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WO2018169307A1 - 규조토를 이용한 미생물 농축 방법 및 핵산 추출 방법 - Google Patents

규조토를 이용한 미생물 농축 방법 및 핵산 추출 방법 Download PDF

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Publication number
WO2018169307A1
WO2018169307A1 PCT/KR2018/002994 KR2018002994W WO2018169307A1 WO 2018169307 A1 WO2018169307 A1 WO 2018169307A1 KR 2018002994 W KR2018002994 W KR 2018002994W WO 2018169307 A1 WO2018169307 A1 WO 2018169307A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
dimethyl
composition
diatomaceous earth
silane compound
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2018/002994
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
신용
조비
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Asan Foundation
University of Ulsan Foundation for Industry Cooperation
Original Assignee
Asan Foundation
University of Ulsan Foundation for Industry Cooperation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020180028131A external-priority patent/KR102136694B1/ko
Application filed by Asan Foundation, University of Ulsan Foundation for Industry Cooperation filed Critical Asan Foundation
Priority to EP18767296.9A priority Critical patent/EP3597773A4/en
Priority to US16/492,606 priority patent/US20210079374A1/en
Publication of WO2018169307A1 publication Critical patent/WO2018169307A1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01B—NON-METALLIC ELEMENTS; COMPOUNDS THEREOF; METALLOIDS OR COMPOUNDS THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASS C01C
    • C01B33/00—Silicon; Compounds thereof
    • C01B33/113—Silicon oxides; Hydrates thereof
    • C01B33/12—Silica; Hydrates thereof, e.g. lepidoic silicic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples

Definitions

  • the present invention relates to a method for enriching microorganisms and a method for extracting nucleic acids using diatomaceous earth, in particular diatomaceous earth modified with a silane compound.
  • Diatoms are unicellular algae that are distributed in various sizes from 2 ⁇ m to 2 mm and are representative phytoplankton commonly found on the earth. Diatoms account for 20-25% of the total primary production of land and 40% of marine biomass production, and have played an important role in ecosystems as marine producers for millions of years.
  • microalgae have high photosynthetic efficiency relative to cell mass and are mainly used for the production of lipids, biofuels, and bioavailable resources through culture.
  • diatomaceous earth is a natural siliceous material which is a main component of diatomaceous cell membrane, and is known as bio-silica because it is calcined at 450 ° C. and composed of silica-rich silica on the surface.
  • the size of the bio-silica is about 10-20 ⁇ m.
  • An object of the present invention is a composition for concentrating microorganisms comprising diatomaceous earth modified with a silane compound as an active ingredient, a method and kit for concentrating microorganisms using the same;
  • a nucleic acid extracting composition comprising diatomaceous earth modified with a silane compound as an active ingredient, a nucleic acid extracting method and kit using the same;
  • it provides a composition for microbial enrichment and nucleic acid extraction, including a diatomaceous earth modified with a silane compound as an active ingredient, a method and kit for extracting nucleic acid from the concentrated microorganism at the same time as the microorganism concentration using the same.
  • the present invention provides a composition for concentrating microorganisms comprising diatomaceous earth modified with a silane compound as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for concentrating microorganisms comprising contacting a sample containing microorganisms with diatomaceous earth modified with the silane compound.
  • the present invention also provides a microbial enrichment kit comprising the composition.
  • the present invention also provides a nucleic acid extracting composition comprising diatomaceous earth modified with a silane compound as an active ingredient.
  • the present invention comprises the steps of (1) reacting by adding a diatomaceous earth modified with a silane compound to the nucleic acid sample to be extracted; And (2) provides a nucleic acid extraction method comprising the step of eluting the nucleic acid from the reaction.
  • the present invention comprises the steps of (1) adding and mixing the diatomaceous earth modified with the silane compound to the nucleic acid sample to be extracted; (2) dimethyl adipimidate (DMA), dimethyl pimelimidate (DMP), dimethyl suberimidate (DMS) and dimethyl 3,3'-dithiobis Reacting by adding one or more selected from the group consisting of dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate (DTBP); And (3) provides a nucleic acid extraction method comprising the step of eluting the nucleic acid from the reaction.
  • DMA dimethyl adipimidate
  • DMP dimethyl pimelimidate
  • DMS dimethyl suberimidate
  • DTBP dimethyl 3,3'-dithiobis Reacting by adding one or more selected from the group consisting of dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate
  • DTBP dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate
  • the present invention also provides a nucleic acid extraction kit comprising the composition.
  • the present invention also provides a composition for microbial enrichment and nucleic acid extraction comprising diatomaceous earth modified with a silane compound as an active ingredient.
  • the present invention comprises the steps of (1) contacting the sample containing the microorganism to the diatomaceous earth modified with the silane compound to concentrate the microorganism; (2) dissolving the concentrated microorganism; And (3) eluting the nucleic acid from the lysate, and providing a method for extracting the nucleic acid from the concentrated microorganism at the same time as the microorganism is concentrated.
  • the present invention comprises the steps of (1) contacting the sample containing the microorganism to the diatomaceous earth modified with the silane compound to concentrate the microorganism; (2) dissolving the concentrated microorganism; (3) dimethyl adipimidate (DMA), dimethyl pimelimidate (DMP), dimethyl suberimidate (DMS) and dimethyl 3,3'-diti in the lysate Reacting by adding any one or more selected from the group consisting of dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate (DTBP); And (4) provides a method for extracting nucleic acid from the concentrated microorganism simultaneously with the concentration of the microorganism comprising eluting the nucleic acid from the reaction.
  • DMA dimethyl adipimidate
  • DMP dimethyl pimelimidate
  • DMS dimethyl suberimidate
  • DTBP dimethyl 3,3'-diti in the lysate Reacting by adding any one or more selected from the group consisting of dimethyl 3,3'-d
  • the present invention also provides a microbial enrichment and nucleic acid extraction kit comprising the composition.
  • the present invention also provides the use of diatomaceous earth modified with a silane compound for microbial enrichment.
  • the present invention also provides the use of diatomaceous earth modified with silane compounds for nucleic acid extraction.
  • the present invention also provides the use of diatomaceous earth modified with silane compounds for microbial enrichment and nucleic acid extraction.
  • the present invention relates to a method for concentrating microorganisms and nucleic acid extraction method using diatomaceous earth, conventional methods for detecting microorganisms do not use the entire solution in more than 1 ml of the patient sample, extracting nucleic acids using only a part of them Detection has been performed using this. For large amounts of microorganisms, this is not a big problem, but for small amounts of microorganisms, it is not possible to detect them correctly, which leads to problems in controlling additional infectious diseases. Research is needed. Therefore, the present inventors have developed a technology capable of concentrating microorganisms about 4-8 times using existing diatomaceous earth, and extracting nucleic acids directly using dimethyl adipimidate (DMA). Developed methods. By enabling microbial enrichment and nucleic acid extraction techniques in one tube, it is expected to significantly reduce external contamination, cost, time and complexity.
  • DMA dimethyl adipimidate
  • Figure 2 shows the results of experimental validation in the pathogen concentration process.
  • D diatomaceous earth
  • DA diatomaceous earth modified with APTES.
  • Figure 3 is the result of optimizing the pathogen concentration experimental conditions by changing the modified diatomaceous earth concentration.
  • Figure 7 shows the results of experimental validation in the DNA extraction process.
  • D diatomaceous earth
  • DA diatomaceous earth modified with APTES.
  • D diatomaceous earth
  • DA diatomaceous earth modified with APTES.
  • RNA extraction experiment 12 is a result of optimizing RNA extraction experiment conditions by varying the concentration of diatomaceous earth (DA) modified with APTES.
  • DA diatomaceous earth
  • Figure 13 is the result of optimizing the RNA extraction experimental conditions by varying the reaction time.
  • FIG. 16 shows experimental results of applying an amine-functionalized diatomaceous earth-based, dimethyl suberimidate assisted system (ADD system) based on RNA extraction from pathogen Brucella sample.
  • ADD system dimethyl suberimidate assisted system
  • the present invention provides a composition for concentrating microorganisms comprising diatomaceous earth modified with a silane compound as an active ingredient.
  • the silane compound may be a compound represented by the following Chemical Formula 1, but is not limited thereto.
  • R 1 to R 3 may each be the same or different, either C1 to C4 alkyl or C1 to C4 alkoxy, R 4 is amino (C1 to C10) alkyl, 3- (2-amino ( C1 to C4) alkylamino) (C1 to C4) alkyl or 3- [2- (2-amino (C1 to C4) alkylamino) (C1 to C4) alkylamino] (C1 to C4) alkyl.
  • the silane compound is (3-aminopropyl) triethoxysilane (APTES), (3-aminopropyl) trimethoxysilane ((3-aminopropyl) trimethoxysilane), (1 -(Aminomethyl) triethoxysilane ((1-aminomethyl) triethoxysilane), (2-aminoethyl) triethoxysilane ((2-aminoethyl) triethoxysilane), (4-aminobutyl) triethoxysilane ((4- aminobutyl) triethoxysilane), (5-aminopentyl) triethoxysilane, (6-aminohexyl) triethoxysilane, (6-aminohexyl) triethoxysilane, 3-aminopropyl (diethoxy Methylsilane (3-aminopropyl (diethoxy) methylsilane),
  • the microorganism may be any negatively charged microorganism such as bacteria, viruses or cells, and more preferably Brucella ovis or para influenza virus (PIV3) described in the embodiment of the present invention.
  • PIV3 para influenza virus
  • the concentration of the microorganism may be 10 0 cfu / ml to 10 7 cfu / ml, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a method for concentrating microorganisms comprising contacting a sample containing microorganisms with diatomaceous earth modified with a silane compound.
  • the silane compound may be a compound represented by the following Chemical Formula 1, but is not limited thereto.
  • R 1 to R 3 may each be the same or different, either C1 to C4 alkyl or C1 to C4 alkoxy, R 4 is amino (C1 to C10) alkyl, 3- (2-amino ( C1 to C4) alkylamino) (C1 to C4) alkyl or 3- [2- (2-amino (C1 to C4) alkylamino) (C1 to C4) alkylamino] (C1 to C4) alkyl.
  • the silane compound is most suitable for (3-aminopropyl) triethoxysilane (APTES) described in the embodiment of the present invention.
  • APTES (3-aminopropyl) triethoxysilane
  • the sample containing the microorganism is feces, urine, tears, saliva, external secretions of the skin, external secretions of the respiratory tract, external secretions of the intestinal tract, external secretions of the digestive tract, plasma, Serum, blood, spinal fluid, lymph, body fluids and tissues, but are not limited thereto.
  • the microorganism may be any negatively charged microorganism such as bacteria, viruses or cells, and more preferably Brucella ovis or para influenza virus (PIV3) described in the embodiment of the present invention.
  • PIV3 para influenza virus
  • the concentration of the microorganism may be 10 0 cfu / ml to 10 7 cfu / ml, but is not limited thereto.
  • the step of contacting the microorganism to the diatomaceous earth modified with the silane compound may be contacted for 20 to 60 minutes, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a microbial enrichment kit comprising the composition.
  • the kit may further include a buffer solution for adjusting pH required for effective microbial concentration.
  • the present invention also provides a nucleic acid extracting composition comprising diatomaceous earth modified with a silane compound as an active ingredient.
  • the silane compound may be a compound represented by the following Chemical Formula 1, but is not limited thereto.
  • R 1 to R 3 may each be the same or different, either C1 to C4 alkyl or C1 to C4 alkoxy, R 4 is amino (C1 to C10) alkyl, 3- (2-amino ( C1 to C4) alkylamino) (C1 to C4) alkyl or 3- [2- (2-amino (C1 to C4) alkylamino) (C1 to C4) alkylamino] (C1 to C4) alkyl.
  • the silane compound is most suitable for (3-aminopropyl) triethoxysilane (APTES) described in the embodiment of the present invention.
  • APTES (3-aminopropyl) triethoxysilane
  • the composition is dimethyl adipimidate (DMA), dimethyl pimelimidate (DMP), dimethyl suberimidate (DMS) and dimethyl 3,3'-dity It may further include any one or more selected from the group consisting of dimethyl propionimate (Dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate; DTBP).
  • DMA dimethyl adipimidate
  • DMP dimethyl pimelimidate
  • DMS dimethyl suberimidate
  • DTBP dimethyl 3,3'-dity
  • the nucleic acid may be DNA or RNA, but is not limited thereto.
  • the present invention comprises the steps of (1) reacting by adding a diatomaceous earth modified with a silane compound to the nucleic acid sample to be extracted; And (2) provides a nucleic acid extraction method comprising the step of eluting the nucleic acid from the reaction.
  • the present invention comprises the steps of (1) adding and mixing the diatomaceous earth modified with the silane compound to the nucleic acid sample to be extracted; (2) dimethyl adipimidate (DMA), dimethyl pimelimidate (DMP), dimethyl suberimidate (DMS) and dimethyl 3,3'-dithiobis Reacting by adding one or more selected from the group consisting of dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate (DTBP); And (3) provides a nucleic acid extraction method comprising the step of eluting the nucleic acid from the reaction.
  • DMA dimethyl adipimidate
  • DMP dimethyl pimelimidate
  • DMS dimethyl suberimidate
  • DTBP dimethyl 3,3'-dithiobis Reacting by adding one or more selected from the group consisting of dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate
  • DTBP dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate
  • the silane compound may be a compound represented by the following Chemical Formula 1, but is not limited thereto.
  • R 1 to R 3 may each be the same or different, either C1 to C4 alkyl or C1 to C4 alkoxy, R 4 is amino (C1 to C10) alkyl, 3- (2-amino ( C1 to C4) alkylamino) (C1 to C4) alkyl or 3- [2- (2-amino (C1 to C4) alkylamino) (C1 to C4) alkylamino] (C1 to C4) alkyl.
  • the silane compound is most suitable for (3-aminopropyl) triethoxysilane (APTES) described in the embodiment of the present invention.
  • APTES (3-aminopropyl) triethoxysilane
  • the nucleic acid may be DNA or RNA, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a nucleic acid extraction kit comprising the composition.
  • the kit may further include a lysis buffer or a protease for lysing the cells in the sample to release the nucleic acid from inside the cell, and a buffer for pH adjustment required for effective nucleic acid extraction. It may additionally be included.
  • the present invention also provides a composition for microbial enrichment and nucleic acid extraction comprising diatomaceous earth modified with a silane compound as an active ingredient.
  • the silane compound may be a compound represented by the following Chemical Formula 1, but is not limited thereto.
  • R 1 to R 3 may each be the same or different, either C1 to C4 alkyl or C1 to C4 alkoxy, R 4 is amino (C1 to C10) alkyl, 3- (2-amino ( C1 to C4) alkylamino) (C1 to C4) alkyl or 3- [2- (2-amino (C1 to C4) alkylamino) (C1 to C4) alkylamino] (C1 to C4) alkyl.
  • the silane compound is most suitable for (3-aminopropyl) triethoxysilane (APTES) described in the embodiment of the present invention.
  • APTES (3-aminopropyl) triethoxysilane
  • the microorganism may be any negatively charged microorganism such as bacteria, viruses or cells, and more preferably Brucella ovis or para influenza virus (PIV3) described in the embodiment of the present invention.
  • PIV3 para influenza virus
  • the concentration of the microorganism may be 10 0 cfu / ml to 10 7 cfu / ml, but is not limited thereto.
  • the composition is dimethyl adipimidate (DMA), dimethyl pimelimidate (DMP), dimethyl suberimidate (DMS) and dimethyl 3,3'-dity It may further comprise the step of reacting by adding any one or more selected from the group consisting of dimethyl propionimate (Dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate; DTBP).
  • DMA dimethyl adipimidate
  • DMP dimethyl pimelimidate
  • DMS dimethyl suberimidate
  • DTBP dimethyl 3,3'-dity
  • the nucleic acid may be DNA or RNA, but is not limited thereto.
  • the present invention comprises the steps of (1) contacting the sample containing the microorganism to the diatomaceous earth modified with the silane compound to concentrate the microorganism; (2) dissolving the concentrated microorganism; And (3) eluting the nucleic acid from the lysate, and providing a method for extracting the nucleic acid from the concentrated microorganism at the same time as the microorganism is concentrated.
  • the present invention comprises the steps of (1) contacting the sample containing the microorganism to the diatomaceous earth modified with the silane compound to concentrate the microorganism; (2) dissolving the concentrated microorganism; (3) dimethyl adipimidate (DMA), dimethyl pimelimidate (DMP), dimethyl suberimidate (DMS) and dimethyl 3,3'-diti in the lysate Reacting by adding any one or more selected from the group consisting of dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate (DTBP); And (4) provides a method for extracting nucleic acid from the concentrated microorganism simultaneously with the concentration of the microorganism comprising eluting the nucleic acid from the reaction.
  • DMA dimethyl adipimidate
  • DMP dimethyl pimelimidate
  • DMS dimethyl suberimidate
  • DTBP dimethyl 3,3'-diti in the lysate Reacting by adding any one or more selected from the group consisting of dimethyl 3,3'-d
  • the silane compound may be a compound represented by the following Chemical Formula 1, but is not limited thereto.
  • R 1 to R 3 may each be the same or different, either C1 to C4 alkyl or C1 to C4 alkoxy, R 4 is amino (C1 to C10) alkyl, 3- (2-amino ( C1 to C4) alkylamino) (C1 to C4) alkyl or 3- [2- (2-amino (C1 to C4) alkylamino) (C1 to C4) alkylamino] (C1 to C4) alkyl.
  • the silane compound is most suitable for (3-aminopropyl) triethoxysilane (APTES) described in the embodiment of the present invention.
  • APTES (3-aminopropyl) triethoxysilane
  • the sample containing the microorganism is feces, urine, tears, saliva, external secretions of the skin, external secretions of the respiratory tract, external secretions of the intestinal tract, external secretions of the digestive tract, plasma, Serum, blood, spinal fluid, lymph, body fluids and tissues, but are not limited thereto.
  • the microorganism may be any negatively charged microorganism such as bacteria, viruses or cells, and more preferably Brucella ovis or para influenza virus (PIV3) described in the embodiment of the present invention.
  • PIV3 para influenza virus
  • the concentration of the microorganism may be 10 0 cfu / ml to 10 7 cfu / ml, but is not limited thereto.
  • the nucleic acid may be DNA or RNA, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a microbial enrichment and nucleic acid extraction kit comprising the composition.
  • the kit may further include a lysis buffer or a protease for lysing the cells in the sample to release the nucleic acid from inside the cell, and for adjusting the pH required for effective microbial concentration or nucleic acid extraction. Buffers and the like may be additionally included.
  • the kit may be in the form of a well-plate, a tube, a column or a microfluidic chip, but the kit may be in the form of any commercially available form. It is possible.
  • the well-plate may be manufactured without limitation, such as 96 wells, 384 wells.
  • the kit may be a single composition or the individual components of the composition for microbial enrichment or nucleic acid extraction may be stored separately for mixing before use.
  • the components of the composition for microbial enrichment or nucleic acid extraction in the kit of the present invention may be packaged separately, or may be packaged in one or more mixtures in any combination of components.
  • Each of the individual components or one or more mixtures may be placed in different containers and may comprise the entire kit in a single container.
  • the present invention also provides the use of diatomaceous earth modified with a silane compound for microbial enrichment.
  • the present invention also provides the use of diatomaceous earth modified with silane compounds for nucleic acid extraction.
  • the present invention also provides the use of diatomaceous earth modified with silane compounds for microbial enrichment and nucleic acid extraction.
  • Brucella ovis was used as the test pathogen.
  • 1 ml of 10 6 cfu / ml Brucella solution was used.
  • HCT-116 cancer cells were used as test samples.
  • 1 ml of 10 5 cells / ml cell solution was used.
  • 100 ⁇ l elution buffer was used for final DNA extraction.
  • DNA was extracted using diatomaceous earth (D) and diatomaceous earth (DA) modified with APTES, and dimethyl adipimidate (DMA) was added.
  • D diatomaceous earth
  • DA diatomaceous earth
  • DMA dimethyl adipimidate
  • the sample is allowed to react at room temperature until the sample becomes clear (within 1 minute).
  • the reaction is carried out at 56 ° C. for 20 minutes to bind DNA to the modified diatomaceous earth (DA).
  • DA modified diatomaceous earth
  • the mixture is centrifuged for 1 minute using a microcentrifuge. Carefully remove the supernatant.
  • the mixture is centrifuged for 1 minute. Using a pipette, transfer the supernatant to a new microtube.
  • HCT-116 cell concentration was varied from 10 0 cells / ml to 10 7 cells / ml. As shown in FIG. 10, Q-PCR results showed that DNA extraction was effective even at low cell concentrations.
  • HCT-116 cancer cells were used as test samples.
  • 1 ml of 10 5 cells / ml cell solution was used.
  • 100 ⁇ l elution buffer was used for final RNA extraction.
  • RNA extraction ii. 40 ⁇ l of DA was used for RNA extraction.
  • HCT-116 cell concentration was varied from 10 1 cells / ml to 10 6 cells / ml.
  • Q-PCR results showed that RNA extraction was effective even at low cell concentrations.
  • DA diatomaceous earth
  • Example 6> for diagnosis Amine Modified Diatomaceous earth based systems (amine-functionalized, diatomaceous earth-based, dimethyl suberimidate assisted system; Application of ADD system
  • the ADD system of the present invention was able to successfully extract RNA from biological samples. Compared with traditional analytical methods, the optimized protocol of the ADD system is expected to be useful for nucleic acid-based diagnostics.
  • Human brucellosis an endemic disease in many countries and regions, is a worldwide common infectious disease.
  • using the ADD system was able to detect even at very low Brucella concentration of 10 0 CFU / mL, which was confirmed that the detection sensitivity is 100 times more improved than the existing kit.
  • NTC no-template control
  • the ADD system of the present invention further confirmed clinical utility using RNA extracted from 10 5 CFU / mL Brucella samples derived from urine. Since Brucella is a transfection pathogen, we included the same concentration of Brucella in human urine and sheep urine samples. Although the overall Ct value of Brucella in urine was slower than PBS, it was confirmed that the RNA extracted using the ADD system was faster than the RNA extracted using the existing kit (FIG. 16c).
  • RNA samples extracted by the ADD system showed faster Ct values compared to existing kits.
  • we tested a relatively large volume of samples using the ADD system increasing the detection limit by loading more samples.
  • using the ADD system was able to extract more RNA from a large volume (1 mL) sample compared to using the other system (Fig.
  • the Ct value for the 1 mL sample derived RNA was about 2 cycles faster than the 200 ⁇ L sample, clearly indicating that the total amount of extracted RNA increased when the sample volume was large.
  • the protocol was optimized for 200 ⁇ L samples, the ADD system could also be used for RNA extraction of large volume samples. Therefore, the ADD system proposed in the present invention can be usefully used for RNA extraction and pathogen detection based on nucleic acid amplification by RT-qPCR.

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Abstract

본 발명은 규조토를 이용한 미생물 농축 방법 및 핵산 추출 방법에 관한 것으로서, 규조토를 이용해서 기존 대비 4-8배 가량 미생물 농축이 가능한 기술을 개발하였으며, 디메틸 아디프이미데이트(dimethyl adipimidate; DMA) 등을 이용해서 농축된 미생물을 바로 핵산 추출할 수 있는 방법을 개발하였다. 미생물 농축과 핵산 추출 기술을 하나의 튜브(tube)에서 가능하게 함으로써, 외부로 오는 오염이나, 비용, 시간, 복잡성 등을 확연히 줄일 것으로 예상된다.

Description

규조토를 이용한 미생물 농축 방법 및 핵산 추출 방법
본 발명은 규조토, 특히 실란 화합물로 개질된 규조토를 이용한 미생물 농축 방법 및 핵산 추출 방법에 대한 것이다.
규조류(Diatom)는 2 ㎛ ~ 2 mm 까지의 다양한 크기로 분포하는 단세포 조류로 지구상에서 흔히 볼 수 있는 대표적인 식물성 플랑크톤이다. 규조류는 육상 총 1차 생산량의 20 ~ 25%를 차지하고, 해상 생물량 생산의 40%를 차지하고 있기 때문에 수백만 년 동안 해양의 생산자로써 생태계에 중요한 역할을 담당해오고 있다. 현재, 미세조류들은 세포 질량 대비 높은 광합성 효율을 갖고 있어서 배양을 통한 지질이나 바이오연료 및 생체 유용 자원의 생산 등의 생산에 주로 활용되고 있다.
또한, 규조토(Diatomaceous earth)는 규조류 세포막의 주성분인 천연 규산질 소재로서, 450℃에서 가소되고, 표면상에 하이드록실기가 풍부한 실리카로 구성되므로 바이오-실리카(bio-silica)라고도 알려져 있다. 바이오-실리카의 크기는 대략 10 ~ 20 ㎛ 정도이다.
한편, 기존의 미생물 검출을 위한 방법들은 환자 샘플 시료 1 ml 이상에서 전체 용액을 다 이용하지 못하고, 그 중 일부만을 이용해서 핵산을 추출하고 이를 이용한 검출을 진행해 왔다. 많은 양의 미생물의 경우에는 큰 문제가 없지만, 적은 양의 미생물의 경우, 정확한 검출이 되지 못해서 추가적 감염병에 대한 조절에 문제가 생기는데, 1 ml 이상의 샘플 시료에서 최대한 모든 미생물을 이용하기 위한 농축 방법에 대한 연구가 필요하다.
최근, 규조류 또는 규조토를 이용하여 무기소재, 생물환경 소재, 나노공학 소재 또는 산업적 응용 소재로써 활용하려는 연구가 활발히 진행 중이지만, 미생물 농축 또는 핵산 추출에 상기 소재를 이용하는 방법에 대한 연구는 부족한 실정이다.
본 발명의 목적은 실란 화합물로 개질된 규조토를 유효성분으로 포함하는 미생물 농축용 조성물, 이를 이용한 미생물 농축 방법 및 키트; 실란 화합물로 개질된 규조토를 유효성분으로 포함하는 핵산 추출용 조성물, 이를 이용한 핵산 추출 방법 및 키트; 및 실란 화합물로 개질된 규조토를 유효성분으로 포함하는 미생물 농축 및 핵산 추출용 조성물, 이를 이용한 미생물 농축과 동시에 상기 농축된 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법 및 키트를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 실란 화합물로 개질된 규조토를 유효성분으로 포함하는 미생물 농축용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 실란 화합물로 개질된 규조토에 미생물이 함유된 시료를 접촉시키는 단계를 포함하는 미생물 농축 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 미생물 농축 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 실란 화합물로 개질된 규조토를 유효성분으로 포함하는 핵산 추출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 실란 화합물로 개질된 규조토를 추출 대상 핵산 시료에 첨가하여 반응시키는 단계; 및 (2) 상기 반응물로부터 핵산을 용출하는 단계를 포함하는 핵산 추출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 실란 화합물로 개질된 규조토를 추출 대상 핵산 시료에 첨가하여 혼합하는 단계; (2) 상기 혼합물에 디메틸 아디프이미데이트(dimethyl adipimidate; DMA), 디메틸 피멜리미데이트(dimethyl pimelimidate; DMP), 디메틸 수베르이미데이트(Dimethyl suberimidate; DMS) 및 디메틸 3,3'-디티오비스프로피온이미데이트(Dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate; DTBP)로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 첨가하여 반응시키는 단계; 및 (3) 상기 반응물로부터 핵산을 용출하는 단계를 포함하는 핵산 추출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 핵산 추출 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 실란 화합물로 개질된 규조토를 유효성분으로 포함하는 미생물 농축 및 핵산 추출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 실란 화합물로 개질된 규조토에 미생물이 함유된 시료를 접촉시켜 미생물을 농축시키는 단계; (2) 상기 농축된 미생물을 용해(lysis)시키는 단계; 및 (3) 상기 용해물로부터 핵산을 용출하는 단계를 포함하는 미생물 농축과 동시에 상기 농축된 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 실란 화합물로 개질된 규조토에 미생물이 함유된 시료를 접촉시켜 미생물을 농축시키는 단계; (2) 상기 농축된 미생물을 용해(lysis)시키는 단계; (3) 상기 용해물에 디메틸 아디프이미데이트(dimethyl adipimidate; DMA), 디메틸 피멜리미데이트(dimethyl pimelimidate; DMP), 디메틸 수베르이미데이트(Dimethyl suberimidate; DMS) 및 디메틸 3,3'-디티오비스프로피온이미데이트(Dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate; DTBP)로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 첨가하여 반응시키는 단계; 및 (4) 상기 반응물로부터 핵산을 용출하는 단계를 포함하는 미생물 농축과 동시에 상기 농축된 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 미생물 농축 및 핵산 추출 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 미생물 농축을 위한 실란 화합물로 개질된 규조토의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 핵산 추출을 위한 실란 화합물로 개질된 규조토의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 미생물 농축 및 핵산 추출을 위한 실란 화합물로 개질된 규조토의 용도를 제공한다.
본 발명은 규조토를 이용한 미생물 농축 방법 및 핵산 추출 방법에 관한 것으로서, 기존의 미생물 검출을 위한 방법들은 환자 샘플 시료 1 ml 이상에서 전체 용액을 다 이용하지 못하고, 그 중 일부만을 이용해서 핵산을 추출하고 이를 이용한 검출을 진행해 왔다. 많은 양의 미생물의 경우에는 큰 문제가 없지만, 적은 양의 미생물의 경우, 정확한 검출이 되지 못해서 추가적 감염병에 대한 조절에 문제가 생기는데, 1 ml 이상의 샘플 시료에서 최대한 모든 미생물을 이용하기 위한 농축 방법에 대한 연구가 필요하다. 이에 본 발명자들은 개질된 규조토를 이용해서 기존 대비 4-8배 가량 미생물 농축이 가능한 기술을 개발하였으며, 디메틸 아디프이미데이트(dimethyl adipimidate; DMA) 등을 이용해서 농축된 미생물을 바로 핵산 추출할 수 있는 방법을 개발하였다. 미생물 농축과 핵산 추출 기술을 하나의 튜브(tube)에서 가능하게 함으로써, 외부로 오는 오염이나, 비용, 시간, 복잡성 등을 확연히 줄일 것으로 예상된다.
도 1은 APTES로 개질 전(파랑)과 개질 후(빨강) 규조토의 FTIR 스펙트럼을 나타낸다.
도 2는 병원균 농축 공정에 있어, 실험 타당성 확인 결과이다. D: 규조토, DA: APTES로 개질된 규조토.
도 3은 개질된 규조토 농도를 달리하여, 병원균 농축 실험 조건을 최적화한 결과이다.
도 4는 반응시간을 달리하여, 병원균 농축 실험 조건을 최적화한 결과이다.
도 5는 브루셀라 농도를 달리하여, 병원균 농축 실험 조건을 최적화한 결과이다.
도 6은 개질된 규조토를 이용하여서, 바이러스 농축 실험 조건을 최적화한 결과이다.
도 7은 DNA 추출 공정에 있어, 실험 타당성 확인 결과이다. D: 규조토, DA: APTES로 개질된 규조토.
도 8은 APTES로 개질된 규조토(DA) 농도를 달리하여, DNA 추출 실험 조건을 최적화한 결과이다.
도 9는 반응시간을 달리하여, DNA 추출 실험 조건을 최적화한 결과이다.
도 10은 HCT-116 세포 농도를 달리하여, DNA 추출 실험 조건을 최적화한 결과이다.
도 11은 RNA 추출 공정에 있어, 실험 타당성 확인 결과이다. D: 규조토, DA: APTES로 개질된 규조토.
도 12는 APTES로 개질된 규조토(DA) 농도를 달리하여, RNA 추출 실험 조건을 최적화한 결과이다.
도 13은 반응시간을 달리하여, RNA 추출 실험 조건을 최적화한 결과이다.
도 14는 HCT-116 세포 농도를 달리하여, RNA 추출 실험 조건을 최적화한 결과이다.
도 15는 개질된 규조토를 이용하여, 하나의 튜브에서 병원균을 농축하고 DNA를 추출한 후, Q-PCR을 수행한 결과이다.
도 16은 병원균 브루셀라 샘플 유래 RNA 추출에 기반한 아민 개질된 규조토 기반 시스템(amine-functionalized, diatomaceous earth-based, dimethyl suberimidate assisted system; ADD system)을 응용한 실험 결과를 나타낸다. (a) PBS에 연속적으로 희석된 세포 농도에 따라 추출된 RNA의 Ct 값을 나타낸다. 회색 바는 본 발명의 ADD 시스템을 사용한 결과이고, 검정색 바는 기존부터 사용된 고체상 추출 상업 키트를 사용한 결과이다. ADD 시스템을 통해 추출된 RNA의 Ct 값 및 세포 농도 사이의 선형 상관관계를 나타냈다(R2 = 0.979). (b) 추출된 RNA의 Tm 값을 RT-qPCR을 통해 측정하였다. (c) 107 CFU/mL 농도의 소변 내 브루셀라 샘플에서 ADD 시스템 및 기존 키트로 추출한 RNA의 Ct 값을 나타낸다. (d) 103 cells/mL 농도의 HCT 116 세포를 사용하여, ADD 시스템을 통해 RNA 추출하기 위해 상대적으로 대량 볼륨 샘플을 시험한 결과이다. 주형 미포함 대조군(no-template control; NTC)는 아무런 시그널을 나타내지 않았다. 에러 바는 독립적으로 3번 반복한 실험의 평균에 대한 표준편차를 나타낸다. p-값은 동일 농도 샘플에서 ADD 및 기존 키트를 비교하여 Student t test를 통해 측정하였다. ★★ pvalue <0.01, ★★★ p-value <0.001; p-value <0.01은 통계적 유의성을 나타내고, p-value <0.001은 통계적으로 높은 유의성을 나타낸다.
본 발명은 실란 화합물로 개질된 규조토를 유효성분으로 포함하는 미생물 농축용 조성물을 제공한다.
바람직하게는 상기 실란 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2018002994-appb-I000001
상기 식에서, R1 내지 R3는 각각 같거나 다를 수 있으며, C1 내지 C4의 알킬 또는 C1 내지 C4의 알콕시 중 어느 하나이고, R4는 아미노(C1 내지 C10)알킬, 3-(2-아미노(C1 내지 C4)알킬아미노)(C1 내지 C4)알킬 또는 3-[2-(2-아미노(C1 내지 C4)알킬아미노)(C1 내지 C4)알킬아미노](C1 내지 C4)알킬 중 어느 하나임.
보다 바람직하게는 상기 실란 화합물은 (3-아미노프로필)트리에톡시실란((3-aminopropyl)triethoxysilane; APTES), (3-아미노프로필)트리메톡시실란((3-aminopropyl)trimethoxysilane), (1-아미노메틸)트리에톡시실란((1-aminomethyl)triethoxysilane), (2-아미노에틸)트리에톡시실란((2-aminoethyl)triethoxysilane), (4-아미노부틸)트리에톡시실란((4-aminobutyl)triethoxysilane), (5-아미노펜틸)트리에톡시실란((5-aminopentyl)triethoxysilane), (6-아미노헥실)트리에톡시실란((6-aminohexyl)triethoxysilane), 3-아미노프로필(디에톡시)메틸실란(3-aminopropyl(diethoxy)methylsilane), N-[3-(트리메톡시실릴)프로필]에틸렌디아민(N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine), [3-(2-아미노에틸아미노)프로필]트리메톡시실란([3-(2-aminoethylamino)propyl]trimethoxysilane; AEAPTMS) 또는 3-[(트리메톡시실릴)프로필]디에틸렌트리아민(3-[(trimethoxysilyl)propyl]diethylenetriamine; TMPTA)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 더 바람직하게는 상기 실란 화합물은 본 발명의 실시예에서 기재한 (3-아미노프로필)트리에톡시실란((3-aminopropyl)triethoxysilane; APTES)이 가장 적합하다.
바람직하게는 상기 미생물은 박테리아, 바이러스 또는 세포 등 음전하를 띄는 모든 미생물일 수 있으며, 보다 바람직하게는 본 발명의 실시예에서 기재한 브루셀라 오비스(Brucella ovis) 또는 파라 인플루엔자 바이러스 (PIV3)일 수 있다.
보다 바람직하게는, 상기 미생물의 농도는 100 cfu/ml 내지 107 cfu/ml일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 실란 화합물로 개질된 규조토에 미생물이 함유된 시료를 접촉시키는 단계를 포함하는 미생물 농축 방법을 제공한다.
바람직하게는 상기 실란 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2018002994-appb-I000002
상기 식에서, R1 내지 R3는 각각 같거나 다를 수 있으며, C1 내지 C4의 알킬 또는 C1 내지 C4의 알콕시 중 어느 하나이고, R4는 아미노(C1 내지 C10)알킬, 3-(2-아미노(C1 내지 C4)알킬아미노)(C1 내지 C4)알킬 또는 3-[2-(2-아미노(C1 내지 C4)알킬아미노)(C1 내지 C4)알킬아미노](C1 내지 C4)알킬 중 어느 하나임.
보다 더 바람직하게는 상기 실란 화합물은 본 발명의 실시예에서 기재한 (3-아미노프로필)트리에톡시실란((3-aminopropyl)triethoxysilane; APTES)이 가장 적합하다.
바람직하게는, 상기 미생물이 함유된 시료는 미생물에 감염된 것으로 의심되는 객체의 분변, 소변, 눈물, 타액, 피부의 외부 분비물, 호흡관의 외부 분비물, 장관의 외부 분비물, 소화관의 외부 분비물, 혈장, 혈청, 혈액, 척수액, 림프액, 체액 및 조직일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는 상기 미생물은 박테리아, 바이러스 또는 세포 등 음전하를 띄는 모든 미생물일 수 있으며, 보다 바람직하게는 본 발명의 실시예에서 기재한 브루셀라 오비스(Brucella ovis) 또는 파라 인플루엔자 바이러스 (PIV3)일 수 있다.
보다 바람직하게는, 상기 미생물의 농도는 100 cfu/ml 내지 107 cfu/ml일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 실란 화합물로 개질된 규조토에 미생물을 접촉시키는 단계는 20 내지 60분 동안 접촉시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 미생물 농축 키트를 제공한다. 상기 키트에는 효과적인 미생물 농축에 필요한 pH 조절 등을 위한 완충액 등이 추가적으로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 실란 화합물로 개질된 규조토를 유효성분으로 포함하는 핵산 추출용 조성물을 제공한다.
바람직하게는 상기 실란 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2018002994-appb-I000003
상기 식에서, R1 내지 R3는 각각 같거나 다를 수 있으며, C1 내지 C4의 알킬 또는 C1 내지 C4의 알콕시 중 어느 하나이고, R4는 아미노(C1 내지 C10)알킬, 3-(2-아미노(C1 내지 C4)알킬아미노)(C1 내지 C4)알킬 또는 3-[2-(2-아미노(C1 내지 C4)알킬아미노)(C1 내지 C4)알킬아미노](C1 내지 C4)알킬 중 어느 하나임.
보다 더 바람직하게는 상기 실란 화합물은 본 발명의 실시예에서 기재한 (3-아미노프로필)트리에톡시실란((3-aminopropyl)triethoxysilane; APTES)이 가장 적합하다.
바람직하게는, 상기 조성물은 디메틸 아디프이미데이트(dimethyl adipimidate; DMA), 디메틸 피멜리미데이트(dimethyl pimelimidate; DMP), 디메틸 수베르이미데이트(Dimethyl suberimidate; DMS) 및 디메틸 3,3'-디티오비스프로피온이미데이트(Dimethyl 3,3'- dithiobispropionimidate; DTBP)로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 추가적으로 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 (1) 실란 화합물로 개질된 규조토를 추출 대상 핵산 시료에 첨가하여 반응시키는 단계; 및 (2) 상기 반응물로부터 핵산을 용출하는 단계를 포함하는 핵산 추출 방법.을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 실란 화합물로 개질된 규조토를 추출 대상 핵산 시료에 첨가하여 혼합하는 단계; (2) 상기 혼합물에 디메틸 아디프이미데이트(dimethyl adipimidate; DMA), 디메틸 피멜리미데이트(dimethyl pimelimidate; DMP), 디메틸 수베르이미데이트(Dimethyl suberimidate; DMS) 및 디메틸 3,3'-디티오비스프로피온이미데이트(Dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate; DTBP)로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 첨가하여 반응시키는 단계; 및 (3) 상기 반응물로부터 핵산을 용출하는 단계를 포함하는 핵산 추출 방법을 제공한다.
바람직하게는 상기 실란 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2018002994-appb-I000004
상기 식에서, R1 내지 R3는 각각 같거나 다를 수 있으며, C1 내지 C4의 알킬 또는 C1 내지 C4의 알콕시 중 어느 하나이고, R4는 아미노(C1 내지 C10)알킬, 3-(2-아미노(C1 내지 C4)알킬아미노)(C1 내지 C4)알킬 또는 3-[2-(2-아미노(C1 내지 C4)알킬아미노)(C1 내지 C4)알킬아미노](C1 내지 C4)알킬 중 어느 하나임.
보다 더 바람직하게는 상기 실란 화합물은 본 발명의 실시예에서 기재한 (3-아미노프로필)트리에톡시실란((3-aminopropyl)triethoxysilane; APTES)이 가장 적합하다.
바람직하게는, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 핵산 추출 키트를 제공한다. 상기 키트에는 시료 내 세포를 용해시켜 세포 내부로부터 핵산을 방출시키기 위한, 용해 완충액(lysis buffer) 또는 프로테아제(protease) 등이 추가로 포함될 수 있으며, 효과적인 핵산 추출에 필요한 pH 조절 등을 위한 완충액 등이 추가적으로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 실란 화합물로 개질된 규조토를 유효성분으로 포함하는 미생물 농축 및 핵산 추출용 조성물을 제공한다.
바람직하게는 상기 실란 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2018002994-appb-I000005
상기 식에서, R1 내지 R3는 각각 같거나 다를 수 있으며, C1 내지 C4의 알킬 또는 C1 내지 C4의 알콕시 중 어느 하나이고, R4는 아미노(C1 내지 C10)알킬, 3-(2-아미노(C1 내지 C4)알킬아미노)(C1 내지 C4)알킬 또는 3-[2-(2-아미노(C1 내지 C4)알킬아미노)(C1 내지 C4)알킬아미노](C1 내지 C4)알킬 중 어느 하나임.
보다 더 바람직하게는 상기 실란 화합물은 본 발명의 실시예에서 기재한 (3-아미노프로필)트리에톡시실란((3-aminopropyl)triethoxysilane; APTES)이 가장 적합하다.
바람직하게는 상기 미생물은 박테리아, 바이러스 또는 세포 등 음전하를 띄는 모든 미생물일 수 있으며, 보다 바람직하게는 본 발명의 실시예에서 기재한 브루셀라 오비스(Brucella ovis) 또는 파라 인플루엔자 바이러스 (PIV3)일 수 있다.
보다 바람직하게는, 상기 미생물의 농도는 100 cfu/ml 내지 107 cfu/ml일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 조성물은 디메틸 아디프이미데이트(dimethyl adipimidate; DMA), 디메틸 피멜리미데이트(dimethyl pimelimidate; DMP), 디메틸 수베르이미데이트(Dimethyl suberimidate; DMS) 및 디메틸 3,3'-디티오비스프로피온이미데이트(Dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate; DTBP)로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 첨가하여 반응시키는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 (1) 실란 화합물로 개질된 규조토에 미생물이 함유된 시료를 접촉시켜 미생물을 농축시키는 단계; (2) 상기 농축된 미생물을 용해(lysis)시키는 단계; 및 (3) 상기 용해물로부터 핵산을 용출하는 단계를 포함하는 미생물 농축과 동시에 상기 농축된 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 실란 화합물로 개질된 규조토에 미생물이 함유된 시료를 접촉시켜 미생물을 농축시키는 단계; (2) 상기 농축된 미생물을 용해(lysis)시키는 단계; (3) 상기 용해물에 디메틸 아디프이미데이트(dimethyl adipimidate; DMA), 디메틸 피멜리미데이트(dimethyl pimelimidate; DMP), 디메틸 수베르이미데이트(Dimethyl suberimidate; DMS) 및 디메틸 3,3'-디티오비스프로피온이미데이트(Dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate; DTBP)로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 첨가하여 반응시키는 단계; 및 (4) 상기 반응물로부터 핵산을 용출하는 단계를 포함하는 미생물 농축과 동시에 상기 농축된 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법을 제공한다.
바람직하게는 상기 실란 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2018002994-appb-I000006
상기 식에서, R1 내지 R3는 각각 같거나 다를 수 있으며, C1 내지 C4의 알킬 또는 C1 내지 C4의 알콕시 중 어느 하나이고, R4는 아미노(C1 내지 C10)알킬, 3-(2-아미노(C1 내지 C4)알킬아미노)(C1 내지 C4)알킬 또는 3-[2-(2-아미노(C1 내지 C4)알킬아미노)(C1 내지 C4)알킬아미노](C1 내지 C4)알킬 중 어느 하나임.
보다 더 바람직하게는 상기 실란 화합물은 본 발명의 실시예에서 기재한 (3-아미노프로필)트리에톡시실란((3-aminopropyl)triethoxysilane; APTES)이 가장 적합하다.
바람직하게는, 상기 미생물이 함유된 시료는 미생물에 감염된 것으로 의심되는 객체의 분변, 소변, 눈물, 타액, 피부의 외부 분비물, 호흡관의 외부 분비물, 장관의 외부 분비물, 소화관의 외부 분비물, 혈장, 혈청, 혈액, 척수액, 림프액, 체액 및 조직일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는 상기 미생물은 박테리아, 바이러스 또는 세포 등 음전하를 띄는 모든 미생물일 수 있으며, 보다 바람직하게는 본 발명의 실시예에서 기재한 브루셀라 오비스(Brucella ovis) 또는 파라 인플루엔자 바이러스 (PIV3)일 수 있다.
보다 바람직하게는, 상기 미생물의 농도는 100 cfu/ml 내지 107 cfu/ml일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 미생물 농축 및 핵산 추출 키트를 제공한다. 상기 키트에는 시료 내 세포를 용해시켜 세포 내부로부터 핵산을 방출시키기 위한, 용해 완충액(lysis buffer) 또는 프로테아제(protease) 등이 추가로 포함될 수 있으며, 효과적인 미생물 농축 또는 핵산 추출에 필요한 pH 조절 등을 위한 완충액 등이 추가적으로 포함될 수 있다.
바람직하게는, 상기 키트는 웰-플레이트(well-plate), 튜브(tube), 컬럼(column) 또는 미세유체칩(microfluidic chip)의 형태일 수 있으나, 상기 키트의 형태는 시판되고 있는 형태는 모두 가능하다. 한편, 상기 웰-플레이트는 96웰, 384웰 등 제한 없이 제작될 수 있다.
상기 키트는 단일 조성물일 수 있거나, 미생물 농축 또는 핵산 추출용 조성물의 개별 성분을 사용 전 혼합을 위해 개별적으로 보관할 수 있다. 이처럼, 본원 발명의 키트 내의 미생물 농축 또는 핵산 추출용 조성물의 성분을 별개로 포장할 수 있거나, 성분 임의의 조합으로 하나 이상의 혼합물로 포장될 수 있다. 개별 성분 각각 또는 하나 이상의 혼합물이 상이한 용기 내에 둘 수 있고, 단일 용기에 전체 키트를 포함할 수도 있다.
또한, 본 발명은 미생물 농축을 위한 실란 화합물로 개질된 규조토의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 핵산 추출을 위한 실란 화합물로 개질된 규조토의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 미생물 농축 및 핵산 추출을 위한 실란 화합물로 개질된 규조토의 용도를 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1> 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-aminopropyltriethoxysilane; APTES)으로 규조토 개질
규조토에 APTES를 개질하는 방법으로, 1g의 규조토 파우더를 증류수에 30분 동안 담가서 세척을 하고, 이후 70% EtOH, 그리고 99% EtOH에 순차적으로 30분씩 담가서 세척을 한 후, Vaccum을 이용해서 완전히 건조 시킨다. 건조된 500mg의 규조토를 80ml의 98% EtOH 용액에 넣고, 2.4ml의 APTES를 추가로 넣어서 4시간 동안 상온에서 반응을 시킨다. 이후 증류수로 세척한 후에, 최종 50mg/ml농도로 만들어서 사용하고 보관한다.
APTES로 개질 전(파랑)과 개질 후(빨강) 규조토의 FTIR 스펙트럼을 도 1에 나타냈다. APTES로 개질 후, 1차 아민기가 기능화된 것으로 보이는 2987nm에서 강한 피크를 나타냈다.
<실시예 2> 병원균 농축 공정
시험 대상 병원균으로는 브루셀라 오비스(Brucella ovis)를 사용하였다. 실험을 위해, 106 cfu/ml의 브루셀라 용액 1 ml을 사용하였다.
1. 실험 타당성 확인
1) 샘플 200 ㎕를 취하여, Qiagen DNA Kit으로 DNA를 추출하고, 이를 대조군으로 사용하였다.
2) 규조토(D) 및 APTES로 개질된 규조토(DA)를 이용하여 샘플 1 ml을 각각 농축하였다. 농축 과정은 아래와 같다.
3) 병원균을 농축시키기 위해서, 200 ㎕ 용출 완충액을 사용하였다. 원심분리 후, 상등액을 취하여 Qiagen DNA Kit으로 DNA를 추출하였다.
4) 도 2에 나타낸 바와 같이, Q-PCR 결과는 규조토가 병원균을 농축시킬 수 있는 것으로 확인되었다.
2. 실험 조건 최적화
개질된 규조토 농도를 달리하여 실험을 수행하였다. 50 mg/ml의 개질된 규조토(DA) 용액 40 ㎕, 80 ㎕, 120 ㎕ 및 200 ㎕를 사용하였다. 증류수로 균형을 맞추었다. 예를 들면, 개질된 규조토(DA) 용액 40 ㎕에는 160 ㎕ 증류수를 첨가하였다. 104 cfu/ml의 브루셀라 용액 1 ml을 사용하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, Q-PCR 결과는 50 mg/ml의 개질된 규조토(DA) 용액을 40 ㎕ 사용시 최적의 효과를 나타냈다.
또한, 반응 시간을 달리하여 실험을 수행하였다. 반응 시간을 20 내지 60분으로 달리하였다. 103 cfu/ml의 브루셀라 용액 1 ml을 사용하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, Q-PCR 결과는 40분의 반응 시간에서 최적의 효과를 나타냈다.
또한, 브루셀라 농도를 달리하여 실험을 수행하였다. 브루셀라 농도를 100 cfu/ml 내지 107 cfu/ml로 달리하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, Q-PCR 결과는 규조토를 사용하면 병원균이 성공적으로 농축되고, 낮은 농도에서 대조군인 Qiagen kit에 비해 더욱 효과적인 것으로 나타났다.
또한, 동일한 조건을 이용해서, 파라 인플루엔자 바이러스 (PIV3) 농축 실험을 진행하였다. 정확한 농도를 모르는 파라 인플루엔자 바이러스 (PIV3)가 들어있는 2ml 환자 샘플에서 기존 방법 (Qiagen kit)와 개질된 규조토를 이용한 실험을 비교 분석하였을 때, 개질된 규조토를 이용시 기존 대비 2배 정도 농축이 되는 것을 확인하였다 (도 6).
<실시예 3> DNA 추출 공정
시험 샘플로는 HCT-116 암세포를 사용하였다. 실험을 위해, 105 cells/ml의 세포 용액 1 ml을 사용하였다. 최종 DNA 추출에는 100 ㎕ 용출 완충액을 사용하였다.
1. DNA 추출 실험 타당성 확인
1) 샘플 200 ㎕를 취하여, Qiagen DNA Kit으로 DNA를 추출하고, 이를 대조군으로 사용하였다.
2) 규조토(D) 및 APTES로 개질된 규조토(DA)를 이용하여 DNA를 추출하였고, 디메틸 아디프이미데이트(dimethyl adipimidate; DMA)를 첨가하였다. 자세한 추출 과정은 아래와 같다.
i. 2 ml 마이크로원심분리기용 튜브에 200 ㎕ 샘플을 옮긴다.
ii. 200 ㎕의 용해 완충액(Lysis Buffer) 및 20 ㎕의 Protease K를 샘플에 첨가하고, 피펫으로 10번 섞어준다. 이때 공기방울이 생기지 않도록 조심한다.
iii. 샘플이 투명해질 때까지 상온에서 샘플을 반응시킨다(1분 이내).
iv. 50 mg/ml의 DA 용액 80 ㎕를 220 ㎕ 샘플(상기 iii 단계 샘플)에 첨가하고, 피펫으로 5번 섞어준다.
v. 상기 혼합물에 100 ㎕의 DMA를 첨가하고, 피펫으로 10번 섞어준다. 이때 공기방울이 생기지 않도록 조심한다.
vi. 개질된 규조토(DA)에 DNA가 결합하도록 56℃에서 20분 동안 반응시킨다. 반응 시간 동안 혼합물을 잘 분산시킨다.
vii. 마이크로원심분리기를 사용하여 혼합물을 1분 동안 원심분리시킨다. 조심스럽게 상등액을 제거한다.
viii. 100 ㎕의 PBS 완충액을 첨가하고, 피펫으로 10번 섞어준다.
ix. 혼합물을 1분 동안 원심분리시킨다. 조심스럽게 상등액을 제거한다. 이때 공기방울이 생기지 않도록 조심한다.
x. 2번 씻어낸다.
xi. 샘플에 100 ㎕의 용출 완충액(pH 11)을 첨가하고, 피펫으로 15번 섞어준다.
xii. 상온에서 반응시킨다(1분 이내).
xiii. 혼합물을 1분 동안 원심분리시킨다. 피펫을 사용하여, 상등액을 새로운 마이크로튜브에 옮겨준다.
3) 도 7에 나타낸 바와 같이, Q-PCR 결과는 APTES로 개질된 규조토(DA)가 DNA 추출에 효과적인 것으로 나타났다.
2. DNA 추출 실험 조건 최적화
APTES로 개질된 규조토(DA) 농도를 달리하여 실험을 수행하였다. 50 mg/ml의 DA 용액을 10 내지 120 ㎕ 사용하였다. 증류수로 균형을 맞추었다. 예를 들면, DA 용액 40 ㎕에는 160 ㎕ 증류수를 첨가하였다. 105 cells/ml의 HCT-116 용액 1 ml을 사용하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, Q-PCR 결과는 50 mg/ml의 DA 용액을 40 ㎕ 사용시 DNA 추출에 최적의 효과를 나타냈다.
또한, 반응 시간을 달리하여 실험을 수행하였다. 반응 시간을 5 내지 35분으로 달리하였다. 105 cells/ml의 HCT-116 용액 1 ml을 사용하였다. 도 9에 나타낸 바와 같이, Q-PCR 결과는 20분의 반응 시간에서 DNA 추출에 최적의 효과를 나타냈다.
또한, HCT-116 세포 농도를 달리하여 실험을 수행하였다. HCT-116 세포 농도를 100 cells/ml 내지 107 cells/ml로 달리하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이, Q-PCR 결과는 낮은 세포 농도에서도 DNA 추출이 효과적인 것으로 나타났다.
<실시예 4> RNA 추출 공정
시험 샘플로는 HCT-116 암세포를 사용하였다. 실험을 위해, 105 cells/ml의 세포 용액 1 ml을 사용하였다. 최종 RNA 추출에는 100 ㎕ 용출 완충액을 사용하였다.
1. RNA 추출 실험 타당성 확인
1) 샘플 200 ㎕를 취하여, Qiagen RNA Kit으로 RNA를 추출하고, 이를 대조군으로 사용하였다.
2) 규조토(D) 및 APTES로 개질된 규조토(DA)를 이용하여 RNA를 추출하였고, 디메틸 아디프이미데이트(dimethyl adipimidate; DMA)를 첨가하였다. 아래 3가지 부분을 제외하고는 상기 DNA 추출 공정과 유사하다.
i. 20 ㎕의 DNase를 처리한 후, 20 ㎕의 Protease K를 처리한다.
ii. RNA 추출에서는 40 ㎕의 DA가 사용되었다.
iii. 상온에서 흔들면서 25분 동안 반응시켰다.
3) 도 11에 나타낸 바와 같이, Q-PCR 결과는 APTES로 개질된 규조토(DA)가 RNA 추출에 효과적인 것으로 나타났다.
2. RNA 추출 실험 조건 최적화
APTES로 개질된 규조토(DA) 농도를 달리하여 실험을 수행하였다. 50 mg/ml의 DA 용액을 10 내지 120 ㎕ 사용하였다. 증류수로 균형을 맞추었다. 예를 들면, DA 용액 40 ㎕에는 160 ㎕ 증류수를 첨가하였다. 105 cells/ml의 HCT-116 용액 1 ml을 사용하였다. 도 12에 나타낸 바와 같이, Q-PCR 결과는 50 mg/ml의 DA 용액을 40 ㎕ 사용시 RNA 추출에 최적의 효과를 나타냈다.
또한, 반응 시간을 달리하여 실험을 수행하였다. 반응 시간을 5 내지 35분으로 달리하였다. 105 cells/ml의 HCT-116 용액 1 ml을 사용하였다. 도 13에 나타낸 바와 같이, Q-PCR 결과는 25분의 반응 시간에서 RNA 추출에 최적의 효과를 나타냈다.
또한, HCT-116 세포 농도를 달리하여 실험을 수행하였다. HCT-116 세포 농도를 101 cells/ml 내지 106 cells/ml로 달리하였다. 도 14에 나타낸 바와 같이, Q-PCR 결과는 낮은 세포 농도에서도 RNA 추출이 효과적인 것으로 나타났다.
<실시예 5> 한 튜브에서의 병원균 농축 및 DNA 추출 공정
규조토가 성공적으로 병원균을 농축시킬 수 있었고, 핵산을 효과적으로 추출할 수 있었으므로, 본 발명자들은 큰 장비 없이, 하나의 튜브에서 병원균을 농축하고 DNA를 추출할 수 있는 실험을 디자인 하였다. 시험 대상 병원균으로는 브루셀라 오비스(Brucella ovis)를 사용하였다. 실험을 위해, 105 cfu/ml의 브루셀라 용액 1 ml을 사용하였다.
1) 샘플 100 ㎕를 취하여, Qiagen DNA Kit으로 DNA를 추출하고, 이를 대조군으로 사용하였다.
2) 50 mg/ml의 APTES로 개질된 규조토(DA) 용액 40 ㎕을 105 cfu/ml의 브루셀라 오비스 샘플 1 ml에 첨가하였다. 40분 동안 흔들면서 반응시켰다. 침전물이 생기지 않도록 잘 섞어주었다.
3) 원심분리한 후, 상등액을 모두 제거하였다. 1 ml 증류수로 2번 씻어냈다.
5) 100 ㎕ 용출 완충액을 첨가하였다. 1분 동안 반응시킨 후 살짝 가라앉혔다.
6) 20 ㎕ Protease K가 함유된 100 ㎕ 용출 완충액을 혼합물에 첨가하고 피펫으로 10번 섞어준다.
7) 상기 혼합물에 100 mg/ml DMA를 100 ㎕를 첨가하여 피펫으로 10번 섞어준다.
8) 56℃에서 20분 동안 650 RPM으로 흔들면서 반응시켰고, 5분 마다 잘 섞어준다.
9) 가라앉혀 상등액을 모두 제거한다. 200 ㎕ PBS 완충액(1X, pH 7.4)으로 2번 씻어낸다.
10) 100 ㎕ 용출 완충액을 첨가하고, 상온에서 1분 동안 반응시킨다.
11) 추출된 DNA가 포함된 상등액을 1.5 ml 튜브에 옮긴다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 큰 장비 없이도, 하나의 튜브에서 성공적으로 병원균을 농축하고 DNA를 추출할 수 있는 것으로 나타났다.
< 실시예 6> 진단을 위해 아민 개질된 규조토 기반 시스템(amine-functionalized, diatomaceous earth-based, dimethyl suberimidate assisted system; ADD system)의 적용
본 발명의 ADD 시스템은 생물학적 샘플들로부터 RNA를 성공적으로 추출할 수 있었다. 전통적인 분석 방법과 비교하여, ADD 시스템의 최적화된 프로토콜을 이용하면 핵산-기반 진단에 유용하게 활용될 것으로 예상된다. 여러 나라 및 지역의 풍토병인 인간 브루셀라증은 전세계적으로 발병하는 인수공통감염병이다. 본 발명자들은 ADD 시스템을 사용하여 브루셀라 박테리아로부터 RNA를 추출하였다. 어떠한 RT 반응에서도 RT 대조군으로부터는 검출 시그널을 확인할 수 없었다. 도 16a에 나타낸 바와 같이, ADD 시스템을 사용하면 100 CFU/mL의 매우 낮은 브루셀라 농도에서도 검출할 수 있었는데, 이는 기존 키트 보다 검출 민감도가 100배 더 향상된 것을 확인할 수 있었다. ADD 시스템을 통해 추출된 RNA의 Ct 값과 병원균 세포 농도 사이에서는 높은 선형 상관관계를 나타냈다(R2 =0.979). 형광 신호는 Tm 및 주형 미포함 대조군(no-template control; NTC)에 대해 특이적인 것으로 확인되었다(도 16b). 또한, 본 발명의 ADD 시스템으로, 소변 유래 105 CFU/mL 브루셀라 샘플로부터 추출된 RNA를 사용하여 임상적 유용성을 좀 더 확인하였다. 브루셀라는 인수공통감염 병원균이므로, 본 발명자들은 동일한 농도의 브루셀라를 인간 소변 및 양 소변 샘플에 포함시켰다. 비록 소변에서 전체적인 브루셀라의 Ct 값이 PBS에 비해 느려졌지만, ADD 시스템을 사용하여 추출된 RNA가 기존 키트를 사용하여 추출된 RNA에 비해 Ct 값이 더 빠르다는 것을 확인하였다(도 16c).
또한, 본 발명자들은 본 발명에서 동일하게 최적화된 프로토콜에 따라 브루셀라 이외에 살모넬라 및 대장균 병원균 유래 RNA도 성공적으로 추출하였다. ADD 시스템에 의해 추출된 모든 RNA 샘플은 기존 키트에 비해 빠른 Ct 값을 나타냈다. 이외에도, 본 발명자들은 ADD 시스템을 이용하여 상대적으로 대량 볼륨의 샘플을 시험하였는데, 더 많은 샘플을 로딩함으로써 검출 한계를 증가시켰다. RT-qPCR 결과, 다른 시스템을 사용한 것에 비해, ADD 시스템을 이용한 경우가 대량 볼륨(1 mL) 샘플로부터 더 많은 RNA를 추출할 수 있었다(도 16d). 1 mL 샘플 유래 RNA에 대한 Ct 값은 200 μL 샘플에 비해 약 2 사이클 정도 빨랐는데, 이는 샘플 볼륨이 대량인 경우, 추출된 RNA의 총량이 증가하였다는 것을 명백하게 나타낸다. 비록 프로토콜이 200 μL 샘플에서 최적화되었지만, 대량 볼륨 샘플의 RNA 추출에도 ADD 시스템을 사용할 수 있었다. 따라서, 본 발명에서 제안된 ADD 시스템은 RT-qPCR에 의한 핵산 증폭 기반의 RNA 추출 및 병원균 검출에 유용하게 활용될 수 있다.

Claims (23)

  1. 실란 화합물로 개질된 규조토를 유효성분으로 포함하는 미생물 농축용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 실란 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 미생물 농축용 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2018002994-appb-I000007
    상기 식에서, R1 내지 R3는 각각 같거나 다를 수 있으며, C1 내지 C4의 알킬 또는 C1 내지 C4의 알콕시 중 어느 하나이고, R4는 아미노(C1 내지 C10)알킬, 3-(2-아미노(C1 내지 C4)알킬아미노)(C1 내지 C4)알킬 또는 3-[2-(2-아미노(C1 내지 C4)알킬아미노)(C1 내지 C4)알킬아미노](C1 내지 C4)알킬 중 어느 하나임.
  3. 제2항에 있어서, 상기 실란 화합물은 (3-아미노프로필)트리에톡시실란((3-aminopropyl)triethoxysilane; APTES), (3-아미노프로필)트리메톡시실란((3-aminopropyl)trimethoxysilane), (1-아미노메틸)트리에톡시실란((1-aminomethyl)triethoxysilane), (2-아미노에틸)트리에톡시실란((2-aminoethyl)triethoxysilane), (4-아미노부틸)트리에톡시실란((4-aminobutyl)triethoxysilane), (5-아미노펜틸)트리에톡시실란((5-aminopentyl)triethoxysilane), (6-아미노헥실)트리에톡시실란((6-aminohexyl)triethoxysilane), 3-아미노프로필(디에톡시)메틸실란(3-aminopropyl(diethoxy)methylsilane), N-[3-(트리메톡시실릴)프로필]에틸렌디아민(N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine), [3-(2-아미노에틸아미노)프로필]트리메톡시실란([3-(2-aminoethylamino)propyl]trimethoxysilane; AEAPTMS) 및 3-[(트리메톡시실릴)프로필]디에틸렌트리아민(3-[(trimethoxysilyl)propyl]diethylenetriamine; TMPTA)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 미생물 농축용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 박테리아, 바이러스 또는 세포인 것을 특징으로 하는 미생물 농축용 조성물.
  5. 실란 화합물로 개질된 규조토에 미생물이 함유된 시료를 접촉시키는 단계를 포함하는 미생물 농축 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 미생물이 함유된 시료는 미생물에 감염된 것으로 의심되는 객체의 분변, 소변, 눈물, 타액, 피부의 외부 분비물, 호흡관의 외부 분비물, 장관의 외부 분비물, 소화관의 외부 분비물, 혈장, 혈청, 혈액, 척수액, 림프액, 체액 및 조직으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 미생물 농축 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 미생물은 박테리아, 바이러스 또는 세포인 것을 특징으로 하는 미생물 농축 방법.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 미생물 농축 키트.
  9. 실란 화합물로 개질된 규조토를 유효성분으로 포함하는 핵산 추출용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 실란 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 핵산 추출용 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2018002994-appb-I000008
    상기 식에서, R1 내지 R3는 각각 같거나 다를 수 있으며, C1 내지 C4의 알킬 또는 C1 내지 C4의 알콕시 중 어느 하나이고, R4는 아미노(C1 내지 C10)알킬, 3-(2-아미노(C1 내지 C4)알킬아미노)(C1 내지 C4)알킬 또는 3-[2-(2-아미노(C1 내지 C4)알킬아미노)(C1 내지 C4)알킬아미노](C1 내지 C4)알킬 중 어느 하나임.
  11. 제9항에 있어서, 상기 조성물은 디메틸 아디프이미데이트(dimethyl adipimidate; DMA), 디메틸 피멜리미데이트(dimethyl pimelimidate; DMP), 디메틸 수베르이미데이트(Dimethyl suberimidate; DMS) 및 디메틸 3,3'-디티오비스프로피온이미데이트(Dimethyl 3,3'- dithiobispropionimidate; DTBP)로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 추출용 조성물.
  12. 제9항에 있어서, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 하는 핵산 추출용 조성물.
  13. (1) 실란 화합물로 개질된 규조토를 추출 대상 핵산 시료에 첨가하여 반응시키는 단계; 및
    (2) 상기 반응물로부터 핵산을 용출하는 단계를 포함하는 핵산 추출 방법.
  14. (1) 실란 화합물로 개질된 규조토를 추출 대상 핵산 시료에 첨가하여 혼합하는 단계;
    (2) 상기 혼합물에 디메틸 아디프이미데이트(dimethyl adipimidate; DMA), 디메틸 피멜리미데이트(dimethyl pimelimidate; DMP), 디메틸 수베르이미데이트(Dimethyl suberimidate; DMS) 및 디메틸 3,3'-디티오비스프로피온이미데이트(Dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate; DTBP)로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 첨가하여 반응시키는 단계; 및
    (3) 상기 반응물로부터 핵산을 용출하는 단계를 포함하는 핵산 추출 방법.
  15. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 핵산 추출 키트.
  16. 실란 화합물로 개질된 규조토를 유효성분으로 포함하는 미생물 농축 및 핵산 추출용 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 실란 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 미생물 농축 및 핵산 추출용 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2018002994-appb-I000009
    상기 식에서, R1 내지 R3는 각각 같거나 다를 수 있으며, C1 내지 C4의 알킬 또는 C1 내지 C4의 알콕시 중 어느 하나이고, R4는 아미노(C1 내지 C10)알킬, 3-(2-아미노(C1 내지 C4)알킬아미노)(C1 내지 C4)알킬 또는 3-[2-(2-아미노(C1 내지 C4)알킬아미노)(C1 내지 C4)알킬아미노](C1 내지 C4)알킬 중 어느 하나임.
  18. 제16항에 있어서, 상기 조성물은 디메틸 아디프이미데이트(dimethyl adipimidate; DMA), 디메틸 피멜리미데이트(dimethyl pimelimidate; DMP), 디메틸 수베르이미데이트(Dimethyl suberimidate; DMS) 및 디메틸 3,3'-디티오비스프로피온이미데이트(Dimethyl 3,3'- dithiobispropionimidate; DTBP)로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 농축 및 핵산 추출용 조성물.
  19. 제16항에 있어서, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 하는 미생물 농축 및 핵산 추출용 조성물.
  20. (1) 실란 화합물로 개질된 규조토에 미생물이 함유된 시료를 접촉시켜 미생물을 농축시키는 단계;
    (2) 상기 농축된 미생물을 용해(lysis)시키는 단계; 및
    (3) 상기 용해물로부터 핵산을 용출하는 단계를 포함하는 미생물 농축과 동시에 상기 농축된 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법.
  21. (1) 실란 화합물로 개질된 규조토에 미생물이 함유된 시료를 접촉시켜 미생물을 농축시키는 단계;
    (2) 상기 농축된 미생물을 용해(lysis)시키는 단계;
    (3) 상기 용해물에 디메틸 아디프이미데이트(dimethyl adipimidate; DMA), 디메틸 피멜리미데이트(dimethyl pimelimidate; DMP), 디메틸 수베르이미데이트(Dimethyl suberimidate; DMS) 및 디메틸 3,3'-디티오비스프로피온이미데이트(Dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate; DTBP)로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 첨가하여 반응시키는 단계; 및
    (4) 상기 반응물로부터 핵산을 용출하는 단계를 포함하는 미생물 농축과 동시에 상기 농축된 미생물로부터 핵산을 추출하는 방법.
  22. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 미생물 농축 및 핵산 추출 키트.
  23. 제22항에 있어서, 상기 키트는 웰-플레이트(well-plate), 튜브(tube), 컬럼(column) 및 미세유체칩(microfluidic chip)으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나의 형태인 것을 특징으로 하는 미생물 농축 및 핵산 추출 키트.
PCT/KR2018/002994 2017-03-15 2018-03-14 규조토를 이용한 미생물 농축 방법 및 핵산 추출 방법 Ceased WO2018169307A1 (ko)

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