WO2018170762A1 - TNLG5A基因的RNAi表达载体、构建方法及其应用 - Google Patents
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Definitions
- a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 1 or a vector comprising the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 1 or an RNAi expression vector of the aforementioned TNLG5A gene is provided in TNLG5A Use in drugs for diseases with abnormal gene expression.
- RNAi expression vector of the TNLG5 A gene provided by the invention has the advantages of high transfection efficiency, low dosage, high and specific inhibition of TNLG5A gene expression in Jurkat cells, and can be used as a powerful tool for preparing and treating TNLG5A gene expression abnormality. Drugs related to the disease.
- FIG. 1 is a schematic diagram showing the results of real-time quantitative PCR detection of RNAi expression vector cells transfected with TNLG5A gene.
- Jurkat cells were purchased from the Cell Resource Center of the Shanghai Institute of Biological Sciences.
- the RNAi vector pLVX-shRNA1 was purchased from C1 ontech, RNeasy MiniKit was purchased from Qiagen, and the endotoxin-free plasmid extraction kit was purchased from Ome ga bio-tek.
- the complete medium described below is a cell culture medium supplemented with 10% fetal bovine serum.
- Synthetic shRNAs are designed based on the target nucleotide sequence.
- the design is as follows: B a m HI cleavage site +19 n t target nucleotide sequence + stem loop structure (TTCAAGAGA) + target sequence complementary sequence + RNAPolym polymerase transcriptional stop site (TTTTTT) + EcoR I cleavage site Six regions, the sequence of which is shown in SEQ ID NO: 1.
- the designed shRNA oligonucleotide chain was synthesized by Shanghai Shenggong Bioengineering Technology Service Co., Ltd.
- Jurkat cells were cultured, and 5,000,000 cells in good growth state were taken, and the cells were collected by centrifugation, and then resuspended in 500 ⁇ L of PBS, mixed with the RNAi expression vector of 20 ⁇ ⁇ TNLG5 ⁇ gene, and then added to an electric shock cup, and BTX ECM830 was applied.
Landscapes
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Abstract
提供了一种TNLG5A基因的RNAi表达载体、构建方法及其应用，提供了：分离的多核苷酸，其序列如SEQ ID NO：1所示；一种载体，它含有SEQ ID NO：1所示的多核苷酸；一种重组载体，含有如SEQ ID NO：2所示的序列；一种TNLG5A基因的RNAi表达载体及制备方法，是以pLVX-shRNA1为骨架载体，在重组位点处插入顺序连接的由Bam HI酶切位点+靶核苷酸序列+茎环结构序列+靶核苷酸序列互补序列+终止位点序列+EcoR I酶切位点组成的shRNA寡核苷酸序列。
Description
说明书 发明名称： TNLG5A基因的 RNAi表达载体、 构建方法及其应用 技术领域
[0001] 本发明属于基因工程领域， 涉及一种 RNAi表达载体及其构建方法和应用， 尤 其涉及一种 TNLG5 A基因的 RNAi表达载体、 构建方法及其应用。
背景技术
[0002] ILA属于 TNFR超家族， 主要表达于活化的 T细胞中， 是一种可诱导的 T细胞表 面受体； TNLG5A属于 TNF超家族， 主要表达在集中抗原呈递细胞 （APC) 。 IL A/TNLG5A是 CD28/B7之外的另一重要的共刺激分子， 可依赖或不依赖于 CD28/
B7途径而介导产生协同刺激信号， 诱导 T细胞的活化、 增殖与细胞因子的分泌。 技术问题
[0003] ILA及其配体系统存在双向信号传导， 既可通过 TNLG5A向 T细胞传递细胞， 又 可将信号传向表达配体的细胞， 其在肿瘤的免疫治疗中起重要的作用， 需做大 量研究方可实现临床转化， 但现有技术中缺乏特异抑制 TNLG5A基因表达的 RN Ai表达载体使得相关研究无法很好地幵展。
问题的解决方案
技术解决方案
[0004] 本发明的目的是 TNLG5A基因的 RNAi表达载体、 构建方法及其应用。
[0005] 在本发明的第一方面， 提供一种分离的多核苷酸， 其核苷酸序列如 SEQ ID ΝΟ:1所示。
[0006] 在本发明的另一方面， 提供一种重组载体， 含有如 SEQ ID NO:2所示的核苷酸 序列， 所述重组载体是以 pLVX-shRNAl载体为骨架载体， 在多克隆酶切位点处 插入顺序连接的由 Bam HI酶切位点 +靶核苷酸序列 +茎环结构序列 +靶核苷酸序列 互补序列 +终止位点序列 +EcoR I酶切位点组成的 shRNA寡核苷酸序列。
[0007] 在本发明的另一方面， 提供一种前述的 TNLG5 A基因的 RNAi表达载体的制备 方法， 包括如下步骤：
[0008] A) shRNA寡核苷酸序列的设计： 根据 TNLG5A的 mRNA全序列， 经 BLAST同
源性比对证实特异性后应用 RNA structure 软件对靶 mRNA序列的二级结构进 行评估得到靶核苷酸序列， 设计并合成靶向 TNLG5A基因的 shRNA寡核苷酸序列
[0009] B) TNLG5A基因的 RNAi表达载体的构建和鉴定： 将合成的 shRNA寡核苷酸单 链按等摩尔比混合， 退火形成双链的 shRNA, 提取质粒 pLVX-shRNAl， 用限制 性内切酶 Bam HI、 EcoR I双酶切， 电泳、 切胶回收载体， 再用 T4 DNA Ligase分 别将双链 shRNA连接到 pLVX-shRNAl表达载体中， 得到连接产物； 将连接产物 转化到感受态大肠杆菌 Stbl3中， 均匀涂布到含氨苄青霉素 LB培养基平板上， 挑 取阳性单克隆菌落培养保存并进行 PCR鉴定， 将初步鉴定结果说明 shRNA寡核苷 酸序列插入成功的菌液进行测序鉴定；
[0010] C) TNLG5 A基因的 RNAi表达载体的抽提： 将测序结果证实 shRNA寡核苷酸序 列插入成功的菌液扩增培养， 进行大量抽提重组质粒， 得到 TNLG5A基因的 RN Ai表达载体。
[0011] 本发明利用 RNAi技术构建靶向 TNLG5A基因表达的 RNAi表达载体， 经鉴定构 建成功后， 电转 Jurkat细胞， 使用实吋荧光定量 PCR技术从 mRNA水平验证 TNLG 5A基因表达的抑制效果， 实验结果证明本发明提供的 shRNA寡核苷酸成功插入 至 pLVX-shRNAl表达载体中， 且对 TNLG5A基因表达的抑制效果显著。
[0012] 在本发明的另一方面， 提供一种 SEQ ID ΝΟ:1所示的多核苷酸或含有 SEQ ID ΝΟ:1所示的多核苷酸的载体或前述 TNLG5A基因的 RNAi表达载体在 TNLG5A基 因表达异常相关疾病的药物中的用途。
发明的有益效果
有益效果
[0013] 本发明提供的 TNLG5 A基因的 RNAi表达载体具有转染效率高， 用量少， 可高 效、 特异地抑制 Jurkat细胞 TNLG5A基因表达的优点， 可作为有力工具应用于制 备治疗 TNLG5A基因表达异常相关疾病的药物。
对附图的简要说明
附图说明
[0014] 图 1为转染 TNLG5A基因的 RNAi表达载体细胞的荧光定量 PCR检测结果示意图
实施该发明的最佳实施例
本发明的最佳实施方式
[0015] 下面结合附图与具体实施例对本发明做进一步的说明。
[0016] Jurkat细胞购自上海生命科学院细胞资源中心， RNAi载体 pLVX-shRNAl购自 C1 ontech公司， RNeasyMiniKit购自 Qiagen公司， 无内毒素质粒提取试剂盒购自 Ome ga bio-tek公司。 下文所述完全培养基为加入了 10%胎牛血清的细胞培养基。
[0017] 实施例一靶向 TNLG5A基因的 shRNA寡核苷酸序列的设计
[0018] 在 GenBank査找 SJTNLG5A的 mRNA全序列， 经 BLAST同源性比对证实特异性 后应用 RNAstmcture 4.4软件对靶 mRNA序列的二级结构进行评估， 最后获得靶 核苷酸序列。
[0019] 根据靶核苷酸序列设计合成 shRNA。 设计如下： Bam HI酶切位点+19nt靶核苷 酸序列 +茎环结构 （TTCAAGAGA) +靶序列互补序列 +RNAPolym聚合酶转录中 止位点 （TTTTTT) +EcoR I酶切位点六个区域， 其序列如 SEQ ID NO: 1所示。 设 计的 shRNA寡核苷酸链由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
[0020] 实施例二 TNLG5A基因的 RNAi表达载体的构建。
[0021] 将合成的 shRNA寡核苷酸单链等量混合， 退火形成双链的 shRNA, 提取质粒 pL VX-shRNAl , 用限制性内切酶 Bam HI、 EcoR I双酶切， 电泳、 切胶回收载体， 再用 T4 DNA Ligase将双链 shRNA连接到载体 pLVX-shRNAl中， 形成 TNLG5A基 因的 RNAi表达载体。 将连接产物转化到感受态大肠杆菌 Stbl3中， 涂布到含氨苄 青霉素 LB培养基的平板上， 于 37°C培养 14 h。 挑取长出的菌落， 送至上海生工 测序。 测序结果与所设计的序列完全相符， 可用于后续实验。
[0022] 实施例三 Jurkat细胞的电转
[0023] 培养 Jurkat细胞， 取生长状态良好的细胞 5000000个， 离心收集细胞， 然后重悬 于 500 μL PBS中， 与 20 μβ TNLG5 Α基因的 RNAi表达载体混匀后加入电击杯， 应 用 BTX ECM830电转仪进行电转， 电转程序： 2.5 KV， 25 FD， 脉冲电击一次； 将细胞转移至含 5 mL DMEM完全培养基的 6
cm皿中， 轻轻晃动皿使细胞混匀， 48 h后检测 TNLG5A基因表达情况。
[0024] 实施例四荧光定量 PCR检测 TNLG5A基因表达量
[0025] 分别培养正常 Jurkat细胞和电转 TNLG5A基因的 RNAi表达载体的 Jurkat细胞 48 h ， 用 RNeasy Mini Kit提取各组细胞的总 RNA， 利用 PrimeScript RT reagent Kit将 mRNA逆转录为 cDNA， 逆转录条件： 37°C， 15min; 85°C， 5s; 4°C， ∞。 反转录结束后， 加入 90μ1的 RNase-Free dH20稀释 cDNA， -20°C保存， 以便后面 检测使用。 取各组细胞的 cDNA 1
为模板， 以 GAPDH为内参， 实吋荧光定量 PCR (QPCR) 检测 TNLG5A相对表 达量， 设置反应条件： 95°C 10s， 1个循环； 95°C 5s， 54°C 30s， 共 40个循环， 利用 SYBR PrimeScript RT-PCR Kit检测各组细胞 TNLG5 A基因相对表达量， 结果 如图 1所示。 结果显示转染 TNLG5 A基因的 RNAi表达载体的 Jurkat细胞， TNLG5 A基因表达明显受到抑制， shRNA片段对目的基因的抑制效率达 77.1%±6.8<¾， 从 而证明本实验中采用的 TNLG5A基因的 RNAi表达载体能特异抑制 TNLG5A基因 的表达， 且抑制效果非常显著。
[0026] 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明， 不能认 定本发明的具体实施只局限于这些说明。 对于本发明所属技术领域的普通技术 人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干简单推演或替换， 都应当视为属于本发明的保护范围。
工业实用性
[0027] 本发明提供的 TNLG5 A基因的 RNAi表达载体具有转染效率高， 用量少， 可高 效、 特异地抑制 Jurkat细胞 TNLG5A基因表达的优点， 可作为有力工具应用于制 备治疗 TNLG5A基因表达异常相关疾病的药物。
Claims
权利要求书
一种分离的多核苷酸， 其特征在于， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO: 1所 示。
一种载体， 其特征在于， 它含有权利要求 1所述的多核苷酸。
一种重组载体， 含有如 SEQ ID
NO:2所示的序列， 所述重组载体是以 pLVX-shRNAl为骨架载体， 在 重组位点处插入顺序连接的由 Bam HI酶切位点 +靶核苷酸序歹 ij+茎环 结构序列 +靶核苷酸序列互补序列 +终止位点序列 +EcoR I酶切位点组 成的 shRNA寡核苷酸序列。
一种权利要求 3所述的 TNLG5A基因的 RNAi表达载体的制备方法， 其 特征在于， 包括如下步骤：
A) shRNA寡核苷酸序列的设计： 根据 TNLG5A的 mRNA全序列， 经 BLAST同源性比对证实特异性后应用 RNA
Stmcture4.4软件对靶 mRNA序列的二级结构进行评估得到靶核苷酸序 列， 设计并合成靶向 TNLG5 A基因的 shRNA寡核苷酸序列；
B) TNLG5A基因的 RNAi表达载体的构建和鉴定： 将合成的 shRNA寡 核苷酸单链按等摩尔比混合， 退火形成双链的 shRNA, 提取质粒 pLV X-shRNAl , 用限制性内切酶 Bam HI、 EcoR I双酶切， 电泳、 切胶回 收载体， 再用 T4 DNA Ligase分别将双链 shRNA连接 SJpLVX-shRNA 1 表达载体中， 得到连接产物； 将连接产物转化到感受态大肠杆菌 Stbl 3中， 均匀涂布到含氨苄青霉素 LB培养基平板上， 挑取阳性单克隆菌 落培养保存并进行 PCR鉴定， 将初步鉴定结果说明 shRNA寡核苷酸序 列插入成功的菌液进行测序鉴定；
C) TNLG5A基因的 RNAi表达载体的抽提： 将测序结果证实 shRNA寡 核苷酸序列插入成功的菌液扩增培养， 进行大量抽提重组质粒， 得到 TNLG5A基因的 RNAi表达载体。
一种权利要求 1所述的多核苷酸或权利要求 2所述的重组载体或权利要 求 3所述的 TNLG5 A基因的 RNAi表达载体在治疗 TNLG5 A基因表达异
常相关疾病的应用。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| PCT/CN2017/077604 WO2018170762A1 (zh) | 2017-03-22 | 2017-03-22 | TNLG5A基因的RNAi表达载体、构建方法及其应用 |
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Publications (1)
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ID=63584892
Family Applications (1)
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| WO (1) | WO2018170762A1 (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101948859A (zh) * | 2010-08-17 | 2011-01-19 | 深圳市疾病预防控制中心 | 特异性抑制SET蛋白表达的shRNA表达载体及其构建方法和应用 |
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- 2017-03-22 WO PCT/CN2017/077604 patent/WO2018170762A1/zh not_active Ceased
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| WANG, HUI ET AL.: "4-1BBL Small Interfering RNA Inhibits the Proliferation of HL-60B Cell in Vitro", JOURNAL OF BENGBU MEDICAL COLLEGE, vol. 2010, no. 8, 15 August 2010 (2010-08-15), pages 757 - 761 * |
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