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WO2018169058A1 - Ｒｎａ結合タンパク質 - Google Patents

Ｒｎａ結合タンパク質 Download PDF

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Publication number
WO2018169058A1
WO2018169058A1 PCT/JP2018/010489 JP2018010489W WO2018169058A1 WO 2018169058 A1 WO2018169058 A1 WO 2018169058A1 JP 2018010489 W JP2018010489 W JP 2018010489W WO 2018169058 A1 WO2018169058 A1 WO 2018169058A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acid
hpuf
alexa680
rna
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2018/010489
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
貴史 世良
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Okayama University NUC
Original Assignee
Okayama University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Okayama University NUC filed Critical Okayama University NUC
Priority to JP2019506304A priority Critical patent/JP7334962B2/ja
Priority to US16/494,796 priority patent/US11472855B2/en
Priority to EP18767056.7A priority patent/EP3597751A4/en
Publication of WO2018169058A1 publication Critical patent/WO2018169058A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to US17/830,822 priority patent/US20220340624A1/en
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to an RNA binding protein.
  • Human Pumilio and FBF homology (hPUF) protein is known as one of RNA binding proteins having high binding ability and selectivity (see, for example, Non-Patent Document 1).
  • the hPUF protein has eight repeat motifs that are different in length from the amino acid sequence, and it is known that three amino acid residues in one repeat recognize one base. Eight repeat motifs are called R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, and R8 from the N-terminal side.
  • the amino acid sequence of each repeat motif is as follows.
  • FIG. 163 is a diagram showing the regularity of wild-type stacking amino acids using a molecular model.
  • R1 HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ (SEQ ID NO: 1)
  • R2 AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG (SEQ ID NO: 2)
  • R3 HVLSLALQMYGCRVIQKALEFIPSDQQNEMVRELDG (SEQ ID NO: 3)
  • R4 HVLKCVKDQNGNHVVQKCIECVQPQSLQFIIDAFKG (SEQ ID NO: 4)
  • R6 HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG (SEQ ID NO: 6)
  • R7 NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS (SEQ ID NO: 7)
  • R8 ALYTMMKDQYANYVV
  • An object of the present invention is to provide an RNA binding protein having solubility and high binding property.
  • the present inventor targeted a soluble and highly binding RNA-binding protein by altering the structure of eight repeat motifs R1 to R8 or amino acid residues.
  • the present inventors have found that it can be designed according to the RNA sequence and have completed the present invention. According to the present invention, the following inventions are provided.
  • RNA-binding protein having an amino acid sequence represented by R1′-R1X-R2X- (R5X or R6Y) L- (R5X-R6Y) M- (R5X or R6Y) N -R7X-R8X-R8 ':
  • R1X represents R1, R1 (S12N), R1 (S12C), R1 (Q16E), or R1 (Q16R);
  • R2X represents R2, R2 (N12C), R2 (N12S), R2 (N12S, Q16E), or R2 (N12S, Q16R);
  • R5X represents any of R5, R5 (C12S), R5 (C12N), R5 (C12S, Q16E), or R5 (C12S, Q16R),
  • R6Y represents any of R6, R6 (N12C), R6 (N12S), R6 (N12S, Q16E), or R6 (N12S, Q16R)
  • R7X represents
  • S12N indicates that the 12th amino acid S is substituted with N
  • S12C indicates that the 12th amino acid S is substituted with C
  • N12C indicates that the 12th amino acid N is substituted with C
  • N12S indicates that the 12th amino acid N is substituted with S
  • C12N indicates that the 12th amino acid C is substituted with N
  • C12S indicates that the 12th amino acid C is substituted with S
  • Q16E indicates that the 16th amino acid Q is substituted with E
  • Q16R indicates that the 16th amino acid Q is substituted with R
  • L and N each independently represent 0 or 1
  • M represents an integer of 2 or more.
  • M preferably represents an integer of 2 to 20, more preferably an integer of 2 to 10, and still more preferably an integer of 2 to 5.
  • R1 ' GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG
  • R1 HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
  • R2 AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
  • R5 QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
  • R6 HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
  • R7 NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
  • R8 ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
  • R8 ' HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG ⁇ 2>
  • R1X, R2X, R5X, R6Y, R7X and R8X When the combination of the base recognized by the repeat and the
  • the 13th amino acid of the corresponding repeat (ie, stacking between the two bases) Amino acid) is Tyr,
  • the combination is AG, AC, GU, UG, CG or GC, the 13th amino acid of the corresponding repeat (ie, between the two bases)
  • the amino acid stacking to Arg is When the combination is AU or GG, the 13th amino acid of the corresponding repeat (that is, the amino acid stacking between the two bases) is Arg or His,
  • the combination is UU
  • the 13th amino acid of the corresponding repeat ie, the amino acid stacking between the two bases
  • Trp or Arg is Trp or Arg
  • the combination is C
  • the protein according to ⁇ 1> the protein according to ⁇ 1>.
  • EIRG- having the amino acid sequence shown in (R5X-R6Y) n, RNA binding protein: wherein the respective n-number of R5X independently, R5, R5 (C12N), R5 (C12S, Q16E), or R5 (C12S, Q16E) is indicated, n pieces of R6Y each independently indicate R6, R6 (N12C), R6 (N12S, Q16E) or R6 (N12S, Q16R), and n is 4 Indicates an integer of ⁇ 15.
  • R1 ' GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG
  • R8 ' HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG ⁇ 6>
  • R1 ' GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG
  • R8 ' HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG
  • R1 HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
  • R2 AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
  • R8 ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP ⁇ A>
  • R1 ' GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG
  • R1 HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
  • R2 AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
  • R3 HVLSLALQMYGCRVIQKALEFIPSDQQNEMVRELDG
  • R4 HVLKCVKDQNGNHVVQKCIECVQPQSLQFIIDAFKG
  • R5 QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
  • RNA binding protein having an amino acid sequence represented by R1′-R1-R2-R5-R6-R5-R6-R5-R6-R7-R8-R8 ′ (wherein R1 ′ represents GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG , R8 ′ represents HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG, and R1, R2, R5 to R8, R1 ′ and R8 ′ represent any one of (1) to (9) below).
  • R1 HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
  • R2 AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
  • R5 QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
  • R6 HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
  • R5 QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
  • R6 HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
  • R5 QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
  • R6 HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
  • R7 NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
  • R8 ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVA
  • R2: AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG SEQ ID NO: 2
  • an RNA-binding protein having solubility and high binding property can be provided.
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 3 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 4 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 5 shows the results of measuring the solubility of RNA protein.
  • FIG. 6 shows the results of measuring the solubility of RNA protein.
  • FIG. 7 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 8 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 9 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 10 shows the results of measuring the solubility of the RNA protein.
  • FIG. 11 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 12 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 13 shows the results of measuring the solubility of RNA protein.
  • FIG. 14 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 15 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 16 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 17 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 18 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 19 shows the results of measuring the solubility of RNA protein.
  • FIG. 20 shows the results of measuring the solubility of the RNA protein.
  • FIG. 21 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 22 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 23 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 24 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 25 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 26 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 15 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 16 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 17 shows the amino acid sequence of the RNA protein
  • FIG. 27 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 28 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 29 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 30 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 31 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 32 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 33 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 34 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 35 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 36 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 37 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 38 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 39 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 40 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 40 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 41 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 42 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 43 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 44 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 45 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 46 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 47 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 48 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 49 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 50 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 51 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 52 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 53 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 54 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 55 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 56 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 57 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 58 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 59 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 60 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 61 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 62 shows the amino acid sequence of RNA protein.
  • FIG. 63 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 64 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 65 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 66 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 67 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 68 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 69 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 70 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 71 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 72 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 73 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 74 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 75 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 76 shows the amino acid sequence of RNA protein.
  • FIG. 77 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 78 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 79 shows the amino acid sequence of RNA protein.
  • FIG. 80 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 69 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 70 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 71 shows the amino acid sequence of the
  • FIG. 81 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 82 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 83 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 84 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 85 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 86 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 87 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 88 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 89 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 90 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 91 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 92 shows the amino acid sequence of RNA protein.
  • FIG. 93 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 95 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 96 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 97 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 98 shows the amino acid sequence of RNA protein.
  • FIG. 99 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 100 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 101 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 102 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 103 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 104 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 105 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 106 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 95 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 96 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 97 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 98 shows the amino acid
  • FIG. 107 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 108 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 109 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 110 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 111 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 112 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 113 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 114 shows an explanatory diagram regarding verification of stacking amino acids.
  • FIG. 115 shows an explanatory diagram related to optimization of amino acids.
  • FIG. 116 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 117 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 118 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 116 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 120 shows an explanatory diagram related to optimization of amino acids.
  • FIG. 121 shows the amino acid sequence of RNA protein.
  • FIG. 122 shows the amino acid sequence of RNA protein.
  • FIG. 123 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 124 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 125 shows an explanatory diagram related to amino acid optimization.
  • FIG. 126 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 127 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 128 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 129 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 130 shows an explanatory diagram regarding verification of stacking amino acids.
  • FIG. 130 shows an explanatory diagram regarding verification of stacking amino acids.
  • FIG. 131 shows an explanatory diagram related to optimization of amino acids.
  • FIG. 132 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 133 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 134 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 135 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 136 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 137 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 138 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 139 shows an explanatory diagram related to amino acid optimization.
  • FIG. 140 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 141 shows the amino acid sequence of RNA protein.
  • FIG. 142 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 140 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 156 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 157 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 158 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 159 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 160 shows the amino acid sequence of the RNA protein.
  • FIG. 161 shows the amino acid sequence of RNA protein.
  • FIG. 162 shows the results of the gel shift assay.
  • FIG. 163 shows the regularity of wild type stacking amino acids.
  • the RNA-binding protein of the present invention is an RNA-binding protein having a plurality of repeat motifs, an N-terminal domain bonded to the N-terminus of the plurality of repeat motifs, and a C-terminal domain bonded to the C-terminus.
  • R1 ′ domain The N-terminal domain is referred to as the R1 ′ domain, and the C-terminal domain is referred to as the R8 ′ domain.
  • the amino acid sequences of R1 ′ domain and R8 ′ domain are as follows.
  • R8 ' HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG (SEQ ID NO: 10)
  • Example 1 when Phe which is the 5th or 14th amino acid residue of R1 is substituted with Ala, the binding force decreases, and even when Phe which is the 18th amino acid residue of R2 is substituted with Ala It was found that the binding force was not affected. That is, it was suggested that Phe which is the 5th and 14th amino acid residues of R1 is involved in the interaction between RNA and protein.
  • Example 2 the solubility and binding properties of RNA binding proteins substituted with recognition repeats were examined.
  • the RNA binding protein in which R3 was substituted with R5 was soluble, and the RNA binding protein in which R4 was substituted with R6 was both soluble and had binding properties equivalent to those of the wild type.
  • the RNA binding protein in which R3 was substituted with R5 and R4 was substituted with R5 was soluble and had binding properties.
  • the RNA binding protein in which R3 was substituted with R5, and Arg, which is the 13th amino acid residue, was substituted with His in R5 substituted with R4 also had the same binding ability as described above.
  • RNA binding protein in which R3 was substituted with R5 and R4 was substituted with R6 was soluble and had the same binding properties as the wild type.
  • the terminal sequence of R7 is preferably ILQ or IRG, and ILQ is more preferable.
  • Example 3 the binding properties of RNA binding proteins with extended recognition repeats were examined. As a result, it was suggested that repeated binding of R5-R6 can exhibit high binding properties.
  • Example 4 an RNA-binding protein having a modified recognition specificity for R5 was prepared, and the binding property was examined. As a result, it was found that the binding strength was strong in the order of C12N (U recognition)> C12S, Q16E (G recognition)> C12S, Q16R (C recognition)> MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R5) (A recognition). For R6, an RNA-binding protein with a modified recognition specificity was prepared and the binding property was examined. As a result, it was shown that G recognition and C recognition have the same binding strength as wild type U recognition.
  • Example 5 the optimal amino acid was examined by modifying the stacking amino acids between UA and AU. As a result, it was shown that Arg can be used as the cationic amino acid between AU, and Trp, Tyr, Phe, and His can be used as the aromatic amino acid between UA. In addition, the optimum amino acid was examined by modifying the stacking amino acid between AC and CA. As a result, it was shown that Tyr, which is an aromatic amino acid, is suitable between CA, and Arg, which is a cationic amino acid, is suitable between AC. In addition, it was shown that Tyr, an aromatic amino acid, is suitable between GA, and Arg, a cationic amino acid, is suitable between AG.
  • Arg which is a cationic amino acid is suitable between UG and Arg which is a cationic amino acid is suitable between GU.
  • aromatic amino acids had higher binding strength than cationic amino acids, and among aromatic amino acids, Tyr and His had higher binding strength.
  • Example 7 the binding property of the RNA binding protein with further extended recognition repeats was examined.
  • the superiority or inferiority of the binding ability was considered together with the result of Example 3, it was found that the binding strength was higher in order from the following. (1) 12, 13 repeat (2) 10, 11, 14 repeat (3) 9, 15 repeat (4) WT, 8, 16 repeat
  • Example 8 is the same as Example 4.
  • the binding specificity of the RNA binding protein was examined by changing the recognition specificity.
  • the recognition characteristics were changed for R1, R2, R7, and R8, and the effects were confirmed by experiments.
  • the recognition specificity for RNA of proteins having each amino acid sequence was clarified, and the order of binding strength was clarified.
  • Example 9 as in Example 5, the amino acid was optimally confirmed by modifying each stacking amino acid.
  • Table 2 below shows the results together with the results obtained in Example 5.
  • RNA-binding protein that specifically recognizes the genome sequence of RNA-virus with high affinity.
  • the method for preparing the gene encoding the RNA binding protein of the present invention is not particularly limited, but it can be prepared by chemical synthesis of nucleic acid based on the amino acid sequence disclosed in the present specification.
  • RNA binding protein In order to improve the solubilization of RNA binding proteins, tag proteins known to promote solubilization can be fused.
  • tag proteins known to promote solubilization
  • MBP maltose binding protein
  • a recombinant expression vector can be prepared by incorporating a nucleic acid encoding an MBP-tagged RNA binding protein into the expression vector.
  • a recombinant expression vector can be introduced into a host for expression and each protein can be expressed in the host.
  • the vector for inserting the nucleic acid encoding the RNA binding protein of the present invention is not particularly limited as long as it can replicate in the host.
  • plasmid DNA, phage DNA, etc. Is mentioned.
  • plasmid DNA examples include plasmids derived from E. coli (for example, pET System, pRSET, pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, etc.), plasmids derived from Bacillus subtilis (for example, pUB110, pTP5, etc.), and the like.
  • phage DNA includes ⁇ phage (Charon 4A, Charon 21A, EMBL3, EMBL4, ⁇ gt10, ⁇ gt11, ⁇ ZAP, etc.).
  • animal viruses such as retrovirus or vaccinia virus, and insect virus vectors such as baculovirus can also be used.
  • a nucleic acid encoding an RNA binding protein can be inserted into a vector by cleaving a nucleic acid (DNA) encoding the RNA binding protein with an appropriate restriction enzyme and inserting it into a restriction enzyme site or a multiple cloning site in the vector. it can.
  • DNA nucleic acid
  • the vector of the present invention includes, in addition to a promoter and a nucleic acid encoding an RNA binding protein, a cis element such as an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, a ribosome binding sequence (SD sequence), etc. You may contain.
  • the selection marker include dihydrofolate reductase gene, ampicillin resistance gene, neomycin resistance gene and the like.
  • the present invention also relates to a host cell (transformant) containing the above-described recombinant expression vector.
  • a transformant can be obtained by introducing a recombinant expression vector into a host so that a target gene (that is, a nucleic acid encoding an RNA binding protein) can be expressed.
  • the host is not particularly limited as long as it can express the nucleic acid of the present invention.
  • Examples of the host include, for example, Escherichia genus such as Escherichia coli, Bacillus genus Bacillus subtilis, Pseudomonas genus such as Pseudomonas putida, Rhizobium melodi Bacteria belonging to the genus Rhizobium.
  • the host may be a yeast such as Saccharomyces cerevisiae or Schizosaccharomyces pombe.
  • the host may be animal cells such as COS cells and CHO cells, or insect cells such as Sf9 and Sf21.
  • the recombinant expression vector of the present invention can autonomously replicate in the bacterium, and at the same time, is composed of a promoter, a ribosome binding sequence, a nucleic acid encoding an RNA binding protein, and a transcription termination sequence. It is preferable. Moreover, the gene which controls a promoter may be contained.
  • Escherichia coli examples include Escherichia coli K12 and DH1
  • Bacillus subtilis examples include Bacillus subtilis.
  • Any promoter may be used as long as it can be expressed in a host such as Escherichia coli.
  • trp promoter, lac promoter, P L promoter, and P R promoter may be used from Escherichia coli or phage.
  • An artificially designed and modified promoter such as a tac promoter may be used.
  • the method for introducing a recombinant vector into bacteria is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into bacteria. Examples thereof include a method using calcium ions and an electroporation method.
  • yeast When yeast is used as a host, for example, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, etc. are used.
  • the promoter is not particularly limited as long as it can be expressed in yeast.
  • gal1 promoter, gal10 promoter, heat shock protein promoter, MF ⁇ 1 promoter, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, AOX1 promoter, etc. Is mentioned.
  • the method for introducing a recombinant vector into yeast is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into yeast, and examples thereof include an electroporation method, a spheroplast method, and a lithium acetate method.
  • monkey cells COS-7, Vero, Chinese hamster ovary cells (CHO cells), mouse L cells, rat GH3, human FL cells and the like are used.
  • As the promoter SR ⁇ promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter and the like may be used, and human cytomegalovirus early gene promoter and the like may be used.
  • methods for introducing a recombinant vector into animal cells include an electroporation method, a calcium phosphate method, and a lipofection method.
  • Sf9 cells When insect cells are used as hosts, Sf9 cells, Sf21 cells, etc. are used.
  • a method for introducing a recombinant vector into insect cells for example, calcium phosphate method, lipofection method, electroporation method and the like are used.
  • RNA-binding protein of the present invention can be obtained by culturing the above transformant and collecting it from the culture.
  • “Culture” means any of cultured cells, cultured cells, or disrupted cells or cells in addition to the culture supernatant. The method of culturing the transformant is performed according to a usual method applied to host culture.
  • the medium contains a carbon source, nitrogen source, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the microorganisms.
  • a carbon source carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose and starch, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and alcohols such as ethanol and propanol are used.
  • ammonium salts of inorganic acids or organic acids such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate and ammonium phosphate, or other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, corn steep liquor and the like are used.
  • inorganic substance monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like are used.
  • Cultivation is usually carried out at 37 ° C. for 6 to 24 hours under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and agitation culture.
  • the pH is maintained at 7.0 to 7.5.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, or the like.
  • an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium as necessary.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • a microorganism transformed with an expression vector using the Lac promoter a microorganism transformed with isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG) or the like with an expression vector using the trp promoter is cultured.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • IAA indoleacrylic acid
  • a medium for cultivating a transformant obtained using animal cells as a host a generally used RPMI 1640 medium, DMEM medium, a medium obtained by adding fetal calf serum or the like to these mediums, or the like is used.
  • the culture is usually carried out at 37 ° C. for 1 to 30 days in the presence of 5% CO 2 .
  • antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium as necessary.
  • the RNA binding protein is extracted by crushing the cells or cells.
  • the culture solution is used as it is, or the cells or cells are removed by centrifugation or the like. Thereafter, by using general biochemical methods used for protein isolation and purification, such as ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. alone or in appropriate combination,
  • the RNA-binding protein of the present invention can be isolated and purified from
  • RNA binding protein of the present invention binds to a target sequence can be evaluated by gel shift assay.
  • RNA binding protein (final concentration: 10-1000 nM) are mixed for 1 hour at 4 ° C and then equilibrated with 0.5 ⁇ TBE buffer.
  • a target RNA probe labeled with Alexa680 (final concentration: 0.5 nM) and RNA binding protein (final concentration: 10-1000 nM) are mixed for 1 hour at 4 ° C and then equilibrated with 0.5 ⁇ TBE buffer.
  • Apply to a non-denaturing polyacrylamide gel (size: 16 x 16 cm, thickness: 1 mm) and run in a cold room (4 ° C).
  • the electrophoresis is stopped, and the fluorescence in the gel taken out from the apparatus is detected while scanning using a far-infrared detector, whereby each band of RNA can be visualized.
  • Example 1 Verification of interaction through Phe (1) Vector cloning The amino acid sequences of hPUF_MT (F856A), MT (F865A), MT (F856A / F865A), MT (905A) are shown in FIGS. .
  • the genes encoding hPUF_MT (F856A), MT (F865A), MT (F856A / F865A), and MT (905A) were completely synthesized.
  • the synthetic gene was cut with BsaI, cut with BsaI, and ligated with pET24-MBP (-B) -R1′-MSC-R8 ′ to construct an expression vector.
  • pET24-MBP (-B) -R1'-MSC-R8 'encodes a gene encoding maltose binding protein (MBP), a gene encoding R1', a multicloning site, and R8 'in the pET24 vector A vector containing a gene.
  • MBP maltose binding protein
  • RNA probe containing a target sequence fluorescently labeled with Alexa 680 at both ends was synthesized.
  • OTS-1511 5'-Alexa680-CCAGAAU UGUAUAUA UUCG-Alexa680-3 '(19 mer)
  • the purified protein was diluted to the target concentration with Binding Buffer, mixed with Binding Buffer and Ribonuclease Inhibitor, Cloned (Invitrogen), and then RNA probe was mixed at a final concentration of 0.5 nM.
  • the composition of Buffer in the binding reaction is 10% glycerol, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.05% BSA, Ribonuclease Inhibitor (0.2 U), 1 mM DTT, 1 mM EDTA. After 30 min binding reaction at 4 ° C., the solution was gently mixed by pipetting and again 30 min binding reaction was performed at 4 ° C.
  • FIG. 4 shows the amino acid sequences of hPUF_MT (R3 ⁇ R5) and MT (R4 ⁇ R6).
  • the genes encoding hPUF_MT (R3 ⁇ R5) and MT (R4 ⁇ R6) were synthesized completely.
  • the synthetic gene was cleaved with BsaI, and ligated with pET24-R1′-MSC-R8 ′ that was also cleaved with BsaI to construct an expression vector.
  • Example 2-2 (1) Vector cloning hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R5), hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R5_R13H), hPUF_MT (R4 ⁇ R6, R5 ⁇ R6), and hPUF_MT (R4 ⁇ R6, R5 ⁇ R6_Y13R)
  • the amino acid sequences are shown in FIG. 8 and FIG. Vector cloning was performed in the same procedure as in Example 2-1.
  • FIG. 12 shows the amino acid sequences of hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6) and hPUF_MT (1-6-5-6-5-6-7-8). Vector cloning was performed in the same procedure as in Example 2-1.
  • hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6) and hPUF_MT (1-6-5-6-5-6-7-8) were performed in the same procedure as in Example 1. However, protein expression induction was performed under the following conditions.
  • hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6): LB-Kan medium containing 0.01 mM IPTG, 25 ° C., 16 h hPUF_MT (1-6-5-6-5-6-7-8): 37 ° C, 3h in LB-Kan medium containing 1 mM IPTG
  • the rotoring for adsorption to Resin was performed for 10 h for hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6) and 14 h for hPUF_MT (1-6-5-6-5-6-7-8).
  • hPUF_MT (R4 ⁇ R6, R5 ⁇ R6) and hPUF_MT (R4 ⁇ R6, R5 ⁇ R6_Y13R) were performed by the following procedure.
  • Each of the obtained expression vectors was transduced into Escherichia coli BL21 (DE3) / pKJE7. After shaking culture in LB-Cm-Kan medium containing 0.5 mg / mL arabinose until OD 600 reaches about 0.4 to 0.8, add IPTG to the medium to a final concentration of 0.1 mM and shake at 30 ° C for 7 h. Protein expression was induced by culturing.
  • Lysis Buffer 25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 500 mM NaCl. After freeze-thawing and sonication, the supernatant was mixed with Profinity TM IMAC Ni-Charged Resin (Biorad) and rotated at 4 ° C. for 14 h to adsorb the target protein. After washing with 25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 500 mM NaCl Buffer and 25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 500 mM NaCl, 20 mM imidazole Buffer, 25 mM Tris-HCl (pH 8.
  • OTS-1511 5'-Alexa680-CCAGAAU UGUAUAUA UUCG-Alexa680-3 '(19 mer) (wild type, hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6), MT (1-6-5-6-5-6- Probe for 7-8)
  • OTS-1760 5'-Alexa680-CCAGAAU UGUUUAUA UUCG-Alexa680-3 '(19 mer) (hPUF_MT (R4 ⁇ R6, R5 ⁇ R6), Probe for MT (R4 ⁇ R6, R5 ⁇ R6_Y13R)
  • the binding power of hPUF_MT (1-6-5-6-5-6-7-8) was about 1/10 that of the wild type (Kd was between 50 and 10 nM).
  • the R6 ⁇ 3 mutant clogged well and did not migrate well.
  • Example 2-4 (1) Vector cloning The amino acid sequences of hPUF_MT (1-2-5-6-5-6-5_ILQ-8) and hPUF_MT (1-6-5-6-5-6-5-6_IRP) are shown in FIG. Show. Vector cloning was performed in the same procedure as in Example 2-1.
  • Example 2-5 (1) Vector cloning hPUF_MT (1-5-5-5-6-7-8), hPUF_MT (1-2-5-6-5-6-5-6-7-8) and hPUF_MT ( The amino acid sequence of 1-5-5-5-5-7-8) is shown in FIG. 17 and FIG. Vector cloning was performed in the same procedure as in Example 2-1.
  • Example 2-6 (1) Vector cloning The amino acid sequences of hPUF_MT (R7 ⁇ R5), hPUF_MT (R7_ILQ) and hPUF_MT (R7_IRG) are shown in FIG. 22 and FIG. Vector cloning was performed in the same procedure as in Example 2-1.
  • Example 2-7 (1) Vector cloning The same vector as in Example 2-6 was used. (2) Protein expression and purification The same as in Example 2-6. (3) Gel shift assay The same procedure as in Example 1 was used. The following RNA probe was used. OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAU UGUAUAUA UUCG-Alexa680-3 '(19 mer) The results are shown in FIG. When linking R7-R8, ILQ is suitable for the terminal sequence.
  • FIG. 26 shows the amino acid sequences of hPUF_MT (R7 ⁇ R5) and hPUF_MT (R8 ⁇ R5). Vector cloning was performed in the same procedure as in Example 2-1.
  • FIG. 28 shows the amino acid sequences of hPUF_MT (R3 ⁇ RC, R4 ⁇ RC, R5 ⁇ RC) and hPUF_MT (R3 ⁇ RC2, R4 ⁇ RC2, R5 ⁇ RC2).
  • Vector cloning was performed in the same procedure as in Example 2-1.
  • Example 3 Extension of recognition repeat
  • Example 3-1 Vector cloning, protein expression and purification are the same as in Example 2-5.
  • the gel shift assay was performed in the same procedure as in Example 1. The following RNA probe was used.
  • OTS-1511 5'-Alexa680-CCAGAAU UGUAUAUA UUCG-Alexa680-3 '(19 mer) (Probe for wild type)
  • OTS-1844 5'-Alexa680-CCAGAAU UGUAUAUAUA UUCG-Alexa680-3 '(21 mer) (Probe for hPUF_MT (1-2-5-6-5-6-5-6-7-8))
  • MT 1-2-5-6-5-6-5-6-7-8) has about 10 times stronger binding force than WT.
  • Example 3-2 (1) Vector Cloning The amino acid sequence of hPUF_MT (1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8) is shown in FIG. Vector cloning was performed in the same procedure as in Example 2-1.
  • Protein expression and purification hPUF_MT (1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8) was carried out in the same procedure as in Example 1. However, protein expression was induced in LB-Kan medium containing 1 mM IPTG at 37 ° C. for 3 hours. In addition, the rotoring for adsorption to Resin was performed for 12.5 h.
  • Example 3-3 (1) Vector cloning hPUF_MT (1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8) and hPUF_MT (1-2-5-6-5-6). The amino acid sequence of -5-6-5-6-5-6-5-6-7-8) is shown in FIG. 33 and FIG.
  • Example 4 Change of recognition specificity
  • Example 4-1 Vector cloning hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R5), hPUF_MT (R3 ⁇ R5_C12N, R4 ⁇ R5_C12N, R5_C12N), hPUF_MT (R3 ⁇ R5_C12S, Q16E, R4 ⁇ R5_C12S, Q16E, R5_E
  • the amino acid sequences of (R3 ⁇ R5_C12S, Q16R, R4 ⁇ R5_C12S, Q16R, R5_C12S, Q16R) are shown in FIG. 36 and FIG. Vector cloning was performed in the same procedure as in Example 2-1.
  • hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R5) is as described above.
  • hPUF_MT (R3 ⁇ R5_C12N, R4 ⁇ R5_C12N, R5_C12N), hPUF_MT (R3 ⁇ R5_C12S, Q16E, R4 ⁇ R5_C12S, Q16E, R5_C12S, Q16E), hPUF_MT (R3 ⁇ R5_C12S, R16_R5_C12S, R16
  • the same procedure as in Example 1 was performed. However, protein expression induction was performed under the following conditions.
  • hPUF_MT (R3 ⁇ R5_C12N, R4 ⁇ R5_C12N, R5_C12N): LB-Kan medium containing 1 mM IPTG, 37 ° C., 3 h hPUF_MT (R3 ⁇ R5_C12S, Q16E, R4 ⁇ R5_C12N, Q16E, R5_C12S, Q16E): 37 ° C., 3 h in LB-Kan medium containing 0.01 mM IPTG hPUF_MT (R3 ⁇ R5_C12S, Q16R, R4 ⁇ R5_C12N, Q16R, R5_C12S, Q16R): LB-Kan medium containing 1 mM IPTG, 20 ° C., 24 h
  • the rotoring for adsorption to Resin was performed for 12.5 h.
  • C12N, C12S, Q16E, C12S, and Q16R were found to have higher binding ability than MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R5). It can be seen that the binding force is strong in the order of C12N (U recognition)> C12S, Q16E (G recognition)> C12S, Q16R (C recognition)> MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R5) (A recognition).
  • Example 4-2 The same protein as in Example 4-1 was used. The gel shift assay was performed in the same procedure as in Example 1. The following RNA probe was used.
  • OTS-1511 5'-Alexa680-CCAGAAU UGUAUAUA UUCG-Alexa680-3 '(19 mer) (wild type sequence)
  • OTS-1841 5'-Alexa680-CCAGAAU UGUUUUUA UUCG-Alexa680-3 '(19 mer) (A ⁇ U sequence)
  • OTS-1842 5'-Alexa680-CCAGAAU UGUGGGUA UUCG-Alexa680-3 '(19 mer) (A ⁇ G sequence)
  • OTS-1843 5'-Alexa680-CCAGAAU UGUCCCUA UUCG-Alexa680-3 '(19 mer) (A ⁇ C sequence)
  • the results are shown in FIG. Each protein binds only to the target sequence and is considered to have specificity.
  • Example 4-3 (1) Cloning of vector hPUF_MT (R4 ⁇ R6), hPUF_MT (R4 ⁇ R6_N12C, R6_N12C), hPUF_MT (R4 ⁇ R6_N12S, Q16E, R6_N12S, Q16E), hPUF_MT (R4 ⁇ R6_N12S, Q16R, R16N, R16_, R16_R16) Is shown in FIG. 40 and FIG. Vector cloning was performed in the same procedure as in Example 2-1.
  • hPUF_MT (R4 ⁇ R6) is as described above.
  • hPUF_MT (R4 ⁇ R6_N12C, R6_N12C), hPUF_MT (R4 ⁇ R6_N12S, Q16E, R6_N12S, Q16E), hPUF_MT (R4 ⁇ R6_N12S, Q16R, R6_N12S, Q16R) were performed in the same procedure as in Example 1. However, protein expression induction was performed under the following conditions.
  • hPUF_MT (R4 ⁇ R6_N12C, R6_N12C): LB-Kan medium containing 0.1 mM IPTG, 30 ° C., 7 h hPUF_MT (R4 ⁇ R6_N12S, Q16E, R6_N12S, Q16E): LB-Kan medium containing 0.1 mM IPTG, 25 ° C., 22 h hPUF_MT (R4 ⁇ R6_N12S, Q16R, R6_N12S, Q16R): 30 ° C., 7 h in LB-Kan medium containing 0.1 mM IPTG
  • the rotoring when adsorbed on Resin was performed for 12 hours.
  • Example 4-4 The protein is the same as in Example 4-3.
  • the gel shift assay was performed in the same procedure as in Example 1.
  • the following RNA probe was used.
  • OTS-1511 5'-Alexa680-CCAGAAU UGUAUAUA UUCG-Alexa680-3 '(19 mer) (wild type sequence)
  • OTS-1819 5'-Alexa680-CCAGAAU UGAAAAUA UUCG-Alexa680-3 '(19 mer) (U ⁇ A sequence)
  • OTS-1979 5'-Alexa680-CCAGAAU UGCACAUA UUCG-Alexa680-3 '(19 mer) (U ⁇ C sequence)
  • the results are shown in FIG. The same results as in Example 4-3 were obtained (reproducibility was confirmed).
  • Example 5 Optimization of stacking amino acids
  • Example 5-1 (1) Vector Cloning The amino acid sequences of hPUF_MT (R5_R13K), hPUF_MT (R6_Y13F), hPUF_MT (R6_Y13H) and hPUF_MT (R6_Y13W) are shown in FIGS. Vector cloning was performed in the same procedure as in Example 2-1.
  • Example 5-2 (1) Vector cloning hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R5), hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R5_R13H, R5_R13H), The amino acid sequences of hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R5_R13Y, R5_R13Y), hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R5_R13Y, R5_R13Y), and hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R5_R13W, R5_R13W) are shown in FIGS. Vector cloning was performed in the same procedure as in Example 2-1.
  • hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R5) is as described above.
  • hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R5_R13H, R5_R13H), hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R5_R13Y, R5_R13Y), hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R5_R13Y, R5_R13Y), and hPUF_R_R13 R5_R13W) was performed in the same procedure as in Example 1. However, protein expression was induced in LB-Kan medium containing 1 mM IPTG at 37 ° C. for 3 hours. Moreover, the rotoring when adsorbing to Resin was performed for 3 hours.
  • FIG. 51 shows the amino acid sequence of hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R5_R13K, R5_R13K). Vector cloning was performed in the same procedure as in Example 2-1.
  • Example 5-4 (1) Vector cloning hPUF_MT (R5: A_13R) 3 (R6: C_13Y) 3 , hPUF_MT (R5: A_13R) 3 (R6: C_13R) 3 , and hPUF_MT (R5: A_13R) (R5: A_13Y) 2 (R6: The amino acid sequence of C — 13Y) 3 is shown in FIG. 53 and FIG. Vector cloning was performed in the same procedure as in Example 2-1.
  • Example 5-5 (1) Vector cloning hPUF_MT (R5: A_13R) 3 (R6: G_13Y) 3 , hPUF_MT (R5: A_13R) 3 (R6: G_13R) 3 , hPUF_MT (R5: A_13R) (R5: A_13Y) 2 (R6: G_13Y )
  • the amino acid sequence of 3 is shown in FIG. 56 and FIG. Vector cloning was performed in the same procedure as in Example 2-1.
  • Example 5-6 (1) Vector cloning hPUF_MT (R5: G_13R) 3 (R6: U_13Y) 3 , hPUF_MT (R5: G_13R) 3 (R6: U_13R) 3 , hPUF_MT (R5: A_13R) (R5: A_13Y) 2 (R6: G_13Y )
  • the amino acid sequence of 3 is shown in FIG. 59 and FIG. Vector cloning was performed in the same procedure as in Example 2-1.
  • Example 6 Comparison with Pumby (1) Cloning of vector hPUF_MT (5_ (6) 8) , MT (6_ (56) 4), the amino acid sequence of MT (4_ (56) 4) in FIG. 62 and FIG. 63 Show. hPUF_MT (5_ (6) 8) , MT (6_ (56) 4), and total synthesis of a gene encoding the MT (4_ (56) 4) .
  • the synthetic gene was cleaved with EcoRI and HindIII, and ligated with pET24-R1′-MSC-R8 ′, which was also cleaved with EcoRI and HindIII, to construct an expression vector. In the constructed expression vector, R1 ′ and R8 ′ are removed.
  • Example 7 Extension of recognition repeat [2]
  • Example 7-1 (1) Vector cloning hPUF_MT (1-2-6-5-6-5-6-7-8), hPUF_MT (1-2-5-5-6-5-6-7-8) and hPUF_MT ( The amino acid sequence of 1-2-5-6-5-6-6-7-8) is shown in FIGS.
  • Vector cloning was performed in the same procedure as in Example 2-1.
  • Protein expression and purification The procedure was the same as in Example 1.
  • (3) Gel shift assay The same procedure as in Example 1 was used. The results are shown in FIG.
  • the extension of the recognition repeat showed about 3 times higher binding ability than WT. Those with extended recognition repeats (9 repeat circle numbers 2 to 4 in FIG. 67) showed almost the same binding ability.
  • Example 7-2 (1) Vector cloning hPUF_MT (1-2-6-5-6-5-6-7-8), hPUF_MT (1-2-5-5-6-5-6-7-8) and hPUF_MT ( The amino acid sequence of 1-2-5-6-5-6-6-7-8) is shown in FIGS. Vector cloning was performed in the same procedure as in Example 2-1. (2) Protein expression and purification The procedure was the same as in Example 7-1. However, for hPUF_MT (1-2-6-5-6-5-6-7-8)), protein expression was induced in LB-Kan medium containing 0.1 mM IPTG at 37 ° C. for 3 h. In addition, the rotoring for adsorption to Resin was performed for 10 hours.
  • hPUF_MT (1-2-5-5-6-5-6-7-8)
  • protein expression was induced in LB-Kan medium containing 1 mM IPTG at 37 ° C. for 3 h.
  • the rotoring for adsorption to Resin was performed for 10 hours.
  • hPUF_MT (1-2-5-6-5-6-6-7-8)
  • protein expression was induced in LB-Kan medium containing 0.1 mM IPTG at 37 ° C. for 3 h.
  • the rotoring for adsorption to Resin was performed for 10 hours.
  • (3) Gel shift assay The same procedure as in Example 7-1 was performed. However, the following RNA probe was used.
  • OTS-1511 5'-Alexa680-CCAGAAU UGUAUAUA UUCG-Alexa680-3 '(19 mer) (wild type sequence)
  • OTS-2080 5'-Alexa680-CCAGAAU UGUAUAUUA UUCG-Alexa680-3 '(20 mer) (9 repeats (2))
  • OTS-2081 5'-Alexa680-CCAGAAU UGUAUAAUA UUCG-Alexa680-3 '(20 mer) (9 repeats (3))
  • OTS-2082 5'-Alexa680-CCAGAAU UGUUAUAUA UUCG-Alexa680-3 '(20 mer) (9 repeats (4))
  • the results are shown in FIG. 13 repeats showed the highest binding capacity. Next, 11 repeats showed high binding ability and about 3 times higher binding ability than WT. 15 repeats showed slightly higher binding capacity than WT.
  • Example 8 Changing recognition specificity [2]
  • Example 8-1 (1) Vector cloning hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6), hPUF_MT (R1_S12N, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6), hPUF_MT (R1_Q16E, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6) and hPUF_MT (R1_Q16R, R3 ⁇ R5) , R4 ⁇ R6) are shown in FIGS. Vector cloning was performed in the same procedure as in Example 2-1. (2) Protein expression and purification The procedure was the same as in Example 1. However, each protein expression was induced under the following conditions.
  • hPUF_MT (R1_S12N, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6): 30 ° C for 7 h in LB-Kan medium containing 0.001 mM IPTG hPUF_MT (R1_Q16E, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6): LB-Kan medium containing 0.1 mM IPTG, 30 ° C., 7 h hPUF_MT (R1_Q16R, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6): LB-Kan medium containing 0.1 mM IPTG, 30 ° C., 7 h Moreover, the rotoring when adsorbing to Resin was performed for 14 hours.
  • OTS-1511 5'-Alexa680-CCAGAAU UGUAUAUA UUCG-Alexa680-3 '(19 mer) (wild type sequence)
  • OTS-2022 5'-Alexa680-CCAGAAU UGUAUAUU UUCG-Alexa680-3 '(19 mer) (A ⁇ U sequence)
  • OTS-2020 5'-Alexa680-CCAGAAU UGUAUAUG UUCG-Alexa680-3 '(19 mer) (A ⁇ G sequence)
  • OTS-2021 5'-Alexa680-CCAGAAU UGUAUAUC UUCG-Alexa680-3 '(19 mer) (A ⁇ C sequence)
  • the results are as shown in FIG.
  • Example 8-3 Vector cloning hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6), hPUF_MT (R2_N12C, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6), hPUF_MT (R2_N12S, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6), hPUF_MT (R2_N12S, Q16E, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6) and hPUF_MT (R2_N12S, Q16R, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6) are shown in FIGS.
  • Vector cloning was performed in the same procedure as in Example 2-1.
  • hPUF_MT (R2_N12C, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6): LB-Kan medium containing 0.1 mM IPTG, 30 ° C., 7 h hPUF_MT (R2_N12S, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6): LB-Kan medium containing 0.1 mM IPTG, 30 ° C., 7 h hPUF_MT (R2_N12S, Q16E, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6): LB-Kan medium containing 0.1 mM IPTG, 30 ° C., 7 h hPUF_MT (R2_N12S, Q16R, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6): LB-Kan medium containing 0.1 mM IPTG, 30 ° C., 7 h hPUF_MT (R2_N12S, Q16R, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6): LB-Kan medium
  • the binding protein having the amino acid sequence prepared this time did not have a higher binding ability than the previously prepared MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R5) (left of the drawing).
  • MT R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R5
  • Example 8-4 Vector cloning hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6), hPUF_MT (R2_N12C, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6), hPUF_MT (R2_N12S, Q16E, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6) and hPUF_MT (R2_N12S, Q16R , R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6) are shown in FIGS.
  • Vector cloning was performed in the same procedure as in Example 2-1.
  • Protein expression and purification The procedure was the same as in Example 8-1. However, protein expression induction was performed under the following conditions.
  • hPUF_MT (R2_N12C, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6): LB-Kan medium containing 0.1 mM IPTG, 30 ° C., 7 h hPUF_MT (R2_N12S, Q16E, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6): LB-Kan medium containing 0.1 mM IPTG, 30 ° C., 7 h hPUF_MT (R2_N12S, Q16R, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6): LB-Kan medium containing 0.1 mM IPTG, 30 ° C., 7 h
  • the rotoring for adsorption to Resin was performed for 12.5 h.
  • Example 8-5 Vector cloning hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6), hPUF_MT (R7_S12C, E16Q, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6), hPUF_MT (R7_E16Q, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6), hPUF_MT (R7_S12N, E16Q , R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6) and hPUF_MT (R7_E16R, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6) are shown in FIGS.
  • Vector cloning was performed in the same procedure as in Example 2-1.
  • Protein expression and purification The procedure was the same as in Example 8-1.
  • hPUF_MT (R7_S12C, E16Q, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6): LB-Kan medium containing 1 mM IPTG, 37 ° C., 3 h hPUF_MT (R7_E16Q, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6): 37 ° C, 3 h in LB-Kan medium containing 1 mM IPTG hPUF_MT (R7_S12N, E16Q, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6): LB-Kan medium containing 1 mM IPTG, 37 ° C., 3 h hPUF_MT (R7_E16R, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6): 37 ° C, 3 h in LB-Kan medium containing 1 mM IPTG Moreover, the rotoring for adsorbing to Resin was performed for 3.5 h.
  • the binding protein having each amino acid sequence prepared this time did not have higher binding ability than MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R5).
  • Example 8-6 (1) Vector cloning hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6), hPUF_MT (R7_S12C, E16Q, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6), hPUF_MT (R7_S12N, E16Q, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6) and hPUF_MT (R7_E16R , R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6) are shown in FIGS. Vector cloning was performed in the same procedure as in Example 2-1. (2) Protein expression and purification The procedure was the same as in Example 8-1. However, protein expression induction was performed under the following conditions.
  • hPUF_MT (R7_S12C, E16Q, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6): LB-Kan medium containing 1 mM IPTG, 37 ° C., 3 h hPUF_MT (R7_S12N, E16Q, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6): LB-Kan medium containing 1 mM IPTG, 37 ° C., 3 h hPUF_MT (R7_E16R, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6): 37 ° C, 3 h in LB-Kan medium containing 1 mM IPTG Moreover, the rotoring for adsorbing to Resin was performed for 3.5 h.
  • Example 8-7 Vector cloning hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6), hPUF_MT (R8_N12C, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6), hPUF_MT (R8_N12S, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6), hPUF_MT (R8_N12S, Q16E, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6) and hPUF_MT (R8_N12S, Q16R, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6) amino acid sequences are shown in FIGS. Vector cloning was performed in the same procedure as in Example 2-1. (2) Protein expression and purification The procedure was the same as in Example 8-1.
  • hPUF_MT (R8_N12C, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6): LB-Kan medium containing 0.01 mM IPTG, 37 ° C.
  • 3 h hPUF_MT (R8_N12S, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6): 37 ° C, 3 h in LB-Kan medium containing 1 mM IPTG
  • hPUF_MT (R8_N12S, Q16E, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6): 37 ° C, 3 h in LB-Kan medium containing 0.01 mM IPTG hPUF_MT (R8_N12S, Q16R, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6): 37 ° C, 3 h in LB-Kan medium containing 0.01 mM IPTG
  • the rotoring when adsorbing to Resin was performed for 11 hours.
  • the binding protein having each amino acid sequence prepared this time did not have higher binding ability than MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R5).
  • the binding strength was strong in the order of MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R5) (U recognition)> N12S, Q16R (C recognition)> N12S, Q16E (G recognition).
  • S12C (A recognition) N12S (A recognition) was not bound.
  • Example 8-8 (1) Vector cloning hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6), hPUF_MT (R8_N12C, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6), hPUF_MT (R8_N12S, Q16E, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6) and hPUF_MT (R8_N12S, Q16R , R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6) are shown in FIGS. Vector cloning was performed in the same procedure as in Example 2-1. (2) Protein expression and purification The procedure was the same as in Example 8-1. However, protein expression induction was performed under the following conditions.
  • hPUF_MT (R8_N12C, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6): LB-Kan medium containing 0.01 mM IPTG, 37 ° C., 3 h hPUF_MT (R8_N12S, Q16E, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6): 37 ° C, 3 h in LB-Kan medium containing 0.01 mM IPTG hPUF_MT (R8_N12S, Q16R, R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R6): 37 ° C, 3 h in LB-Kan medium containing 0.01 mM IPTG Moreover, the rotoring when adsorbing to Resin was performed for 11 hours.
  • Example 9 Optimization of stacking amino acids [2] Regarding the optimization of the confirmed stacking amino acids, the following 16 types of combinations can be considered. In this example, an experiment was performed on the level marked with * and the result was confirmed. Stacking between different bases (12 types) Between AC / CA Between AU / UA * Between GA / AG UG / GU Between CG / GC * Between UC / CU * Stacking between the same bases (4 types) Between AA * Between GG * Between UU * Between CC *
  • Example 9-1 Between AU / UA (FIG. 115) (1) Vector cloning hPUF_MT (R5: A_13R) 3 (R6: U_13Y) 3 , hPUF_MT (R5: A_13R) 3 (R6: U_13R) 3 and hPUF_MT (R5: A_13R) (R5: A_13Y) 2 (R6: U_13Y ) The amino acid sequence of 3 is shown in FIGS. Vector cloning was performed in the same procedure as in Example 2-1. (2) Protein expression and purification The procedure was the same as in Example 1. However, protein expression induction was performed under the following conditions.
  • hPUF_MT (R5: A_13R) 3 (R6: U_13Y) 3 : 37 ° C, 3 h in LB-Kan medium containing 1 mM IPTG Rotoring for adsorption to Resin was performed for 9.5 h.
  • hPUF_MT (R5: A_13R) 3 (R6: U_13R) 3 : LB-Kan medium containing 0.1 mM IPTG, 30 ° C, 7 h hPUF_MT (R5: A_13R) (R5: A_13Y) 2 (R6: U_13Y) 3 : LB-Kan medium containing 1 mM IPTG at 37 ° C for 3 h Rotoring for adsorbing to Resin was performed for 8 h. (3) Gel shift assay The same procedure as in Example 1 was used. However, the following RNA probe was used.
  • OTS-1844 5'-Alexa680-CCAGAAU UGUAUAUAUA UUCG-Alexa680-3 '(21 mer)
  • Example 9-2 Between CG / GC (FIG. 120) (1) Vector cloning hPUF_MT (R5: G_13R) 3 (R6: C_13Y) 3 , hPUF_MT (R5: G_13R) 3 (R6: C_13R) 3 and hPUF_MT (R5: G_13R) (R5: G_13Y) 2 (R6: C_13Y ) The amino acid sequence of 3 is shown in FIGS. Vector cloning was performed in the same procedure as in Example 2-1. (2) Protein expression and purification The procedure was the same as in Example 1. However, protein expression induction was performed under the following conditions.
  • hPUF_MT (R5: G_13R) 3 (R6: C_13Y) 3 : 37 ° C, 3 h in LB-Kan medium containing 1 mM IPTG hPUF_MT (R5: G_13R) 3 (R6: C_13R) 3 : LB-Kan medium containing 1 mM IPTG at 37 ° C for 3 h hPUF_MT (R5: G_13R) (R5: G_13Y) 2 (R6: C_13Y) 3 : 37 ° C, 3 h in LB-Kan medium containing 1 mM IPTG
  • the rotoring when adsorbed on Resin was performed for 12 hours.
  • Example 9-3 Between UC / CU (FIG. 125) (1) Vector cloning hPUF_MT (R5: C_13R) 3 (R6: U_13Y) 3 , hPUF_MT (R5: C_13R) 3 (R6: U_13R) 3 and hPUF_MT (R5: C_13R) (R5: C_13Y) 2 (R6: U_13Y ) The amino acid sequence of 3 is shown in FIGS. Vector cloning was performed in the same procedure as in Example 2-1. (2) Protein expression and purification The procedure was the same as in Example 1. However, protein expression induction was performed under the following conditions.
  • hPUF_MT (R5: C_13R) 3 (R6: U_13Y) 3 : 37 ° C for 3 h in LB-Kan medium containing 0.1 mM IPTG hPUF_MT (R5: C_13R) 3 (R6: U_13R) 3 : 37 ° C, 3 h in LB-Kan medium containing 0.1 mM IPTG hPUF_MT (R5: C_13R) (R5: C_13Y) 2 (R6: U_13Y) 3 : 37 ° C. for 3 h in LB-Kan medium containing 0.1 mM IPTG
  • the rotoring for adsorption to Resin was performed for 13.5 h.
  • Example 9-4 Between AA (FIG. 131) (1) Vector cloning hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R5), hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R5_R13K, R5_R13K), hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R5_R13F, R5_R13F), hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R5 The amino acid sequences of R5_R13H, R5_R13H), hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R5_R13W, R5_R13W) and hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R5_R13Y, R5_R13Y) are shown in FIGS.
  • hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R5): LB-Kan medium containing 0.01 mM IPTG, 30 ° C., 7 h Rotoring for adsorption to Resin was performed for 10 h.
  • hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R5_R13K, R5_R13K): 30 ° C, 7 h in LB-Kan medium containing 0.1 mM IPTG Rotoring for adsorption to Resin was performed for 16 h.
  • hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R5_R13F, R5_R13F): 37 ° C, 3 h in LB-Kan medium containing 1 mM IPTG hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R5_R13H, R5_R13H): 37 ° C, 3 h in LB-Kan medium containing 1 mM IPTG hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R5_R13W, R5_R13W): 37 ° C, 3 h in LB-Kan medium containing 1 mM IPTG hPUF_MT (R3 ⁇ R5, R4 ⁇ R5_R13Y, R5_R13Y): 37 ° C, 3 h in LB-Kan medium containing 1 mM IPTG Rotoring for adsorbing to Resin was performed for 3 h.
  • Example 9-5 Between GG (FIG. 139) (1) Vector cloning hPUF_MT (R5: G_13R) 3 , hPUF_MT (R5: G_13K) 3 , hPUF_MT (R5: G_13F) 3 , hPUF_MT (R5: G_13H) 3 , hPUF_MT (R5: G_13W) 3 and hPUF_MTR (5) The amino acid sequence of G_13Y) 3 is shown in FIGS. Vector cloning was performed in the same procedure as in Example 2-1. (2) Protein expression and purification The procedure was the same as in Example 1. However, protein expression induction was performed under the following conditions.
  • hPUF_MT (R5: G_13R) 3: 37 °C in LB-Kan medium containing 0.01 mM IPTG, 3 h Rotoring for adsorption to Resin was performed for 12.5 h.
  • hPUF_MT (R5: G_13K) 3 : 37 ° C, 7 h in LB-Kan medium containing 1 mM IPTG hPUF_MT (R5: G_13F) 3 : 37 ° C, 7 h in LB-Kan medium containing 1 mM IPTG hPUF_MT (R5: G_13H) 3 : 37 ° C, 7 h in LB-Kan medium containing 1 mM IPTG hPUF_MT (R5: G_13W) 3 : 37 ° C, 7 h in LB-Kan medium containing 1 mM IPTG hPUF_MT (R5: G_13Y) 3 : 37 ° C, 7 h in
  • Example 9-6 Between UUs (FIG. 147) (1) Vector cloning hPUF_MT (R5: U_13R) 3 , hPUF_MT (R5: U_13K) 3 , hPUF_MT (R5: U_13F) 3 , hPUF_MT (R5: U_13H) 3 , hPUF_MT (R5: U_13W) 3 and hPUF_MTR (5) The amino acid sequence of U_13Y) 3 is shown in FIGS. Vector cloning was performed in the same procedure as in Example 2-1. (2) Protein expression and purification The procedure was the same as in Example 1. However, protein expression induction was performed under the following conditions.
  • hPUF_MT (R5: U_13R) 3 : 37 ° C, 3 h in LB-Kan medium containing 1 mM IPTG Rotoring for adsorption to Resin was performed for 12.5 h.
  • hPUF_MT (R5: U_13K) 3 : 37 ° C, 3 h in LB-Kan medium containing 0.1 mM IPTG hPUF_MT (R5: U_13F) 3 : 37 ° C, 3 h in LB-Kan medium containing 1 mM IPTG hPUF_MT (R5: U_13H) 3: 37 °C in LB-Kan medium containing 0.1 mM IPTG, 3 h hPUF_MT (R5: U_13W) 3 : 37 ° C, 3 h in LB-Kan medium containing 1 mM IPTG hPUF_MT (R5: U_13Y) 3 : 37 ° C, 3 h in
  • Example 9-7 CC interval (FIG. 155)
  • Vector cloning hPUF_MT (R5: C_13R) 3 , hPUF_MT (R5: C_13K) 3 , hPUF_MT (R5: C_13F) 3 , hPUF_MT (R5: C_13H) 3 , hPUF_MT (R5: C_13W) 3 and hPUF_MTR The amino acid sequence of C_13Y) 3 is shown in FIGS.
  • Vector cloning was performed in the same procedure as in Example 2-1.
  • Protein expression and purification The procedure was the same as in Example 1. However, protein expression induction was performed under the following conditions.
  • hPUF_MT (R5: C_13R) 3 : 20 ° C for 24 h in LB-Kan medium containing 1 mM IPTG Rotoring for adsorption to Resin was performed for 12.5 h.
  • hPUF_MT (R5: C_13K) 3 : 30 ° C for 7 h in LB-Kan medium containing 0.1 mM IPTG hPUF_MT (R5: C_13F) 3 : 30 ° C, 7 h in LB-Kan medium containing 0.1 mM IPTG hPUF_MT (R5: C_13H) 3 : 30 ° C, 7 h in LB-Kan medium containing 0.1 mM IPTG hPUF_MT (R5: C_13W) 3: 30 °C in LB-Kan medium containing 0.1 mM IPTG, 7 h hPUF_MT (R5: C_13Y) 3 : 30 ° C for 7

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Abstract

本発明の課題は、可溶性及び高い結合性を有するＲＮＡ結合タンパク質を提供することである。本発明によれば、Ｒ１'－Ｒ１Ｘ－Ｒ２Ｘ－（Ｒ５Ｘ又はＲ６Ｙ）L－（Ｒ５Ｘ－Ｒ６Ｙ）M－（Ｒ５Ｘ又はＲ６Ｙ）N－　Ｒ７Ｘ－Ｒ８Ｘ－　Ｒ８'で示されるアミノ酸配列を有する、ＲＮＡ結合タンパク質（式中、各記号は本明細書に記載のアミノ酸配列を示す）が提供される。

Description

ＲＮＡ結合タンパク質
　本発明は、ＲＮＡ結合タンパク質に関する。
　高い結合能と選択性を有するＲＮＡ結合タンパク質の一つとして、human Pumilio and FBF homology （hPUF)タンパク質が知られている（例えば、非特許文献１参照）。hPUFタンパク質は、アミノ酸配列と長さが異なる、８つのリピートモチーフを有しており、１つのリピート内の３つのアミノ酸残基が１塩基を認識することが知られている。８つのリピートモチーフをN末端側から、R1,R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8と呼ぶこととする。各リピートモチーフのアミノ酸配列は以下の通りである。図１６３は、野生型スタッキングアミノ酸の規則性を分子モデルにより示す図である。
　　R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ（配列番号１）
　　R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG（配列番号２）
　　R3 ：HVLSLALQMYGCRVIQKALEFIPSDQQNEMVRELDG（配列番号３）
　　R4 ：HVLKCVKDQNGNHVVQKCIECVQPQSLQFIIDAFKG（配列番号４）
　　R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ（配列番号５）
　　R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG（配列番号６）
　　R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS（配列番号７）
　　R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP（配列番号８）
X. Wang, et. al. Cell, Vol. 110, 501-512, August 23, 2002
　本発明は、可溶性及び高い結合性を有するＲＮＡ結合タンパク質を提供することを課題とする。
　本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、R1～R8の８つのリピートモチーフの構成又はアミノ酸残基を改変することにより、可溶性及び高い結合性を有するＲＮＡ結合タンパク質を、標的ＲＮＡ配列に応じて設計できることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞　Ｒ１’－Ｒ１Ｘ－Ｒ２Ｘ－（Ｒ５Ｘ又はＲ６Ｙ）L－（Ｒ５Ｘ－Ｒ６Ｙ）M－（Ｒ５Ｘ又はＲ６Ｙ）N－　Ｒ７Ｘ－Ｒ８Ｘ－　Ｒ８’で示されるアミノ酸配列を有する、ＲＮＡ結合タンパク質：
式中、
Ｒ１Ｘは、Ｒ１、Ｒ１（Ｓ１２Ｎ）、Ｒ１（Ｓ１２Ｃ）、Ｒ１（Ｑ１６Ｅ）、又はＲ１（Ｑ１６Ｒ）を示し、
Ｒ２Ｘは、Ｒ２、Ｒ２（Ｎ１２Ｃ）、Ｒ２（Ｎ１２Ｓ）、Ｒ２（Ｎ１２Ｓ，Ｑ１６Ｅ）、又はＲ２（Ｎ１２Ｓ，Ｑ１６Ｒ）を示し、
Ｒ５Ｘは、Ｒ５、Ｒ５（Ｃ１２Ｓ）、Ｒ５（Ｃ１２Ｎ）、Ｒ５（Ｃ１２Ｓ，Ｑ１６Ｅ）、又はＲ５（Ｃ１２Ｓ，Ｑ１６Ｒ）の何れかを示し、
Ｒ６ＹはＲ６、Ｒ６（Ｎ１２Ｃ）、Ｒ６（Ｎ１２Ｓ）、Ｒ６（Ｎ１２Ｓ，Ｑ１６Ｅ）、又はＲ６（Ｎ１２Ｓ，Ｑ１６Ｒ）の何れかを示し、
Ｒ７Ｘは、Ｒ７、Ｒ７（Ｓ１２Ｃ，　Ｅ１６Ｑ）、Ｒ７（Ｅ１６Ｑ）、Ｒ７（Ｓ１２Ｎ，　Ｅ１６Ｑ）、又はＲ７（Ｅ１６Ｒ）を示し、
Ｒ８Ｘは、Ｒ８、Ｒ８（Ｎ１２Ｃ）、Ｒ８（Ｎ１２Ｓ）、Ｒ８（Ｎ１２Ｓ，　Ｑ１６Ｅ）、又はＲ８（Ｎ１２Ｓ，　Ｑ１６Ｒ）を示す。
Ｓ１２Ｎは、１２番目のアミノ酸ＳがＮに置換されていることを示し、
Ｓ１２Ｃは、１２番目のアミノ酸ＳがＣに置換されていることを示し、
Ｎ１２Ｃは、１２番目のアミノ酸ＮがＣに置換されていることを示し、
Ｎ１２Ｓは、１２番目のアミノ酸ＮがＳに置換されていることを示し、
Ｃ１２Ｎは、１２番目のアミノ酸ＣがＮに置換されていることを示し、
Ｃ１２Ｓは、１２番目のアミノ酸ＣがＳに置換されていることを示し、
Ｑ１６Ｅは、１６番目のアミノ酸ＱがＥに置換されていることを示し、
Ｑ１６Ｒは、１６番目のアミノ酸ＱがＲに置換されていることを示し
Ｌ及びＮはそれぞれ独立に０又は１を示し、Ｍは２以上の整数を示す。Ｍは好ましくは２～２０の整数を示し、より好ましくは２～１０の整数を示し、さらに好ましくは２～５の整数を示す。
各リピートは以下のアミノ酸配列を示す。
R1'：GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
R8'：HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG
＜２＞　Ｒ１Ｘ、Ｒ２Ｘ、Ｒ５Ｘ、Ｒ６Ｙ、Ｒ７Ｘ及びＲ８Ｘの何れか一以上のリピートにおいて、
前記リピートが認識する塩基とそれに隣接する下流の塩基の組み合わせが、Ａ－Ａである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸（即ち、前記の２塩基の間にスタッキングするアミノ酸）がＴｙｒ又はＨｉｓであり、
前記の組み合わせが、Ｇ－Ａ、Ｕ－Ａ、Ｃ－Ａ、Ｕ－Ｃ又はＣ－Ｕである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸（即ち、前記の２塩基の間にスタッキングするアミノ酸）がＴｙｒであり、
前記組み合わせが、Ａ－Ｇ、Ａ－Ｃ、Ｇ－Ｕ、Ｕ－Ｇ、Ｃ－Ｇ又はＧ－Ｃである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸（即ち、前記の２塩基の間にスタッキングするアミノ酸）がＡｒｇであり、
前記組み合わせが、Ａ－Ｕ又はＧ－Ｇである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸（即ち、前記の２塩基の間にスタッキングするアミノ酸）がＡｒｇ又はＨｉｓであり、
前記組み合わせが、Ｕ－Ｕである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸（即ち、前記の２塩基の間にスタッキングするアミノ酸）がＴｒｐ又はＡｒｇであり、及び／又は
前記組み合わせが、Ｃ－Ｃである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸（即ち、前記の２塩基の間にスタッキングするアミノ酸）がＰｈｅであり、＜１＞に記載のタンパク質。
＜３＞　EIRG-(R5X-R6Y)nで示されるアミノ酸配列を有する、ＲＮＡ結合タンパク質：式中、ｎ個のR5Xはそれぞれ独立に、R5、R5(C12N)、R5(C12S,Q16E)、又はR5(C12S,Q16E)の何れかを示し、ｎ個のR6Yはそれぞれ独立に、R6、R6(N12C)、R6(N12S,Q16E)又はR6(N12S,Q16R)の何れかを示し、ｎは４～１５の整数を示す。
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12N)：QVFALSTHPYGNRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16E)： QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16R) ：QVFALSTHPYGSRVIRRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12C)：HTEQLVQDQYGCYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16E): HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16R): HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
＜４＞　AFKG-(R5X-R6YZ)n-1 R5X-R6Yで示されるアミノ酸配列を有する、ＲＮＡ結合タンパク質：式中、ｎ個のR5Xはそれぞれ独立に、R5、R5(C12N)、R5(C12S,Q16E)、又はR5(C12S,Q16E)の何れかを示し、（ｎ－１）個のR6YZはそれぞれ独立に、R6(AFKG)、R6(N12C) (AFKG)、R6(N12S,Q16E) (AFKG)又はR6(N12S,Q16R) (AFKG)の何れかを示し、R6Yは、R6、R6(N12C)、R6(N12S,Q16E)又はR6(N12S,Q16R)の何れかを示し、ｎは４～１５の整数を示す。
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12N)：QVFALSTHPYGNRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16E)： QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16R) ：QVFALSTHPYGSRVIRRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 (AFKG) ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAAFKG
R6(N12C) (AFKG)：HTEQLVQDQYGCYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAAFKG
R6(N12S,Q16E) (AFKG): HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAAFKG
R6(N12S,Q16R) (AFKG): HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAAFKG
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12C)：HTEQLVQDQYGCYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16E): HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16R): HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
＜５＞　さらにＮ末端にR1'を有し、及び／又はＣ末端にR8'を有する、＜３＞又は＜４＞に記載のタンパク質。
R1'：GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG
R8'：HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG
＜６＞　さらにＮ末端にR1'-R1-R2を有し、及び／又はＣ末端にR8-R8'を有する、＜３＞又は＜４＞に記載のタンパク質。
R1'：GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG
R8'：HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
＜Ａ＞
R1'- R1-R2-R5X-R4-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R3-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'
R1'- R1-R2-R5X-R5X-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5(R13H)-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R3-R4-R5X-R6Y-R7(ILQ)-R8-R8'
R1'- R1-R2-R3-R4-R5X-R6Y-R7(IRG)-R8-R8'
R1'- R1-R2-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5X-R5X-R6-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R3-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'
R1'- R1-R2-R3-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'
R1'- R1-R2-R3-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'
R1'- R1-R2-R3-R4-R5(R13K)-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R3-R4-R5X-R6(Y13W)-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5(R13H)-R5(R13H)-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5(R13F)-R5(R13F)-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5(R13Y)-R5(R13Y)-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5(R13W)-R5(R13W)-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、又は
R1'- R1-R2-R5X-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'
で示されるアミノ酸配列を有する、ＲＮＡ結合タンパク質（式中、R5Xは、R5、R5(C12N)、R5(C12S,Q16E)、又はR5(C12S,Q16R)の何れかを示し、R6YはR6、R6(N12C)、R6(N12S,Q16E)又はR6(N12S,Q16R)の何れかを示す。各リピートは以下のアミノ酸配列を示す）。
R1'：GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R3 ：HVLSLALQMYGCRVIQKALEFIPSDQQNEMVRELDG
R4 ：HVLKCVKDQNGNHVVQKCIECVQPQSLQFIIDAFKG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(R13H)：QVFALSTHPYGCHVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12N)：QVFALSTHPYGNRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(R13K)：QVFALSTHPYGCKVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(R13F)：QVFALSTHPYGCFVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(R13Y)：QVFALSTHPYGCYVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(R13W)：QVFALSTHPYGCWVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16E)： QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16R) ：QVFALSTHPYGSRVIRRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12C)：HTEQLVQDQYGCYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16E): HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16R): HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(Y13W)：HTEQLVQDQYGNWVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R7(ILQ)：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEILQ
R7(IRG)：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEIRG
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
R8'：HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG
＜Ｂ＞　R1'- （Rｘ）n-R8'で示されるアミノ酸配列（式中、ｎは８～３０を示し、Rｘはそれぞれ独立に、R1、R2、R3、R4、R5X、R6X、R7又はR8の何れかのリピートを示し、R1'、 R1、R2、R3、R4、R5X、R6X、R7、R8、R8'の定義は＜Ａ＞に記載の通りである）を有する、ＲＮＡ結合タンパク質であって、何れか一以上のリピートにおいて、前記リピートが認識する塩基とそれに隣接する下流の塩基の組み合わせが、Ａ－Ａである場合には、前記リピートの少なくとも一つの13番目のアミノ酸がＴｙｒ又はＨｉｓであり、前記の組み合わせが、Ｇ－Ａ、Ｕ－Ａ、Ｃ－Ａ、Ｕ－Ｃ又はＣ－Ｕである場合には、前記リピートの少なくとも一つの13番目のアミノ酸がＴｙｒであり、前記組み合わせが、Ａ－Ｇ、Ａ－Ｃ、Ｇ－Ｕ、Ｕ－Ｇ、Ｃ－Ｇ又はＧ－Ｃである場合には、前記リピートの少なくとも一つの13番目のアミノ酸がＡｒｇであり、前記組み合わせが、Ａ－Ｕ又はＧ－Ｇである場合には、前記リピートの少なくとも一つの13番目のアミノ酸がＡｒｇ又はＨｉｓであり、前記組み合わせが、Ｕ－Ｕである場合には、前記リピートの少なくとも一つの13番目のアミノ酸がＴｒｐ又はＡｒｇであり、及び／又は前記組み合わせが、Ｃ－Ｃである場合には、前記リピートの少なくとも一つの13番目のアミノ酸がＰｈｅであり、前記タンパク質。
＜Ｃ＞　　R1'- R1-R2-R5-R6-R5-R6-R5-R6-R7-R8-R8'で示されるアミノ酸配列を有する、ＲＮＡ結合タンパク質（式中、R1'は、GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAGを示し、R8'はHIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLGを示し、R1,R2,R5～R8、R1'及びR8'は以下の（１）～（９）の何れかを示す）。
（１）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
（２）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSRVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSRVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSRVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
（３）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCYVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCYVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
（４）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
（５）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSRVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSRVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSRVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
（６）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCYVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCYVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
（７）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
（８）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNRVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNRVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNRVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
（９）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGSYVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGSYVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGSYVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
＜Ｄ＞R1'- R1-R2-R5-R6-R5-R6- R7-R8-R8'（式中、R1'、R8'、R1～R8は下記に示すアミノ酸配列である）で示されるアミノ酸配列を有する、ＲＮＡ結合タンパク質であって、
R1(S12N)、R1(Q16E)、R1(Q16R)、R2(N12C)、R2(N12S)、R2(N12S, Q16E)、R2(N12S, Q16R)、R7(S12C, E16Q)、R7(E16Q)、R7(S12N, E16Q)、R7(E16R)、R8(N12C)、R8(N12S)、R8(N12S, Q16E)及びR8(N12S, Q16R)のいずれかの置換を有する、タンパク質。
　　R1'：GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG（配列番号９）
　　R8'：HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG（配列番号１０）
　　R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ（配列番号１）
　　R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG（配列番号２）
　　R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ（配列番号５）
　　R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG（配列番号６）
　　R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS（配列番号７）
　　R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP（配列番号８）
＜７＞　　＜１＞から＜６＞及び＜Ａ＞から＜Ｄ＞の何れか一に記載のＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸。
＜８＞　　＜７＞に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
＜９＞　　＜８＞に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
　本発明によれば、可溶性及び高い結合性を有するＲＮＡ結合タンパク質を提供することができる。
図１は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図２は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図３は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図４は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図５は、ＲＮＡタンパク質の可溶性を測定した結果を示す。 図６は、ＲＮＡタンパク質の可溶性を測定した結果を示す。 図７は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図８は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図９は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１０は、ＲＮＡタンパク質の可溶性を測定した結果を示す。 図１１は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図１２は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１３は、ＲＮＡタンパク質の可溶性を測定した結果を示す。 図１４は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図１５は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１６は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図１７は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１８は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１９は、ＲＮＡタンパク質の可溶性を測定した結果を示す。 図２０は、ＲＮＡタンパク質の可溶性を測定した結果を示す。 図２１は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図２２は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図２３は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図２４は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図２５は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図２６は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図２７は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図２８は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図２９は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図３０は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図３１は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図３２は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図３３は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図３４は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図３５は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図３６は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図３７は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図３８は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図３９は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図４０は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図４１は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図４２は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図４３は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図４４は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図４５は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図４６は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図４７は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図４８は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図４９は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図５０は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図５１は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図５２は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図５３は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図５４は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図５５は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図５６は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図５７は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図５８は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図５９は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図６０は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図６１は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図６２は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図６３は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図６４は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図６５は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図６６は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図６７は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図６８は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図６９は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図７０は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図７１は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図７２は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図７３は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図７４は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図７５は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図７６は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図７７は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図７８は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図７９は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図８０は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図８１は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図８２は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図８３は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図８４は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図８５は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図８６は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図８７は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図８８は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図８９は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図９０は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図９１は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図９２は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図９３は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図９４は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図９５は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図９６は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図９７は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図９８は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図９９は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１００は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１０１は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１０２は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図１０３は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１０４は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１０５は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１０６は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１０７は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１０８は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図１０９は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１１０は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１１１は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１１２は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１１３は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図１１４は、スタッキングアミノ酸の検証に関する説明図を示す。 図１１５は、アミノ酸の最適化に関する説明図を示す。 図１１６は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１１７は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１１８は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１１９は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図１２０は、アミノ酸の最適化に関する説明図を示す。 図１２１は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１２２は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１２３は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１２４は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図１２５は、アミノ酸の最適化に関する説明図を示す。 図１２６は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１２７は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１２８は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１２９は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図１３０は、スタッキングアミノ酸の検証に関する説明図を示す。 図１３１は、アミノ酸の最適化に関する説明図を示す。 図１３２は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１３３は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１３４は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１３５は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１３６は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１３７は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１３８は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図１３９は、アミノ酸の最適化に関する説明図を示す。 図１４０は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１４１は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１４２は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１４３は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１４４は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１４５は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１４６は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図１４７は、アミノ酸の最適化に関する説明図を示す。 図１４８は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１４９は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１５０は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１５１は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１５２は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１５３は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１５４は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図１５５は、アミノ酸の最適化に関する説明図を示す。 図１５６は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１５７は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１５８は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１５９は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１６０は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１６１は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図１６２は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。 図１６３は、野生型スタッキングアミノ酸の規則性を示す。
　本発明のＲＮＡ結合タンパク質では、複数のリピートモチーフを有し、この複数のリピートモチーフのN末端に結合したN末端側ドメインと、C末端に結合したC末端ドメインとを有するＲＮＡ結合タンパク質である。
　N末端のドメインをR1'ドメインと呼び、C末端のドメインをR8'ドメインと呼ぶこととする。なお、R1'ドメインとR8'ドメインのアミノ酸配列は以下の通りである。
R1'：GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG（配列番号９）
R8'：HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG（配列番号１０）
　本発明の実施例においては以下の知見が得られた。
　実施例１では、R1の５番目又は１４番目のアミノ酸残基であるPheをAlaに置換すると結合力が低下すること、並びにR2の１８番目のアミノ酸残基であるPheをAlaに置換しても結合力に影響しないことが判明した。即ち、R1の５番目及び１４番目のアミノ酸残基であるPheがＲＮＡとタンパク質との相互作用に関与していることが示唆された。
　実施例２においては、認識リピートを置換したＲＮＡ結合タンパク質の可溶性と結合性を調べた。
　その結果、R3をR5に置換したＲＮＡ結合タンパク質は可溶性、並びにR4をR6に置換したＲＮＡ結合タンパク質は何れも可溶性であり、野生型と同等の結合性を有していた。
　また、R3をR5に置換し、R4をR5に置換したＲＮＡ結合タンパク質は可溶性であり、結合性も有していた。R3をR5に置換し、さらにR4から置換されたR5において、１３番目のアミノ酸残基であるArgをHisに置換したＲＮＡ結合タンパク質も上記と同等の結合性を有していた。
　また、R3をR5に置換し、R4をR6に置換したＲＮＡ結合タンパク質は可溶性であり、野生型と同等の結合性を有していた。
　また、R7-R8を連結する際には、R7の末端配列は、ILQ又はIRGであることが好ましく、ILQがより好ましいことが示された。
　実施例３においては認識リピートを延長したＲＮＡ結合タンパク質の結合性を調べた。その結果、R5-R6のリピートを繰り返すことにより、高い結合性を発揮できることが示唆された。
　実施例４においては、R5について認識特異性を改変したＲＮＡ結合タンパク質を作製し、結合性を調べた。その結果、C12N（U認識）＞C12S,Q16E（G認識）＞C12S,Q16R（C認識）＞MT(R3→R5,R4→R5)（A認識）の順に結合力が強いことが分かった。
　また、R6について、認識特異性を改変したＲＮＡ結合タンパク質を作製し、結合性を調べた。その結果、G認識及びC認識の場合、野生型のU認識の場合と同程度の結合力を有することが示された。
　実施例５においては、Ｕ－Ａ、Ａ－Ｕ間スタッキングアミノ酸を改変することによって最適アミノ酸について調べた。その結果、Ａ－Ｕ間のカチオン性アミノ酸はArg、Ｕ－Ａ間の芳香族アミノ酸はTrp、Tyr、Phe、Hisが使用できることが示された。
　また、Ａ－Ｃ、Ｃ－Ａ間スタッキングアミノ酸を改変することによって最適アミノ酸について調べた。その結果、Ｃ－Ａ間には芳香族アミノ酸であるTyr、Ａ－Ｃ間にはカチオ性アミノ酸であるArgが適していることが示された。
　また、Ｇ－Ａ間には芳香族アミノ酸であるTyr、Ａ－Ｇ間にはカチオ性アミノ酸であるArgが適していることが示された。
　また、Ｕ－Ｇ間にはカチオン性アミノ酸であるArg、Ｇ－Ｕ間にはカチオ性アミノ酸であるArgが適していることが示された。
　また、Ａ－Ａ間には、カチオン性アミノ酸よりも芳香族系アミノ酸の方が結合力が高く、芳香族系アミノ酸の中では、Tyr、Hisの結合力が高かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　実施例７においては、認識リピートをさらに延長したＲＮＡ結合タンパク質の結合性を調べた。結合能の優劣について、実施例３の結果と合わせて考察すると、下記の上から順に結合力が高いことが分かった。
　（１）　１２，１３リピート
　（２）　１０，１１，１４リピート
　（３）　９，１５リピート
　（４）　ＷＴ，８，１６リピート
　実施例８においては、実施例４と同様に。認識特異性の変更を行ってＲＮＡ結合タンパク質の結合性を調べた。特にＲ１、Ｒ２、Ｒ７、Ｒ８について認識特性の変更を行い、その影響を実験により確認した。実験結果を通じて、各アミノ酸配列を有するタンパク質のＲＮＡに対する認識特異性を明らかにし、さらに結合力の序列を明らかにした。
　実施例９においては、実施例５と同様に、各スタッキングアミノ酸を改変することによって最適にアミノ酸について確認した。その結果を、実施例５で得られた結果と合わせて表にすると、下記表２のとおりとなる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本発明の知見を利用することによって、RNA ウイルスのゲノム配列を高い親和性で特異的に認識する人工RNA 結合タンパク質をデザインすることが可能である。
＜ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子＞
　本発明のＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子の調製方法は特に限定されないが、本明細書に開示したアミノ酸配列に基づいて核酸の化学合成により調製することができる。
＜ＲＮＡ結合タンパク質の可溶化＞
　ＲＮＡ結合タンパク質の可溶化を改善するために、可溶化を促進することが知られているタグタンパク質の融合を行うことができる。タグタンパク質としては、マルトース結合タンパク質（MBP）等を使用することができる。
＜ＲＮＡ結合タンパク質の精製＞
　MBPタグ化したＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸を発現ベクターに組み込むことにより組み換え発現ベクターを調製することができる。組み換え発現ベクターを発現用の宿主に導入し、各タンパク質を宿主で発現させることができる。
（１）組換え発現ベクターの作製
　本発明のＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージ　ＤＮＡ等が挙げられる。
　プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えば、ｐＥＴ　Ｓｙｓｔｅｍ、ｐＲＳＥＴ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８，　ｐＵＣ１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
　ＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸（ＤＮＡ）を適当な制限酵素で切断し、ベクター中の制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入することにより、ＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸をベクター中に挿入することができる。
　ＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。即ち、本発明のベクターには、プロモーター、ＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸のほかに、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）などを含有していてもよい。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
（２）形質転換体の作製
　本発明は、上記した組換え発現ベクターを含む宿主細胞（形質転換体）にも関する。形質転換体は、組換え発現ベクターを、目的遺伝子（即ち、ＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸）が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。宿主としては、本発明の核酸を発現できるものであれば特に限定されるものではない。
　宿主としては、例えば、エッシェリヒア・コリ(Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属する細菌などが挙げられる。宿主としては、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母でもよい。宿主としてはさらに、COS細胞、CHO細胞等の動物細胞でもよいし、Sf9、Sf21等の昆虫細胞でもよい。
　大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換え発現ベクターが細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、ＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
　大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)K12、DH1などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などが挙げられる。プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばtrpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。tacプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
　酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomycescerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピヒア・パストリス(Pichia pastoris)などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばgal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
　動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスL細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞などが用いられる。プロモーターとしてSRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMVプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
　昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞、Sf21細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
（３）ＲＮＡ結合タンパク質の生産
　本発明のＲＮＡ結合タンパク質は、上記の形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に適用される通常の方法に従って行われる。
　大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
　培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３７℃で６～２４時間行う。培養期間中、ｐＨは７．０～７．５に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
　プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
　動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、５％ＣＯ2存在下、３７℃で１～３０日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
　培養後、ＲＮＡ結合タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりＲＮＡ結合タンパク質を抽出する。また、本発明のＲＮＡ結合タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のＲＮＡ結合タンパク質を単離精製することができる
＜ゲルシフトアッセイによる結合能の比較・評価＞
　本発明のＲＮＡ結合タンパク質が標的配列に結合するかどうかは、ゲルシフトアッセイにより評価することができる。
　反応緩衝液（10 mM Tris-HCl、pH 7.5、100 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM DTT、10% Glycerol、0.05% BSA、0.2 U RNase inhibitor）の中に、遠赤外の680nmに吸収のあるAlexa680でラベルした標的RNAプローブ（終濃度：0.5 nM）と、ＲＮＡ結合タンパク質（終濃度：10～1000 nM）を4℃で１時間混合した後、0.5×TBE緩衝液で平衡化ずみの6%非変性ポリアクリルアミドゲル（大きさ：16×16 cm、厚さ：1 mm）にアプライして、コールドルーム（4℃）内で泳動する。色素マーカーが3cm流れたところで泳動を止め、装置から取り出したゲル内の蛍光を、遠赤外検出器を用いてスキャンしながら検知することにより、RNAの各バンドを視覚化することができる。
実施例１：Ｐｈｅを介した相互作用の検証
（１）ベクターのクローニング
　hPUF＿MT(F856A), MT(F865A), MT(F856A/F865A), MT(905A)のアミノ酸配列を図１及び図２に示す。hPUF＿MT(F856A), MT(F865A), MT(F856A/F865A), MT(905A)をコードする遺伝子を全合成した。合成遺伝子をBsaIで切断し、同じくBsaIで切断し、pET24-MBP(-B)-R1'-MSC-R8'とライゲーションすることで発現ベクターを構築した。pET24-MBP(-B)-R1'-MSC-R8'は、pET24ベクター中に、マルトース結合タンパク質（MBP）をコードする遺伝子、R1'をコードする遺伝子、マルチクローニングサイト、及びR8'をコードする遺伝子を含むベクターである。
（２）タンパク質の発現および精製
　得られた各発現ベクターをそれぞれ大腸菌BL21(DE3)に形質導入した。2%グルコースを含むLB-Kan培地でOD600が0.6～0.75程度になるまで振とう培養した後、1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h振とう培養することでタンパク質の発現誘導を行った。大腸菌をペレット化し、Lysis Buffer (25 mM Tris-HCl (pH8.0), 500 mM NaCl）で懸濁した。凍結融解・ソニケーションを行った後、遠心上清をProfinityTM IMAC Ni-Charged Resin (Biorad)と混合し、4℃で10 hロータリングすることで目的タンパク質を吸着させた。25 mM Tris-HCl (pH8.0), 500 mM NaClのBufferおよび25 mM Tris-HCl (pH8.0), 500 mM NaCl, 20 mM imidazoleのBufferで洗浄した後、25 mM Tris-HCl (pH8.0), 500 mM NaCl, 150 mM imidazoleのBufferで溶出を行った。限外濾過によって、50 mM Tris-HCl (pH7.5), 300 mM NaClへのBuffer交換および濃縮を行った。99.5%グリセロールおよび1 M DTTと混合し、25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 50% グリセロール, 5 mM DTTの組成で-20℃保存した。
（３）ゲルシフトアッセイ
　両末端をAlexa680で蛍光標識した標的配列を含むRNA probe(OTS-1511)を合成した。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
　精製タンパク質をBinding Bufferで目的濃度まで希釈し、Binding Buffer およびRibonuclease Inhibitor, Cloned (Invitrogen)と混合した後、RNA probeを終濃度0.5 nMで混合した。結合反応におけるBufferの組成は、10%グリセロール, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.05% BSA, Ribonuclease Inhibitor (0.2 U), 1 mM DTT, 1 mM EDTAである。4℃で30 min結合反応を行った後、溶液をピペッティングにより穏やかに混合し、再度4℃で30 min結合反応を行った。
　結合反応後の溶液を6% 非変性ポリアクリルアミドゲルにアプライして4℃, 200 Vで泳動した。泳動マーカー(6×Dye 2 μL + 1×Binding Buffer 10 μL)が0.5 cm移動したところで100 Vに変更し、泳動マーカーが3 cm移動するまで泳動を行った。最後にOdysseyでRNAを検出した。
　結果を図３に示す。
　Phe856およびPhe865をそれぞれAlaに置換すると、結合力が落ちた（1/10程度）。Phe905をAlaに置換しても、結合力にはあまり影響はなかった。
　結合力への寄与は、Phe856>Phe865>>Phe905であることが分かった。
実施例２：認識リピートの確認
実施例２－１：
（１）ベクターのクローニング
　hPUF＿MT(R3→R5), MT(R4→R6)のアミノ酸配列を図４に示す。
　hPUF＿MT(R3→R5), MT(R4→R6)をコードする遺伝子を全合成した。合成遺伝子をBsaIで切断し、同じくBsaIで切断したpET24-R1'-MSC-R8'とライゲーションすることで発現ベクターを構築した。
（２）タンパク質の発現および精製
　実施例１の（２）と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で25℃、16 hで行った。また、Resinに吸着させる際のロータリングは8 h行った。可溶性を調べた結果を図５及び図６に示す。
（３）ゲルシフトアッセイ
　実施例１の（３）と同じ手順で行った。
　RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
　結果を図７に示す。MT(R3→R5)とMT(R4→R6)は、どちらも野生型と同等の結合力を示した
実施例２－２：
（１）ベクターのクローニング
　hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5)、hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13H)、hPUF＿MT(R4→R6, R5→R6)、及びhPUF＿MT(R4→R6, R5→R6＿Y13R)のアミノ酸配列を図８及び図９に示す。
　ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
　実施例１と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 hで行った。また、Resinに吸着させる際のロータリングは10 h行った。
　可溶性を調べた結果を図１０に示す。
（３）ゲルシフトアッセイ
　実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型用のProbe）
OTS-1759: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAAAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（hPUF＿MT(R3→R5,R4→R5),
MT(R3→R5,R4→R5＿R13H)用のProbe）
　結果を図１１に示す。
実施例２－３：
（１）ベクターのクローニング
　hPUF＿MT(R3→R5, R4→R6)及びhPUF＿MT(1-6-5-6-5-6-7-8)のアミノ酸配列を図１２に示す。
　ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
　hPUF＿MT(R3→R5, R4→R6)とhPUF＿MT(1-6-5-6-5-6-7-8)は実施例１と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF＿MT(R3→R5, R4→R6)：0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で25℃、16 h
hPUF＿MT(1-6-5-6-5-6-7-8)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3h
　また、Resinに吸着させる際のロータリングは、 hPUF＿MT(R3→R5, R4→R6) は10 h、hPUF＿MT(1-6-5-6-5-6-7-8)は14 h行った。
　hPUF＿MT(R4→R6, R5→R6)およびhPUF＿MT(R4→R6, R5→R6＿Y13R)は以下の手順で行った。得られた各発現ベクターをそれぞれ大腸菌BL21(DE3)/pKJE7に形質導入した。0.5 mg/mLアラビノースを含むLB-Cm-Kan培地でOD600が0.4～0.8程度になるまで振とう培養した後、培地に終濃度0.1 mMになるようIPTGを添加し30℃、7 h振とう培養することでタンパク質の発現誘導を行った。大腸菌をペレット化し、Lysis Buffer (25 mM Tris-HCl (pH8.0), 500 mM NaCl）で懸濁した。凍結融解・ソニケーションを行った後、遠心上清をProfinityTM IMAC Ni-Charged Resin (Biorad)と混合し、4℃で14 hロータリングすることで目的タンパク質を吸着させた。25 mM Tris-HCl (pH8.0), 500 mM NaClのBufferおよび25 mM Tris-HCl (pH8.0), 500 mM NaCl, 20 mM imidazoleのBufferで洗浄した後、25 mM Tris-HCl (pH8.0), 500 mM NaCl, 150 mM imidazoleのBufferで溶出を行った。限外濾過によって、50 mM Tris-HCl (pH7.5), 300 mM NaClへのBuffer交換および濃縮を行った。99.5%グリセロールおよび1 M DTTと混合し、25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 50% グリセロール, 5 mM DTTの組成で-20℃保存した。
　可溶性を調べた結果を図１３に示す。
（３）ゲルシフトアッセイ
　実施例１と同じ手順で行った。ただし、hPUF＿MT(R4→R6, R5→R6)およびhPUF＿MT(R4→R6, R5→R6＿Y13R)はタンパク質濃度を測定できなかったため、精製サンプルを希釈せず原液を用いた。
　RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型、hPUF＿MT(R3→R5, R4→R6), MT(1-6-5-6-5-6-7-8)用のProbe）
OTS-1760: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUUUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（ hPUF＿MT(R4→R6, R5→R6),
MT(R4→R6, R5→R6＿Y13R)用のProbe ）
　結果を図１４に示す。hPUF＿MT(1-6-5-6-5-6-7-8)の結合力は、野生型の約1/10程度（Kdは50～10 nMの間）であった。R6×3変異体は、ウェルに詰まってうまく泳動できなかった。
実施例２－４：
（１）ベクターのクローニング
　hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5＿ILQ-8)及びhPUF＿MT(1-6-5-6-5-6-5-6＿IRP)のアミノ酸配列を図１５に示す。
　ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
　実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5＿ILQ-8)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6＿IRP)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは14 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
　実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型用のProbe）
OTS-1754: 5'-Alexa680-CCAGAAUUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5＿ILQ-8), 
MT(1-2-5-6-5-6-5-6＿IRP)用のProbe）
　結果を図１６に示す。
　MT(1-2-5-6-5-6-5＿ILQ-8)、MT(1-2-5-6-5-6-5-6＿IRP)はWTよりも結合能が弱いことが考えられる
実施例２－５：
（１）ベクターのクローニング
　hPUF＿MT(1-5-5-5-5-6-7-8)、hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)及びhPUF＿MT(1-5-5-5-5-5-7-8)のアミノ酸配列を図１７及び図１８に示す。
　ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
　実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF＿MT(1-5-5-5-5-6-7-8)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で20℃、24 h
hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは10 h行った。
　可溶性を調べた結果を図１９及び図２０に示す。
（３）ゲルシフトアッセイ
　実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型用のProbe）
OTS-1818: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAAAAAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （hPUF＿MT(1-5-5-5-5-6-7-8)用のProbe）
OTS-1844: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)（hPUF＿ MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8) 用のProbe）
　結果を図２１に示す。MT(1-5-5-5-5-6-7-8)はWTと比べて結合能が低く、MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)はWTとほぼ同等の結合力を持つことが分かった。
実施例２－６：
（１）ベクターのクローニング
　hPUF＿MT(R7→R5)、hPUF＿MT(R7＿ILQ)及びhPUF＿MT(R7＿IRG)のアミノ酸配列を図２２及び図２３に示す。
　ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
　実施例１と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF＿MT(R7→R5)： 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で25℃、16 h
hPUF＿MT(R7＿IRG)：0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で25℃、16 h
hPUF＿MT(R7＿ILQ)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で25℃、13 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは13  h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
　実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型、hPUF＿MT(R7＿ILQ)、 MT(R7＿IRG)用のProbe）
OTS-1754: 5'-Alexa680-CCAGAAUUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（hPUF＿MT(R7→R5)用のProbe）
　結果を図２４に示す。MT(R7→R5)はWTに比べて結合力が弱く、またシフトしたバンドの位置が予想より高い。・MT(R7＿ILQ)、 MT(R7＿IRG)はWTとほぼ同等の結合力であった。
実施例２－７：
（１）ベクターのクローニング
　実施例２－６と同じベクターを使用した。
（２）タンパク質の発現および精製
　実施例２－６と同じである。
（３）ゲルシフトアッセイ
　実施例１と同じ手順で行った。RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
　結果を図２５に示す。R7-R8を連結する場合、末端配列はILQが適していることが分かる。
実施例２－８：
（１）ベクターのクローニング
　hPUF＿MT(R7→R5)及びhPUF＿MT(R8→R5)のアミノ酸配列を図２６に示す。
　ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
　実施例１と同じ手順で行った。
　ただし、タンパク質発現誘導は1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 hで行った。
　また、Resinに吸着させる際のロータリングは8 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
　実施例１と同じ手順で行った。
　RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型、hPUF＿MT(R7＿ILQ)、 MT(R7＿IRG)用のProbe）
OTS-1754: 5'-Alexa680-CCAGAAUUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（hPUF＿MT(R7→R5)用のProbe）
OTS-1825: 5'-Alexa680-CCAGAAUAGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（ hPUF＿MT(R8→R5)用のProbe ）
　結果を図２７に示す。MT(R7→R5) はWTと比べて非常に弱く、MT(R8→R5)はほとんど結合能を持たないと考えられる。
実施例２－９：
（１）ベクターのクローニング
　hPUF＿MT(R3→RC, R4→RC, R5→RC)及びhPUF＿MT(R3→RC2, R4→RC2, R5→RC2)のアミノ酸配列を図２８に示す、
　ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
　実施例１と同じ手順で行った。
　ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF＿MT(R3→RC,R4→RC, R5→RC)： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF＿MT(R3→RC2,R4→RC2,R5→RC2)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは9 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
　実施例１と同じ手順で行った。
　RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1759: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAAAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
　結果を図２９に示す。
　MT(R3→RC,R4→RC, R5→RC), MT(R3→RC2,R4→RC2,R5→RC2)はMT(R3→R5,  R4→R5)と比べて結合力が低い可能性がある。
実施例３：認識リピートの延長
実施例３－１：
　ベクターのクローニング、タンパク質の発現および精製は、実施例２－５と同じである。
　ゲルシフトアッセイは、実施例１と同じ手順で行った。
　RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型用のProbe）
OTS-1844: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)（hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)用のProbe）
　結果を図３０に示す。MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)はWTより約10倍強い結合力を持つことが分かる。
実施例３－２
（１）ベクターのクローニング
　hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)のアミノ酸配列は図３１に示す。
　ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
　hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)について、実施例１と同じ手順で行った。
　ただし、タンパク質発現誘導は1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 hで行った。
また、Resinに吸着させる際のロータリングは12.5 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
　実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型用のProbe）
OTS-1844: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)（hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)用のProbe）
OTS-1924: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (23 mer) （hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)用のProbe）
　結果を図３２に示す。MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)及びMT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)は、MT(R3→R5,R4→R6)よりも強い結合能を持つことが分かる。
実施例３－３：
（１）ベクターのクローニング
　hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)及びhPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)のアミノ酸配列を図３３及び図３４に示す。
（２）タンパク質の発現および精製
　実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは16 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
　実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1844: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)（hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)用のProbe）
OTS-1925: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (25 mer) （hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)用のProbe）
OTS-1926: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (27 mer) 
（hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)用のProbe）
　結果を図３５に示す。
実施例４：認識特異性の変更
実施例４－１：
（１）ベクターのクローニング
　hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5)、hPUF＿MT(R3→R5＿C12N, R4→R5＿C12N, R5＿C12N)、hPUF＿MT(R3→R5＿C12S,Q16E, R4→R5＿C12S,Q16E, R5＿C12S,Q16E)、hPUF＿MT(R3→R5＿C12S,Q16R, R4→R5＿C12S,Q16R, R5＿C12S,Q16R)のアミノ酸配列を図３６及び図３７に示す。
　ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
　 hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5) は上記した通りである。
　hPUF＿MT(R3→R5＿C12N, R4→R5＿C12N, R5＿C12N)、hPUF＿MT(R3→R5＿C12S,Q16E, R4→R5＿C12S,Q16E, R5＿C12S,Q16E)、hPUF＿MT(R3→R5＿C12S,Q16R, R4→R5＿C12S,Q16R, R5＿C12S,Q16R)については、実施例１と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF＿MT(R3→R5＿C12N, R4→R5＿C12N, R5＿C12N)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF＿MT(R3→R5＿C12S,Q16E, R4→R5＿C12N,Q16E, R5＿C12S,Q16E)：0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF＿MT(R3→R5＿C12S,Q16R, R4→R5＿C12N,Q16R, R5＿C12S,Q16R)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で20℃、24 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは12.5 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
　実施例１と同じ手順で行った。
　RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-1841: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUUUUUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（A→U配列）
OTS-1842: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUGGGUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （A→G配列）
OTS-1843: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUCCCUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （A→C配列）
　結果を図３８に示す。C12N・C12S,Q16E・C12S,Q16RはMT(R3→R5,R4→R5)よりも高い結合能を持つことが分かった。C12N（U認識）>C12S,Q16E（G認識）>C12S,Q16R（C認識）>MT(R3→R5,R4→R5)（A認識）の順に結合力が強いことが分かる。
実施例４－２：
　実施例４－１と同じタンパク質を使用した。
　ゲルシフトアッセイは、実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-1841: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUUUUUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（A→U配列）
OTS-1842: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUGGGUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （A→G配列）
OTS-1843: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUCCCUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （A→C配列）
　結果を図３９に示す。各タンパク質は標的配列に対してのみ結合しており、特異性を持つことが考えられる。
実施例４－３：
（１）ベクターのクローニング
　hPUF＿MT(R4→R6)、hPUF＿MT(R4→R6＿N12C, R6＿N12C)、hPUF＿MT(R4→R6＿N12S,Q16E, R6＿N12S,Q16E)、hPUF＿MT(R4→R6＿N12S,Q16R, R6＿N12S,Q16R)のアミノ酸配列を、図４０及び図４１に示す。
　ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
　 hPUF＿MT(R4→R6) は上記した通りである。
　hPUF＿MT(R4→R6＿N12C, R6＿N12C)、hPUF＿MT(R4→R6＿N12S,Q16E, R6＿N12S,Q16E)、hPUF＿MT(R4→R6＿N12S,Q16R, R6＿N12S,Q16R)については、実施例１と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF＿MT(R4→R6＿N12C, R6＿N12C)： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF＿MT(R4→R6＿N12S,Q16E, R6＿N12S,Q16E)： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で25℃、22 h
hPUF＿MT(R4→R6＿N12S,Q16R, R6＿N12S,Q16R)： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは12  h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
　実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-1819: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGAAAAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→A配列）
OTS-1978: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGGAGAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→G配列）
OTS-1979: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGCACAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→C配列）
　結果を図４２に示す。G, C認識の場合、野生型のU認識の場合と同程度～少し弱い結合力でであった。A認識の場合、結合力が著しく低下（1/100程度）した。
実施例４－４：
　タンパク質は、実施例４－３と同じである。
　ゲルシフトアッセイは、実施例１と同じ手順で行った。RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-1819: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGAAAAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→A配列）
OTS-1978: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGGAGAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→G配列）
OTS-1979: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGCACAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→C配列）
　結果を図４３に示す。実施例４－３と同じ結果になった（再現性が確認できた）。
実施例５：スタッキングアミノ酸の最適化
実施例５－１：
（１）ベクターのクローニング
　hPUF＿MT(R5＿R13K)、hPUF＿MT(R6＿Y13F)、hPUF＿MT(R6＿Y13H)及びhPUF＿MT(R6＿Y13W)のアミノ酸配列を図４４及び図４５に示す。
　ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
　実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF＿MT(R5＿13K)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF＿MT(R6＿13F)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF＿MT(R6＿13H)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF＿MT(R6＿13W)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは8 h行った。
（２）ゲルシフトアッセイ
　実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
　結果を図４６に示す。A-U間のカチオンはArg, U-A間の芳香族はTyrが最適アミノ酸であった。
実施例５－２：
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5)、hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13H, R5＿R13H)、
hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13Y, R5＿R13Y)、hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13Y, R5＿R13Y)、及びhPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13W, R5＿R13W)のアミノ酸配列を図４７～４９に示す。
　ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
　hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5)に関しては上記した通りである。hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13H, R5＿R13H)、hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13Y, R5＿R13Y)、hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13Y, R5＿R13Y)、及びhPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13W, R5＿R13W)については、実施例１と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 hで行った。
また、Resinに吸着させる際のロータリングは3 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
　実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1759: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAAAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
　結果を図５０に示す。Ａ－Ａ間のスタッキングアミノ酸の結合力は、Trp>Tyr>>Phe>Hisであるように見える
実施例５－３：
（１）ベクターのクローニング
　hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13K, R5＿R13K)のアミノ酸配列を図５１に示す。
　ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
　実施例１と同じ手順で行った。
　ただし、タンパク質発現誘導は0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 hで行った。
また、Resinに吸着させる際のロータリングは16 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
　実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1759: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAAAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
　結果を図５２に示す。Ａ－Ａ間のスタッキングアミノ酸としてはカチオン系よりも芳香族の方が結合力が高く、芳香族の中では、His, Tyrが結合力が高い。
実施例５－４：
（１）ベクターのクローニング
　hPUF＿MT(R5:A＿13R)3(R6:C＿13Y)3、hPUF＿MT(R5:A＿13R)3(R6:C＿13R)3、及びhPUF＿MT(R5:A＿13R)(R5:A＿13Y)2(R6:C＿13Y)3のアミノ酸配列を図５３及び図５４に示す。
　ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
　実施例１と同じ手順で行った。
　ただし、Resinに吸着させる際のロータリングは11 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
　実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-2004: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGCACACAUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)
　結果を図５５に示す。
　丸数字１と２を比較すると、丸数字１の方が3倍程度結合力が高い（Tyr>Arg）
　丸数字１と３を比較すると、丸数字１の方が10倍程度結合力が高い（Arg>Tyr）
　C-A間には芳香族のTyr、A-C間にはカチオン系のArgが適している。
実施例５－５
（１）ベクターのクローニング
　hPUF＿MT(R5:A＿13R)3(R6:G＿13Y)3、hPUF＿MT(R5:A＿13R)3(R6:G＿13R)3、hPUF＿MT(R5:A＿13R)(R5:A＿13Y)2(R6:G＿13Y)3のアミノ酸配列を図５６及び図５７に示す。
　ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
　実施例１と同じ手順で行った。
ただし、Resinに吸着させる際のロータリングは11 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
　実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-2008: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGGAGAGAUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)
　結果を図５８に示す。
　丸数字１と丸数字２を比較すると、丸数字１の方が30倍以上結合力が高い（Tyr>Arg）。
G-A間には芳香族のTyr適している。
　丸数字１と丸数字３を比較すると、わずかに丸数字１の方が結合力が高い（Arg>Tyr）。A-G間にはカチオン系のArgが適している。
実施例５－６
（１）ベクターのクローニング
　hPUF＿MT(R5:G＿13R)3(R6:U＿13Y)3、hPUF＿MT(R5:G＿13R)3(R6:U＿13R)3、hPUF＿MT(R5:A＿13R)(R5:A＿13Y)2(R6:G＿13Y)3のアミノ酸配列は、図５９及び図６０に示す。
　ベクターのクローニングは、実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
　実施例１と同じ手順で行った。
　ただし、Resinに吸着させる際のロータリングは11 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
　実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-2004: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUGUGUGUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)
　結果を図６１に示す。丸数字１と丸数字２を比較すると、丸数字２の方が3倍程度結合力が高い（Tyr<Arg）。丸数字１と丸数字３を比較すると、丸数字１の方が30倍程度結合力が高い（Arg>Tyr）。U-G間にはカチオン系のArg、G-U間にはカチオン系のArgが適している。
実施例６：Ｐｕｍｂｙとの比較
（１）ベクターのクローニング
 hPUF＿MT(5＿(6)8), MT(6＿(56)4), MT(4＿(56)4)のアミノ酸配列を図６２及び図６３に示す。
　hPUF＿MT(5＿(6)8), MT(6＿(56)4), MT(4＿(56)4)をコードする遺伝子を全合成した。合成遺伝子をEcoRIおよびHindIIIで切断し、同じくEcoRIおよびHindIIIで切断したpET24-R1'-MSC-R8'とライゲーションすることで発現ベクターを構築した。構築した発現ベクターにおいては、 R1'及びR8'は除去されている。
（２）タンパク質の発現および精製
　実施例１と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 hで行った。
hPUF＿MT(5＿(5)8)： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で20℃、21 h
hPUF＿MT(6＿(56)4)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF＿MT(4＿(56)4)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは11 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
　実施例１と同じ手順で行った。
　RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
　結果を図６４に示す。
実施例７：認識リピートの延長［２］
実施例７－１
（１）ベクターのクローニング
　hPUF_MT(1-2-6-5-6-5-6-7-8)、hPUF_MT(1-2-5-5-6-5-6-7-8)及びhPUF_MT(1-2-5-6-5-6-6-7-8)のアミノ酸配列を図６５～６７に示す。
　ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
　実施例１と同じ手順で行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
　実施例１と同じ手順で行った。
　結果を図６８に示す。認識リピートを延長したものは、ＷＴよりも約3倍高い結合能を示した。認識リピートを延長したものどうしでは（図６７の９リピート丸数字の２～４）はほぼ同等の結合能を示した。
実施例７－２
（１）ベクターのクローニング
　hPUF_MT(1-2-6-5-6-5-6-7-8)、hPUF_MT(1-2-5-5-6-5-6-7-8)及びhPUF_MT(1-2-5-6-5-6-6-7-8) のアミノ酸配列を図６９～７１に示す。
　ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
　実施例７－１と同じ手順で行った。
　ただし、hPUF_MT(1-2-6-5-6-5-6-7-8))については、タンパク質発現誘導は0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 hで行った。また、Resinに吸着させる際のロータリングは10 h行った。hPUF_MT(1-2-5-5-6-5-6-7-8))については、タンパク質発現誘導は1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 hで行った。また、Resinに吸着させる際のロータリングは10 h行った。hPUF_MT(1-2-5-6-5-6-6-7-8))については、タンパク質発現誘導は0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 hで行った。また、Resinに吸着させる際のロータリングは10 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
　実施例７－１と同じ手順で行った。
　ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （野生型配列）
OTS-2080: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUUAUUCG-Alexa680-3' (20 mer) （9リピート（２））
OTS-2081: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAAUAUUCG-Alexa680-3' (20 mer) （9リピート（３））
OTS-2082: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (20 mer) （9リピート（４））
　結果を図７２に示す。１３リピートが最も高い結合能を示した。次に、１１リピートが結合能が高く、ＷＴよりも約３倍高い結合能を示した。１５リピートはＷＴよりも若干高い結合能を示した。
実施例８：認識特異性の変更［２］
実施例８－１
（１）ベクターのクローニング
　hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R1_S12N, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R1_Q16E, R3→R5, R4→R6)及びhPUF_MT(R1_Q16R, R3→R5, R4→R6)のアミノ酸配列を図７３～７６に示す。
　ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
　実施例１と同じ手順で行った。
　ただし、各タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
　hPUF_MT(R1_S12N, R3→R5, R4→R6)：0.001 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
　hPUF_MT(R1_Q16E, R3→R5, R4→R6)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
　hPUF_MT(R1_Q16R, R3→R5, R4→R6)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
　また、Resinに吸着させる際のロータリングは14 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
　実施例１と同じ手順で行った。
　ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-2022: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUUUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（A→U配列）
OTS-2020: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUGUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （A→G配列）
OTS-2021: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUCUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （A→C配列）
　結果は図７７のとおりである。同図から分かるとおり、認識リピートを延長したものは、ＷＴよりも約3倍高い結合能を示した。結合力については、Q16R（C認識）>Q16E（G認識）= MT(R3→R5,R4→R5)（A認識)>S12N(U認識)の順に結合力が強い結果となった。
　さらに認識の特異性の結果としては（図７８）、下記の特異性が確認された。
（１）MT(R3→R5,R4→R5)：U=C>A>Gの順に結合力が高い
（２）MT(R1_S12N,R3→R5,R4→R5)（U認識）：U>C>>G=Aの順に結合力が高い
（３）MT(R1_Q16E,R3→R5,R4→R5)（G認識）：G>>U=Cの順に結合力が高い
（３）MT(R1_Q16E,R3→R5,R4→R5)（C認識）：C>U>>G>Aの順に結合力が高い
　なお、上記の（　）の数字が図中の丸数字に対応する。
実施例８－２
（１）ベクターのクローニング
　hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)  （＝ 新規バックボーン）のアミノ酸配列を図７９に示す。
　ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
　実施例８－１と同じ手順とした。
（３）ゲルシフトアッセイ
　実施例８－１と同じ手順で行った。
　ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-2022: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUUUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（A→U配列）
OTS-2020: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUGUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （A→G配列）
OTS-2021: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUCUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （A→C配列）
　結果は図８０とおりである。図から分かるとおり、元の野生型も塩基特異性がなかったことから、骨格の変更が理由ではないことを確認できた。
　なお、試験においては、ＷＴの1，2回目のサンプルはMBPタグ付きであった。野生型でも特異性のない結果が得られたが、この点につき、3回目と4回目でＷＴ，新規バックボーンの再現性が確認された。
実施例８－３
（１）ベクターのクローニング
　hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R2_N12C, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R2_N12S, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R2_N12S,Q16E, R3→R5, R4→R6)及びhPUF_MT(R2_N12S,Q16R, R3→R5, R4→R6)のアミノ酸配列を図８１～８５に示す。
　ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
　実施例８－１と同じ手順とした。
　ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
　hPUF_MT(R2_N12C, R3→R5, R4→R6)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
　hPUF_MT(R2_N12S, R3→R5, R4→R6)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
　hPUF_MT(R2_N12S, Q16E, R3→R5, R4→R6)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
　hPUF_MT(R2_N12S, Q16R, R3→R5, R4→R6)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
　また、Resinに吸着させる際のロータリングは12.5 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
　実施例８－１と同じ手順で行った。
　ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-2023: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAAAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→A配列）
OTS-2024: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAGAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （U→G配列）
OTS-2025: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUACAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （U→C配列）
　結果は図８６のとおりである。図から分かるとおり、今回作成したアミノ酸配列を有する結合タンパク質は、先に作成したMT(R3→R5,R4→R5)（図面左）よりも高い結合能を持たない結果となった。序列を示すと、MT(R3→R5,R4→R5)（U認識>N12S, Q16E（G認識）>N12S ,Q16R（C認識)>S12C(U認識)の順に結合力が強い結果となった。
実施例８－４
（１）ベクターのクローニング
　hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R2_N12C, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R2_N12S,Q16E, R3→R5, R4→R6)及びhPUF_MT(R2_N12S,Q16R, R3→R5, R4→R6)のアミノ酸配列を図８７～９０に示す。
　ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
　実施例８－１と同じ手順とした。
　ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
　hPUF_MT(R2_N12C, R3→R5, R4→R6)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
　hPUF_MT(R2_N12S, Q16E, R3→R5, R4→R6)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
　hPUF_MT(R2_N12S, Q16R, R3→R5, R4→R6)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
　また、Resinに吸着させる際のロータリングは12.5 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
　実施例８－１と同じ手順で行った。
　ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-2023: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAAAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→A配列）
OTS-2024: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAGAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （U→G配列）
OTS-2025: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUACAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （U→C配列）
　結果は図９１のとおりである。図から分かるとおり、以下のことが言える。
（１）MT(R3→R5,R4→R5)： U >> C の順に結合力が高い
（２）MT(R2_S12C, R3→R5,R4→R5)（A認識）： A = U = C >> G の順に結合力が高い
（３）MT(R2_N12S, Q16E R3→R5,R4→R5)（G認識）： Gのみに結合した。
（４）MT(R2_N12S, Q16R, R3→R5,R4→R5)（C認識）： C のみに結合した。
　図中の丸数字の１～４は上記の（１）～（４）に対応する。
実施例８－５
（１）ベクターのクローニング
　hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R7_S12C,E16Q, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R7_E16Q, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R7_S12N,E16Q, R3→R5, R4→R6)及びhPUF_MT(R7_E16R, R3→R5, R4→R6)のアミノ酸配列を図９２～９６に示す。
　ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
　実施例８－１と同じ手順とした。
　ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
　hPUF_MT(R7_S12C, E16Q, R3→R5, R4→R6)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
　hPUF_MT(R7_E16Q, R3→R5, R4→R6)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
　hPUF_MT(R7_S12N, E16Q, R3→R5, R4→R6)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
　hPUF_MT(R7_E16R, R3→R5, R4→R6)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
　また、Resinに吸着させる際のロータリングは3.5 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
　実施例８－１と同じ手順で行った。
　ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-1754: 5'-Alexa680-CCAGAAUUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（G→A配列）
OTS-2032: 5'-Alexa680-CCAGAAUUUUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （G→U配列）
OTS-2033: 5'-Alexa680-CCAGAAUUCUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （G→C配列）
　結果は図９７のとおりである。図から分かるとおり、以下のことが言える。
　今回作成した各アミノ酸配列を有する結合タンパク質は、MT(R3→R5,R4→R5)よりも高い結合能を持たなかった。
　結合力の序列については、MT(R3→R5,R4→R5 （G認識）> MT(R3→R5,R4→R5, R7_ S12N, E16Q）（U認識）> MT(R3→R5,R4→R5, R7_E16R）（C認識）> MT(R3→R5,R4→R5, R7_S12C, E16Q （A_E16Q）> MT(R3→R5,R4→R5, R7_S12C, E16Q）（A_S12C, E16Q）の順に結合力が高い結果となった。
実施例８－６
（１）ベクターのクローニング
　hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R7_S12C,E16Q, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R7_S12N,E16Q, R3→R5, R4→R6)及びhPUF_MT(R7_E16R, R3→R5, R4→R6)のアミノ酸配列を図９８～１０１に示す。
　ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
　実施例８－１と同じ手順とした。
　ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R7_S12C, E16Q, R3→R5, R4→R6)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R7_S12N, E16Q, R3→R5, R4→R6)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R7_E16R, R3→R5, R4→R6)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
　また、Resinに吸着させる際のロータリングは3.5 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
　実施例８－１と同じ手順で行った。
　ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-1754: 5'-Alexa680-CCAGAAUUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（G→A配列）
OTS-2032: 5'-Alexa680-CCAGAAUUUUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （G→U配列）
OTS-2033: 5'-Alexa680-CCAGAAUUCUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （G→C配列）
　結果は図１０２のとおりである。図から分かるとおり、以下のことが言える。
（１）MT(R3→R5,R4→R5)： G のみに結合した。
（２）MT(R3→R5,R4→R5, R7_S12C, E16Q)（A認識）：U > C の順に結合力が高い
（３）MT(R3→R5,R4→R5, R7_S12N, E16Q)（U認識）： Uのみに結合した。
（４）MT(R3→R5,R4→R5, R7_E16R)（C認識）： C, Uに結合した。
　なお、（　）は図中の丸数字と対応した説明となっている。
実施例８－７
（１）ベクターのクローニング
　hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R8_N12C, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R8_N12S, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R8_N12S,Q16E, R3→R5, R4→R6)及びhPUF_MT(R8_N12S,Q16R, R3→R5, R4→R6)のアミノ酸配列を図１０３～１０７に示す。
　ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
　実施例８－１と同じ手順とした。
　ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R8_N12C, R3→R5, R4→R6)： 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R8_N12S, R3→R5, R4→R6)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R8_N12S, Q16E, R3→R5, R4→R6)： 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R8_N12S, Q16R, R3→R5, R4→R6)： 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
　また、Resinに吸着させる際のロータリングは11 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
　実施例８－１と同じ手順で行った。
　ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-1825: 5'-Alexa680-CCAGAAUAGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→A配列）
OTS-2034: 5'-Alexa680-CCAGAAUGGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （U→G配列）
OTS-2035: 5'-Alexa680-CCAGAAUCGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （U→C配列）
　結果は図１０８のとおりである。図から分かるとおり、以下のことが言える。
　今回作成した各アミノ酸配列を有する結合タンパク質は、MT(R3→R5,R4→R5)よりも高い結合能を持たなかった。結合力の序列については、MT(R3→R5,R4→R5)（U認識）>N12S, Q16R（C認識）>N12S ,Q16E（G認識)の順に結合力が強かった。S12C(A認識) = N12S（A認識）は結合していなかった。
実施例８－８
（１）ベクターのクローニング
　hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R8_N12C, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R8_N12S,Q16E, R3→R5, R4→R6)及びhPUF_MT(R8_N12S,Q16R, R3→R5, R4→R6)のアミノ酸配列を図１０９～１１２に示す。
　ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
　実施例８－１と同じ手順とした。
　ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R8_N12C, R3→R5, R4→R6)： 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R8_N12S, Q16E, R3→R5, R4→R6)： 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R8_N12S, Q16R, R3→R5, R4→R6)： 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
　また、Resinに吸着させる際のロータリングは11 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
　実施例８－１と同じ手順で行った。
　ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-1825: 5'-Alexa680-CCAGAAUAGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→A配列）
OTS-2034: 5'-Alexa680-CCAGAAUGGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （U→G配列）
OTS-2035: 5'-Alexa680-CCAGAAUCGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （U→C配列）
　結果は図１１３のとおりである。図から分かるとおり、以下のことが言える。
（１）MT(R3→R5,R4→R5)： U のみに結合した。
（２）MT(R3→R5,R4→R5, R8_N12C)（A認識）： 結合なし
（３）MT(R3→R5,R4→R5, R8 N12S, Q16E)（G認識）： Gのみに結合した。
（４）MT(R1_Q16E, R3→R5,R4→R5)（C認識）： C >>  G > Cの順に結合力が高い
　なお、（　）は図中の丸数字と対応した説明となっている。
実施例９：スタッキングアミノ酸の最適化［２］
　確認したスタッキングアミノ酸の最適化については、以下の１６種類の組合せが考えられる。本実施例では、＊をした水準について実験を行い、結果を確認した。
　異なる塩基間のスタッキング（12種類）
　　A-C/C-A 間
　　A-U/U-A 間＊
　　G-A/A-G 間
　　U-G/G-U 間
　　C-G/G-C 間＊
　　U-C/C-U 間＊
　同じ塩基間のスタッキング（4種類）
　　A-A 間＊
　　G-G 間＊
　　U-U 間＊
　　C-C 間＊
＜異なる塩基間についてのスタッキングアミノ酸の検証（図１１４）＞
実施例９－１：A-U/U-A 間（図１１５）
（１）ベクターのクローニング
　hPUF_MT(R5:A_13R)3(R6:U_13Y)3、hPUF_MT(R5:A_13R)3(R6:U_13R)3及びhPUF_MT(R5:A_13R)(R5:A_13Y)2(R6:U_13Y)3のアミノ酸配列を図１１６～１１８に示す。
　ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
　実施例１と同じ手順で行った。
　ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R5:A_13R)3(R6:U_13Y)3： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
　Resinに吸着させる際のロータリングは9.5 h行った。
hPUF_MT(R5:A_13R)3(R6:U_13R)3： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R5:A_13R)(R5:A_13Y)2(R6:U_13Y)3： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
　Resinに吸着させる際のロータリングは8 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
　実施例１と同じ手順で行った。
　ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1844: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)
　結果を図１１９に示す。図中の丸数字の１と２の比較から、１の方が30倍以上結合力が高いことが分かった（Tyr>Arg）。丸数字の１と３の比較から、１,３ともに結合力は同程度であることが分かった（Arg=Tyr）。すなわち、U-A間には芳香族のTyr、A-U間はArg, Tyrで有意差がなかった。
実施例９－２：C-G/G-C 間（図１２０）
（１）ベクターのクローニング
　hPUF_MT(R5:G_13R)3(R6:C_13Y)3、hPUF_MT(R5:G_13R)3(R6:C_13R)3及びhPUF_MT(R5:G_13R)(R5:G_13Y)2(R6:C_13Y)3のアミノ酸配列を図１２１～１２３に示す。
　ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
　実施例１と同じ手順で行った。
　ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R5:G_13R)3(R6:C_13Y)3： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:G_13R)3(R6:C_13R)3： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:G_13R)(R5:G_13Y)2(R6:C_13Y)3： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
　また、Resinに吸着させる際のロータリングは12 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
　実施例１と同じ手順で行った。
　ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-2007: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGCGCGCGUAUUCG-Alexa680-3' (24 mer)
　結果を図１２４に示す。図中の丸数字の１と２の比較から、２の方がわずかに結合力が高いことが分かった（Tyr<Arg）。１と３の比較から、１の方がわずかに結合力が高いことが分かった（Arg>Tyr）。すなわち、C-G間にはカチオン系のArg 、G-C間にもカチオン系のArgが適していた。
実施例９－３：U-C/C-U 間（図１２５）
（１）ベクターのクローニング
　hPUF_MT(R5:C_13R)3(R6:U_13Y)3、hPUF_MT(R5:C_13R)3(R6:U_13R)3及びhPUF_MT(R5:C_13R)(R5:C_13Y)2(R6:U_13Y)3のアミノ酸配列を図１２６～１２８に示す。
　ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
　実施例１と同じ手順で行った。
　ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R5:C_13R)3(R6:U_13Y)3： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:C_13R)3(R6:U_13R)3： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:C_13R)(R5:C_13Y)2(R6:U_13Y)3： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
　また、Resinに吸着させる際のロータリングは13.5 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
　実施例１と同じ手順で行った。
　ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-2006: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUCUCUCUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)
　結果を図１２９に示す。図中の丸数字の１と２の比較から、１の方が10倍程度結合力が高いことが分かった（Tyr>Arg）。１と３の比較から、３の方がわずかに結合力が高いことが分かった（Arg<Tyr）。すなわち、U-C間には芳香族のTyr、C-U間にも芳香族のTyrが適していた。
＜同じ塩基間についてのスタッキングアミノ酸の検証（図１３０）＞
実施例９－４：A-A 間（図１３１）
（１）ベクターのクローニング
　hPUF_MT(R3→R5, R4→R5)、hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13K, R5_R13K)、hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13F, R5_R13F)、hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13H, R5_R13H)、hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13W, R5_R13W)及びhPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13Y, R5_R13Y)のアミノ酸配列を図１３２～１３７に示す。
　ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
　実施例１と同じ手順で行った。
　ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5) ： 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
　Resinに吸着させる際のロータリングは10 h行った。
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13K, R5_R13K)： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
　Resinに吸着させる際のロータリングは16 h行った。
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13F, R5_R13F) ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13H, R5_R13H) ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13W, R5_R13W) ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13Y, R5_R13Y) ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
　Resinに吸着させる際のロータリングは3 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
　実施例１と同じ手順で行った。
　ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1759: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAAAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
　結果を図１３８に示す。カチオン系よりも芳香族の方が結合力が高いことが分かった。芳香族の中では、 His, Tyrが最も結合力が高いことが分かった（H=Y>R>F=W>K）。
実施例９－５：G-G 間（図１３９）
（１）ベクターのクローニング
　hPUF_MT(R5:G_13R)3、hPUF_MT(R5:G_13K)3、hPUF_MT(R5:G_13F)3、hPUF_MT(R5:G_13H)3、hPUF_MT(R5:G_13W)3及びhPUF_MT(R5:G_13Y)3のアミノ酸配列を図１４０～１４５に示す。
　ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
　実施例１と同じ手順で行った。
　ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R5:G_13R)3 ： 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
　Resinに吸着させる際のロータリングは12.5 h行った。
hPUF_MT(R5:G_13K)3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、7 h
hPUF_MT(R5:G_13F)3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、7 h
hPUF_MT(R5:G_13H)3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、7 h
hPUF_MT(R5:G_13W)3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、7 h
hPUF_MT(R5:G_13Y)3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、7 h
　Resinに吸着させる際のロータリングは14 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
　実施例１と同じ手順で行った。
　ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1842: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUGGGUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
　結果を図１４６に示す。芳香族よりもカチオン系の方が結合力が高いことが分かった。カチオン系の中では、Argが最も結合力が高いことが分かった（R=H>K>W=Y>F）。
実施例９－６：U-U 間（図１４７）
（１）ベクターのクローニング
　hPUF_MT(R5:U_13R)3、hPUF_MT(R5:U_13K)3、hPUF_MT(R5:U_13F)3、hPUF_MT(R5:U_13H)3、hPUF_MT(R5:U_13W)3及びhPUF_MT(R5:U_13Y)3のアミノ酸配列を図１４８～１５３に示す。
　ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
　実施例１と同じ手順で行った。
　ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R5:U_13R) 3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
　Resinに吸着させる際のロータリングは12.5 h行った。
hPUF_MT(R5:U_13K) 3 ： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:U_13F) 3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:U_13H) 3 ： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:U_13W) 3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:U_13Y) 3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
　Resinに吸着させる際のロータリングは14 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
　実施例１と同じ手順で行った。
　ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1841: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUUUUUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
　結果を図１５４に示す。カチオン系よりも芳香族の方が結合力が高いことが分かった。芳香族の中では、Trpが最も結合力が高いことが分かった（W=R>H>F=Y>K）。
実施例９－７：C-C 間（図１５５）
（１）ベクターのクローニング
　hPUF_MT(R5:C_13R)3、hPUF_MT(R5:C_13K)3、hPUF_MT(R5:C_13F)3、hPUF_MT(R5:C_13H)3、hPUF_MT(R5:C_13W)3及びhPUF_MT(R5:C_13Y)3のアミノ酸配列を図１５６～１６１に示す。
　ベクターのクローニングは実施例２－１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
　実施例１と同じ手順で行った。
　ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R5:C_13R)3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で20℃、24 h
　Resinに吸着させる際のロータリングは12.5 h行った。
hPUF_MT(R5:C_13K)3 ： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R5:C_13F)3  ： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R5:C_13H)3 ： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R5:C_13W)3 ： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R5:C_13Y)3 ： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
　Resinに吸着させる際のロータリングは14 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
　実施例１と同じ手順で行った。
　ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1843: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUCCCUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
　結果を図１６２に示す。Fが最も適していることが分かった（F>H>W>R=K>Y）。

Claims (9)

  1. Ｒ１’－Ｒ１Ｘ－Ｒ２Ｘ－（Ｒ５Ｘ又はＲ６Ｙ）L－（Ｒ５Ｘ－Ｒ６Ｙ）M－（Ｒ５Ｘ又はＲ６Ｙ）N－　Ｒ７Ｘ－Ｒ８Ｘ－　Ｒ８’で示されるアミノ酸配列を有する、ＲＮＡ結合タンパク質：
    式中、
    Ｒ１Ｘは、Ｒ１、Ｒ１（Ｓ１２Ｎ）、Ｒ１（Ｓ１２Ｃ）、Ｒ１（Ｑ１６Ｅ）、又はＲ１（Ｑ１６Ｒ）を示し、
    Ｒ２Ｘは、Ｒ２、Ｒ２（Ｎ１２Ｃ）、Ｒ２（Ｎ１２Ｓ）、Ｒ２（Ｎ１２Ｓ，Ｑ１６Ｅ）、又はＲ２（Ｎ１２Ｓ，Ｑ１６Ｒ）を示し、
    Ｒ５Ｘは、Ｒ５、Ｒ５（Ｃ１２Ｓ）、Ｒ５（Ｃ１２Ｎ）、Ｒ５（Ｃ１２Ｓ，Ｑ１６Ｅ）、又はＲ５（Ｃ１２Ｓ，Ｑ１６Ｒ）の何れかを示し、
    Ｒ６ＹはＲ６、Ｒ６（Ｎ１２Ｃ）、Ｒ６（Ｎ１２Ｓ）、Ｒ６（Ｎ１２Ｓ，Ｑ１６Ｅ）、又はＲ６（Ｎ１２Ｓ，Ｑ１６Ｒ）の何れかを示し、
    Ｒ７Ｘは、Ｒ７、Ｒ７（Ｓ１２Ｃ，　Ｅ１６Ｑ）、Ｒ７（Ｅ１６Ｑ）、Ｒ７（Ｓ１２Ｎ，　Ｅ１６Ｑ）、又はＲ７（Ｅ１６Ｒ）を示し、
    Ｒ８Ｘは、Ｒ８、Ｒ８（Ｎ１２Ｃ）、Ｒ８（Ｎ１２Ｓ）、Ｒ８（Ｎ１２Ｓ，　Ｑ１６Ｅ）、又はＲ８（Ｎ１２Ｓ，　Ｑ１６Ｒ）を示す。
    Ｓ１２Ｎは、１２番目のアミノ酸ＳがＮに置換されていることを示し、
    Ｓ１２Ｃは、１２番目のアミノ酸ＳがＣに置換されていることを示し、
    Ｎ１２Ｃは、１２番目のアミノ酸ＮがＣに置換されていることを示し、
    Ｎ１２Ｓは、１２番目のアミノ酸ＮがＳに置換されていることを示し、
    Ｃ１２Ｎは、１２番目のアミノ酸ＣがＮに置換されていることを示し、
    Ｃ１２Ｓは、１２番目のアミノ酸ＣがＳに置換されていることを示し、
    Ｑ１６Ｅは、１６番目のアミノ酸ＱがＥに置換されていることを示し、
    Ｑ１６Ｒは、１６番目のアミノ酸ＱがＲに置換されていることを示し
    Ｌ及びＮはそれぞれ独立に０又は１を示し、Ｍは２以上の整数を示す。
    各リピートは以下のアミノ酸配列を示す。
    R1'：GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG
    R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
    R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
    R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
    R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
    R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
    R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
    R8'：HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG
  2. Ｒ１Ｘ、Ｒ２Ｘ、Ｒ５Ｘ、Ｒ６Ｙ、Ｒ７Ｘ及びＲ８Ｘの何れか一以上のリピートにおいて、
    前記リピートが認識する塩基とそれに隣接する下流の塩基の組み合わせが、Ａ－Ａである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸（即ち、前記の２塩基の間にスタッキングするアミノ酸）がＴｙｒ又はＨｉｓであり、
    前記の組み合わせが、Ｇ－Ａ、Ｕ－Ａ、Ｃ－Ａ、Ｕ－Ｃ又はＣ－Ｕである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸（即ち、前記の２塩基の間にスタッキングするアミノ酸）がＴｙｒであり、
    前記組み合わせが、Ａ－Ｇ、Ａ－Ｃ、Ｇ－Ｕ、Ｕ－Ｇ、Ｃ－Ｇ又はＧ－Ｃである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸（即ち、前記の２塩基の間にスタッキングするアミノ酸）がＡｒｇであり、
    前記組み合わせが、Ａ－Ｕ又はＧ－Ｇである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸（即ち、前記の２塩基の間にスタッキングするアミノ酸）がＡｒｇ又はＨｉｓであり、
    前記組み合わせが、Ｕ－Ｕである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸（即ち、前記の２塩基の間にスタッキングするアミノ酸）がＴｒｐ又はＡｒｇであり、及び／又は
    前記組み合わせが、Ｃ－Ｃである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸（即ち、前記の２塩基の間にスタッキングするアミノ酸）がＰｈｅであり、請求項１に記載のタンパク質。
  3. EIRG-(R5X-R6Y)nで示されるアミノ酸配列を有する、ＲＮＡ結合タンパク質：式中、ｎ個のR5Xはそれぞれ独立に、R5、R5(C12N)、R5(C12S,Q16E)、又はR5(C12S,Q16E)の何れかを示し、ｎ個のR6Yはそれぞれ独立に、R6、R6(N12C)、R6(N12S,Q16E)又はR6(N12S,Q16R)の何れかを示し、ｎは４～１５の整数を示す。
    R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
    R5(C12N)：QVFALSTHPYGNRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
    R5(C12S,Q16E)： QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
    R5(C12S,Q16R) ：QVFALSTHPYGSRVIRRILEHCLPDQTLPILEELHQ
    R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
    R6(N12C)：HTEQLVQDQYGCYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
    R6(N12S,Q16E): HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
    R6(N12S,Q16R): HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
  4. AFKG-(R5X-R6YZ)n-1 R5X-R6Yで示されるアミノ酸配列を有する、ＲＮＡ結合タンパク質：式中、ｎ個のR5Xはそれぞれ独立に、R5、R5(C12N)、R5(C12S,Q16E)、又はR5(C12S,Q16E)の何れかを示し、（ｎ－１）個のR6YZはそれぞれ独立に、R6(AFKG)、R6(N12C) (AFKG)、R6(N12S,Q16E) (AFKG)又はR6(N12S,Q16R) (AFKG)の何れかを示し、R6Yは、R6、R6(N12C)、R6(N12S,Q16E)又はR6(N12S,Q16R)の何れかを示し、ｎは４～１５の整数を示す。
    R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
    R5(C12N)：QVFALSTHPYGNRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
    R5(C12S,Q16E)： QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
    R5(C12S,Q16R) ：QVFALSTHPYGSRVIRRILEHCLPDQTLPILEELHQ
    R6 (AFKG) ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAAFKG
    R6(N12C) (AFKG)：HTEQLVQDQYGCYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAAFKG
    R6(N12S,Q16E) (AFKG): HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAAFKG
    R6(N12S,Q16R) (AFKG): HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAAFKG
    R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
    R6(N12C)：HTEQLVQDQYGCYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
    R6(N12S,Q16E): HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
    R6(N12S,Q16R): HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
  5. さらにＮ末端にR1'を有し、及び／又はＣ末端にR8'を有する、請求項３は４に記載のタンパク質。
    R1'：GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG
    R8'：HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG
  6. さらにＮ末端にR1'-R1-R2を有し、及び／又はＣ末端にR8-R8'を有する、請求項３又は４に記載のタンパク質。
    R1'：GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG
    R8'：HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG
    R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
    R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
    R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
  7. 請求項１から６の何れか一項に記載のＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸。
  8. 請求項７に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
  9. 請求項８に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
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