WO2018170622A1 - 一种同步下调微小rna-152和微小rna-185表达的方法 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to the field of life sciences, and more particularly to a method for simultaneously down-regulating the expression of microRNA-152 and microRNA-185.
- MicroRNA-152 (miR-152) is a multifunctional miRNA. It was found that miR-152 is related to methylation, such as methyltransferase DNMT1 content and enzyme activity, miR-152 can be DNA methylation of endometrial cancer becomes a silent gene, and it is associated with the development of various cancers. It is a tumor suppressor microRNA, with preeclampsia, trophoblastic tumor, bladder cancer, gastrointestinal cancer, ovarian cancer.
- microRNA-185 (miR-185) is a 22nt miRNA, located in human chromosome 22ql l.21, in the occurrence and invasion of colon cancer, gastric cancer, esophageal cancer, lung cancer, liver cancer and other tumors. It plays an important role as a tumor suppressor gene.
- it is a methylation-related tumor suppressor miRNA that affects the methylation level of the whole genome by directly targeting the expression of DNMT1, thereby regulating the methylation of certain genes. Modification of the state, affecting gene expression.
- the synergy with other drugs can provide new epigenetic ideas for the treatment of cancer.
- miRNA silencing is the presentation of artificially synthesized oligonucleotide small molecules into cells, and endogenous miRNAs.
- a heteroduplex allows the miRNA to reduce the inhibition of the target gene to achieve regulation of gene function.
- Silencing of miRNAs is currently difficult to achieve.
- Commonly used methods for silencing miRNA mainly include anti-miR, antagomiR, miRNA sponge, etc. These methods have short effects such as short inter-turn, poor stability, complex construction, high requirements on instrument conditions, and complicated technical operations, which are difficult to achieve, simple, and effective.
- the effect of miR-152 and miR-185 expression was down-regulated simultaneously.
- the object of the present invention is to provide a method for simultaneously down-regulating the expression of miR-152 and miR-185, which is The method is simple, easy to operate, and can easily and effectively adjust the effects of miR-152 and miR-185 expression to overcome the deficiencies of the prior art.
- a method for the present invention a method for down-regulating expression of miR-152 and miR-185, and constructing eukaryotic expression targeting miR-152 and miR-185 on a eukaryotic vector pRI-GFP/Neo containing a HI promoter Vector pRI-152-185, which regulates the expression of miR-152 and miR-185 in eukaryotic cells; after transfecting the vector into eukaryotic cells in vitro, the expression of miR-152 and miR-185 was detected by real-time PCR Level.
- the sequences of pRI-GFP/Neo and Tud-152-185 were double-digested with Xho I and Bgl II, and the recovered fragments were purified and ligated overnight at 4 °C. After ligation, 6 colonies were picked and inoculated. After 12 hours of LB medium containing 1 (Vg/ml kanamycin), the bacterial solution was extracted and sent to Shanghai Yingjun for sequencing. The correctly sequenced vector was the successfully constructed recombinant plasmid pRI-152-185.
- the present invention utilizes a molecular biology technique to construct a eukaryotic expression vector containing Tud-152-185 based on a eukaryotic vector containing a CMV promoter, thereby down-regulating the expression of miR-152 and miR-185; After the vector was transfected into eukaryotic cells in vitro, the expression of miR-152 and miR-185 was detected by a real-time PCR instrument.
- the invention is not only suitable for transfection of cells, but also for the production of whole horizontal transgenic animals.
- FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of the pRI-GFP/Neo vector
- FIG. 2 is a quantitative PCR method for detecting the expression level of miRNA, wherein a. miR-152 expression, b. miR-185 expression.
- Example of a method for downregulating expression of miR-152 and miR-185 [0011] 1 First search for the sequence of hsa-miR-152 and hsa-miR-185 in the miRBase database, according to Tou gh Decoy RNA (Tud
- the design principle of RNA is to design the Tud RNA targeting hsa-miR-152 and hsa-miR-185, and finally add the Xho I and Bgl II restriction sites at the 5' and 3' ends of the Tud RNA to obtain the desired The sequence of Tud-152-185.
- the nucleotide sequence ⁇ IJ of Tud-152-185 is shown as SEQ ID No. 1.
- HepG2 cells were seeded in a 6-well plate at a density of 30,000/ml, and 10 ug of plasmid pRI-152-185 was transiently transfected with Lip ofectamine 2000, and cultured at 5 ⁇ 3 ⁇ 4C02, 37 °C; After 48 hours, total RNA was extracted from each group, and the expression of miR-152 and miR-185 was detected by Realtime PCR. The results showed that miR-152 and miR-185 were expressed in pRI-152-185 transfected group. Significant down-regulation (Figure 2) suggests that this vector can be used to down-regulate the expression of miR-152 and miR-185.
- the present invention utilizes a molecular biology technique to construct a eukaryotic expression vector containing Tud-152-185 based on a eukaryotic vector containing a CMV promoter, thereby down-regulating the expression of miR-152 and miR-185; After the vector was transfected into eukaryotic cells in vitro, the expression of miR-152 and miR-185 was detected by a real-time PCR instrument.
- the invention is not only suitable for transfection of cells, but also for the production of whole horizontal transgenic animals.
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Abstract
提供了一种降低微小RNA-152和微小RNA-185表达的方法，包括在含H1启动子的真核载体pRI-GFP/Neo上构建靶向miR-152和miR-185的真核表达载体pRI-152-185，实现下调miR-152和miR-185的表达。
Description
发明名称：一种同步下调微小 RNA-152和微小 RNA-185表达的方法 技术领域
[0001] 本发明涉及生命科学领域， 尤其是一种同步下调微小 RNA-152和微小 RNA-185 表达的方法。
背景技术
[0002] 微小 RNA-152 (miR-152) 是一种具有多功能的 miRNA, 研究发现 miR-152与甲 基化相关， 如与甲基转移酶 DNMT1含量和酶活性相关， miR-152可被子宫内膜 癌 DNA甲基化变为沉默基因， 并且其与多种癌症的发生发展相关， 它是一种肿 瘤抑制 microRNA, 与子痫前期、 滋养细胞肿瘤、 膀胱癌、 胃肠癌、 卵巢癌等诸 多疾病相关； 微小 RNA-185 (miR-185) 是一个长度为 22nt的 miRNA, 定位于人 染色体 22ql l.21， 在结肠癌、 胃癌、 食管癌、 肺癌、 肝癌等肿瘤的发生和侵袭等 方面作为一个抑癌基因发挥重要作用， 另外它一种甲基化相关的抑瘤性 miRNA ， 可通过直接靶向 DNMT1的表达而影响全基因组的甲基化水平， 进而调控某些 基因的甲基化修饰状态， 影响基因表达。 通过控制 miR-152和 miR-185的表达， 同吋与其他药物协同作用， 能为治疗癌症提供新的表观遗传思路。
技术问题
[0003] 目前 miRNA功能研究一般通过 miRNA过表达和沉默来实现， miRNA沉默是把 人工合成的寡核苷酸小分子提呈到细胞内， 与内源性 miRNA
形成异源双链， 使 miRNA降低对靶基因的抑制作用， 以实现对基因功能的调控 。 miRNA沉默， 特别是长期稳定沉默目前较难以实现。 常用的沉默 miRNA的方 法主要有 anti-miR， antagomiR, miRNA sponge等， 这些方法存在作用吋间短、 稳定性差、 构建复杂、 仪器条件要求高且技术操作复杂的不足， 难以达到方便 、 简单而有效地同步下调 miR-152和 miR-185表达的效果。
问题的解决方案
技术解决方案
[0004] 本发明的目的是： 提供一种同步下调 miR-152和 miR-185表达的方法， 它方法设
计简单， 操作容易， 能简单而有效地下调 miR-152和 miR-185表达的效果， 以克 服现有技术的不足。
[0005] 本发明的实现方法： 下调 miR-152和 miR-185表达的方法， 在含 HI启动子的真 核载体 pRI-GFP/Neo上构建靶向 miR- 152和 miR- 185的真核表达载体 pRI- 152-185 , 以下调 miR-152和 miR-185在真核细胞中的表达； 将该载体体外转染真核细胞后 ， 利用荧光定量 PCR仪检测 miR- 152和 miR- 185的表达水平。
[0006] 所述的 pRI-152-185的构建， 具体是， 利用软件完成 Tud-152-185的序列设计
； 用 Xho I、 Bgl II双酶切骨架载体 pRI-GFP/Neo和 Tud-152-185序列， 回收片段纯 化， 再 4°C的条件下过夜连接； 连接后转化， 挑取 6个菌落， 接种到含 l(Vg/ml卡 那霉素的 LB培养基中， 12小吋后提取菌液并送上海英骏测序。 测序正确的载体 即为成功构建的重组质粒 pRI-152-185。
发明的有益效果
有益效果
[0007] 本发明利用分子生物学技术， 在含 CMV启动子的真核载体基础上， 构建含 Tud- 152-185的真核表达载体， 实现下调 miR-152和 miR-185的表达； 并通过将该载体 体外转染真核细胞后， 利用荧光定量 PCR仪检测 miR-152和 miR-185表达情况。 本发明不仅适于细胞的转染， 也可用于整体水平转基因动物的制作。
对附图的简要说明
附图说明
[0008] 图 1为所述 pRI-GFP/Neo载体的结构示意图； 图 2为定量 PCR检测 miRNA表达水 平情况， 其中， a. miR-152的表达情况， b. miR- 185的表达情况。
实施该发明的最佳实施例
本发明的最佳实施方式
[0009] 根据下述实施例， 可以更好地理解本发明。 然而， 本领域的技术人员容易理解
， 实施例所描述的具体的物料配比、 工艺条件及其结果仅用于说明本发明， 而 不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0010] 实施例下调 miR-152和 miR-185表达的方法
[0011] ①首先在 miRBase数据库中检索出 hsa-miR-152和 hsa-miR-185的序列， 根据 Tou gh Decoy RNA (Tud
RNA) 的设计原则设计靶向 hsa-miR-152和 hsa-miR-185的 Tud RNA， 最后在 Tud RNA的 5'端和 3'端加上 Xho I和 Bgl II酶切位点， 获得所需的 Tud-152-185序列。 所 述 Tud-152-185的核苷酸序歹 IJ如 SEQ ID No 1所示。
[0012] ②用 Xho l和 8§1 11双酶切骨架载体 1-0?? 60和1^(1-152-185序列， 回收片段 纯化， 再 4°C的条件下过夜连接； 连接后转化， 挑取 6个菌落， 接种到含 lO g/ml 卡那霉素的 LB培养基中， 12小吋后提取菌液并送上海英骏测序。 测序正确的载 体即为成功构建的重组质粒 pRI-152-185。
[0013] ③应用无内毒素质粒提取试剂盒 （天根生化） 提取重组质粒 pRI-152-185。
[0014] 按 3万 /ml的密度将 HepG2细胞接种于 6孔板中， 将 10ug质粒 pRI-152-185利用 Lip ofectamine2000瞬吋转染细胞， 继续在 5<¾C02、 37°C条件下培养； 48小吋后， 抽 取各组细胞总 RNA， 利用 Realtime PCR分别检测 miR-152和 miR-185表达情况， 结 果显示， pRI-152-185转染组中， miR-152和 miR-185表达均水平显著下调 （图 2) ， 提示该载体可以用于同步下调 miR- 152和 miR- 185的表达。
工业实用性
[0015] 本发明利用分子生物学技术， 在含 CMV启动子的真核载体基础上， 构建含 Tud- 152-185的真核表达载体， 实现下调 miR-152和 miR-185的表达； 并通过将该载体 体外转染真核细胞后， 利用荧光定量 PCR仪检测 miR-152和 miR-185表达情况。 本发明不仅适于细胞的转染， 也可用于整体水平转基因动物的制作。
Claims
[权利要求 1] 一种同步下调微小 RNA-152和微小 RNA-185的方法， 其特征在于： 在 含 H 1启动子的真核载体 pRI-GFP/Neo上构建靶向 miR- 152和 miR- 185的 真核表达载体 pRI- 152-185 , 以下调 miR- 152和 miR- 185在真核细胞中 的表达； 将该载体体外转染真核细胞后， 利用荧光定量 PCR仪检测 mi R- 152和 miR- 185的表达水平。
[权利要求 2] 根据权利要求 1所述的同步下调微小 RNA-152和微小 RNA-185表达的 方法， 其特征在于： 所述的 pRI-152-185的构建， 具体是， 利用软件 完成 Tud-152-185的序列设计； 用 Xho I、 Bgl
II双酶切骨架载体 pRI-GFP/Neo和 Tud-152-185序列， 回收片段纯化， 再 4°C的条件下过夜连接； 连接后转化， 挑取 6个菌落， 接种到含 10μ§ /ml卡那霉素的 LB培养基中， 12小吋后提取菌液并送上海英骏测序。 测序正确的载体即为成功构建的重组质粒 pRI-152-185。
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