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WO2018172587A1 - Compuestos inhibidores de cdc-7 y su uso para el tratamiento de patologías neurológicas - Google Patents

Compuestos inhibidores de cdc-7 y su uso para el tratamiento de patologías neurológicas Download PDF

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WO2018172587A1
WO2018172587A1 PCT/ES2018/070215 ES2018070215W WO2018172587A1 WO 2018172587 A1 WO2018172587 A1 WO 2018172587A1 ES 2018070215 W ES2018070215 W ES 2018070215W WO 2018172587 A1 WO2018172587 A1 WO 2018172587A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
alkyl
compound
use according
disease
mmol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/ES2018/070215
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ana Martinez Gil
Daniel I. PEREZ
Carmen GIL AYUSO-GONTÁN
Angeles MARTIN-REQUERO
Elisa ROJAS PRATS
Loreto MARTINEZ-GONZALEZ
Concepción PEREZ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Original Assignee
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC filed Critical Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
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Priority to US16/495,613 priority patent/US11446304B2/en
Priority to AU2018240527A priority patent/AU2018240527B2/en
Publication of WO2018172587A1 publication Critical patent/WO2018172587A1/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A61K31/52—Purines, e.g. adenine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia

Definitions

  • the present invention provides a series of purine-derived compounds that are CDC-7 inhibitors and useful as potential drugs for diseases mediated by TDP-43 proteinopathies, such as Alzheimer's disease, amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and frontotemporal dementia .
  • TDP-43 proteinopathies such as Alzheimer's disease, amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and frontotemporal dementia .
  • compositions are the adjuvants and vehicles known to those skilled in the art and commonly used in the elaboration of therapeutic compositions.
  • the pharmaceutical compositions are suitable for oral administration, in solid or liquid form.
  • Possible forms for oral administration are tablets, capsules, syrups or solutions and may contain conventional excipients known in the pharmaceutical field, as aggregating agents (eg syrup, acacia, gelatin, sorbitol, tragacanth or polyvinyl pyrrolidone), fillers (eg lactose, sugar, corn starch, calcium phosphate, sorbitol or glycine), disintegrants (eg starch, polyvinyl pyrrolidone or microcrystalline cellulose) or a pharmaceutically acceptable surfactant such as sodium lauryl sulfate.
  • aggregating agents eg syrup, acacia, gelatin, sorbitol, tragacanth or polyvinyl pyrrolidone
  • fillers eg lactose, sugar, corn starch, calcium phosphate, sorbitol or glycine
  • disintegrants eg starch, polyviny
  • the amount administered of a compound of the present invention will depend on the relative efficacy of the compound chosen, the severity of the disease to be treated and the weight of the patient. However, the compounds of this invention will be administered one or more times a day, for example 1, 2, 3 or 4 times daily, with a total dose between 0.1 and 1000 mg / kg / day. It is important to keep in mind that it may be necessary to introduce variations in the dose, depending on the age and condition of the patient, as well as modifications in the route of administration.
  • the compounds and compositions of the present invention can be used together with other medicaments in combination therapies.
  • the other drugs may be part of the same composition or of a different composition, for administration at the same time or at different times.
  • FIG. 1 Shows the linear correlation between the described and experimental permeability of 10 commercial compounds using the PAMPA methodology.
  • 6-Mercaptopurine monohydrate (300.0 mg, 1.76 mmol) and K 2 C0 3 (243.7 mg, 1.76 mmol) are dissolved in DMF (25 mL).
  • the reaction mixture is kept under stirring for 1 h at room temperature.
  • 1- (Chloromethyl) naphthalene (311.4 mg, 1.76 mmol) is added and kept under stirring overnight at room temperature.
  • the solvent is evaporated under reduced pressure and AcOEt (100 mL) is added.
  • the organic phase is washed with distilled water (3 x 100 mL) by adding a little NaCl. Dry over anhydrous Mg 2 S0 4 , filter and concentrate to dryness.
  • 6-Mercaptopurine monohydrate (300.0 mg, 1.76 mmol) and K 2 C0 3 (243.7 mg, 1.76 mmol) are dissolved in DMF (25 mL).
  • the reaction mixture is kept under stirring for 1 h at room temperature.
  • 4-Chlorobenzene bromide (362.3 mg, 1.76 mmol) is added and kept under stirring overnight at room temperature.
  • the solvent is evaporated under reduced pressure and AcOEt (100 mL) is added.
  • the Organic phase is washed with distilled water (3 x 100 ml_) by adding a little NaCl. Dry over anhydrous Mg 2 S0 4 , filter and concentrate to dryness.
  • the crude is purified by chromatographic column using (10: 1) as eluent.
  • 6-Mercaptopurine monohydrate (300.0 mg, 1.76 mmol) and K 2 C0 3 (243.7 mg, 1.76 mmol) are dissolved in DMF (25 ml_).
  • the reaction mixture is kept under stirring for 1 h at room temperature.
  • 3- (Trifluoromethyl) benzyl bromide (421.4 mg, 1.76 mmol) is added and kept under stirring overnight at room temperature.
  • the solvent is evaporated under reduced pressure and AcOEt (100 ml_) is added.
  • the organic phase is washed with distilled water (3 x 100 ml_) by adding a little NaCl. Be Dry over anhydrous, filter and concentrate to dryness.
  • the oil is
  • 6-Mercaptopurine monohydrate (300.0 mg, 1.76 mmol) and K 2 C0 3 (243.7 mg, 1.76 mmol) are dissolved in DMF (25 ml_).
  • the reaction mixture is kept under stirring for 1 h at room temperature.
  • 3-Chlorobenzyl bromide (362.3 mg, 1.76 mmol) is added and kept under stirring overnight at room temperature.
  • the solvent is evaporated under reduced pressure and AcOEt (100 ml_) is added.
  • the organic phase is washed with distilled water (3 x 100 ml_) by adding a little NaCl. It is dried over anhydrous, filtered and concentrated to dryness.
  • the oil is
  • 6-Mercaptopurine monohydrate (300.0 mg, 1.76 mmol) and K 2 C0 3 (243.7 mg, 1.76 mmol) are dissolved in DMF (25 ml_).
  • the reaction mixture is kept under stirring for 1 h at room temperature.
  • 3-iodobenzyl bromide 523.5 mg, 1.76 mmol is added and kept under stirring for 4 h at room temperature.
  • the solvent is evaporated under reduced pressure and AcOEt (100 mL) is added.
  • the organic phase Wash with distilled water (3 x 100 ml_) by adding a little NaCl. Dry over anhydrous Mg 2 S0 4 , filter and concentrate to dryness. It is not necessary to purify by chromatographic column.
  • 6-Mercaptopurine monohydrate (300.0 mg, 1.76 mmol) and K 2 C0 3 (243.7 mg, 1.76 mmol) are dissolved in DMF (25 ml_).
  • the reaction mixture is kept under stirring for 1 h at room temperature.
  • 3-Nitrobenzyl bromide (380.9 mg, 1.76 mmol) is added and kept stirring for 3 hours at room temperature.
  • the solvent is evaporated under reduced pressure and AcOEt (100 ml_) is added.
  • the organic phase is washed with distilled water (3 x 100 ml_) by adding a little NaCl. Dry over anhydrous Mg 2 S0 4 , filter and concentrate to dryness. It is not necessary to purify by chromatographic column.
  • 6-Mercaptopurine monohydrate (300.0 mg, 1.76 mmol) and K 2 CO 3 (243.7 mg, 1.76 mmol) are dissolved in DMF (25 mL).
  • the reaction mixture is kept under stirring for 1 h at room temperature.
  • 2-Chlorobenzyl bromide (362.3 mg, 1.76 mmol) is added and kept under stirring overnight at room temperature.
  • the solvent is evaporated under reduced pressure and AcOEt (100 mL) is added.
  • the organic phase is washed with distilled water (3 x 100 mL) by adding a little NaCl. Dry over anhydrous Mg 2 SO 4 , filter and concentrate to dryness.
  • the crude is purified by chromatographic column using CH 2 CI 2 / MeOH (10: 1) as eluent.
  • 6-Mercaptopurine monohydrate (300.0 mg, 1.76 mmol) and K 2 C0 3 (243.7 mg, 1.76 mmol) are dissolved in DMF (25 mL).
  • the reaction mixture is kept under stirring for 1 h at room temperature.
  • 4-Acetamidobenzyl chloride (323.8 mg, 1.76 mmol) is added and kept under stirring for 3 h and 30 min at room temperature.
  • the solvent is evaporated under reduced pressure and AcOEt (100 mL) is added.
  • the organic phase is washed with distilled water (3 x 100 mL) by adding a little NaCl. Dry over anhydrous Mg 2 S0 4 , filter and concentrate to dryness.
  • 6-mercaptopurine monohydrate (300.0 mg, 1.76 mmol) and K are dissolved 2 C0 3 (243.7 mg, 1.76 mmol) in DMF (25 mL).
  • the reaction mixture is kept under stirring. for 1 h at room temperature.
  • 4-Cyanobenzyl bromide 345.6 mg, 1.76 mmol
  • Be evaporate the solvent under reduced pressure and AcOEt (100 mL) is added.
  • the phase Organic is washed with distilled water (3 x 100 mL) by adding a little NaCl. Be dry over Mg 2 S0 4 anhydrous, filtered and concentrated to dryness.
  • 6-Mercaptopurine monohydrate (300.0 mg, 1.76 mmol) and K 2 C0 3 (243.7 mg, 1.76 mmol) are dissolved in DMF (25 ml_).
  • the reaction mixture is kept under stirring for 1 h at room temperature.
  • 4- (Methylthio) benzyl bromide (382.8 mg, 1.76 mmol) is added and kept under stirring overnight at room temperature.
  • the solvent is evaporated under reduced pressure and AcOEt (100 mL) is added.
  • the organic phase is washed with distilled water (3 x 100 mL) by adding a little NaCl. Dry over anhydrous Mg 2 S0 4 , filter and concentrate to dryness.
  • the crude is purified by chromatographic column using (10: 1) as eluent.
  • the method used is a non-radioactive enzyme inhibition assay using recombinant human CDC7. This is based on the luminometric quantification of the inhibition using the ADP-Glo TM Kinase Kit. In this test, the luminescent signal correlates positively with the amount of adenosine diphosphate (ADP) and the kinase activity. All compounds were evaluated at fixed concentration of 10 ⁇ . For those compounds with a percentage of inhibition greater than 50%, a dose-response study is carried out determining its Clso value (concentration of compound capable of 50% inhibiting CDC7 function).
  • Enzymatic inhibition studies of CDC7 were carried out using the promega kit: ADP-Glo TM Kinase Assay + CDC7 / DBF4 Kinase Enzyme System (catalog number V5089).
  • ATP and other reagents were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). The tests were performed in a buffer solution using 96-well plates. The compound to be tested (5 ⁇ L, 40 ⁇ dissolved in 4% DMSO) was added to each well followed by the enzyme (5 ⁇ L, 25 ng / well), ATP (5 ⁇ L, final concentration in the 10 ⁇ well) and PDKtidE (5 ⁇ L, 4 ⁇ / ⁇ ).
  • the LanthaScreen Eu kinase inhibition assay uses an Alexa Fluor TM marker that binds to a kinase and is detected by the addition of an Eu-labeled antibody.
  • the binding of the label and the antibody to the kinase results in a high degree of FRET, while the movement of the label by an inhibitor results in a loss of FRET.
  • this is a simple mixing and reading test, with no stages of development. This test method has been developed by "Life Technologies" and identifies competitive ATP kinase inhibitors, making them suitable for the detection of any compound that binds to the ATP site.
  • the compounds are evaluated in 1% DMSO (final) in the well.
  • Example 3 Prediction of the blood-brain barrier passage
  • BHE blood-brain barrier
  • PAMPA Parallel Artificial Membrane Permeability Assay
  • the donor plate was deposited on the acceptor forming a kind of "sandwich” and allowed to incubate for 2 h and 30 min at 25 ° C. In this way, the Compounds will pass from the donor plate to the acceptor plate through the porcine brain lipid by passive diffusion. After that time, the donor plate is carefully removed and the final concentration and absorbency of both commercial and synthesized compounds are determined. The results obtained are expressed as the average of the measurements [standard deviation (SD)] of the different experiments performed and are shown in table 2.
  • SD standard deviation
  • the cell line SH-SY5Y human neuroblastoma cultured at 37 ° C with 5% CO 2 in DMEM medium (Dulbecco 's Modified Eagle Medium) supplemented with L - glutamine (2 mM), 1% non - essential amino acids, 1% Penicillin / Streptomycin and 10% fetal bovine serum.
  • DMEM medium Dulbecco 's Modified Eagle Medium
  • L - glutamine 2 mM
  • non - essential amino acids 1% Penicillin / Streptomycin
  • Penicillin / Streptomycin 10% fetal bovine serum.
  • the cells were treated with CDC7 inhibitors (compounds 1 and 8) at different concentrations for 1, 30 hours post-addition of the causative agent of the phosphorylation of TPD-43; Ethacrynic acid (20 ⁇ ) (Sigma).
  • CDC7 inhibitors compounds 1 and 8
  • the cells after 24 h of incubation with ethacrynic acid were washed with PBS and subsequently cold lysed with lysis buffer (50mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCI, 50 mM NaF, 1% Nonidet P-40 and Protease and phosphatase inhibitors (Roche).
  • lysis buffer 50mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCI, 50 mM NaF, 1% Nonidet P-40 and Protease and phosphatase inhibitors (Roche).
  • the collected cell extracts were centrifuged for 10 minutes at 4,000 rpm. Protein quantification was performed with the Pierce BCA protein assay kit (Thermo Scientific).
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • the membrane was blocked with 5% bovine serum albumin (Sigma), and incubated for 12 hours with the following concentrations of primary antibodies (anti-phospho (S409 / 410) -TDP-43 human (1: 500) (22309-1 AP, Proteintech); a-tubulin (1: 1,000) (sc-23948, Santa Cruz Biotechnologies).

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Abstract

La presente invención se refiere a una serie de derivados de purina sustituidas que son capaces de inhibir la actividad de la quinasa CDC7, por lo que resultan útiles para el tratamiento de enfermedades neurológicas tales como la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis lateral amiotrófica o la demencia frontotemporal, entre otras, donde se produce una hiperfosforilación de TDP-43 y posterior formación de aglomerados inducida por la CDC7.

Description

COMPUESTOS INHIBIDORES DE CDC-7 Y SU USO PARA EL TRATAMIENTO DE
PATOLOGÍAS NEUROLÓGICAS DESCRIPCIÓN
La presente invención se refiere a una serie de derivados de purína sustituidas que son capaces de inhibir la actividad de la quinasa CDC7, por lo que resultan útiles para el tratamiento y/o prevención de enfermedades neurológicas tales como la esclerosis lateral amiotrófica, la enfermedad de Alzheimer o la demencia frontotemporal, donde se produce una hiperfosforilación de TDP-43 y posterior formación de aglomerados inducida por la CDC7.
ESTADO DE LA TÉCNICA La hiperactividad de quinases se produce en muchos tipos de enfermedades y particularmente en enfermedades neurodegenerativas y cáncer. La hiperfosforilación de la proteína TDP-43 induce la formación de agregados que se han detectado en pacientes con esclerosis lateral amiotrófica o con degeneración lobular frontotemporal. Se ha detectado que la quinasa CDC7 es responsable de la hiperfosforilación dual de la TDP-43 en las serinas 409/410 en ciertos modelos, por lo que la inhibición de esta CDC7 sería una estrategia interesante para desarrollar fármacos para enfermedades neurodegerativas, como por ejemplo esclerosis lateral amiotrófica (ELA) o con degeneración lobular frontotemporal (Lianchko, N. F. et al., Ann Neurol. 2013 74(1): 39-52). Existen otras enfermedades neurológicas mediadas también por TDP-43, como la encefalopatía traumática crónica y el deterioro cognitivo asociado a la edad (Iverson GL, et al., Neurosa Biobehav Rev. 2015 Sep; 56: 276-293; Nag S, et al., Neurology. 2017 Feb 14; 88(7): 653-660; Wilson RS, et al., JAMA Neurol. 2013 Nov; 70(11): 1418-1424). El documento US2013/0072506A1 describe derivados de purinas 6,8-disustituidas que son útiles para una serie de usos terapéuticos y cosméticos. Entre los posibles usos terapéuticos, se menciona el del tratamiento de la esclerosis múltiple o como fármacos antineurodegenerativos. El documento WO2007/124288A1 describe una sene de compuestos con un núcleo estructural de indazol que tienen la habilidad de inhibir la CDC-7 y que son útiles para el tratamiento de una enfermedad en la que esta quinasa está implicada, como por ejemplo el cáncer.
En ACS Med. Chem. Lett. 2013, 4, 211-215, Penning et al. describen un estudio sobre la interacción de compuestos derivados de azaindol con la CDC-7 y la posibilidad de usar estos compuestos en terapia contra el cáncer. El documento US2011/015172A1 describe una familia de pirrolpirazinas que son inhibidores de quinasas como la CDC-7 y su uso para el tratamiento de enfermedades asociadas a esta quinasa como el cáncer.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona una serie de compuestos derivados de purina que son inhibidores de CDC-7 y útiles como potenciales fármacos para enfermedades mediadas por proteinopatias de TDP-43, como por ejemplo la enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y demencia frontotemporal.
Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula (I)
Figure imgf000003_0001
O) donde:
G representa un grupo que se selecciona de entre arilo, heteroarilo o alquilo C1-C10, cualquiera de ellos opcionalmente sustituido por al menos un sustituyente seleccionado de entre CF3, alquilo C1-C6, S-alquilo C1-C6, halógeno, CN, O-alquilo C1- C6, NO2, COO-alquilo C1-C6, NHCO-alquilo C1-C6, NH2 y NH-alquilo C1-C6, u opcionalmente sustituido por dos sustituyentes formado un ciclo condensado al grupo G cuando es un arilo o un heteroarilo y
Z se selecciona de entre O ó S; o cualquiera de sus sales, solvatos o isómeros farmacéuticamente aceptables para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de patologías relacionadas con la proteína TDP-43, en particular con modificaciones post- traslacionales de TDP-43. Estos compuestos son inhibidores de CDC7 en la fosforilación de TDP-43.
En una realización preferida G es un grupo arilo opcionalmente sustituido por al menos un sustituyente seleccionado de entre CF3, alquilo C1-C6, S-alquilo C1-C6, halógeno, CN, O-alquilo C1-C6, NO2, COO-alquilo C1-C6, NHCO-alquilo C1-C6, NH2 y NH-alquilo C1-C6, u opcionalmente sustituido por dos sustituyentes formado un ciclo condensado al grupo arilo, más preferiblemente el grupo arilo es un fenilo que puede estar opcionalmente sustituido y el compuesto de fórmula (I) sería el compuesto de fórmula (II):
Figure imgf000004_0001
donde:
R a Rs se seleccionan independientemente cada uno de entre H, CF3, S-alquilo C1-C6, halógeno, alquilo C1-C6, CN, O-alquilo C1-C6, NO2, COO-alquilo C1-C6, NHCO-alquilo C1-C8, NH2 y NH-alquilo C1-C8 o dos de los radicales R1 a R5 forman un ciclo condensado al fenilo; y Z se selecciona de entre O ó S.
El término "arilo", se refiere, en la presente invención, a anillos aromáticos, sencillos o múltiples, que tienen entre 5 a 18 átomos de carbono en la parte del anillo, tales como pero sin limitarse a, fenilo, naftilo, difenilo, indenilo, fenantrilo, fluorenilo o antracilo. Preferiblemente el grupo arilo tiene de 5 a 7 átomos de carbono y más preferiblemente el grupo arilo es un fenilo. Los grupos arilo pueden estar opcionalmente sustituidos en cualquiera de sus posiciones por uno o más sustituyentes o por dos sustituyentes formando un ciclo condensado al arilo y se seleccionan independientemente entre tales como CF3, alquilo C1-C6 S-alquilo C1-C6, halógeno, CN, O-alquilo C1-C6, NO2, COO-alquilo C1-C6, NHCO-alquilo C1-C6, NH2 y NH-al quilo C1-C6, y más preferiblemente entre CF3, alquilo C1-C6, halógeno, CN y NO2.
El término "heteroarilo" se refiere a un arilo, como se ha definido anteriormente, que contiene al menos un átomo distinto de carbono, tales como S, N, ó O, formando parte del anillo aromático. Los grupos heteroarilo pueden estar opcionalmente sustituidos en cualquiera de sus posiciones por uno o más sustituyentes o por dos sustituyentes formando un ciclo condensado al heteroarilo y se seleccionan independientemente entre tales como CF3, alquilo C1-C6, S-alquilo C1-C6, halógeno, CN, O-alquilo C1-C6, NO2, COO-alquilo C1-C6, NHCO-alquilo C1-Ce, NH2 y NH-alquilo C1-C6, y más preferiblemente entre CF3, alquilo C1-C6, halógeno, CN y NO2.
El término "alquilo" se refiere, en la presente invención, a cadenas hidrocarbonadas saturadas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 10 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, Apropilo, n-butilo, tere-butilo, seo-butilo, n-pentilo, n- hexilo, etc. Preferiblemente el grupo alquilo tiene entre 1 y 6 átomos de carbono y más el grupo alquilo tiene entre 1 y 3 átomos de carbono. Los grupos alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como CF3, alquilo C1-C6, S-alquilo C1-C6, halógeno, CN, O-alquilo C1-C6, NO2, COO-alquilo C1-C6, NHCO-alquilo C1-C6, NH2 y NH-alquilo C1-C6, y más preferiblemente entre CF3, halógeno, CN y NO2.
Por "halógeno" se entiende en la presente invención a un átomo de bromo, cloro, yodo o flúor, preferiblemente bromo, cloro o yodo. En una realización preferida de los compuestos de fórmula (II), R1 a Rs se seleccionan independientemente de entre H, CF3, halógeno, alquilo C1-C6, CN, NO2 o dos de los radicales R1 a R5 forman un ciclo condensado al fenilo. Más preferiblemente R5 es H y aún más preferiblemente al menos uno de R1, R2| R3 o R4 es Cl, Br, I, metilo, CF3, CN o NO2, más preferiblemente al menos uno de R1, R2, R3 o R4 es Cl, Br, I, CF3, CN o NO2.
Más preferiblemente R5 es H y aún más preferiblemente dos de los radicales R1 a R4 forman un ciclo condensado al fenilo, más preferiblemente R1 y R2 forman un ciclo condensado al fenilo, aún más preferiblemente formando un naftilo.
En otra realización preferida, R1, R2, R3, R4 y R5 son H. En una realización más preferida el compuesto de fórmula (I) o (II) se selecciona de entre:
Figure imgf000006_0001
Figure imgf000007_0002
Preferiblemente la enfermedad relacionada con la proteína TDP-43 es una enfermedad neurológica o neurodegenerativa y se puede seleccionar fundamentalmente de entre esclerosis lateral amiotrófica, demencia frontotemporal y enfermedad de Alzheimer, también se puede seleccionar entre la encefalopatía traumática crónica y el deterioro cognitivo asociado a la edad. Preferiblemente la enfermedad se selecciona entre esclerosis lateral amiotrófica, demencia frontotemporal, enfermedad de Alzheimer y el deterioro cognitivo asociado a la edad, aún más preferiblemente la enfermedad es esclerosis lateral amiotrófica.
Otro aspecto de la invención se refiere a un compuesto, a partir de ahora compuesto del segundo aspecto de la invención, que se selecciona de entre:
Figure imgf000007_0001
Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto del segundo aspecto de la invención junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable y opcionalmente puede comprender otro principio activo. Otro aspecto más de la presente invención se refiere al uso de un compuesto del segundo aspecto de la invención para la fabricación de un medicamento.
Los compuestos de la presente invención representados por la fórmula (I), (II) o por los compuestos del segundo aspecto de la invención, pueden incluir isómeros, dependiendo de la presencia de enlaces múltiples (por ejemplo, Z, E), incluyendo isómeros ópticos o enantiómeros, dependiendo de la presencia de centros quirales. Los isómeros, enantiómeros o diastereoisómeros individuales y las mezclas de los mismos caen dentro del alcance de la presente invención, es decir, el término isómero también se refiere a cualquier mezcla de isómeros, como diastereómeros, racémicos, etc., incluso a sus isómeros ópticamente activos o las mezclas en distintas proporciones de los mismos. Los enantiómeros o diastereoisómeros individuales, así como sus mezclas, pueden separarse mediante técnicas convencionales. Todos compuestos descritos en la invención pueden estar en forma cristalina como compuestos libres o como solvatos. En este sentido, el término "solvato", tal como aquí se utiliza, incluye tanto solvatos farmacéuticamente aceptables, es decir, solvatos del compuesto de fórmula (I) que pueden ser utilizados en la elaboración de un medicamento, como solvatos farmacéuticamente no aceptables, los cuales pueden ser útiles en la preparación de solvatos o sales farmacéuticamente aceptables. La naturaleza del solvato farmacéuticamente aceptable no es crítica siempre y cuando sea farmacéuticamente aceptable. En una realización particular, el solvato es un hidrato. Los solvatos pueden obtenerse por métodos convencionales de solvatación conocidos por los expertos en la materia.
Para su aplicación en terapia, los compuestos de fórmula (I), (II) o los compuestos del segundo aspecto de la presente invención, sus sales, solvatos o isómeros, se encontrarán, preferentemente, en una forma farmacéuticamente aceptable o sustancialmente pura, es decir, que tiene un nivel de pureza farmacéuticamente aceptable excluyendo los aditivos farmacéuticos normales tales como diluyentes y portadores, y no incluyendo material considerado tóxico a niveles de dosificación normales. Los niveles de pureza para el principio activo son preferiblemente superiores al 50%, más preferiblemente superior al 70%, y todavía más preferiblemente superiores al 90%. En una realización preferida, son superiores al 95% de compuesto de fórmula (I), (II) o los compuestos del segundo aspecto de la presente invención, o de sus sales, solvatos o isómeros.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a las composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un compuesto de la invención, o un isómero, una sal farmacéuticamente aceptable o un derivado del mismo, junto con un transportador o "carrier" farmacéuticamente aceptable, un excipiente o un vehículo, para la administración a un paciente. En una realización preferida, la composición farmacéutica comprende además otro principio activo.
Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia y utilizados habitualmente en la elaboración de composiciones terapéuticas.
Otro aspecto de la invención es un método de tratamiento de una enfermedad neurológica o neurodegenerativa, que comprende la administración a un paciente de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de fórmula (I), preferiblemente de fórmula (II), o de una composición farmacéutica que lo comprende, donde la enfermedad neurológica o neurodegenerativa es una enfermedad relacionada con la proteína TDP-43 que se puede seleccionar fundamentalmente de entre esclerosis lateral amiotrófica, demencia frontotemporal, enfermedad de Alzheimer, deterioro cognitivo asociado a la edad y encefalopatía traumática crónica.
En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad del agente o compuesto capaz de desarrollar la acción terapéutica determinada por sus propiedades farmacológicas, calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de los compuestos, incluyendo la edad, estado del paciente, la severidad de la alteración o trastorno, y de la ruta y frecuencia de administración.
Los compuestos descritos en la presente invención, sus sales o solvatos, así como las composiciones farmacéuticas que los contienen pueden ser utilizados junto con otros fármacos, o principios activos, adicionales para proporcionar una terapia de combinación. Dichos fármacos adicionales pueden formar parte de la misma composición farmacéutica o, alternativamente, pueden ser proporcionados en forma de una composición separada para su administración simultánea o no a la de la composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I), preferiblemente un compuesto de fórmula (II), o una sal o solvato del mismo.
En otra realización particular, dicha composición terapéutica se prepara en forma de una forma sólida o suspensión acuosa, en un diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición terapéutica proporcionada por esta invención puede ser administrada por cualquier vía de administración apropiada, para lo cual dicha composición se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía de administración elegida. En una realización particular, la administración de la composición terapéutica proporcionada por esta invención se efectúa por vía oral, tópica, rectal o parenteral (incluyendo subcutánea, intraperitoneal, intradérmica, intramuscular, intravenosa, etc.).
En una realización preferida de la presente invención, las composiciones farmacéuticas son adecuadas para la administración oral, en forma sólida o líquida. Las posibles formas para la administración oral son tabletas, cápsulas, siropes o soluciones y pueden contener excipientes convencionales conocidos en el ámbito farmacéutico, como agentes agregantes (p.e. sirope, acacia, gelatina, sorbitol, tragacanto o polivinil pirrolidona), rellenos (p.e. lactosa, azúcar, almidón de maíz, fosfato de calcio, sorbitol o glicina), disgregantes (p.e. almidón, polivinil pirrolidona o celulosa microcristalina) o un surfactante farmacéuticamente aceptable como el lauril sulfato de sodio.
Las composiciones para administración oral pueden ser preparadas por métodos los convencionales de Farmacia Galénica, como mezcla y dispersión. Las tabletas se pueden recubrir siguiendo métodos conocidos en la industria farmacéutica.
Las composiciones farmacéuticas se pueden adaptar para la administración parenteral, como soluciones estériles, suspensiones, o liofilizados de los productos de la invención, empleando la dosis adecuada. Se pueden emplear excipientes adecuados, como agentes tamponadores del pH o surfactantes. Las formulaciones anteriormente mencionadas pueden ser preparadas usando métodos convencionales, como los descritos en las Farmacopeas de diferentes países y en otros textos de referencia. La administración de los compuestos o composiciones de la presente invención puede ser realizada mediante cualquier método adecuado, como la infusión intravenosa y las vías oral, intraperitoneal o intravenosa. La administración oral es la preferida por la conveniencia de los pacientes y por el carácter crónico de las enfermedades a tratar. La cantidad administrada de un compuesto de la presente invención dependerá de la relativa eficacia del compuesto elegido, la severidad de la enfermedad a tratar y el peso del paciente. Sin embargo, los compuestos de esta invención serán administrados una o más veces al día, por ejemplo 1 , 2, 3 ó 4 veces diarias, con una dosis total entre 0,1 y 1000 mg/Kg/día. Es importante tener en cuenta que puede ser necesario introducir variaciones en la dosis, dependiendo de la edad y de la condición del paciente, así como modificaciones en la vía de administración.
Los compuestos y composiciones de la presente invención pueden ser empleados junto con otros medicamentos en terapias combinadas. Los otros fármacos pueden formar parte de la misma composición o de otra composición diferente, para su administración al mismo tiempo o en tiempos diferentes.
El uso de los compuestos de la invención es compatible con su uso en protocolos en que los compuestos de la fórmula (I), o sus mezclas se usan por sí mismos o en combinaciones con otros tratamientos o cualquier procedimiento médico.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS FIG. 1. Muestra la correlación lineal entre la permeabilidad descrita y la experimental de 10 compuestos comerciales empleando la metodología PAMPA.
FIG. 2. Muestra el efecto neuroprotector de los inhibidores de CDC7 (compuestos 1 , 8, 9 y 13) en células de neuroblastoma humano SH-SY5Y tratadas previamente con ácido etacrínico (AE, 20 μΜ) durante 12 horas en presencia o ausencia de los inhibidores a 10 μΜ. Los datos representan la media de cuatro experimentos diferentes ±SEM (*p <0.05). FIG. 3. Muestra del efecto de los inhibidores de CDC7 (compuestos 1, 8, 9 y 13) en la fosforilación de TDP-43. Cuantificación y representación de los niveles de TDP-43 fosforílada mediante western blot.
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad del producto de la invención.
Ejemplo 1 : síntesis de los nuevos compuestos de la invención.
Compuesto 1 : 6~(benciltio)-9tt-purina
Este compuesto está descrito en Pathak A.K. et al, Journal of Medical Chemistry, 2004, 47(1): 273-276. Compuesto 2: 6-((Naftalen-1-ilmetil)tio)-9/#-purina
Se disuelven 6-mercaptopurina monohidrato (300,0 mg, 1 ,76 mmoles) y K2C03 (243,7 mg, 1,76 mmoles) en DMF (25 mL). Se mantiene la mezcla de reacción en agitación durante 1 h a temperatura ambiente. Se adiciona 1-(clorometil)naftaleno (311,4 mg, 1 ,76 mmoles) y se mantiene en agitación durante una noche a temperatura ambiente. Se evapora el disolvente a presión reducida y se añade AcOEt (100 mL). La fase orgánica se lava con agua destilada (3 x 100 mL) añadiendo un poco de NaCI. Se seca sobre Mg2S04 anhidro, se filtra y se concentra hasta sequedad. El crudo se purifica mediante columna cromatográfica empleando CH2CI2/MeOH (10:1) como eluyente. De esta forma se obtiene el producto 2 en forma de sólido blanco (218,0 mg, 42 %). 1H-RMN (500 MHz, DMSO-ck): δ 13,55 (s, 1H), 8,81 (s, 1H), 8,42 (s, 1H), 8,19 (dd, J = 8,3, 1,4 Hz, 1H), 7,96 (dd, J = 7,9, 1,5 Hz, 1H), 7,87 (d, J = 8,1 Hz, 1 H), 7,72 (dd, J = 7,1 , 1,3 Hz, 1H), 7,63 - 7,52 (m, 2H), 7,45 (dd, J = 8,2, 7.0 Hz, 1 H), 5,16 (s, 2H). 1iC-RMN (125 MHz, DMSO-d6): δ 158,2 (1C), 151,2 (1C), 149,4 (1C), 143,0 (1C), 133,5 (1C). 133,0 (1C), 131,1 (1C), 130,1 (1C), 128,7 (1C), 128,2 (1C), 127,7 (1C), 126,4 (1C), 126,0 (1C), 125,5 (1C), 123,7 (1C), 29,5 (1C). HPLC: Pureza > 99%, t.r. = 4,33 min. MS (ES): m/z 293 [M+1]. P.f. 221 - 222 °C Análisis elemental (CieH12N4S) Calculado: C 65,73%, H 4,14%, N 19,16%, S 10,97%. Hallado: C 65,41%, H 4,07%, N 19,11%, S 10,99%. Compuesto 3: 6-((3-(cianobencil)tio)-9ft-purina
Se disuelven 6-mercaptopurina monohidrato (300,0 mg, 1 ,76 mmoles) y K2C03 (243,7 mg, 1,76 mmoles) en DMF (25 ml_). Se mantiene la mezcla de reacción en agitación durante 1 h a temperatura ambiente. Se adiciona 3-(bromometil)benzonitrilo (345,6 mg, 1 ,76 mmoles) y se mantiene en agitación durante una noche a temperatura ambiente. Se evapora el disolvente a presión reducida y se añade AcOEt (100 mL). La fase orgánica se lava con agua destilada (3 x 100 mL) añadiendo un poco de NaCI. Se seca sobre Mg2S04 anhidro, se filtra y se concentra hasta sequedad. No es necesario purificar mediante columna cromatográfica. De esta forma se obtiene el producto 3 en forma de sólido blanco (438,7 mg, 93 %). 1H-RMN (300 MHz, DMSO-a¾): δ 13,57 (s, 1 H), 8,74 (s, 1H), 8,46 (s, 1H), 7,93 (t, J = 1,7 Hz, 1H), 7,85 - 7,79 (m, 1H), 7,71 (dt, J = 7,8, 1 ,4 Hz, 1H), 7,52 (t, J= 7,8 Hz, 1H), 4,70 (s, 2H). 13C-RMN (75 MHz, DMSO-d6): δ 156,9 (1C), 151,4 (1C), 150,2 (1C), 143,5 (1C), 140,1 (1C), 134,0 (1C), 132,4 (1C), 130,9 (1C), 129,7 (2C), 118,6 (1C), 111 ,3 (1C), 30,7 (1C). MS (ES): m/z 268 [M+1]. P.f. 189 - 191 °C. Análisis elemental (C13H9N5S) Calculado: C 58,41%, H 3,39%, N 26,20%, S 12,00%. Hallado: C 58,46%, H 3,47%, N 26,03%, S 11,84%.
Compuesto 4: 6-((2-(trifluorometil)bencil)tio)-9H-purina
Este compuesto está descrito en Kamper C. et al., Mol Diversity, 2012, 16(3):541-551. Compuesto 5: 6-((4-clorobencil)tio)-9/#-purina
Se disuelven 6-mercaptopurina monohidrato (300,0 mg, 1 ,76 mmoles) y K2C03 (243,7 mg, 1,76 mmoles) en DMF (25 mL). Se mantiene la mezcla de reacción en agitación durante 1 h a temperatura ambiente. Se adiciona bromuro de 4-clorobenceno (362,3 mg, 1 ,76 mmoles) y se mantiene en agitación durante una noche a temperatura ambiente. Se evapora el disolvente a presión reducida y se añade AcOEt (100 mL). La fase orgánica se lava con agua destilada (3 x 100 ml_) añadiendo un poco de NaCI. Se seca sobre Mg2S04 anhidro, se filtra y se concentra hasta sequedad. El crudo se purifica mediante columna cromatográfica empleando
Figure imgf000014_0001
(10:1) como eluyente. De esta forma se obtiene el producto 5 en forma de sólido blanco (387,2 mg, 79 %). 1H-RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ 13,55 (s, 1H), 8,73 (s, 1H), 8,45 (s, 1H), 7,55 - 7,43 (m, 2H), 7,42 - 7,29 (m, 2H), 4,65 (s, 2H). "C-RMN (75 MHz, DMSO-d6): δ 157,8 (1C), 151,4 (1C), 149,4 (1C), 143,2 (1C), 137,2 (1C), 131,7 (1C), 130,8 (2C), 130,0 (1C), 128,4 (2C), 30,8 (1C). MS (ES): m/z 279 [M+3], 277 [M+1]. P.f. 198 - 200 °C. Análisis elemental (C12H9CIN4S) Calculado: C 52,08%, H 3,28%, N 20,24%, S 11,59%. Hallado: C 52,19%, H 3,28%, N 20,27%, S 11,59%.
Compuesto 6: 6-((3-clorobencil)oxi)-9H-purina
Se disuelve 3-clorobencil alcohol (2766,2 mg, 19,40 mmoles) en NaOH (155,2 mg, 3,88 mmoles) y se calienta hasta la disolución del NaOH. Se enfría la disolución, se añade 6-cloro-9H-purina (300,0 mg, 1,94 mmoles) y se calienta a 100 °C durante 1 día. Se añade Et20 (120 ml_) y se extrae 2 veces con una disolución acuosa de NaOH 1% (70 mL). Se juntan las fases acuosas, se lava con tolueno y, después de eliminar el tolueno, se neutraliza con HCI 37% hasta pH 6-8. Se enfría la disolución en un baño de hielo y el precipitado obtenido se recoge por filtración. El crudo se purifica mediante columna cromatográfica empleando CH2CI2/MeOH (10:1) como eluyente. De esta forma se obtiene el producto 6 en forma de sólido blanco (153,7 mg, 30 %). 1H-RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ 13,48 (s, 1H), 8,52 (s, 1H), 8,41 (s, 1H), 7,60 (s, 1H), 7,53 - 7,45 (m, 1H), 7,45 - 7,38 (m, 2H), 5,62 (s, 2H). 13C-RMN (75 MHz, DMSO-d6): δ 158,4 (1C), 155,4 (1C), 151,2 (1C), 143,0 (1C), 139,0 (1C), 133,1 (1C), 130,4 (1C), 128,0 (1C), 127,9 (1C), 126,7 (1C), 118.0 (1C), 66,7 (1C). P.f. 197 - 199 °C. Análisis elemental (C12H9CIN40) Calculado: C 55,29%, H 3,48%, N 21,49%. Hallado: C 55,12%, H 3,51%, N 21,34%.
Compuesto 7: 6-((3-(trifluorometil)bencil)tio)-9H--purina
Se disuelven 6-mercaptopurina monohidrato (300,0 mg, 1 ,76 mmoles) y K2C03 (243,7 mg, 1,76 mmoles) en DMF (25 ml_). Se mantiene la mezcla de reacción en agitación durante 1 h a temperatura ambiente. Se adiciona bromuro de 3-(trifluorometil)bencilo (421,4 mg, 1,76 mmoles) y se mantiene en agitación durante una noche a temperatura ambiente. Se evapora el disolvente a presión reducida y se añade AcOEt (100 ml_). La fase orgánica se lava con agua destilada (3 x 100 ml_) añadiendo un poco de NaCI. Se seca sobre anhidro, se filtra y se concentra hasta sequedad. El crudo se
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purifica mediante columna cromatográfica empleando CH2CI2/MeOH (10:1) como eluyente. De esta forma se obtiene el producto 7 en forma de sólido blanco (283,3 mg, 52 %). 1H-RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ 13,57 (s, 1H), 8,74 (s, 1H), 8,46 (s, 1H), 7,86 (s, 1H), 7,79 (d, J= 7,3 Hz, 1H), 7,65 - 7,49 (m, 2H), 4,74 (s, 2H). "C-RMN (75 MHz, DMSO-d6): δ 157,2 (1C), 151,4 (1C), 150,2 (1C), 143,5 (1C), 139,8 (1C), 133,1 (1C), 129,5 (2C), 129,1 (c, J= 31,4 Hz, 1C), 125,5 (c, J = 3,9 Hz, 1C), 124,1 (m, 1C), 123,8 (c, J = 3,9 Hz, 1C), 30,9 (1C). MS (ES): m/z 311 [M+1]. P.f. 180 - 182 °C. Análisis elemental Calculado: C 50,32%, H 2,92%, N 18,06%, S 10,33%.
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Hallado: C 50,49%, H 3,03%, N 18,03%, S 10,32%.
Compuesto 8: 6-((3-Clorobencil)tio)-9H-purina
Se disuelven 6-mercaptopurina monohidrato (300,0 mg, 1 ,76 mmoles) y K2C03 (243,7 mg, 1,76 mmoles) en DMF (25 ml_). Se mantiene la mezcla de reacción en agitación durante 1 h a temperatura ambiente. Se adiciona bromuro de 3-clorobencilo (362,3 mg, 1,76 mmoles) y se mantiene en agitación durante una noche a temperatura ambiente. Se evapora el disolvente a presión reducida y se añade AcOEt (100 ml_). La fase orgánica se lava con agua destilada (3 x 100 ml_) añadiendo un poco de NaCI. Se seca sobre anhidro, se filtra y se concentra hasta sequedad. El crudo se
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purifica mediante columna cromatográfica empleando CH2CI2/MeOH (10:1) como eluyente. De esta forma se obtiene el producto 8 en forma de sólido blanco (233,1 mg, 48 %). 1H-RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ 13,56 (s, 1H), 8,74 (s, 1H), 8,46 (s, 1H), 7,54 (t, J= 2,0 Hz, 1H), 7,47 - 7,40 (m, 1H), 7,39 - 7,27 (m, 2H), 4,66 (s, 2H). "C-RMN (75 MHz, DMSO-d6): δ 157,3 (1C), 151,4 (1C), 149,5 (1C), 143,4 (1C), 140,8 (1C), 132,9 (1C), 130,3 (2C), 128,8 (1C), 127,7 (1C), 127,1 (1C), 30,9 (1C). MS (ES): m/z 279 [M+3], 277 [M+1]. P.f. 167 - 169 °C. Análisis elemental (C12H9CIN4S) Calculado: C 52,08%, H 3,28%, N 20,24%, S 11,59%. Hallado: C 51,98%, H 3,28%, N 20,21%, S 11,58%. Compuesto 9: 6-((3-lodobencil)tio)-9H-purina
Se disuelven 6-mercaptopurina monohidrato (300,0 mg, 1 ,76 mmoles) y K2C03 (243,7 mg, 1,76 mmoles) en DMF (25 ml_). Se mantiene la mezcla de reacción en agitación durante 1 h a temperatura ambiente. Se adiciona bromuro de 3-iodobencilo (523,5 mg, 1,76 mmoles) y se mantiene en agitación durante 4 h a temperatura ambiente. Se evapora el disolvente a presión reducida y se añade AcOEt (100 mL). La fase orgánica se lava con agua destilada (3 x 100 ml_) añadiendo un poco de NaCI. Se seca sobre Mg2S04 anhidro, se filtra y se concentra hasta sequedad. No es necesario purificar mediante columna cromatográfica. De esta forma se obtiene el producto 9 en forma de sólido amarillo pálido (379,6 mg, 58 %). 1H-RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ 13,56 (s, 1 H), 8,74 (s, 1 H), 8,46 (s, 1 H), 7,85 (t, J = 1 ,8 Hz, 1 H), 7,60 (dt, J = 7,6, 1,4 Hz, 1 H), 7,48 (dt, J = 7,6, 1 ,4 Hz, 1H), 7,11 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 4,61 (s, 2H). "C-RMN (75 MHz, DMSO-d6): δ 157,3 (1C), 151,4 (1C), 149,8 (1C), 143,4 (1C), 140,8 (1C), 137,4 (1C), 135,8 (1C), 130,6 (1C), 129,8 (1C), 128,4 (1C), 94,7 (1C), 30,7 (1C). P.f. 185 - 187 °C. Análisis elemental (C12H9IN4S) Calculado: C 39,14%, H 2,46%, N 15,22%, S 8,71%. Hallado: C 39,26%, H 2,53%, N 15,05%, S 8,58%.
Compuesto 10: 6-((3-nitrobencil)tio)-9H-purina
Se disuelven 6-mercaptopurina monohidrato (300,0 mg, 1 ,76 mmoles) y K2C03 (243,7 mg, 1,76 mmoles) en DMF (25 ml_). Se mantiene la mezcla de reacción en agitación durante 1 h a temperatura ambiente. Se adiciona bromuro de 3-nitrobencilo (380,9 mg, 1 ,76 mmoles) y se mantiene en agitación 3 h a temperatura ambiente. Se evapora el disolvente a presión reducida y se añade AcOEt (100 ml_). La fase orgánica se lava con agua destilada (3 x 100 ml_) añadiendo un poco de NaCI. Se seca sobre Mg2S04 anhidro, se filtra y se concentra hasta sequedad. No es necesario purificar mediante columna cromatográfica. De esta forma se obtiene el producto 10 en forma de sólido amarillo pálido (460,6 mg, 91 %). 1H-RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ 13,58 (s, 1H), 8,74 (s, 1H), 8,47 (s, 1H), 8,36 (t, J = 2.0 Hz, 1H), 8,09 (ddd, J = 8,4, 2,3, 1,1 Hz, 1H), 7,94 (dt, J = 7,8, 1,2 Hz, 1H), 7,60 (t, J = 8,0 Hz, 1H), 4,79 (s, 2H). 13C-RMN (75 MHz, DMSO-d6): δ 156,8 (1C), 151,4 (1C), 150,2 (1C), 147,7 (1C), 143,6 (1C), 140,9 (1C), 135,7 (1C), 129,9 (2C), 123,6 (1C), 122,0 (1C), 30,6 (1C). P.f. 193 - 195 °C. Análisis elemental (C12H9N5O2S) Calculado: C 50,17%, H 3,16%, N 24,38%, S 11,16%. Hallado: C 50,07%, H 2,76%, N 24,15%, S 11 ,05%.
Compuesto 11 : 6-((3-bromobencil)tio)-9H-purina
Este compuesto está descrito en Kamper C. et al., Mol Diversity, 2012, 16(3):541-551.
Compuesto 12: 6-((4-bromobencil)tio)-9H-purina
Este compuesto está descrito en Kamper C. et al., Mol Diversity, 2012, 16(3):541-551. Compuesto 13: 6-((2-bromobencil)tio)-9H-purina Se disuelven 6-mercaptopurina monohidrato (300,0 mg, 1 ,76 mmoles) y K2C03 (243,7 mg, 1,76 mmoles) en DMF (25 mL). Se mantiene la mezcla de reacción en agitación durante 1 h a temperatura ambiente. Se adiciona el bromuro de 2-bromobencilo (440,6 mg, 1,76 mmoles) y se mantiene en agitación durante 4 h a temperatura ambiente. Se evapora el disolvente a presión reducida y se añade AcOEt (100 mL). La fase orgánica se lava con agua destilada (3 x 100 mL) añadiendo un poco de NaCI. Se seca sobre Mg2S04 anhidro, se filtra y se concentra hasta sequedad. No es necesario purificar mediante columna cromatográfica. De esta forma se obtiene el producto 13 en forma de sólido blanco ( 462.3 mg, 82 %). 1H-RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ 13,58 (s, 1H), 8,76 (s, 1H), 8,45 (s, 1H), 7,66 (dt, J = 7,9, 1,8 Hz, 2H), 7,33 (td, J = 7,5, 1,4 Hz, 1H), 7,22 (td, J = 7,6, 1,8 Hz, 1H), 4,74 (s, 2H). "C-RMN (75 MHz, DMSO-d6): δ 157,7 (1C), 151,5 (1C), 149,4 (1C), 143,2 (1C), 136,8 (1C), 132,8 (1C), 131,5 (1C), 130,1 (1C), 129,6 (1C), 128,0 (1C), 124,2 (1C), 32,4 (1C). P.f. 209 - 211 °C. Análisis elemental (C12H9BrN4S) Calculado: C 44,87%, H 2,82%, N 17,44%, S 9,98%. Hallado: C 44,96%, H 2,83%, N 17,43%, S 9,97%.
Compuesto 14: 6-((2-Clorobencil)tio)-9H-purina
Se disuelven 6-mercaptopurina monohidrato (300.0 mg, 1.76 mmoles) y K2CO3 (243.7 mg, 1.76 mmoles) en DMF (25 mL). Se mantiene la mezcla de reacción en agitación durante 1 h a temperatura ambiente. Se adiciona bromuro de 2-clorobencilo (362.3 mg, 1.76 mmoles) y se mantiene en agitación durante una noche a temperatura ambiente. Se evapora el disolvente a presión reducida y se añade AcOEt (100 mL). La fase orgánica se lava con agua destilada (3 x 100 mL) añadiendo un poco de NaCI. Se seca sobre Mg2SO4 anhidro, se filtra y se concentra hasta sequedad. El crudo se purifica mediante columna cromatográfica empleando CH2CI2/MeOH (10:1) como eluyente. De esta forma se obtiene el compuesto 14 en forma de sólido blanco (235.5 mg, 48 %). 1H-RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ 13.56 (s, 1H), 8.76 (s, 1H), 8.46 (s, 1H), 7.66 (dd, J = 6.4 Hz, 3.0 Hz, 1H), 7.49 (dd, J = 6.8, 2.5 Hz, 1H), 7.37 - 7.23 (m, 2H), 4.75 (s, 2H). 13C-RMN (75 MHz, DMSO-d6): δ 157.6 (1C), 151.4 (1C), 149.4 (1C), 143.3 (1C), 135.1 (1C), 133.4 (1C), 131.4 (1C), 130.5 (1C), 129.5 (1C), 129.3 (1C), 127.4 (1C), 29.7 (1C). MS (ES): m/z 279 [M+3], 277 [M+1]. P.f. 200 - 202 °C. Análisis elemental (C12HeCIN4S) Calculado: C 52.08%, H 3.28%, N 20.24%, S 11.59%. Hallado: C 52.12%, H 3.33%, N 20.08%, S 11.38%. Compuesto 15: 6-((3-metoxibencil)tio)-9H-purina Este compuesto está descrito en Patthack AK. et al., J Med Chem, 2004, 47(1):273- 276.
Compuesto 16: 2-(((9H-Purin-6-il)tio)metil)benzoato de etilo
Se disuelven 6-mercaptopurina monohidrato (48.7 mg, 0.29 mmoles) y K2CO3 (39.5 mg, 0.29 mmoles) en DMF (4 ml_). Se mantiene la mezcla de reacción en agitación durante 1 h a temperatura ambiente. Se adiciona 2-(clorometil)benzoato de etilo (56.8 mg, 0.29 mmoles) y se mantiene en agitación durante una noche a temperatura ambiente. Se evapora el disolvente a presión reducida y se añade AcOEt (50 mL). La fase orgánica se lava con agua destilada (3 x 50 mL) añadiendo un poco de NaCI. Se seca sobre anhidro, se filtra y se concentra hasta sequedad. El crudo se
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purifica mediante recristalización en EtOH. De esta forma se obtiene el compuesto 16 en forma de sólido blanco (22.0 mg, 24 1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6): δ 13.51 (s, 1H), 8.73 (s, 1H), 8.41 (s, 1H), 7.87 (dd, J = 7.8, 1.4 Hz, 1H), 7.69 (dd, J= 7.8, 1.2 Hz, 1H), 7.52 (td, J = 7.5, 1.5 Hz, 1H), 7.39 (td, J = 7.6, 1.3 Hz, 1H), 4.96 (s, 2H), 4.34 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 1.33 (t, J = 7.1 Hz, 3H). 13C-RMN (125 MHz, DMSO-d6): δ 166.6 (1C),
158.3 (1C), 151.3 (1C), 149.3 (1C), 143.0 (1C), 139.4 (1C), 132.3 (1C), 131.4 (1C),
130.4 (1C), 130.0 (1C), 129.5 (1C), 127.6 (1C), 61.0 (1C), 30.0 (1C), 14.0 (1C). P.f. 145 - 147 °C. Análisis elemental
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Calculado: C 57.31%, H 4.49%, N 17.82%, S 10.20%. Hallado: C 56.91 %, H 4.72%, N 17.19%, S 9.84%.
Compuesto 17: 6-((4-nitrobencil)tio)-9W-purina
Este compuesto está descrito en Tromp R. et al., J Med Chem, 2004, 47(22):5441- 5450.
Compuesto 18: 6-((4-Acetamidobencil)tio)-9H-purína
Se disuelven 6-mercaptopurina monohidrato (300.0 mg, 1.76 mmoles) y K2C03 (243.7 mg, 1.76 mmoles) en DMF (25 mL). Se mantiene la mezcla de reacción en agitación durante 1 h a temperatura ambiente. Se adiciona cloruro de 4-acetamidobencilo (323.8 mg, 1.76 mmoles) y se mantiene en agitación durante 3 h y 30 min a temperatura ambiente. Se evapora el disolvente a presión reducida y se añade AcOEt (100 mL). La fase orgánica se lava con agua destilada (3 x 100 mL) añadiendo un poco de NaCI. Se seca sobre Mg2S04 anhidro, se filtra y se concentra hasta sequedad. El crudo se purifica mediante columna cromatográfica empleando CH2CI2/MeOH (10:1) como eluyente. De esta forma se obtiene el compuesto 18 en forma de sólido amarillo pálido (207.2 mg, 39 %). 1H-RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ 13.53 (s, 1H), 9.93 (s, 1H), 8.73 (s, 1 H), 8.44 (s, 1 H), 7.51 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.37 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 4.59 (s, 2H), 2.01 (s, 3H). 13C-RMN (75 MHz, DMSO-d 6 ): δ 168.2 (1 C), 158.4 (1C), 151.4 (1C), 149.3 (1C), 143.0 (1 C), 138.4 (1 C), 132.1 (1 C), 130.1 (1C) 129.4 (2C), 1 19.0 (2C), 31.4 (1 C), 24.0 (1C). HPLC: Pureza > 99%, t.r. = 5.25 min. MS (ES): m/z 300 [M+1]. P.f. 223 - 225 °C. Análisis elemental (C 14 H 13 N 6 OS) Calculado: C 56.17%, H 4.38%, N 23.40%, S 10.71 %. Hallado: C 55.54%, H 4.51 %, N 22.67%, S 10.27%.
Compuesto 19: 6-((4-Cianobencil)tio)-9H-purina
Se disuelven 6-mercaptopurina monohidrato (300.0 mg, 1.76 mmoles) y K 2 C0 3 (243.7 mg, 1.76 mmoles) en DMF (25 mL). Se mantiene la mezcla de reacción en agitación durante 1 h a temperatura ambiente. Se adiciona bromuro de 4-cianobencilo (345.6 mg, 1.76 mmoles) y se mantiene en agitación durante 2 h a temperatura ambiente. Se evapora el disolvente a presión reducida y se añade AcOEt (100 mL). La fase orgánica se lava con agua destilada (3 x 100 mL) añadiendo un poco de NaCI. Se seca sobre Mg 2 S0 4 anhidro, se filtra y se concentra hasta sequedad. El crudo se purifica mediante columna cromatográfica empleando CH 2 CI 2 /MeOH (10: 1) como eluyente. De esta forma se obtiene el compuesto 19 en forma de sólido blanco (358.7 mg, 76 %). 1H-RMN (300 MHz, DMSO-d 6 ): δ 13.57 (s, 1 H), 8.73 (s, 1 H), 8.46 (s, 1 H), 7.77 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.66 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.72 (s, 2H). 13C-RMN (75 MHz, DMSO-d 6 ): δ 157.2 (1C), 151.4 (1C), 149.9 (1C), 144.3 (1C), 143.5 (1C), 132.4 (2C), 130.0 (2C), 129.6 (1C), 1 18.8 (1C), 109.8 (1 C), 31.1 (1 C). P.f. 228 - 230 °C. Análisis elemental (C 13 H,N 6 S) Calculado: C 58.41 %, H 3.39%, N 26.20%, S 11.99%. Hallado: C 58.30%, H 3.43%, N 26.10%, S 11.87%. Compuesto 20: 6-((bencil)oxi)-9H-purina
Este compuesto está descrito en Wanner MJ. et al., J Med Chem, 2004, 47(27):6875- 6883.
Compuesto 21 : 6-((4-Bromobencil)oxi)-9H-purina
Se disuelven 4-bromobencil alcohol (1815.1 mg, 9.70 mmoles) y NaOH (155.2 mg, 3.88 mmoles) en un poco de MeOH (25 mL). Se mantiene la mezcla de reacción en agitación hasta la disolución del NaOH. Se adiciona 6-cloro-9H-purina (300.0 mg, 1.94 mmoles) y se calienta a (90 °C) durante 2 h. Se evapora el disolvente a presión reducida y se añade AcOEt (50 mL). La fase orgánica se lava con agua destilada (3 x 50 mL) añadiendo un poco de NaCI. A continuación, se seca sobre Mg 2 S0 4 anhidro, se filtra y se concentra hasta sequedad. El crudo se purifica mediante columna cromatográfica empleando CH2CI2/MeOH (10:1) como eluyente. De esta forma se obtiene el compuesto 21 en forma de sólido beis (107.2 mg, 18 %). 1H-RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ 13.48 (s, 1 H), 8.51 (s, 1H), 8.40 (s, 1H), 7.61 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.48 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 5.59 (s, 2H). 13C-RMN (75 MHz, DMSO-d6): δ 158.5 (1C), 155.3 (1C), 151.2 (1C), 143.0 (1C), 136.0 (1C), 131.4 (2C), 130.4 (2C), 121.3 (1C), 118.1 (1C), 66.8 (1C). P.f. °C. Análisis elemental (C12H9BríM40) Calculado: C 47.24%, H 2.97%, N 18.36%. Hallado: C 47.06%, H 2.98%, N 18.31%. Compuesto 22: 6-(4-(trifluorometil)benciltio)-9H-purina
Este compuesto está descrito en Kamper C. et al., Mol Diver, 2012, 16(3):541-551.
Compuesto 23: 6-((4-(Metittio)bencil)tio)-9H-purina
Se disuelven 6-mercaptopurína monohidrato (300.0 mg, 1.76 mmoles) y K2C03 (243.7 mg, 1.76 mmoles) en DMF (25 ml_). Se mantiene la mezcla de reacción en agitación durante 1 h a temperatura ambiente. Se adiciona bromuro de 4-(metiltio)bencilo (382.8 mg, 1.76 mmoles) y se mantiene en agitación durante una noche a temperatura ambiente. Se evapora el disolvente a presión reducida y se añade AcOEt (100 mL). La fase orgánica se lava con agua destilada (3 x 100 mL) añadiendo un poco de NaCI. Se seca sobre Mg2S04 anhidro, se filtra y se concentra hasta sequedad. El crudo se purifica mediante columna cromatográfica empleando
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(10:1) como eluyente. De esta forma se obtiene el compuesto 24 en forma de sólido blanco (158.0 mg, 31 %). 1H-RMN (300 MHz, DMSO-d6): δ 13.53 (s, 1H), 8.73 (s, 1 H), 8.44 (s, 1H), 7.40 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.20 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 4.61 (s, 2H), 2.44 (s, 3H). "C-RMN (125 MHz, DMSO-</e): δ 158.2 (1C), 151.4 (1C), 149.3 (1C), 143.0 (1C), 136.9 (1C), 134.5 (1C), 130.1 (1C), 129.6 (2C), 126.0 (2C), 31.2 (1C), 14.7 (1C). MS (ES): m/z 289 [M+1]. P.f. 203 - 205 °C. Análisis elemental (013Η12Ν482) Calculado: C 54.14%, H 4.19%, N 19.43%, S 22.24%. Hallado: C 53.96%, H 4.15%, N 19.34%, S 22.19%. Ejemplo 2: Medida de la inhibición de CDC7 (tecnología ADP-Glo™)
El método utilizado es un ensayo de inhibición enzimática no radiactivo utilizando CDC7 recombinante humana. Éste se basa en la cuantificación luminométrica de la inhibición utilizando el Kit de Quinasa ADP-Glo™. En este ensayo la señal luminiscente se correlaciona positivamente con la cantidad de adenosin difosfato (ADP) y la actividad de la quinasa. Todos los compuestos se evaluaron a una concentración fija de 10 μΜ. Para aquellos compuestos con un porcentaje de inhibición mayor del 50%, se lleva a cabo un estudio dosis-respuesta determinándose su valor de Clso (concentración de compuesto capaz de inhibir al 50% la función de CDC7).
Los estudios de inhibición enzimática de CDC7 se llevaron a cabo utilizando el kit de promega: ADP-Glo™ Kinase Assay + CDC7/DBF4 Kinase Enzyme System (n° de catálogo V5089). El ATP y otros reactivos se compraron en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Los ensayos fueron realizados en una solución tampón utilizando placas de 96 pocilios. El compuesto a ensayar (5 μL, 40 μΜ disuelto en DMSO 4 %) se añadió a cada pocilio seguido de la enzima (5 μL, 25 ng/pocillo), ATP (5 μL, concentración final en el pocilio 10 μΜ) y PDKtidE (5 μL, 4 μσ/ροαΙΙο). A continuación, se dejó incubar durante 60 min a temperatura ambiente y se añadió el reactivo ADP-Glo™ (20 μL) dejándose incubar nuevamente durante 40 min a temperatura ambiente. Tras la incubación, se añadió el agente de detección de quinasa (40 μL) y se dejó incubar durante 30 min a temperatura ambiente. Por último, se midió la luminiscencia (tiempo de integración de 0,5 - 1 seg) usando un polarímetro POLARstar Optima multimode reader. Las actividades de inhibición se calcularon en función de la actividad máxima, medida en ausencia de inhibidor. Los valores de inhibición determinados para los compuestos preparados se encuentran recogidos en la tabla 1.
Ejemplo 3: Medida de la inhibición de CDC7 (tecnología LanthaScreen)
El ensayo de inhibión de quinasas LanthaScreen Eu utiliza un marcador de Alexa Fluor™ que se une a una quinasa y se detecta mediante la adición de un anticuerpo marcado con Eu. La unión del marcador y el anticuerpo a la quinasa da como resultado un alto grado de FRET, mientras que el desplazamiento del marcador por un inhibidor resulta en una pérdida de FRET. A diferencia de otros muchos ensayos de actividad quinasa, este es un ensayo de simple mezcla y lectura, sin etapas de desarrollo. Este método de ensayo ha sido desarrollado por "Life Technologies" e identifican inhibidores de quinasa ATP competitivos, haciéndolos adecuados para la detección de cualquier compuesto que se una al sitio del ATP.
Los compuestos se evalúan en 1% DMSO (final) en el pocilio. Se ha utilizado una mezcla de CDC7/DBF4 recombinante humana (0,5 nM), anticuerpo Eu-antiGST (2 nM) y marcador AlexaFluor (1nM) en un buffer de 50 mM HEPES pH 7,5, 0,01% BRIJ-35, 10 mM MgCI2, 1 mM EGTA.En placas blancas de 348 pocilios, de bajo volumen, codificadas (Greiner cat. #784207), se añaden 160 nL (100 x compuesto en 100% DMSO), 3,84 ML (buffer con CDC7/DBF4), 8,0 μL. (anticuerpo), 4,0 μL( marcador). Se agita 30 s y se incuba a temperatura ambiente durante 60 min. A continuación se mide la fluorescencia en el lector de placas y se analizan los datos (Tabla 1).
Tabla 1. Valores de inhibición en CDC7 de los compuestos de fórmula (II):
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Ejemplo 3: Predicción del paso de barrera hematoencefálica Un requisito imprescindible que deben cumplir los fármacos destinados al tratamiento de enfermedades neurodegenerativas es la capacidad de atravesar la barrera hematoencefálica (BHE) ya que, en caso contrarío, no podrían actuar sobre la diana de interés. Por tanto, para los compuestos no permeables o situados en la zona de incertidumbre, podría ser necesario que fueran vehiculizados adecuadamente un su formulación farmacéutica mediante métodos conocidos por un experto en la materia como por ejemplo mediante encapsulación. Esta capacidad puede predecirse in vitro utilizando un método conocido con las siglas PAMPA (Parallel Artificial Membrane Permeability Assay) descrito por Di y colaboradores (Di, L.¡ Kerns, E. H.; Fan, K.¡ McConnell, O. J.; Cárter, G. T. Eur. J. Med. Chem., 2003, 38 (3), 223-232) y que posteriormente ha sido puesto a punto en nuestro grupo de investigación. Dicho método permite predecir la permeabilidad efectiva a través de membranas artificiales mediante un proceso de difusión pasiva. En primer lugar, es preciso validar el método, para lo cual se utilizan 10 compuestos comerciales cuya capacidad de penetración en el sistema nervioso central (SNC) es conocida que se especificarán a continuación, obteniéndose en este caso una buena correlación lineal entre los valores de permeabilidad (Pe) experimentales y los descritos (FIG. 1). Esta recta de correlación obtenida siguiendo el patrón descrito en la bibliografía permite establecer los límites para predecir si un compuesto puede atravesar o no la barrera hematoencefálica. Así, se considera que un compuesto es permeable a la BHE (SNC+) si presenta una permeabilidad > 4,48 x 10-6 cm-s'1.
Para el procedimiento, se tomaron entre 3-5 mg de cafeína, desipramina, enoxacino, hidrocortisona, ofloxacino, piroxicam y testosterona, 12 mg de promazina y 25 mg de atenolol y verapamilo, y se disolvieron en EtOH (1000 μΙ_). Se tomaron 100 μΙ_ de estas disoluciones y se añadieron EtOH (1400 μΙ_) y tampón fosfato (PBS) pH = 7,4 (3500 μΙ_) con el fin de alcanzar una concentración final de EtOH del 30% v/v en disolución. Por último, se filtraron las disoluciones.
Por otro lado, se añadió una disolución de PBS/EtOH (70:30) a cada pocilio de la placa aceptara (180 μΙ_). La placa donadora fue impregnada con una disolución de lípido de cerebro porcino (4 μL.) disuelto en dodecano (20 mg-mL'1). Una vez transcurridos 5 min, se añadió disolución de cada compuesto sobre esta placa (180 μL).
De los compuestos 1 a 10 evaluados, se tomaron entre 1-2 mg y se disolvieron en EtOH (1500 μL) y tampón fosfato (PBS) pH = 7,4 (3500 μL), se filtraron y se añadieron a la placa donadora. Con estas disoluciones, se determinan las longitudes de onda a las cuales absorben los compuestos y se miden los niveles de absorbanáa inicial a estas longitudes de onda empleando un lector de absorbencia de UV. Cada muestra fue analizada de dos a cinco longitudes de onda, en tres pocilios y en dos experimentos independientes.
A continuación, la placa donadora se depositó sobre la aceptara formando una especie de "sándwich" y se dejaron incubar durante 2 h y 30 min a 25 °C. De esta forma, los compuestos irán pasando de la placa donadora a la placa aceptora a través del lípido de cerebro porcino mediante difusión pasiva. Transcurrido ese tiempo, se retira cuidadosamente la placa donadora y se determinan la concentración y absorbencia final tanto de los compuestos comerciales como de los sintetizados. Los resultados obtenidos se expresan como la media de las medidas [desviación estándar (SD)] de los distintos experimentos realizados y se encuentran recogidos en la tabla 2.
Tabla 2. Valores de permeabilidad (Pe 10-8 cm s-1) en el experimento PAMPA-BHE y predicción de la penetración en el sistema nervioso central (SNC) de los compuestos de fórmula (II) como se describen también en la tabla 1 :
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Ejemplo 4: Efecto neuroprotector de los inhibidores de CDC7 frente al ácido etacrínico
La línea celular de neuroblastoma humana SH-SY5Y, se cultivó a 37°C con un 5% de CO2 en medio DMEN (Dulbecco's Modified Eagle Médium) enriquecido con L- glutamina (2mM), 1% de aminoácidos no esenciales, 1% de Penicilina/Estreptomicina y un 10% de suero fetal bobino. En el estado de semiconfluencia, las células fueron tratadas con los inhibidores de CDC7 (compuestos 1 y 8) a diferentes concentraciones durante 1 ,30 horas posf-adición del agente causante de la fosforilación de TPD-43; ácido etacrínico (20 μΜ) (Sigma). A las 24 horas se evaluó la viabilidad celular con MTT ([3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) siguiendo un procedimiento descrito (Denizot F, Lang R. J Immunol Methods. 1987; 89:271-7) y los niveles de TDP-43 fosforilada mediante western blot (FIG. 2).
Ejemplo 5: Efecto de los inhibidores de CDC 7 en la fosforilación de TDP-43
Para evaluar los niveles de TDP-43 fosforilada en presencia de los inhibidores de CDC7 (compuestos 1 y 8), las células tras 24 h de incubación con el ácido etacrínico, fueron lavadas con PBS y posteriormente lisadas en frío con tampón de lisis (50mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCI, 50 mM NaF, 1% Nonidet P-40 y Proteasa e inhibidores de fosfatase (Roche)). Los extractos celulares recogidos se centrifugaron durante 10 minutos a 4.000 rpm. La cuantificación de proteínas se realizó con el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (Thermo Scientific). 10 μg de proteína se cargaron en el gel de poliacrilamida con SDS y posteriormente se transfirieron a una membrana de fluoruro de poli-vinilideno (PVDF) (Millipore). La membrana fue bloqueada con albúmina de suero bovino al 5% (Sigma), e incubada durante 12 horas con las siguientes concentraciones de anticuerpos primarios (anti-fosfo(S409/410)-TDP-43 humana (1:500) (22309-1 AP, Proteintech); a-tubulina (1:1.000) (sc-23948, Santa Cruz Biotechnologies). La amplificación de la señal se llevó a cabo con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano, correspondientes a la especie utilizada en el anticuerpo primario (Bio-Rad). La densidad de las bandas se cuantificó con el programa Image J (National Institutos of Health, Bethesda, Maryland, USA). La FIG. 3 muestra que el tratamiento de las células con los inhibidores de CDC7 (compuestos de la invención 1 y 8) permitió reducir la fosforilación de TDP-43.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Uso de un compuesto de fórmula (I)
Figure imgf000028_0001
donde:
G representa un grupo que se selecciona de entre arilo, heteroarilo o alquilo d- C10, cualquiera de ellos opcionalmente sustituido por al menos un sustituyeme seleccionado de entre CF3, alquilo C1-C6, S-alquilo C1-C6, halógeno, CN, O-alquilo C1-C6, NO2, COO-alquilo C1-C6, NHCO-alquilo C1-C6, NH2 y NH-alquilo C1-C6, u opcionalmente sustituido por dos sustituyentes formando un ciclo condensado al grupo G cuando es un arilo o heteroarilo, y
Z se selecciona de entre O o S;
o cualquiera de sus sales, solvatos o isómeros farmacéuticamente aceptables para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de patologías relacionadas con la proteína TDP-43.
Uso según la reivindicación 1 , donde G es un grupo arilo, opcionalmente sustituido por al menos un sustituyente seleccionado de entre CF3, alquilo C1-C6, S-alquilo C1-C6, halógeno, CN, O-alquilo C1-C6, NO2, COO-alquilo C1-C6, NHCO-alquilo Cr C6, NH2 y NH-alquilo C1-C6, u opcionalmente sustituido por dos sustituyentes formando un ciclo condensado al arilo.
Uso según la cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde G es un grupo fenilo y el compuesto es de fórmula (II):
Figure imgf000029_0001
donde R1 a R5 se seleccionan independientemente de entre H, CF3, S-aiquilo C1 C6, halógeno, alquilo C1-C6, CN, O-alquilo C1-C6, NO2, COO-alquilo C1-C6, NHCO- alquilo C1-C6, NH2 y NH-alquilo C1-C6, o dos de los radicales R1 a R5 forman un ciclo condensado al fenilo; y
Z se describe en la reivindicación 1.
4. Uso según la reivindicación 3, donde R1 a R5 se seleccionan independientemente de entre H, CF3, halógeno, alquilo C1-C6, CN y NO2 o dos de los radicales R1 a R5 forman un ciclo condensado al fenilo.
5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4, donde R5 es H. 6. Uso según la reivindicación 4, donde al menos uno de R1 , R2, R3 o R4 es Cl, Br o I y R5 es H.
7. Uso según la reivindicación 4, donde al menos uno de R1, R2, R3 o R4 es metilo, CF3, CN o NO2 y R5 es H.
8. Uso según la reivindicación 4, donde dos de los radicales R1 a R4 forman un ciclo condensado al fenilo y R5 es H.
9. Uso según la reivindicación 8, donde R1 y R2 forman un ciclo condensado al fenilo.
10. Uso según la reivindicación 4, donde R1, R2, R3, FU y R5 son H.
1 1. Uso según la reivindicación 1 , donde el compuesto se selecciona de entre:
Figure imgf000030_0001
12. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , donde la enfermedad relacionada con la proteína TDP-43 es una enfermedad neurológica.
13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde la enfermedad relacionada con la proteína TDP-43 es una enfermedad neurológica que se selecciona de entre esclerosis lateral amiotrófica, demencia frontotemporal, enfermedad de Alzheimer, deterioro cognitivo asociado a la edad y encefalopatía traumática crónica.
14. Uso según la reivindicación 13, donde la enfermedad se selecciona de entre esclerosis lateral amiotrófica, demencia frontotemporal y enfermedad de Alzheimer. 15. Compuesto que se selecciona de entre:
Figure imgf000031_0001
16. Composición farmacéutica que comprende un compuesto según se describe en la reivindicación 15 junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. 17. Uso de un compuesto según se describe en la reivindicación 15 para la fabricación de un medicamento.
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