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WO2018166542A1 - Método para el tratamiento de pacientes con carcinomas - Google Patents

Método para el tratamiento de pacientes con carcinomas Download PDF

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WO2018166542A1
WO2018166542A1 PCT/CU2018/050001 CU2018050001W WO2018166542A1 WO 2018166542 A1 WO2018166542 A1 WO 2018166542A1 CU 2018050001 W CU2018050001 W CU 2018050001W WO 2018166542 A1 WO2018166542 A1 WO 2018166542A1
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her1
her2
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receptors
carcinoma
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PCT/CU2018/050001
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French (fr)
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Belinda SÁNCHEZ RAMÍREZ
Gretchen BERGADO BÁEZ
Narjara GONZÁLEZ SUÁREZ
Mabel CRUZ RODRÍGUEZ
Diana Rosa HERNÁNDEZ FERNÁNDEZ
Lisset CHAO GARCÍA
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Centro de Immunologia Molecular
Original Assignee
Centro de Immunologia Molecular
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Definitions

  • the present invention relates to the branch of Biotechnology and Medicine.
  • methods are provided to improve the treatment of certain subgroups of patients with carcinomas of epithelial origin, more particularly those patients who are not candidates for receiving monoclonal antibody therapy against HER-1 or HER-2.
  • the invention provides a method of treatment where the chosen patients are treated with bivalent vaccine compositions HER1 + HER2.
  • Receptors of the epidermal growth factor receptor (RFCE) family are involved in cell growth, differentiation, motility and survival (Schneider MR and Yarden Y. (2016) Oncogene 35 (23 ): 2949-60).
  • This family consists of four members: the prototype is the RFCE (HER1 / ErbB1) which was the first receptor with cloned tyrosine kinase activity (Ullrich A., Coussens L., Hayflick JS and cois. (1984) Nature 309 (5967): 418-25), HER2 / Neu / ErbB2 (Coussens L., Yang-Feng TL, Liao YC and cois.
  • RFCE epidermal growth factor receptor
  • the characteristic structure of these receptors consists of an extracellular N-terminal ligand binding domain that contains the dimerization arm, a hydrophobic transmembrane region and a C-terminal cytoplasmic region that has tyrosine kinase activity, in addition to several autophosphorylation residues. Frequently, they are co-expressed in various combinations, and depending on the activating ligand they can form homodimers or heterodimers, generating a complex signal transduction network (Seshacharyulu P., Ponnusamy MP, Haridas D., and cois.
  • a complex signal transduction network Seshacharyulu P., Ponnusamy MP, Haridas D., and cois.
  • the first one is the way of l mitogen-activated protein kinases (MAPKs) whose aberrant activity is related to uncontrolled cell proliferation observed in tumors (Citri A. and Yarden Y. (2006) Nat Rev Mol Cell Biol 7 (7): 505-16).
  • PI3K / Akt phosphatidylinositol 3 kinase pathway
  • Akt phosphatidylinositol 3 kinase pathway
  • phosphotidylinositol-3 kinase / serine-threonine protein kinase phosphatidylinositol 3 kinase pathway
  • Faber AC Li D., Song Y, and cois. (2009) Proc Nati Acad Sci USA 106 (46): 19503 -08.
  • the third signaling pathway is related to the c-Src adapter protein, which activates the family of transcription factor and signal transducer 3 (STAT3), the signal transducer and activator of transcription 3 ", which activates processes such as proliferation, angiogenesis and tumor-associated inflammation (Murray PJ (2007) J Immunol 178 (5): 2623-29.
  • STAT3 transcription factor and signal transducer 3
  • HER1 and HER2 receptors are involved in the progression of tumors of epithelial origin. These proteins They are expressed in the epithelial tissues of the organism. However, due to their aberrant expression in many types of tumors of epithelial origin as well as their functional relevance in the uncontrolled proliferation of malignant cells, they have been considered associated tumor antigens (Yarden Y.
  • HER1 has an increased expression in tumors of the lung, breast, head and neck, colon, pancreas (Brand TM, lida M. and Wheeler DL (201 1) Cancer Biol Ther 1 1 (9): 777-92.), Prostate ( Seth D., Shaw K., Jazayeri J. and cois (1999) Br J Cancer 80 (5-6): 657-69.), Bladder (Neal DE and Mellon K. (1992) Urol Int 48 (4): 365-71), ovary (Gullick WJ, Marsden JJ, Whittle N. et al.
  • HER2 is found in high levels in breast, gastric, lung, ovarian tumors, and in prostate tumors (Tai W., Mahato R. and Cheng K. (2010) J Control Relay 146 (3): 264 -75) and this overexpression in breast tumors has been correlated with a decrease in total patient survival.
  • HER1 and HER2 have been proven in other locations, for example: brain, ovarian, head and neck, lung and prostate cancer (Di Lorenzo G., Tortora G., D'Armiento FP, and cois. ( 2002) Clin Cancer Res 8 (1 1): 3438-44 and Emanuel SL, Hughes TV, Adams M., and cois. (2008) Mol Pharmacol 73 (2): 338-48).
  • This coexpression has been related to a poor prognosis of the disease and a tumor phenotype characterized by the strong survival signals transmitted by the heterodimer HER1 -HER2 (Zhou Y. and Brattain MG (2005) Cancer Res 65 (13): 5848- 56).
  • HER1 and HER2 are not necessarily accompanied by the increased expression of one of these receptors.
  • overexpression of a family receptor tilts the balance towards the formation of homodimers of said receptor, rather than heterodimers with the receptor that is co-expressed.
  • a low or intermediate expression of these receptors co-expressed in tumor cells leads to a greater formation of heterodimers, and the cells with these characteristics are more dependent on them to activate the cellular signaling cascades MAPK, STAT3 and PI3K / AKT (Fichter CD, Timme S., Braun JA, (2014) Int J Cancer.Oct 1; 135 (7): 1517-30).
  • HER1 and / or HER2 thyrocin kinase activity (ITC) inhibitor drugs are low molecular weight drugs analogous to adenosine triphosphate (ATP) widely tested in the clinic. Although these drugs have shown promising results, their high toxicity has limited chronic use.
  • the ITC gefitinib (Iressa), erlotinib (Tarceva) and afatinib (Gilotrif) selectively inhibit HER1 by blocking the ATP binding site located in the intracellular domain (Tortora G., Gelardi T., Ciardiello F. (2007) Int J Biol Markers Jan-Mar; 22 (1 Suppl 4): S47-52).
  • Such inhibitors have been approved for the treatment of patients with non-small cell lung carcinomas that express the HER1 receptor in a mutated form (L858R mutation in exon 21 of the erbb oncogene) with an increased sensitivity to this type of drugs (Schneider MR and Yarden Y. (2016) Oncogene 35 (23): 2949-60).
  • This anti-HER1 AcM has been approved for the treatment of metastatic colon cancer with detectable expression of HER1, without RAS activating mutations, and for the treatment of squamous cell carcinomas of the head and neck, after chemotherapy or combined with radio or chemotherapy (Seshacharyulu P., Ponnusamy MP, Haridas D., and cois. (2012) Expert Opin Ther Ther Targets 16 (1): 15-31).
  • panitumumab (ABX-EGF, Vectibix), which is a human lgG2 that recognizes DEC-HER1 with more affinity than cetuximab (Seshacharyulu P., Ponnusamy MP, Haridas D., and cois. (2012) Expert Opin Ther Ther Targets 16 (1): 15-31).
  • the humanized Acim nimotuzumab (hR3, TheraCIM®), lgG1, recognizes subdomain III of DEC-HER1 (Matthew C, Moreno E., Amour K. et al.
  • trastuzumab Herceptin
  • HER2 DEC subdomain IV The ACM trastuzumab
  • HER2 DEC subdomain IV the ACM trastuzumab
  • this AcM has been covalently conjugated to a chemotherapeutic drug to enhance its antitumor effect, which has resulted in a new therapy, called trastuzumab-DM1 (Kadcyla), recently approved for the treatment of patients with metastatic breast carcinoma, refractory to treatment with trastuzumab and chemotherapy (Slamon DJ, Leyland-Jones B., Shak S., and cois.
  • bivalent vaccine compositions which comprise as an active principle the extracellular domains of the HER1 and HER2 receptors and very small proteoliposomes formed by Neisser ⁇ a meningitidis outer membrane proteins and the GM3 ganglioside as adjuvant.
  • said vaccine compositions have an effect on carcinomas of epithelial origin that coexpress HER1 and HER2 receptors without increased expression thereof or in those with RAS activating mutations and said effect is superior to that observed for the AcM against HER1 and HER2 registered in the cynical.
  • the present invention is based on a method to determine if a patient diagnosed with carcinoma of epithelial origin is likely to respond to treatment with an inhibitor of the RFCE family where this method comprises a step of determining in a sample taken from said patient the presence of at least one of the biomarkers selected from the group comprising: coexpression of the HER1 and HER2 receptors and their levels of expression or the existence of activating mutations in RAS.
  • this method comprises a step of determining in a sample taken from said patient the presence of at least one of the biomarkers selected from the group comprising: coexpression of the HER1 and HER2 receptors and their levels of expression or the existence of activating mutations in RAS.
  • the object of the present invention is also a method for treating a patient with carcinoma of epithelial origin which comprises determining if a patient with the previous diagnosis is likely to respond to treatment with an inhibitor of the RFCE family and administer to this patient an amount therapeutically effective of said inhibitor.
  • the inhibitor of the RFCE family is the BV that has as active principle the complete extracellular domains of the HER1 and HER2 receptors or portions thereof and as an adjuvant proteoliposomes of very small stature formed by Neisser ⁇ a meningitidis outer membrane proteins and the GM3 ganglioside.
  • Said vaccine is used in a dose range of the extracellular domains of HER1 and HER2 or portions thereof which is between 40C ⁇ g to 1600 ⁇ g; this concentration being the sum of both molecules and is administered subcutaneously, intradermally or intramuscularly with a weekly frequency the first five doses and subsequently monthly doses for at least six months. After these administrations the responding patients show a complete or partial response after 9 doses of the administration of BV.
  • the method of treatment object of the present invention is used in squamous epithelial cell cancer, small cell lung, non-small cell lung, lung adenocarcinoma, squamous lung carcinoma, hepatocellular, gastric, gastrointestinal cancer, pancreas, gliobastoma, cervical, ovary, liver, bladder, breast, colon, rectum, colorectal cancer, head and neck, uterus, salivary gland carcinoma, kidney, prostate, vulva, thyroid, anal carcinoma, penile carcinoma.
  • compositions used in the present invention comprise as an active ingredient the extracellular domains of the HER1 receptors and HER2 or portions thereof.
  • As an adjuvant it has very small size proteoliposomes formed by proteins of the outer membrane of Neisseria meningitidis and the GM3 ganglioside (VSSP-GM3).
  • the vaccine compositions employed in the present invention may additionally comprise another pharmaceutically suitable adjuvant.
  • adjuvants can be without limitation, an oily adjuvant such as highly purified mineral oil and a mineral adjuvant such as alumina.
  • the vaccine compositions used herein contain suitable excipients that include, for example: water, saline and the like. Methods of identification and / or selection of tumors for the application of the VB HER1 + HER2 compositions.
  • Sources for obtaining tumor samples include but are not limited to tumor biopsies, circulating tumor cells, circulating plasma proteins, ascites fluid and circulating DNA.
  • a tumor cell with increased expression of HER receptors is one that has higher levels of this molecule compared to a non-tumor cell of the same cell type.
  • the increased expression of the HER receptors can be determined by a diagnostic or prognostic assay by evaluating the increased levels of the cell surface receptor for example using IHC, immunofluorescence or polymerase chain reaction.
  • a tumor cell that does not have increased expression of HER receptors is one that has higher levels than normal for proteins or genes of HER receptors compared to a non-tumor cell of the same cell type but does not reach considerable levels of said increased expression.
  • Tissues embedded in paraffin can be classified by the intensity of the IHC tide as follows: Negative or Score 0. No staining by IHC is observed or staining is in less than 10% of tumor cells.
  • Negative / Weak or Score 1 + Tenuous staining is observed in more than 10% of tumor cells, but only in part of their membranes.
  • Weak / Moderate or Score 2+ Staining of weak to moderate is observed in more than 10% of tumor cells, homogeneously on the membrane
  • Tumors with a score of 0 for HER1 and / or HER2 can be characterized as having no detectable expression of these receptors.
  • Tumors with a score between 1 + and 2+ for HER1 and / or HER2 can be characterized as having no increased expression of these receptors.
  • Tumors with a 3+ score for HER1 and / or HER2 can be characterized as having increased expression of these receptors.
  • Routine techniques known from the state of the art can be used to determine RAS mutations. An example of this is to obtain a sample of the patient's tumor and extract the nucleic acids from the sample that are amplified and sequenced.
  • Another method is related to obtaining a serum or plasma sample from the patient where circulating tumor cells are found with the RAS oncogene and its mutation is detected using microarrays or polymerase chain reaction.
  • a positive result of RAS mutation in the plasma or serum suggests a RAS mutation in the tumor while the absence of RAS mutation in said plasma or serum does not necessarily prove the absence of a similar mutation in the tumor tissue.
  • the expression of mutated RAS can be checked by determining the mutated polypeptides in the tumor sample by antibodies that bind specific epitopes on said RAS mutant polypeptides. (Steven MA, Diagn. 201 1; 1 1 (6): 635-642).
  • the present invention relates to a method of stratification of a subject diagnosed with cancer, specifically with carcinoma of epithelial origin, in responders or non-responders to treatment with the VB compositions of HER1 + HER2.
  • the expression levels of the HER1 and HER2 receptors or the presence of RAS activating mutations indicates that the subject will be responsive to the treatment with the VB HER1 + HER2 compositions. It can also be predicted that the patient will respond to the treatment with the above-mentioned vaccine compositions if the presence of activating mutations in RAS is checked in the sample.
  • the present invention relates to a method of treating subjects with carcinoma of epithelial origin, previously classified as responders by the method described above and comprising administering to said patients inhibitors of the RFCE family.
  • these inhibitors consist of VB compositions composed of the extracellular domains of the HER1 and HER2 receptors or portions thereof.
  • subject refers to a human patient.
  • responder in the context of the method provided in the present invention means that the patient or the tumor shows a complete or partial response after administration of the VB compositions defined herein, according to the Response Evaluation Criteria. in Solid Tumors (from RECIST).
  • non-respondent refers to those patients who show a stable or progressive disease after the administration of said vaccine compositions.
  • RECIST is described in: New response evaluation criteria in solid tumors: revised RECIST guideline (version 1 .1). Eur. J. Cancer. 45, Nr. 2, 2009, 228-47.
  • the term "therapeutic effect” generally refers to the desirable or beneficial impact of the treatment such as an improvement or remission in the manifestations of the disease.
  • the term “manifestation” of the disease is used to describe its perceptible expression and includes both the clinical manifestations that can be detected during a medical examination and / or that are perceptible by the patient (symptoms) and the pathological manifestations that are the meaning of the expression of the disease at the cellular and molecular level.
  • the method of treatment of the present invention comprises a step of administering an effective amount of VB compositions based on the combination of the HER1 and HER2 receptors to a patient.
  • the term "effective amount" refers to an amount of the vaccine composition effective to treat cancer in the patient.
  • the effective amount of the vaccine composition can reduce the number of cancer cells, reduce the size of the tumor; inhibit (either by reducing to a certain extent or preferably by stopping) the infiltration of cancer cells in the peripheral organs, tumor metastases, tumor growth and / or alleviate the symptoms associated with cancer.
  • types of cancer that can be treated with the method object of the present invention are carcinomas of epithelial origin.
  • examples of these cancers include squamous epithelial cell cancer, lung cancer including small cell cancer, non-small cell cancer, lung adenocarcinoma and squamous lung carcinoma, hepatocellular cancer, gastric cancer including gastrointestinal cancer. , pancreatic cancer, head and neck gliobastoma, cervical, ovarian cancer, liver, bladder, breast, colon, rectum, colorectal cancer, uterus, salivary gland carcinoma, kidney, prostate, vulva, thyroid, anal carcinoma and penile carcinoma .
  • the VB HER1 + HER2 compositions can be administered by any known route, such as: subcutaneous, intradermal, intramuscular. Preferably subcutaneously.
  • the dose range of the extracellular domains of HER1 + HER2 or portions thereof to be used in patients who are eligible as responders for treatment with the vaccine compositions of the present invention is between 40C ⁇ g to 1600 ⁇ g, preferably 800 ⁇ g to 1600 ⁇ g ; this concentration being the sum of both molecules.
  • Said compositions are administered in subjects with a biweekly frequency for at least a total of five induction doses and subsequently monthly maintenance doses for at least six months.
  • FIGURES Figure 1 Recognition by flow cytometry of tumor lines with different levels of HER1 and HER2 expression: A431, MDAMB468, H125, H292, PC3, SKBR3, MCF7 / HER2, SKOV3, A549 and Raji, by polyclonal antibodies (AcPs) generated by the HB of HER1 + HER2.
  • AcPs polyclonal antibodies
  • Figure 2 Effect caused by HBV-induced AcPs of HER1 + HER2 on cell viability: A) Flow cytometry to assess the recognition of the lines tested by the trastuzumab and nimotuzumab AcMs. B) Inhibition of cell viability in lines A431, H125, H292, SKOV3, SKBR3 with differential expression of HER1 and HER2 measured by the MTT colorimetric method. C) Bar chart Comparison of the effect of the sera on cell viability in the different lines tested.
  • Figure 3 Inhibition of the activation of the HER1 and HER2 receptors and signaling cascade proteins, measured by Western Blot in the H292 tumor line and caused by the immune serum AcPs induced by the VB HER1 + HER2.
  • Pl Pre-immune serum
  • ITC tyrosine kinase inhibitor.
  • Figure 4 Effect of AcPs induced by the VB HER1 + HER2 on the degradation of the HER1 and HER2 receptors in the H292 tumor line measured by Western Blot.
  • Figure 6 Comparison of the ability of the HER1 + HER2 VB AcPs with the nimotuzumab, cetuximab and trastuzumab AcMs to inhibit the activation of the HER1 and HER2 receptors in the H125 and H292 tumor lines by Western Blot.
  • Figure 7. Comparison of the ability of AcPs with the nMotuzumab, cetuximab and trastuzumab AcMs to degrade HER1 and HER2 receptors in the H292 tumor line by ELISA. A) Degradation of HER1 after 24h of treatment. B) Degradation of HER2 after 1 h of treatment.
  • Figure 8 Comparison of the effect induced by the VB HER1 + HER2 AcPs on the viability of the A549 lung carcinoma line bearing the KRAS mutation, with the effect of the nMotuzumab, cetuximab, trastuzumab, and the combination between them.
  • mice immunized with HBV HER1 + HER2, diluted 1: 200 were incubated for 20 min with 10 5 tumor cell lines that co-express the HER1 and HER2 receptors. Lines that have no increased expression of any of these receptors were used: H125, derived from lung carcinoma; H292, derived from lung carcinoma; PC3, derived from prostate carcinoma.
  • lines with increased expression of HER1: A431, derived from vulvar epithelial carcinoma were used; MDAMB468, derived from breast carcinoma and lines with increased expression of HER2: SKBR3, derived from breast carcinoma; MCF7 / HER2 derived from breast carcinoma transfected with HER2; SKOV3, derived from ovarian carcinoma.
  • a carrier line of an RAS activating mutation was also used.
  • the Raji line derived from Burkitt lymphoma, was used as a negative control of receptor expression.
  • Preimmune sera were used as negative controls for specificity, and nimotuzumab AcM, specific for HER1 and AcM trastuzumab, specific for HER2, were used as positive controls.
  • the recognition was evaluated by flow cytometry. In Figure 1 it can be seen that the sera generated by the VB recognized all the cell lines evaluated, and the highest intensity of recognition (corresponding to the highest average fluorescence intensity (MFI)), was appreciated for the lines with increased expression of some of the receivers.
  • MFI average fluorescence intensity
  • Example 2 Immune serum AcPs induced by BV HER1 + HER2 inhibit the viability of tumor lines with differential expression of HER1 and HER2, and the effect is more marked in lines that do not exhibit increased expression of these receptors.
  • Example 3 Immune serum AcPs induced by BV HER1 + HER2 inhibit the activation of HER1 and HER2 receptors and signaling cascade proteins. Serums from mice immunized with BV, diluted 1: 100, were incubated with H292 tumor line cells that co-express the HER1 and HER2 receptors but have no increased expression of any of these receptors, for 30 min, 8 h and 24 h . Cells were stimulated with 100 ng / mL of EGF for 10 min to induce activation of HER1 and HER2 receptors that were forming heterodimers with HER1. Subsequently the treated cells were lysed.
  • untreated cells were used as negative phosphorylation control and EGF treated cells as positive control.
  • the tyrosine kinase inhibitor AG1478 at 10 ⁇ was used and as a negative control of specificity of the immune serum, pre-immune serum was used.
  • Figure 3 shows that sera containing the VB-generated AcPs inhibited the activation of the HER1 and HER2 receptors, measured in terms of phosphorylation, from as early as 30 min, inhibition that increased markedly with increases in treatment times up to 8h and 24h.
  • AcPs markedly inhibited the phosphorylation of Akt and STAT3 proteins, which are key proteins in signal transduction as apoptosis inhibitors and inflammation inducers, at 8h of treatment.
  • the total inhibition of Erk1 / Erk2 proteins from the MAPK pathway, inducers of cell proliferation was observed.
  • Example 4 Immune serum AcPs induced by BV HER1 + HER2 cause degradation of the HER1 and HER2 receptors.
  • H292 tumor line cells were incubated with mixtures of immune sera (diluted 1: 100) induced by HBV HER1 + HER2 for 30 min, 1, 8 or 24 h.
  • Pre-immune serum was included as a negative control in this assay.
  • the expression levels of both receptors at different times were determined by Western blotting.
  • Figure 4 shows that the total expression levels of the HER1 and HER2 receptors decreased with the increase in incubation time with the immune serum, with respect to the cells treated with the pre-immune serum. At 24 hours a total degradation of both receptors was evident.
  • Example 5 Comparison of the ability of immune serum AcPs with nimotuzumab, trastuzumab and their combinations to inhibit the viability of tumor lines with low expression of HER1 and HER2 receptors.
  • H292 tumor line cells were incubated with mixtures of immune sera (diluted 1: 100) induced by HBV HER1 + HER2 for 96 h. Cell viability was determined by the MTT method. Pre-immune serum was included as a negative control in this assay. Mitomycin C was included as a positive cytotoxicity control. The effect of immune sera was compared with that induced by the Acim nimotuzumab, the AcM trastuzumab, and the mixture of both antibodies. Figure 5 shows that the immune sera of the VB HER1 + HER2 had a much greater effect on the viability of the tumor cells than the mAbs and their combination.
  • Example 6 Comparison of the ability of immune serum AcPs with nimotuzumab, cetuximab and trastuzumab AcMs to inhibit the activation of HER1 and HER2 receptors.
  • Sera from mice immunized with HBV HER1 + HER2, diluted 1: 100 were incubated for 1 h, with cells of the H125 and H292 tumor lines that coexpress the HER1 and HER2 receptors but have no increased expression of any of these receptors.
  • This treatment was compared with the nimotuzumab and cetuximab mAbs, specific for HER1 and with the trastuzumab mAbs, specific for HER2.
  • Cells were stimulated with 100 ng / mL of EGF for 10 min to induce activation of HER1 and HER2 receptors that were forming heterodimers with HER1. Subsequently the treated cells were lysed. Inhibition of receptor activation was measured by Western Blot. As positive phosphorylation control, cells treated with EGF were used. As a positive inhibition control, the tyrosine kinase inhibitor AG1478 was used and as a negative control of specificity of the immune serum, pre-immune serum was used.
  • Figure 6 shows that the immune sera of BV after 1 h of treatment had inhibited more activation of HER1, measured in terms of phosphorylation, than the mAbs nimotuzumab and cetuximab. They also inhibited the activation of HER2 more than the ACM trastuzumab.
  • Example 7 Comparison of the capacity of the AcPs generated by the VB HER1 + HER2 with the AcMs nimotuzumab, cetuximab and tratuzumab to degrade the HER1 and HER2 receptors.
  • This treatment was compared with the nimotuzumab and cetuximab mAbs, specific for HER1, at the concentration of K ⁇ g / mL by incubating the cells for 24 hours, and with the trastuzumab mAb, specific for HER2, at a concentration of g / mL at a time 1 h incubation It was also compared with the combined treatment of nimotuzumab and trastuzumab MMA, and the combined treatment of cetuximab and trastuzumab MMA.
  • nimtozumab and cetuximab were 1 C ⁇ g / ml_ and that of trastuzumab was ⁇ g / mL.
  • Pre-immune serum was used as a negative control of specificity of the VB AcPs.
  • the cells were stimulated with 100 ng / mL of EGF for 10 minutes to induce the activation of HER1 and HER2 receptors that were forming heterodimers with HER1. Subsequently the treated cells were lysed.
  • the degraded receptors were detected by the ELISA technique, using a set of reagents, Quantikine ELISA Human EGFR / Erb B1 Immunoassay to determine the degradation of HER1 and the DuoSet ELISA DEVELOPMENT SYSTEM Human Erb B2 / Her2 for the degradation of HER2.
  • Figure 7 A shows that the HV1 + HER2 VB AcPs after 24 hours of treatment had degraded more HER1 than the nimotuzumab, cetuximab, and tratuzumab, alone and in combination.
  • Figure 7B shows that the HV1 + HER2 HBV AcPs, after 1 h of treatment, degraded more HER2 than the trastuzumab, nimotuzumab, cetuximab and their combinations.
  • Example 8 Comparison of the effect induced by the VB HER1 + HER2 AcPs on the viability of the A549 lung carcinoma line bearing the KRAS mutation, with the effect of the nMotuzumab, cetuximab, trastuzumab AcMs, and the combination between them.
  • Example 9 Comparison of the effect induced by the AcPs of the VB HER1 + HER2 on the degradation of HER1 and HER2, with the effect of the AcMs nimotuzumab, cetuximab, trastuzumab, and the combination between them.
  • This treatment was compared with the nimotuzumab and cetuximab AcM, at the concentration of " ⁇ g / mL, and with the trastuzumab AcM, at a concentration of ⁇ g / mL. It was also compared with the combined treatment of the nimotuzumab and trastuzumab AcM, and the combined treatment of Cetuximab and trastuzumab AcM. In both combinations, the concentration of nimtozumab and cetuximab was " ⁇ g / mL and that of trastuzumab was ⁇ g / mL.

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Abstract

La presente invención se relaciona con la rama de la Biotecnología y la Medicina, particularmente con un método para seleccionar y tratar pacientes con carcinomas de origen epitelial que co-expresen los receptores HER1 y HER2 sin expresión incrementada de los mismos o con presencia de mutaciones activadoras en RAS. En particular este método se basa en la aplicación de composiciones vacunales bivalentes que tienen como principio activo los dominios extracelulares de los receptores HER1 y HER2 o porciones de estos y como adyuvante proteoliposomas de muy pequeña talla formados por proteínas de la membrana externa de Neisseria meningitidis y el gangliósido GM3. Este método es útil en aquellos pacientes en que los niveles de expresión de HER1 y HER2 no permiten que los anticuerpos monoclonales contra HER1 y/o HER2 tengan un efecto terapéutico.

Description

MÉTODO PARA EL TRATAMIENTO DE PACIENTES CON CARCINOMAS DE
ORIGEN EPITELIAL
CAMPO DE LA TÉCNICA
La presente invención se relaciona con la rama de la Biotecnología y la Medicina. En particular se proporcionan métodos para mejorar el tratamiento de cierto subgrupo de pacientes con carcinomas de origen epitelial, más particularmente aquellos pacientes que no son candidatos a recibir terapia con anticuerpos monoclonales contra HER-1 o HER-2. En una realización particular la invención brinda un método de tratamiento donde los pacientes elegidos son tratados con composiciones vacunales bivalentes HER1 +HER2.
ANTECEDENTES
Los receptores de la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico (RFCE), con actividad tirosina cinasa, están involucrados en el crecimiento, la diferenciación, la motilidad y la sobrevida celular (Schneider M.R. y Yarden Y. (2016) Oncogene 35(23): 2949-60). Esta familia consta de cuatro miembros: el prototipo es el RFCE (HER1 /ErbB1 ) que fue el primer receptor con actividad tirosina cinasa clonado (Ullrich A., Coussens L., Hayflick J.S. y cois. (1984) Nature 309(5967): 418-25), el HER2/Neu/ErbB2 (Coussens L., Yang-Feng T.L., Liao Y.C. y cois. (1985) Science 230(4730): 1 132-39), el HER3/ErbB3 y el HER4/ErbB4. La estructura característica de estos receptores consiste en un dominio extracelular N-terminal de unión al ligando que contiene el brazo de dimerizacion, una región transmembrana hidrofobica y una región citoplasmática C-terminal que presenta actividad tirosina cinasa, además de varios residuos de autofosforilación. Frecuentemente, se encuentran co-expresados en varias combinaciones, y en dependencia del ligando activador pueden formar homodímeros o heterodímeros, generando una compleja red de transducción de señales (Seshacharyulu P., Ponnusamy M.P., Haridas D., y cois. (2012) Expert Opin Ther Targets 16(1 ): 15-31 . En este sentido, se ha informado que las combinaciones heterodiméricas constituyen los complejos de señalización más potentes y se caracterizan por su control directo sobre el ciclo celular (Pinkas-Kramarski R., Soussan L, Waterman H. y cois. (1996) EMBO J 15(10): 2452-67.
Los residuos de fosfotirosina generados en la activación de receptores HER/ErbB, recluían proteínas adaptadoras que inician múltiples vías de señalización intracelular, estrechamente relacionadas entre sí, lo cual determina la gran complejidad de la red de señales transmitidas a través de HER1 y HER2. La primera de ellas, es la vía de l las proteínas cinasas activadas por mitógenos (MAPKs, del inglés, "mitogen-activated protein kinases") cuya actividad aberrante está relacionada con la proliferación celular incontrolada observada en tumores (Citri A. y Yarden Y. (2006) Nat Rev Mol Cell Biol 7(7): 505-16). Otra de las cascadas es la vía de la fosfatidilinositol 3 cinasa (PI3K/Akt, del inglés, "phosphotidylinositol-3 kinase/serine-threonine protein kinase"), cuya activación conduce a un incremento de señales anti-apoptóticas mediadas por NF-κΒ y señales de división celular, y por tanto está directamente relacionada con la evasión de la apoptosis por las células tumorales (Faber A.C., Li D., Song Y, y cois. (2009) Proc Nati Acad Sci U S A 106(46): 19503-08. La tercera vía de señalización, está relacionada con la proteína adaptadora c-Src, que activa la familia del factor de transcripción y transductor de señales 3 (STAT3 , del inglés: "signal transducer and activator of transcription 3"), la cual activa procesos como la proliferación, la angiogénesis y la inflamación asociada a tumores (Murray P.J. (2007) J Immunol 178(5): 2623-29. Los receptores HER1 y HER2 están implicados en la progresión de tumores de origen epitelial. Estas proteínas se encuentran expresadas en los tejidos epiteliales del organismo. Sin embargo, debido a su expresión aberrante en muchos tipos de tumores de origen epitelial así como su relevancia funcional en la proliferación descontrolada de las células malignas, han sido considerados antígenos tumor asociados (Yarden Y. y Sliwkowski M.X. (2001 ) Nat Rev Mol Cell Bio 2, 127-137 (127-37) y (Ross J.S., Slodkowska E.A., Symmans W.F. y cois (2009) Oncologist 14(4): 320-68).
HER1 tiene una expresión incrementada en tumores de pulmón, mama, cabeza y cuello, colon, páncreas (Brand T.M., lida M. y Wheeler D.L. (201 1 ) Cáncer Biol Ther 1 1 (9): 777-92.), próstata (Seth D., Shaw K., Jazayeri J. y cois (1999) Br J Cáncer 80(5- 6): 657-69.), vejiga (Neal D.E. y Mellon K. (1992) Urol Int 48(4): 365-71 ), ovario (Gullick W.J., Marsden J.J., Whittle N. y cois. (1986) Cáncer Res 46(1 ): 285-92), esófago (Fitcher, C.D. Timme S., Braun J.A. y cois., (2014) Int. J. Cancer,135,1517-30) y glioma (Salomón D.S., Brandt R., Ciardiello F. y cois. (1995) Crit Rev Oncol Hematol 19(3): 183-32.). Cabe destacar que la frecuencia de sobreexpresión de HER1 en los carcinomas mencionados es alta y se ha asociado con un mal pronóstico de la enfermedad en tumores de cabeza y cuello y pulmón, con un alto riesgo de recurrencia de la enfermedad (Chow N.H., Liu H.S., Lee E.l. y cois. (1997) Anticancer Res 17(2B): 1293-96) y con disminución de la supervivencia en pacientes con cáncer de ovario, colon, vejiga, tiroide y cabeza y cuello (Grandis J.R., Chakraborty A., Zeng Q., y cois. (1998) J Cell Biochem 69(1 ): 55-62.). Además, altos niveles de HER1 se correlacionan con la resistencia a las terapias convencionales como la quimio y la radioterapia (Pal S.K. y Pegram M. (2005) Anticancer Drugs 16(5): 483-94).
Por su parte, HER2 se encuentra en altos niveles en tumores de mamas, gástricos, pulmón, ovario, y en tumores de próstata (Tai W., Mahato R. y Cheng K. (2010) J Control Reléase 146(3): 264-75) y esta sobreexpresion en tumores de mama se ha correlacionado con una disminución en la supervivencia total de los pacientes.
La sobreexpresion de HER2 en tumores de mama se ha correlacionado con una disminución en la supervivencia total, sin embargo, la co-expresión de HER1 y HER2 en estos tumores aumenta notablemente este riesgo, lo cual sugiere que la expresión de HER1 en estos carcinomas tiene un efecto sinérgico sobre la influencia clínica de la expresión de HER2 (Suo Z., Risberg B., Kalsson M.G. y cois. (2002) J Pathol 196(1 ): 17-25).
La co-expresión de HER1 y HER2 se ha comprobado en otras localizaciones, por ejemplo: cáncer de cerebro, ovario, cabeza y cuello, pulmón y próstata (Di Lorenzo G., Tortora G., D'Armiento F.P., y cois. (2002) Clin Cáncer Res 8(1 1 ): 3438-44 y Emanuel S.L., Hughes T.V., Adams M., y cois. (2008) Mol Pharmacol 73(2): 338-48). Esta coexpresión ha sido relacionada con un mal pronóstico de la enfermedad y con un fenotipo tumoral caracterizado por las fuertes señales de sobrevida transmitidas por el heterodímero HER1 -HER2 (Zhou Y. y Brattain M.G. (2005) Cáncer Res 65(13): 5848- 56). La cocexpresión de HER1 y HER2 no se acompaña necesariamente de la expresión incrementada de uno de estos receptores. De hecho, la sobreexpresion de un receptor de la familia inclina la balanza hacia la formación de homodímeros de dicho receptor, más que heterodímeros con el receptor que se co-expresa. Por el contrario, una expresión baja o intermedia de estos receptores co-expresados en células tumorales conduce a una mayor formación de heterodímeros, y las células con estas características son más dependientes de los mismos para activar las cascadas de señalización celular MAPK, STAT3 y PI3K/AKT (Fichter C.D., Timme S., Braun J.A., (2014) Int J Cancer.Oct 1 ;135(7):1517-30).
Unido a las sólidas evidencias clínicas que sustentan la relevancia de la expresión de HER1 y HER2 en la proliferación y supervivencia de tumores epiteliales, numerosos estudios validan el papel fundamental de ambos receptores en la regulación de otros atributos de los tumores como la inflamación y el escape tumoral, entre otros (Chen N., Fang W., Zhan J., y cois., (2015) J Thorac Oncol. 2015 Jun;10(6):910-23 y Hartman Z.C., Yang X.Y., Glass O., (201 1 ) Cáncer Res. Jul 1 ;71 (13):4380-91. Diversas terapias han sido desarrolladas para inhibir la actividad pro-tumoral de los receptores HER1 y HER2. Las drogas inhibidoras de la actividad tirocina cinasa (ITC) de HER1 y/o HER2 son drogas de bajo peso molecular análogas al trifosfato de adenosina (ATP) ampliamente ensayadas en la clínica. Aunque estas drogas han mostrado resultados prometedores, su alta toxicidad ha limitado el uso crónico. Los ITC gefitinib (Iressa), erlotinib (Tarceva) y afatinib (Gilotrif) inhiben selectivamente HER1 bloqueando el sitio de unión del ATP situado en el dominio intracelular (Tortora G., Gelardi T., Ciardiello F. (2007) Int J Biol Markers. Jan-Mar;22(1 Suppl 4):S47-52). Dichos inhibidores han sido aprobados para el tratamiento de pacientes con carcinomas de pulmón de células no pequeñas que expresan el receptor HER1 en forma mutada (mutación L858R en el exón 21 del oncogén erbb) con una sensibilidad incrementada a este tipo de drogas (Schneider M.R. y Yarden Y. (2016) Oncogene 35(23): 2949-60).
Adicionalmente, tres anticuerpos monoclonales (AcM) dirigidos contra el DEC-HER1 han sido registrados para su uso en la clínica. El AcM quimérico de isotipo lgG1 , cetuximab (ICM-C225, Erbitux) representa la terapia anti-HER1 más exitosa hasta el momento. Se une al subdominio III del DEC-HER1 con alta afinidad por el receptor (Kd = 2.3 x 10-9M) e impide la unión del ligando y la activación del receptor (Harding J. y Burtness B. (2005) Drugs Today (Barc) 41 (2): 107-27). Este AcM anti-HER1 ha sido aprobado para el tratamiento de cáncer de colon metastásico con expresión detectable de HER1 , sin mutaciones activadoras de RAS, y para el tratamiento de carcinomas escamosos de cabeza y cuello, después de la quimioterapia o combinado con radio o quimioterapia (Seshacharyulu P., Ponnusamy M.P., Haridas D., y cois. (2012) Expert Opin Ther Targets 16(1 ):15-31 ). Otro AcM anti-HER1 registrado para el tratamiento de carcinoma colorrectal metastásico sin expresión activadora de RAS, en combinación con quimioterapia es el panitumumab (ABX-EGF, Vectibix), que es una lgG2 humana que reconoce al DEC-HER1 con más afinidad que cetuximab (Seshacharyulu P., Ponnusamy M.P., Haridas D., y cois. (2012) Expert Opin Ther Targets 16(1 ):15-31 ). Por último, el AcM humanizado nimotuzumab (hR3, TheraCIM®), lgG1 , reconoce el subdominio III del DEC-HER1 (Mateo C, Moreno E., Amour K. y cois. (1997) Immunotechnology 3(1 ): 71 -81 ), con una afinidad intermedia, (Kd nimotuzumab= 2.1 x 10"8M) bloqueando la unión del ligando y por consiguiente la señalización a través de HER1 . Este AcM está registrado para su uso en pacientes con tumores avanzados de cabeza y cuello, glioma, esófago y tumores nasofaríngeos (Ramos-Suzarte M., Lorenzo-Luaces P., Lazo N.G., y cois. (2012) Cáncer Biol Ther 13(8): 600-05). Por su baja toxicidad, este anticuerpo se emplea en tratamientos crónicos (Garrido G., Tikhomirov I.A., Rabasa A., y cois. (201 1 a) Cáncer Biol Ther 1 1 (4): 373-82). Si bien todas estas terapias anti-HER1 han tenido resultados que han beneficiado a un nicho de pacientes, hay otro grupo de pacientes que queda desprotegido. Las mutaciones somáticas de RAS están entre los eventos más frecuentes de la tumorigénesis (KRAS, HRAS y NRAS), proporcionándole a las células transformadas ventajas proliferativas. La frecuencia de estas mutaciones es muy alta en tumores de páncreas, de colon, de pulmón, gástricos, y otros (Bahrami A, Hassanian S.M., ShahidSales S., y cois. (2017) J Cell Physiol. Mar 6. doi: 10.1002/jcp.25890).
AcM específicos por el DEC-HER2 se encuentran también registrados para el tratamiento de pacientes con cáncer. El AcM trastuzumab (Herceptin), específico por el subdominio IV del DEC de HER2, está indicado para el tratamiento adyuvante de pacientes con tumores de mama, gástricos y de páncreas que sobreexpresan la molécula HER2. Adicionalmente, este AcM se ha conjugado covalentemente a una droga quimioterapéutica para potenciar su efecto antitumoral, con lo cual se ha obtenido una nueva terapia, denominada trastuzumab-DM1 (Kadcyla), recientemente aprobada para el tratamiento de pacientes con carcinoma de mama metástasico, refractarios al tratamiento con trastuzumab y quimioterapia (Slamon D.J., Leyland- Jones B., Shak S., y cois. (2001 ) N Engl J Med 344(1 1 ): 783-92). Otro AcM humanizado específico por el subdominio II del DEC de HER2 es el pertuzumab (Perjeta), que está indicado para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama, en combinación con trastuzumab.
La compleja biología de los tumores habilita mecanismos de resistencia a las monoterapias contra HER1 y HER2 (Yarden Y. y Pines G. (2012) Nat Rev Cáncer 12(8): 553-63) y (Brand T.M., lida M. y Wheeler D.L. (201 1 ) Cáncer Biol Ther 1 1 (9): 777-92). La sobreexpresión de otros miembros de la familia HER/ErbB ha sido descrita entre los mecanismos de resistencia frecuentemente observados en la clínica, para estos tratamientos anti-HER1 o anti-HER2 (Grovdal L.M., Kim J., Holst M.R., y cois. (2012) Cell Signal 24(1 ): 296-301 ). Esto ha impulsado la evaluación de combinaciones dirigidas a diferentes epítopes de un mismo receptor o a más de un receptor de la familia, que han demostrado ser más eficaces en inhibir las cascadas de señalización, endocitar a los receptores y por consiguiente tienen un mayor efecto antitumoral. (Marón R., Schechter B., Mancini M., y cois. (2013) Proc Nati Acad Sci U S A. Sep 17;1 10(38):15389-94 y (Yarden Y. y Sela M. (2015) Clin Cáncer Res 21 (18): 4030-32. En la clínica se ha evaluado la combinación de los AcM trastuzumab y cetuximab, para demostrar la superioridad clínica de la combinación de estos AcM en pacientes con carcinoma pancreático refractario a gencitabina. A pesar de los resultados prometedores, la implementación de estas terapias ha producido un incremento de la toxicidad (Assenat E., Azria D., Mollevi C, y cois. (2015) Oncotarget 6(14): 12796- 808). Si bien las terapias registradas mencionadas han contribuido a aumentar la supervivencia de un grupo de pacientes de cáncer, existe aún un nicho de pacientes que no se puede favorecer con las mismas. Parte de estos son aquellos pacientes que presentan tumores con mutaciones activadoras de la proteína RAS, así como aquellos cuyos tumores co-expresan los receptores HER1 y HER2 pero no tienen una sobreexpresión o expresión incrementada de los mismos.
Si bien las terapias registradas mencionadas han contribuido a aumentar la supervivencia de un grupo de pacientes de cáncer, existe aún un nicho de pacientes que no se puede favorecer con las mismas. Parte de estos son aquellos pacientes que presentan tumores con mutaciones activadoras de la proteína RAS, así como aquellos cuyos tumores que co-expresan los receptores HER1 y HER2 pero no tienen una sobreexpresión o expresión incrementada de los mismos. En las patentes US 7,776,342 y WO 2015/014327 se reclaman composiciones vacunales bivalentes (VB) que comprenden como principio activo los dominios extracelulares de los receptores HER1 y HER2 y proteoliposomas de muy pequeña talla formados por proteínas de la membrana externa de Neissería meningitidis y el gangliósido GM3 como adyuvante. Inesperadamente, los inventores de la presente invención encontraron que dichas composiciones vacunales tienen efecto en los carcinomas de origen epitelial que coexpresan los receptores HER1 y HER2 sin expresión incrementada de los mismos o en aquellos con mutaciones activadoras en RAS y dicho efecto es superior al observado para los AcM contra HER1 y HER2 registrados en la cínica.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
En una realización la presente invención se basa en un método para determinar si un paciente diagnosticado con carcinoma de origen epitelial es probable que responda al tratamiento con un inhibidor de la familia del RFCE donde este método comprende un paso de determinar en una muestra tomada de dicho paciente la presencia de al menos uno de los biomarcadores seleccionados del grupo que comprende: coexpresión de los receptores HER1 y HER2 y sus niveles de expresión o la existencia de mutaciones activadoras en RAS. En una realización particular se concluye que el paciente será respondedor al tratamiento si tiene co-expresión de los receptores HER1 y HER2 sin expresión incrementada de los mismos o presenta mutaciones activadoras en RAS.
Más particularmente se considerarán respondedores aquellos pacientes donde el nivel de expresión de HER1 y HER2 en la muestra del paciente tenga una puntuación de 1 + o 2+ medido por inmuno istoquímica (IHC).
Es también objeto de la presente invención un método para tratar a un paciente con carcinoma de origen epitelial que comprende determinar si un paciente con el diagnóstico anterior es probable que responda al tratamiento con un inhibidor de la familia del RFCE y administrar a este paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de dicho inhibidor.
Particularmente, el inhibidor de la familia del RFCE es la VB que tiene como principio activo los dominios extracelulares completos de los receptores HER1 y HER2 o porciones de estos y como adyuvante proteoliposomas de muy pequeña talla formados por proteínas de la membrana externa de Neissería meningitidis y el gangliósido GM3. Dicha vacuna se emplea en un rango de dosis de los dominios extracelulares de HER1 y HER2 o porciones de estos que está entre 40C^g a 1600 μg; siendo esta concentración la suma de ambas moléculas y se administra por vía subcutánea, intradérmica o intramuscular con una frecuencia semanal las primeras cinco dosis y posteriormente dosis mensuales por al menos seis meses. Después de estas administraciones los pacientes respondedores muestran una respuesta completa o parcial tras 9 dosis de la administración de la VB.
En particular, el método de tratamiento objeto de la presente invención se usa en el cáncer de células epiteliales escamosas, pulmón de células pequeñas, pulmón de células no-pequeñas, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma escamoso de pulmón, cáncer hepatocelular, gástrico, gastrointestinal, páncreas, gliobastoma, cervical, ovario, hígado, vejiga, mama, colon, recto, cáncer colorectal, cabeza y cuello, útero, carcinoma de glándulas salivales, riñon, próstata, vulva, tiroides, carcinoma anal, carcinoma del pene. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Composiciones farmacéuticas
Las composiciones farmacéuticas que se emplean en la presente invención comprenden como principio activo los dominios extracelulares de los receptores HER1 y HER2 o porciones de estos. Como adyuvante tiene proteoliposomas de muy pequeña talla formados por proteínas de la membrana externa de Neisseria meningitidis y el gangliósido GM3 (VSSP-GM3).
En una modalidad particular las composiciones vacunales empleadas en la presente invención pueden comprender adicionalmente otro adyuvante farmacéuticamente adecuado. Estos adyuvantes pueden ser sin limitarse, a un adyuvante oleoso tal como aceite mineral altamente purificado y un adyuvante mineral tal como Alúmina.
Adicionalmente las composiciones vacunales que aquí se emplean contienen excipientes adecuados que incluyen por ejemplo: agua, solución salina y similares. Métodos de identificación y/o selección de los tumores para la aplicación de las composiciones VB HER1+HER2.
Para la selección de los tumores en los cuales las composiciones VB HER1 +HER2 tendrán un efecto terapéutico se determina el nivel de expresión de los receptores HER o la presencia de mutaciones RAS en las muestras. Las fuentes para la obtención de muestras de tumores incluyen pero no se limitan a biopsias de tumores, células tumorales circulantes, proteínas plasmáticas circulantes, líquido ascítico y DNA circulante.
Una célula tumoral con expresión incrementada de los receptores HER es aquella que tiene niveles superiores de esta molécula en comparación a una célula no tumoral del mismo tipo celular. La expresión incrementada de los receptores HER se puede determinar mediante un ensayo diagnóstico o pronóstico evaluando los niveles incrementados del receptor en la superficie celular por ejemplo utilizando IHC, inmunofluorescencia o reacción en cadena de la polimerasa.
Por el contrario, una célula tumoral que no tenga expresión incrementada de los receptores HER, es una que tiene niveles más altos de los normales para las proteínas o genes de los receptores HER comparados con una célula no tumoral del mismo tipo celular pero que no alcanza niveles considerables de dicha expresión incrementada.
Para determinar los niveles de expresión de los receptores HER1 y HER2 en las muestras de tejidos tumorales, hay disponibles diversos sistemas diagnóstico/pronóstico ejemplo de ellos técnicas de IHC como HERCEPTEST-Dako y EGFR pharmDxTM-Dako. Tejidos embebidos en parafina pueden ser clasificados por la intensidad del mareaje por IHC como sigue: Negativo o Puntuación 0. No se observa tinción por IHC o la tinción es en menos del 10% de las células tumorales.
Negativo/Débil o Puntuación 1 +. Se observa tinción tenue en más del 10% de las células tumorales, pero solo en parte de sus membranas. Débil/Moderada o Puntuación 2+: Se observa tinción de débil a moderada en más del 10% de las células tumorales, de forma homogénea en la membrana
Intensa o Puntuación 3+: Se observa tinción de moderada a fuerte en más del 10% de las células tumorales, de forma homogénea en la membrana
Los tumores con puntuación 0 para HER1 y/o HER2 pueden ser caracterizados como que no presentan expresión detectable de estos receptores. Los tumores con puntuación entre 1 + y 2+ para HER1 y/o HER2 pueden ser caracterizados como que no presentan expresión incrementada de estos receptores. Los tumores con puntuación 3+ para HER1 y/o HER2 pueden ser caracterizados como que presentan expresión incrementada de estos receptores. Para determinar las mutaciones en RAS se pueden utilizar las técnicas rutinarias conocidas del estado del arte. Un ejemplo de ello es obtener una muestra del tumor del paciente y extraer los ácidos nucleicos de la muestra que se amplifican y secuencian. Otro método se relaciona con la obtención de una muestra de suero o plasma del paciente donde se encuentran las células tumorales circulantes con el oncogen RAS y su mutación se detecta usando microarreglos o reacción en cadena de la polimerasa. En este sentido, un resultado positivo de mutación de RAS en el plasma o suero sugiere una mutación de RAS en el tumor mientras que la ausencia de mutación de RAS en dicho plasma o suero no necesariamente prueba la ausencia de una mutación similar en el tejido tumoral. Adicionalmente o alternativamente, la expresión de RAS mutado se puede comprobar determinando los polipéptidos mutados en la muestra de tumor mediante anticuerpos que se unan a epítopes específicos en dichos polipéptidos mutantes de RAS. (Steven MA, Diagn. 201 1 ; 1 1 (6): 635-642).
Métodos de tratamiento
En un primer aspecto, la presente invención se relaciona con un método de estratificación de un sujeto diagnosticado con cáncer, específicamente con carcinoma de origen epitelial, en respondedores o no respondedores al tratamiento con las composiciones VB de HER1 +HER2. De acuerdo a dicho método, se determina en el paciente los niveles de expresión de los receptores HER1 y HER2 o la presencia de mutaciones activadoras de RAS. La co-expresión de los receptores HER1 y HER2 sin expresión incrementada de los mismos indica que el sujeto será respondedor al tratamiento con las composiciones VB HER1 +HER2. También se podrá predecir que el paciente será respondedor al tratamiento con las composiciones vacunales antes mencionadas si en la muestra se comprueba la presencia de mutaciones activadoras en RAS.
En una realización particular, la presente invención se relaciona con un método de tratamiento de sujetos con carcinoma de origen epitelial, previamente clasificados como respondedores por el método anteriormente descrito y que comprende administrar a dichos pacientes inhibidores de la familia del RFCE. Específicamente, estos inhibidores consisten en composiciones VB compuestas por los dominios extracelulares de los receptores HER1 y HER2 o porciones de estos. El término "sujeto" se refiere a un paciente humano.
El término "respondedor" en el contexto del método proporcionado en la presente invención significa que el paciente o el tumor muestran una respuesta completa o parcial después de la administración de las composiciones VB que aquí se definen, de acuerdo a los Criterios de Evaluación de Respuesta en Tumores Sólidos (del inglés RECIST). El término no respondedor de acuerdo a la presente invención se refiere a aquellos pacientes que muestran una enfermedad estable o progresiva después de la administración de dichas composiciones vacunales. RECIST se describe en: New response evaluation criteria in solid tumours: revised RECIST guideline (versión 1 .1 ). Eur. J. Cáncer. 45, Nr. 2, 2009, 228-47.
En el contexto de la presente invención el término "efecto terapéutico" en general se refiere al impacto deseable o beneficioso del tratamiento como por ejemplo una mejoría o remisión en las manifestaciones de la enfermedad. El término "manifestación" de la enfermedad es usado para describir su expresión perceptible e incluye tanto las manifestaciones clínicas que pueden ser detectadas durante un examen médico y/o que son perceptibles por el paciente (síntomas) y las manifestaciones patológicas que son el significado de la expresión de la enfermedad a nivel celular y molecular.
El método de tratamiento de la presente invención comprende un paso de administración de una cantidad efectiva de composiciones VB basadas en la combinación de los receptores HER1 y HER2 a un paciente. El término cantidad efectiva se refiere a una cantidad de la composición vacunal efectiva para tratar el cáncer en el paciente. La cantidad efectiva de la composición vacunal puede reducir el número de células cancerosas, reducir el tamaño del tumor; inhibir (ya sea reduciendo hasta cierto punto o preferiblemente deteniendo) la infiltración de células cancerosas en los órganos periféricos, las metástasis tumorales, el crecimiento tumoral y/o aliviar los síntomas asociados al cáncer. Entre los tipos de cáncer que se pueden tratar con el método objeto de la presente invención se incluyen los carcinomas de origen epitelial. Más particularmente, entre los ejemplos de estos cánceres se incluyen cáncer de células epiteliales escamosas, cáncer de pulmón incluidos el de células pequeñas, el de células no-pequeñas, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma escamoso de pulmón, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico incluido el gastrointestinal, cáncer de páncreas, cabeza y cuello gliobastoma, cáncer cervical, de ovario, hígado, vejiga, mama, colon, recto, cáncer colorectal, útero, carcinoma de glándulas salivales, riñon, próstata, vulva, tiroides, carcinoma anal y carcinoma del pene. En el método de la presente invención las composiciones VB HER1 +HER2 se pueden administrar por cualquier vía conocida, como por vía: subcutánea, intradérmica, intramuscular. Preferiblemente por vía subcutánea.
El rango de dosis de los dominios extracelulares de HER1 +HER2 o porciones de estos a emplear en los pacientes que resulten elegibles como respondedores para el tratamiento con las composiciones vacunales de la presente invención está entre 40C^g a 1600 μg, preferiblemente 800μg a 1600 μg; siendo esta concentración la suma de ambas moléculas. Dichas composiciones se administran en los sujetos con una frecuencia quincenal durante al menos un total de cinco dosis de inducción y posteriormente dosis mensuales de mantenimiento por al menos seis meses.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Reconocimiento por citometría de flujo de las líneas tumorales con diferentes niveles de expresión de HER1 y HER2: A431 , MDAMB468, H125, H292, PC3, SKBR3, MCF7/HER2, SKOV3, A549 y Raji, por los anticuerpos policlonales (AcPs) generados por la VB de HER1 +HER2.
Figura 2. Efecto causado por los AcPs inducidos por la VB de HER1 +HER2 sobre la viabilidad celular: A) Citometría de flujo para evaluar el reconocimiento de las líneas ensayadas por los AcMs trastuzumab y nimotuzumab. B) Inhibición de la viabilidad celular en las líneas A431 , H125, H292, SKOV3, SKBR3 con expresión diferencial de HER1 y HER2 medida por el método colorimétrico del MTT. C) Gráfico de barras comparativo del efecto de los sueros sobre la viabilidad celular en las diferentes líneas ensayadas.
Figura 3. Inhibición de la activación de los receptores HER1 y HER2 y las proteínas de las cascadas de señalización, medida por Western Blot en la línea tumoral H292 y causada por los AcPs del suero inmune inducidos por la VB HER1 +HER2. Pl: Suero pre-inmune, ITC: inhibidor tirosina cinasa.
Figura 4. Efecto de los AcPs inducidos por la VB HER1 +HER2 sobre la degradación de los receptores HER1 y HER2 en la línea tumoral H292 medido por Western Blot.
Figura 5. Comparación del efecto sobre la viabilidad celular de la línea de carcinoma pulmonar H292 inducida por los AcPs de la VB HER1 +HER2 y los AcMs: nimotuzumab, trastuzumab y la combinación de ambos.
Figura 6. Comparación de la capacidad de los AcPs de la VB HER1 +HER2 con los AcMs nimotuzumab, cetuximab y trastuzumab de inhibir la activación de los receptores HER1 y HER2 en las líneas tumorales H125 y H292 mediante Western Blot. Figura 7. Comparación de la capacidad de los AcPs con los AcMs nimotuzumab, cetuximab y trastuzumab de degradar los receptores HER1 y HER2 en la línea tumoral H292 mediante ELISA. A) Degradación de HER1 después de 24h de tratamiento. B) Degradación de HER2 después de 1 h de tratamiento.
Figura 8. Comparación del efecto inducido por los AcPs de la VB HER1 +HER2 sobre la viabilidad de la línea de carcinoma pulmonar A549 portadora de la mutación KRAS, con el efecto de los AcMs nimotuzumab, cetuximab, trastuzumab, y la combinación entre ellos.
Figura 9. Comparación de la capacidad de los AcPs de la VB HER1 +HER2 con los AcMs nimotuzumab, cetuximab, trastuzumab, y sus combinaciones de degradar los receptores HER1 y HER2 en la línea de carcinoma pulmonar A549 portadora de la mutación KRAS. EJEMPLOS
Ejemplo 1. Reconocimiento de líneas tumorales HER1 +HER2+ por los AcPs del suero inmune inducido por la VB HER1 +HER2.
Sueros provenientes de ratones inmunizados con la VB HER1 +HER2, diluidos 1 :200 se incubaron durante 20 min con 105 células de líneas tumorales que co-expresan los receptores HER1 y HER2. Se utilizaron líneas que no tienen expresión incrementada de ninguno de estos receptores: H125, derivada de carcinoma de pulmón; H292, derivada de carcinoma de pulmón; PC3, derivada de carcinoma de próstata. Además, se utilizaron líneas con expresión incrementada de HER1 : A431 , derivada de carcinoma epitelial de vulva; MDAMB468, derivada de carcinoma de mama y líneas con expresión incrementada de HER2: SKBR3, derivada de carcinoma de mama; MCF7/HER2 derivada de carcinoma de mama transfectada con HER2; SKOV3, derivada de carcinoma de ovario. Se empleó además una línea portadora de una mutación activadora de RAS, la A549, derivada de carcinoma de pulmón. Se utilizó como control negativo de expresión de los receptores la línea Raji, derivada de linfoma de Burkitt. Como controles negativos de especificidad se emplearon los sueros pre- inmunes y como controles positivos se usaron el AcM nimotuzumab, específico por HER1 y el AcM trastuzumab, específico por HER2. El reconocimiento fue evaluado por citometría de flujo. En la Figura 1 se aprecia que los sueros generados por la VB reconocieron todas las líneas celulares evaluadas, y la mayor intensidad del reconocimiento (correspondiente con la mayor intensidad media de fluorescencia (IMF)), se apreció para las líneas con expresión incrementada de algunos de los receptores.
Ejemplo 2. Los AcPs del suero inmune inducidos por la VB HER1 +HER2 inhiben la viabilidad de líneas tumorales con expresión diferencial de HER1 y HER2, y el efecto es más marcado en líneas que no presentan expresión incrementada de estos receptores.
Para evaluar el efecto de los sueros inmunes sobre líneas con diferentes niveles de expresión de HER1 y HER2 como se muestra en la Tabla 1 , primeramente se corroboraron dichos niveles utilizando los AcMs tratuzumab y nimotuzumab, específicos por HER2 y HER1 respectivamente. Para ello las células de las líneas tumorales humanas: A431 , H125, H292, SKOV3 y SKBR3, se incubaron durante 20 min con dichos AcMs y se midió la IMF. Se muestran los histogramas solapados del reconocimiento de los AcMs específicos por HER1 y HER2, Figura 2A. Esta reportado que la tinción por citometría de flujo de líneas celulares y la IHC de los tumores en los pacientes muestran asociación (Helfrich BA, y cois, (2006) Clin Cáncer Res; 12(23) December 1 ; 71 17-25), lo que permite extrapolar nuestros resultados.
Sueros inmunes provenientes de ratones inmunizados con la VB HER1 +HER2, diluidos 1 :20 y calentados durante 30 min a 56°C para inactivar las proteínas del complemento, se incubaron con las líneas tumorales antes evaluadas. La incubación con los sueros se llevó a cabo durante 96 h y la viabilidad celular se determinó por el método colorimétrico del MTT. Como control de máxima viabilidad (100%), se emplearon células sin tratamiento de cada una de estas líneas, incubadas en condiciones de cultivo. Las células tratadas con una mezcla de sueros pre-inmunes (1 : 20), se consideraron como control negativo de inducción de citotoxicidad, asociada a la inhibición de HER1 y HER2 mientras que el inhibidor tirosina cinasa AG1478, a la concentración de 10μΜ se empleó como control positivo. Los sueros inmunes afectaron la viabilidad de todas las líneas tumorales cuando se compararon con aquella tratadas con los sueros pre-inmunes (Figura 2B). Sin embargo, el efecto más marcado sobre la viabilidad celular se obtuvo sobre líneas que no presentan expresión incrementada de ninguno de los receptores HER1 y HER2: las líneas H292 y H125, Figura 2C.
Tabla 1. Niveles de expresión de HER1 y HER2 en las líneas tumorales evaluadas.
Figure imgf000016_0001
Ejemplo 3. Los AcPs del suero inmune inducidos por la VB HER1 +HER2 inhiben la activación de los receptores HER1 y HER2 y las proteínas de las cascadas de señalización. Sueros provenientes de ratones inmunizados con la VB, diluidos 1 :100 se incubaron con células de la línea tumoral H292 que co-expresa los receptores HER1 y HER2 pero no tiene expresión incrementada de ninguno de estos receptores, durante 30 min, 8 h y 24 h. Las células se estimularon con 100 ng/mL de EGF durante 10 min para inducir la activación de HER1 y de los receptores HER2 que estuvieran formando heterodímeros con HER1 . Posteriormente se lisaron las células tratadas. El efecto de los sueros inmunes sobre la inhibición de la fosforilación de HER1 , HER2, y las proteínas de las cascadas de señalización Erk1/Erk2 (MAPK), Akt y STAT3, se determinó mediante un ensayo de Western Blot, mediante el uso de anticuerpos específicos para la detección de dichas proteínas fosforiladas. En este ensayo se usó como control negativo de fosforilación las células sin tratar y como control positivo las células tratadas con EGF. Como control positivo de inhibición se utilizó el inhibidor tirosina cinasa AG1478 a 10 μΜ y como control negativo de especificidad del suero inmune se empleó el suero pre-inmune. En la Figura 3 se observa que los sueros que contienen los AcPs generados por la VB inhibieron la activación de los receptores HER1 y HER2, medida en términos de fosforilación, desde tiempos tan tempranos como los 30 min, inhibición que aumentó marcadamente con aumentos en los tiempos de tratamiento hasta 8h y 24h. Además, los AcPs inhibieron marcadamente la fosforilación de las proteínas Akt y STAT3, que son proteínas claves en la transduccion de señales como inhibidoras de la apoptosis e inductoras de la inflamación, a las 8h de tratamiento. Asimismo, después de 24h se pudo apreciar la inhibición total de las proteínas Erk1 /Erk2 de la vía de las MAPK, inductoras de proliferación celular.
Ejemplo 4. Los AcPs del suero inmune inducidos por la VB HER1 +HER2 causan degradación de los receptores HER1 y HER2.
Células de la línea tumoral H292 se incubaron con mezclas de los sueros inmunes (diluidos 1 :100) inducidos por la VB HER1 +HER2 durante 30 min, 1 , 8 ó 24 h. El suero pre-inmune fue incluido como control negativo en este ensayo. Los niveles de expresión de ambos receptores a los diferentes tiempos se determinaron mediante Western Blot. En la Figura 4 se observa que los niveles de expresión total de los receptores HER1 y HER2, disminuyeron con el aumento del tiempo de incubación con el suero inmune, con respecto a las células tratadas con el suero pre-inmune. A las 24 horas se evidenció un degradación total de ambos receptores. Ejemplo 5. Comparación de la capacidad de los AcPs del suero inmune con los AcMs nimotuzumab, trastuzumab y sus combinaciones de inhibir la viabilidad de líneas tumorales con baja expresión de los receptores HER1 y HER2.
Células de la línea tumoral H292 se incubaron con mezclas de los sueros inmunes (diluidos 1 : 100) inducidos por la VB HER1 +HER2 durante 96 h. La viabilidad celular se determinó por el método del MTT. El suero pre-inmune fue incluido como control negativo en este ensayo. La mitomicina C se incluyó como control positivo de citotoxicidad. El efecto de los sueros inmunes se comparó con el inducido por el AcM nimotuzumab, el AcM trastuzumab, y la mezcla de ambos anticuerpos. La Figura 5 muestra que los sueros inmunes de la VB HER1 +HER2 tuvieron un efecto mucho mayor sobre la viabilidad de las células tumorales que los AcM y su combinación.
Ejemplo 6. Comparación de la capacidad de los AcPs del suero inmune con los AcMs nimotuzumab, cetuximab y trastuzumab de inhibir la activación de los receptores HER1 y HER2. Sueros provenientes de ratones inmunizados con la VB HER1 +HER2, diluidos 1 :100 se incubaron durante 1 h, con células de las líneas tumorales H125 y H292 que coexpresan los receptores HER1 y HER2 pero no tienen expresión incrementada de ninguno de estos receptores. Este tratamiento se comparó con los AcM nimotuzumab y cetuximab, específicos por HER1 y con el AcM trastuzumab, específico por HER2. Las células se estimularon con 100 ng/mL de EGF durante 10 min para inducir la activación de HER1 y de los receptores HER2 que estuvieran formando heterodímeros con HER1 . Posteriormente se lisaron las células tratadas. La inhibición de la activación de los receptores se midió por Western Blot. Como control positivo de fosforilación se utilizaron las células tratadas con EGF. Como control positivo de inhibición se utilizó el inhibidor tirosina cinasa AG1478 y como control negativo de especificidad del suero inmune se empleó el suero pre-inmune. La Figura 6 muestra que los sueros inmunes de la VB después de 1 h de tratamiento habían inhibido más la activación de HER1 , medida en términos de fosforilación, que los AcM nimotuzumab y cetuximab. Asimismo, inhibieron más la activación de HER2 que el AcM trastuzumab. Ejemplo 7. Comparación de la capacidad de los AcPs generados por la VB HER1+HER2 con los AcMs nimotuzumab, cetuximab y tratuzumab de degradar los receptores HER1 y HER2.
AcPs provenientes de los sueros de ratones inmunizados con la VB HER1 +HER2, a una concentración de 10μg/mL, se incubaron con células de la línea tumoral H292 que co-expresa los receptores HER1 y HER2 pero no tiene expresión incrementada de ninguno de estos receptores. Este tratamiento se comparó con los AcM nimotuzumab y cetuximab, específicos por HER1 , a la concentración de K^g/mL incubando las células durante 24h, y con el AcM trastuzumab, específico por HER2, a una concentración de g/mL a un tiempo de incubación de 1 h. También se comparó con el tratamiento combinado de los AcM nimotuzumab y trastuzumab, y el tratamiento combinado de los AcM cetuximab y trastuzumab. En ambas combinaciones, la concentración de nimtozumab y cetuximab fue 1 C^g/ml_ y la de trastuzumab de ^g/mL. Como control negativo de especificidad de los AcPs de la VB se empleó el suero pre-inmune. Las células se estimularon con 100 ng/mL de EGF durante 10 minutos para inducir la activación de HER1 y de los receptores HER2 que estuvieran formando heterodímeros con HER1 . Posteriormente se lisaron las células tratadas. Los receptores degradados fueron detectados mediante la técnica de ELISA, empleando un juego de reactivos, Quantikine ELISA Human EGFR/Erb B1 Immunoassay para determinar la degradación de HER1 y el DuoSet ELISA DEVELOPMENT SYSTEM Human Erb B2/Her2 para la degradación de HER2. En la Figura 7 A se observa que los AcPs de la VB HER1 +HER2 después de 24h de tratamiento habían degradado más HER1 que los AcMs nimotuzumab, cetuximab, y tratuzumab, solos y combinados. En la Figura 7B se observa que los AcPs de la VB HER1 +HER2, después de 1 h de tratamiento, degradaron más HER2 que los AcMs trastuzumab, nimotuzumab, cetuximab y sus combinaciones.
Ejemplo 8. Comparación del efecto inducido por los AcPs de la VB HER1 +HER2 sobre la viabilidad de la línea de carcinoma pulmonar A549 portadora de la mutación KRAS, con el efecto de los AcMs nimotuzumab, cetuximab, trastuzumab, y la combinación entre ellos.
Los AcP provenientes del suero de ratones inmunizados con la VB HER1 +HER2 {^ 0μg/mL·), se incubaron durante 72h, con células de la línea de carcinoma pulmonar A549, que porta la mutación activadora KRAS. La viabilidad celular se determinó por el método del MTT. Este tratamiento se comparó con los AcMs nimotuzumab y cetuximab, a la concentración de 1 0μg/mL, y con el AcM trastuzumab, a una concentración de ^g/mL. También se comparó con el tratamiento combinado de los AcM nimotuzumab y trastuzumab, y el tratamiento combinado de los AcM cetuximab y trastuzumab. En ambas combinaciones, la concentración de nimtozumab y cetuximab fue ^g/mL y la de trastuzumab de ^g/mL. Como control negativo de especificidad de los AcPs generados por la VB HER1 +HER2 se emplearon anticuerpos provenientes del suero pre-inmune. El % de células viables resultante del tratamiento con los AcPs se normalizó contra el control negativo. La Figura 8 muestra que los AcP de la VB después de 72h de tratamiento inhibieron en un 40% la viabilidad de las células tumorales, mientras que cetuximab, nimotuzumab y trastuzumab inhibieron solo entre un 20% y un 10%. Las combinaciones no tuvieron ningún efecto sobre la viabilidad de las células A549.
Ejemplo 9. Comparación del efecto inducido por los AcPs de la VB HER1 +HER2 sobre la degradación de HER1 y HER2, con el efecto de los AcMs nimotuzumab, cetuximab, trastuzumab, y la combinación entre ellos. AcPs provenientes de los sueros de ratones inmunizados con la VB HER1 +HER2, a una concentración de ^ 0μg/mL·, se incubaron durante 24h, con células de la línea de carcinoma pulmonar A549, que porta la mutación activadora KRAS. Este tratamiento se comparó con los AcM nimotuzumab y cetuximab, a la concentración de "^g/mL, y con el AcM trastuzumab, a una concentración de ^g/mL. También se comparó con el tratamiento combinado de los AcM nimotuzumab y trastuzumab, y el tratamiento combinado de los AcM cetuximab y trastuzumab. En ambas combinaciones, la concentración de nimtozumab y cetuximab fue "^g/mL y la de trastuzumab de ^g/mL. Como control negativo de especificidad de los AcP de la VB se emplearon anticuerpos provenientes el suero pre-inmune. Las células se estimularon con 100 ng/mL de EGF durante 10 minutos para inducir la activación de HER1 y de los receptores HER2 que estuvieran formando heterodímeros con HER1 . Posteriormente se lisaron las células tratadas. Los receptores HER1 degradados fueron detectados mediante la técnica de ELISA, Quantikine ELISA Human EGFR/Erb B1 Immunoassay. En la Figura 9 se observa que los AcPs de la VB HER1 +HER2 después de 24h de tratamiento habían degradado más HER1 que los AcMs nimotuzumab y cetuximab, solos o combinados con el AcM trastuzumab.

Claims

MÉTODO PARA EL TRATAMIENTO DE PACIENTES CON CARCINOMAS DE ORIGEN EPITELIAL. REIVINDICACIONES
1 . Un método para determinar si un paciente diagnosticado con carcinoma de origen epitelial es probable que responda al tratamiento con un inhibidor de la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico (RFCE) donde el método comprende un paso de determinar en una muestra tomada de dicho paciente la presencia de al menos uno de los siguientes biomarcadores:
co-expresión de los receptores HER1 y HER2 y sus niveles de expresión,
- mutaciones activadoras en RAS.
2. El método según la reivindicación 1 donde se concluye que el paciente es probable que responda al tratamiento si:
existe co-expresión de los receptores HER1 y HER2 sin expresión incrementada de los mismos o,
- presenta mutaciones activadoras en RAS.
3. El método según la reivindicación 2 donde se consideran respondedores aquellos pacientes en que el nivel de expresión de HER1 y HER2 en la muestra del paciente tenga una puntuación de 1 + o 2+ medida por inmunohistoquímica.
4. Un método para tratar a un paciente con carcinoma de origen epitelial que comprende:
a) determinar si un paciente con carcinoma de origen epitelial es probable que responda al tratamiento con un inhibidor de la familia del RFCE realizando el método de acuerdo a la reivindicaciones 1 -3 y
b) administrar al paciente que es probable que responda al tratamiento según se determinó en a) una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de la familia del RFCE.
5. El método según la reivindicación 4 donde el inhibidor de la familia del RFCE es la vacuna bivalente (VB) que tiene como principio activo los dominios extracelulares de los receptores HER1 y HER2 o porciones de estos y como adyuvante proteoliposomas de muy pequeña talla formados por proteínas de la membrana externa de Neisseria meningitidis y el gangliósido GM3.
6. El método según la reivindicación 5 donde el rango de dosis de los dominios extracelulares de HER1 y HER2 o porciones de estos está entre 40C^g a 1600 μg; siendo esta concentración la suma de ambas moléculas.
7. El método según la reivindicación 5 donde la VB se administra por vía subcutánea, intradérmica o intramuscular con una frecuencia semanal las primeras cinco dosis y posteriormente dosis mensuales por al menos seis meses.
8. El método según la reivindicación 4 para el tratamiento del cáncer de células epiteliales escamosas, pulmón de células pequeñas, pulmón de células no- pequeñas, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma escamoso de pulmón, cáncer hepatocelular, gástrico, gastrointestinal, páncreas, gliobastoma, cervical, ovario, hígado, vejiga, mama, colon, recto, cáncer colorectal, cabeza y cuello, útero, carcinoma de glándulas salivales, riñon, próstata, vulva, tiroides, carcinoma anal y carcinoma del pene.
9. El método según la reivindicación 4 donde los pacientes respondedores muestran una respuesta completa o parcial después de la administración de 9 dosis de la VB.
10. Uso del método según las reivindicaciones 1 -7 para el tratamiento de carcinomas de origen epitelial.
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