下、「プロテインＡ」を「ＰＡ」と略記する。
　（２－２）イミノ化反応－ＰＡ仕込量が２０ｍｇ／ｍＬの場合
　クエン酸三ナトリウム二水和物２．９４１ｇに水を加えて１００ｍＬとし、ｐＨ８のバッファーを作製した。＃３のグラスフィルター上でアルデヒド基含有ビーズの全量（３．５ｍＬ）に対して３倍量の前記バッファーを通液して、ビーズ内の液体部分を上記バッファーで置換した。置換後のアルデヒド基含有ビーズを反応容器に入れ、総体積が７．５ｍＬとなるようにＰＡ固定化バッファーを添加した。プロテインＡをビーズ１ｍＬに対して２０ｍｇ（正味量）添加した。６℃に温調後、０．０８Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を用いて、ｐＨを１２に調整した後、６℃にて一晩攪拌した。
　（２－３）中和および還元反応
　一晩反応後のイミノ化反応液を濾過し、濾液をＵＶ測定してＰＡ固定化量を求めた。前記ｐＨ８．０のクエン酸Ｎａバッファーに、０．１Ｍのクエン酸水溶液を加えて、ｐＨを５．０に調整したバッファーを作製し、前記濾過ビーズに対して３倍量の当該バッファーを用い、ビーズ内の液体部分を置換した。ｐ５．０のバッファーで総量を７．０ｍＬに調整しながら反応器に移し、４時間６℃で中和を保持しながら攪拌した。
　その後、５．５％ジメチルアミンボラン水溶液を１．９３ｍＬ加えた後、反応温度を２５℃に上昇させ、２５℃で一晩攪拌した。反応後のビーズを＃３のグラスフィルター上で、ビーズの３倍体積量の水で洗浄した。
　（２－４）洗浄
　＃３のグラスフィルター上でＰＡ固定化ビーズ１ｍＬに対して３ｍＬの０．１Ｍクエン酸（以下「酸バッファー」と略記する）を通液して、ビーズ内の液体部分を酸バッファーで置換した。置換後のＰＡ固定化ビーズを容器に移し、酸バッファーを加えて全量を２ｍＬ以上とし、２５℃で３０分間攪拌し、酸洗浄とした。
　次いで、上記酸バッファーの代わりに０．０５Ｎ水酸化ナトリウム＋１Ｍ硫酸ナトリウム水溶液を用いた以外は同様の方法でアルカリ洗浄を行なった。
　次いで、上記酸バッファーの代わりに、０．１Ｍクエン酸と０．１Ｍクエン酸ナトリウムを混合してｐＨを５．９に調整した液を用いた以外は、同様の方法で中性洗浄を行なった。
　中性洗浄後のビーズを蒸留水を用いて洗浄濾液の電導度が１０μｓ／ｃｍ以下になるまで洗浄し、プロテインＡが固定化された吸着体を得た。表２に各造粒例の条件と、造粒後の固形分含量の結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　図１に比較例４で得られたビーズの透過観察像を示す。本造粒例は吸着性能が高いとされる特許文献６の実施例と特に関連が深いものであるが、先に述べたとおり、均質な透過観察像が得られず、ビーズ内の長さ１０μｍ以上の平均異物数も２を超えており、非特許文献６のような解析が困難となる可能性がある。また比較例１～３，５～６においても、透過観察像は同様の傾向であった。
　図２に造粒例比較例１４で得られたビーズの透過観察像を示す。平均異物数は少なくなったものの、ビーズ内に透過度の小さい構造体があるかのような像が得られた。またこの透過度の小さい構造体のせいで、異物数を計測することができなかった。また、比較例１２，１３，１５～１９においても、同様の観察像が得られた。表２に示すとおり、比較例１２～１５は異物数を減らすためにドープの冷却温度を－１５℃にしたものであるが、何れも［造粒後の多孔質セルロースビーズの固形分含量］／［ドープ中の副原料以外の固形分含量］の値が大きかった。造粒時に何かしらの凝縮作用が働き、その作用が透過観察像と［造粒後の多孔質セルロースビーズの固形分含量］／［ドープ中の副原料以外の固形分含量］の値に顕れている可能性がある。比較例１６，１７では、更にドープの冷却温度を下げて－１８℃とした例であるが、［造粒後の多孔質セルロースビーズの固形分含量］／［ドープ中の副原料以外の固形分含量］の値が大きくなる傾向が強くなっている。
　本発明に関するセルロースドープの作製方法では、セルロースを低温のアルカリ水溶液中に分散させる。そこで、本発明者は冷却工程温度を低くすれば低くするほど、ビーズ内の異物等による不均質な観察像が解消され、非特許文献６のような解析が可能となると考えていたが、図２に示すとおり、異物等による不均質さとは別の好ましくない観察像が得られる結果となった。
　図３に実施例２で得られたビーズの透過観察像を示す。実施例１～３はドープ冷却温度を－１５℃としつつ、その後、ドープ温度を２５℃に上昇させた例であるが、図３に示すとおり、透過観察像が良好であった。また表２に示すとおり、［造粒後の多孔質セルロースビーズの固形分含量］／［ドープ中の副原料以外の固形分含量］の値が良好であった。前記の何かしらの凝縮作用が、緩和された可能性があると考えられる。また実施例２は、吸着性能が高いとされる特許文献６と関連が深い比較例４と［造粒後の多孔質セルロースビーズの固形分含量］／［ドープ中の副原料以外の固形分含量］の値が同じで、且つ造粒後の固形分含量の値も同等であった。このことから、吸着性能が高く、且つ非特許文献６のような解析にも適用可能なビーズが得られていることが期待できる。またその他の実施例１，３，４においても、透過観察像は実施例２と同様の傾向を示した。また表２に示すとおり、実施例４の［造粒後の多孔質セルロースビーズの固形分含量］／［ドープ中の副原料以外の固形分含量］の値は良好で且つ実施例２より小さいことが分かった。前記の何かしらの凝縮作用が更に緩和された可能性がある。
　図４に各造粒例におけるドープ中のセルロース濃度と造粒後固形分含量の関係を示す。一連の本造粒例によって、［造粒後の多孔質セルロースビーズの固形分含量］／［ドープ中の副原料以外の固形分含量］の値を巧みに制御できる例を見出していることが証明された。
　試験例７：　ドープの観察
　実施例２と同様に作製中のセルロースドープを冷却工程の途中で少量抜き取って顕微鏡観察を実施し、異物数を計測した。その結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示す結果の通り、冷却時間を長くするほど異物数が減り、実施例２の条件である６０分では、異物数がかなり減っていることが明らかとなった。
　比較例２０
　比較例４と同様にセルロースドープを作製し、４℃、２５００ｒｐｍでドープの遠心濾過を実施した。このドープの上清を用いて、比較例４と同様にエマルション化と多孔質化を実施して、多孔質セルロースビーズを得た。得られた多孔質セルロースビーズの透過観察を行った結果、図１と同様の観察像が得られた。このビーズの固形分含量は３．８ｗ／ｖ％であった。
　試験例８：　セルロースドープの濾過例
　実施例２と同様にセルロースドープを作製し、グラスフィルター（「２６Ｇ－３」ＴＯＰ社製，孔径：１６～４０μｍ）とアスピレーター（「ＡＳ－０１」アズワン社製）を用いて吸引濾過を２５℃雰囲気下で実施した。濾過はスムーズに実施できた。
　実施例５
　試験例８で濾過したセルロースドープを用いた以外は実施例２と同様に多孔質セルロースビーズを得た。得られた多孔質セルロースビーズの物性も実施例２と同等であった。医薬品精製用吸着体や医療用吸着体に求められる異物除去の観点で好ましい製法を介したビーズが得られたといえる。また非特許文献６のような解析に適用した場合、より精密な試験が実施可能となることが期待できる。
　一方、比較例４と同様にセルロースドープを作製し、４℃雰囲気下とした以外は濾過実施例と同様に濾過を試みたが、極少量しか濾過することができなかった。
　また、比較例７と同様に得たドープ上清を濾過比較例１と同様に濾過し、比較例２０と同様の方法で多孔質セルロースビーズを得た。このビーズの固形分含量は３．１ｗ／ｖ％と比較例４や比較例２０より小さかったが、図５に示すように、透過度が極めて低い観察像が得られた。
　以上の濾過例及び造粒例から分かるとおり、従来より公知の方法で作製されたセルロースドープは濾過がし辛いこと分かる。また異物の遠心分離を試みても本発明の目的を達成するほどの効果は得られないことが分かる。さらに、従来のセルロースドープを遠心分離することで得られた上清を濾過すると、更に観察像が悪化することがわかった。
　試験例９：　架橋多孔質セルロースビーズの圧流速特性
　前記比較例４、架橋例、分級例からメディアン粒径が９０μｍの架橋多孔質セルロースビーズを得た。この架橋多孔質セルロースビーズの２０％圧縮応力は０．１１ＭＰａであった。また参考例１として、大型カラム用の高吸着型アガロース系プロテインＡレジンとしてよく知られているＧＥヘルスケア社製のＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅ　ＬＸを用いた。両者の圧流速特性比較を図６に示した。使用したカラムの内径は５ｃｍ、充填層高さは５ｃｍ、充填されているビーズの量は沈降体積で９８．１ｍＬである。
　図６に示すとおり、本造粒例、架橋例、分級例による架橋多孔質セルロースビーズは、メディアン粒径が９０μｍ以上、２０％圧縮応力が０．１１ＭＰａ以上であれば、参考例１と同等以上の圧流速特性を示すことが分かる。
　試験例１０：　吸着体の吸着性能
　粒径が９０μｍに調整された架橋多孔質セルロースビーズを用いた吸着体の吸着性能及び２０％圧縮応力値を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４の結果から、本発明に関する実施例２から得られたメディアン粒径９０μｍの吸着体は、２０％圧縮応力が０．１１ＭＰａであることから、大型カラム用として知られる参考例１と同等の圧流速特性を示すことが示唆される。また、吸着性能も、高吸着型セルロース系プロテインＡレジンとして報告されている比較例４と比べて遜色ない結果であった。また、アルカリ洗浄工程を含む本吸着試験を５回繰り返したが、吸着量変化は５％未満であった。さらには、カラム差圧も１回目と５回目でほとんど変化が無かった。更に表２に示すとおり、本発明の多孔質セルロースビーズは透過観察像が良好であることから、精製方法の最適化検討の省力化に寄与できる。また一連の造粒例から得られた吸着体の結果から、［造粒後の多孔質セルロースビーズの固形分含量］／［ドープ中の副原料以外の固形分含量］の値が大きすぎると、吸着性能、特にＳＢＣが低い傾向にあることも分かった。
　試験例１１：　吸着体の吸着性能
　表５に粒径が５０μｍに調整された架橋多孔質セルロースビーズを用いた吸着体の吸着性能を示す。参考例２には、連続クロマトシステム用の小粒径プロテインＡレジンとして注目されている東ソー社製のＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＡＦ－ｒＰｒｏｔｅｉｎ　Ａ　ＨＣ－６５０Ｆの結果を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５の結果から、本発明に関する実施例２から得られたメディアン粒径５０μｍの吸着体は、連続クロマトシステム用として注目されている参考例２のプロテインＡレジンと同等以上の吸着特性を有することが実証できた。よって本発明によれば、連続クロマト精製システム用の吸着体を提供できる優れた多孔質セルロースビーズを提供できる。
　試験例１２：　Ｋavの測定
　図７に各造粒例で得られた架橋多孔質ビーズを前記方法で架橋した架橋多孔質セルロースビーズと参考例１の吸着体のＫav測定結果をプロットしたｉｎｖｅｒｓｅ　ｓｉｚｅ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＩＳＥＣ）のカーブを示す。このＫavの値が大きければ、そのマーカー分子における細孔容量が大きい。また、このカーブの傾きが急峻であれば、細孔径分布が比較的シャープであり、傾きがなだらかであれば細孔径分布はブロードである。一般的には前者の方が粒子内比表面積と飽和吸着量が大きい傾向にある。また充分に小さいマーカー分子のＫavは、そのビーズの粒子内空孔率と見なすことができる。ただし、この空孔率が１．０に近い場合は、ビーズのマトリックス（固相）が存在しないという意味になるため、注意が必要である。これは低分子マーカーの流出が理論値より遅く、計算上、空孔率が１．０前後となったものと考えられ、すなわち、空孔率が不自然に大きい場合、その原因の一つとして、非特異的吸着が起こりやすい材質であるということが考えられる。
　本発明に関する実施例２は、高吸着型の多孔質セルロースビーズの先行技術に関する比較例４とほぼ同等のＩＳＥＣカーブを示していることが分かった。また、粒子内空孔率も適度な値であることが分かった。一方、［造粒後の多孔質セルロースビーズの固形分含量］／［ドープ中の副原料以外の固形分含量］の値が大きい比較例１３，１４においては、空孔率が小さかったり、逆に大きいマーカーのＫav値が比較的大きいことが分かり、細孔径分布がブロードであることが示唆される。表４に示す吸着性能の結果を裏付けるものと考えられる。アガロース系プロテインＡレジンである参考例１は空孔率が不自然に大きいことが分かった。

Claims (11)

  1. 　アルカリ水溶液と原料セルロース粉末とを混合して作製したセルロースドープを－１２℃より低い温度に冷却する工程と、前記冷却する工程の後に、セルロースドープを１５℃より高い温度に調整する工程を含むことを特徴とする多孔質セルロースビーズの製造方法。
  2. 　セルロースドープを冷却する温度が－２０℃以上、－１５℃以下であることを特徴とする、請求項１に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
  3. 　セルロースドープを－１２℃より低い温度で冷却する時間が３０分間以上であることを特徴とする、請求項１または２のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
  4. 　［造粒後の多孔質セルロースビーズの固形分含量］／［ドープ中の副原料以外の固形分含量］の値が１．３５未満となることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
  5. 　セルロースドープに助剤が含まれていることを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
  6. 　セルロースドープを１５℃より高い温度に調整する工程の温度が６０℃未満であることを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
  7. 　セルロースドープを孔径が５０μｍ以下の濾材で濾過する工程を含むことを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の多孔質セルロースビーズの製造方法。
  8. 　請求項１～７のいずれか一項に記載の製造方法により多孔質セルロースビーズを製造する工程、および、
    　架橋剤を用いて多孔質セルロースビーズを架橋する工程を含むことを特徴とする架橋多孔質セルロースビーズの製造方法。
  9. 　請求項８に記載の製造方法により架橋多孔質セルロースビーズを製造する工程、および、
    　架橋多孔質セルロースビーズにリガンドを固定化する工程を含むことを特徴とする吸着体の製造方法。
  10. 　標的化合物を精製する方法であって、
    　請求項９に記載の製造方法により、標的物質に結合するリガンドを架橋多孔質セルロースビーズに固定化して吸着体を製造する工程、および、
    　標的物質を含む溶液と吸着体とを接触させる工程を含むことを特徴とする方法。
  11. 　吸着体をカラムに充填し、標的物質を含む溶液を当該カラムに通液する請求項１０に記載の方法。
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