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WO2018164116A1 - リポソーム、抗癌剤及び癌治療用キット - Google Patents

リポソーム、抗癌剤及び癌治療用キット Download PDF

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WO2018164116A1
WO2018164116A1 PCT/JP2018/008560 JP2018008560W WO2018164116A1 WO 2018164116 A1 WO2018164116 A1 WO 2018164116A1 JP 2018008560 W JP2018008560 W JP 2018008560W WO 2018164116 A1 WO2018164116 A1 WO 2018164116A1
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WO
WIPO (PCT)
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liposome
acid
liposomes
result
tdm
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2018/008560
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
淳 宮▲崎▼
博之 西山
喬之 吉野
英之 赤座
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Tokyo NUC
University of Tsukuba NUC
Original Assignee
University of Tokyo NUC
University of Tsukuba NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Tokyo NUC, University of Tsukuba NUC filed Critical University of Tokyo NUC
Priority to JP2019504598A priority Critical patent/JP7220472B2/ja
Publication of WO2018164116A1 publication Critical patent/WO2018164116A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/20—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K47/28—Steroids, e.g. cholesterol, bile acids or glycyrrhetinic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K47/44—Oils, fats or waxes according to two or more groups of A61K47/02-A61K47/42; Natural or modified natural oils, fats or waxes, e.g. castor oil, polyethoxylated castor oil, montan wax, lignite, shellac, rosin, beeswax or lanolin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to a liposome, an anticancer agent, and a cancer treatment kit.
  • Bladder cancer is known as a cancer with frequent recurrence. Therefore, as a method for treating non-muscle invasive bladder cancer that has not invaded the muscle layer, after removing the cancer tissue by endoscopic surgery, Bacillus Calmette Guerlain (BCG) is used in the bladder to suppress recurrence. The standard of treatment is infused. BCG administered into the bladder is thought to invade the patient's cancer cells and activate the patient's immune system to damage the cancer cells. BCG may also be used to treat intraepithelial cancers other than bladder cancer.
  • BCG Bacillus Calmette Guerlain
  • BCG is an attenuated strain derived from Mycobacterium bovis, a kind of acid-fast bacterium, and is also used as a preventive vaccine for tuberculosis.
  • mycolic acid present in the cell wall is considered (see, for example, Non-Patent Document 1).
  • Mycolic acid is a cell wall functional molecule characteristic of acid-fast bacteria, and is a long-chain fatty acid having 60 to 90 carbon atoms.
  • Mycolic acid is a characteristic long-chain molecular fatty acid that forms the cell walls of mycobacteria, including tuberculosis, and its hydrophobicity contributes to the stability of the cell wall and is considered essential for maintaining acid resistance. It has been.
  • mycolic acid and its derivatives including free mycolic acid, sugar esters such as trehalose, glucose, glycerol, etc.
  • mycolic acid and its derivatives are administered to animals as a pathogenic factor of Mycobacterium tuberculosis
  • tuberculosis lesions granulomas
  • mycolic acid and its derivatives are distributed in all mycobacteria and the pathogenicity varies depending on the subclass and carbon chain.
  • mycolic acid has many subclasses such as ⁇ -mycolic acid, methoxymycolic acid, ketomycolic acid, wax ester mycolic acid, epoxymycolic acid, dihydroxymycolic acid and the like having different polarities.
  • Mycolic acid of Mycobacterium tuberculosis and BCG is composed of three subclasses: ⁇ -mycolic acid, methoxymycolic acid, and ketomycolic acid.
  • an object of the present invention is to provide a technique for clinical application of mycolic acid.
  • the present invention includes the following aspects.
  • [1] A liposome containing mycolic acid and a sterol compound.
  • [2] The liposome according to [1], further containing a cationic lipid.
  • [3] The liposome according to [1] or [2], wherein the mycolic acid includes ketomycolic acid.
  • [4] The liposome according to any one of [1] to [3], wherein the zeta potential is positive.
  • [5] The liposome according to any one of [1] to [4], having a diameter of 200 nm or less.
  • [6] The liposome according to any one of [1] to [5], which has a polydispersity index of 0.3 or less.
  • An anticancer agent comprising the liposome according to any one of [1] to [6] as an active ingredient.
  • a cancer treatment kit comprising the anticancer agent according to [7] and an immune checkpoint inhibitor.
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of thin-layer chromatography of mycolic acid in Experimental Example 1.
  • (A) to (c) are mass spectra showing the results of mass spectrometry of ⁇ -mycolic acid, methoxymycolic acid, and ketomycolic acid in Experimental Example 2, respectively.
  • (A) to (d) are fluorescence micrographs of T24 cells contacted with control liposomes, ⁇ -mycolic acid-containing liposomes, methoxymycolic acid-containing liposomes, and ketomycolic acid-containing liposomes in Experimental Example 5, respectively.
  • Experimental example 5 it is a graph which shows the result of having analyzed T24 cell which contacted the control liposome by flow cytometry.
  • FIG. 7 it is a graph which shows the result of having measured the tumor volume of the mouse
  • Experimental Example 8 it is a graph which shows the result of having measured the tumor volume of the mouse
  • 14 is a graph showing the results of flow cytometry in Experimental Example 10.
  • Experimental example 11 it is a graph which shows the result of having measured the tumor volume of the mouse
  • (A) And (b) is a typical photograph which shows the result of the immuno-staining of the tumor tissue of a mouse
  • FIG. (C) is a graph showing the results of counting CD4-positive T cells infiltrating the tumor tissue of mice in Experimental Example 12.
  • (A) And (b) is a typical photograph which shows the result of the immuno-staining of the tumor tissue of a mouse
  • FIG. (C) is a graph showing the results of counting CD8 positive T cells infiltrating the tumor tissue of mice in Experimental Example 12. It is a figure explaining the experiment schedule of Experimental example 13.
  • (A) to (d) are graphs showing the results of measuring the concentration of TNF released in the medium of bone marrow-derived dendritic cells in Experimental Example 16.
  • (A) to (c) are graphs showing the results of measuring the concentration of TNF released in the medium of bone marrow-derived macrophages in Experimental Example 16.
  • the present invention provides a liposome containing mycolic acid and a sterol compound.
  • the liposome of the present embodiment can be used as an anticancer agent, an immunoactivator, an adjuvant and the like.
  • Mycolic acid is a hydrophobic molecule that forms the surface layer barrier of mycobacteria. On the other hand, it is considered to be a component that induces strong immune activation on the host organism side, but it can be administered directly to the living body. It is difficult to activate the immune system. This is considered to be because mycolic acid has strong hydrophobicity and low cell affinity.
  • the liposome of the present embodiment has high cell affinity and can efficiently deliver mycolic acid into the host cytoplasm.
  • mycolic acid can be delivered to cancer cells, immunity against cancer cells can be activated, and cancer cells can be damaged.
  • Liposomes are a type of artificial vesicle composed of an amphiphile.
  • amphiphilic substances include phospholipids, glycolipids, and surfactants.
  • phosphatidylcholines for example, dioleoylphosphatidylcholine (DOPC), dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), dilauroylphosphatidylcholine (DLPC), etc.
  • Phosphatidylglycerols for example, dioleoylphosphatidylglycerol, dipalmitoylphosphatidylglycerol, dilauroylphosphatidylglycerol, etc.
  • phosphatidylethanolamines for example, dioleoylphosphatidylethanolamine, dipalmitoylphosphatidylethanolamine, dilauroylphosphatidylethanolamine) Etc.
  • phosphatidylserine for example, dioleoylphosphatidylserine, dipa Palmi
  • glycolipids examples include glyceroglycolipids such as sulfoquinovosyl diglyceride, diglycosyl diglyceride and digalactosyl diglyceride; glycosphingolipids such as galactosyl cerebroside, lactosyl cerebroside and ganglioside.
  • the surfactant include Span 80, Tween 80, Tween 20, and the like. One kind of amphiphilic substance may be used alone, or two or more kinds may be mixed and used.
  • Liposomes can be produced by any conventionally known method such as an ultrasonic treatment method, reverse phase evaporation method, freeze-thaw method, lipid dissolution method, spray drying method and the like.
  • mycolic acid In the liposome of the present embodiment, mycolic acid can be used without particular limitation as long as it can activate the immune system. In general, mycolic acid is difficult to chemically synthesize. For this reason, it is preferable to use it purified from acid-fast bacteria.
  • Mycolic acid of Mycobacterium tuberculosis and BCG bacteria There are three subclasses of Mycolic acid of Mycobacterium tuberculosis and BCG bacteria: ⁇ -mycolic acid, methoxymycolic acid, and ketomycolic acid.
  • non-tuberculous mycobacterial mycolic acid includes ⁇ -mycolic acid, ketomycolic acid, and wax ester mycolic acid, all of which are known to exhibit strong immune enhancing activity in the form of trehalose ester.
  • ketomycolic acid is preferred because it tends to have a high activity of damaging cancer in vivo.
  • the mycolic acid may be in the form of free mycolic acid, for example, in the form of a sugar ester of mycolic acid such as trehalose monoester, trehalose diester, glucose monoester, glycerol monoester.
  • a sugar ester of mycolic acid such as trehalose monoester, trehalose diester, glucose monoester, glycerol monoester.
  • any one of these may be used as mycolic acid, or a mixture of two or more may be used.
  • the content of mycolic acid is preferably 5 to 20% by mass, and more preferably 10 to 15% by mass, based on the liposome.
  • the liposome of the present embodiment contains a sterol compound.
  • the inventors have clarified that by incorporating a sterol compound in the mycolic acid-containing liposome, the particle size of the liposome can be made smaller and the stability can be improved.
  • Examples of the sterol compound include cholesterol, 3 ⁇ - [N- (dimethylaminoethane) carbamoyl] cholesterol, N- (trimethylammonioethyl) carbamoylcholesterol and the like. Among these, cholesterol can be preferably used.
  • the content of the sterol compound is preferably 5 to 20% by mass, more preferably 10 to 15% by mass, based on the dry weight of the liposome.
  • the liposome of the present embodiment preferably has a positive zeta potential.
  • a positive zeta potential improves cell affinity and facilitates delivery of mycolic acid into the cell.
  • the zeta potential of the liposome is preferably 1 to 20 mV, more preferably 5 to 20 mV.
  • the zeta potential of the liposome can be measured by, for example, electrophoretic light scattering measurement.
  • a cationic substance to the amphiphilic substance constituting the liposome.
  • a cationic lipid may be added as a liposome material.
  • Examples of the cationic lipid include those having a cholesterol skeleton, those having a glutamic acid skeleton, quaternary ammonium salts, dendron lipids and the like.
  • Examples of the cationic lipid having a cholesterol skeleton include [N- (N ′, N′-dimethylaminoethane) -carbamoyl] cholesterol (DC-Chol).
  • Examples of the cationic lipid having a glutamic acid skeleton include N- ( ⁇ -trimethylammonioacetyl) -didodecyl-D-glutamic acid (TMAG).
  • Examples of the quaternary ammonium salt include N- (1- (2,3-dioleyloxy) propyl) -N, N, N-trimethylammonium bromide (DOTMA), dimethyldioctadecylammonium bromide (DDAB), 2,3- Dioleyloxy-N- [2 (sperminecarboxamido) ethyl] -N, N-dimethyl-1-propaneammonium trifluoroacetate (DOSPA), Dioleoyl-D-glutamate-N-2 (sperminecarboxyamido) ethyl (DOGS), 1,2-Dimyristoyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethylammonium bromide (DMRIE) and the like.
  • DOTMA dimethyldioctadecylammonium bromide
  • DOSPA Dioleyloxy-N- [2 (sperminecarboxamido) ethyl] -N
  • dendron lipids examples include dendron lipids (types “D1”, “D2”, “D3”, “D12”, “D22”, “D32”, all manufactured by Hygieia Biosciences). It is not limited. Among these, dendron lipids (model “D22”, manufactured by Hygieia Bioscience) are preferable.
  • the content of the cationic lipid is preferably 1 to 10% by mass, more preferably 2 to 5% by mass, based on the dry weight of the liposome.
  • the liposome of the present embodiment is preferably cationic and preferably has a diameter of 200 nm or less.
  • the diameter of the liposome can be measured, for example, by a dynamic light scattering method. Liposomes having a diameter of 200 nm or less can be easily sterilized by filter sterilization. For this reason, it is easy to administer to a living body.
  • the liposome of the present embodiment preferably has a polydispersity index of 0.3 or less.
  • a small polydispersity index means that the particle size of the liposomes is uniform. When the liposomes have the same particle size, loss can be minimized when filter sterilization is performed.
  • the present invention provides an anticancer agent comprising the above-described liposome as an active ingredient.
  • the immune system can be activated and cancer cells can be damaged. Therefore, the anticancer agent of this embodiment can also be called an immune activator, an adjuvant and the like.
  • the anticancer agent of the present embodiment is unlikely to cause infectious diseases, unlike conventional BCG live bacteria, and is easy to manage, supply and dispose of.
  • Examples of the cancer to be treated by the anticancer agent of the present embodiment include cancer that can be easily administered locally, and specific examples include bladder cancer, breast cancer, melanoma, and the like.
  • the anticancer agent of this embodiment is taken into cancer cells by administering the anticancer agent of this embodiment into the bladder or locally by local injection or the like. As a result, cancer cells incorporating the anticancer agent of this embodiment are damaged by the immune system. Thereby, cancer can be treated effectively.
  • the present invention provides a cancer treatment kit comprising the anticancer agent described above and an immune checkpoint inhibitor.
  • immune checkpoint inhibitors include, but are not limited to, anti-PD-1 antibodies, anti-PD-L1 antibodies, anti-CTLA-4 antibodies, and the like.
  • anti-PD-1 antibody examples include nivolumab, pembrolizumab and the like.
  • anti-CTLA-4 antibody examples include ipilimumab, tremelimumab and the like.
  • the present invention provides a liposome for the treatment of cancer, comprising a mycolic acid and a sterol compound.
  • the liposome is preferably cationic.
  • the mycolic acid and the sterol compound the same ones as described above can be used.
  • the present invention provides the use of a liposome for producing an anticancer agent, the liposome containing a mycolic acid and a sterol compound.
  • the liposome is preferably cationic.
  • the mycolic acid and the sterol compound the same ones as described above can be used.
  • the present invention provides a method for treating cancer comprising administering an effective amount of a liposome containing mycolic acid and a sterol compound to a patient in need of treatment.
  • the liposome is preferably cationic.
  • the cancer to be treated by the treatment method of this embodiment is the same as described above.
  • the mycolic acid and sterol compound the same ones as described above can be used.
  • the invention treats cancer comprising administering an effective amount of a liposome containing mycolic acid and a sterol compound and an effective amount of an immune checkpoint inhibitor to a patient in need of treatment.
  • the liposome is preferably cationic.
  • the cancer to be treated by the treatment method of this embodiment is the same as described above.
  • the mycolic acid and sterol compound the same ones as described above can be used.
  • the thing similar to what was mentioned above can be used as an immune checkpoint inhibitor.
  • FIG. 1 is a photograph showing the results of thin-layer chromatography of mycolic acid methyl ester developed four times.
  • lane 1 is the result of mycolic acid methyl ester purified from Mycobacterium tuberculosis, which is a human tuberculosis bacterium.
  • Lane 2 is the result of mycolic acid methyl ester purified from BCG.
  • Lane 3 is the result of ⁇ (Alpha) -mycolic acid methyl ester purified from BCG.
  • Lane 4 is the result of methoxy-mycolic acid methyl ester purified from BCG.
  • Lane 5 is the result of keto-mycolic acid methyl ester purified from BCG.
  • 2 (a) to 2 (c) are mass spectra showing the analysis results of ⁇ -mycolic acid, methoxymycolic acid, and ketomycolic acid, respectively.
  • Table 1 below summarizes the results of MALDI-TOF mass spectrometry of each subclass of mycolic acid.
  • the purified subclasses of mycolic acid are ⁇ -mycolic acid having 78 carbon atoms, methoxymycolic acid having 85 carbon atoms, and ketomycolic acid having 84 and 86 carbon atoms. It was confirmed.
  • Table 3 shows the measurement results.
  • ⁇ represents ⁇ -mycolic acid
  • methoxy represents methoxymycolic acid
  • keto represents ketomycolic acid.
  • time after preparation represents the number of days after the preparation of liposomes.
  • liposomes containing mycolic acid, cholesterol and cationic lipid have a diameter of 200 nm or less, a positive zeta potential, and a polydispersity index of 0.3. It became clear that: A small polydispersity index means that the particle size of the liposomes is uniform.
  • the inventors have also clarified that by changing the composition of mycolic acid, cholesterol and cationic lipid, the zeta potential and diameter of the mycolic acid-containing liposome can be adjusted, and a liposome according to the purpose can be prepared.
  • each liposome was added to the medium of the human bladder cancer cell line T24 at a final concentration of 50 ⁇ g / mL, allowed to stand at 37 ° C. for 2 hours, and observed with a confocal microscope, whereby the liposome was incorporated into the cells. We examined whether or not. The fluorescence of NBD indicates the localization of the liposome. In addition, the cell nucleus was fluorescently stained with 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
  • DAPI 6-diamidino-2-phenylindole
  • FIG. 3 (a) to 3 (d) are fluorescence micrographs of T24 cells in contact with each liposome.
  • FIG. 3 (a) shows the result of the control liposome
  • FIG. 3 (b) shows the result of the ⁇ -mycolic acid-containing liposome
  • FIG. 3 (c) shows the result of the methoxymycolic acid-containing liposome
  • FIG. ) Shows the result of ketomycolic acid-containing liposomes.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of flow cytometry analysis of T24 cells (with liposomes) contacted with control liposomes.
  • T24 cells not contacted with liposomes were similarly analyzed.
  • a peak of cells showing fluorescence of the control liposome was observed, and it was confirmed that the control liposome was taken up by T24 cells.
  • PBS control liposome
  • each mycolic acid-containing liposome was added to a serum-free medium, and the number of viable cells was measured after 24 hours and 48 hours, respectively.
  • the number of viable cells was measured using a kit (Dojin Chemical Co., Ltd.) using WST-8 which is a water-soluble tetrazolium salt.
  • 5 (a) to 5 (c) are graphs showing the measurement results of the number of viable cells.
  • FIG. 5 (a) shows the results for T24 cells
  • FIG. 5 (b) shows the results for MBT-2 cells
  • FIG. 5 (c) shows the results for MB49 cells.
  • PBS shows the result of adding PBS
  • Control shows the result of adding control liposomes
  • ⁇ shows the result of adding ⁇ -mycolic acid-containing liposomes.
  • Methodoxy indicates the result of adding methoxymycolic acid-containing liposomes
  • keto indicates the result of adding ketomycolic acid-containing liposomes.
  • FIG. 6 is a diagram for explaining an experiment schedule.
  • each reagent alone ( ⁇ -mycolic acid-containing liposome, methoxymycolic acid-containing liposome, ketomycolic acid-containing liposome prepared in the same manner as in Experimental Example 5, Control liposomes or PBS) were each administered subcutaneously at the same site.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of measuring the tumor volume over time.
  • PBS indicates the result of the PBS administration group
  • Control indicates the result of the control liposome administration group
  • ⁇ indicates the result of the ⁇ -mycolic acid-containing liposome administration group
  • Methodoxy indicates The result of the methoxymycolic acid-containing liposome administration group is shown
  • keto shows the result of the ketomycolic acid-containing liposome administration group.
  • Example 8 (Study of antitumor effect of mycolic acid-containing liposomes using mouse subcutaneous tumor model 2) The antitumor effect (antitumor activity) of mycolic acid-containing liposomes was examined using a mouse subcutaneous tumor model in the same manner as in Experimental Example 7 except that Beige mice were used instead of C57BL / 6J mice.
  • the Beige mouse is known as a model animal for the Chediak-Higashi syndrome and lacks NK cells.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of measuring the tumor volume over time.
  • PBS indicates the result of the PBS administration group
  • Control indicates the result of the control liposome administration group
  • ⁇ indicates the result of the ⁇ -mycolic acid-containing liposome administration group
  • methoxy indicates The result of the methoxymycolic acid-containing liposome administration group is shown
  • keto shows the result of the ketomycolic acid-containing liposome administration group.
  • NK cells are less involved in the expression of antitumor effects of mycolic acid-containing liposomes.
  • Example 9 (Preparation of mycolic acid-containing liposome 2) Except for using a dendron lipid represented by the following chemical formula (2) (model “D12”, Hygieia Biosciences) as the cationic lipid, the composition of Production Example 12 having the composition shown in Table 5 was used. Liposomes (hereinafter sometimes referred to as “D12 liposomes”) were prepared. In Table 5, DOPC represents dioleoylphosphatidylcholine.
  • the diameter, polydispersity index, and zeta potential of the D12 liposome were measured using a molecular property evaluation apparatus (model “ZEN3600”, Malvern). Table 6 shows the measurement results. The measurement was performed on the 11th day after the preparation of the liposome. As a result, the diameter, polydispersity index, and zeta potential of the D12 liposome are each a production example using a dendron lipid represented by the above chemical formula (1) (model “D22”, Hygieia Bioscience) as the cationic lipid. It was clarified that it was almost the same as each value of 6 liposomes (hereinafter sometimes referred to as “D22 liposome”).
  • Example 10 (Investigation of uptake of mycolic acid-containing liposomes into cells 2)
  • the liposome of Production Example 13 was prepared with the composition shown in Table 7 below in the same manner as in Experimental Example 9 except that cholesterol labeled with a fluorescent dye NBD (Avanti Polar Lipid) was used.
  • NBD Advanti Polar Lipid
  • DOPC represents dioleoylphosphatidylcholine.
  • each liposome was added to the medium of the mouse bladder cancer cell line MB49 at a final concentration of 50 ⁇ g / mL, allowed to stand at 37 ° C. for 2 hours, and analyzed by flow cytometry.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of flow cytometry.
  • MB49 cells not contacted with liposomes were similarly analyzed.
  • “None” is the result of MB49 cells not contacted with liposomes
  • “D12” is the result of D12 liposomes
  • “D22” is the result of D22 liposomes.
  • the D22 and D12 liposomes had the same degree of color development of the fluorescent dye, and the D12 liposome was taken up by MB49 cells to the same extent as the D22 liposome.
  • the liposome of Production Example 12 prepared in the same manner as in Experimental Example 9 (hereinafter sometimes referred to as “D12 liposome”), the liposome prepared in the same manner as in Production Example 6 of Experimental Example 3 (hereinafter referred to as “D12 liposome”).
  • D12 liposome the liposome prepared in the same manner as in Production Example 6 of Experimental Example 3
  • D22 liposomes liposomes prepared in the same manner as in Production Example 7 of Experimental Example 3
  • control liposomes liposomes prepared in the same manner as in Production Example 7 of Experimental Example 3
  • PBS phosphate buffer
  • FIG. 6 is a diagram for explaining the experiment schedule.
  • day 0 D12 liposome 0.44 mg, D22 liposome 0.44 mg, control liposome 0.5 mg, or PBS 0.1 mL were mixed with 500,000 mouse bladder cancer cell lines MB49, respectively.
  • each reagent alone D12 liposome, D22 liposome, control liposome or PBS was additionally administered subcutaneously to the same site.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of measuring the tumor volume over time.
  • PBS indicates the result of the PBS administration group
  • Control indicates the result of the control liposome administration group
  • D22 indicates the result of the D22 liposome administration group
  • D12 indicates the D12 liposome administration group. The results are shown.
  • D22 liposomes using dendron lipids (type “D12”, Hygieia Biosciences) as cationic lipids are more suitable for D22 liposomes using dendron lipids (type “D22”, Hygiea Biosciences) as cationic lipids. It was revealed that the antitumor effect was higher than that.
  • the immunostained tissue was observed under a microscope, and an area where there was much infiltration of CD4-positive T cells and CD8-positive T cells was photographed.
  • CD4 positive T cells and CD8 positive T cells infiltrating the tumor tissue were counted based on the micrographs taken. T cells were counted three times by one observer for the same region, and the average value was statistically analyzed.
  • FIG. 11 (a) is a representative photograph showing the result of immunostaining the tumor tissue of a mouse in the control liposome-administered group with an anti-CD4 antibody.
  • FIG. 11 (b) is a representative photograph showing the result of immunostaining the tumor tissue of a mouse in the D22 liposome administration group with an anti-CD4 antibody.
  • FIG.11 (c) is a graph which shows the result of having counted the CD4 positive T cell in the tumor tissue of the mouse
  • “control” shows the result of the control liposome-administered group
  • D22 shows the result of the D22 liposome-administered group.
  • FIG. 12 (a) is a representative photograph showing the result of immunostaining the tumor tissue of a mouse in the control liposome administration group with an anti-CD8 antibody.
  • FIG. 12 (b) is a representative photograph showing the result of immunostaining the tumor tissue of a mouse in the D22 liposome administration group with an anti-CD8 antibody.
  • FIG.12 (c) is a graph which shows the result of having counted the CD8 positive T cell in the tumor tissue of the mouse
  • “control” shows the result of the control liposome-administered group
  • D22 shows the result of the D22 liposome-administered group.
  • mice in the D22 liposome administration group had significantly more CD8-positive T cells infiltrating the tumor tissue than the mice in the control liposome administration group. Moreover, this result shows that CD8 positive T cells infiltrate the tumor tissue by administration of D22 liposome, and an antitumor effect is exhibited in a CD8 positive T lymphocyte-dependent manner.
  • FIG. 13 is a diagram for explaining the experiment schedule.
  • mycolic acid-containing liposomes were subcutaneously administered to the same site 9 times every 1-2 days, and the tumor volume was measured over time.
  • mycolic acid-containing liposomes As the mycolic acid-containing liposomes, a group was prepared in which 0.44 mg of ketomycolic acid-containing liposomes prepared in the same manner as in Experimental Example 5 was administered per administration. The dose of mycolic acid per administration per mouse was 40 ⁇ g. For comparison, a group was also prepared in which 0.5 mg of control liposome prepared in the same manner as in Experimental Example 5 or 0.1 mL of PBS was administered per administration.
  • FIG. 14 is a graph showing the results of measuring the tumor volume over time.
  • PBS shows the results of the PBS administration group
  • Control shows the results of the control liposome administration group
  • Keto shows the results of the ketomycolic acid-containing liposome administration group.
  • Example 14 (Preparation of mycolic acid-containing liposome 3) A mycolic acid-containing liposome (hereinafter sometimes referred to as “TDM liposome”) using trehalose dimycolic acid (TDM, trehalose diester of mycolic acid) as mycolic acid was prepared.
  • TDM liposome trehalose dimycolic acid
  • BCG Mycobacterium bovis BCG Tokyo 172 strain
  • Mycobacterium phlei Mycobacterium phlei
  • Rhodococcus terae Rhodococcus terae
  • BCG-TDM Mycobacterium bovis BCG Tokyo 172 strain
  • Mycobacterium phlei Mycobacterium phlei
  • Rhodococcus terae Rhodococcus terae
  • BCG-TDM Mycobacterium bovis BCG Tokyo 172 strain
  • Mycobacterium phlei Mycobacterium phlei
  • Rhodococcus terae Rhodococcus terae
  • the liposome of Production Example 14 (hereinafter sometimes referred to as “BCG-TDM liposome”) and the liposome of Production Example 15 (hereinafter referred to as “M. phlei-TDM liposome ”) and the liposome of Production Example 16 (hereinafter also referred to as“ R. terrae-TDM liposome ”).
  • DOPC represents dioleoylphosphatidylcholine.
  • a dendron lipid represented by the chemical formula (1) (model “D22”, manufactured by Hygieia Bioscience) was used.
  • TDM liposome BCG-TDM liposome prepared in Experimental Example 14, M.M. phlei-TDM liposomes, R.I. 0.44 mg of terae-TDM liposome was used per administration.
  • a group was also prepared in which 0.5 mg of control liposome prepared in the same manner as in Experimental Example 5 or 0.1 mL of PBS was administered per administration.
  • FIG. 15 is a graph showing the results of measuring the tumor volume over time.
  • PBS indicates the result of the PBS administration group
  • Control indicates the result of the control liposome administration group
  • BCG indicates the result of the BCG-TDM liposome administration group
  • phlei indicates the M.P.
  • the result of the phlei-TDM liposome administration group is shown.
  • the result of the terrae-TDM liposome administration group is shown.
  • TDM liposomes also have an antitumor effect.
  • mycolic acid liposomes using trehalose dimycolic acid (TDM) derived from BCG, liposomes using TDM derived from Mycobacterium phlei, and TDM derived from Rhodococcus terae are used.
  • TDM trehalose dimycolic acid
  • TDM Immunoreceptor tyrosine-based activation motif
  • bone marrow-derived dendritic cells BDMC
  • bone marrow-derived macrophages BMM
  • TDM liposomes TDM liposomes
  • Bone marrow-derived dendritic cells (BDMC) prepared from wild type mice or Mincle ⁇ / ⁇ mice were respectively seeded in 96-well plates at a cell density of 1 ⁇ 10 5 cells / well. Subsequently, the BCG-TDM liposome prepared in Experimental Example 14 or M.P. Phlei-TDM liposomes were added to a final concentration of 100 ⁇ g / mL and cultured for 48 hours. For comparison, a group in which control liposomes prepared in the same manner as in Experimental Example 5 were added to a final concentration of 100 ⁇ g / mL and a group in which nothing was added were also prepared. Subsequently, the concentration of TNF released into the medium was measured by ELISA.
  • FIG. 16A is a graph showing the results of measuring the concentration of TNF released into the medium.
  • BCG indicates the result of the BCG-TDM liposome addition group
  • M The results of the phlei-TDM liposome added group are shown
  • Control shows the result of the control liposome added group
  • Ni shows the result of the group to which nothing was added
  • WT is derived from the bone marrow of the wild type mouse.
  • the results of dendritic cells are shown, and “Mincle ⁇ / ⁇ ” shows the results of bone marrow derived dendritic cells of Mincle ⁇ / ⁇ mice.
  • BDMC bone marrow-derived dendritic cells
  • FIGS. 16B to 16D are graphs showing the results of measuring the concentration of TNF released into the medium.
  • BCG indicates the result of the BCG-TDM liposome coat group
  • M The result of the phlei-TDM liposome-coated group
  • control shows the result of the control liposome-coated group
  • no shows the result of the group that did not coat anything.
  • FIG.16 (c) shows the result of the group which coated commercially available TDM.
  • FIG. 16D shows the results of the group to which LPS was added.
  • WT shows the results of wild-type mouse bone marrow-derived dendritic cells
  • Mincle ⁇ / ⁇ shows the results of Mincle ⁇ / ⁇ mouse bone marrow-derived dendritic cells. Results are shown.
  • Bone marrow derived macrophages prepared from wild type mice or Mincle ⁇ / ⁇ mice were seeded in 96-well plates at a cell density of 1 ⁇ 10 5 cells / well, respectively. Subsequently, the BCG-TDM liposome prepared in Experimental Example 14 or M.P. Phlei-TDM liposomes were added to a final concentration of 100 ⁇ g / mL and cultured for 48 hours.
  • FIGS. 17A to 17C are graphs showing the results of measuring the concentration of TNF released into the medium.
  • BCG indicates the result of the BCG-TDM liposome addition group
  • M The result of the phlei-TDM liposome added group
  • control shows the result of the control liposome added group
  • no shows the result of the group to which nothing was added.
  • FIG.17 (b) shows the result of the group which coated commercially available TDM.
  • FIG.17 (c) shows the result of the group which added LPS.
  • “WT” indicates the result of bone marrow-derived macrophages of wild-type mice
  • “Mincle ⁇ / ⁇ ” indicates the results of bone marrow-derived macrophages of Mingle ⁇ / ⁇ mice.
  • Example 17 Large-scale preparation of TDM liposomes
  • TDM BCG-TDM purified in Experimental Example 14 was used. Specifically, 15.0 mg of BCG-TDM, 15.0 mg of cholesterol, and 5.0 mg of cationic lipid (type “D22”, Hygieia Bioscience) were weighed and put into a glass vial.
  • the diameter, polydispersity index, and zeta potential of the TDM liposome of Production Example 17 were measured using a molecular property evaluation apparatus (model “ZETA SIZER Nano-ZS”, Malvern). Table 11 shows the measurement results. As a result, it was revealed that the diameter, polydispersity index, and zeta potential of the TDM liposome of Production Example 17 were comparable to the values of the liposome of Production Example 6 produced in Experimental Example 3, respectively.
  • the TDM liposome of Production Example 17 was used in an amount of 0.44 mg per administration.
  • 0.44 mg of BCG-TDM liposome prepared in the same manner as in Production Example 14 of Experimental Example 14 (hereinafter sometimes referred to as “TDM-D22”) per administration.
  • 0.44 mg of the BCG-TDM liposome of Production Example 18 (hereinafter sometimes referred to as “TDM-D12”) produced in the same manner as in Experimental Example 14 with the composition shown in Table 12 below, as in Experimental Example 5.
  • a group in which 0.5 mg of the control liposome prepared as described above or 0.1 mL of PBS was administered was also prepared. Table 12 below shows the composition of each liposome.
  • “D22” represents dendron lipid (model “D22”, manufactured by Hygieia Bioscience)
  • “D12” represents dendron lipid (model “D12”, manufactured by Hygieia Bioscience).
  • FIG. 18 is a graph showing the results of measuring the tumor volume over time.
  • PBS shows the result of the PBS administration group
  • Control shows the result of the control liposome administration group
  • TDM-D22 shows the result of the TDM-D22 administration group
  • TDM- “D12” shows the results of the TDM-D12 administration group described above
  • Production Example 17 shows the results of the TDM liposome administration group of Production Example 17.
  • TDM liposome of Production Example 17 exhibited an antitumor effect. Also in TDM liposomes, when dendron lipid (type “D22”, Hygieia Bioscience) is used as the cationic lipid, dendron lipid (type “D12”, Hygieia Bioscience) is used as the cationic lipid. It was revealed that the antitumor effect was higher than that.

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Abstract

ミコール酸及びステロール化合物を含有するリポソーム。

Description

リポソーム、抗癌剤及び癌治療用キット
　本発明は、リポソーム、抗癌剤及び癌治療用キットに関する。本願は、２０１７年３月６日に、日本に出願された特願２０１７－０４２２２８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　膀胱癌は再発が多い癌として知られている。このため、筋層に浸潤していない筋層非浸潤性膀胱癌の治療法として、内視鏡手術で癌組織を切除した後に、再発を抑制するためにカルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）を膀胱内に注入する治療法が標準的に行われている。膀胱内に投与されたＢＣＧは、患者の癌細胞に侵入し、患者の免疫系を活性化して癌細胞を傷害させると考えられている。ＢＣＧは、膀胱癌以外の上皮内癌の治療にも用いられる場合がある。
　ＢＣＧは、抗酸菌の一種であるマイコバクテリウム・ボビス由来の弱毒株であり、結核の予防ワクチン等としても使用されるものである。ＢＣＧを含む抗酸菌の免疫活性化成分として、細胞壁に存在するミコール酸が考えられている（例えば、非特許文献１を参照）。
　ミコール酸は、抗酸菌に特徴的な細胞壁機能分子であり、炭素数６０～９０の長鎖脂肪酸である。ミコール酸は、結核菌をはじめ、抗酸菌細胞壁を構成する特徴的な大長鎖分子脂肪酸であり、その疎水性が細胞壁の安定性に寄与するとともに、抗酸性の保持に必須であると考えられている。
　一方、ミコール酸及びその誘導体（遊離ミコール酸を含め、トレハロース、グルコース、グリセロール等の糖エステル等）は、結核菌の病原因子として動物に投与したときに、肺に結核性病変（肉芽腫）を形成することから、病原因子としても注目されてきた。最近、ミコール酸及びその誘導体はすべての抗酸菌に分布し、サブクラスや炭素鎖の違いにより病原性が異なることが明らかにされつつある。
　ミコール酸には、極性の異なるα－ミコール酸、メトキシミコール酸、ケトミコール酸、ワックスエステルミコール酸、エポキシミコール酸、ジヒドロキシミコール酸等の多数のサブクラスが存在することが知られている。結核菌やＢＣＧ菌のミコール酸は、α－ミコール酸、メトキシミコール酸、ケトミコール酸の３種類のサブクラスからなる。
Korf J., et al., The Mycobacterium tuberculosis cell wall component mycolic acid elicits pathogen-associated host innate immune responses, Eur. J. Immunol., 35, 890-900, 2005.
　ＢＣＧは強力な抗腫瘍性を示すことが認められているにもかかわらず、生菌であるため、生体に投与すると感染症を引き起こす場合がある。また、バイオハザードの問題から、管理、供給搬送、廃棄等が煩雑である。一方、抗酸菌の免疫活性化成分と考えられているミコール酸そのものを使用すれば、バイオハザードの問題は生じないものの、ミコール酸をそのまま生体に投与しても免疫系を活性化することが困難である。このため、ミコール酸を臨床応用した例は知られていない。そこで、本発明は、ミコール酸を臨床応用する技術を提供することを目的とする。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］ミコール酸及びステロール化合物を含有するリポソーム。
［２］カチオン性脂質を更に含有する、［１］に記載のリポソーム。
［３］前記ミコール酸がケトミコール酸を含む、［１］又は［２］に記載のリポソーム。
［４］ゼータ電位がプラスである、［１］～［３］のいずれかに記載のリポソーム。
［５］直径が２００ｎｍ以下である、［１］～［４］のいずれかに記載のリポソーム。
［６］多分散指数が０．３以下である、［１］～［５］のいずれかに記載のリポソーム。
［７］［１］～［６］のいずれかに記載のリポソームを有効成分とする抗癌剤。
［８］［７］に記載の抗癌剤と免疫チェックポイント阻害剤とを備える、癌治療用キット。
　本発明によれば、ミコール酸を臨床応用する技術を提供することができる。
実験例１における、ミコール酸の薄層クロマトグラフィーの結果を示す写真である。 （ａ）～（ｃ）は、それぞれ、実験例２における、α－ミコール酸、メトキシミコール酸、ケトミコール酸の質量分析の結果を示すマススペクトルである。 （ａ）～（ｄ）は、それぞれ、実験例５において、対照リポソーム、α－ミコール酸含有リポソーム、メトキシミコール酸含有リポソーム、ケトミコール酸含有リポソームを接触させたＴ２４細胞の蛍光顕微鏡写真である。 実験例５において、対照リポソームを接触させたＴ２４細胞をフローサイトメトリーで解析した結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｃ）は、それぞれ、実験例６における、Ｔ２４細胞、ＭＢＴ－２細胞、ＭＢ４９細胞の結果を示すグラフである。 実験例７の実験スケジュールを説明する図である。 実験例７において、マウスの腫瘍体積を経時的に測定した結果を示すグラフである。 実験例８において、マウスの腫瘍体積を経時的に測定した結果を示すグラフである。 実験例１０におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。 実験例１１において、マウスの腫瘍体積を経時的に測定した結果を示すグラフである。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例１２における、マウスの腫瘍組織の免疫染色の結果を示す代表的な写真である。（ｃ）は、実験例１２において、マウスの腫瘍組織に浸潤したＣＤ４陽性Ｔ細胞をカウントした結果を示すグラフである。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例１２における、マウスの腫瘍組織の免疫染色の結果を示す代表的な写真である。（ｃ）は、実験例１２において、マウスの腫瘍組織に浸潤したＣＤ８陽性Ｔ細胞をカウントした結果を示すグラフである。 実験例１３の実験スケジュールを説明する図である。 実験例１３において、マウスの腫瘍体積を経時的に測定した結果を示すグラフである。 実験例１５において、マウスの腫瘍体積を経時的に測定した結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｄ）は、実験例１６において、骨髄由来樹状細胞の培地中に放出されたＴＮＦの濃度を測定した結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｃ）は、実験例１６において、骨髄由来マクロファージの培地中に放出されたＴＮＦの濃度を測定した結果を示すグラフである。 実験例１８において、マウスの腫瘍体積を経時的に測定した結果を示すグラフである。
［リポソーム］
　１実施形態において、本発明は、ミコール酸及びステロール化合物を含有するリポソームを提供する。
　実施例において後述するように、本実施形態のリポソームを生体に投与することにより、免疫系を活性化させ、癌細胞を傷害させることができる。したがって、本実施形態のリポソームは、抗癌剤、免疫活性化剤、アジュバント等として使用することができる。
　ミコール酸は、抗酸菌の菌表層バリアーを形成する疎水性分子であり、一方、宿主生体側には強力な免疫活性化を誘導する成分と考えられているものの、そのまま生体に投与しても免疫系を活性化することが困難である。これは、ミコール酸が疎水性が強く、細胞親和性が低いためであると考えられる。
　これに対し、実施例において後述するように、本実施形態のリポソームは、細胞親和性が高く、ミコール酸を効率的に宿主細胞質内に送達することができる。その結果、ミコール酸を癌細胞に送達し、癌細胞に対する免疫を活性化し、癌細胞を傷害することができる。
（リポソーム）
　リポソームとは、両親媒性物質により構成される人工的な小胞の１種である。両親媒性物質としては、リン脂質、糖脂質、界面活性剤等が挙げられる。
　リン脂質としては、炭素数３～３０の飽和又は不飽和脂肪酸を構成成分に有する、ホスファチジルコリン類（例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）等）、ホスファチジルグリセロール類（例えば、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール等）、ホスファチジルエタノールアミン類（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン等）、ホスファチジルセリン類（例えば、ジオレオイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジラウロイルホスファチジルセリン等）、ホスファチジン酸類、ホスファチジルイノシトール類、カルジオリピン類、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、及びこれらの水素添加物等が挙げられる。中でも、ＤＯＰＣは安価であり、生体に対する毒性が低いため好適である。
　糖脂質としては、例えば、スルホキノボシルジグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド等のグリセロ糖脂質；ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド等のスフィンゴ糖脂質等が挙げられる。また、界面活性剤としては、Ｓｐａｎ８０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０等が挙げられる。両親媒性物質は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。
　リポソームは、超音波処理法、逆相蒸発法、凍結融解法、脂質溶解法、噴霧乾燥法等の従来公知の任意の方法により製造することができる。
（ミコール酸）
　本実施形態のリポソームにおいて、ミコール酸としては、免疫系を活性化できるものであれば特に制限なく用いることができる。一般的に、ミコール酸は化学合成することが困難である。このため、抗酸菌から精製して用いることが好適である。
　結核菌やＢＣＧ菌のミコール酸には、α－ミコール酸、メトキシミコール酸、ケトミコール酸の３種類のサブクラスが存在する。また、非結核性抗酸菌ミコール酸にはα－ミコール酸、ケトミコール酸、ワックスエステルミコール酸が含まれ、いずれもトレハロースエステルの形で強力な免疫増強活性を示すことが知られている。実施例において後述するように、中でも、ケトミコール酸は、インビボにおいて癌を傷害する活性が高い傾向にあるため好適である。ミコール酸は、遊離ミコール酸の形態であってもよく、例えばトレハロースモノエステル、トレハロースジエステル、グルコースモノエステル、グリセロールモノエステル等のミコール酸の糖エステルの形態であってもよい。本実施形態のリポソームにおいて、ミコール酸としては、これらのいずれか１種を用いてもよいし、２種以上の混合物を用いてもよい。
　ミコール酸の含有量は、リポソームを基準とした乾燥重量で５～２０質量％であることが好ましく、１０～１５質量％であることがより好ましい。
（ステロール化合物）
　本実施形態のリポソームは、ステロール化合物を含有する。発明者らは、ミコール酸含有リポソームにステロール化合物を含有させることにより、リポソームの粒径を小さく揃え、安定性を高めることができることを明らかにした。
　ステロール化合物としては、コレステロール、３β－［Ｎ－（ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール、Ｎ－（トリメチルアンモニオエチル）カルバモイルコレステロール等が挙げられる。中でも、コレステロールを好適に用いることができる。
　ステロール化合物の含有量は、リポソームを基準とした乾燥重量で５～２０質量％であることが好ましく、１０～１５質量％であることがより好ましい。
（ゼータ電位）
　本実施形態のリポソームは、ゼータ電位がプラスであることが好ましい。ゼータ電位がプラスであることにより、細胞親和性が向上し、細胞内にミコール酸を送達することが容易になる。リポソームのゼータ電位は１～２０ｍＶであることが好ましく、５～２０ｍＶであることがより好ましい。リポソームのゼータ電位は、例えば、電気泳動光散乱測定法等により測定することができる。
　リポソームのゼータ電位をプラスにする方法として、リポソームを構成する両親媒性物質にカチオン性を有するものを添加することが挙げられる。例えば、リポソームの材料として、カチオン性脂質を添加してもよい。
　カチオン性脂質としては、コレステロール骨格を有するもの、グルタミン酸骨格を有するもの、４級アンモニウム塩、デンドロン脂質等が挙げられる。
　コレステロール骨格を有するカチオン性脂質としては、例えば、［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）等が挙げられる。
　グルタミン酸骨格を有するカチオン性脂質としては、例えば、塩化Ｎ－（α－トリメチルアンモニオアセチル）－ジドデシル－Ｄ－グルタミン酸（ＴＭＡＧ）等が挙げられる。
　４級アンモニウム塩としては、例えば、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイロキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムブロマイド（ＤＯＴＭＡ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡＢ）、２，３－ジオレイロキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキシアミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、ジオレオイル－Ｄ－グルタメート－Ｎ－２（スペルミンカルボキシアミド）エチル（ＤＯＧＳ）、１，２－ジミリストイロキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド（ＤＭＲＩＥ）等が挙げられる。
　デンドロン脂質としては、例えば、デンドロン脂質（型式「Ｄ１」、「Ｄ２」、「Ｄ３」、「Ｄ１２」、「Ｄ２２」、「Ｄ３２」、いずれもヒュギエイアバイオサイエンス社製）等が挙げられるがこれらに限定されない。中でも、デンドロン脂質（型式「Ｄ２２」、ヒュギエイアバイオサイエンス社製）が好ましい。
　カチオン性脂質の含有量は、リポソームを基準とした乾燥重量で１～１０質量％であることが好ましく、２～５質量％であることがより好ましい。
（直径）
　本実施形態のリポソームは、カチオン性であることが好ましく、直径が２００ｎｍ以下であることが好ましい。リポソームの直径は、例えば動的光散乱法により測定することができる。リポソームの直径が２００ｎｍ以下であること、フィルター滅菌により簡便に滅菌することが可能である。このため、生体に投与しやすい。
（多分散指数）
　本実施形態のリポソームは、多分散指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ　ｉｎｄｅｘ）が０．３以下であることが好ましい。多分散指数が小さいことはリポソームの粒径が揃っていることを意味する。リポソームの粒径が揃っていると、フィルター滅菌した場合等にロスを最小限に抑制することができる。
［抗癌剤］
　１実施形態において、本発明は、上述したリポソームを有効成分とする抗癌剤を提供する。実施例において後述するように、本実施形態の抗癌剤を生体に投与することにより、免疫系を活性化させ、癌細胞を傷害させることができる。したがって、本実施形態の抗癌剤は、免疫活性化剤、アジュバント等といいかえることもできる。
　本実施形態の抗癌剤は、従来のＢＣＧ生菌と異なり、感染症を引き起こす心配がなく、管理、供給搬送、廃棄等も簡便である。
　本実施形態の抗癌剤が治療対象とする癌としては、薬剤を局所投与することが容易な癌が挙げられ、具体的には、膀胱癌、乳癌、メラノーマ等が挙げられる。本実施形態の抗癌剤を膀胱内に投与、あるいは局所注射等により局所投与することにより、本実施形態の抗癌剤が癌細胞に取り込まれる。その結果、本実施形態の抗癌剤を取り込んだ癌細胞が、免疫系により傷害される。これにより、癌を効果的に治療することができる。
［癌治療用キット］
　１実施形態において、本発明は、上述した抗癌剤と、免疫チェックポイント阻害剤とを備える、癌治療用キットを提供する。
　上述した抗癌剤を免疫チェックポイント阻害剤と併用して患者に投与することにより、患者の免疫系を活性化し、癌の治療効果を更に向上させることができる。免疫チェックポイント阻害剤としては、例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体等が挙げられるがこれらに限定されない。抗ＰＤ－１抗体としては、例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ等が挙げられる。抗ＣＴＬＡ－４抗体としては、例えば、イピリムマブ、トレメリムマブ等が挙げられる。
［その他の実施形態］
　１実施形態において、本発明は、癌の治療のためのリポソームであって、ミコール酸及びステロール化合物を含有するリポソームを提供する。ここで、リポソームはカチオン性であることが好ましい。ミコール酸、ステロール化合物としては、上述したものと同様のものを用いることができる。
　１実施形態において、本発明は、抗癌剤を製造するためのリポソームの使用であって、ミコール酸及びステロール化合物を含有するリポソームの使用を提供する。ここで、リポソームはカチオン性であることが好ましい。ミコール酸、ステロール化合物としては、上述したものと同様のものを用いることができる。
　１実施形態において、本発明は、ミコール酸及びステロール化合物を含有するリポソームの有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、癌の治療方法を提供する。ここで、リポソームはカチオン性であることが好ましい。本実施形態の治療方法が治療対象とする癌は上述したものと同様である。また、ミコール酸、ステロール化合物としては、上述したものと同様のものを用いることができる。
　１実施形態において、本発明は、ミコール酸及びステロール化合物を含有するリポソームの有効量、及び、免疫チェックポイント阻害剤の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、癌の治療方法を提供する。ここで、リポソームはカチオン性であることが好ましい。本実施形態の治療方法が治療対象とする癌は上述したものと同様である。また、ミコール酸、ステロール化合物としては、上述したものと同様のものを用いることができる。また、免疫チェックポイント阻害剤としては上述したものと同様のものを用いることができる。
　以下、実験例により本発明を説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
［実験例１］
（ＢＣＧからのミコール酸の精製）
《ＢＣＧの培養》
　マイコバクテリウム・ボビス　ＢＣＧ　Ｔｏｋｙｏ　１７２株を、ソートン培地を用いて３７℃で９日間表面培養した。続いて、培地を１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した後遠心分離し、ＢＣＧ加熱死菌を回収した。
《粗ミコール酸の抽出》
　続いて、ＢＣＧ加熱死菌２０ｇに５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液１００ｍＬを加え、１２１℃で２０分間オートクレーブした。続いて、冷却後５Ｎ塩酸を加え、ｐＨを２に調整した。続いてヘキサンを加え、ヘキサン層を回収して純水で洗浄後、乾固することにより、総脂肪酸を得た。続いて、総脂肪酸を１ｍＬクロロホルムに溶解し、メタノール５０ｍＬを加え、粗ミコール酸の沈殿物を形成して回収した。
《ミコール酸の精製》
　続いて、粗ミコール酸１００ｍｇに、ヘキサン・メタノール（ヘキサン：メタノール＝２０：１，ｖ／ｖ）１０ｍＬ、１０％トリメチルシリルジアゾメタン２５０μＬを加え、室温に３０分静置し、ミコール酸をメチルエステル化した。得られたメチルエステルミコール酸を、シリカゲルコートガラス薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート（２０×２０ｃｍ）、ヘキサン・酢酸エチル溶媒（ヘキサン：酢酸エチル＝２０：１，ｖ／ｖ）で４回展開し、ヨウ素で呈色させた。
　続いて、α－ミコール酸、メトキシミコール酸、ケトミコール酸の３つのメチルエステル分画を回収した。続いて、回収した各ミコール酸メチルエステルに、トルエン３ｍＬ、５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液５ｍＬ、エタノール２ｍＬをそれぞれ加え、１２１℃で２０分間オートクレーブした。続いて、冷却後５Ｎ塩酸で酸性化し、ヘキサンを加え、ヘキサン層の精製ミコール酸をそれぞれ回収した。
　図１は、４回展開したミコール酸メチルエステルの薄層クロマトグラフィーの結果を示す写真である。図１中、レーン１はヒトの結核菌であるマイコバクテリウム・ツベルクローシスから精製したミコール酸メチルエステルの結果である。また、レーン２はＢＣＧから精製したミコール酸メチルエステルの結果である。また、レーン３はＢＣＧから精製したα（Ａｌｐｈａ）－ミコール酸メチルエステルの結果である。また、レーン４はＢＣＧから精製したメトキシ（Ｍｅｔｈｏｘｙ）－ミコール酸メチルエステルの結果である。また、レーン５はＢＣＧから精製したケト（Ｋｅｔｏ）－ミコール酸メチルエステルの結果である。
［実験例２］
（質量分析によるミコール酸のサブクラスの確認）
　実験例１で精製した各サブクラスのミコール酸メチルエステルの分子量を、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析装置（型式「Ｖｏｙａｇｅｒ　ＤＥ－ＳＴＲ」、アプライドバイオシステムズ社）により解析した。
　各サンプルをクロロホルム・メタノール（クロロホルム：メタノール＝２：１，ｖ／ｖ）に１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、０．７５ｍＬの液滴としてサンプルプレートにアプライした。マトリックスとして、２，５－ジヒドロキシ安息香酸（２．５－ＤＨＢ）を使用した。ポジティブリフレクションモードでＴＯＦイオントラッピングを行い、加速電圧は２０ｋＶに設定した。
　図２（ａ）～（ｃ）は、それぞれ、α－ミコール酸、メトキシミコール酸、ケトミコール酸の解析結果を示すマススペクトルである。下記表１に、各サブクラスのミコール酸のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析の結果をまとめた。
　薄層クロマトグラフィーと質量分析の結果から、精製した各サブクラスのミコール酸が、炭素数７８中心のα－ミコール酸、炭素数８５中心のメトキシミコール酸、炭素数８４及び８６中心のケトミコール酸であることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［実験例３］
（ミコール酸含有リポソームの作製１）
　実験例１で精製した、α－ミコール酸、メトキシミコール酸、ケトミコール酸を用いて、表２に示す組成で製造例１～７のリポソームをそれぞれ作製した。表２中、ＤＯＰＣはジオレオイルホスファチジルコリンを表す。また、カチオン性脂質として、下記化学式（１）で表されるデンドロン脂質（型式「Ｄ２２」、ヒュギエイアバイオサイエンス社）を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　具体的には、まず、表２に示す組成で、ミコール酸、ＤＯＰＣ、コレステロール及びカチオン性脂質を、クロロホルム・メタノール（２：１、ｖ／ｖ）混合溶媒中で混合して６０℃で加熱し、溶解した。続いて、減圧下で溶媒を完全に除去した。続いて、窒素気流下で乾固させ、脂質を薄層化させた。続いて、リン酸バッファー（ＰＢＳ）１ｍＬを加えて超音波破砕装置（型式「Ｂｉｏｒｕｐｔｅｒ」、コスモバイオ社）で破砕した。続いて、得られた懸濁液を１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心し、ペレットを回収した。続いて、回収したペレットを５００μＬのＰＢＳに溶解した。
　続いて、液体窒素を用いて凍結融解を１０回繰り返した。続いて、得られた液体を、６０℃に加熱したヒートブロック上で、エクストルーダー装置（型式「Ｍｉｎｉ　Ｅｘｔｒｕｄｅｒ」、アバンティポーラリピッド社）を用いて、２１回ポリカーボネート膜（ポアサイズ２００ｎｍ）を通過させ、均一なリポソームを得た。作製したリポソームは使用するまで４℃で保存した。
［実験例４］
（ミコール酸含有リポソームの解析）
　実験例３で作製した各リポソームについて、分子特性評価装置（型式「ＺＥＮ３６００」、マルバーン社）を用いて、直径、多分散指数、ゼータ電位をそれぞれ測定した。
　表３に測定結果を示す。表３中、「α」はα－ミコール酸を表し、「メトキシ」はメトキシミコール酸を表し、「ケト」はケトミコール酸を表す。また、「作製後の時間」は、リポソームの作製後何日目に測定したかを表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　その結果、製造例１～３のリポソームの結果から明らかなように、ミコール酸含有リポソームがコレステロールを含まない場合、製造から２日後よりも製造から７日後の方が、直径が増大することが明らかとなった。
　これに対し、製造例４～６のリポソームの結果から明らかなように、ミコール酸含有リポソームがコレステロールを含む場合、直径が安定しており、製造から７日後の測定においても直径２００ｎｍ以下を維持できることが明らかとなった。
　また、製造例４～６のリポソームの結果から明らかなように、ミコール酸、コレステロール及びカチオン性脂質を含有するリポソームは、直径２００ｎｍ以下で、ゼータ電位がプラスであり、多分散指数が０．３以下となることが明らかとなった。多分散指数が小さいことは、リポソームの粒径が揃っていることを意味する。
　また、発明者らは、ミコール酸、コレステロール及びカチオン性脂質の組成を変えることにより、ミコール酸含有リポソームのゼータ電位、直径を調整し、目的に応じたリポソームを作製できることも明らかにした。
［実験例５］
（ミコール酸含有リポソームの細胞への取り込みの検討１）
　コレステロールとして、蛍光色素であるＮＢＤで標識されたコレステロール（アバンティポーラリピッド社）を使用した以外は実験例３と同様にして、下記表４の組成で製造例８～１１のリポソームを作製した。以下、製造例８のリポソームを「α－ミコール酸含有リポソーム」といい、製造例９のリポソームを「メトキシミコール酸含有リポソーム」といい、製造例１０のリポソームを「ケトミコール酸含有リポソーム」といい、製造例１１のリポソームを「対照リポソーム」という場合がある。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　続いて、各リポソームを、ヒト膀胱癌細胞株Ｔ２４の培地に５０μｇ／ｍＬの終濃度で添加して３７℃で２時間静置し、共焦点顕微鏡で観察することにより、リポソームが細胞に取り込まれたか否かを検討した。ＮＢＤの蛍光はリポソームの局在を示す。また、細胞の核を４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で蛍光染色した。
　図３（ａ）～（ｄ）は、各リポソームを接触させたＴ２４細胞の蛍光顕微鏡写真である。図３（ａ）は対照リポソームの結果を示し、図３（ｂ）はα－ミコール酸含有リポソームの結果を示し、図３（ｃ）はメトキシミコール酸含有リポソームの結果を示し、図３（ｄ）はケトミコール酸含有リポソームの結果を示す。その結果、いずれのリポソームもＴ２４細胞の細胞質に取り込まれたことが明らかとなった。
　また、図４は、対照リポソームを接触させたＴ２４細胞（リポソームあり）をフローサイトメトリーで解析した結果を示すグラフである。比較のために、リポソームを接触させなかったＴ２４細胞（リポソームなし）を同様に解析した。その結果、対照リポソームの蛍光を示す細胞のピークが観察され、対照リポソームがＴ２４細胞に取り込まれたことが確認された。
［実験例６］
（ミコール酸含有リポソームの細胞傷害活性の検討）
　実験例５と同様にして作製した、α－ミコール酸含有リポソーム、メトキシミコール酸含有リポソーム、ケトミコール酸含有リポソーム及び対照リポソームを、５０μｇ／ｍＬの終濃度でヒト膀胱癌細胞株Ｔ２４、マウス膀胱癌細胞株ＭＢＴ－２及びマウス膀胱癌細胞株ＭＢ４９の培地にそれぞれ添加し、細胞傷害活性を検討した。
　具体的には、血清不含培地に、ＰＢＳ、対照リポソーム又は各ミコール酸含有リポソームをそれぞれ添加し、２４時間後及び４８時間後に生細胞数をそれぞれ測定した。生細胞数の測定は、水溶性テトラゾリウム塩であるＷＳＴ－８を使用したキット（同仁化学）を使用して行った。
　図５（ａ）～（ｃ）は生細胞数の測定結果を示すグラフである。図５（ａ）はＴ２４細胞の結果を示し、図５（ｂ）はＭＢＴ－２細胞の結果を示し、図５（ｃ）はＭＢ４９細胞の結果を示す。図５（ａ）～（ｃ）中、「ＰＢＳ」はＰＢＳを添加した結果を示し、「対照」は対照リポソームを添加した結果を示し、「α」はα－ミコール酸含有リポソームを添加した結果を示し、「メトキシ」はメトキシミコール酸含有リポソームを添加した結果を示し、「ケト」はケトミコール酸含有リポソームを添加した結果を示す。
　その結果、いずれのリポソームもインビトロでは細胞傷害活性をほとんど有しないことが明らかとなった。
［実験例７］
（マウス皮下腫瘍モデルによるミコール酸含有リポソームの抗腫瘍効果の検討１）
　マウス皮下腫瘍モデルを用いてミコール酸含有リポソームの抗腫瘍効果を検討した。図６は、実験スケジュールを説明する図である。まず、実験初日（０日目）に、実験例５と同様にして作製した、α－ミコール酸含有リポソーム、メトキシミコール酸含有リポソーム若しくはケトミコール酸含有リポソーム０．４４ｍｇ、対照リポソーム０．５ｍｇ、又はＰＢＳ０．１ｍＬを、それぞれ５００，０００個のマウス膀胱癌細胞株ＭＢ４９と混合し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの背側の皮下に投与した（ｎ＝５又は６）。続いて、腫瘍体積を継時的に測定した。また、実験開始後３日目、５日目及び７日目に、各試薬のみ（実験例５と同様にして作製した、α－ミコール酸含有リポソーム、メトキシミコール酸含有リポソーム、ケトミコール酸含有リポソーム、対照リポソーム又はＰＢＳ）をそれぞれ追加で同じ部位に皮下投与した。
　図７は、腫瘍体積を経時的に測定した結果を示すグラフである。図７中、「ＰＢＳ」はＰＢＳ投与群の結果を示し、「対照」は対照リポソーム投与群の結果を示し、「α」はα－ミコール酸含有リポソーム投与群の結果を示し、「メトキシ」はメトキシミコール酸含有リポソーム投与群の結果を示し、「ケト」はケトミコール酸含有リポソーム投与群の結果を示す。
　その結果、実験開始後１４日目において、ＰＢＳ投与群とケトミコール酸含有リポソーム投与群との間で腫瘍体積に有意差が認められた（ｐ＝０．００６７）。また、ＰＢＳ投与群とメトキシミコール酸含有リポソーム投与群との間でも腫瘍体積に有意差が認められた（ｐ＝０．０１２）。また、対照リポソーム投与群とケトミコール酸含有リポソーム投与群との間でも腫瘍体積に有意差が認められた（ｐ＝０．００４４）。
　また、実験開始後２１日目において、ＰＢＳ投与群とケトミコール酸含有リポソーム投与群との間で腫瘍体積に有意差が認められた（ｐ＝０．０１４）。また、ＰＢＳ投与群とメトキシミコール酸含有リポソーム投与群との間でも腫瘍体積に有意差が認められた（ｐ＝０．０３７）。
　また、実験開始後２８日目において、ＰＢＳ投与群とケトミコール酸含有リポソーム投与群との間で腫瘍体積に有意差が認められた（ｐ＝０．０１４）。
　この結果から、実験例６に示すように、ミコール酸含有リポソームは直接細胞傷害活性を有しないが、免疫系が関与する条件下では細胞傷害活性（抗腫瘍活性）を示すことが明らかとなった。また、ケトミコール酸が最も高い細胞傷害活性を示すことが明らかとなった。
［実験例８］
（マウス皮下腫瘍モデルによるミコール酸含有リポソームの抗腫瘍効果の検討２）
　Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの代わりにＢｅｉｇｅマウスを用いた以外は実験例７と同様にして、マウス皮下腫瘍モデルを用いてミコール酸含有リポソームの抗腫瘍効果（抗腫瘍活性）を検討した。ＢｅｉｇｅマウスはＣｈｅｄｉａｋ－Ｈｉｇａｓｈｉ症候群のモデル動物として知られており、ＮＫ細胞が欠損している。
　図８は、腫瘍体積を経時的に測定した結果を示すグラフである。図８中、「ＰＢＳ」はＰＢＳ投与群の結果を示し、「対照」は対照リポソーム投与群の結果を示し、「α」はα－ミコール酸含有リポソーム投与群の結果を示し、「メトキシ」はメトキシミコール酸含有リポソーム投与群の結果を示し、「ケト」はケトミコール酸含有リポソーム投与群の結果を示す。
　その結果、実験開始後２４日目において、ＰＢＳ投与群とメトキシミコール酸含有リポソーム投与群との間で腫瘍体積に有意差が認められた（ｐ＝０．０１８）。また、ＰＢＳ投与群とα－ミコール酸含有リポソーム投与群との間でも腫瘍体積に有意差が認められた（ｐ＝０．０４５）。また、ＰＢＳ投与群とケトミコール酸含有リポソーム投与群との間でも腫瘍体積に有意差が認められた（ｐ＝０．０４５）。
　この結果から、ミコール酸含有リポソームの抗腫瘍効果発現へのＮＫ細胞の関与は少ないものと考えられた。
［実験例９］
（ミコール酸含有リポソームの作製２）
　カチオン性脂質として、下記化学式（２）で表されるデンドロン脂質（型式「Ｄ１２」、ヒュギエイアバイオサイエンス社）を用いた以外は実験例３と同様にして、表５に示す組成で製造例１２のリポソーム（以下、「Ｄ１２リポソーム」という場合がある。）を作製した。表５中、ＤＯＰＣはジオレオイルホスファチジルコリンを表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　続いて、分子特性評価装置（型式「ＺＥＮ３６００」、マルバーン社）を用いて、Ｄ１２リポソームの直径、多分散指数、ゼータ電位をそれぞれ測定した。表６に測定結果を示す。測定は、リポソームの作製後１１日目に行った。その結果、Ｄ１２リポソームの直径、多分散指数、ゼータ電位は、それぞれ、カチオン性脂質として、上記化学式（１）で表されるデンドロン脂質（型式「Ｄ２２」、ヒュギエイアバイオサイエンス社）を用いた製造例６のリポソーム（以下、「Ｄ２２リポソーム」という場合がある。）の各値と同程度であることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
［実験例１０］
（ミコール酸含有リポソームの細胞への取り込みの検討２）
　コレステロールとして、蛍光色素であるＮＢＤで標識されたコレステロール（アバンティポーラリピッド社）を使用した以外は実験例９と同様にして、下記表７の組成で製造例１３のリポソームを作製した。表７中、ＤＯＰＣはジオレオイルホスファチジルコリンを表す。
　また、比較のために、実験例５の製造例１０と同様にして調製したリポソーム（以下、「Ｄ２２リポソーム」という場合がある。）を使用した。表７には、製造例１０のリポソームの組成も示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　続いて、各リポソームを、マウス膀胱癌細胞株ＭＢ４９の培地に５０μｇ／ｍＬの終濃度で添加して３７℃で２時間静置し、フローサイトメトリーで解析した。図９は、フローサイトメトリーの結果を示すグラフである。比較のために、リポソームを接触させなかったＭＢ４９細胞を同様に解析した。図９中、「なし」はリポソームを接触させなかったＭＢ４９細胞の結果であり、「Ｄ１２」はＤ１２リポソームの結果であり、「Ｄ２２」はＤ２２リポソームの結果である。その結果、Ｄ２２、Ｄ１２リポソーム共、蛍光色素の発色の程度は等しく、Ｄ１２リポソームは、Ｄ２２リポソームと同程度にＭＢ４９細胞に取り込まれたことが確認された。
［実験例１１］
（マウス皮下腫瘍モデルによるミコール酸含有リポソームの抗腫瘍効果の検討３）
　ミコール酸含有リポソームに含有させるカチオン性脂質として、上記化学式（１）で表されるデンドロン脂質（型式「Ｄ２２」、ヒュギエイアバイオサイエンス社）を用いた場合、及び上記化学式（２）で表されるデンドロン脂質（型式「Ｄ１２」、ヒュギエイアバイオサイエンス社）を用いた場合の抗腫瘍効果を検討した。
　具体的には、実験例９と同様にして調製した製造例１２のリポソーム（以下、「Ｄ１２リポソーム」という場合がある。）、実験例３の製造例６と同様にして調製したリポソーム（以下、「Ｄ２２リポソーム」という場合がある。）、実験例３の製造例７と同様にして調製したリポソーム（以下、「対照リポソーム」という場合がある。）、及びリン酸バッファー（ＰＢＳ）を、実験例７と同様のマウス皮下腫瘍モデルに投与し、抗腫瘍効果を検討した。下記表８に、各リポソームの組成を示す。表８中、ＤＯＰＣはジオレオイルホスファチジルコリンを表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　図６は、実験スケジュールを説明する図である。まず、実験初日（０日目）に、Ｄ１２リポソーム０．４４ｍｇ、Ｄ２２リポソーム０．４４ｍｇ、対照リポソーム０．５ｍｇ、又はＰＢＳ０．１ｍＬを、それぞれ５００，０００個のマウス膀胱癌細胞株ＭＢ４９と混合し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの背側の皮下に投与した（ｎ＝５又は６）。続いて、腫瘍体積を継時的に測定した。また、実験開始後３日目、５日目及び７日目に、各試薬のみ（Ｄ１２リポソーム、Ｄ２２リポソーム、対照リポソーム又はＰＢＳ）をそれぞれ追加で同じ部位に皮下投与した。
　図１０は、腫瘍体積を経時的に測定した結果を示すグラフである。図１０中、「ＰＢＳ」はＰＢＳ投与群の結果を示し、「対照」は対照リポソーム投与群の結果を示し、「Ｄ２２」はＤ２２リポソーム投与群の結果を示し、「Ｄ１２」はＤ１２リポソーム投与群の結果を示す。
　その結果、カチオン性脂質としてデンドロン脂質（型式「Ｄ２２」、ヒュギエイアバイオサイエンス社）を用いたＤ２２リポソームのほうが、カチオン性脂質としてデンドロン脂質（型式「Ｄ１２」、ヒュギエイアバイオサイエンス社）を用いたＤ１２リポソームよりも抗腫瘍効果が高いことが明らかとなった。
［実験例１２］
（腫瘍組織の組織学的検討）
　実験例１１のマウス皮下腫瘍モデルにおいて、実験開始後１０日目のＤ２２リポソーム投与群のマウス及び対照リポソーム投与群のマウスを用いて、腫瘍組織へのＴリンパ球の浸潤を検討した。
　まず、各マウスから摘出した腫瘍組織を固定してパラフィン包埋し、厚さ４μｍの切片を作製した。続いて、抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ８抗体を用いた免疫染色を行い、腫瘍組織へのＴリンパ球の浸潤を検討した（ｎ＝３）。
　続いて、免疫染色した組織を顕微鏡観察し、ＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞の浸潤が多い領域を撮影した。続いて、撮影した顕微鏡写真に基づいて、腫瘍組織に浸潤したＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞をカウントした。Ｔ細胞のカウントは一人の観察者が同一の領域について３回ずつ行い、その平均値を統計学的に解析した。
　図１１（ａ）は、対照リポソーム投与群のマウスの腫瘍組織を抗ＣＤ４抗体で免疫染色した結果を示す代表的な写真である。また、図１１（ｂ）は、Ｄ２２リポソーム投与群のマウスの腫瘍組織を抗ＣＤ４抗体で免疫染色した結果を示す代表的な写真である。また、図１１（ｃ）は、各群のマウスの腫瘍組織におけるＣＤ４陽性Ｔ細胞をカウントした結果を示すグラフである。図１１（ｃ）中、「対照」は対照リポソーム投与群の結果を示し、「Ｄ２２」はＤ２２リポソーム投与群の結果を示す。
　また、図１２（ａ）は、対照リポソーム投与群のマウスの腫瘍組織を抗ＣＤ８抗体で免疫染色した結果を示す代表的な写真である。また、図１２（ｂ）は、Ｄ２２リポソーム投与群のマウスの腫瘍組織を抗ＣＤ８抗体で免疫染色した結果を示す代表的な写真である。また、図１２（ｃ）は、各群のマウスの腫瘍組織におけるＣＤ８陽性Ｔ細胞をカウントした結果を示すグラフである。図１２（ｃ）中、「対照」は対照リポソーム投与群の結果を示し、「Ｄ２２」はＤ２２リポソーム投与群の結果を示す。
　独立ｔ検定により解析した結果、図１１（ｃ）に示すように、対照リポソーム投与群及びＤ２２リポソーム投与群において、腫瘍組織に浸潤したＣＤ４陽性Ｔ細胞数には有意差が認められなかった。これに対し、図１２（ｃ）に示すように、対照リポソーム投与群及びＤ２２リポソーム投与群において、腫瘍組織に浸潤したＣＤ８陽性Ｔ細胞数には有意差が認められた。
　この結果から、Ｄ２２リポソーム投与群のマウスでは、対照リポソーム投与群のマウスと比較して、腫瘍組織に浸潤するＣＤ８陽性Ｔ細胞が有意に多いことが明らかとなった。また、この結果は、Ｄ２２リポソームの投与により、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が腫瘍組織に浸潤し、ＣＤ８陽性Ｔリンパ球依存的に抗腫瘍効果が発揮されることを示す。
［実験例１３］
（マウス皮下腫瘍モデルによるミコール酸含有リポソームの抗腫瘍効果の検討４）
　実験例７、８、１１のマウス皮下腫瘍抑制効果モデルでは、腫瘍細胞の接種と同時にミコール酸含有リポソームの投与を開始していた。そこで、腫瘍が形成された後にミコール酸含有リポソームの投与を開始した場合に腫瘍抑制効果が認められるか否かについて検討した。
　図１３は、実験スケジュールを説明する図である。まず、実験初日（０日目）に、５００，０００個のマウス膀胱癌細胞株ＭＢ４９を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの背側の皮下に投与した（ｎ＝５又は６）。続いて、実験開始後７日目以降、１～２日おきに合計９回、ミコール酸含有リポソームを同じ部位に皮下投与し、腫瘍体積を継時的に測定した。
　ミコール酸含有リポソームとして、１匹１回の投与あたり、実験例５と同様にして作製したケトミコール酸含有リポソームを０．４４ｍｇ投与した群を用意した。１匹１回の投与あたりのミコール酸の投与量は４０μｇであった。また、比較のために、１匹１回の投与あたり、実験例５と同様にして作製した対照リポソームを０．５ｍｇ又はＰＢＳを０．１ｍＬ投与した群も用意した。
　図１４は、腫瘍体積を経時的に測定した結果を示すグラフである。図１４中、「ＰＢＳ」はＰＢＳ投与群の結果を示し、「対照」は対照リポソーム投与群の結果を示し、「ケト」はケトミコール酸含有リポソーム投与群の結果を示す。
　その結果、実験開始後１７日目において、ＰＢＳ投与群とケトミコール酸含有リポソーム投与群との間で腫瘍体積に有意差が認められた（ｐ＝０．０４８）。また、対照リポソーム投与群とケトミコール酸含有リポソーム投与群との間でも腫瘍体積に有意差が認められた（ｐ＝０．０１５）。
　この結果、腫瘍が形成された後にミコール酸含有リポソームの投与を実施した場合においても抗腫瘍効果が認められることが明らかとなった。
［実験例１４］
（ミコール酸含有リポソームの作製３）
　ミコール酸として、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ、ミコール酸のトレハロースジエステル）を用いたミコール酸含有リポソーム（以下、「ＴＤＭリポソーム」という場合がある。）を作製した。
　まず、ＢＣＧ（マイコバクテリウム・ボビス　ＢＣＧ　Ｔｏｋｙｏ　１７２株）、マイコバクテリウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｈｌｅｉ）、及びロドコッカス・テラエ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｅｒｒａｅ）の各菌を培養し、各菌体からそれぞれトレハロースジミコール酸を精製した。以下、各菌由来のトレハロースジミコール酸を、それぞれ、「ＢＣＧ－ＴＤＭ」、「Ｍ．ｐｈｌｅｉ－ＴＤＭ」、「Ｒ．ｔｅｒｒａｅ－ＴＤＭ」という場合がある。
　続いて、実験例３と同様にして、表９に示す組成で、製造例１４のリポソーム（以下、「ＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム」という場合がある。）、製造例１５のリポソーム（以下、「Ｍ．ｐｈｌｅｉ－ＴＤＭリポソーム」という場合がある。）及び製造例１６のリポソーム（以下、「Ｒ．ｔｅｒｒａｅ－ＴＤＭリポソーム」という場合がある。）を作製した。表９中、ＤＯＰＣはジオレオイルホスファチジルコリンを表す。カチオン性脂質としては、上記化学式（１）で表されるデンドロン脂質（型式「Ｄ２２」、ヒュギエイアバイオサイエンス社製）を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　続いて、分子特性評価装置（型式「ＺＥＮ３６００」、マルバーン社）を用いて、各ＴＤＭポソームの直径、多分散指数、ゼータ電位をそれぞれ測定した。その結果、ＴＤＭリポソームの直径、多分散指数、ゼータ電位は、それぞれ、実験例３で作製した製造例６のリポソームの各値と同程度であることが明らかとなった。
［実験例１５］
（マウス皮下腫瘍モデルによるミコール酸含有リポソームの抗腫瘍効果の検討５）
　実験例１３と同様のマウス皮下腫瘍モデルを用いて、実験例１４で作製した各ＴＤＭリポソームの抗腫瘍効果を検討した。
　ＴＤＭリポソームとしては、実験例１４で作製した、ＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム、Ｍ．ｐｈｌｅｉ－ＴＤＭリポソーム、Ｒ．ｔｅｒｒａｅ－ＴＤＭリポソームを、１匹１回の投与あたり０．４４ｍｇ使用した。また、比較のために、１匹１回の投与あたり、実験例５と同様にして作製した対照リポソームを０．５ｍｇ又はＰＢＳを０．１ｍＬ投与した群も用意した。
　図１５は、腫瘍体積を経時的に測定した結果を示すグラフである。図１５中、「ＰＢＳ」はＰＢＳ投与群の結果を示し、「対照」は対照リポソーム投与群の結果を示し、「ＢＣＧ」はＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム投与群の結果を示し、「ｐｈｌｅｉ」はＭ．ｐｈｌｅｉ－ＴＤＭリポソーム投与群の結果を示し、「ｔｅｒｒａ」はＲ．ｔｅｒｒａｅ－ＴＤＭリポソーム投与群の結果を示す。
　その結果、実験開始後１４日目において、ＰＢＳ投与群とＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム投与群との間で腫瘍体積に有意差が認められた（ｐ＝０．０４）。一方、ＰＢＳ投与群とＲ．ｔｅｒｒａｅ－ＴＤＭリポソーム投与群との間、ＰＢＳ投与群とＭ．ｐｈｌｅｉ－ＴＤＭリポソーム投与群との間には腫瘍抑制傾向は認められるものの有意差が認められなかった。
　また、実験開始後１８日目において、ＰＢＳ投与群とＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム投与群との間で腫瘍体積に有意差が認められた（ｐ＝０．０２）。また、対照リポソーム投与群とＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム投与群との間においても腫瘍体積に有意差が認められた（ｐ＝０．０２）。
　以上の結果、ＴＤＭリポソームも抗腫瘍効果を有することが明らかとなった。また、ミコール酸として、ＢＣＧ由来のトレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）を用いたリポソーム、マイコバクテリウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｈｌｅｉ）由来のＴＤＭを用いたリポソーム、ロドコッカス・テラエ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｅｒｒａｅ）由来のＴＤＭを用いたリポソームの中では、ＢＣＧ由来のＴＤＭを用いたリポソームが最も抗腫瘍効果が高いことが明らかとなった。
［実験例１６］
（ＴＤＭリポソームによるＭｉｎｃｌｅ依存的なサイトカイン産生の検討）
　Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　Ｃ－ｔｙｐｅ　ｌｅｃｔｉｎ（Ｍｉｎｃｌｅ）は、Ｃ型レクチン受容体の１種である。Ｍｉｎｃｌｅのリガンドとしては、損傷自己、真菌、結核菌由来のトレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）等が知られている。
　ＴＤＭが結合したＭｉｎｃｌｅは、ＦｃＲγ鎖と会合し、Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｍｏｔｉｆ（ＩＴＡＭ）を介して活性化シグナル伝達を行い、炎症性サイトカインの産生を誘導することが知られている。
　本実験例では、野生型マウス又はＭｉｎｃｌｅ－／－マウスから骨髄由来樹状細胞（ＢＤＭＣ）及び骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭ）を調製し、それぞれＴＤＭリポソームで活性化して炎症性サイトカインの産生が誘導されるか否かを検討した。炎症性サイトカインとしては、Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）の産生を検討した。
《骨髄由来樹状細胞（ＢＤＭＣ）の検討１》
　野生型マウス又はＭｉｎｃｌｅ－／－マウスから調製した骨髄由来樹状細胞（ＢＤＭＣ）を、それぞれ、９６ウェルプレートに、１×１０５個／ウェルの細胞密度で播種した。続いて、各細胞の培地に、実験例１４で作製したＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム又はＭ．ｐｈｌｅｉ－ＴＤＭリポソームをそれぞれ１００μｇ／ｍＬの終濃度となるように添加し、４８時間培養した。また、比較のために、実験例５と同様にして作製した対照リポソームを１００μｇ／ｍＬの終濃度となるように添加した群、及び何も添加しなかった群も用意した。続いて、ＥＬＩＳＡ法により培地中に放出されたＴＮＦの濃度を測定した。
　図１６（ａ）は培地中に放出されたＴＮＦの濃度を測定した結果を示すグラフである。図１６（ａ）中、「ＢＣＧ」はＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム添加群の結果を示し、「Ｍ．ｐｈｌｅｉ」はＭ．ｐｈｌｅｉ－ＴＤＭリポソーム添加群の結果を示し、「対照」は対照リポソーム添加群の結果を示し、「なし」は何も添加しなかった群の結果を示し、「ＷＴ」は野生型マウスの骨髄由来樹状細胞の結果を示し、「Ｍｉｎｃｌｅ－／－」はＭｉｎｃｌｅ－／－マウスの骨髄由来樹状細胞の結果を示す。
　その結果、野生型マウス由来の骨髄由来樹状細胞においては、ＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム又はＭ．ｐｈｌｅｉ－ＴＤＭリポソームの培地中への添加により、ＴＮＦの産生が誘導されたことが明らかとなった。
　一方、Ｍｉｎｃｌｅ－／－マウス由来の骨髄由来樹状細胞においては、ＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム又はＭ．ｐｈｌｅｉ－ＴＤＭリポソームを培地中に添加しても、ＴＮＦの産生誘導が認められなかった。
　この結果は、ＴＤＭリポソームの添加によるサイトカイン産生誘導がＭｉｎｃｌｅ依存的であることを示す。
《骨髄由来樹状細胞（ＢＤＭＣ）の検討２》
　実験例１４で作製したＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム及びＭ．ｐｈｌｅｉ－ＴＤＭリポソームを、９６ウェルプレートに、それぞれ０．３μｇ／ウェルとなるように添加してウェル表面をコートした。また、比較のために、実験例５と同様にして作製した対照リポソームを０．３μｇ／ウェルとなるようにコートした群、何もコートしなかった群、市販のＴＤＭ（ナカライテスク社）を１μｇ／ウェルでコートした群、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）を１０ｎｇ／ｍＬの終濃度で培地に添加した群も用意した。
　続いて、各ウェルに、野生型マウス又はＭｉｎｃｌｅ－／－マウスから調製した骨髄由来樹状細胞（ＢＤＭＣ）を、それぞれ１×１０５個／ウェルの細胞密度で播種し、４８時間培養した。続いて、ＥＬＩＳＡ法により培地中に放出されたＴＮＦの濃度を測定した。
　図１６（ｂ）～（ｄ）は培地中に放出されたＴＮＦの濃度を測定した結果を示すグラフである。図１６（ｂ）中、「ＢＣＧ」はＢＣＧ－ＴＤＭリポソームコート群の結果を示し、「Ｍ．ｐｈｌｅｉ」はＭ．ｐｈｌｅｉ－ＴＤＭリポソームコート群の結果を示し、「対照」は対照リポソームコート群の結果を示し、「なし」は何もコートしなかった群の結果を示す。また、図１６（ｃ）は、市販のＴＤＭをコートした群の結果を示す。また、図１６（ｄ）は、ＬＰＳを添加した群の結果を示す。また、図１６（ｂ）～（ｄ）中、「ＷＴ」は野生型マウスの骨髄由来樹状細胞の結果を示し、「Ｍｉｎｃｌｅ－／－」はＭｉｎｃｌｅ－／－マウスの骨髄由来樹状細胞の結果を示す。
　その結果、野生型マウス由来の骨髄由来樹状細胞においては、ＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム又はＭ．ｐｈｌｅｉ－ＴＤＭリポソームでウェルをコートすることにより、ＴＮＦの産生が誘導されたことが明らかとなった。一方、Ｍｉｎｃｌｅ－／－マウス由来の骨髄由来樹状細胞においては、ＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム又はＭ．ｐｈｌｅｉ－ＴＤＭリポソームでウェルをコートしても、ＴＮＦの産生誘導が認められなかった。
　この結果は、ＴＤＭリポソームによる骨髄由来樹状細胞のサイトカイン産生誘導がＭｉｎｃｌｅ依存的であることを更に支持するものである。
《骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭ）の検討》
　野生型マウス又はＭｉｎｃｌｅ－／－マウスから調製した骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭ）を、それぞれ、９６ウェルプレートに、１×１０５個／ウェルの細胞密度で播種した。続いて、各細胞の培地に、実験例１４で作製したＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム又はＭ．ｐｈｌｅｉ－ＴＤＭリポソームをそれぞれ１００μｇ／ｍＬの終濃度となるように添加し、４８時間培養した。また、比較のために、実験例５と同様にして作製した対照リポソームを１００μｇ／ｍＬの終濃度となるように添加した群、何も添加しなかった群、市販のＴＤＭ（ナカライテスク社）を１μｇ／ウェルでコートした群、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）を１０ｎｇ／ｍＬの終濃度で培地に添加した群も用意した。続いて、ＥＬＩＳＡ法により培地中に放出されたＴＮＦの濃度を測定した。
　図１７（ａ）～（ｃ）は培地中に放出されたＴＮＦの濃度を測定した結果を示すグラフである。図１７（ａ）中、「ＢＣＧ」はＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム添加群の結果を示し、「Ｍ．ｐｈｌｅｉ」はＭ．ｐｈｌｅｉ－ＴＤＭリポソーム添加群の結果を示し、「対照」は対照リポソーム添加群の結果を示し、「なし」は何も添加しなかった群の結果を示す。また、図１７（ｂ）は、市販のＴＤＭをコートした群の結果を示す。また、図１７（ｃ）は、ＬＰＳを添加した群の結果を示す。また、図１７（ａ）～（ｃ）中、「ＷＴ」は野生型マウスの骨髄由来マクロファージの結果を示し、「Ｍｉｎｃｌｅ－／－」はＭｉｎｃｌｅ－／－マウスの骨髄由来マクロファージの結果を示す。
　その結果、野生型マウス由来の骨髄由来マクロファージにおいては、ＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム又はＭ．ｐｈｌｅｉ－ＴＤＭリポソームの培地中への添加により、ＴＮＦの産生が誘導されたことが明らかとなった。一方、Ｍｉｎｃｌｅ－／－マウス由来の骨髄由来マクロファージにおいては、ＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム又はＭ．ｐｈｌｅｉ－ＴＤＭリポソームを培地中に添加しても、ＴＮＦの産生誘導が認められなかった。
　この結果は、ＴＤＭリポソームの添加による骨髄由来マクロファージのサイトカイン産生誘導がＭｉｎｃｌｅ依存的であることを示す。
［実験例１７］
（ＴＤＭリポソームの大量調製）
　表１０に示す組成で製造例１７のＴＤＭリポソームを工業的に大量調製した。ＴＤＭとしては、実験例１４で精製したＢＣＧ－ＴＤＭを使用した。具体的には、ＢＣＧ－ＴＤＭ　１５．０ｍｇ、コレステロール１５．０ｍｇ、カチオン性脂質（型式「Ｄ２２」、ヒュギエイアバイオサイエンス社）５．０ｍｇを秤量し、ガラスバイアルへ投入した。
　続いて、ＤＯＰＣ－クロロホルム溶液（２５ｍｇ／ｍＬ）５．４ｍＬを添加し、常温で充分に撹拌して脂質成分を溶解させた。続いて、減圧乾燥により、クロロホルムを除去した。続いて、ｔｅｒｔ－ブチルアルコールを３．０ｍＬ添加し、常温で撹拌して脂質成分を溶解させた。続いて、ＰＢＳ　１４ｍＬを添加し、５８℃のウォーターバスで加温・撹拌した。続いて、脂質成分の溶解を確認した後、室温まで冷却した。続いて、０．２μｍと０．１μｍのシリンジフィルターを通過させ、透析液をＰＢＳとして透析を行い、ｔｅｒｔ－ブチルアルコールを除去し、製造例１７のＴＤＭリポソームを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　続いて、分子特性評価装置（型式「ＺＥＴＡ　ＳＩＺＥＲ　Ｎａｎｏ－ＺＳ」、マルバーン社）を用いて、製造例１７のＴＤＭリポソームの直径、多分散指数、ゼータ電位をそれぞれ測定した。表１１に測定結果を示す。その結果、製造例１７のＴＤＭリポソームの直径、多分散指数、ゼータ電位は、それぞれ、実験例３で作製した製造例６のリポソームの各値と同程度であることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
［実験例１８］
（マウス皮下腫瘍モデルによるミコール酸含有リポソームの抗腫瘍効果の検討６）
　実験例７と同様のマウス皮下腫瘍モデルを用いて、実験例１７で作製した製造例１７のＴＤＭリポソームの抗腫瘍効果を検討した。
　製造例１７のＴＤＭリポソームは、１匹１回の投与あたり０．４４ｍｇ使用した。また、比較のために、１匹１回の投与あたり、実験例１４の製造例１４と同様にして作製したＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム（以下、「ＴＤＭ－Ｄ２２」という場合がある。）を０．４４ｍｇ、下記表１２に示す組成で、実験例１４と同様にして作製した製造例１８のＢＣＧ－ＴＤＭリポソーム（以下、「ＴＤＭ－Ｄ１２」という場合がある。）を０．４４ｍｇ、実験例５と同様にして作製した対照リポソームを０．５ｍｇ又はＰＢＳを０．１ｍＬ投与した群も用意した。下記表１２に、各リポソームの組成を示す。下記表１２中、「Ｄ２２」はデンドロン脂質（型式「Ｄ２２」、ヒュギエイアバイオサイエンス社製）を表し、「Ｄ１２」はデンドロン脂質（型式「Ｄ１２」、ヒュギエイアバイオサイエンス社製）を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　図１８は、腫瘍体積を経時的に測定した結果を示すグラフである。図１８中、「ＰＢＳ」はＰＢＳ投与群の結果を示し、「対照」は対照リポソーム投与群の結果を示し、「ＴＤＭ－Ｄ２２」は上述したＴＤＭ－Ｄ２２投与群の結果を示し、「ＴＤＭ－Ｄ１２」は上述したＴＤＭ－Ｄ１２投与群の結果を示し、「製造例１７」は製造例１７のＴＤＭリポソーム投与群の結果を示す。
　その結果、実験開始後２５日目において、ＰＢＳ投与群とＴＤＭ－Ｄ２２投与群との間で腫瘍体積に有意差が認められた（ｐ＝０．０２）。また、ＰＢＳ投与群、対照リポソーム投与群と比較して、製造例１７のＴＤＭリポソーム投与群において、腫瘍体積の減少傾向が認められた。
　以上の結果、製造例１７のＴＤＭリポソームが抗腫瘍効果を示すことが確認された。また、ＴＤＭリポソームにおいても、カチオン性脂質としてデンドロン脂質（型式「Ｄ２２」、ヒュギエイアバイオサイエンス社）を用いたほうが、カチオン性脂質としてデンドロン脂質（型式「Ｄ１２」、ヒュギエイアバイオサイエンス社）を用いた場合よりも抗腫瘍効果が高いことが明らかとなった。
　本発明によれば、ミコール酸を臨床応用する技術を提供することができる。

Claims (8)

  1. 　ミコール酸及びステロール化合物を含有するリポソーム。
  2. 　カチオン性脂質を更に含有する、請求項１に記載のリポソーム。
  3. 　前記ミコール酸がケトミコール酸を含む、請求項１又は２に記載のリポソーム。
  4. 　ゼータ電位がプラスである、請求項１～３のいずれか一項に記載のリポソーム。
  5. 　直径が２００ｎｍ以下である、請求項１～４のいずれか一項に記載のリポソーム。
  6. 　多分散指数が０．３以下である、請求項１～５のいずれか一項に記載のリポソーム。
  7. 　請求項１～６のいずれか一項に記載のリポソームを有効成分とする抗癌剤。
  8. 　請求項７に記載の抗癌剤と免疫チェックポイント阻害剤とを備える、癌治療用キット。
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