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WO2018181443A1 - 微小物質封入方法及び微小物質検出方法並びに微小物質検出用デバイス - Google Patents

微小物質封入方法及び微小物質検出方法並びに微小物質検出用デバイス Download PDF

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WO2018181443A1
WO2018181443A1 PCT/JP2018/012678 JP2018012678W WO2018181443A1 WO 2018181443 A1 WO2018181443 A1 WO 2018181443A1 JP 2018012678 W JP2018012678 W JP 2018012678W WO 2018181443 A1 WO2018181443 A1 WO 2018181443A1
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WO
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insert
substrate
solution
solvent
space
Prior art date
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Application number
PCT/JP2018/012678
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English (en)
French (fr)
Inventor
博行 野地
和仁 田端
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Japan Science and Technology Agency
Original Assignee
Japan Science and Technology Agency
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to US16/496,197 priority patent/US11231370B2/en
Priority to JP2019509955A priority patent/JP7125763B2/ja
Priority to EP18774733.2A priority patent/EP3605054B1/en
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    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N2021/7769—Measurement method of reaction-produced change in sensor
    • G01N2021/7786—Fluorescence

Definitions

  • the present invention relates to a method for enclosing a micro substance, a method for detecting a micro substance, and a device for detecting a micro substance. More specifically, the present invention relates to a method of forming a droplet in which a minute substance is sealed in a plurality of recesses formed on a substrate so as to be separated from each other.
  • markers such as nucleic acids, proteins, viruses and cells quickly, simply and with high sensitivity.
  • marker proteins 100 molecules from each cell
  • the blood concentration of the marker protein is about 30 aM.
  • a technique capable of detecting such a very low concentration substance there is a need for a technique capable of detecting such a very low concentration substance.
  • the detection target substance can be detected with a sensitivity of one molecular unit.
  • Patent Document 1 as a technique applicable to a single molecule enzyme assay, “a plurality of accommodating portions that can accommodate only one bead are separated from each other by a side wall having a hydrophobic upper surface” And a bead introducing step of introducing a hydrophilic solvent containing the beads into the space between the lower layer portion and the upper layer portion facing the surface where the accommodating portion is formed, and after the bead introducing step There is disclosed a bead encapsulating method including a hydrophobic solvent introducing step of introducing a hydrophobic solvent into the space.
  • Patent Document 1 The technique disclosed in Patent Document 1 is “a lower layer part in which a plurality of accommodating parts are separated from each other by a side wall having a hydrophobic upper surface, and a surface on which the accommodating part in the lower layer part is formed. Using an array having a flow cell structure in which the lower layer portion and the upper layer portion are opposed to each other with a space therebetween. It is. According to this technique, “a large number of beads can be efficiently encapsulated in an array, so that a low concentration of target molecules can be detected with high sensitivity”.
  • the main object of the present invention is to provide a technique for enabling highly sensitive detection by enclosing a detection target substance such as a nucleic acid, a protein, a virus, and a cell in an extremely small volume droplet with a simple operation.
  • the present invention provides the following [1] to [32].
  • [1] A method of encapsulating a minute substance in at least a part of a plurality of recesses formed on a surface of a substrate so as to be separated from each other, (1) An insert is disposed above the recess-forming surface of the substrate, and the relative position between the insert and the substrate is positioned by a support provided on the insert, and the lower surface of the insert And the concave portion forming surface of the substrate are arranged opposite to each other, thereby providing a solution introduction space between the lower surface of the insert and the concave portion forming surface of the substrate, and A solution discharge space communicating with the solution introduction space is provided above the lower surface of the insert and between the substrate and the insert, and located in the substrate and / or the insert.
  • the first step (2) a second procedure for introducing a first solution containing the fine substance and the first solvent into the solution introduction space; (3) A second liquid containing a second solvent immiscible with the first solvent is introduced into the solution introduction space, and the first liquid in the solution introduction space is discharged into the solution discharge space.
  • the insert has a bobbin shape with fringes at both ends in the insertion direction,
  • the lower surface of the insert is a first fringe having substantially the same shape as the recess forming surface of the substrate,
  • the first fringe has a space above the recess formation surface of the substrate, the solution introduction space located between the lower surface and the recess formation surface, and the solution discharge located above the first fringe.
  • a method of encapsulating a minute substance in at least a part of a plurality of recesses formed on the surface of a substrate so as to be separated from each other (A) The insert is disposed above the recess forming surface of the substrate so that the lower surface of the insert and the recess forming surface of the substrate face each other, and the lower surface of the insert formed thereby Introducing a first solution containing the fine substance and the first solvent into the solution introduction space between the concave portion forming surface of the substrate; (B) A second liquid containing a second solvent immiscible with the first solvent is introduced into the solution introduction space, and the solution out of the first solvents introduced into the solution introduction space and the recess. The first solvent introduced into the introduction space is discharged into a solution discharge space communicating with the solution introduction space, thereby covering the recess with the second liquid and including the fine substance, Forming a droplet of the first liquid.
  • a method for detecting a minute substance enclosed in at least a part of a plurality of recesses formed on a surface of a substrate so as to be separated from each other (1) An insert is disposed above the recess-forming surface of the substrate, and the relative position between the insert and the substrate is positioned by a support provided on the insert, and the lower surface of the insert And the concave portion forming surface of the substrate are arranged opposite to each other, thereby providing a solution introduction space between the lower surface of the insert and the concave portion forming surface of the substrate, and A solvent discharge space communicating with the solution introduction space is provided above the lower surface of the insert and between the substrate and the insert and positioned in the substrate and / or the insert.
  • the first step (2) a second procedure for introducing a first solution containing the fine substance and the first solvent into the solution introduction space; (3) A second liquid containing a second solvent immiscible with the first solvent is introduced into the solution introduction space, and the first liquid in the solution introduction space is discharged into the solvent discharge space.
  • a method for optically detecting a minute substance enclosed in at least a part of a plurality of recesses formed on the surface of a substrate on the basis of a change in absorbance and / or fluorescence of a chromogenic substrate (1) An insert is disposed above the recess-forming surface of the substrate, and the relative position between the insert and the substrate is positioned by a support provided on the insert, and the lower surface of the insert And the concave portion forming surface of the substrate are arranged opposite to each other, thereby providing a solution introduction space between the lower surface of the insert and the concave portion forming surface of the substrate, and A solvent discharge space communicating with the solution introduction space is provided above the lower surface of the insert and between the substrate and the insert and positioned in the substrate and / or the insert.
  • the first step (2) a second procedure for introducing a first solution containing the minute substance, the chromogenic substrate and the first solvent into the solution introduction space; (3) A second liquid containing a second solvent immiscible with the first solvent is introduced into the solution introduction space, and the first liquid in the solution introduction space is discharged into the solvent discharge space.
  • a device for detecting a minute substance comprising: a substrate having a plurality of surfaces formed with a plurality of recesses in which minute substances are enclosed; and an insert disposed above the recess forming surface of the substrate.
  • the insert includes a support for positioning a relative position with the substrate, A solution introduction space is provided between the concave portion forming surface of the substrate and a lower surface of the insert disposed to face the concave portion; A solution discharge space is provided above the lower surface of the insert and between the substrate and the insert, located in the substrate and / or in the insert, and communicating with the solution introduction space.
  • a device in which a channel having an outlet in the solution introduction space is formed in the insert and / or the substrate.
  • the first solvent held in the solution introduction space is replaced with a second solvent immiscible with the first solvent, which is introduced into the solution introduction space through the flow path, and the solution is discharged.
  • the device configured to be discharged into the space.
  • the first liquid held in the solution introduction space passes through the flow path.
  • the insert has a bobbin shape with fringes at both ends in the insertion direction,
  • the lower surface of the insert is a first fringe having substantially the same shape as the recess forming surface of the substrate,
  • the first fringe has an upper space above the recess forming surface of the substrate, the solution introduction space positioned between the first fringe and the recess forming surface, and the above-mentioned first fringe positioned above the first fringe.
  • the support portion is a second fringe provided around the upper end side of the insert, The second fringe is locked to the substrate when arranged above the concave surface of the substrate, and the height of the insert from the first fringe to the second fringe is the height of the solution discharge space.
  • the insert has a cylindrical shape between the first fringe and the second fringe, and the first fringe and the second fringe have a disc shape.
  • the support portion is a protrusion disposed on the lower surface of the insert, [21] The device according to [21], wherein a height of the protrusion is a height of the solution introduction space. [26] A gap formed between the first fringe and the substrate communicates between the solution introduction space and the solution discharge space so that liquid can be circulated at the time of disposition above the recess forming surface. The device according to any one of [21] to [25]. [27] The first fringe of the insert has a notch; [21] The device according to any one of [21] to [25], wherein the notch communicates the solution introduction space and the solution discharge space so as to allow liquid flow when arranged above the recess forming surface.
  • a method of enclosing a microscopic body in a cavity including the following procedure.
  • (1) Procedure for bringing the insert into detachable contact with the substrate The insert has a surface;
  • the substrate has a surface on which a plurality of recesses are formed,
  • the surface of the insert is located on the surface of the substrate at a sufficiently small distance to induce capillary action, thereby forming a liquid introduction space between both surfaces,
  • the plane containing the surface of the insert defines the threshold level,
  • the liquid introduction space communicates with the space above the threshold level through at least the first flow path and the second flow path.
  • the first liquid includes a first solvent and a target microscopic body
  • the second solvent is immiscible with the first solvent. It is.
  • a technique for enabling highly sensitive detection by enclosing a detection target substance such as a nucleic acid, protein, virus, or cell in an extremely small volume droplet with a simple operation is provided.
  • FIG. 14 is a cross-sectional view of the plug shown in FIG. 14-1. It is a figure which shows the adsorptive substance with which the plug used for this invention is provided.
  • a minute substance is encapsulated in at least a part of a plurality of recesses (hereinafter also referred to as “receptacles”) formed on the surface of a substrate (hereinafter also referred to as “array”) and separated from each other by side walls. It is a method to do.
  • the method for encapsulating a minute substance according to the present invention includes the following procedures (A), (B), and (C).
  • An insert (hereinafter also referred to as a “plug”) is disposed above the receptacle forming surface of the array, and the relative position between the plug and the array is positioned by a support portion provided on the plug, The lower surface of the plug and the receptacle forming surface of the array are arranged to face each other, thereby providing a solution introduction space between the lower surface of the plug and the receptacle forming surface of the array; and A procedure for providing a solution discharge space that is above the lower surface of the plug and between the array and the plug, in the array and / or in the plug, and communicates with the solution introduction space ( Plug insertion procedure).
  • (B) A procedure for introducing a first solution containing the fine substance and the first solvent into the solution introduction space (substance introduction procedure).
  • (C) introducing a second liquid containing a second solvent immiscible with the first solvent into the solution introduction space, and discharging the first liquid in the solution introduction space into the solution discharge space; A step of forming a droplet of the first liquid that is coated with the second liquid and includes the minute object in the receptacle (substance sealing procedure).
  • the minute substance detection method according to the present invention is a method for detecting the minute substance enclosed in the receptacle, and in addition to the steps (A) to (C) of the minute substance encapsulation method, (D).
  • D A procedure (detection procedure) for optically, electrically and / or magnetically detecting the minute substance present in the droplet.
  • the minute substance to be detected (hereinafter also referred to as “target substance”) is not particularly limited as long as it is a substance that can be accommodated in the receptacle.
  • Target substances may be nucleic acids, proteins, sugars, lipids and complexes thereof, as well as viruses, cells and intracellular organelles.
  • the target material may be resin or metal particles (beads) having a binding ability to the above-mentioned material.
  • the target substance is preferably a nucleic acid, protein, sugar, lipid and complex thereof, and cells and intracellular organelles, or a carrier capable of binding to them, which can be a marker for various diseases or infectious diseases.
  • Nucleic acids include natural nucleic acids such as DNA and RNA, and artificial nucleic acids such as LNA and PNA, and polymers thereof.
  • the cells include animal cells, plant cells, and bacterial cells.
  • Intracellular organelles include liposomes, exosomes, mitochondria, and the like.
  • beads is used synonymously with “particle” and is a technical term commonly used in this technical field.
  • the shape of the beads is not particularly limited, but is usually spherical.
  • the material of the beads is not particularly limited, and glass, silicon, rubber, polystyrene, polypropylene, polyvinylpyrrolidone, polyacrylamide, polystyrene dextran, crosslinked dextran (Sephadex (trademark)), agarose gel (sepharose (trademark)), silica gel, latex It may be a gel, an acrylic resin, a copolymer of vinyl and acrylamide, cellulose, nitrocellulose, a cellulose derivative, gelatin, a magnetic substance, or the like.
  • the beads may be porous.
  • the beads preferably have an average particle diameter of 5 ⁇ m or less, for example, about 1 ⁇ m to 4 ⁇ m.
  • the “average particle diameter” means a numerical value measured using an electron microscope observation or a dynamic light scattering method.
  • a complementary strand to nucleic acids is immobilized on the beads
  • An antibody may be immobilized.
  • a known intermolecular binding reaction such as a nucleic acid hybridization reaction or an antigen-antibody reaction, the ability to bind the target substance to the beads can be imparted.
  • Immobilization of nucleic acid chains or antibodies to beads may be performed by a conventionally known method.
  • a complementary chain or an antibody may be bound to the modifying group on the surface of the bead via a linker.
  • a nucleic acid chain or an antibody can be covalently bonded to an amino group on the surface via a cross-linking agent having N-hydroxysuccinimide or the like.
  • a device used in the method for detecting a minute substance according to the present invention includes an array and a plug. 1 and 2A show the structure of the array and the plug.
  • a well 11 is formed in the array 1 (see FIG. 2A).
  • a plurality of wells 11 may be formed in the array 1.
  • a plurality of receptacles 112 for accommodating a target material are formed on the bottom surface 111 of the well 11 (hereinafter, the bottom surface 111 is referred to as “receptacle forming surface 111”). Each receptacle 112 is separated from each other by a side wall 113.
  • the array 1 can be formed using a known technique such as wet etching or dry etching of a glass substrate layer, or nanoimprinting, injection molding, or cutting of a plastic substrate layer.
  • the material of the array 1 is a light-transmitting material when optically detecting a target substance, and is, for example, glass or various plastics (PP, PC, PS, COC, COP, PDMS, etc.).
  • PP polyethylene
  • PS polycarbonate
  • COC COC
  • COP COP
  • PDMS light-transmitting material
  • a commercially available 96-well plate with 96 wells 11 can be used for the array 1.
  • the size (volume) and shape of the well 11 are not particularly limited as long as the plug 2 can be fitted.
  • the size of the well 11 is, for example, about 5 to 10 mm, typically about 7 mm in diameter of the receptacle forming surface 111, and has a depth (see symbol H in FIG. 2B) of about 10 to 12 cm.
  • the shape of the well 11 is preferably cylindrical or prismatic from the viewpoint of ease of forming the well 11 and the plug 2.
  • the number of receptacles 112 in each well 11 is not particularly limited, but is about 100,000 to 1 million, preferably about 200,000 to 500,000.
  • the receptacle 112 may have any size (volume) and shape as long as it can accommodate the target material.
  • the size of the receptacle 12 is, for example, a bottom diameter of about 4 to 8 ⁇ m, typically about 5 ⁇ m, a depth of about 6 to 12 ⁇ m, and a volume of the femtoliter order.
  • the shape of the well 11 is also preferably a columnar shape or a prismatic shape from the viewpoint of ease of molding.
  • Plug insertion procedure In this procedure, the plug 2 is disposed above the receptacle forming surface 111 of the array 1, the relative position between the plug 2 and the array 1 is positioned by the support portion provided on the plug 2, The receptacle forming surface 111 of the array 1 is disposed so as to be opposed to each other, thereby providing a solution introduction space between the lower surface of the plug 2 and the receptacle forming surface 111 of the array 1. At the same time, a solution discharge space is provided above the lower surface of the plug 2 and between the array 1 and the plug 2 so that the solution introduction space and the liquid can communicate with each other.
  • the plug 2 is inserted into the well 11 space from the opening 114 of the well 11 (see FIGS. 1 and 2B).
  • the array 1 may have a plurality of wells 11. In this case, the number of plugs 2 corresponding to the number of wells 11 is used.
  • the plug 2 may be removably inserted into the well 11.
  • the plug 2 has a bobbin shape with fringes at both ends in the insertion direction, and includes a first fringe 23 provided around the lower end side in the insertion direction into the well 11 space, and when inserted into the well space 11.
  • the lower surface of the first fringe 23 and the lower surface 22 constitute the same plane.
  • the plug 2 is provided around the upper end side in the insertion direction into the well 11 space as a support portion that holds the lower surface 22 at a position not in contact with the well bottom surface 111 when inserted into the well space 11.
  • a fringe 24 is provided.
  • the bobbin shape is a cylindrical shape between the first fringe 23 and the second fringe 24 of the plug 2 (hereinafter also referred to as “plug 2 main body”), and the first fringe 23 and the second fringe 24 are cylindrical. This means that it is formed into a disk shape protruding from each of both ends.
  • the plug 2 main body may have a taper, and preferably has a taper that decreases in diameter toward the lower side in the insertion direction.
  • the second fringe 24 is preferably fitted to the substrate 1.
  • the plug 2 includes a solvent introduction path 25 having an inlet 251 on the upper surface 21 and an outlet 252 on the lower surface 22.
  • the material of the plug 2 is not particularly limited, but may be the same material as the array 1.
  • the plug 2 can be molded using a known technique such as plastic nanoimprint, injection molding, or cutting, and can also be molded using a 3D printer.
  • the first fringe 23 of the plug 2 has an area smaller than the receptacle forming surface 111. That is, the projected area of the first fringe 23 from the insertion direction of the plug 2 into the well 11 space is smaller than the area of the receptacle forming surface 111. For this reason, a gap 231 is formed between the first fringe 23 and the inner wall of the well 11 when the plug 21 is inserted into the well 11 space.
  • the diameter of the well 11 is about 5 to 10 mm, typically about 7 mm, and the diameter of the first fringe 23 of the plug 2 (the diameter of the lower surface 22) is smaller than the diameter of the well 11 in order to form the gap 231. For example, it is reduced by about 5 to 30%.
  • the first fringe 23 includes a solution introduction space 11a positioned between the receptacle forming surface 111 and the first fringe 23 and the first fringe 23 in the well space 11 when the plug 2 is inserted into the well 11 space. And a solution discharge space 11b positioned between the second fringe 24 and the second fringe 24.
  • the solution introduction space 11a and the solution discharge space 11b communicate with each other through a gap 231 formed between the first fringe 23 and the inner wall of the well 11 so that the liquid can flow.
  • the lower surface 22 of the plug 2 defines a “threshold level” in the sense that the lower surface 22 of the plug 2 partitions the solution introduction space 11 a located below and the solution discharge space 11 b located above. Is.
  • the second fringe 24 is locked to the opening edge of the well 11 when the plug 2 is inserted into the well space 11, and holds the lower surface 22 in a position where it does not come into contact with the receptacle forming surface 111. For this reason, the height h from the lower surface 22 of the plug 2 to the second fringe 24 (that is, the height of the solution discharge space 11 b) is set lower than the depth H of the well 11.
  • the first solvent may be any suitable solvent for dissolving or suspending the target substance 3 and the chromogenic substrate 4, and includes nucleic acids, proteins, sugars, lipids and complexes thereof, as well as viruses, cells, and intracellular organelles.
  • a solvent that is usually used for detecting the like is used.
  • the first solution S1 includes, for example, at least one selected from the group consisting of water, alcohol, ether, ketone, nitrile solvent, dimethyl sulfoxide (DMSO), and N, N-dimethylformamide (DMF). It may be a mixture or the like, preferably water.
  • the alcohol include ethanol, methanol, propanol, and glycerin.
  • Examples of the ether include tetrahydrofuran, polyethylene oxide, 1,4-dioxane and the like.
  • Examples of the ketone include acetone and methyl ethyl ketone.
  • Examples of the nitrile solvent include acetonitrile.
  • the first solvent may contain a buffer substance.
  • MES General Mobile Chemical Company
  • ADA N- (2-Acetamido) iminodiacetic acid
  • PIPES Pieriperazine-1,4-bis (2- ethanesulfonic acid
  • ACES N- (2-Acetamido) -2-aminoethanesulfonic acid
  • BES N, N-Bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid
  • TES N-Tris (hydroxymethyl) methyl- So-called good buffers such as 2-aminoethanesulfonic acid HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid), Tris (tris (hydroxymethyl) aminomethane), DEA (diethanolamine) and the like can be used.
  • the first solvent may contain a surfactant.
  • the surfactant is not particularly limited.
  • TWEEN 20 CAS number: 9005-64-5, polyoxyethylene sorbitan monolaurate
  • Triton X-100 CAS number: 9002-93-1, generic name polyethylene glycol mono) -4-octylphenyl ether (n ⁇ 10)
  • concentration of the surfactant added to the first solvent 20 is not particularly limited, but is preferably 0.01 to 1%.
  • an anionic surfactant an anionic surfactant, a cationic surfactant, a nonionic surfactant, a zwitterionic surfactant, a naturally derived surfactant and the like can be widely used.
  • anionic surfactant examples include a carboxylic acid type, a sulfate ester type, a sulfonic acid type, and a phosphate ester type.
  • specific examples include sodium dodecyl sulfate, sodium laurate, sodium ⁇ -sulfo fatty acid methyl ester, sodium dodecyl benzene sulfonate, sodium dodecyl ethoxylate sulfate, etc.
  • sodium dodecyl benzene sulfonate is used. It is preferable to use it.
  • Examples of the cationic surfactant are classified into a quaternary ammonium salt type, an alkylamine type, and a heterocyclic amine type. Specific examples include stearyl trimethyl ammonium chloride, distearyl dimethyl ammonium chloride, didecyl dimethyl ammonium chloride, cetyl tripyridinium chloride, dodecyl dimethyl benzyl ammonium chloride, and the like.
  • Nonionic surfactants include, for example, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, polyoxyethylene mono fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan mono fatty acid ester, sucrose fatty acid ester, polyglycerin fatty acid ester, alkyl polyglycoside , N-methylalkylglucamide and the like.
  • amphoteric surfactants include lauryldimethylaminoacetic acid betaine, dodecylaminomethyldimethylsulfopropylbetaine, and 3- (tetradecyldimethylaminio) propane-1-sulfonate, but 3-[(3-colamide Propyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS), 3-[(3-colamidopropyl) dimethylammonio] -2-hydroxy-1-propanesulfonate (CHAPSO) and the like are preferably used.
  • lauryldimethylaminoacetic acid betaine dodecylaminomethyldimethylsulfopropylbetaine
  • 3- (tetradecyldimethylaminio) propane-1-sulfonate but 3-[(3-colamide Propyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS), 3-[(3-colamidopropyl) dimethylammoni
  • lecithin and saponin are preferable, and among the compounds referred to as lecithin, specifically, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, phosphatidic acid, phosphatidylglycerol, etc. preferable.
  • a saponin Kiraya saponin is preferable.
  • the first solution S1 containing the target material 3 and the chromogenic substrate 4 is injected from the inlet 251 of the solvent introduction path 25 of the plug 2 and introduced from the outlet 252 into the solution introduction space 11a.
  • the introduction amount of the first solution S1 can be appropriately set according to the volume of the solution introduction space 11a, and is, for example, about 1 to 50 ⁇ l, preferably about 5 to 20 ⁇ l.
  • the diameter and shape of the solvent introduction path 25 are not particularly limited.
  • the shape may be a cylinder, and the inner diameter is about 1 to 5 mm, typically about 2.5 mm.
  • the first solution S1 introduced into the solution introduction space 11a proceeds between the receptacle bottom surface 111 and the lower surface 22 of the plug 2 by capillary action, and is filled into the solution introduction space 11a (see FIG. 2D).
  • the target material 3 and the chromogenic substrate 4 are also introduced into the receptacle 112.
  • the chromogenic substrate 4 is preferably contained in the first solution S1 at a concentration sufficiently higher than the concentration of the target material 3. Accordingly, one or more molecules of the chromogenic substrate 4 are introduced into almost all the receptacles 112.
  • the second solvent only needs to be immiscible with the first solution S1, for example, saturated hydrocarbon, unsaturated hydrocarbon, aromatic hydrocarbon, silicone oil, hexafluoropropylene epoxide polymer, polymer having a hydrofluoroether structure.
  • saturated hydrocarbons include alkanes and cycloalkanes.
  • alkane include decane and hexadecane.
  • unsaturated hydrocarbon include squalene.
  • Examples of aromatic hydrocarbons include benzene and toluene.
  • Examples of the hexafluoropropylene epoxide polymer include Krytox143 (manufactured by DuPont), Krytox GPL (manufactured by DuPont), and the like.
  • Examples of the polymer having a hydrofluoroether structure include Asahiklin AE3000 (Asahi Glass Co., Ltd.), Novec® 7000 (Sumitomo 3M Co., Ltd.), and the like.
  • Examples of the polymer having a perfluorocarbon structure include Fluorinert FC-40, Fluorinert FC-43 (manufactured by Sumitomo 3M), and the like.
  • a solvent having a higher specific gravity than the first solvent or the first solution S1 containing the first solvent is used.
  • the second solution S2 is injected from the inlet 251 of the solvent introduction path 25 of the plug 2 and introduced from the outlet 252 into the solution introduction space 11a.
  • the introduction amount of the second solution S2 can be appropriately set according to the volume of the solution introduction space 11a, but is about 1.1 to 5 times, preferably about 1.5 to 2 times the introduction amount of the first solution S1. Is done.
  • the second solution S2 introduced into the solution introduction space 11a proceeds between the receptacle forming surface 111 and the lower surface 22 of the plug 2 by capillary action.
  • the first solution S1 filled in the solution introduction space 11a is pushed out to the solution discharge space 11b through the gap 231 and replaced with the second solution S2.
  • a droplet D of the first solution S1 including the chromogenic substrate 4 covered with the second solution S2 is formed in the receptacle 112 (see FIG. 2F).
  • a target material 3 is sealed together with the chromogenic substrate 4 in a certain ratio of the droplets D formed on the receptacle 112.
  • the volume of the solution discharge space 11b is sufficient to receive the first liquid S1 held in the solution introduction space 11a out of the first liquid S1 held in the solution introduction space 11a and the receptacle 112. It is said.
  • the volume of the solution discharge space 11b can be appropriately set according to the volume of the solution introduction space 11a, the number and volume of the receptacles 112, and the introduction amount of the first liquid S1.
  • the target material 3 present in the droplet D is detected optically, electrically and / or magnetically.
  • the target substance 3 is optically detected by detecting a change in absorbance and / or fluorescence of the chromogenic substrate 4. More specifically, the target substance 3 is responsive to the chromogenic substrate 4.
  • a virus having an enzyme having a substrate-cleaving activity on the surface or inside thereof and the chromogenic substrate 4 is a substance that is cleaved by the enzyme and liberates a reaction product as a chromophore.
  • the chromogenic substrate 4 may be any substance that generates a reaction product having optical characteristics different from those before the reaction after the reaction with the enzyme, such as a substance whose absorbance or optical rotation changes before and after the reaction, or fluorescence after the reaction. It may be a substance that comes to exhibit.
  • the reaction between the enzyme present on the surface of the target substance 3 (virus) particle or inside the particle and the chromogenic substrate 4 coexists in a very small volume, and a reaction product is generated.
  • the enzyme 31 is present on the surface or inside of the virus particle (the figure shows the case where the enzyme 31 is present on the virus surface).
  • a reaction product 6 is generated.
  • the colored product 6 exhibits optical characteristics different from those of the colored substrate 4 and exhibits a shift in absorbance and optical rotation and fluorescence (or luminescence).
  • the reaction product 6 is generated and accumulated in the minimal volume of the droplet D by the reaction between the enzyme 31 and the chromogenic substrate 4. Thereby, since the production of the reaction product 6 rapidly proceeds to a concentration that can be detected in the next detection procedure, it is possible to detect the reaction product 6 with high sensitivity.
  • the virus is an influenza virus (see Table 1), and 4-methylumbelliferyl- ⁇ -D-neuraminic acid (4-Methylbelliferyl-N-acetyl- ⁇ -D-neuraminic acid: 4MU-NANA) is added to the chromogenic substrate 4 This will be described more specifically by taking the case of using as an example.
  • Neuraminidase (enzyme 31) is present on the surface of influenza virus particles.
  • 4MU-NANA chromogenic substrate 4
  • 4-methylumbelliferone reaction product 6
  • 4-methylumbelliferone accumulates in the minimal volume of droplet D, and the accumulated 4-methylumbelliferone emits enhanced fluorescence.
  • the reaction product 6 can be generated before the procedure if the chromogenic substrate 4 and the enzyme 31 are in contact with each other in the first solution S1, but the target substance 3 and the chromogenic substrate 4 are included in the procedure.
  • the produced reaction product 6 is not accumulated in the minimum volume before the droplet D of the first solution S1 to be formed is formed. For this reason, in the detection of the reaction product 6, the influence of the reaction product 6 generated before this procedure is small enough to be ignored.
  • the target material 3 present in the droplet D is detected optically, electrically, and / or magnetically (see FIG. 2G).
  • the influenza virus as the target substance 3 is detected by detecting the fluorescence emitted from the reaction product 6 (4-methylumbelliferone) generated in the droplet D.
  • Optical detection can be performed by a detector 7 including a light source, an optical path for condensing light from the light source in the receptacle 112 and condensing light generated from the receptacle 112 on the sensor, and the sensor. .
  • the minute substance detection device according to the present invention may include a detector 7. Light from the light source is irradiated into the receptacle 112 from the lower side of the array 1 (opposite to the opening surface of the well 11), and light generated from the receptacle 112 is also collected from the same side. Normally used lenses and filters are arranged between the light source and the array 1 and between the array 1 and a sensor such as a CMOS image sensor.
  • the device for detecting a minute substance may include a temperature controller for controlling the temperature of the array 1.
  • a heating mechanism or a temperature adjusting mechanism disclosed in Patent Document 2 can be adopted as the temperature controller.
  • the temperature controller may be a heat block whose temperature can be controlled by, for example, a Peltier element or a Joule-Thomson element.
  • the reaction product 6 can be generated in the first solution S1 before the substance encapsulation procedure, but most of the reaction product 6 generated before the substance encapsulation procedure is in the substance encapsulation procedure.
  • the second solution S2 is discharged from the solution introduction space 11a to the solution discharge space 11b.
  • the reaction product 6 generated before the substance sealing procedure does not become noise, and is generated in the minimal volume of the droplet D.
  • the signal from the accumulated reaction product 6 can be selectively detected.
  • the first fringe 23 of the plug 2 is preferably light-impermeable. Light transmittance can be imparted by forming the first fringe 23 or the entire plug 2 including the same with an opaque material.
  • Fluorescence detection of 4-methylumbelliferone (reaction product 6) in droplet D was performed, and using the acquired fluorescence intensity and a standard curve that defined the relationship between the fluorescence intensity and neuraminidase activity prepared in advance. Calculate the enzyme activity of neuraminidase. Further, the presence or absence of influenza virus is determined or the number of particles is quantified using a standard curve that defines the calculated enzyme activity and the relationship between the enzyme activity and the number of virus particles prepared in advance. Thereby, the influenza virus as the target substance 3 can be detected, and the amount of virus can also be determined quantitatively.
  • the number of target materials 3 entering one receptacle 112 can be 0 or 1 at the maximum.
  • the reaction product 6 can be accumulated at a high concentration in the droplet D of the first solution S1, so that only one particle of virus as the target substance 3 is contained in the receptacle 112.
  • the detection of the reaction product 6 can be performed with high sensitivity. Therefore, according to the substance detection method according to the present invention, even a very small amount of the target substance 3 such as a virus can be detected with high sensitivity, and the abundance thereof can be determined with high accuracy.
  • the concentration of the target material 3 can also be determined based on a standard curve that defines the relationship between the ratio and the ratio.
  • the target material 3 can be efficiently enclosed in each receptacle 112 by a simple operation.
  • the time required from the substance introduction procedure to the substance encapsulation procedure is typically very short, about 1 to 10 minutes, and the operation is simple.
  • the target molecule 3 can be detected with high sensitivity, even a very low concentration of the target molecule 3 of about 10 aM can be detected.
  • digital ELISA, ELISA-PCR, etc. Applicable to applications.
  • the second fringe 24 functions as a support portion that holds the lower surface 22 so as not to contact the receptacle forming surface 111 when the plug 2 is inserted into the well space 11 ( 1 and 2A).
  • the support portion of the plug 2 may be a protrusion 26 disposed on the lower surface 22 as shown in FIGS. 4 and 5A.
  • the height h of the protrusion 26 (that is, the height of the solution introduction space 11 a) is set lower than the depth H of the well 11.
  • the number of the protrusions 26 is not particularly limited, but about 3 to 4 are preferably provided in order to perform stable positioning.
  • the first fringe 23 only needs to be provided near the lower end in the insertion direction of the plug 2 as shown in FIG. 5B, and does not need to be positioned at the lower end.
  • the solution introduction space 11a and the solution discharge space 11b of the well 11 communicate with each other so that the liquid can flow through the gap 231 formed between the first fringe 23 and the inner wall of the well 11.
  • the solution introduction space 11a and the solution discharge space 11b are configured to communicate with each other through a notch 232 provided in the first fringe 23 of the plug 2. May be.
  • the first fringe 23 of the plug 2 does not need to have a smaller area than the receptacle forming surface 111.
  • the size and number of the cutouts 232 are not particularly limited.
  • the first solution S1 pushed out by the second solution S2 introduced into the solution introduction space 11a passes through the cutout 232 and is quickly discharged into the solution discharge space 11b. It is preferable that they are arranged in a sufficient size and number so that they can be moved.
  • the plug 2 in the substance introduction procedure, between the plug 2 and the array 1 (specifically, the first fringe 23, the second fringe 24, and the plug 2 of the plug 2 having a bobbin shape).
  • the example in which the first solution S1 is discharged to the solution discharge space 11b located in the main body part and a region partitioned by the surface of the well 11 facing the plug 2 main body part) has been described.
  • the plug 2 may be configured to lack the second fringe 24 (see FIG. 8).
  • a solution introduction space 11a is formed between the receptacle forming surface 111 of the array 2 and the lower surface 22 of the plug 2 disposed so as to be opposed thereto.
  • the solution discharge portion 11b for discharging the first solution S1 introduced into the solution introduction space 11a is a surface facing the plug 2 body of the well 11 and is lower than the lower surface 22 of the plug 2.
  • the upper surface can be provided with a recessed surface.
  • the lower surface 22 of the plug 2 defines a “threshold level” in the sense that it partitions the solution introduction space 11 a located below and the solution discharge space 11 b located above.
  • the “solution discharge part 11b provided in the array 1” also includes the solution discharge part 11b provided by partially denting the surface of the well 11 facing the plug 2 body. Shall be. Even when the plug 2 is configured to lack the second fringe 24, the solution discharge space 11b is provided between the plug 2 and the array 1 without causing the surface of the substrate 1 facing the plug 2 to be recessed. It is also possible (see FIG. 9).
  • the solution discharge space 11b is partitioned between the plug 2 and the array 1 (specifically, including the plug 2 body and the surface of the well 11 facing the plug 2 body).
  • the example provided in the area) has been described.
  • the “solution discharge part 11 b provided in the array 1” may be provided in a region of the array 1 that is independent of the surface facing the plug 2.
  • the solution discharge part 11b needs to be connected with the solution introduction space 11a so that the liquid can flow.
  • the plug 2 is disposed above the receptacle forming surface 111 of the array 1, the relative position between the plug 2 and the array 1 is positioned by the second fringe 24 provided on the plug 2, and the plug 2
  • the lower surface 22 and the receptacle forming surface 111 of the array 1 are arranged to face each other, whereby a solution introduction space 11 a is provided between the lower surface 22 of the plug 2 and the receptacle forming surface 111 of the array 1.
  • a solution discharge space 11b is provided above the lower surface 22 of the plug 2 and positioned in the array 1 so as to communicate with the solution introduction space 11a so that the liquid can flow.
  • the plug 2 is inserted into the well 11 space from the opening 114 of the well 11 of the array 1.
  • the plug 2 shown in FIG. 10 employs a configuration lacking the first fringe 23.
  • the second fringe 24 is locked to the opening edge of the well 11 and holds the lower surface 22 at a position not in contact with the receptacle forming surface 111.
  • the lower surface 22 of the plug 2 faces the receptacle forming surface 111, and forms a solution introduction space 11 a between the receptacle forming surface 111.
  • the second fringe 24 is preferably fitted to the substrate 1.
  • the first solution S1 containing the target material 3 and the chromogenic substrate 4 is injected from the inlet 251 of the solvent introduction path 25 of the plug 2 and introduced from the outlet 252 into the solution introduction space 11a.
  • the first solution S1 introduced into the solution introduction space 11a proceeds between the receptacle bottom surface 111 and the lower surface 22 of the plug 2 by capillary action, and is filled in the solution introduction space 11a.
  • the target material 3 and the chromogenic substrate 4 are introduced into the receptacle 112.
  • one target material 3 is introduced into each receptacle 112.
  • a second solution S2 containing a second solvent immiscible with the first solution S1 is introduced into the solution introduction space 11a.
  • a region communicating with the solution introduction space 11a is provided below the lower surface 22 of the plug 2, and the region below the lower surface 22 of the plug 2 in the region is the solution introduction space. It is integrated with the space 11a.
  • the area is extended upward of the array 1, and the area above the lower surface 22 of the plug 2 in the area functions as the solution discharge space 11b.
  • the lower surface 22 of the plug 2 defines a “threshold level” in the sense that it partitions the solution introduction space 11 a located below and the solution discharge space 11 b located above.
  • FIG. 10 shows the case where four solution discharge spaces 11b are provided in the array 1, the number of solution discharge spaces 11b is not particularly limited.
  • the second solution S2 is injected from the inlet 251 of the solvent introduction path 25 of the plug 2 and introduced from the outlet 252 into the solution introduction space 11a.
  • the second solution S2 introduced into the solution introduction space 11a proceeds between the receptacle forming surface 111 and the lower surface 22 of the plug 2 by capillary action.
  • the first solution S1 filled in the solution introduction space 11a is pushed out to the solution discharge space 11b and replaced with the second solution S2.
  • a droplet D of the first solution S1 containing the chromogenic substrate 4 covered with the second solution S2 is formed in the receptacle 112 (see FIG. 10).
  • the solution discharge space 11b may be added in the array 1 and provided between the plug 2 and the array 1 (see FIG. 11).
  • the solvent discharge space 11 b may be provided in the plug 2.
  • the solution discharge portion 11b is configured to communicate with the solution introduction space 11a so that the liquid can flow when the plug 2 is inserted into the well 11 space.
  • the plug 2 is arranged above the receptacle forming surface 111 of the array 1, the relative position between the plug 2 and the array 1 is positioned by the protrusion 26 provided on the plug 2, and the lower surface 22 of the plug 2.
  • the receptacle forming surface 111 of the array 1 are arranged opposite to each other, thereby providing a solution introduction space 11 a between the lower surface 22 of the plug 2 and the receptacle forming surface 111 of the array 1.
  • a solution discharge space 11b is provided above the lower surface 22 of the plug 2 and positioned in the plug 2 so as to communicate with the solution introduction space 11a so that the liquid can flow.
  • the plug 2 is inserted into the well 11 space from the opening 114 of the well 11 of the array 1.
  • the plug 2 shown in FIG. 12 employs a configuration lacking the first fringe 23. Further, the plug 2 employs a protrusion 26 disposed on the lower surface 22 as a support portion that holds the lower surface 22 so as not to contact the receptacle forming surface 111 when inserted into the well space 11.
  • the lower surface 22 of the plug 2 faces the receptacle forming surface 111, and forms a solution introduction space 11 a between the receptacle forming surface 111.
  • the second fringe 24 is preferably fitted to the substrate 1.
  • the first solution S1 containing the target material 3 and the chromogenic substrate 4 is injected from the inlet 251 of the solvent introduction path 25 of the plug 2 and introduced from the outlet 252 into the solution introduction space 11a.
  • the first solution S1 introduced into the solution introduction space 11a proceeds between the receptacle bottom surface 111 and the lower surface 22 of the plug 2 by capillary action, and is filled in the solution introduction space 11a.
  • the target material 3 and the chromogenic substrate 4 are introduced into the receptacle 112.
  • a second solution S2 containing a second solvent immiscible with the first solution S1 is introduced into the solution introduction space 11a.
  • the plug 2 according to the present embodiment is provided with a region communicating with the solution introduction space 11a when inserted into the well space 11, and the region above the lower surface 22 of the plug 2 in the region is a solution discharge. It functions as the space 11b.
  • the lower surface 22 of the plug 2 defines a “threshold level” in the sense that it partitions the solution introduction space 11 a located below and the solution discharge space 11 b located above.
  • the number of solution discharge spaces 11b provided in the plug 2 is not particularly limited.
  • the second solution S2 is injected from the inlet 251 of the solvent introduction path 25 of the plug 2 and introduced from the outlet 252 into the solution introduction space 11a.
  • the second solution S2 introduced into the solution introduction space 11a proceeds between the receptacle forming surface 111 and the lower surface 22 of the plug 2 by capillary action.
  • the first solution S1 filled in the solution introduction space 11a is pushed out to the solution discharge space 11b, and the first solution S1 in the solution introduction space 11a is replaced with the second solution S2.
  • a droplet D of the first solution S1 containing the chromogenic substrate 4 covered with the second solution S2 is formed in the receptacle 112 (see FIG. 12).
  • the solution discharge space 11b may be added between the plug 2 and the array 1 (see FIG. 13).
  • FIG. 14A is a top view of a reference example of a plug used in the present invention
  • FIG. 14B is a front view
  • FIG. 14C is a cross-sectional view.
  • the plug of this reference example is manufactured by the 3D printer method.
  • the shaft body portion of the plug is gradually narrowed in the insertion direction (direction in which the array is located), and has a tapered shape as a whole.
  • Fringes 23 and 24 are provided at both ends of the plug and have a bobbin structure as a whole.
  • the upper fringe (second fringe 24) of the plug provides a support for the array when inserted into the opening.
  • a thin step is provided on the lower side of the upper fringe, and the step is fitted with an opening having a round shape in the array, and is semi-fixed to the opening of the array by its own weight to such an extent that the subsequent series of operations is not hindered. . Plugs can be easily inserted into the openings in the array.
  • the step portion prevents the solvent discharged into the discharge space from leaking outside from the side portion of the upper fringe.
  • the upper fringe of the plug has a thin cylindrical shape with an outer diameter of about 8.3 mm, and the upper fringe has a thickness of about 2 mm.
  • the lower fringe (first fringe 23) is formed such that the outer diameter of the lower surface portion is larger than the upper surface portion, and the side surface portion is slightly tapered.
  • the outer diameter of the lowermost surface of the lower fringe is about 5.9 mm, and the outer diameter of the uppermost surface is about 5.4 mm.
  • the thickness of the lower fringe is about 1 mm.
  • the distance between the lowermost surface of the upper fringe and the uppermost surface of the lower fringe is about 10.9 mm, except for the step portion at the lower part of the upper fringe.
  • the overall length of the plug in the axial direction is about 13.9 mm.
  • the plug is formed with a tapered through hole that passes from the center portion of the upper fringe to the center of the shaft body portion, and functions as a solvent introduction path 25 for the first solution and the second solution.
  • the diameter of the through hole in the upper surface portion of the upper fringe is about 2.5 mm. From the bottom surface of the plug to a position of about 3.8 mm (inner diameter change point), the inner diameter of the through hole gradually decreases from the uppermost surface of the upper fringe toward the lowermost surface, and the through hole is tapered as a whole. It is formed in a shape. From the inner diameter changing point to the lowermost surface of the lower fringe, the through hole has a cylindrical shape.
  • a hole in the uppermost surface of the upper fringe serves as an inlet 251 for introducing a solvent or the like
  • a hole in the lowermost surface of the lower fringe serves as an outlet 252 for introducing a solvent or the like into the solution introduction space.
  • the shaft body part of the plug is formed to be considerably narrower than the fringe part, and a solvent discharge space having a slightly larger volume is formed around the shaft body part between the inner wall of the opening of the array. Will be.
  • the plug is inserted into the opening of the array, and it is semi-fixed by fitting with the opening at the step part below the upper fringe. Insertion into the opening of the plug may be performed in units of one by manual operation, or a plurality of plugs may be inserted simultaneously using a jig. Also, the plug can be simultaneously inserted into a plurality of rows of the array or the entire 96 holes by the robot system.
  • the inspected object contains an infectious pathogen
  • a solvent containing an infectious pathogen is discharged from the solvent introduction space to the discharge space, the solvent leaks out of the array opening.
  • the material of the plug can be a thermoplastic resin or a thermosetting resin that can be easily molded by the 3D printer method.
  • a plug can also be manufactured by a general-purpose resin injection molding method.
  • the plug material has a predetermined rigidity after molding, is suitable for precision molding, and preferably has predetermined physical properties such as heat resistance, low adsorption, low moisture permeability, and chemical resistance. .
  • it is particularly preferred that use in pharmaceutical / bio applications is permitted.
  • cyclic olefin polymers (COP) are well known for pharmaceutical / bio-related applications.
  • PPSU / PPSF resin that is highly heat resistant and suitable for sterilization is also suitable.
  • the plug in order to detect the number of objects to be inspected contained in the solvent optically with high accuracy, it is desirable that the plug exhibits light shielding or light absorbing properties at the light wavelength used. In particular, it is mainly to optically measure the inspection object in the receptacle from the lower side of the array. For this reason, the lower fringe of the plug is preferably black. In this reference example, a black thermoplastic resin material is used.
  • an array having a typical number of holes such as 96 holes and 384 holes and an arrangement configuration can be adopted.
  • the overall shape of the opening is basically a flat bottom type.
  • the surface of the array is flat and suitable for flowing liquid.
  • the shape of the opening in the planar direction of the array is circular, and is suitable for capturing a solvent or a bead containing a test object.
  • background noise such as unnecessary light emitted from the plug or the array itself is low.
  • the volume of one opening is about 1 to 400 ⁇ L.
  • the material for the array include resins such as polypropylene, polystyrene, and COP. Among them, it is preferable to use a material suitable for pharmaceutical / bio use.
  • One opening has an outer diameter of 7 mm and a depth of about 10 to 12 mm.
  • an array having an outer diameter of 126 ⁇ 85 ⁇ 20 mm and a rectangular shape is well known.
  • a minute receptacle is provided at the bottom of each opening.
  • the hole diameter is about 4-8 ⁇ m on the bottom surface, typically 5 ⁇ m.
  • the depth of one receptacle is about 6 to 12 ⁇ m.
  • the volume of one receptacle is a femtoliter size.
  • FIG. 16 shows an entire array, a partially enlarged photograph of the opening, and a partially enlarged photograph of the receptacle provided at the bottom of the opening.
  • a large number of receptacles are geometrically arranged, and hundreds of thousands of receptacles can be arranged per one opening according to one size (diameter), arrangement pitch, or arrangement density.
  • the receptacles are staggered with each row being shifted by half the size.
  • plugs can be manually inserted into the array. Suitable for laboratory experiments and single-shot experiments.
  • 96 plugs can be semi-automatically inserted into the 96 holes using a dedicated device for manual operation and insertion.
  • FIG. 17 shows a state in which two rows of plugs are connected in advance and 16 of them are inserted into the array as a unit. The other part is one in which one plug is inserted manually.
  • FIG. 18 shows a photograph of a state in which one plug is inserted into the opening of the array, taken from the side of the array.
  • FIG. 19 is a photograph showing a state in which a solvent is injected by a pipette from one end portion of two rows of connecting plugs inserted into the array. After the plug is inserted into the opening of the array, it is supported by the upper fringe of the plug and is firmly fixed to the array without swinging in the left-right direction. Further, a first liquid and then a second liquid are sequentially injected from an inlet provided in the center of the plug.
  • the array may be provided with heating / cooling means as disclosed in Patent Document 2.
  • a robot system that automatically performs array and plug treatment can be constructed to perform automatic processing.

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Abstract

簡易な操作で、核酸、タンパク質、ウイルス及び細胞等の検出対象物質を極小容積の液滴中に封入し、高感度な検出を可能とするための技術として、基板の表面に互いに隔てられて形成された複数の凹部の少なくとも一部に微小物質を封入する方法であって、以下の手順を少なくとも含む方法を提供する。 （１）前記基板の凹部形成面の上方に挿入体を配置し、該挿入体と前記基板との相対的な位置を前記挿入体に設けられた支持部により位置決めして、前記挿入体の下面と前記基板の前記凹部形成面とを対向配置し、これによって前記挿入体の下面と前記基板の前記凹部形成面との間に溶液導入空間を設け、かつ、前記挿入体の前記下面よりも上方であって、かつ前記基板と前記挿入体との間、前記基板内及び／又は前記挿入体内に位置させて、前記溶液導入空間と連通する溶液排出空間を設ける、第一手順。

Description

微小物質封入方法及び微小物質検出方法並びに微小物質検出用デバイス
　本発明は、微小物質封入方法及び微小物質検出方法並びに微小物質検出用デバイスに関する。より詳しくは、基板上に互いに隔てられて形成された複数の凹部内に、微小物質が封入された液滴を形成する方法等に関する。
　疾患や感染症等の診断のため、核酸、タンパク質、ウイルス及び細胞等のマーカーを迅速、簡便、かつ高感度に検出するための技術が求められている。例えば、体積１ｍｍ3の腫瘍に含まれる１００万個の癌細胞からマーカータンパク質（各細胞から１００分子ずつ）が５Ｌの血中に分泌された場合、マーカータンパク質の血中濃度は３０ａＭ程度である。このような非常に低濃度の物質をも検出しうる技術が求められている。
　このような技術として、核酸、タンパク質、ウイルス及び細胞等の検出対象物質を極小容積の液滴中に封入し、標識抗体を用いた免疫学的手法によって検出する「一分子酵素アッセイ」がある。一分子酵素アッセイによれば、検出対象物質を一分子単位の感度で検出することができる。
　特許文献１には、一分子酵素アッセイに応用可能な技術として、「ビーズを１個のみ収容可能な複数の収容部が、疎水性の上面を有する側壁によって互いに隔てられて形成されている下層部と、当該下層部における当該収容部が形成されている面に対向している上層部との間の空間に、当該ビーズを含む親水性溶媒を導入するビーズ導入工程と、上記ビーズ導入工程の後に上記空間に疎水性溶媒を導入する疎水性溶媒導入工程とを含むことを特徴とするビーズ封入方法」が開示されている。
　特許文献１に開示される技術は、「複数の収容部が疎水性の上面を有する側壁によって互いに隔てられて形成されている下層部と、上記下層部における上記収容部が形成されている面に対して空間を隔てて対向している上層部とを備えていることを特徴とするアレイ」を用いるものであり、下層部と上層部が空間を隔てて対向するフローセル構造を有するアレイを用いるものである。この技術によれば、「多数のビーズをアレイに効率よく封入させることができるので、低濃度のターゲット分子を高感度に検出可能」とされている。
国際公開２０１２／１２１３１０号 特開２００４－３０９４０５号
　本発明は、簡易な操作で、核酸、タンパク質、ウイルス及び細胞等の検出対象物質を極小容積の液滴中に封入し、高感度な検出を可能とするための技術を提供することを主な目的とする。
　上記の課題を解決するために、本発明は、以下の［１］～［３２］を提供する。
［１］　基板の表面に互いに隔てられて形成された複数の凹部の少なくとも一部に微小物質を封入する方法であって、
（１）前記基板の凹部形成面の上方に挿入体を配置し、該挿入体と前記基板との相対的な位置を前記挿入体に設けられた支持部により位置決めして、前記挿入体の下面と前記基板の前記凹部形成面とを対向配置し、これによって前記挿入体の下面と前記基板の前記凹部形成面との間に溶液導入空間を設け、かつ、
前記挿入体の前記下面よりも上方であって、かつ前記基板と前記挿入体との間、前記基板内及び／又は前記挿入体内に位置させて、前記溶液導入空間と連通する溶液排出空間を設ける、第一手順と、
（２）前記微小物質と第一溶媒とを含む第一溶液を前記溶液導入空間内に導入する第二手順と、
（３）前記第一溶媒と非混和性の第二溶媒を含む第二液体を前記溶液導入空間に導入し、該溶液導入空間内の前記第一液体を前記溶液排出空間へ排出して、これによって前記凹部内に、前記第二液体で被覆されかつ前記微小物質を包含する、前記第一液体の液滴を形成する第三手順と、を含む方法。
［２］　前記第一手順において、前記溶液排出空間を、前記挿入体の前記下面よりも上方であって、かつ前記基板と前記挿入体との間に設ける、［１］の方法。
［３］　前記第一手順において、前記溶液排出空間を、前記挿入体の前記下面よりも上方であって、かつ前記基板内に設ける、［１］の方法。
［４］　前記第一手順において、前記溶液排出空間を、前記挿入体の前記下面よりも上方であって、かつ前記基板と前記挿入体との間及び前記基板内に設ける、［１］の方法。
［５］　前記第一手順において、前記溶液排出空間を、前記挿入体の前記下面よりも上方であって、かつ前記挿入体内に設ける、［１］の方法。
［６］　前記第一手順において、前記溶液排出空間を、前記挿入体の前記下面よりも上方であって、かつ前記基板と前記挿入体との間及び前記挿入体内に設ける、［１］の方法。
［７］　前記第二手順において、前記第一溶液を、前記挿入体及び／又は前記基板に形成され、前記溶液導入空間にアウトレットを有する流路を通じて、前記溶液導入空間に導入する、［１］～［６］のいずれかの方法。
［８］　前記挿入体は挿入方向の両端にフリンジを備えたボビン状形状を有し、
該挿入体の前記下面は、前記基板の前記凹部形成面と略同一形状を有する第一フリンジとされ、
該第一フリンジは、前記基板の前記凹部形成面の上方空間を、該下面と前記凹部形成面との間に位置する前記溶液導入空間と、該第一フリンジよりも上方に位置する前記溶液排出空間とに、両空間を区画する、［２］の方法。
［９］　前記第二手順と前記第三手順との間に、前記ウェルが形成された基板の温度を制御する手順をさらに含む、［１］～［８］のいずれかの方法。
［１０］　基板の表面に互いに隔てられて形成された複数の凹部の少なくとも一部に微小物質を封入する方法であって、
（Ａ）挿入体を、前記基板の凹部形成面の上方に、該挿入体の下面と前記基板の前記凹部形成面とが対向するように配置し、これによって形成される前記挿入体の下面と前記基板の前記凹部形成面との間の溶液導入空間に、前記微小物質と第一溶媒とを含む第一溶液を導入する手順と、
（Ｂ）前記第一溶媒と非混和性の第二溶媒を含む第二液体を前記溶液導入空間に導入し、前記溶液導入空間と前記凹部内とに導入された前記第一溶媒のうち前記溶液導入空間に導入された前記第一溶媒を、前記溶液導入空間と連通する溶液排出空間へ排出して、これによって前記凹部内に、前記第二液体で被覆されかつ前記微小物質を包含する、前記第一液体の液滴を形成する手順と、を含む方法。
［１１］　基板の表面に互いに隔てられて形成された複数の凹部の少なくとも一部に封入された微小物質を検出する方法であって、
（１）前記基板の凹部形成面の上方に挿入体を配置し、該挿入体と前記基板との相対的な位置を前記挿入体に設けられた支持部により位置決めして、前記挿入体の下面と前記基板の前記凹部形成面とを対向配置し、これによって前記挿入体の下面と前記基板の前記凹部形成面との間に溶液導入空間を設け、かつ、
前記挿入体の前記下面よりも上方であって、かつ前記基板と前記挿入体との間、前記基板内及び／又は前記挿入体内に位置させて、前記溶液導入空間と連通する溶媒排出空間を設ける、第一手順と、
（２）前記微小物質と第一溶媒とを含む第一溶液を前記溶液導入空間内に導入する第二手順と、
（３）前記第一溶媒と非混和性の第二溶媒を含む第二液体を前記溶液導入空間に導入し、該溶液導入空間内の前記第一液体を前記溶媒排出空間へ排出して、これによって前記凹部内に、前記第二液体で被覆されかつ前記微小物質を包含する、前記第一液体の液滴を形成する第三手順と、
（４）前記液滴内に存在する前記微小物質を光学的、電気的及び／又は磁気的に検出する第四手順と、
を含む方法。
［１２］　基板の表面に互いに隔てられて形成された複数の凹部の少なくとも一部に封入された微小物質を発色基質の吸光度変化及び／又は蛍光に基づいて光学的に検出する方法であって、
（１）前記基板の凹部形成面の上方に挿入体を配置し、該挿入体と前記基板との相対的な位置を前記挿入体に設けられた支持部により位置決めして、前記挿入体の下面と前記基板の前記凹部形成面とを対向配置し、これによって前記挿入体の下面と前記基板の前記凹部形成面との間に溶液導入空間を設け、かつ、
前記挿入体の前記下面よりも上方であって、かつ前記基板と前記挿入体との間、前記基板内及び／又は前記挿入体内に位置させて、前記溶液導入空間と連通する溶媒排出空間を設ける、第一手順と、
（２）前記微小物質と前記発色基質と第一溶媒とを含む第一溶液を前記溶液導入空間内に導入する第二手順と、
（３）前記第一溶媒と非混和性の第二溶媒を含む第二液体を前記溶液導入空間に導入し、該溶液導入空間内の前記第一液体を前記溶媒排出空間へ排出して、これによって前記凹部内に、前記第二液体で被覆されかつ前記微小物質を包含する、前記第一液体の液滴を形成する第三手順と、
（４）前記液滴内に存在する前記発色基質の吸光度変化及び／又は蛍光を検出する第四手順と、
を含む方法。
［１３］　微小物質が封入される凹部が互いに隔てられて複数形成された表面を備える基板と、前記基板の凹部形成面の上方に配置される挿入体と、を含んでなる微小物質検出用デバイスであり、
前記挿入体は、前記基板との相対的な位置を位置決めするための支持部を備え、
前記基板の前記凹部形成面と、その上方に対向配置された前記挿入体の下面との間に溶液導入空間が設けられ、
前記挿入体の前記下面よりも上方であって、かつ前記基板と前記挿入体との間、前記基板内及び／又は前記挿入体内に位置して、前記溶液導入空間と連通する溶液排出空間が設けられ、かつ、
前記挿入体及び／又は前記基板に、前記溶液導入空間にアウトレットを有する流路が形成されている、デバイス。
［１４］　前記溶液導入空間内に保持された第一溶媒が、前記流路を通じて前記溶液導入空間内に導入される、前記第一溶媒と非混和性の第二溶媒に置換されて前記溶液排出空間へ排出され得るように構成された、［１３］のデバイス。
［１５］　前記溶液導入空間内及び前記凹部内に保持された、前記微小物質と前記第一溶媒を含む第一液体のうち前記溶液導入空間内に保持された第一液体が、前記流路を通じて前記溶液導入空間内に導入される、前記第一溶媒と非混和性の第二溶媒を含む第二液体によって前記溶液排出空間へ排出されて、前記凹部内に、前記第二液体で被覆されかつ前記微小物質を包含する、前記第一液体の液滴が形成されるように構成された、［１４］のデバイス。
［１６］　前記溶媒排出空間が、前記挿入体の前記下面よりも上方であって、かつ前記基板と前記挿入体との間に設けられた、［１３］のデバイス。
［１７］　前記溶媒排出空間が、前記挿入体の前記下面よりも上方であって、かつ前記基板内に設けられた、［１３］のデバイス。
［１８］　記溶媒排出空間が、前記挿入体の前記下面よりも上方であって、かつ前記基板と前記挿入体との間及び前記基板内に設けられた、［１３］のデバイス。
［１９］　前記溶媒排出空間が、前記挿入体の前記下面よりも上方であって、かつ前記挿入体内に設けられた、［１３］のデバイス。
［２０］　前記溶媒排出空間が、前記挿入体の前記下面よりも上方であって、かつ前記基板と前記挿入体との間及び前記挿入体に設けられた、［１３］のデバイス。
［２１］　前記挿入体は挿入方向の両端にフリンジを備えたボビン状形状を有し、
該挿入体の前記下面は、前記基板の前記凹部形成面と略同一形状を有する第一フリンジとされ、
該第一フリンジは、前記基板の前記凹部形成面の上方空間を、該第一フリンジと前記凹部形成面との間に位置する前記溶液導入空間と、該第一フリンジよりも上方に位置する前記溶液排出空間とに、両空間を区画する、［１３］のデバイス。
［２２］　前記支持部は、前記挿入体の上端側に周設された第二フリンジであり、
該第二フリンジは、前記基板の凹部形成面の上方への配置時において前記基板に係止し、前記挿入体の前記第一フリンジから該第二フリンジまでの高さが、前記溶液排出空間の高さである、［２１］のデバイス。
［２３］　前記挿入体の前記第一フリンジ及び前記第二フリンジとの間が円筒形状であり、前記第一フリンジ及び前記第二フリンジが円板形状である、［２２］のデバイス。
［２４］　前記第一フリンジが光不透過性である、［２１］～［２３］のいずれかのデバイス。
［２５］　前記支持部は、前記挿入体の前記下面に配設された突起であり、
前記突起の高さが、前記溶液導入空間の高さである、［２１］のデバイス。
［２６］　前記凹部形成面の上方への配置時において、該第一フリンジと前記基板との間に形成される間隙が、前記溶液導入空間と前記溶液排出空間とを液体流通可能に連通する、［２１］～［２５］のいずれかのデバイス。
［２７］　前記挿入体の前記第一フリンジは、切欠を有し、
前記凹部形成面の上方への配置時において、該切欠が、前記溶液導入空間と前記溶液排出空間とを液体流通可能に連通する、［２１］～［２５］のいずれかのデバイス。
［２８］　前記挿入体が、少なくともその下面において光不透過性である、［１３］～［２７］のいずれかのデバイス。
［２９］　前記挿入体の前記基板の凹部形成面の上方への配置時において、前記支持部が前記基板に嵌合する、［１３］～［２６］のいずれかのデバイス。
［３０］　前記基板の温度を制御する温度調節器をさらに備える、［１３］～［２９］のいずれかのデバイス。
［３１］　前記凹部内に存在する前記微小物質を光学的、電気的及び／又は磁気的に検出する検出器をさらに備える、［１３］～［３０］のいずれかのデバイス。
［３２］　以下の手順を含む、微小物質（microscopic body）を凹部（cavity）に封入する方法。
（１）挿入体を基板に脱着可能に接触させる手順ここで、
挿入体は表面を有し、
基板は、複数の凹部が形成された表面を有し、
挿入体が基板に脱着可能に接触する際、
　挿入体の表面は、基板の表面上に、毛細現象を誘導するために十分に小さな距離をおいて位置し、これによって両表面間に液体導入空間を形成し、
　挿入体の表面を含む平面が閾値レベル（threshold level）を定義し、
　液体導入空間は、少なくとも第一流路と第二流路を通じて、閾値レベル上の空間と連通する、
（２）第一流路を通じて液体導入空間に第一液体を導入する手順、
ここで、第一液体は、第一溶媒と目的微小物質（target microscopic body）を含む、
（３）第一流路又は第二流路を通じて液体導入空間に第二溶媒を導入して液体導入空間内の第一液体を置換する手順、ここで、第二溶媒は第一溶媒と非混和性である。
　本発明により、簡易な操作で、核酸、タンパク質、ウイルス及び細胞等の検出対象物質を極小容積の液滴中に封入し、高感度な検出を可能とするための技術が提供される。
本発明の第一実施形態に係る微小物質検出用デバイスのウェルとプラグを示す図である。 第一実施形態に係る微小物質検出用デバイスを用いた微小物質検出方法及び微小物質封入方法の手順を説明する図である。 第一実施形態に係る微小物質検出用デバイスを用いた微小物質検出方法及び微小物質封入方法の手順を説明する図である。 第一実施形態に係る微小物質検出用デバイスを用いた微小物質検出方法及び微小物質封入方法の手順を説明する図である。 第一実施形態に係る微小物質検出用デバイスを用いた微小物質検出方法及び微小物質封入方法の手順を説明する図である。 ウイルスの粒子表面に存在する酵素と発色基質との反応による反応生成物を説明するための図である。 第一実施形態に係るプラグの変形例を示す図である。 （Ａ）図４に示すプラグの変形例、（Ｂ）第一実施形態に係るプラグの他の変形例を示す図である。 第一実施形態に係るプラグの他の変形例を示す図である。 図６に示すプラグの変形例の構成を示す図である。 本発明の第一実施形態に係るアレイ及びプラグの他の変形例を示す図である。 本発明の第一実施形態に係るアレイ及びプラグの他の変形例を示す図である。 本発明の第二実施形態に係るアレイ及びプラグの他の変形例を示す図である。 第二実施形態に係るアレイ及びプラグの変形例を示す図である。 本発明の第三実施形態に係るアレイ及びプラグの他の変形例を示す図である。 第三実施形態に係るアレイ及びプラグの変形例を示す図である。 本発明に用いるプラグの参考例の上面図（Ａ）、正面図（Ｂ）である。 図１４－１に示すプラグの断面図である。 本発明に用いるプラグが備える吸着性物質を示す図である。 本発明に用いる９６穴アレイの参考例の全体、開口の部分拡大、及び開口の底部に設けられたレセプタクルの部分拡大を示す図面代用写真である。 プラグを１個、又は２列であらかじめ連結された１６個で、アレイに挿入した様子を示す図面代用写真である。 プラグを１個、アレイに挿入した様子を示す図面代用写真である。 アレイに挿入された２列の連結プラグの一個の端部からピペットで溶媒を注入する様子を示す図面代用写真である。
　以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
　本発明に係る物質封入方法は、基板（以下「アレイ」とも称する）の表面に側壁によって互いに隔てられて形成された複数の凹部（以下「レセプタクル」とも称する）の少なくとも一部に微小物質を封入するための方法である。本発明に係る微小物質封入方法は、以下の手順（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）を含む。
（Ａ）アレイのレセプタクル形成面の上方に挿入体（以下「プラグ」とも称する）を配置し、該プラグと前記アレイとの相対的な位置を前記プラグに設けられた支持部により位置決めして、前記プラグの下面と前記アレイの前記レセプタクル形成面とを対向配置し、これによって前記プラグの下面と前記アレイの前記レセプタクル形成面との間に溶液導入空間を設け、かつ、
前記プラグの前記下面よりも上方であって、かつ前記アレイと前記プラグとの間、前記アレイ内及び／又は前記プラグ内に位置させて、前記溶液導入空間と連通する溶液排出空間を設ける手順（プラグ挿入手順）。
（Ｂ）前記微小物質と第一溶媒とを含む第一溶液を前記溶液導入空間内に導入する手順（物質導入手順）。
（Ｃ）前記第一溶媒と非混和性の第二溶媒を含む第二液体を前記溶液導入空間に導入し、該溶液導入空間内の前記第一液体を前記溶液排出空間へ排出して、これによって前記レセプタクル内に、前記第二液体で被覆されかつ前記微小物体を包含する、前記第一液体の液滴を形成する手順（物質封入手順）。
　また、本発明に係る微小物質検出方法は、上記のレセプタクル内に封入された微小物質を検出する方法であって、上記の微小物質封入方法の手順（Ａ）～（Ｃ）に加えて、以下の手順（Ｄ）を含む。
（Ｄ）前記液滴内に存在する前記微小物質を光学的、電気的及び／又は磁気的に検出する手順（検出手順）。
　以下、本発明に係る微小物質検出方法について説明する。本発明に係る微小物質封入方法及び微小物質検出用デバイスについては、微小物質検出方法に関する説明のなかで併せて説明する。
［検出対象物質］
　本発明に係る微小物質検出方法等において、検出対象となる微小物質（以下「ターゲット物質」とも称する）は、レセプタクルに収容可能な大きさの物質であれば特に限定されない。ターゲット物質は、核酸、タンパク質、糖、脂質及びこれらの複合体、並びにウイルス、細胞及び細胞内小器官等であってよい。また、ターゲット物質は、上記の物質に対する結合能を有する樹脂製又は金属製の粒子（ビーズ）であってよい。ターゲット物質は、各種の疾患又は感染症のマーカーとなり得る、核酸、タンパク質、糖、脂質及びこれらの複合体、並びに細胞及び細胞内小器官、あるいはこれらに対する結合能を有する担体であることが好ましい。
　核酸には、ＤＮＡ及びＲＮＡ等の天然核酸及びＬＮＡ及びＰＮＡ等の人工核酸が含まれ、これらの重合体も含まれる。また、細胞には、動物細胞、植物細胞及びバクテリア細胞などが含まれる。細胞内小器官には、リポソーム、エキソソーム及びミトコンドリアなどが含まれるものとする。
　ここで、「ビーズ」は、「粒子」と同義に用いられ、当技術分野において慣用の技術用語である。ビーズの形状は、特に限定されないが、通常球形とされる。ビーズの材料も、特に限定されず、ガラス、ケイ素、ゴム、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリスチレンデキストラン、架橋デキストラン（Sephadex（商標））、アガロースゲル（セファロース（商標））、シリカゲル、ラテックスゲル、アクリル樹脂、ビニルとアクリルアミドとのコポリマー、セルロース、ニトロセルロース、セルロース誘導体、ゼラチン及び磁性体などであってよい。ビーズは、多孔性であってもよい。ビーズは、平均粒子径５μｍ以下であることが好ましく、例えば１μｍ～４μｍ程度とされる。なお、「平均粒子径」とは、ここでは電子顕微鏡観察又は動的光散乱法を用いて測定した数値をいう。
　核酸、タンパク質、糖、脂質及びこれらの複合体、並びウイルス、細胞及び細胞内小器官等に対する結合能をビーズに付与するためには、例えばビーズに核酸に対する相補鎖を固定化したり、タンパク質等に対する抗体を固定化したりすればよい。これら核酸ハイブリダイゼーション反応や抗原抗体反応などの公知の分子間結合反応を利用して、ビーズにターゲット物質に対する結合能を付与できる。
　核酸鎖や抗体のビーズへの固定化は、従来公知の手法により行えばよい。例えば、ビーズの表面にある修飾基にリンカーを介して相補鎖や抗体を結合させればよい。アミノ基修飾ビーズであれば、その表面にあるアミノ基に、Ｎ－ヒドロキシスクシニミド（Ｎ―ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）等を持つ架橋剤を介して、核酸鎖や抗体を共有結合させることができる。
＜第一実施形態＞
［アレイ］
　本発明に係る微小物質検出方法に用いられるデバイスは、アレイとプラグとを含んでなる。図１及び図２（Ａ）に、アレイとプラグの構成を示す。アレイ１（図２（Ａ）参照）には、ウェル１１が形成されている。ウェル１１は、アレイ１に複数形成されていてもよい。ウェル１１の底面１１１には、ターゲット物質を収容する、複数のレセプタクル１１２が形成されている（以下、底面１１１を「レセプタクル形成面１１１」という）。各レセプタクル１１２は、側壁１１３によって互いに隔てられている。
　アレイ１は、ガラス製基板層のウェットエッチングやドライエッチング、またはプラスチック製基板層のナノインプリントや射出成型、切削加工などの公知の技術を用いて成形できる。アレイ１の材質は、ターゲット物質を光学的に検出する場合には、光透過性を有する材質とされ、例えばガラスや各種プラスチック（ＰＰ、ＰＣ、ＰＳ、ＣＯＣ、ＣＯＰ、ＰＤＭＳ等）とされる。アレイ１には、自家蛍光が少なく、波長分散が小さく、光学誤差の少ない材質を選択するのが好ましい。
　アレイ１には、ウェル１１が９６個設けられた市販の９６穴ウェルプレートを用いることができる。
　ウェル１１の大きさ（容積）及び形状は、プラグ２が嵌合可能であれば特に限定されない。ウェル１１の大きさは、例えば、レセプタクル形成面１１１の径で５～１０ｍｍ程度、典型的には７ｍｍ程度であり、深さ（図２（Ｂ）符号Ｈ参照）が１０～１２ｃｍ程度である。ウェル１１の形状は、ウェル１１及びプラグ２の成形のしやすさの観点から、円柱形あるいは角柱形であることが好ましい。
　各ウェル１１におけるレセプタクル１１２の配設数は、特に限定されないが、１０万～１００万個程度、好ましくは２０万～５０万個程度である。
　レセプタクル１１２の大きさ（容積）及び形状は、ターゲット物質を収容可能であればよい。レセプタクル１２の大きさは、例えば、底面の径が４～８μｍ程度、典型的には５μｍ程度であり、深さが６～１２μｍ程度であり、容積ではフェムトリットルオーダーである。
　ウェル１１の形状も、成形のしやすさの観点から、円柱形あるいは角柱形であることが好ましい。
［プラグ挿入手順］
　本手順では、アレイ１のレセプタクル形成面１１１の上方にプラグ２を配置し、プラグ２とアレイ１との相対的な位置をプラグ２に設けられた支持部により位置決めして、プラグ２の下面とアレイ１のレセプタクル形成面１１１とを対向配置し、これによってプラグ２の下面とアレイ１のレセプタクル形成面１１１との間に溶液導入空間を設ける。同時に、プラグ２の下面よりも上方であって、かつアレイ１とプラグ２との間に位置させて、溶液導入空間と液体が流通可能に連通する溶液排出空間を設ける。
　はじめに、ウェル１１の開口１１４からウェル１１空間内にプラグ２を挿入する（図１及び図２（Ｂ）参照）。ここでは、一対のウェル１１とプラグ２を示しているが、アレイ１は複数のウェル１１を有していてよく、この場合にはウェル１１の数に相応する数のプラグ２が用いられる。プラグ２は、脱着可能にウェル１１に挿入されてよい。
　プラグ２は、挿入方向の両端にフリンジを備えたボビン状形状を有し、ウェル１１空間内への挿入方向下端側に周設された第一フリンジ２３と、ウェル空間１１内への挿入時においてレセプタクル形成面１１１に対向し、かつレセプタクル形成面１１１と略同一形状を有する下面２２と、を備える。ここでは、第一フリンジ２３の下面と、下面２２とは、同一平面を構成する。
　また、プラグ２は、ウェル空間１１内への挿入時において下面２２を、ウェル底面１１１と接触しない位置に保持する支持部として、ウェル１１空間内への挿入方向上端側に周設された第二フリンジ２４を備える。
　上記ボビン状形状とは、プラグ２の第一フリンジ２３及び第二フリンジ２４との間（以下「プラグ２本体部」とも称する）が円柱形状であり、第一フリンジ２３及び第二フリンジ２４が円柱の両端のそれぞれから突出する円板形状に成形されていることを意味する。プラグ２本体部はテーパを有していてもよく、挿入方向下方に向かって小径となるテーパを有することが好ましい。
　プラグ２のウェル空間１１内への挿入時において、第二フリンジ２４は基板１に嵌合することが好ましい。これにより、一旦挿入したプラグ２が再び外れないようにすることで、誤操作をなくすとともに、プラグ２が不慮に外れてウェル空間１１内の溶液がこぼれ出すことによる汚染を防止できる。
　プラグ２は、上面２１にインレット２５１、下面２２にアウトレット２５２を有する溶媒導入路２５を備える。
　プラグ２の材質は、特に限定されないが、アレイ１と同様の材質であってよい。プラグ２は、プラスチックのナノインプリントや射出成型、切削加工などの公知の技術を用いて成形でき、３Ｄプリンターを用いて成形することもできる。
　プラグ２の第一フリンジ２３は、レセプタクル形成面１１１よりも小さい面積を有する。すなわち、プラグ２のウェル１１空間内への挿入方向からの第一フリンジ２３の投影面積は、レセプタクル形成面１１１の面積よりも小さい。このため、プラグ２１のウェル１１空間内への挿入時において、第一フリンジ２３とウェル１１の内壁との間には、間隙２３１が形成される。
　ウェル１１の直径は５～１０ｍｍ程度、典型的には７ｍｍ程度であり、プラグ２の第一フリンジ２３の直径（下面２２の直径）は、間隙２３１を形成するために、ウェル１１の直径より小さくされ、例えば５～３０％程度小さくされる。
　第一フリンジ２３は、プラグ２のウェル１１空間内への挿入時において、ウェル空間１１内を、レセプタクル形成面１１１と第一フリンジ２３との間に位置する溶液導入空間１１ａと、第一フリンジ２３と第二フリンジ２４との間に位置する溶液排出空間１１ｂとに区画する。溶液導入空間１１ａと溶液排出空間１１ｂは、第一フリンジ２３とウェル１１の内壁との間に形成された間隙２３１によって、液体流通可能に連絡する。
　ここで、プラグ２の下面２２は、その下方に位置する溶液導入空間１１ａと、上方に位置する溶液排出空間１１ｂとを区画するものであるという意味で「閾値レベル（threshold level）」を定義するものである。
　第二フリンジ２４は、プラグ２のウェル空間１１内への挿入時においてウェル１１の開口縁に係止し、下面２２を、レセプタクル形成面１１１と接触しない位置に保持する。このために、プラグ２の下面２２から第二フリンジ２４までの高さｈ（すなわち、溶液排出空間１１ｂの高さ）は、ウェル１１の深さＨよりも低くされている。
［物質導入手順］
　次に、溶液導入空間１１ａに、ターゲット物質３と第一溶媒とを含む第一溶液Ｓ１を導入する（図２（Ｃ）参照）。
　ここでは、ターゲット物質３ととともに、ターゲット物質３を吸光度変化及び／又は蛍光に基づいて光学的に検出するための発色基質４を導入する例を説明する。
　第一溶媒は、ターゲット物質３及び発色基質４を溶解又は懸濁するために適当な溶媒であればよく、核酸、タンパク質、糖、脂質及びこれらの複合体、並びウイルス、細胞及び細胞内小器官等を検出する際に通常用いられる溶媒が用いられる。第一溶液Ｓ１は、例えば、水、アルコール、エーテル、ケトン、ニトリル系溶媒、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、及びＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）からなる群より選択される少なくとも１つ又はこれを含む混合物などであってよく、好ましくは水である。アルコールとしては、例えばエタノール、メタノール、プロパノール、グリセリン等が挙げられる。エーテルとしては、例えばテトラヒドロフラン、ポリエチレンオキサイド、１，４－ジオキサン等が挙げられる。ケトンとしては、例えばアセトン、メチルエチルケトン等が挙げられる。ニトリル系溶媒としては、例えばアセトニトリル等が挙げられる。
　第一溶媒は、緩衝物質を含んでいてもよい。緩衝物質としては、特に限定されないが、蛍光色素のｐＫａにあわせてＭＥＳ（2-Morpholinoethanesulfonic acid）、ＡＤＡ（N-(2-Acetamido)iminodiacetic acid）、ＰＩＰＥＳ（Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid)）、ＡＣＥＳ（N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid）、ＢＥＳ（N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid）、ＴＥＳ（N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid）ＨＥＰＥＳ（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）等のいわゆるグッドバッファー（Good's Buffer）や、Ｔｒｉｓ（Tris(hydroxymethyl)aminomethane）、ＤＥＡ（Diethanolamine）等が用いられ得る。
　また、第一溶媒は、界面活性剤を含んでいてもよい。界面活性剤を含むことで、第一溶液Ｓ１は、溶液導入空間１１ａ及びレセプタクル１１２内へ導入され易くなる。界面活性剤としては、特に限定されないが、例えばＴＷＥＥＮ２０（ＣＡＳ番号：9005-64-5、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン）及びＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（ＣＡＳ番号：9002-93-1、一般名ポリエチレングリコールモノ－４－オクチルフェニルエーテル（n≒10））などが挙げられる。第一の溶媒２０への界面活性剤の添加濃度は、特に限定されないが、好ましくは０．０１～１％である。
　さらに、界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性イオン界面活性剤、天然由来の界面活性剤などを広く用いることができる。
　陰イオン性界面活性剤としては、例えば、カルボン酸型、硫酸エステル型、スルホン酸型、リン酸エステル型に分類される。このうち、具体的には、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリン酸ナトリウム、α-スルホ脂肪酸メチルエステルナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ドデシルエトキシレート硫酸ナトリウムなどが挙げられ、中でも、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを用いることが好ましい。
　陽イオン性界面活性剤としては、例えば、第四級アンモニウム塩型、アルキルアミン型、複素環アミン型に分類される。具体的には、例えば、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライド、ジステアリルジメチルアンモニウムクロライド、ジデシルジメチルアンモニウムクロライド、セチルトリピリジニウムクロライド、ドデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライドなどが挙げられる。
　非イオン界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、ポリオキシエチレンモノ脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、アルキルポリグリコシド、N-メチルアルキルグルカミドなどが挙げられる。中でも、ドデシルアルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、ラウロイルジエタノールアマイドの他、Triton X（Triton X-100など）、Pluronic（登録商標）（Pluronic F-123、F-68など）、Tween (Tween 20、40、60、65、80、85など)、Brij（登録商標）（Brij 35、58、98など）、Span (Span 20、40、60、80、83、85)の名前で市販されているものが好ましい。
　両性界面活性剤としては、例えば、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、ドデシルアミノメチルジメチルスルホプロピルベタイン、3-(テトラデシルジメチルアミニオ)プロパン-1-スルホナートなどがあるが、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホナート（CHAPS）、3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホナート（CHAPSO）などを用いることが好ましい。
　天然由来の界面活性剤としては、例えば、レシチン、サポニンが好ましく、レシチンとして称される化合物のうち、具体的には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロールなどが好ましい。また、サポニンとしてはキラヤサポニンが好ましい。
　ターゲット物質３と発色基質４を含む第一溶液Ｓ１は、プラグ２の溶媒導入路２５のインレット２５１から注入され、アウトレット２５２から溶液導入空間１１ａに導入される。
　第一溶液Ｓ１の導入量は、溶液導入空間１１ａの容積に応じて適宜設定され得るが、例えば１～５０μｌ程度、好ましくは５～２０μｌ程度である。
　溶媒導入路２５の径や形状は特に限定されない。例えば形状は円筒であってよく、その内径は１～５ｍｍ程度、典型的には２．５ｍｍ程度である。
　溶液導入空間１１ａに導入された第一溶液Ｓ１は、レセプタクル底面１１１とプラグ２の下面２２との間を毛管現象により進み、溶液導入空間１１ａに充填される（図２（Ｄ）参照）。これよって、ターゲット物質３と発色基質４がレセプタクル１１２内にも導入される。
　第一溶液Ｓ１中のターゲット物質３の濃度が低い場合、各レセプタクル１１２には、ターゲット物質３が１分子導入されるか全く導入されないかのどちらかとなる。発色基質４は、ターゲット物質３の濃度に比して十分に高い濃度で第一溶液Ｓ１中に含まれることが好ましい。したがって、発色基質４は、ほとんど全てのレセプタクル１１２に１分子あるいは２分子以上導入される。
［物質封入手順］
　本手順では、溶液導入空間１１ａに、第一溶液Ｓ１と非混和性の第二溶媒を含む第二溶液Ｓ２を導入する（図２（Ｅ）参照）。これによって、溶液導入空間１１ａ内の第一液体Ｓ１を溶液排出空間１１ｂへ押し出して排出させ、レセプタクル１１２内に第一液体Ｓ１の液滴を形成する。この第一液体Ｓ１の液滴は、第二溶液Ｓ２で被覆されかつターゲット物質３と発色基質４を包含する。　
　第二溶媒は、第一溶液Ｓ１と非混和性であればよく、例えば飽和炭化水素、不飽和炭化水素、芳香族炭化水素、シリコーンオイル、ヘキサフルオロプロピレンエポキシド系ポリマー、ハイドロフルオロエーテル構造を持つポリマー、パーフルオロポリエーテル、三フッ化塩化エチレンポリマー及びパーフルオロカーボン構造を持つポリマーからなる群より選択される少なくとも１つ又はこれを含む混合物等を好適に用いることができる。飽和炭化水素としては、例えばアルカン、シクロアルカンなどが挙げられる。アルカンとしては、例えばデカン、ヘキサデカン等が挙げられる。不飽和炭化水素としては、例えばスクアレン等が挙げられる。芳香族炭化水素としては、例えばベンゼン、トルエン等が挙げられる。ヘキサフルオロプロピレンエポキシド系ポリマーとしては、例えば、Krytox143（デュポン社製）、Krytox GPL（デュポン社製）等が挙げられる。ハイドロフルオロエーテル構造を持つポリマーとしては、例えば、アサヒクリンＡＥ３０００（旭硝子社製）、Novec 7000（住友３Ｍ社製）等が挙げられる。パーフルオロカーボン構造を持つポリマーとしては、例えば、フロリナートFC-40、フロリナートFC-43（住友３Ｍ社製）等が挙げられる。
　好ましくは、第二溶媒は、第一溶媒あるいはこれを含む第一溶液Ｓ１よりも比重の高いものが用いられる。
　第二溶液Ｓ２は、プラグ２の溶媒導入路２５のインレット２５１から注入され、アウトレット２５２から溶液導入空間１１ａに導入される。
　第二溶液Ｓ２の導入量は、溶液導入空間１１ａの容積に応じて適宜設定され得るが、第一溶液Ｓ１の導入量の１．１～５倍程度、好ましくは１．５～２倍程度とされる。
　溶液導入空間１１ａに導入された第二溶液Ｓ２は、レセプタクル形成面１１１とプラグ２の下面２２との間を毛管現象により進む。このとき、溶液導入空間１１ａ内に充填されていた第一溶液Ｓ１は、間隙２３１を通って溶液排出空間１１ｂへ押し出され、第二溶液Ｓ２に置換される。これよって、レセプタクル１１２内に、第二溶液Ｓ２で被覆された、発色基質４を含む第一溶液Ｓ１の液滴Ｄが形成される（図２（Ｆ）参照）。レセプタクル１１２に形成された液滴Ｄのうち一定の割合には、発色基質４とともにターゲット物質３が封入される。
　溶液排出空間１１ｂの容積は、溶液導入空間１１ａ内及びレセプタクル１１２内に保持された第一液体Ｓ１のうち、溶液導入空間１１ａ内に保持された第一液体Ｓ１を受容し得るのに十分な容積とされる。溶液排出空間１１ｂの容積は、溶液導入空間１１ａの容積及びレセプタクル１１２の数・容積並びに第一液体Ｓ１の導入量に応じて適宜設定され得る。
　次の検出手順では、液滴Ｄ内に存在するターゲット物質３を光学的、電気的及び／又は磁気的に検出する。ここで説明する例は、発色基質４の吸光度変化及び／又は蛍光を検出することによってターゲット物質３を光学的に検出するものであるが、より具体的に、ターゲット物質３が、発色基質４に対する基質切断活性を有する酵素を表面又は内部に有するウイルスであって、発色基質４が、該酵素により切断されて発色団としての反応生成物を遊離させる物質である場合を例として説明する。ただし、発色基質４は、酵素との反応後に反応前とは異なる光学特性を有する反応生成物を生成するものであればよく、反応前後で吸光度や旋光度が変化する物質や、反応後に蛍光を呈するようになる物質であってもよい。
　このようなウイルスと酵素の組み合わせとしては以下が例示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　レセプタクル１１２に形成された液滴Ｄ中では、極小容積中で共存する、ターゲット物質３（ウイルス）の粒子表面又は内部に存在する酵素と発色基質４との反応が進行し、反応生成物が生成する。図３を参照して詳しく説明する。ウイルスの粒子表面又は内部には酵素３１が存在している（図には酵素３１がウイルス表面に存在する場合を示した）。発色基質４が、酵素３１と接触し反応すると、反応生成物６が生成する。発色生成物６は、発色基質４と異なる光学特性を示し、吸光度や旋光度のシフトや、蛍光（又は発光）を示す。
　酵素３１と発色基質４との反応によって液滴Ｄの極小容積中に反応生成物６が生成、蓄積される。これによって、次の検出手順において検出可能な濃度にまで反応生成物６の生成が迅速に進むため、反応生成物６の高感度検出が可能とされる。
　ウイルスがインフルエンザウイルスであり（表１参照）、発色基質４に４－メチルウンベリフェリル－α－Ｄ－ノイラミン酸（４－Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ－Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－α－Ｄ－ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ　ａｃｉｄ：４ＭＵ－ＮＡＮＡ）を用いる場合を例にさらに具体的に説明する。
　インフルエンザウイルスの粒子表面にはノイラミニダーゼ（酵素３１）が存在している。４ＭＵ－ＮＡＮＡ（発色基質４）がノイラミニダーゼと接触し反応すると、４ＭＵ－ＮＡＮＡのノイラミニダーゼによる加水分解に由来して蛍光を呈する発色団として４－メチルウンベリフェロン（反応生成物６）が生成する。４－メチルウンベリフェロンは液滴Ｄの極小容積中に蓄積され、蓄積された４－メチルウンベリフェロンが増強された蛍光を発する。
　なお、反応生成物６は、本手順前にも、第一溶液Ｓ１中において発色基質４と酵素３１が接触すれば生成し得るものであるが、本手順においてターゲット物質３と発色基質４を包含する第一溶液Ｓ１の液滴Ｄが形成される前には、生成した反応生成物６が極小容積中に蓄積されることがない。このため、反応生成物６の検出において、本手順前に生成した反応生成物６の影響は無視できる程度に小さい。
［検出手順］
　本手順では、液滴Ｄ内に存在するターゲット物質３を光学的、電気的及び／又は磁気的に検出する（図２（Ｇ）参照）。ここで説明する具体例では、液滴Ｄ内に生成した反応生成物６（４－メチルウンベリフェロン）が発する蛍光を検出することにより、ターゲット物質３としてのインフルエンザウイルスを検出する。
　光学検出は、光源と、光源からの光をレセプタクル１１２内に集光しかつレセプタクル１１２内からの発生する光をセンサに集光する光学経路と、センサとを備える検出器７によって行うことができる。本発明に係る微小物質検出用デバイスは、アレイ１とプラグ２に加えて、検出器７を含んでいてもよい。光源からの光は、アレイ１の下方側（ウェル１１の開口面と逆面側）からレセプタクル１１２内に照射され、レセプタクル１１２内からの発生する光も同側から集光される。光源とアレイ１の間、及びアレイ１とＣＭＯＳイメージセンサ等のセンサとの間には、通常使用されるレンズやフィルタなどが配設される。
　また、本発明に係る微小物質検出用デバイスは、アレイ１の温度を制御する温度調節器を含んでいてもよい。温度調節器には、特許文献２に開示される加熱機構又は温度調節機構を採用できる。温度調節器は、例えばペルチェ素子やジュール・トムソン素子等により温度制御可能なヒートブロックであってよい。
　上述のとおり、反応生成物６は、物質封入手順前にも、第一溶液Ｓ１中に生成し得るものであるが、物質封入手順前に生成した反応生成物６の多くは、物質封入手順において、第二溶液Ｓ２によって溶液導入空間１１ａから溶液排出空間１１ｂに排出される。このため、本手順におけるアレイ１の下方側からの反応生成物６の検出において、物質封入手順前に生成した反応生成物６がノイズとなることがなく、液滴Ｄの極小容積中で生成、蓄積した反応生成物６からのシグナルを選択的に検出できる。溶液排出空間１１ｂに排出された反応生成物６からのノイズの検出を回避するため、プラグ２の第一フリンジ２３は光不透過性であることが好ましい。光透過性は、第一フリンジ２３あるいはこれを含むプラグ２全体を、不透明な材料により形成することにより付与できる。
　液滴Ｄ中の４－メチルウンベリフェロン（反応生成物６）の蛍光検出を行い、取得された蛍光強度と、予め作成した蛍光強度とノイラミニダーゼ活性との関係を規定した標準曲線とを用いてノイラミニダーゼの酵素活性を算出する。さらに、算出された酵素活性と、予め作成した酵素活性とウイルス粒子数との関係を規定した標準曲線を用いてインフルエンザウイルスの存在の有無の判定あるいは粒子数の定量を行う。これにより、ターゲット物質３としてのインフルエンザウイルスを検出することができ、ウイルス量を定量的に決定することもできる。
　上述の通り、第一溶液Ｓ１中において、ターゲット物質３が十分に低い濃度に希釈されている場合、１つのレセプタクル１１２に入るターゲット物質３の数は０又は最大で１となり得る。物質封入手順においては、第一溶液Ｓ１の液滴Ｄ中に反応生成物６を高濃度に蓄積させることができるため、ターゲット物質３としてのウイルスが１粒子のみレセプタクル１１２に入っている場合であっても、反応生成物６の検出を高感度に行うことができる。従って、本発明に係る物質検出方法によれば、ウイルス等のごく微量のターゲット物質３であっても高感度に検出でき、その存在量を高精度に決定することが可能となる。
　また、本工程では、ターゲット物質３が検出されたレセプタクル１１２の数と、ターゲット物質３が検出されないレセプタクル１１２の数との比率を用いて、予め作成した第一溶液Ｓ１中のターゲット物質３の濃度と当該比率との関係を規定した標準曲線に基づいて、ターゲット物質３の濃度を決定することもできる。
　本実施形態によれば、多数のウェル１１及びレセプタクル１１２を有する大面積のアレイ１を実現することが可能である。例えば、１００万個程度のレセプタクル１１２を有するアレイ１であっても、簡便な操作で効率よくターゲット物質３を各レセプタクル１１２に封入することが可能である。物質導入手順から物質封入手順までに要する時間は典型的には１分～１０分程度と非常に短く、操作は簡便である。
　実施形態によれば、ターゲット分子３を高感度に検出することができるため、１０ａＭ程度の非常に低濃度のターゲット分子３であっても検出することが可能となり、例えばＤｉｇｉｔａｌＥＬＩＳＡやＥＬＩＳＡ－ＰＣＲなどのアプリケーションに応用できる。
［第一実施形態の変形例］
　上述の第一実施形態では、プラグ２のウェル空間１１内への挿入時において下面２２をレセプタクル形成面１１１と接触しないように保持する支持部として、第二フリンジ２４が機能する例を説明した（図１及び図２（Ａ）参照）。本発明において、プラグ２の支持部は、図４及び図５（Ａ）に示すように、下面２２に配設された突起２６であってよい。突起２６の高さｈ（すなわち、溶液導入空間１１ａの高さ）は、ウェル１１の深さＨよりも低くされる。突起２６の数は特に限定されないが、安定的な位置決めを行うため、３～４個程度配設されることが好ましい。
　また、上述の第一実施形態では、プラグ２の下面２２が第一フリンジ２３の下面と同一平面を構成する例を説明した（図１及び図２（Ａ）参照）。本発明において、第一フリンジ２３は、図５（Ｂ）に示すように、プラグ２の挿入方向下端の近くに設けられていればよく、下方末端に位置する必要はないものとする。
　さらに、上述の第一実施形態では、ウェル１１の溶液導入空間１１ａと溶液排出空間１１ｂは、第一フリンジ２３とウェル１１の内壁との間に形成される間隙２３１によって、液体流通可能に連絡する例を説明した。本発明において、溶液導入空間１１ａと溶液排出空間１１ｂは、図６及び図７に示すように、プラグ２の第一フリンジ２３に設けられた切欠２３２によって、液体流通可能に連絡するように構成されてもよい。この場合、プラグ２の第一フリンジ２３は、レセプタクル形成面１１１よりも小さい面積を有する必要ない。切欠２３２の大きさと数は特に限定されないが、物質封入手順において、溶液導入空間１１ａに導入された第二溶液Ｓ２によって押し出された第一溶液Ｓ１が、切欠２３２を通って速やかに溶液排出空間１１ｂへ移動できるように十分な大きさと数で配設されることが好ましい。
　加えて、上述の第一実施形態では、物質導入手順において、プラグ２とアレイ１の間（具体的には、ボビン形状としたプラグ２の第一フリンジ２３と、第二フリンジ２４と、プラグ２本体部と、ウェル１１のプラグ２本体部へ対向する面とによって区画される領域）に位置する溶液排出空間１１ｂへ第一溶液Ｓ１が排出される例を説明した。本発明において、プラグ２は、第二フリンジ２４を欠く構成であってもよい（図８参照）。この場合にも、アレイ２のレセプタクル形成面１１１と、それに対向配置されたプラグ２の下面２２との間に溶液導入空間１１ａが形成される。そして、この場合、溶液導入空間１１ａに導入された第一溶液Ｓ１を排出するための溶液排出部１１ｂは、ウェル１１のプラグ２本体へ対向する面であって、かつプラグ２の下面２２よりも上方に位置する面を陥凹させて設けることができる。プラグ２の下面２２は、その下方に位置する溶液導入空間１１ａと、上方に位置する溶液排出空間１１ｂとを区画するものであるという意味で「閾値レベル（threshold level）」を定義する。
　本発明において、「アレイ１内に設けられた溶液排出部１１ｂ」とは、このようにウェル１１のプラグ２本体への対向面を一部陥凹させて設けられた溶液排出部１１ｂをも含むものとする。
　なお、プラグ２を第二フリンジ２４を欠く構成とする場合であっても、基板１のプラグ２へ対向する面を陥凹させることなく、溶液排出空間１１ｂをプラグ２とアレイ１の間に設けることも可能である（図９参照）。
＜第二実施形態＞
　上述の第一実施形態では、溶液排出空間１１ｂをプラグ２とアレイ１の間（具体的には、プラグ２本体部と、ウェル１１のプラグ２本体部への対向面とを含んで区画される領域）に設ける例を説明した。本発明において、「アレイ１内に設けられた溶液排出部１１ｂ」には、アレイ１において、プラグ２への対向面とは独立した領域に設けられていてもよい。ただし、この場合にも、溶液排出部１１ｂは、溶液導入空間１１ａと液体が流通可能に連通されていることが必要である。
　以下、図１０を参照して、第二実施形態に係る微小物質検出用デバイスを用いた微小物質封入方法を説明する。
［プラグ挿入手順］
　本手順では、アレイ１のレセプタクル形成面１１１の上方にプラグ２を配置し、プラグ２とアレイ１との相対的な位置をプラグ２に設けられた第二フリンジ２４により位置決めして、プラグ２の下面２２とアレイ１のレセプタクル形成面１１１とを対向配置し、これによってプラグ２の下面２２とアレイ１のレセプタクル形成面１１１との間に溶液導入空間１１ａを設ける。同時に、プラグ２の下面２２よりも上方であって、かつアレイ１内に位置させて、溶液導入空間１１ａと液体が流通可能に連通する溶液排出空間１１ｂを設ける。
　はじめに、第一実施形態と同様に、アレイ１のウェル１１の開口１１４からウェル１１空間内にプラグ２を挿入する。
　図１０に示すプラグ２は、第一フリンジ２３を欠く構成を採用している。ウェル空間１１内への挿入時において、第二フリンジ２４は、ウェル１１の開口縁に係止し、下面２２をレセプタクル形成面１１１と接触しない位置に保持する。また、ウェル空間１１内への挿入時において、プラグ２の下面２２は、レセプタクル形成面１１１に対向し、レセプタクル形成面１１１との間に溶液導入空間１１ａを形成する。
　プラグ２のウェル空間１１内への挿入時において、第二フリンジ２４は基板１に嵌合することが好ましい。これにより、一旦挿入したプラグ２が再び外れないようにすることで、誤操作をなくすとともに、プラグ２が不慮に外れてウェル空間１１内の溶液がこぼれ出すことによる汚染を防止できる。
［物質導入手順］
　次に、溶液導入空間１１ａに、ターゲット物質３と第一溶媒とを含む第一溶液Ｓ１を導入する。
　ターゲット物質３と発色基質４を含む第一溶液Ｓ１は、プラグ２の溶媒導入路２５のインレット２５１から注入され、アウトレット２５２から溶液導入空間１１ａに導入される。溶液導入空間１１ａに導入された第一溶液Ｓ１は、レセプタクル底面１１１とプラグ２の下面２２との間を毛管現象により進み、溶液導入空間１１ａに充填される。これよって、ターゲット物質３と発色基質４がレセプタクル１１２内に導入される。好ましくは、ターゲット物質３は各レセプタクル１１２内に１個ずつ導入される。
［物質封入手順］
　第一実施形態と同様に必要に応じて冷却手順を行った後、溶液導入空間１１ａに、第一溶液Ｓ１と非混和性の第二溶媒を含む第二溶液Ｓ２を導入する。
　本実施形態に係るアレイ１では、プラグ２の下面２２よりも下方において溶液導入空間１１ａと連通している領域が設けられており、当該領域のうちプラグ２の下面２２よりも下方は、溶液導入空間１１ａと一体をなす。当該領域はアレイ１の上方への拡張されており、該領域のプラグ２の下面２２よりも上方が溶液排出空間１１ｂとして機能する。プラグ２の下面２２は、その下方に位置する溶液導入空間１１ａと、上方に位置する溶液排出空間１１ｂとを区画するものであるという意味で「閾値レベル（threshold level）」を定義する。
　なお、図１０では、溶液排出空間１１ｂをアレイ１内に４つ設ける場合を示したが、溶液排出空間１１ｂの数は特に限定されない。
　第二溶液Ｓ２は、プラグ２の溶媒導入路２５のインレット２５１から注入され、アウトレット２５２から溶液導入空間１１ａに導入される。溶液導入空間１１ａに導入された第二溶液Ｓ２は、レセプタクル形成面１１１とプラグ２の下面２２との間を毛管現象により進む。このとき、溶液導入空間１１ａ内に充填されていた第一溶液Ｓ１は、溶液排出空間１１ｂへ押し出され、第二溶液Ｓ２に置換される。これよって、レセプタクル１１２内に、第二溶液Ｓ２で被覆された、発色基質４を含む第一溶液Ｓ１の液滴Ｄが形成される（図１０参照）。
［第二実施形態の変形例］
　上述の第二実施形態においては、溶液排出空間１１ｂをアレイ１内に加えて、プラグ２とアレイ１の間に設けてもよい（図１１参照）。
＜第三実施形態＞
　さらに、本発明において、溶媒排出空間１１ｂは、プラグ２内に設けられていてもよい。この場合、溶液排出部１１ｂは、プラグ２のウェル１１空間内への挿入時において、溶液導入空間１１ａと液体が流通可能に連通するように構成される。
　以下、図１２を参照して、第三実施形態に係る微小物質検出用デバイスを用いた微小物質封入方法を説明する。
［プラグ挿入手順］
　本手順では、アレイ１のレセプタクル形成面１１１の上方にプラグ２を配置し、プラグ２とアレイ１との相対的な位置をプラグ２に設けられた突起２６により位置決めして、プラグ２の下面２２とアレイ１のレセプタクル形成面１１１とを対向配置し、これによってプラグ２の下面２２とアレイ１のレセプタクル形成面１１１との間に溶液導入空間１１ａを設ける。同時に、プラグ２の下面２２よりも上方であって、かつプラグ２内に位置させて、溶液導入空間１１ａと液体が流通可能に連通する溶液排出空間１１ｂを設ける。
　はじめに、第一実施形態と同様に、アレイ１のウェル１１の開口１１４からウェル１１空間内にプラグ２を挿入する。
　図１２に示すプラグ２は、第一フリンジ２３を欠く構成を採用している。また、プラグ２は、ウェル空間１１内への挿入時において下面２２をレセプタクル形成面１１１と接触しないように保持する支持部として、下面２２に配設された突起２６を採用している。ウェル空間１１内への挿入時において、プラグ２の下面２２は、レセプタクル形成面１１１に対向し、レセプタクル形成面１１１との間に溶液導入空間１１ａを形成する。
　プラグ２のウェル空間１１内への挿入時において、第二フリンジ２４は基板１に嵌合することが好ましい。これにより、一旦挿入したプラグ２が再び外れないようにすることで、誤操作をなくすとともに、プラグ２が不慮に外れてウェル空間１１内の溶液がこぼれ出すことによる汚染を防止できる。
［物質導入手順］
　次に、溶液導入空間１１ａに、ターゲット物質３と第一溶媒とを含む第一溶液Ｓ１を導入する。
　ターゲット物質３と発色基質４を含む第一溶液Ｓ１は、プラグ２の溶媒導入路２５のインレット２５１から注入され、アウトレット２５２から溶液導入空間１１ａに導入される。溶液導入空間１１ａに導入された第一溶液Ｓ１は、レセプタクル底面１１１とプラグ２の下面２２との間を毛管現象により進み、溶液導入空間１１ａに充填される。これよって、ターゲット物質３と発色基質４がレセプタクル１１２内に導入される。
［物質封入手順］
　第一実施形態と同様に必要に応じて冷却手順を行った後、溶液導入空間１１ａに、第一溶液Ｓ１と非混和性の第二溶媒を含む第二溶液Ｓ２を導入する。
　本実施形態に係るプラグ２には、ウェル空間１１内への挿入時において溶液導入空間１１ａに連通する領域が設けられており、当該領域のうちプラグ２の下面２２よりもよりも上方が溶液排出空間１１ｂとして機能する。プラグ２の下面２２は、その下方に位置する溶液導入空間１１ａと、上方に位置する溶液排出空間１１ｂとを区画するものであるという意味で「閾値レベル（threshold level）」を定義する。
　なお、プラグ２に設けられる溶液排出空間１１ｂの数は特に限定されない。
　第二溶液Ｓ２は、プラグ２の溶媒導入路２５のインレット２５１から注入され、アウトレット２５２から溶液導入空間１１ａに導入される。溶液導入空間１１ａに導入された第二溶液Ｓ２は、レセプタクル形成面１１１とプラグ２の下面２２との間を毛管現象により進む。このとき、溶液導入空間１１ａ内に充填されていた第一溶液Ｓ１は、溶液排出空間１１ｂへ押し出され、溶液導入空間１１ａ内の第一溶液Ｓ１は第二溶液Ｓ２に置換される。これよって、レセプタクル１１２内に、第二溶液Ｓ２で被覆された、発色基質４を含む第一溶液Ｓ１の液滴Ｄが形成される（図１２参照）。
［第三実施形態の変形例］
　上述の第三実施形態においては、溶液排出空間１１ｂをプラグ２内に加えて、プラグ２とアレイ１の間に設けてもよい（図１３参照）。
　本発明に用いるプラグの参考例の上面図を図１４（Ａ）に、正面図を図１４（Ｂ）、断面図を図１４（Ｃ）に示す。本参考例のプラグは３Dプリンター法によって製造したものである。挿入方向を軸とした場合、プラグの軸体部は挿入方向（アレイが位置する方向）に向けて徐々に細く形成され、全体としてテーパー状になっている。プラグの両端にフリンジ２３，２４が備えられており全体としてボビン構造を有している。プラグの上側フリンジ（第２フリンジ２４）は、開口への挿入時にアレイに対する支持部となる。上側フリンジの下部側に薄い段差が備えられ、その段差部がアレイの丸形状を持つ開口と嵌合され、その後の一連の操作に支障が生じない程度にアレイの開口に自重で半固定される。プラグはアレイの開口に容易に挿入できる。段差部は排出空間に排出された溶媒が上側フリンジの側部から外部に漏れ出すことを防いでいる。
　標準的な９６穴アレイに適合し得るプラグの一例の機械的寸法は以下の通りである。プラグの上側フリンジは外径直径が約８．３ｍｍの薄い円筒形状で、上側フリンジの厚みは約２ｍｍである。下側フリンジ（第１フリンジ２３）は、その上面部より下面部の外径直径が大きく、その側面部が僅かにテーパー状を示すように形成されている。下側フリンジの最下面の外径直径は約５．９ｍｍ、最上面の外径直径は約５．４ｍｍである。下側フリンジの厚みは約１ｍｍである。上側フリンジ下部の段差部を除き、上側フリンジの最下面と下側フリンジの最上面との間の距離は約１０．９ｍｍである。プラグ全体の軸方向における長さは約１３．９ｍｍである。本発明に係わるプラグを標準的な３８４穴アレイに用いる場合には、上記の機械的寸法を開口のサイズに合わせてそれぞれ縮小し設定すればよい。
　プラグには、上側フリンジの中央部から軸体部の中心を通るテーパー状の貫通穴が形成されており、第１溶液や第２溶液などの溶媒導入路２５として機能する。上側フリンジの上面部における貫通穴の直径は約２．５ｍｍである。プラグの最下面から約３．８ｍｍの距離の位置（内径変更点）までは、上側フリンジの最上面から最下面に向かって貫通孔の内径が徐々に細くなっており、貫通孔は全体としてテーパー状に形成されている。上記の内径変更点から下側フリンジの最下面までは、貫通孔は円柱形状となっている。上側フリンジの最上面における穴部が、溶媒などを導入するためのインレット２５１、下側フリンジの最下面における穴部が溶媒等を溶液導入空間に導入するためのアウトレット２５２となる。本参考例のプラグの場合、プラグの軸体部がフリンジ部よりかなり細く形成されており、アレイの開口の内壁との間にやや広めの体積を持つ溶媒排出空間が軸体部の周りに形成されることになる。
　プラグがアレイの開口に挿入され、上側フリンジ下部の段差部で開口と嵌合して半固定される。プラグの開口への挿入は手操作によって一個単位でもよいし、治具を用いて複数個を同時に挿入することもできる。また、ロボットシステムによってアレイの複数列や９６穴の全体に対して、プラグを同時に挿入することもできる。被検査物が感染性の病原体を含む場合は、オペレータや外部環境を汚染することを防止するために、プラグの操作を自動化することが好ましい。また、感染性の病原体を含む溶媒を溶媒導入空間から排出空間に排出した際、当該溶媒がアレイの開口の外部に漏れ出すことは問題となる。この不具合を抑止するために、プラグ２の軸体部の外側に、吸着性物質５をあらかじめ設けることが好ましい。そこに、溶液導入空間から排出空間に排出されてきた当該溶媒を吸着させることができるからである（図１５参照）。
　プラグの材質は３Ｄプリンター法による成形加工が容易な熱可塑性樹脂または熱硬化性樹脂を用いることができる。ポリプロピレ（ＰＰ）、ＡＢＳ樹脂、ポリカーボネートなどがある。また、汎用的な樹脂射出成形法でプラグを製造することもできる。このように、プラグの材料は、成形後に所定の剛性を持ち、精密成型に適しており、さらに、耐熱性、低吸着性、低透湿性、対薬品性などの所定の物性を持つことが好ましい。また、医薬・バイオ用途での使用が認められていることが特に好ましい。例えば、医薬・バイオ関係の用途では環状オレフィンポリマー（COP）が良く知られている。さらに、高耐熱性であって滅菌処理に適しているＰＰＳＵ／ＰＰＳＦ樹脂なども好適である。
　本発明においては、溶媒に含まれている被検査物の数を光学的に高精度で検出するため、プラグは用いる光波長において遮光性または光吸収性を示すことが望ましい。特に、アレイの下側からレセプタクル内の被検査物を光計測することが主となる。そのため、プラグの下側フリンジは黒色であることが好適である。本参考例では黒色の熱可塑性樹脂材料が用いられている。
　本発明には、９６穴、３８４穴等の典型的な穴数と配置構成を持つアレイを採用できる。その開口の全体形状は基本的には平底型である。アレイの表面は平坦性があり液体を流動させるのに適している。アレイの平面方向における開口の形状は円形であって被検査物を含む溶媒やビーズを捕捉するのに適している。また、捕捉した被検査物を含む溶媒やビーズを高精度で検出するため、開口の底部に設けられた無数のレセプタクルの全体を短時間で計測することが必要である。その光学的計測をする際、プラグやアレイ自体から発せされる不要光などのバックグラウンドノイズが低いことが重要となる。
　さらに、一つの開口の体積は１～４００μＬ程度である。アレイの材料としてはポリプロピレン、ポリスチレン、ＣＯＰなどの樹脂があげられる。中でも、医薬・バイオ用途に適した材料を用いることが好ましい。一つの開口の外径は７ｍｍ、深さが１０～１２ｍｍ程度である。例えば、あるアレイの外径は、１２６×８５×２０ｍｍで矩形の矩形形状をなすものが良く知られている。
　さらに、個々の開口の底部には微小なレセプタクルが設けられている。その穴径は底部の表面で約４～８μｍ、標準的には５μｍである。また、一つのレセプタクルの深さは約６～１２μｍである。一つのレセプタクルの容積はフェムトリットル・サイズである。
　本発明に用いることができる８×１６の９６穴アレイの一例を説明する。アレイ全体と、その開口の部分拡大写真、および開口の底部に設けられたレセプタクルの部分拡大写真を図１６に示す。多数のレセプタクルが幾何学的に配列されており、その一つのサイズ（直径）や配列ピッチまたは配列密度に応じて、一つの開口当たりに何十万個のレセプタクルが配置され得る。本参考例ではレセプタクルが一列毎にサイズの半分だけずらして配置された千鳥状となっている。
　本発明において、アレイに対してプラグを手操作で挿入することができる。実験室内での実験や単発の実験に適している。または、手操作と挿入用の専用装置を用いて、９６穴に対して９６個のプラグを半自動的に挿入することもできる。図１７に、２列分のプラグがあらかじめ連結され、その１６個を一体としてアレイに挿入した様子を示す。他の一箇所は手操作で一個のプラグを挿入したものである。図１８にはアレイの開口に一個のプラグが挿入された状態をアレイの横方向から撮影した写真を示す。
　図１９は、アレイに挿入された２列の連結プラグの一個の端部からピペットで溶媒を注入する様子を示す写真である。プラグは、アレイの開口に挿入された後は、プラグの上部フリンジによって支持され左右方向に揺動することなく、しっかりアレイに固定されている。さらにプラグの中央に設けられたインレットから第１の液体、その後、第２の液体を順次注入する。アレイには特許文献２のように加熱・冷却手段を付設してもよい。あるいは、アレイとプラグの処置を自動的に行うロボットシステムを構築し、自動的な処理をすることもできる。
１：アレイ、１１：ウェル、１１ａ：下方空間、１１ｂ：上方空間、１１１：レセプタクル形成面、１１２：レセプタクル、１１３：側壁、１１４：開口、２：プラグ、２１：上面、２２：下面、２３：第一フリンジ、２３１：間隙、２３２：切欠、２４：第二フリンジ、２５：溶媒導入路、２５１：インレット、２５２：アウトレット、２６：突起、３：ターゲット物質、３１：酵素、４：発色基質、５：吸着性物質、６：反応生成物、７：検出器、Ｄ：液滴、Ｓ１：第一溶液、Ｓ２：第二溶液

Claims (29)

  1. 　基板の表面に互いに隔てられて形成された複数の凹部の少なくとも一部に微小物質を封入する方法であって、
    （１）前記基板の凹部形成面の上方に挿入体を配置し、該挿入体と前記基板との相対的な位置を前記挿入体に設けられた支持部により位置決めして、前記挿入体の下面と前記基板の前記凹部形成面とを対向配置し、これによって前記挿入体の下面と前記基板の前記凹部形成面との間に溶液導入空間を設け、かつ、
    前記挿入体の前記下面よりも上方であって、かつ前記基板と前記挿入体との間、前記基板内及び／又は前記挿入体内に位置させて、前記溶液導入空間と連通する溶液排出空間を設ける、第一手順と、
    （２）前記微小物質と第一溶媒とを含む第一溶液を前記溶液導入空間内に導入する第二手順と、
    （３）前記第一溶媒と非混和性の第二溶媒を含む第二液体を前記溶液導入空間に導入し、前記溶液導入空間と前記凹部内とに導入された前記第一溶媒のうち前記溶液導入空間に導入された前記第一溶媒を前記溶液排出空間へ排出して、これによって前記凹部内に、前記第二液体で被覆されかつ前記微小物質を包含する、前記第一液体の液滴を形成する第三手順と、を含む方法。
  2. 　前記第一手順において、前記溶液排出空間を、前記挿入体の前記下面よりも上方であって、かつ前記基板と前記挿入体との間に設ける、請求項１記載の方法。
  3. 　前記第一手順において、前記溶液排出空間を、前記挿入体の前記下面よりも上方であって、かつ前記基板内に設ける、請求項１記載の方法。
  4. 　前記第一手順において、前記溶液排出空間を、前記挿入体の前記下面よりも上方であって、かつ前記基板と前記挿入体との間及び前記基板内に設ける、請求項１記載の方法。
  5. 　前記第一手順において、前記溶液排出空間を、前記挿入体の前記下面よりも上方であって、かつ前記挿入体内に設ける、請求項１記載の方法。
  6. 　前記第一手順において、前記溶液排出空間を、前記挿入体の前記下面よりも上方であって、かつ前記基板と前記挿入体との間及び前記挿入体内に設ける、請求項１記載の方法。
  7. 　前記第二手順において、前記第一溶液を、前記挿入体及び／又は前記基板に形成され、前記溶液導入空間にアウトレットを有する流路を通じて、前記溶液導入空間に導入する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　前記挿入体は挿入方向の両端にフリンジを備えたボビン状形状を有し、
    該挿入体の前記下面は、前記基板の前記凹部形成面と略同一形状を有する第一フリンジとされ、
    該第一フリンジは、前記基板の前記凹部形成面の上方空間を、該該第一フリンジと前記凹部形成面との間に位置する前記溶液導入空間と、該第一フリンジよりも上方に位置する前記溶液排出空間とに、両空間を区画する、
    請求項２記載の方法。
  9. 　前記第二手順と前記第三手順との間に、前記ウェルが形成された基板の温度を制御する手順をさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　基板の表面に互いに隔てられて形成された複数の凹部の少なくとも一部に微小物質を封入する方法であって、
    （Ａ）挿入体を、前記基板の凹部形成面の上方に、該挿入体の下面と前記基板の前記凹部形成面とが対向するように配置し、これによって形成される前記挿入体の下面と前記基板の前記凹部形成面との間の溶液導入空間に、前記微小物質と第一溶媒とを含む第一溶液を導入する手順と、
    （Ｂ）前記第一溶媒と非混和性の第二溶媒を含む第二液体を前記溶液導入空間に導入し、前記溶液導入空間と前記凹部内とに導入された前記第一溶媒のうち前記溶液導入空間に導入された前記第一溶媒を、前記溶液導入空間と連通する溶液排出空間へ排出して、これによって前記凹部内に、前記第二液体で被覆されかつ前記微小物質を包含する、前記第一液体の液滴を形成する手順と、を含む方法。
  11. 　基板の表面に互いに隔てられて形成された複数の凹部の少なくとも一部に封入された微小物質を検出する方法であって、
    （１）前記基板の凹部形成面の上方に挿入体を配置し、該挿入体と前記基板との相対的な位置を前記挿入体に設けられた支持部により位置決めして、前記挿入体の下面と前記基板の前記凹部形成面とを対向配置し、これによって前記挿入体の下面と前記基板の前記凹部形成面との間に溶液導入空間を設け、かつ、
    前記挿入体の前記下面よりも上方であって、かつ前記基板と前記挿入体との間、前記基板内及び／又は前記挿入体内に位置させて、前記溶液導入空間と連通する溶媒排出空間を設ける、第一手順と、
    （２）前記微小物質と第一溶媒とを含む第一溶液を前記溶液導入空間内に導入する第二手順と、
    （３）前記第一溶媒と非混和性の第二溶媒を含む第二液体を前記溶液導入空間内に導入し、前記溶液導入空間と前記凹部内とに導入された前記第一溶媒のうち前記溶液導入空間に導入された前記第一溶媒を前記溶液排出空間へ排出して、これによって前記凹部内に、前記第二液体で被覆されかつ前記微小物質を包含する、前記第一液体の液滴を形成する第三手順と、
    （４）前記液滴内に存在する前記微小物質を光学的、電気的及び／又は磁気的に検出する第四手順と、
    を含む方法。
  12. 　基板の表面に互いに隔てられて形成された複数の凹部の少なくとも一部に封入された微小物質を発色基質の吸光度変化及び／又は蛍光に基づいて光学的に検出する方法であって、
    （１）前記基板の凹部形成面の上方に挿入体を配置し、該挿入体と前記基板との相対的な位置を前記挿入体に設けられた支持部により位置決めして、前記挿入体の下面と前記基板の前記凹部形成面とを対向配置し、これによって前記挿入体の下面と前記基板の前記凹部形成面との間に溶液導入空間を設け、かつ、
    前記挿入体の前記下面よりも上方であって、かつ前記基板と前記挿入体との間、前記基板内及び／又は前記挿入体内に位置させて、前記溶液導入空間と連通する溶媒排出空間を設ける、第一手順と、
    （２）前記微小物質と前記発色基質と第一溶媒とを含む第一溶液を前記溶液導入空間内に導入する第二手順と、
    （３）前記第一溶媒と非混和性の第二溶媒を含む第二液体を前記溶液導入空間に導入し、前記溶液導入空間と前記凹部内とに導入された前記第一溶媒のうち前記溶液導入空間に導入された前記第一溶媒を前記溶液排出空間へ排出して、これによって前記凹部内に、前記第二液体で被覆されかつ前記微小物質を包含する、前記第一液体の液滴を形成する第三手順と、
    （４）前記液滴内に存在する前記発色基質の吸光度変化及び／又は蛍光を検出する第四手順と、
    を含む方法。
  13. 　微小物質が封入される凹部が互いに隔てられて複数形成された表面を備える基板と、前記基板の凹部形成面の上方に配置される挿入体と、を含んでなる微小物質検出用デバイスであり、
    前記挿入体は、前記基板との相対的な位置を位置決めするための支持部を備え、
    前記基板の前記凹部形成面と、その上方に対向配置された前記挿入体の下面との間に溶液導入空間が設けられ、
    前記挿入体の前記下面よりも上方であって、かつ前記基板と前記挿入体との間、前記基板内及び／又は前記挿入体内に位置して、前記溶液導入空間と連通する溶液排出空間が設けられ、かつ、
    前記挿入体及び／又は前記基板に、前記溶液導入空間にアウトレットを有する流路が形成されている、デバイス。
  14. 　前記溶液導入空間内に保持された第一溶媒が、前記流路を通じて前記溶液導入空間内に導入される、前記第一溶媒と非混和性の第二溶媒に置換されて前記溶液排出空間へ排出され得るように構成された、請求項１３記載のデバイス。
  15. 　前記溶液導入空間内及び前記凹部内に保持された、前記微小物質と前記第一溶媒を含む第一液体のうち前記溶液導入空間内に保持された該第一液体が、前記流路を通じて前記溶液導入空間内に導入される、前記第一溶媒と非混和性の第二溶媒を含む第二液体によって前記溶液排出空間へ排出されて、前記凹部内に、前記第二液体で被覆されかつ前記微小物質を包含する、前記第一液体の液滴が形成されるように構成された、請求項１４記載のデバイス。
  16. 　前記溶媒排出空間が、前記挿入体の前記下面よりも上方であって、かつ前記基板と前記挿入体との間に設けられた、請求項１３記載のデバイス。
  17. 　前記溶媒排出空間が、前記挿入体の前記下面よりも上方であって、かつ前記基板内に設けられた、請求項１３記載のデバイス。
  18. 　記溶媒排出空間が、前記挿入体の前記下面よりも上方であって、かつ前記基板と前記挿入体との間及び前記基板内に設けられた、請求項１３記載のデバイス。
  19. 　前記溶媒排出空間が、前記挿入体の前記下面よりも上方であって、かつ前記挿入体内に設けられた、請求項１３記載のデバイス。
  20. 　前記溶媒排出空間が、前記挿入体の前記下面よりも上方であって、かつ前記基板と前記挿入体との間及び前記挿入体に設けられた、請求項１３記載のデバイス。
  21. 　前記挿入体は挿入方向の両端にフリンジを備えたボビン状形状を有し、
    該挿入体の前記下面は、前記基板の前記凹部形成面と略同一形状を有する第一フリンジとされ、
    該第一フリンジは、前記基板の前記凹部形成面の上方空間を、該第一フリンジと前記凹部形成面との間に位置する前記溶液導入空間と、該第一フリンジよりも上方に位置する前記溶液排出空間とに、両空間を区画する、請求項１３記載のデバイス。
  22. 　前記支持部は、前記挿入体の上端側に周設された第二フリンジであり、
    該第二フリンジは、前記基板の凹部形成面の上方への配置時において前記基板に係止し、前記挿入体の前記第一フリンジから該第二フリンジまでの高さが、前記溶液排出空間の高さである、請求項２１記載のデバイス。
  23. 　前記支持部は、前記挿入体の前記下面に配設された突起であり、
    前記突起の高さが、前記溶液導入空間の高さである、請求項２１記載のデバイス。
  24. 　前記凹部形成面の上方への配置時において、該第一フリンジと前記基板との間に形成される間隙が、前記溶液導入空間と前記溶液排出空間とを液体流通可能に連通する、請求項２１～２３のいずれか一項に記載のデバイス。
  25. 　前記挿入体の前記第一フリンジは、切欠を有し、
    前記凹部形成面の上方への配置時において、該切欠が、前記溶液導入空間と前記溶液排出空間とを液体流通可能に連通する、請求項２０～２２のいずれか一項に記載のデバイス。
  26. 　前記挿入体が、少なくともその下面において光不透過性である、請求項１３～２５のいずれか一項に記載のデバイス。
  27. 　前記挿入体の前記基板の凹部形成面の上方への配置時において、前記支持部が前記基板に嵌合する、請求項１３～２６のいずれか一項に記載のデバイス。
  28. 　前記基板の温度を制御する温度調節器をさらに備える、請求項１３～２７のいずれか一項に記載のデバイス。
  29. 　前記凹部内に存在する前記微小物質を光学的、電気的及び／又は磁気的に検出する検出器をさらに備える、請求項１３～２８のいずれか一項に記載のデバイス。

     
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