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WO2018155607A1 - 細胞処理装置、浮遊培養器、及び幹細胞の誘導方法 - Google Patents

細胞処理装置、浮遊培養器、及び幹細胞の誘導方法 Download PDF

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WO2018155607A1
WO2018155607A1 PCT/JP2018/006613 JP2018006613W WO2018155607A1 WO 2018155607 A1 WO2018155607 A1 WO 2018155607A1 JP 2018006613 W JP2018006613 W JP 2018006613W WO 2018155607 A1 WO2018155607 A1 WO 2018155607A1
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WO
WIPO (PCT)
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medium
cell
container
cells
suspension
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2018/006613
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
剛士 田邊
健太 須藤
亮二 平出
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
I Peace Inc
Original Assignee
I Peace Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by I Peace Inc filed Critical I Peace Inc
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Priority to JP2019501821A priority patent/JP6998018B2/ja
Priority to EP18758459.4A priority patent/EP3587556A4/en
Priority to US16/485,146 priority patent/US20200040297A1/en
Publication of WO2018155607A1 publication Critical patent/WO2018155607A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/36—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of biomass, e.g. colony counters or by turbidity measurements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to a cell technology, and relates to a cell treatment device, a suspension culture device, and a stem cell induction method.
  • Embryonic stem cells are stem cells established from early embryos of humans and mice. ES cells have pluripotency capable of differentiating into all cells present in a living body. Currently, human ES cells are available for cell transplantation therapy for many diseases such as Parkinson's disease, juvenile diabetes, and leukemia. However, there are obstacles to transplantation of ES cells. In particular, transplantation of ES cells can elicit immune rejection similar to the rejection that occurs following unsuccessful organ transplantation. In addition, there are many criticisms and objections from the ethical point of view regarding the use of ES cells established by destroying human embryos.
  • iPS pluripotent stem cells
  • An object of the present invention is to provide a cell treatment device, a suspension culture device, and a stem cell induction method.
  • a factor introduction apparatus for producing an inducer-introduced cell by introducing a pluripotency inducer into cells, and a suspension culture for subjecting the inducer-introduced cell produced by the factor introduction apparatus to suspension culture
  • a cell processing apparatus comprising: a vessel.
  • the inducer-introduced cells may be initialized in a suspension culture device.
  • the inducer-introduced cells may be initialized and expanded in a suspension incubator.
  • the suspension incubator includes a semipermeable membrane in which the inducer-introduced cells and the medium are placed, a container in which the semipermeable membrane is placed, and a medium is placed around the semipermeable membrane, and the medium in the container And a drive device for stirring.
  • the semipermeable membrane has, for example, a tube shape.
  • a stirring member may be provided in the container.
  • the driving device may rotate the stirring member via magnetic force.
  • the suspension incubator is a semipermeable membrane in which the inducer-introduced cells and the medium are placed, and a container in which the semipermeable membrane is placed and the medium is placed around the semipermeable membrane, You may provide the container provided with the helical groove
  • the induced factor-introduced cells produced by the factor-introducing apparatus may be sent into the semipermeable membrane of the suspension incubator.
  • the suspension incubator includes a semipermeable membrane in which a medium is placed, a container in which a semipermeable membrane is placed, an inducing factor-introduced cell and a medium are placed around the semipermeable membrane, and a semipermeable membrane And a pump for supplying the medium into the semipermeable membrane so that a liquid flow of the medium is generated.
  • the induced factor-introduced cells produced by the factor introduction apparatus may be sent outside the semipermeable membrane in the container.
  • the suspension incubator may include a container in which the inducer-introduced cells and the medium are placed, and a driving device for stirring the medium in the container.
  • a stirring member may be provided in the container.
  • the driving device may rotate the stirring member via magnetic force.
  • the suspension incubator is a container in which the inducer-introduced cells and the medium are placed, the container having a spiral groove on the inner surface, and the medium along the groove in the container. And a pump for supplying the culture medium into the container so as to flow.
  • the induced factor-introduced cells produced by the factor-introducing apparatus may be sent into a container of a suspension incubator.
  • the medium may be a liquid medium.
  • the medium may be a gel medium.
  • a semipermeable membrane in which cells and a medium are placed a container in which the semipermeable membrane is placed, and a medium is placed around the semipermeable membrane, and a stirring member provided in the container, A suspension incubator is provided.
  • a drive device for stirring the medium in the container may be further provided.
  • the driving device may rotate the stirring member via magnetic force.
  • a semipermeable membrane in which cells and a medium are placed a container in which the semipermeable membrane is placed, and a medium is placed around the semipermeable membrane, the spiral groove on the inner surface
  • a container provided with a suspension incubator a container provided with a suspension incubator.
  • the above-mentioned floating incubator may further include a pump for supplying the medium into the container so that the medium flows along the groove in the container.
  • a floating incubator provided with a container in which cells and a medium are placed, and a container having a spiral groove on the inner surface.
  • the above-mentioned floating incubator may further include a pump for supplying the medium into the container so that the medium flows along the groove in the container.
  • a floating incubator comprising: a semipermeable membrane in which a medium is placed; and a container in which the semipermeable membrane is placed and cells and the medium are placed around the semipermeable membrane.
  • a pump for supplying the medium into the semipermeable membrane may be further provided so that a liquid flow of the medium is generated in the semipermeable membrane.
  • the medium may be a liquid medium.
  • the medium may be a gel medium.
  • introducing an pluripotency inducer into a cell to produce an inducer-introduced cell initializing the inducer-introduced cell by subjecting the inducer-introduced cell to suspension culture, A method for inducing stem cells is provided.
  • the suspension culture may be agitation culture.
  • a liquid medium may be used when the inducer-introduced cells are cultured in suspension.
  • a gel medium may be used when suspension-inducing the inducer-introduced cells.
  • the method includes introducing an inducer into a cell to produce an inducer-introduced cell, and inducing a desired somatic cell by suspension culture of the inducer-introduced cell.
  • a method for inducing cells is provided.
  • the suspension culture may be agitation culture.
  • a liquid medium may be used when the inducer-introduced cells are cultured in suspension.
  • a gel medium may be used when the inducer-introduced cells are cultured in suspension.
  • the present invention it is possible to provide a cell treatment device, a suspension culture device, and a stem cell induction method.
  • FIG. 2 is a photomicrograph of an induced cell mass according to Example 1.
  • 2 is a dot plot obtained by FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) according to Example 1.
  • FIG. 2 is a photomicrograph of induced cells according to Example 1.
  • 4 is a micrograph of an induced cell mass according to Example 2.
  • 6 is a dot plot obtained by FACS according to Example 2.
  • 4 is a micrograph of induced cells according to Example 2.
  • Example 4 is a micrograph of an induced cell mass according to Example 3. 6 is a graph showing the number of cell clusters according to Example 3. 4 is a photomicrograph of cells induced and cultured using a dialysis tube according to Example 3. It is a microscope picture of the cell induced-cultured without using the dialysis tube concerning Example 3.
  • the cell treatment apparatus includes a factor introduction apparatus 30 that introduces a pluripotency inducer into a cell to produce an inducer-introduced cell, and an inducer produced by the factor introduction apparatus 30.
  • An initialization suspension incubator for culturing the introduced cells; and an expansion suspension incubator for expanding and culturing a plurality of cell clusters composed of stem cells established in the initialization suspension incubator.
  • the initialization suspension culture device and the expansion suspension culture device are not provided separately, and the induction factor-introduced cells may be cultured in the same suspension culture device to induce stem cells.
  • the cell treatment device may include, for example, a separation device 10 that separates cells from blood and a pre-introduction cell liquid supply path 20 through which a solution containing cells separated by the separation device 10 passes.
  • the pre-introduction cell liquid supply path 20 is connected to the factor introduction apparatus 30.
  • the cell processing apparatus may include an inducing factor liquid feeding mechanism 21 that sends a pluripotency inducer into the pre-introduction cell liquid feeding path 20 or the factor introduction apparatus 30.
  • the initialization suspension incubator and the expansion suspension incubator constitute at least a part of the cell mass production apparatus 40 that cultivates induction factor-introduced cells to produce a plurality of cell souls composed of stem cells.
  • the cell processing apparatus may include a packaging apparatus 100 that sequentially packages each of a plurality of cell clusters.
  • the separation device 10 receives, for example, a vial containing human blood.
  • the separation device 10 includes an anticoagulant tank for storing an anticoagulant such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), heparin, and biological preparation reference blood preservation solution A (ACD-A solution, Terumo Corporation). I have.
  • the separation device 10 adds an anticoagulant to human blood from an anticoagulant tank using a pump or the like.
  • the separation apparatus 10 includes a separation reagent tank that stores a mononuclear cell separation reagent such as Ficoll-Paque PREMIUM (registered trademark, GE Healthcare Japan Co., Ltd.).
  • the separation apparatus 10 dispenses 5 mL of the mononuclear cell separation reagent from the separation reagent tank into, for example, two 15 mL tubes using a pump or the like.
  • a resin bag may be used instead of the tube.
  • the separation apparatus 10 includes a buffer solution tank for storing a buffer solution such as phosphate buffered saline (PBS).
  • the separation device 10 is diluted by adding 5 mL of buffer solution from a buffer solution tank to, for example, 5 mL of human blood using a pump or the like.
  • the separating apparatus 10 adds 5 mL of diluted human blood on a mononuclear cell separation reagent in a tube using a pump or the like.
  • the separation device 10 further includes a centrifuge capable of setting the temperature.
  • the centrifuge is set at 18 ° C., for example.
  • the separation device 10 uses a moving device or the like to place a tube containing a mononuclear cell separation reagent and human blood into a centrifuge holder.
  • the centrifuge centrifuges the solution in the tube at, for example, 400 ⁇ g for 30 minutes. Instead of the tube, the resin bag may be centrifuged.
  • the separation apparatus 10 collects a white turbid intermediate layer of mononuclear cells in the solution in a tube with a pump or the like.
  • the separation apparatus 10 sends out the recovered mononuclear cell suspension to the pre-introduction cell liquid supply path 20 using a pump or the like.
  • the separation apparatus 10 further adds, for example, 12 mL of PBS to 2 mL of the recovered mononuclear cell solution, and puts the tube into a centrifuge holder. The centrifuge centrifuges the solution in the tube at, for example, 200 ⁇ g for 10 minutes.
  • the separation apparatus 10 uses a pump or the like to aspirate and remove the supernatant of the solution in the tube, and 3 mL of mononuclear cell medium such as X-VIVO 10 (registered trademark, Lonza Japan Co., Ltd.) is removed. Suspend in addition to the mononuclear cell solution in the tube.
  • the separation apparatus 10 sends out the mononuclear cell suspension to the pre-introduction cell liquid supply path 20 using a pump or the like.
  • the separation device 10 may separate mononuclear cells from blood using a dialysis membrane. Further, when using somatic cells such as fibroblasts previously separated from the skin or the like, the separating device 10 is not necessary.
  • Separation device 10 may separate cells suitable for induction by a method other than centrifugation.
  • the cells to be separated are T cells, cells that are positive for CD3, CD4, or CD8 may be separated by panning.
  • cells to be separated are vascular endothelial progenitor cells, cells that are positive for CD34 may be separated by panning.
  • cells to be separated are B cells, cells that are positive for any of CD10, CD19, and CD20 may be separated by panning.
  • cells suitable for induction are not limited to blood-derived cells.
  • the induction factor feeding mechanism 21 includes an induction factor introduction reagent tank for storing an induction factor introduction reagent solution and the like.
  • the induction factor introduction reagent solution such as a gene introduction reagent solution includes, for example, an electroporation solution such as a Human T Cell Nucleofector (registered trademark, Lonza Japan Co., Ltd.) solution, a supplement solution, and a plasmid set.
  • the plasmid set includes, for example, 0.83 ⁇ g of pCXLE-hOCT3 / 4-shp53-F, 0.83 ⁇ g of pCXLE-hSK, 0.83 ⁇ g of pCE-hUL, and 0.5 ⁇ g of pCXWB-EBNA1.
  • the inducing factor feeding mechanism 21 uses a micropump or the like to transfer the inducing factor introduction reagent solution to the cell feeding path 20 before introduction so that the mononuclear cell suspension is suspended in the inducing factor introduction reagent solution. To send.
  • the inner wall of the pre-introduction cell liquid supply path 20 may be coated with poly-HEMA (poly 2-hydroxyethyl methacrylate) so that cells do not adhere to make it non-adhesive.
  • poly-HEMA poly 2-hydroxyethyl methacrylate
  • a material in which cells are difficult to adhere may be used as the material of the cell feeding path 20 before introduction.
  • the conditions in the cell feeding path 20 before introduction are set such that the ambient temperature and the carbon dioxide concentration become equivalent.
  • the pre-introduction cell liquid supply path 20 may be provided with a backflow prevention valve from the viewpoint of preventing contamination.
  • the factor introduction device 30 connected to the cell feeding path 20 before introduction is, for example, an electroporator, which receives a mixed solution of the inducer introduction reagent solution and the mononuclear cell suspension, Perform electroporation of the plasmid. After the electroporation is performed, the factor introduction apparatus 30 adds the mononuclear cell culture medium to the solution containing the mononuclear cells electroporated with the plasmid.
  • the factor introduction device 30 uses a pump or the like to send a solution containing mononuclear cells electroporated with a plasmid (hereinafter referred to as “induction factor introduction cells”) to the introduction cell liquid supply path 31.
  • the factor introduction device 30 is not limited to an electroporator.
  • the factor introduction device 30 may introduce RNA encoding the reprogramming factor into cells by the lipofection method.
  • the lipofection method is a method in which a complex of a negatively charged nucleic acid and a positively charged lipid is formed by electrical interaction, and the complex is taken into the cell by endocytosis or membrane fusion. .
  • the lipofection method has advantages such as little damage to cells, excellent introduction efficiency, simple operation, and less time.
  • Reprogramming factor RNAs as pluripotency inducers include, for example, OCT3 / 4 mRNA, SOX2 mRNA, KLF4 mRNA, and c-MYC mRNA.
  • gene symbol is described in humans here, it is not intended to limit the species by capital letter / lower case notation. For example, all capital letters do not exclude the inclusion of mouse or rat genes. However, in the examples, gene symbols are written according to the biological species actually used.
  • RNA lipofection reagent for example, a small interfering RNA (siRNA) or a lipofection reagent is used.
  • siRNA lipofection reagents siRNA lipofection reagents and mRNA lipofection reagents can be used.
  • Lipofectamine registered trademark
  • RNAiMAX Thermo Fisher Scientific
  • Lipofectamine registered trademark
  • MessengerMAX ThermoFisher Scientific 3 registered trademark, Lipofect3 registered trademark, Lipofect3 registered trademark
  • NeonTransfection System Thermo Fisher scientific
  • Stemfect RNA transfection reagent Stemfect
  • NextFect registered trademark
  • RNA Transfection Reagent BiooScientific
  • the factor introduction apparatus 30 introduces the reprogramming factor into the cell by the lipofection method, the reprogramming factor RNA, the reagent, and the like are sent out to the pre-introduction cell liquid feeding path 20 by the induction factor liquid feeding mechanism 21.
  • the inner wall of the introduced cell liquid supply path 31 may be coated with poly-HEMA so that cells do not adhere to be non-adhesive.
  • a material in which cells are difficult to adhere may be used as the material of the introduced cell liquid supply path 31.
  • the conditions in the introduced cell liquid supply path 31 are controlled in the surrounding temperature and carbon dioxide concentration.
  • the introduction cell liquid supply path 31 may be provided with a backflow prevention valve from the viewpoint of preventing contamination.
  • many cells may die and a cell mass of dead cells may be formed.
  • a filter for removing dead cell mass may be provided in the introduced cell liquid supply path 31.
  • one or a plurality of wrinkles that change the inner diameter intermittently may be provided inside the introduced cell liquid supply path 31.
  • the inner diameter of the introduced cell liquid supply path 31 may be changed intermittently.
  • the cell mass production apparatus 40 connected to the introduction cell liquid supply path 31 includes an initialization culture apparatus 50 that cultures the induced factor introduction cells produced by the factor introduction apparatus 30, and an initialization culture apparatus.
  • a first dividing mechanism 60 that divides a cell mass (cell colony) composed of stem cells established in 50 into a plurality of cell masses, and an expansion culture that expands and cultures the plurality of cell masses divided by the first dividing mechanism 60
  • a device 70, a second dividing mechanism 80 that divides a cell mass composed of stem cells expanded and cultured in the expansion culture device 70 into a plurality of cell masses, and a cell soul transport mechanism 90 that sequentially sends a plurality of cell souls to the package device 100. And comprising.
  • the initialization culture apparatus 50 includes, for example, the initialization suspension incubator shown in FIGS.
  • the initialization suspension incubator is a dialysis tube 75 in which inducer-introduced cells and a medium are placed, a container 76 in which a dialysis tube 75 is placed and a medium is placed around the dialysis tube 75, and the medium in the container 76 is agitated. And a driving device 74.
  • the dialysis tube 75 is made of a semipermeable membrane, and allows, for example, a ROCK inhibitor to pass therethrough.
  • the fractional molecular weight of the dialysis tube 75 is 0.1 KDa or more, 10 KDa or more, or 50 KDa or more.
  • the dialysis tube 75 includes, for example, cellulose ester, ethyl cellulose, cellulose esters, regenerated cellulose, polysulfone, polyacrylonitrile, polymethyl methacrylate, ethylene vinyl alcohol copolymer, polyester polymer alloy, polycarbonate, polyamide, cellulose acetate, cellulose diester. It consists of acetate, cellulose triacetate, copper ammonium rayon, saponified cellulose, hemophane film, phosphatidylcholine film, and vitamin E coating film.
  • the container 76 has, for example, a cylindrical shape, but is not limited thereto.
  • the side wall of the container 76 is made of a transparent material such as polypropylene or glass, for example.
  • the container 76 may be carbon dioxide permeable. G-Rex (registered trademark, Wilson Wolf) can be used as the carbon dioxide permeable container 76.
  • the inducer-introduced cells are placed in the dialysis tube 75.
  • the dialysis tube 75 may be connected to a liquid supply path for supplying a medium containing cells into the dialysis tube 75.
  • the dialysis tube 75 may be connected to a liquid supply path for supplying a medium containing cells in the dialysis tube 75 to the outside of the container.
  • the medium placed in the container 76 and the dialysis tube 75 is, for example, a blood cell medium or a stem cell medium.
  • a blood cell medium may be used at the beginning of initialization culture, and a stem cell medium may be used thereafter.
  • a medium for stem cells for example, human ES / iPS medium such as Primate ES Cell Medium (ReproCELL) can be used.
  • the medium for stem cells is not limited to this, and various stem cell culture media can be used.
  • Primate ES Cell Medium Reprostem, ReproFF, ReproFF2, ReproXF (Reprocell), mTeSR1, TeSR2, TeSRE8, ReproTeSR (STEMCELL Technologies), and PruriSTM (registered trademark).
  • the medium may be a liquid medium that is not a gel medium, or a gel medium.
  • the gel medium is gellan gum, deacylated gellan gum, hyaluronic acid, rhamzan gum, diyutan gum, xanthan gum, carrageenan, fucoidan, pectin, pectinic acid, pectinic acid, heparan sulfate, heparin, heparitin sulfate, It may contain at least one polymer compound selected from the group consisting of keratosulfuric acid, chondroitin sulfate, deltaman sulfate, rhamnan sulfate, and salts thereof.
  • the gel culture medium may contain methylcellulose. By containing methylcellulose, aggregation between cells is further suppressed.
  • the gel medium can be poly (glycerol monomethacrylate) (PGMA), poly (2-hydroxypropyl methacrylate) (PHPMA), Poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM), amine terminated, carboxylic acid terminated, maleimide terminated, N-hydroxysuccinimide ( NHS) ester terminated, triethoxysilane terminated, Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylamide), Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid), Poly (N-isopropylacrylamide-co-butylacrylate), Poly (N-isopropylacrylamide-co- It may contain a small number of temperature sensitive gels selected from methacrylic acid, Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid-co-octadecyl acrylate), and N-isopropylacrylamide.
  • PGMA poly (glycerol monomethacrylate)
  • a stirring member 271 is provided on the bottom surface of the container 76, for example.
  • the shape of the stirring member 271 is arbitrary and may be a rod shape or a plate shape provided with stirring blades.
  • the stirring member 271 may include a metal that receives a magnetic force.
  • the drive device 74 rotates the stirring member 271 in the container 76 through, for example, magnetic force.
  • the culture medium in the container 76 is stirred, and the cells in the dialysis tube 75 are suspended and cultured.
  • the medium outside the dialysis tube 75 in the container 76 is mainly stirred.
  • the flow rate of the medium in the dialysis tube 75 is slower than the flow rate of the medium outside the dialysis tube 75 in the container 76, or the medium in the dialysis tube 75 hardly flows.
  • iPS cells may collide randomly and combine to form cell clusters (colony) of various sizes. Therefore, the homogeneity between colonies may not be maintained. Furthermore, in a colony that is too large, nutrients and growth factors do not reach the inside of the colony, and differentiation or cell death may occur from the inside. On the other hand, colonies that are too small may not be suitable for subculture. On the other hand, in the dialysis tube 75, the flow rate of the medium is slow or the medium does not flow, so the frequency of collision between cells is low. Therefore, it is possible to maintain clonality in the colony. Therefore, for example, when the stem cell is an iPS cell, it is possible to ensure the clonality of one somatic cell-derived iPS cell. In addition, since the frequency with which the stem cells collide with each other is low, the size of the stem cell colony can be kept uniform.
  • the medium placed in the dialysis tube 75 may not contain a ROCK inhibitor.
  • the ROCK inhibitor has a final concentration of 1000 ⁇ mol / L or more and 0.1 ⁇ mol / L or less, 100 ⁇ mol / L or more and 1 ⁇ mol / L or less, or 5 ⁇ mol / L or more. Add every day to 20 ⁇ mol / L or less.
  • the medium may or may not contain a growth factor such as basic fibroblast growth factor (bFGF) or TGF- ⁇ .
  • a growth factor such as basic fibroblast growth factor (bFGF) or TGF- ⁇ .
  • the medium around the dialysis tube 75 in the container 76 is replaced. It should be noted that exchanging the medium includes partially replacing the medium and supplementing the medium. In this case, the medium may not be replenished in the dialysis tube 75. Alternatively, the medium is supplied into the dialysis tube 75 while the cells are suspended in the dialysis tube 75. In this case, it is not necessary to replenish the medium around the dialysis tube 75 in the container 76.
  • the initialization suspension incubator may include a pH sensor that measures the hydrogen ion index (pH) of the medium around the dialysis tube 75.
  • the cell treatment apparatus replaces or replenishes the medium around the dialysis tube 75 in the container 76 of the initialized suspension culture apparatus, using a replenishing medium feeding pump as a medium replenishing apparatus.
  • a replenishing medium feeding pump As the supplement medium feeding pump, a pump used for infusion can be used.
  • the supplemental medium feeding pump and the container 76 of the initialization suspension incubator are connected by a feeding tube.
  • the replenishing medium feeding pump feeds the medium into the container 76 of the initialization floating incubator through the feeding tube.
  • a waste liquid tube is connected to the container 76 of the initialization suspension incubator.
  • the medium in the container 76 of the initialization suspension incubator is discharged through the waste liquid tube.
  • the medium in the container 76 of the initialization floating incubator may be discharged, for example, by the pressure of a fresh medium supplied by a supplemented medium feeding pump, may be discharged using gravity, or may be discharged. It may be discharged by a pump.
  • the temperature of the medium fed from the supplemented medium feeding pump to the initialization suspension incubator is set, for example, so that the temperature of the medium in the initialization suspension incubator does not change rapidly.
  • the temperature of the medium fed to the initialization suspension incubator is also set to 37 ° C.
  • the medium before being sent to the initialization suspension incubator may be refrigerated at a low temperature such as 4 ° C. in the refrigerated storage unit.
  • the amount of the medium fed into the container 76 of the initialization floating incubator by the supplemented medium feeding pump is the same as the amount of the medium discharged from the container 76 of the initialization floating incubator.
  • the supplemental medium feed pump is controlled.
  • the supplemental medium feeding pump may always feed the medium into the container 76 of the initialization floating incubator, or may feed the medium at an appropriate interval.
  • the flow rate of the fed medium may or may not be constant.
  • the culture medium and the cell mass in the culture medium may be monitored with an imaging device, and the flow rate of the fed medium may be increased or decreased depending on the state of the culture medium and the cell mass in the culture medium.
  • the medium feeding may be started and stopped according to the state of the medium and the cell mass in the medium without always feeding the medium.
  • the flow rate of the fed medium may be increased or decreased according to the state of the medium and the cell mass in the medium.
  • the flow rate of the medium sent to the initialized suspension incubator is set so that the cells are not damaged.
  • the waste medium is removed from the initialized floating culture vessel by feeding fresh medium into the initialized floating culture vessel with the supplemented medium feeding pump and discharging the old medium from the initialized floating culture vessel.
  • the pH in the medium within an appropriate range and supply components necessary for cell culture. Thereby, it is possible to keep the state of a culture medium in a state near constant.
  • the supplementary medium feeding pump and the container 76 of the initialization floating incubator may be connected by a liquid feeding tube, or dialysis in the supplementary medium feeding pump and the container 76 of the initialization floating incubator
  • the inside of the tube 75 may be connected by a liquid feeding tube.
  • the structure of the initialization suspension incubator is not limited to the structure shown in FIGS.
  • the initialization suspension incubator shown in FIGS. 7 and 8 includes a dialysis tube 75 in which inducer-introduced cells and a medium are placed, and a container 76 in which the dialysis tube 75 is placed and the culture medium is placed around the dialysis tube 75.
  • a container 76 having a spiral groove 272 on the inner surface and a pump for supplying the medium into the container 76 so that the medium flows along the groove 272 in the container 76 are provided.
  • a first communication hole 273 communicating with the inside and outside of the container 76 is provided in the upper part of the container 76 of the initialization suspension incubator, and a second communication hole 274 communicating with the inside and outside of the container 76 is provided at the lower part of the container 76.
  • a culture medium is introduced into the container 76 from the first communication hole 273, and the introduced culture medium is guided to the lower part of the container 76 while generating a rotational flow along the groove 272, and then from the second communication hole 274.
  • the liquid is discharged out of the container 76.
  • the culture medium discharged from the second communication hole 274 may be introduced into the container 76 from the first communication hole 273 again through the circulation path.
  • the culture medium is introduced into the container 76 from the second communication hole 274, and the introduced culture medium is guided to the upper part of the container 76 while generating a rotational flow along the groove 272, and is transmitted from the first communication hole 273. , It may be discharged out of the container 76.
  • the medium discharged from the first communication hole 273 may be introduced again into the container 76 from the second communication hole 274 via a circulation path.
  • the spiral groove 272 may be provided directly on the inner wall of the container 76, or a member provided with a spiral groove may be disposed on the inner wall of the container 76.
  • the initialization suspension incubator shown in FIGS. 9 and 10 includes a dialysis tube 75 in which inducer-introduced cells and a medium are placed, a container in which the dialysis tube 75 is placed and the culture medium is placed around the dialysis tube 75. 76 and a pump for supplying a medium into the dialysis tube 75 so that a liquid flow is generated in the dialysis tube 75.
  • a first communication hole 275 communicating with the inside and outside of the dialysis tube 75 is provided in the upper part of the dialysis tube 75 of the initialization suspension incubator, and a second communication hole communicating with the inside and outside of the dialysis tube 75 is provided below the dialysis tube 75.
  • the communication hole 276 is provided.
  • a culture medium is introduced into the dialysis tube 75 from the first communication hole 275, the introduced culture medium is guided to the lower part of the dialysis tube 75, and is discharged out of the dialysis tube 75 from the second communication hole 276.
  • the medium discharged from the second communication hole 276 may be introduced again into the dialysis tube 75 from the first communication hole 275 via a circulation path.
  • the culture medium is introduced into the dialysis tube 75 from the second communication hole 276, and the introduced culture medium is guided to the upper part of the dialysis tube 75 and discharged from the first communication hole 275 to the outside of the dialysis tube 75. Also good.
  • the medium discharged from the first communication hole 275 may be reintroduced into the dialysis tube 75 from the second communication hole 276 via a circulation path.
  • the initialization suspension incubator provided with a dialysis tube has been described. However, as shown in FIG. 11 and FIG. 12, the initialization suspension incubator does not have to have a dialysis tube. In this case, the cells are stirred and suspended in the container 76.
  • the cell treatment apparatus may further include an initialization culture imaging apparatus such as a photographic camera or a video camera for imaging culture in the initialization culture apparatus 50 shown in FIG.
  • an initialization culture imaging apparatus such as a photographic camera or a video camera for imaging culture in the initialization culture apparatus 50 shown in FIG.
  • a colorless medium is used as the medium used in the initialization culture apparatus 50
  • a pH indicator such as phenol red
  • the cell processing apparatus captures the induced cells by photographing the cells in the initialization culture apparatus 50. You may further provide the guidance state monitoring apparatus which calculates a ratio.
  • the induced state monitoring device may specify the ratio of induced cells by antibody immunostaining or RNA extraction.
  • the cell treatment apparatus may include an uninduced cell removal apparatus that removes uninduced cells by a magnetic cell separation method, flow cytometry, or the like.
  • a first cell mass feeding channel 51 is connected to the initialization culture apparatus 50.
  • the initialization culture apparatus 50 sends the cell mass-containing liquid to the first cell mass feeding path 51 using a pump or the like.
  • the first cell mass feeding channel 51 has an inner diameter through which only induced cells having a size smaller than a predetermined size are passed, and is connected to a branch channel that removes non-induced cells having a size larger than a predetermined size. It may be.
  • the pump that sends the solution containing the cell mass to the first cell mass feeding channel 51 may be driven, for example, when the value of the size of the cell mass becomes a predetermined threshold value or more.
  • the pump which sends the solution containing a cell clump to the 1st cell clump liquid supply path 51 may be driven, for example, when the value of the density of a cell clump becomes more than a predetermined threshold.
  • the inner wall of the first cell mass feeding channel 51 may be coated with poly-HEMA so that cells do not adhere to make it non-adhesive.
  • a material in which cells are difficult to adhere may be used as the material of the first cell mass feeding channel 51.
  • the conditions in the first cell mass feeding channel 51 are controlled at the ambient controlled temperature. And equivalent to the carbon dioxide concentration.
  • the back flow prevention valve may be provided in the 1st cell mass liquid supply path 51 from a viewpoint of contamination prevention.
  • the first cell mass feeding channel 51 is connected to the first dividing mechanism 60.
  • the first dividing mechanism 60 includes, for example, a mesh. When the cell mass contained in the solution passes through the mesh by water pressure, it is divided into a plurality of cell masses having the size of each hole of the mesh. For example, if the size of each hole of the mesh is uniform, the size of the plurality of cell clusters after the division is also substantially uniform.
  • the first dividing mechanism 60 may include a nozzle. For example, by finely processing the inside of a substantially conical nozzle in a stepped manner, the cell mass contained in the solution is divided into a plurality of cell masses when passing through the nozzle.
  • An expansion culture device 70 is connected to the first dividing mechanism 60.
  • the solution containing the cell mass divided by the first division mechanism 60 is sent to the expansion culture device 70.
  • the expansion culture apparatus 70 may use an expansion suspension incubator having the same structure as the initialization suspension incubator as shown in FIGS. Also in the expansion culture apparatus 70, a plurality of cell masses are put in the dialysis tube 75 of the suspension culture apparatus shown in FIGS. In the expansion culture apparatus 70, the medium around the dialysis tube 75 in the container 76 is exchanged or replenished using a supplement medium feeding pump. Alternatively, the replenishing medium feeding pump and the inside of the dialysis tube 75 in the container 76 of the floating incubator are connected by a feeding tube to replenish the medium in the dialysis tube 75 with components necessary for cell culture. Also good.
  • the expansion culture apparatus 70 may use an expansion suspension culture apparatus having the same structure as that of the initialization suspension culture apparatus as shown in FIGS. In this case, a plurality of cell masses are placed in the container 76.
  • the cell processing apparatus may further include an expansion culture imaging apparatus that images culture in the expansion culture apparatus 70 shown in FIG.
  • an expansion culture imaging apparatus that images culture in the expansion culture apparatus 70 shown in FIG.
  • a colorless culture medium is used as the culture medium used in the expansion culture apparatus 70
  • a pH indicator such as phenol red may be included.
  • the cell processing apparatus captures the ratio of the induced cells by photographing the cells in the expansion culture apparatus 70.
  • a guidance state monitoring device for calculating.
  • the induced state monitoring device may specify the ratio of induced cells by antibody immunostaining or RNA extraction.
  • the cell treatment apparatus may include an uninduced cell removal apparatus that removes uninduced cells by a magnetic cell separation method, flow cytometry, or the like.
  • the expansion culture device 70 sends the solution containing the cell mass to the first division mechanism 60 via the expansion culture liquid supply path 71.
  • the cell mass divided by the first division mechanism 60 is cultured again in the expansion culture device 70.
  • the division of the cell mass in the first division mechanism 60 and the culture of the cell mass in the expansion culture device 70 are repeated until the necessary amount of cells is obtained.
  • the pump that sends the solution containing the cell mass in the expansion culture apparatus 70 to the first dividing mechanism 60 via the expansion culture liquid supply path 71 has, for example, a value of the size of the cell mass equal to or greater than a predetermined threshold value. If so, it may be driven. Or the pump which sends the solution containing a cell clump to the 1st cell clump liquid supply path 51 may be driven, for example, when the value of the density of a cell clump becomes more than a predetermined threshold.
  • a second cell mass feeding path 72 is connected to the expansion culture device 70.
  • the expansion culture device 70 sends out the expanded cell mass-containing liquid to the second cell mass feeding path 72 using a pump or the like.
  • the second cell mass feeding path 72 has an inner diameter through which only induced cells having a size less than a predetermined size are passed, and is connected to a branch flow path for removing uninduced cells having a size greater than or equal to a predetermined size. Also good.
  • the inner wall of the second cell mass feeding path 72 may be coated with poly-HEMA so that cells do not adhere to make it non-adhesive.
  • a material in which cells are difficult to adhere may be used as the material of the second cell mass feeding path 72.
  • the conditions in the second cell mass feeding channel 72 can be controlled at the ambient controlled temperature. And equivalent to the carbon dioxide concentration.
  • a backflow prevention valve may be provided in the second cell mass feeding path 72 from the viewpoint of preventing contamination.
  • the second cell mass feeding path 72 is connected to the second dividing mechanism 80.
  • the second dividing mechanism 80 includes, for example, a mesh. When the cell mass contained in the solution passes through the mesh by water pressure, it is divided into a plurality of cell masses having the size of each hole of the mesh. For example, if the size of each hole of the mesh is uniform, the size of the plurality of cell clusters after the division is also substantially uniform.
  • the second dividing mechanism 80 may include a nozzle. For example, by finely processing the inside of a substantially conical nozzle in a stepped manner, the cell mass contained in the solution is divided into a plurality of cell masses when passing through the nozzle.
  • a cell soul transport mechanism 90 that sequentially sends a plurality of cell souls to the package device 100 is connected to the second division mechanism 80.
  • a pre-package cell flow path 91 is connected between the cell soul transport mechanism 90 and the package apparatus 100.
  • the cell soul transport mechanism 90 sequentially sends each of the cell masses divided by the second division mechanism 80 to the package apparatus 100 via the pre-package cell flow path 91 using a pump or the like.
  • the pre-package cell channel 91 may be coated with poly-HEMA so that cells do not adhere. Or you may use the material which a cell does not adhere easily to the material of the cell flow path 91 before a package. Further, by using a material having good temperature conductivity and carbon dioxide permeability as the material of the pre-package cell flow path 91, the conditions in the pre-package cell flow path 91 are controlled in the surrounding temperature and carbon dioxide concentration. Is equivalent to The pre-package cell flow path 91 may be provided with a backflow prevention valve from the viewpoint of preventing contamination.
  • the cryopreservation liquid feeding mechanism 110 is connected to the pre-package cell flow path 91.
  • the cryopreservation solution feeding mechanism 110 sends the cell cryopreservation solution into the pre-package cell flow path 91.
  • the cell mass is suspended in the cell cryopreservation solution in the pre-package cell flow path 91.
  • the packaging apparatus 100 sequentially freezes each of the plurality of cell masses sent via the pre-package cell flow path 91. For example, each time the cell mass is received, the packaging apparatus 100 puts the cell mass in a cryopreservation container such as a cryotube and instantaneously freezes the cell mass solution at, for example, ⁇ 80 ° C. or lower.
  • a cryopreservation container having a small surface area per volume tends to be frozen
  • the shape of the cryopreservation container includes, but is not limited to, a capillary shape and a spherical shape. Further, depending on the required survival rate of the cells after thawing, it is not always necessary to freeze them instantly.
  • a vitrification method for example, a vitrification method is used.
  • DAP213 Cosmo Bio Inc.
  • Freezing Medium Reprocell Corp.
  • Freezing may be performed by a normal method other than the vitrification method.
  • CryoDefend-Stem Cell R & D System
  • STEM-CELLBANKER registered trademark, Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.
  • Freezing may be performed with liquid nitrogen or with a Peltier element.
  • the cryopreservation container is preferably a fully closed system.
  • the packaging device 100 may package the stem cells in a storage container without freezing them.
  • the cell mass solution may be replaced with a cryopreservation solution using a solution replacement device 101 as shown in FIG.
  • a filter 102 is provided on the bottom surface, which is provided with pores through which cell masses do not permeate.
  • the solution replacement device 101 has a cell mass introduction hole connected to the first liquid supply flow path 103 for feeding a medium containing cell mass on the internal filter 102, and the cell mass on the internal filter 102.
  • a replacement solution introduction hole to which a second liquid supply flow path 104 for supplying a freezing liquid not included is connected, and a first discharge flow path 105 for discharging the frozen liquid containing cell clumps from above the internal filter 102 are connected.
  • a cell mass outflow hole is provided.
  • the solution displacement device 101 is provided with a waste liquid outflow hole to which a second discharge channel 106 for discharging the solution that has passed through the filter 102 is connected.
  • a tube or the like can be used for each of the first liquid supply flow path 103, the second liquid supply flow path 104, the first discharge flow path 105, and the second discharge flow path 106.
  • FIGS. 13 (a) and 13 (b) in the state where the flow of the solution in the second discharge channel 106 is stopped, the inside of the solution replacer 101 is transferred from the first liquid supply channel 103. Into this, a medium containing a cell mass is added. Next, as shown in FIG. 13C, the solution is allowed to flow in the second discharge channel 106, and the medium is discharged from the solution replacement device 101. At this time, the cell mass remains on the filter 102 as shown in FIG. Further, as shown in FIGS. 13 (e) and 13 (f), in the state in which the flow of the solution in the second discharge channel 106 is stopped, the solution replacement device 101 inside the second liquid supply channel 104 is stopped.
  • cryopreservation solution is added, and the cell mass is dispersed in the cryopreservation solution. Thereafter, as shown in FIG. 13 (g), the cryopreservation solution containing the cell mass is discharged from the first discharge channel 105.
  • the cryopreservation solution containing the cell mass is sent to the cryopreservation container or the like via the first discharge channel 105.
  • the cell processing device shown in FIG. 1 is a recording device for the separation device 10, the pre-introduction cell liquid supply path 20, the induction factor liquid supply mechanism 21, the factor introduction device 30, the cell mass production device 40, the package device 100, and the like, and photographing.
  • An image captured by the apparatus may be transmitted to an external server by wire or wireless.
  • an external server for example, conditions such as induction factor introduction conditions, culture conditions, and freezing conditions, incomplete initialization of stem cells, failure of differentiation and proliferation of stem cells, and chromosomal abnormalities, etc. You may analyze the relationship with a result, extract the conditions which lead a result, or predict a result.
  • the external server controls the separation device 10 of the cell processing device, the induction factor liquid feeding mechanism 21, the factor introduction device 30, the cell mass production device 40, the packaging device 100, and the like based on the standard operation procedure (SOP). Depending on the SOP, whether or not each device is operating may be monitored, and an operation record of each device may be automatically generated.
  • SOP standard operation procedure
  • stem cells such as iPS cells.
  • the cell processing apparatus which concerns on embodiment is not limited to the structure shown in FIG.
  • blood is fed from the blood storage unit 201 to the mononuclear cell separation unit 203 via the blood feeding path 202.
  • a tube can be used as the blood storage unit 201 and the mononuclear cell separation unit 203.
  • the blood liquid supply path 202 is, for example, a resin tube or a silicon tube. The same applies to other liquid feeding paths described later.
  • Blood information may be managed by attaching an identifier such as a barcode to the blood storage unit 201.
  • a pump 204 is used for liquid feeding.
  • a positive displacement pump can be used.
  • positive displacement pumps include reciprocating pumps including piston pumps, plunger pumps, and diaphragm pumps, or rotary pumps including gear pumps, vane pumps, and screw pumps.
  • the diaphragm pump include a tubing pump and a piezoelectric (piezo) pump.
  • the tubing pump include a peristaltic pump (registered trademark, Ato Corporation), and RP-Q1 and RP-TX (Takasago Electric Co., Ltd.).
  • piezoelectric pumps include SDMP304, SDP306, SDM320, and APP-20KG (Takasago Electric Co., Ltd.).
  • liquid can be fed without the pump coming into direct contact with the blood inside the blood feeding path 202.
  • a syringe pump may be used as the pump 204 and the pump 207, the pump 216, the pump 222, the pump 225, the pump 234, the pump 242, and the pump 252 described later.
  • Even pumps other than the hermetic pump can be reused by heat sterilization treatment or the like.
  • the red blood cell coagulant is sent to the mononuclear cell separation unit 203 from the separation agent storage unit 205 via the liquid feeding path 206 and the pump 207.
  • the separating agent storage unit 205 for example, a tube can be used.
  • the separating agent storage unit 205 may be managed by attaching an identifier such as a barcode to manage the separating agent information.
  • the erythrocyte coagulant for example, HetaSep (registered trademark, STEMCELL Technologies) or erythrocyte coagulant (Nipro) can be used.
  • erythrocytes are precipitated by the erythrocyte coagulant, and mononuclear cells are separated.
  • the supernatant containing the mononuclear cells in the mononuclear cell separation unit 203 is sent to the mononuclear cell purification filter 210 via the mononuclear cell feeding path 208 and the pump 209.
  • the mononuclear cell purification filter 210 components other than mononuclear cells are removed, and a solution containing mononuclear cells is obtained.
  • Purecell registered trademark, PALL
  • CellSorba E As the mononuclear cell purification filter 210, Purecell (registered trademark, PALL), CellSorba E (Asahi Kasei Corporation), Sepacel PL (Asahi Kasei Corporation), Adacolumn (registered trademark, JIMRO), and separation bag (Nipro Corporation) Etc.
  • a mononuclear cell separation unit 203 a separation agent storage unit 205, a mononuclear cell purification filter 210, pumps 204, 207, 209, and the like constitute a separation device.
  • the solution containing mononuclear cells is sent to the factor introduction part 213 via the pre-introduction cell liquid supply path 211 and the pump 212.
  • a tube can be used as the factor introduction unit 213.
  • a pluripotency inducing factor is sent to the factor introduction unit 213 from the factor storage unit 214 including the pluripotency inducing factor via the factor feeding path 215 and the pump 216.
  • a tube can be used as the factor storage unit 214.
  • the factor storage unit 214 may be managed with information on pluripotency inducers by attaching an identifier such as a barcode.
  • the factor storage unit 214, the pump 216, and the like constitute an induction factor liquid feeding mechanism.
  • a pluripotency inducer is introduced into a cell by, for example, RNA lipofection, and an inducer introduced cell is produced.
  • the transfection method of the inducer is not limited to the RNA lipofection method.
  • a Sendai virus vector containing a pluripotency inducer may be used.
  • the pluripotency inducer may be a protein.
  • Induced factor-introduced cells are sent to an initialization suspension incubator 219 as a part of the cell mass production apparatus via the introduced cell liquid supply path 217 and the pump 218.
  • the introduced cell liquid supply path 217 is, for example, temperature permeable and carbon dioxide permeable.
  • the initialization suspension incubator 219 has a structure as shown in FIGS. 4 to 10, for example. In this case, the inducer-introduced cells are placed in a dialysis tube.
  • the initialization suspension incubator 219 has a structure as shown in FIGS. 11 and 12, for example. In this case, the inducer-introduced cells are placed in a container.
  • the initialization suspension incubator 219 shown in FIG. 14 includes a medium feeding path 221 and a pump from the blood cell medium storage unit 220 containing the blood cell medium for the first few days after the introduction of the pluripotency inducer into the cells. Via 222, the blood cell culture medium is replenished.
  • the medium feeding path 221 is, for example, temperature permeable and carbon dioxide permeable.
  • the blood cell culture medium storage unit 220 may be managed with information on the blood cell culture medium by attaching an identifier such as a barcode.
  • the blood cell culture medium storage unit 220, the culture medium supply path 221 and the pump 222 constitute a culture medium supply device.
  • the pump 222 may continuously supply the blood cell culture medium, or may supply the blood cell culture medium at a predetermined timing.
  • the stem cell culture medium 219 is replenished to the initialization suspension incubator 219 from the stem cell culture medium storage unit 223 including the stem cell culture medium via the medium feeding path 224 and the pump 225.
  • the stem cell culture medium storage unit 223 may be managed with information on the stem cell culture medium by attaching an identifier such as a barcode.
  • the medium feeding path 224 is, for example, temperature permeable and carbon dioxide permeable.
  • the stem cell culture medium storage unit 223, the culture medium supply path 224, and the pump 225 constitute a culture medium supply device.
  • the pump 225 may continuously supply the stem cell culture medium, or may supply the stem cell culture medium at a predetermined timing.
  • the blood cell culture medium storage unit 220 and the stem cell culture medium storage unit 223 may be refrigerated and stored at a low temperature such as 4 ° C. in the refrigerated storage unit 260, for example.
  • the culture medium sent from the blood cell culture medium storage unit 220 and the stem cell culture medium storage unit 223 may be, for example, heated to 37 ° C. with a heater outside the refrigeration storage unit 260 and then sent to the incubator. Or you may set the temperature around a liquid feeding path so that it may heat up to 37 degreeC while the culture medium preserve
  • the old medium in the initialization suspension incubator 219 is sent to the waste liquid storage unit 228 via the waste liquid supply path 226 and the pump 227.
  • the waste liquid storage unit 228 may be managed by attaching an identifier such as a barcode to manage the information on the waste liquid.
  • the cell mass cultured in the initialization suspension incubator 219 is supplied to the first expanded suspension incubator as a part of the cell mass preparation device via the introduced cell liquid supply path 229, the pump 230, and the cell mass divider 231. 232. By passing through the cell mass divider 231, the cell mass is divided into smaller cell masses.
  • the first expansion suspension incubator 232 has a structure as shown in FIGS. 4 to 10, for example. In this case, the cell mass is placed in a dialysis tube. Alternatively, the first expansion suspension incubator 232 has a structure as shown in FIGS. 11 and 12, for example. In this case, the cell mass is placed in a container.
  • the stem cell culture medium is supplied to the first expansion suspension incubator 232 shown in FIG. 14 from the stem cell culture medium storage unit 223 including the stem cell culture medium via the culture medium feeding path 233 and the pump 234.
  • the introduced cell feeding path 229 and the medium feeding path 233 are, for example, temperature permeable and carbon dioxide permeable.
  • the stem cell culture medium storage unit 223, the culture medium supply path 233, and the pump 234 constitute a culture medium supply device.
  • the pump 234 may continuously supply the stem cell culture medium, or may supply the stem cell culture medium at a predetermined timing.
  • the old medium in the first expansion suspension incubator 232 is sent to the waste liquid storage unit 228 via the waste liquid feed path 235 and the pump 236.
  • the cell mass cultured in the first expansion suspension incubator 232 passes through the introduction cell liquid supply path 237, the pump 238, and the cell aggregation divider 239, and then the second expansion suspension incubator as a part of the cell aggregation preparation device. 240.
  • the cell clump divider 239 By passing through the cell clump divider 239, the cell clump is divided into smaller cell clumps.
  • the second expansion suspension incubator 240 shown in FIG. 14, for example, has a structure as shown in FIGS. In this case, the cell mass is placed in a dialysis tube. Or the 2nd expansion suspension culture device 240, for example, the structure as shown in FIG.11 and FIG.12 is provided. In this case, the cell mass is placed in a container.
  • the stem cell culture medium is supplied to the second expansion suspension incubator 240 shown in FIG. 14 from the stem cell culture medium storage unit 223 including the stem cell culture medium via the medium feeding path 241 and the pump 242.
  • the introduced cell feeding path 237 and the medium feeding path 241 are, for example, temperature permeable and carbon dioxide permeable.
  • the stem cell culture medium storage unit 223, the culture medium supply path 241 and the pump 242 constitute a culture medium supply device.
  • the pump 242 may continuously supply the stem cell culture medium, or may supply the stem cell culture medium at a predetermined timing.
  • the old medium in the second expansion suspension incubator 240 is sent to the waste liquid storage unit 228 via the waste liquid feed path 243 and the pump 244.
  • the cell mass cultured in the second expansion suspension incubator 240 is sent to the solution replacement device 247 through the introduced cell liquid supply path 245 and the pump 246.
  • the solution replacer 247 may have a configuration shown in FIG. 13, for example.
  • the cell mass is held by a filter, and the culture medium is sent to the waste liquid storage unit 228 via the waste liquid supply path 248 and the pump 249.
  • the solution replacement unit 247 After stopping the flow of the solution in the waste liquid feeding path 248 by stopping the driving of the pump 249 or closing the waste liquid feeding path 248 with a valve or the like, the solution replacement unit 247 includes a cryopreservation liquid containing a cryopreservation liquid.
  • the cryopreservation solution is put from the storage unit 250 through the liquid supply path 251 and the pump 252. As a result, the cell mass is dispersed in the cryopreservation solution.
  • the cryopreservation liquid in which the cell mass is dispersed is sent into the cryopreservation container 255 via the liquid supply path 253 and the pump 254 as a part of the package device.
  • the cryopreservation container 255 is placed in a low temperature storage 256.
  • a low temperature storage 256 For example, -80 ° C. liquid nitrogen is sent from the liquid nitrogen storage 257 to the low temperature storage 256 through the liquid supply path 258.
  • the cell mass in the cryopreservation container 255 is frozen.
  • the freezing of the cell mass may not depend on liquid nitrogen.
  • the low temperature storage 256 may be a freezer such as a compression freezer, an absorption freezer, or a Peltier freezer.
  • a backflow prevention valve may be appropriately provided in the above-described liquid supply path.
  • the solution replacer 247 and the like are disposed on the member 259, for example.
  • the material of the member 259 is, for example, resin, but is not limited to this.
  • the member 259 is made of a heat-resistant material that can be sterilized, for example.
  • the member 259 may have a plate shape or a cassette shape.
  • the member 259 may be a flexible bag.
  • the liquid supply path through which the medium flows is made of, for example, a carbon dioxide permeable material.
  • the above-described liquid supply path, mononuclear cell separation unit 203, mononuclear cell purification filter 210, factor introduction unit 213, initialization suspension incubator 219, first expansion suspension incubator 232, second expansion suspension incubator 240, the solution replacer 247, and the like may be divided and stored in a plurality of cases.
  • the member 259 and the flow path provided in the member 259 are disposable, and after the freezing of the cell mass is completed, it may be discarded and replaced with a new one.
  • an identifier such as a barcode may be attached to the member 259 to manage the number of times of use.
  • stem cells such as iPS cells.
  • the factor introduction apparatus 30 may induce cells by transfection using a viral vector such as a retrovirus, a lentivirus, or a Sendai virus, a plasmid, or a protein transfection rather than electroporation or RNA lipofection. Good.
  • a viral vector such as a retrovirus, a lentivirus, or a Sendai virus, a plasmid, or a protein transfection rather than electroporation or RNA lipofection. Good.
  • the pre-introduction cell liquid supply path 20, the introduced cell liquid supply path 31, the cell mass liquid supply path 51, the expanded culture liquid supply path 71, the cell mass liquid supply path 72, and the pre-package cell flow path 91 are microfluidic technologies. May be provided on the substrate.
  • the present invention includes various embodiments and the like not described herein.
  • Example 1 5 ⁇ 10 6 fibroblasts (HDF1419, Cell Applications, Inc.) suspended in DMEM (Gibco) containing 10% FBS (Gibco), which is not a gel medium, were added to each well of the well dish.
  • the well dish was placed in a 37 ° C. CO 2 incubator, and fibroblasts were cultured for adhesion.
  • the reprogramming factor OSKM OCT3 / 4, SOX2, KLF4, c-MYC
  • a gel medium was prepared by adding 0.02% by mass of deacylated gellan gum to hES medium not containing bFGF (Primate ES Cell Medium, Reprocell). The prepared gel medium, the cells were suspended so that the concentration becomes 1 ⁇ 10 5 cells / mL, was placed in a container of the incubator. Thereafter, the cells were stirred and suspended in a CO 2 incubator using a magnet and a stirrer for 22 days. Meanwhile, 10 mL of medium was added to the incubator every 48 hours.
  • Example 2 As in Example 1, the reprogramming factor OSKM (OCT3 / 4, SOX2, KLF4, c-MYC) was introduced into fibroblasts. Thereafter, the medium was changed every 24 hours for 7 days.
  • OSKM OCT3 / 4, SOX2, KLF4, c-MYC
  • hES medium Primary ES Cell Medium, Reprocell
  • the medium was a liquid medium not containing a polymer and not a gel medium.
  • Cells were suspended in the prepared liquid medium to a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells / mL, and placed in a container of an incubator. Thereafter, cells were stirred and suspended in a CO 2 incubator using a magnet and a stirrer for 8 days. Meanwhile, 10 mL of medium was added to the incubator every 48 hours.
  • Example 3 As in Example 1, the reprogramming factor OSKM (OCT3 / 4, SOX2, KLF4, c-MYC) was introduced into fibroblasts. Thereafter, the medium was changed every 24 hours for 7 days.
  • OSKM OCT3 / 4, SOX2, KLF4, c-MYC
  • a gel medium was prepared by adding 0.02% by mass of deacylated gellan gum to hES medium not containing bFGF (Primate ES Cell Medium, Reprocell). Cells were suspended in the prepared gel medium so as to have a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells / mL, and placed in an incubator without a dialysis tube or a dialysis tube of an incubator as shown in FIG.
  • All incubators were placed in a CO 2 incubator. Thereafter, in an incubator without a dialysis tube, the cells were suspended in culture for 20 days without stirring the gel medium. On the other hand, in the incubator having a dialysis tube, the gel medium in the container outside the dialysis tube was stirred using a magnet and a stirrer, and the cells were suspended for 20 days. Meanwhile, 10 mL of medium was added to the incubator every 48 hours.
  • the formation of cell mass was confirmed as shown in the photograph of FIG.
  • the number of the collected cells was measured, as shown in FIG. 22, the number of cells was larger when the cells were put into a dialysis tube and cultured with stirring than when the cells were not put into the dialysis tube. This indicates that nutrient components and the like are efficiently supplied to the cells in the dialysis tube from the agitated medium outside the dialysis tube.
  • the collected cells were seeded on feeder cells and cultured for 5 days. Thereafter, the cell colonies were fixed with paraformaldehyde, and the cells were immunostained with an antibody against OCT3 / 4.
  • FIG. 23 culture using a dialysis tube
  • FIG. 24 culture without using a dialysis tube. The cells were confirmed to be OCT3 / 4 positive. Therefore, it was shown that iPS cells were induced from fibroblasts.
  • DESCRIPTION OF SYMBOLS 10 ... Separation device, 20 ... Cell feeding channel before introduction, 21 ... Induction factor feeding mechanism, 30 ... Factor feeding device, 31 ... Introducing cell feeding channel, 40 ... Cell lump preparation device, 50 ... Initialization culture device, 51 ... Cell lump feeding path, 60 ... Splitting mechanism, 70 ... Expansion culture apparatus, 71 ... Expansion culture feeding path, 72 ⁇ ⁇ ⁇ Cell lump feeding path, 74 ⁇ ⁇ ⁇ Driving device, 75 ⁇ ⁇ ⁇ Dialysis tube, 76 ⁇ ⁇ ⁇ Container, 80 ⁇ ⁇ ⁇ Splitting mechanism, 90 ⁇ ⁇ ⁇ Cell soul transport mechanism, 91 ⁇ ⁇ ⁇ Package Pre-cell flow path, 100 ...

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Abstract

細胞に多能性誘導因子を導入して誘導因子導入細胞を作製する因子導入装置３０と、因子導入装置３０で作製された誘導因子導入細胞を培養するための初期化浮遊培養器と、を備える細胞処理装置。

Description

細胞処理装置、浮遊培養器、及び幹細胞の誘導方法
　本発明は細胞技術に関し、細胞処理装置、浮遊培養器、及び幹細胞の誘導方法に関する。
　胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、ヒトやマウスの初期胚から樹立された幹細胞である。ＥＳ細胞は、生体に存在する全ての細胞へと分化できる多能性を有する。現在、ヒトＥＳ細胞は、パーキンソン病、若年性糖尿病、及び白血病等、多くの疾患に対する細胞移植療法に利用可能である。しかし、ＥＳ細胞の移植には障害もある。特に、ＥＳ細胞の移植は、不成功な臓器移植に続いて起こる拒絶反応と同様の免疫拒絶反応を惹起しうる。また、ヒト胚を破壊して樹立されるＥＳ細胞の利用に対しては、倫理的見地から批判や反対意見が多い。
　このような背景の状況の下、京都大学の山中伸弥教授は、４種の遺伝子：ＯＣＴ３／４、ＫＬＦ４、ｃ－ＭＹＣ、及びＳＯＸ２を体細胞に導入することにより、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を樹立することに成功した。これにより、山中教授は、２０１２年のノーベル生理学・医学賞を受賞した（例えば、特許文献１、２参照。）。ｉＰＳ細胞は、拒絶反応や倫理的問題のない理想的な多能性細胞である。したがって、ｉＰＳ細胞は、細胞移植療法への利用が期待されている。
特許第４１８３７４２号公報 特開２０１４－１１４９９７号公報
　ｉＰＳ細胞に限らず、様々な細胞を効率よく培養可能な装置や方法が望まれている。本発明は、細胞処理装置、浮遊培養器、及び幹細胞の誘導方法を提供することを目的の一つとする。
　本発明の態様によれば、細胞に多能性誘導因子を導入して誘導因子導入細胞を作製する因子導入装置と、因子導入装置で作製された誘導因子導入細胞を浮遊培養するための浮遊培養器と、を備える、細胞処理装置が提供される。
　上記の細胞処理装置において、浮遊培養器内で誘導因子導入細胞が初期化されてもよい。
　上記の細胞処理装置において、浮遊培養器内で誘導因子導入細胞が初期化され、拡大培養されてもよい。
　上記の細胞処理装置において、浮遊培養器が、誘導因子導入細胞と培地が入れられる半透膜と、半透膜が入れられ、半透膜の周囲に培地が入れられる容器と、容器内の培地を攪拌させるための駆動装置と、を備えていてもよい。半透膜は、例えば、チューブ状である。
　上記の細胞処理装置において、容器内に攪拌部材が設けられていてもよい。
　上記の細胞処理装置において、駆動装置が、磁力を介して、攪拌部材を回転させてもよい。
　上記の細胞処理装置において、浮遊培養器が、誘導因子導入細胞と培地が入れられる半透膜と、半透膜が入れられ、半透膜の周囲に培地が入れられる容器であって、内側面にらせん状の溝が設けられている容器と、容器内の溝に沿って培地が流れるよう、容器内に培地を供給するポンプと、を備えていてもよい。
　上記の細胞処理装置において、因子導入装置で作製された誘導因子導入細胞が、浮遊培養器の半透膜内に送られてもよい。
　上記の細胞処理装置において、浮遊培養器が、培地が入れられる半透膜と、半透膜が入れられ、半透膜の周囲に誘導因子導入細胞と培地が入れられる容器と、半透膜内に培地の液流が生じるよう、半透膜内に培地を供給するポンプと、を備えていてもよい。
　上記の細胞処理装置において、因子導入装置で作製された誘導因子導入細胞が、容器内の半透膜の外に送られてもよい。
　上記の細胞処理装置において、浮遊培養器が、誘導因子導入細胞と培地が入れられる容器と、容器内の培地を攪拌させるための駆動装置と、を備えていてもよい。
　上記の細胞処理装置において、容器内に攪拌部材が設けられていてもよい。
　上記の細胞処理装置において、駆動装置が、磁力を介して、攪拌部材を回転させてもよい。
　上記の細胞処理装置において、浮遊培養器が、誘導因子導入細胞と培地が入れられる容器であって、内側面にらせん状の溝が設けられている容器と、容器内の溝に沿って培地が流れるよう、容器内に培地を供給するポンプと、を備えていてもよい。
　上記の細胞処理装置において、因子導入装置で作製された誘導因子導入細胞が、浮遊培養器の容器内に送られてもよい。
　上記の細胞処理装置において、培地が液体培地であってもよい。
　上記の細胞処理装置において、培地がゲル培地であってもよい。
　また、本発明の態様によれば、細胞と培地が入れられる半透膜と、半透膜が入れられ、半透膜の周囲に培地が入れられる容器と、容器内に設けられた攪拌部材と、を備える、浮遊培養器が提供される。
　上記の浮遊培養器において、容器内の培地を攪拌させるための駆動装置をさらに備えていてもよい。
　上記の浮遊培養器において、駆動装置が、磁力を介して、攪拌部材を回転させてもよい。
　また、本発明の態様によれば、細胞と培地が入れられる半透膜と、半透膜が入れられ、半透膜の周囲に培地が入れられる容器であって、内側面にらせん状の溝が設けられている容器と、を備える浮遊培養器が提供される。
　上記の浮遊培養器において、容器内の溝に沿って培地が流れるよう、容器内に培地を供給するポンプをさらに備えていてもよい。
　また、本発明の態様によれば、細胞と培地が入れられる容器であって、内側面にらせん状の溝が設けられている容器を備える浮遊培養器が提供される。
　上記の浮遊培養器において、容器内の溝に沿って培地が流れるよう、容器内に培地を供給するポンプをさらに備えていてもよい。
　また、本発明の態様によれば、培地が入れられる半透膜と、半透膜が入れられ、半透膜の周囲に細胞と培地が入れられる容器と、を備える、浮遊培養器が提供される。
　上記の浮遊培養器において、半透膜内に培地の液流が生じるよう、半透膜内に培地を供給するポンプをさらに備えていてもよい。
　上記の浮遊培養器において、培地が液体培地であってもよい。
　上記の浮遊培養器において、培地がゲル培地であってもよい。
　また、本発明の態様によれば、細胞に多能性誘導因子を導入して誘導因子導入細胞を作製することと、誘導因子導入細胞を浮遊培養して誘導因子導入細胞を初期化することと、を含む、幹細胞の誘導方法が提供される。
　上記の幹細胞の誘導方法において、浮遊培養が、攪拌培養であってもよい。
　上記の幹細胞の誘導方法において、誘導因子導入細胞を浮遊培養する際に液体培地が用いられてもよい。
　上記の幹細胞の誘導方法において、誘導因子導入細胞を浮遊培養する際にゲル培地が用いられてもよい。
　また、本発明の態様によれば、細胞に誘導因子を導入して誘導因子導入細胞を作製することと、誘導因子導入細胞を浮遊培養して目的とする体細胞を誘導することと、を含む、細胞の誘導方法が提供される。
　上記の細胞の誘導方法において、浮遊培養が、攪拌培養であってもよい。
　上記の細胞の誘導方法において、誘導因子導入細胞を浮遊培養する際に液体培地が用いられてもよい。
　上記の細胞の誘導方法において、誘導因子導入細胞を浮遊培養する際にゲル培地が用いられてもよい。
　本発明によれば、細胞処理装置、浮遊培養器、及び幹細胞の誘導方法を提供可能である。
実施形態に係る細胞処理装置の模式図である。 実施形態に係る細胞処理装置の導入細胞送液路の一例の模式的断面図である。 実施形態に係る細胞処理装置の導入細胞送液路の一例の模式的断面図である。 実施形態に係る浮遊培養器の模式的斜視図である。 実施形態に係る浮遊培養器の模式的断面図である。 実施形態に係る浮遊培養器の模式的断面図である。 実施形態に係る浮遊培養器の模式的斜視図である。 実施形態に係る浮遊培養器の模式的断面図である。 実施形態に係る浮遊培養器の模式的斜視図である。 実施形態に係る浮遊培養器の模式的断面図である。 実施形態に係る浮遊培養器の模式的斜視図及び模式的断面図である。 実施形態に係る浮遊培養器の模式的斜視図及び模式的断面図である。 実施形態に係る溶液置換器の模式図である。 実施形態に係る細胞処理装置の模式図である。 実施例１に係る誘導された細胞塊の顕微鏡写真である。 実施例１に係るＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｃｅｌｌ　Ｓｏｒｔｉｎｇ）で得られたドットプロットである。 実施例１に係る誘導された細胞の顕微鏡写真である。 実施例２に係る誘導された細胞塊の顕微鏡写真である。 実施例２に係るＦＡＣＳで得られたドットプロットである。 実施例２に係る誘導された細胞の顕微鏡写真である。 実施例３に係る誘導された細胞塊の顕微鏡写真である。 実施例３に係る細胞塊の数を示すグラフである。 実施例３に係る透析チューブを用いて誘導培養された細胞の顕微鏡写真である。 実施例３に係る透析チューブを用いずに誘導培養された細胞の顕微鏡写真である。
　以下に本発明の実施形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号で表している。ただし、図面は模式的なものである。したがって、具体的な寸法等は以下の説明を照らし合わせて判断するべきものである。また、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることは勿論である。
　実施形態に係る細胞処理装置は、図１に示すように、細胞に多能性誘導因子を導入して誘導因子導入細胞を作製する因子導入装置３０と、因子導入装置３０で作製された誘導因子導入細胞を培養するための初期化浮遊培養器と、初期化浮遊培養器で樹立された幹細胞からなる複数の細胞塊を拡大培養するための拡大浮遊培養器と、を備える。なお、初期化浮遊培養器と、拡大浮遊培養器と、を別個に設けず、同じ浮遊培養器の中で誘導因子導入細胞を培養し、幹細胞を誘導してもよい。
　細胞処理装置は、例えば、血液から細胞を分離する分離装置１０と、分離装置１０で分離された細胞を含む溶液が通過する導入前細胞送液路２０と、を備えていてもよい。導入前細胞送液路２０は、因子導入装置３０に接続される。細胞処理装置は、導入前細胞送液路２０又は因子導入装置３０内に多能性誘導因子を送る誘導因子送液機構２１を備えていてもよい。
　初期化浮遊培養器と、拡大浮遊培養器と、は、誘導因子導入細胞を培養して幹細胞からなる複数の細胞魂を作製する細胞塊作製装置４０の少なくとも一部を構成している。細胞処理装置は、複数の細胞塊のそれぞれを順次パッケージするパッケージ装置１００を備えていてもよい。
　分離装置１０は、例えばヒトの血液が入ったバイアルを受け取る。分離装置１０は、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ヘパリン、及び生物学的製剤基準血液保存液Ａ液（ＡＣＤ－Ａ液、テルモ株式会社）等の抗凝固剤を保存する抗凝固剤タンクを備えている。分離装置１０は、ポンプ等を用いて、抗凝固剤タンクから、ヒトの血液に、抗凝固剤を添加する。
　また、分離装置１０は、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ　ＰＲＥＭＩＵＭ（登録商標、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）等の単核細胞分離用試薬を保存する分離用試薬タンクを備えている。分離装置１０は、ポンプ等を用いて、分離用試薬タンクから、例えば１５ｍＬチューブ２本に、単核細胞分離用試薬を５ｍＬずつ分注する。なお、チューブの代わりに、樹脂バッグを用いてもよい。
　さらに、分離装置１０は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の緩衝液を保存する緩衝液タンクを備えている。分離装置１０は、ポンプ等を用いて、緩衝液タンクから、例えばヒトの血液５ｍＬに、緩衝液５ｍＬを加えて希釈する。またさらに、分離装置１０は、ポンプ等を用いて、希釈されヒトの血液を、チューブ中の単核細胞分離用試薬上に、５ｍＬずつ加える。
　分離装置１０は、温度設定可能な遠心機をさらに備える。遠心機は、例えば１８℃に設定される。分離装置１０は、移動装置等を用いて、単核細胞分離用試薬及びヒトの血液等が入れられたチューブを、遠心機のホルダーに入れる。遠心機は、チューブ中の溶液を、例えば４００×ｇで３０分間遠心する。チューブの代わりに、樹脂バッグを遠心させてもよい。
　遠心後、分離装置１０は、チューブ中の溶液の単核球細胞で白く濁った中間層をポンプ等で回収する。分離装置１０は、ポンプ等を用いて、回収した単核球細胞の懸濁液を、導入前細胞送液路２０に送り出す。あるいは、さらに、分離装置１０は、回収した単核球細胞溶液２ｍＬに対し、例えばＰＢＳ１２ｍＬを加えて、チューブを遠心機のホルダーに入れる。遠心機は、チューブ中の溶液を、例えば２００×ｇで１０分間遠心する。
　遠心後、分離装置１０は、ポンプ等を用いて、チューブ中の溶液の上清を吸引して除去し、Ｘ－ＶＩＶＯ　１０（登録商標、ロンザジャパン株式会社）等の単核球細胞培地３ｍＬをチューブ中の単核球細胞溶液に加えて懸濁する。分離装置１０は、ポンプ等を用いて、単核球細胞懸濁液を、導入前細胞送液路２０に送り出す。なお、分離装置１０は、透析膜を使用して、血液から単核球細胞を分離してもよい。また、皮膚等から予め分離された繊維芽細胞等の体細胞を使用する場合は、分離装置１０は無くともよい。
　分離装置１０は、遠心分離以外の方法で、誘導に適した細胞を分離してもよい。例えば、分離すべき細胞がＴ細胞であればＣＤ３，ＣＤ４，ＣＤ８のいずれかが陽性である細胞をパニングにより分離すればよい。分離すべき細胞が血管内皮前駆細胞であればＣＤ３４が陽性である細胞をパニングにより分離すればよい。分離すべき細胞がＢ細胞であれば、ＣＤ１０，ＣＤ１９，ＣＤ２０のいずれかが陽性である細胞をパニングにより分離すればよい。また、パニングに限らず、磁気細胞分離方法（ＭＡＣＳ）やフローサイトメトリー等により分離してもよい。また、誘導に適した細胞は、血液由来の細胞に限定されない。
　誘導因子送液機構２１は、誘導因子導入試薬溶液等を保存する誘導因子導入試薬タンクを備える。遺伝子導入試薬溶液等の誘導因子導入試薬溶液は、例えば、Ｈｕｍａｎ　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標、ロンザジャパン株式会社）溶液等のエレクトロポレーション溶液、サプリメント溶液、及びプラスミドセットを含む。プラスミドセットは、例えば、ｐＣＸＬＥ－ｈＯＣＴ３／４－ｓｈｐ５３－Ｆを０．８３μｇ、ｐＣＸＬＥ－ｈＳＫを０．８３μｇ、ｐＣＥ－ｈＵＬを０．８３μｇ、及びｐＣＸＷＢ－ＥＢＮＡ１を０．５μｇ含む。誘導因子送液機構２１は、マイクロポンプ等を用いて、誘導因子導入試薬溶液中に単核球細胞懸濁液が懸濁されるように、誘導因子導入試薬溶液を、導入前細胞送液路２０に送り出す。
　導入前細胞送液路２０の内壁には、細胞が接着しないよう、ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡ（ｐｏｌｙ　２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ　ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）をコーティングして、細胞非接着性にしてもよい。あるいは、導入前細胞送液路２０の材料に、細胞が接着しにくい材料を用いてもよい。また、導入前細胞送液路２０の材料に、温度伝導率が良く、二酸化炭素透過性の材料を用いることにより、導入前細胞送液路２０内の条件が、周囲の温度及び二酸化炭素濃度と同等になる。さらに、導入前細胞送液路２０には、コンタミネーション防止の観点から、逆流防止弁が設けられていてもよい。
　導入前細胞送液路２０に接続された因子導入装置３０は、例えばエレクトロポレーターであり、誘導因子導入試薬溶液と単核球細胞懸濁液の混合液を受け取り、単核球細胞に対してプラスミドのエレクトロポレーションを実施する。因子導入装置３０は、エレクトロポレーションを実施後、プラスミドをエレクトロポレーションされた単核球細胞を含む溶液に、単核球細胞培地を加える。因子導入装置３０は、ポンプ等を用いて、プラスミドをエレクトロポレーションされた単核球細胞（以下、「誘導因子導入細胞」という。）を含む溶液を、導入細胞送液路３１に送り出す。
　なお、因子導入装置３０は、エレクトロポレーターに限定されない。因子導入装置３０は、細胞に初期化因子をコードしているＲＮＡをリポフェクション法により導入してもよい。リポフェクション法とは、陰性荷電物質である核酸と、陽性荷電脂質と、の複合体を、電気的な相互作用により形成し、複合体をエンドサイトーシスや膜融合により細胞内に取り込ませる方法である。リポフェクション法は、細胞へのダメージが少なく、導入効率に優れており、操作が簡便であり、時間がかからない等の利点を有する。また、リポフェクション法においては、細胞のゲノムに初期化因子が挿入される可能性がないため、得られた幹細胞を全ゲノムシークエンスして、外来遺伝子の挿入の有無を確認する必要がない。多能性誘導因子としての初期化因子ＲＮＡは、例えば、ＯＣＴ３／４のｍＲＮＡ、ＳＯＸ２のｍＲＮＡ、ＫＬＦ４のｍＲＮＡ、及びｃ－ＭＹＣのｍＲＮＡを含む。なお、ここでは遺伝子記号はヒトで記載しているが、大文字・小文字表記によって、種を制限することを意図するものではない。例えば、全て大文字表記していても、マウス又はラットの遺伝子を含むことを排除するものではない。ただし、実施例においては、実際に使用した生物種に則って、遺伝子記号を表記している。
　初期化因子ＲＮＡのリポフェクションには、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）或いはリポフェクション試薬が用いられる。ＲＮＡのリポフェクション試薬としては、ｓｉＲＮＡのリポフェクション試薬及びｍＲＮＡのリポフェクション試薬が使用可能である。より具体的には、ＲＮＡのリポフェクション試薬としては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（登録商標）２０００、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（登録商標）３０００、ＮｅｏｎＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｓｔｅｍｆｅｃｔ　ＲＮＡ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｔｅｍｆｅｃｔ）、ＮｅｘｔＦｅｃｔ（登録商標）ＲＮＡ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ＢｉｏｏＳｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ａｍａｘａ（登録商品）Ｈｕｍａｎ　Ｔ　ｃｅｌｌ　Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商品）ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ社、ＶＡＰＡ－１００２）、Ａｍａｘａ（登録商品）Ｈｕｍａｎ　ＣＤ３４　ｃｅｌｌ　Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商品）ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ社、ＶＡＰＡ－１００３）、及びＲｅｐｒｏＲＮＡ（登録商標）トランスフェクション試薬（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等が使用可能である。
　因子導入装置３０が、リポフェクション法により細胞に初期化因子を導入する場合は、初期化因子ＲＮＡ及び試薬等が、誘導因子送液機構２１により導入前細胞送液路２０に送り出される。
　導入細胞送液路３１の内壁には、細胞が接着しないよう、ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡをコーティングして、非接着性にしてもよい。あるいは、導入細胞送液路３１の材料に、細胞が接着しにくい材料を用いてもよい。また、導入細胞送液路３１の材料に、温度伝導率が良く、二酸化炭素透過性の材料を用いることにより、導入細胞送液路３１内の条件が、周囲の管理された温度及び二酸化炭素濃度と同等になる。さらに、導入細胞送液路３１には、コンタミネーション防止の観点から、逆流防止弁が設けられていてもよい。また、エレクトロポレーションの後は、多くの細胞が死に、死んだ細胞の細胞塊ができることがある。そのため、導入細胞送液路３１に、死細胞塊を除去するフィルターを設けてもよい。あるいは、図２に示すように、導入細胞送液路３１内部に、内径を断続的に変化させる一又は複数の襞を設けてもよい。またあるいは、図３に示すように、導入細胞送液路３１の内径を断続的に変化させてもよい。
　図１に示すように、導入細胞送液路３１に接続された細胞塊作製装置４０は、因子導入装置３０で作製された誘導因子導入細胞を培養する初期化培養装置５０と、初期化培養装置５０で樹立された幹細胞からなる細胞塊（細胞コロニー）を複数の細胞塊に分割する第１の分割機構６０と、第１の分割機構６０で分割された複数の細胞塊を拡大培養する拡大培養装置７０と、拡大培養装置７０で拡大培養された幹細胞からなる細胞塊を複数の細胞塊に分割する第２の分割機構８０と、複数の細胞魂をパッケージ装置１００に順次送る細胞魂搬送機構９０と、を備える。
　初期化培養装置５０は、例えば、図４から図６に示す初期化浮遊培養器を備える。初期化浮遊培養器は、誘導因子導入細胞と培地が入れられる透析チューブ７５と、透析チューブ７５が入れられ、透析チューブ７５の周囲に培地が入れられる容器７６と、容器７６内の培地を攪拌させるための駆動装置７４と、を備える。
　図１に示す因子導入装置３０で作製された誘導因子導入細胞は、図４から図６に示す初期化浮遊培養器の透析チューブ７５内に送られる。
　透析チューブ７５は、半透膜からなり、例えば、ＲＯＣＫ阻害剤を透過させる。透析チューブ７５の分画分子量は、０．１ＫＤａ以上、１０ＫＤａ以上、あるいは５０ＫＤａ以上である。透析チューブ７５は、例えば、セルロースエステル、エチルセルロース、セルロースエステル類、再生セルロース、ポリスルホン、ポリアクリルニトリル、ポリメチルメタクリレート、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリエステル系ポリマーアロイ、ポリカーボネート、ポリアミド、セルロースアセテート、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、銅アンモニウムレーヨン、鹸化セルロース、ヘモファン膜、フォスファチジルコリン膜、及びビタミンＥコーティング膜等からなる。
　容器７６としては、例えば円柱形であるが、これに限定されない。容器７６の側壁は、例えば、ポリプロピレンやガラス等の透明材料からなる。容器７６は、二酸化炭素透過性であってもよい。二酸化炭素透過性の容器７６としては、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標、Ｗｉｌｓｏｎ　Ｗｏｌｆ）が使用可能である。
　誘導因子導入細胞は、透析チューブ７５内に入れられる。透析チューブ７５には、透析チューブ７５内に細胞を含む培地を送液するための送液路が接続されていてもよい。また、透析チューブ７５には、透析チューブ７５内の細胞を含む培地を容器外部に送液するための送液路が接続されていてもよい。
　容器７６内及び透析チューブ７５内に入れられる培地は、例えば、血液細胞培地又は幹細胞用培地である。例えば、初期化培養の当初は、血液細胞培地を用い、その後は、幹細胞用培地を用いてもよい。幹細胞用培地としては、例えば、Ｐｒｉｍａｔｅ　ＥＳ　Ｃｅｌｌ　Ｍｅｄｉｕｍ(ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ)等のヒトＥＳ／ｉＰＳ培地を使用可能である。
　ただし、幹細胞用培地は、これに限定されず、種々の幹細胞培地が使用可能である。例えばＰｒｉｍａｔｅ　ＥＳ　Ｃｅｌｌ　Ｍｅｄｉｕｍ、Ｒｅｐｒｏｓｔｅｍ、ＲｅｐｒｏＦＦ、ＲｅｐｒｏＦＦ２、ＲｅｐｒｏＸＦ（Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ）、ｍＴｅＳＲ１、ＴｅＳＲ２、ＴｅＳＲＥ８、ＲｅｐｒｏＴｅＳＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（登録商標）Ｈｕｍａｎ　ＥＳ／ｉＰＳ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｅｒｃｋ）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ　（登録商標）ＸＦ／ＦＦ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　Ｈｕｍａｎ　ｉＰＳ　ａｎｄ　ＥＳ　Ｃｅｌｌｓ、Ｐｌｕｒｉｔｏｎ　ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（登録商標）、Ｓｔｅｍｆｉｔ　ＡＫ０２Ｎ、Ｓｔｅｍｆｉｔ　ＡＫ０３（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）、ＥＳＣ－Ｓｕｒｅ（登録商標）ｓｅｒｕｍ　ａｎｄ　ｆｅｅｄｅｒ　ｆｒｅｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ｈＥＳＣ／ｉＰＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ　ＳｔｅｍＣｅｌｌ）、及びＬ７（登録商標）ｈＰＳＣ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　（ＬＯＮＺＡ）等を利用してもよい。
　培地は、ゲル培地ではない液体培地であってもよいし、ゲル培地であってもよい。
　培地がゲル培地である場合、ゲル培地は、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム、ヒアルロン酸、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、ラムナン硫酸、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の高分子化合物を含んでいてもよい。また、ゲル培地は、メチルセルロースを含んでいてもよい。メチルセルロースを含むことにより、細胞同士の凝集がより抑制される。
　あるいは、ゲル培地は、poly(glycerol monomethacrylate) (PGMA)、poly(2-hydroxypropyl methacrylate) (PHPMA）、Poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)、amine terminated、carboxylic acid terminated、maleimide terminated、N-hydroxysuccinimide (NHS) ester terminated、triethoxysilane terminated、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylamide)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-butylacrylate)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid-co-octadecyl acrylate)、及びN-Isopropylacrylamideから選択される少なくの温度感受性ゲルを含んでいてもよい。
　容器７６の内、例えば底面には、攪拌部材２７１が設けられている。攪拌部材２７１の形状は任意であり、棒状であってもよいし、攪拌翼が設けられた板状であってもよい。攪拌部材２７１は、磁力を受ける金属を備えていてもよい。駆動装置７４は、例えば磁力を介して、容器７６内の攪拌部材２７１を回転させる。これにより、容器７６内の培地が攪拌され、透析チューブ７５内の細胞が浮遊培養される。この際、容器７６内の透析チューブ７５の外の培地が主に撹拌される。透析チューブ７５内の培地の流速は、容器７６内の透析チューブ７５の外側の培地の流速より遅くなるか、あるいは透析チューブ７５内の培地は、ほとんど流動しない。
　攪拌されている培地中では、ｉＰＳ細胞同士がランダムに衝突し、結合して、様々な大きさの細胞塊（コロニー）が形成される場合がある。そのためコロニー間の均質性が保てない場合がある。さらに、大きすぎるコロニーにおいては、コロニーの中まで栄養や成長因子がとどかず、内部から分化、細胞死してしまう場合がある。その一方で、小さすぎるコロニーは、継代培養には適さない場合がある。これに対し、透析チューブ７５内では、培地の流速が遅いか、培地が流動しないため、細胞同士が衝突する頻度が低い。そのため、コロニーにおいてクローナリティを維持することが可能である。したがって、例えば、幹細胞がｉＰＳ細胞である場合、１つの体細胞由来のｉＰＳ細胞のクローナリティを担保することが可能である。また、幹細胞同士が衝突する頻度が低いため、幹細胞のコロニーの大きさを均質に保つことが可能である。
　透析チューブ７５内に入れられる培地は、ＲＯＣＫ阻害剤を含んでいなくてもよい。容器７６内の透析チューブ７５の周囲に入れられる培地には、例えば、ＲＯＣＫ阻害剤を終濃度が１０００μｍｏｌ／Ｌ以上０．１μｍｏｌ／Ｌ以下、１００μｍｏｌ／Ｌ以上１μｍｏｌ／Ｌ以下、あるいは５μｍｏｌ／Ｌ以上２０μｍｏｌ／Ｌ以下となるよう、毎日添加する。ＲＯＣＫ阻害剤を透析チューブ７５の周囲の培地に添加することにより、ＲＯＣＫ阻害剤が透析チューブ７５内に浸透し、細胞によるコロニー形成が促進される。
　培地は、例えば、ｂａｓｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）やＴＧＦ－β等の成長因子を含んでいてもよいし、含んでいなくともよい。
　透析チューブ７５内で細胞を浮遊培養する間、容器７６内の透析チューブ７５の周囲の培地は交換される。なお、培地を交換するとは、培地を一部置換することや、補充することも含む。この場合、透析チューブ７５内に培地を補給しなくともよい。あるいは、透析チューブ７５内で細胞を浮遊培養する間、透析チューブ７５内に培地が補給される。この場合、容器７６内の透析チューブ７５の周囲に培地を補給しなくともよい。
　初期化浮遊培養器は、透析チューブ７５の周囲に培地の水素イオン指数（ｐＨ）を測定するｐＨセンサーを備えていてもよい。
　実施形態に係る細胞処理装置は、培地補給装置としての補給培地送液ポンプを用いて、初期化浮遊培養器の容器７６内の透析チューブ７５の周囲の培地を、交換、あるいは補給する。補給培地送液ポンプとしては、点滴に用いられるポンプ等が使用可能である。補給培地送液ポンプと、初期化浮遊培養器の容器７６と、は、送液チューブで接続される。補給培地送液ポンプは、送液チューブを介して、初期化浮遊培養器の容器７６内に培地を送液する。初期化浮遊培養器の容器７６には、廃液チューブが接続されている。初期化浮遊培養器の容器７６内の培地は、廃液チューブを介して排出される。初期化浮遊培養器の容器７６内の培地は、例えば、補給培地送液ポンプによって補給される新鮮な培地による圧力によって排出されてもよいし、重力を利用して排出してもよいし、排出ポンプによって排出してもよい。
　補給培地送液ポンプから初期化浮遊培養器に送液される培地の温度は、例えば、初期化浮遊培養器中の培地の温度が急激に変化しないように設定される。例えば、初期化浮遊培養器中の培地の温度が３７℃である場合は、初期化浮遊培養器に送液される培地の温度も３７℃に設定される。ただし、初期化浮遊培養器に送液される前の培地は、冷蔵保存部で、例えば４℃等の低温で冷蔵保存されていてもよい。
　例えば、補給培地送液ポンプによって初期化浮遊培養器の容器７６内に送液される培地の量と、初期化浮遊培養器の容器７６から排出される培地の量と、が同じになるよう、補給培地送液ポンプは制御される。補給培地送液ポンプは、初期化浮遊培養器の容器７６内に、常時、培地を送液してもよいし、適宜間隔をおいて、培地を送液してもよい。
　培地を常時送液する場合、送液される培地の流量は、一定であっても、一定でなくてもよい。例えば、培地及び培地中の細胞塊を撮影装置で監視し、培地及び培地中の細胞塊の状態に応じて、送液される培地の流量を増加させたり、減少させたりしてもよい。
　また、培地を常時送液せずに、培地及び培地中の細胞塊の状態に応じて、培地の送液の開始及び終了をしてもよい。この場合も、培地及び培地中の細胞塊の状態に応じて、送液される培地の流量を増加させたり、減少させたりしてもよい。
　なお、初期化浮遊培養器に送液される培地の流量が大きすぎると、初期化浮遊培養器内の細胞が培地の圧力によりダメージを受ける場合がある。そのため、初期化浮遊培養器に送液される培地の流量は、細胞がダメージを受けないように設定される。
　培地を交換せずに細胞の培養を続けると、細胞が排出する乳酸等の老廃物の蓄積や、ｐＨの変化が、細胞培養に悪影響を及ぼしうる。また、培地中に含まれるｂＦＧＦやリコンビナントタンパク質等の様々なタンパク質が分解され、細胞の培養に必要な成分が培地から損なわれうる。
　これに対し、補給培地送液ポンプで新鮮な培地を初期化浮遊培養器中に送液し、古い培地を初期化浮遊培養器から排出することにより、初期化浮遊培養器中から老廃物を除去し、培地中のｐＨを適切な範囲内に保ち、細胞の培養に必要な成分を補給することが可能になる。これにより、培地の状態を一定に近い状態に保つことが可能である。
　なお、補給培地送液ポンプと、初期化浮遊培養器の容器７６と、を、送液チューブで接続してもよいし、補給培地送液ポンプと、初期化浮遊培養器の容器７６内の透析チューブ７５内と、を送液チューブで接続してもよい。透析チューブ７５内に新鮮な培地を送液することにより、透析チューブ７５内の培地に含まれる老廃物が、透析チューブ７５外に排出される。また、透析チューブ７５内の培地のｐＨを適切な範囲内に保ち、透析チューブ７５内の培地に細胞の培養に必要な成分を補給することが可能である。
　初期化浮遊培養器の構造は、図４から図６に示した構造に限定されない。例えば、図７及び図８に示す初期化浮遊培養器は、誘導因子導入細胞と培地が入れられる透析チューブ７５と、透析チューブ７５が入れられ、透析チューブ７５の周囲に培地が入れられる容器７６であって、内側面にらせん状の溝２７２が設けられている容器７６と、容器７６内の溝２７２に沿って培地が流れるよう、容器７６内に培地を供給するポンプと、を備えている。
　初期化浮遊培養器の容器７６の上部には、容器７６内外に連通する第１の連通孔２７３が設けられており、容器７６の下部には、容器７６内外に連通する第２の連通孔２７４が設けられている。例えば、第１の連通孔２７３から容器７６内に培地が導入され、導入された培地が、溝２７２に沿って回転流を生じさせながら容器７６の下部に導かれ、第２の連通孔２７４から、容器７６外に排出される。第２の連通孔２７４から排出された培地は、循環経路を経て、再び第１の連通孔２７３から容器７６内に導入されてもよい。
　あるいは、第２の連通孔２７４から容器７６内に培地が導入され、導入された培地が、溝２７２に沿って回転流を生じさせながら容器７６の上部に導かれ、第１の連通孔２７３から、容器７６外に排出されてもよい。第１の連通孔２７３から排出された培地は、循環経路を経て、再び第２の連通孔２７４から容器７６内に導入されてもよい。
　なお、らせん状の溝２７２は、容器７６の内壁に直接設けられていてもよいし、容器７６の内壁に、らせん状の溝が設けられた部材を配置してもよい。
　また、例えば、図９及び図１０に示す初期化浮遊培養器は、誘導因子導入細胞と培地が入れられる透析チューブ７５と、透析チューブ７５が入れられ、透析チューブ７５の周囲に培地が入れられる容器７６と、透析チューブ７５内に液流が生じるよう、透析チューブ７５内に培地を供給するポンプと、を備える。
　初期化浮遊培養器の透析チューブ７５の上部には、透析チューブ７５内外に連通する第１の連通孔２７５が設けられており、透析チューブ７５の下部には、透析チューブ７５内外に連通する第２の連通孔２７６が設けられている。例えば、第１の連通孔２７５から透析チューブ７５内に培地が導入され、導入された培地が、透析チューブ７５の下部に導かれ、第２の連通孔２７６から、透析チューブ７５外に排出される。第２の連通孔２７６から排出された培地は、循環経路を経て、再び第１の連通孔２７５から透析チューブ７５内に導入されてもよい。
　あるいは、第２の連通孔２７６から透析チューブ７５内に培地が導入され、導入された培地が、透析チューブ７５の上部に導かれ、第１の連通孔２７５から、透析チューブ７５外に排出されてもよい。第１の連通孔２７５から排出された培地は、循環経路を経て、再び第２の連通孔２７６から透析チューブ７５内に導入されてもよい。
　また、図４から図１０においては、透析チューブを備える初期化浮遊培養器を説明したが、図１１及び図１２に示すように、初期化浮遊培養器は、透析チューブを備えていなくともよい。この場合、細胞は、容器７６内で攪拌浮遊培養される。
　細胞処理装置は、図１に示す初期化培養装置５０における培養を撮影する写真カメラやビデオカメラ等の初期化培養撮影装置をさらに備えていてもよい。ここで、初期化培養装置５０で使用される培地に無色の培地を用いると、有色の培地を用いた場合に生じうる乱反射や自家蛍光を抑制することが可能となる。ただし、培地のｐＨを確認するために、フェノールレッド等のｐＨ指示薬を含んでいてもよい。また、誘導された細胞と、誘導されなかった細胞とでは、細胞の形状及び大きさ等が異なるため、細胞処理装置は、初期化培養装置５０における細胞を撮影することにより、誘導された細胞の割合を算出する誘導状態監視装置を、さらに備えていてもよい。あるいは、誘導状態監視装置は、抗体免疫染色法又はＲＮＡ抽出法により、誘導された細胞の割合を特定してもよい。さらに、細胞処理装置は、磁気細胞分離方法やフローサイトメトリー等により、誘導されていない細胞を取り除く、未誘導細胞除去装置を備えていてもよい。
　初期化培養装置５０には、第１細胞塊送液路５１が接続されている。初期化培養装置５０は、細胞塊の含有液を、ポンプ等を用いて、第１細胞塊送液路５１に送り出す。なお、第１細胞塊送液路５１は、所定の大きさ未満の誘導された細胞のみを通す内径を有し、所定の大きさ以上の誘導されていない細胞を除去する分岐流路に接続されていてもよい。
　細胞塊を含む溶液を第１細胞塊送液路５１に送り出すポンプは、例えば、細胞塊の大きさの値が、所定の閾値以上になった場合に、駆動されてもよい。あるいは、細胞塊を含む溶液を第１細胞塊送液路５１に送り出すポンプは、例えば、細胞塊の密度の値が、所定の閾値以上になった場合に、駆動されてもよい。
　第１細胞塊送液路５１の内壁には、細胞が接着しないよう、ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡをコーティングして、細胞非接着性にしてもよい。あるいは、第１細胞塊送液路５１の材料に、細胞が接着しにくい材料を用いてもよい。また、第１細胞塊送液路５１の材料に、温度伝導率が良く、二酸化炭素透過性の材料を用いることにより、第１細胞塊送液路５１内の条件が、周囲の管理された温度及び二酸化炭素濃度と同等になる。さらに、第１細胞塊送液路５１には、コンタミネーション防止の観点から、逆流防止弁が設けられていてもよい。
　第１細胞塊送液路５１は、第１の分割機構６０に接続されている。第１の分割機構６０は、例えば、メッシュを備える。溶液に含まれる細胞塊は、水圧によってメッシュを通過する際、メッシュの各孔の大きさの複数の細胞塊に分割される。例えば、メッシュの各孔の大きさが均一であれば、分割後の複数の細胞塊の大きさも、ほぼ均一となる。あるいは、第１の分割機構６０は、ノズルを備えていてもよい。例えば、略円錐状のノズルの内部を階段状に微細加工することにより、溶液に含まれる細胞塊がノズルを通過する際に、複数の細胞塊に分割される。
　第１の分割機構６０には、拡大培養装置７０が接続されている。第１の分割機構６０で分割された細胞塊を含む溶液は、拡大培養装置７０に送られる。
　拡大培養装置７０は、図４から図１０に示したような初期化浮遊培養器と同様の構造を備える拡大浮遊培養器を用いてもよい。拡大培養装置７０においても、図４から図１０に示す浮遊培養器の透析チューブ７５に、複数の細胞塊が入れられる。また、拡大培養装置７０においても、補給培地送液ポンプを用いて、容器７６内の透析チューブ７５の周囲の培地を、交換、あるいは補給する。あるいは、補給培地送液ポンプと、浮遊培養器の容器７６内の透析チューブ７５内と、を送液チューブで接続して、透析チューブ７５内の培地に細胞の培養に必要な成分を補給してもよい。
　あるいは、拡大培養装置７０は、図１１及び図１２に示したような初期化浮遊培養器と同様の構造を備える拡大浮遊培養器を用いてもよい。この場合、容器７６内に複数の細胞塊が入れられる。
　細胞処理装置は、図１に示す拡大培養装置７０における培養を撮影する拡大培養撮影装置をさらに備えていてもよい。ここで、拡大培養装置７０で使用される培地に無色の培地を用いると、有色の培地を用いた場合に生じうる乱反射や自家蛍光を抑制することが可能となる。ただし、培地のｐＨを確認するために、フェノールレッド等のｐＨ指示薬を含んでいてもよい。また、誘導された細胞と、誘導されなかった細胞とでは、細胞の形状及び大きさ等が異なるため、細胞処理装置は、拡大培養装置７０における細胞を撮影することにより、誘導された細胞の割合を算出する誘導状態監視装置を、さらに備えていてもよい。あるいは、誘導状態監視装置は、抗体免疫染色法又はＲＮＡ抽出法により、誘導された細胞の割合を特定してもよい。さらに、細胞処理装置は、磁気細胞分離方法やフローサイトメトリー等により、誘導されていない細胞を取り除く、未誘導細胞除去装置を備えていてもよい。
　拡大培養装置７０は、細胞塊を含む溶液を、拡大培養送液路７１を介して、第１の分割機構６０に送る。第１の分割機構６０で分割された細胞塊は、再び拡大培養装置７０内で培養される。必要な細胞の量が得られるまで、第１の分割機構６０における細胞塊の分割と、拡大培養装置７０内での細胞塊の培養が繰り返される。
　拡大培養装置７０中の細胞塊を含む溶液を、拡大培養送液路７１を介して、第１の分割機構６０に送り出すポンプは、例えば、細胞塊の大きさの値が、所定の閾値以上になった場合に、駆動されてもよい。あるいは、細胞塊を含む溶液を第１細胞塊送液路５１に送り出すポンプは、例えば、細胞塊の密度の値が、所定の閾値以上になった場合に、駆動されてもよい。
　拡大培養装置７０には、第２細胞塊送液路７２が接続されている。拡大培養装置７０は、拡大培養された細胞塊の含有液を、ポンプ等を用いて、第２細胞塊送液路７２に送り出す。第２細胞塊送液路７２は、所定の大きさ未満の誘導された細胞のみを通す内径を有し、所定の大きさ以上の誘導されていない細胞を除去する分岐流路に接続されていてもよい。
　第２細胞塊送液路７２の内壁には、細胞が接着しないよう、ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡをコーティングして、細胞非接着性にしてもよい。あるいは、第２細胞塊送液路７２の材料に、細胞が接着しにくい材料を用いてもよい。また、第２細胞塊送液路７２の材料に、温度伝導率が良く、二酸化炭素透過性の材料を用いることにより、第２細胞塊送液路７２内の条件が、周囲の管理された温度及び二酸化炭素濃度と同等になる。さらに、第２細胞塊送液路７２には、コンタミネーション防止の観点から、逆流防止弁が設けられていてもよい。
　第２細胞塊送液路７２は、第２の分割機構８０に接続されている。第２の分割機構８０は、例えば、メッシュを備える。溶液に含まれる細胞塊は、水圧によってメッシュを通過する際、メッシュの各孔の大きさの複数の細胞塊に分割される。例えば、メッシュの各孔の大きさが均一であれば、分割後の複数の細胞塊の大きさも、ほぼ均一となる。あるいは、第２の分割機構８０は、ノズルを備えていてもよい。例えば、略円錐状のノズルの内部を階段状に微細加工することにより、溶液に含まれる細胞塊がノズルを通過する際に、複数の細胞塊に分割される。
　第２の分割機構８０に、複数の細胞魂をパッケージ装置１００に順次送る細胞魂搬送機構９０が接続されている。細胞魂搬送機構９０と、パッケージ装置１００と、の間には、パッケージ前細胞流路９１が接続されている。細胞魂搬送機構９０は、ポンプ等を用いて、第２の分割機構８０で分割された細胞塊のそれぞれを、パッケージ前細胞流路９１を介して、パッケージ装置１００に順次送る。
　パッケージ前細胞流路９１には、細胞が接着しないよう、ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡをコーティングしてもよい。あるいは、パッケージ前細胞流路９１の材料に、細胞が接着しにくい材料を用いてもよい。また、パッケージ前細胞流路９１の材料に、温度伝導率が良く、二酸化炭素透過性の材料を用いることにより、パッケージ前細胞流路９１内の条件が、周囲の管理された温度及び二酸化炭素濃度と同等になる。パッケージ前細胞流路９１には、コンタミネーション防止の観点から、逆流防止弁が設けられていてもよい。
　パッケージ前細胞流路９１には、凍結保存液送液機構１１０が接続されている。凍結保存液送液機構１１０は、細胞凍結保存液をパッケージ前細胞流路９１に送り込む。これにより、パッケージ前細胞流路９１内で、細胞塊が細胞凍結保存液で懸濁される。
　パッケージ装置１００は、パッケージ前細胞流路９１を介して送られてきた複数の細胞塊のそれぞれを順次凍結する。例えば、パッケージ装置１００は、細胞塊を受け取るたびに細胞塊をクライオチューブ等の凍結保存容器に入れ、細胞塊溶液を例えば－８０℃以下で瞬間的に凍結する。体積あたりの表面積が小さい凍結保存容器を用いると、凍結に時間がかかる傾向にあるため、体積あたりの表面積が大きい凍結保存容器を用いることが好ましい。体積あたりの表面積が大きい凍結保存容器を用いることにより、解凍後の細胞の生存率を高くすることが可能となる。凍結保存容器の形状としては、キャピラリー状及び球状が挙げられるが、これらに限定されない。また、必要とされる解凍後の細胞の生存率によっては、必ずしも瞬間凍結をしなくともよい。
　凍結には、例えば、ガラス化（Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法を用いる。この場合、細胞凍結保存液としては、ＤＡＰ２１３（コスモバイオ株式会社）及びＦｒｅｅｚｉｎｇ　Ｍｅｄｉｕｍ（リプロセル株式会社）が使用可能である。凍結は、ガラス化法以外の通常の方法で行ってもよい。この場合、細胞凍結保存液としては、ＣｒｙｏＤｅｆｅｎｄ－Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ（Ｒ＆Ｄシステム社）や、ＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標、日本全薬工業株式会社）等が使用可能である。凍結は、液体窒素によって行ってもよいし、ペルチェ素子によっておこなってもよい。ペルチェ素子を用いると、温度変化を制御したり、温度のムラを抑制したりすることが可能となる。凍結細胞が臨床用途である場合は、凍結保存容器は完全閉鎖系であることが好ましい。ただし、パッケージ装置１００は、幹細胞を凍結することなく、保存容器内にパッケージしてもよい。
　あるいは、パッケージ装置１００においては、図１３に示すような溶液置換器１０１を用いて、細胞塊の溶液を培地から凍結保存液に置換してもよい。溶液置換器１０１の内部には、底面上に、細胞塊が透過しない細孔が設けられたフィルター１０２が設けられている。また、溶液置換器１０１には、内部のフィルター１０２上に細胞塊を含む培地を送液する第１の送液流路１０３が接続された細胞塊導入孔、内部のフィルター１０２上に細胞塊を含まない凍結液を送液する第２の送液流路１０４が接続された置換溶液導入孔、内部のフィルター１０２上から細胞塊を含む凍結液を排出する第１の排出流路１０５が接続された細胞塊流出孔が設けられている。さらに、溶液置換器１０１には、フィルター１０２を透過した溶液を排出する第２の排出流路１０６が接続された廃液流出孔が設けられている。第１の送液流路１０３、第２の送液流路１０４、第１の排出流路１０５、及び第２の排出流路１０６のそれぞれには、チューブ等が使用可能である。
　まず、図１３（ａ）及び図１３（ｂ）に示すように、第２の排出流路１０６における溶液の流動を停止させた状態で、第１の送液流路１０３から溶液置換器１０１内部に、細胞塊を含む培地を入れる。次に、図１３（ｃ）に示すように、第２の排出流路１０６における溶液の流動を許容する状態にし、培地を溶液置換器１０１から排出する。この際、図１３（ｄ）に示すように、細胞塊は、フィルター１０２上に残る。さらに、図１３（ｅ）及び図１３（ｆ）に示すように、第２の排出流路１０６における溶液の流動を停止させた状態で、第２の送液流路１０４から溶液置換器１０１内部に、凍結保存液を入れ、凍結保存液中に細胞塊を分散させる。その後、図１３（ｇ）に示すように、第１の排出流路１０５から、細胞塊を含む凍結保存液を排出する。細胞塊を含む凍結保存液は、第１の排出流路１０５を経由して、凍結保存容器等に送られる。
　図１に示す細胞処理装置は、分離装置１０、導入前細胞送液路２０、誘導因子送液機構２１、因子導入装置３０、細胞塊作製装置４０、及びパッケージ装置１００等の動作記録、並びに撮影装置が撮影した画像を、有線又は無線により、外部のサーバーに送信してもよい。また、外部のサーバーにおいて、ニューラルネットワークにより、例えば、誘導因子導入条件、培養条件、及び凍結条件等の条件と、幹細胞の不完全な初期化、幹細胞の分化及び増殖の失敗、及び染色体異常等の結果と、の関連を分析し、結果を導く条件を抽出したり、結果を予測したりしてもよい。さらに、外部サーバーは、標準作業手順（ＳＯＰ）に基づいて、細胞処理装置の分離装置１０、誘導因子送液機構２１、因子導入装置３０、細胞塊作製装置４０、及びパッケージ装置１００等を制御し、ＳＯＰに基づいて各装置が稼働しているか否かを監視し、各装置の稼働記録を自動的に生成してもよい。
　以上説明した細胞処理装置によれば、自動で、ｉＰＳ細胞等の幹細胞の誘導を行うことが可能である。
　なお、実施形態に係る細胞処理装置は、図１に示す構成に限定されない。例えば、図１４に示す細胞処理装置においては、血液保存部２０１から単核球分離部２０３に、血液送液路２０２を経由して血液が送液される。血液保存部２０１及び単核球分離部２０３としては、例えばチューブが使用可能である。血液送液路２０２は、例えば、樹脂チューブやシリコンチューブ等である。後述する他の送液路も同様である。血液保存部２０１には、バーコード等の識別子を付けて、血液の情報を管理してもよい。送液には、ポンプ２０４が使用される。
　ポンプ２０４としては、容積式ポンプが使用可能である。容積式ポンプの例としては、ピストンポンプ、プランジャーポンプ、及びダイヤフラムポンプを含む往復ポンプ、あるいは、ギアポンプ、ベーンポンプ、及びネジポンプを含む回転ポンプが挙げられる。ダイヤフラムポンプの例としては、チュービングポンプ及び圧電（ピエゾ）ポンプが挙げられる。チュービングポンプの例としては、ペリスタポンプ（登録商標、アトー株式会社）、並びにＲＰ－Ｑ１及びＲＰ－ＴＸ（高砂電気工業株式会社）が挙げられる。圧電ポンプの例としては、ＳＤＭＰ３０４、ＳＤＰ３０６、ＳＤＭ３２０、及びＡＰＰ－２０ＫＧ（高砂電気工業株式会社）が挙げられる。また、様々な種類のポンプを組み合わせたマイクロ流体チップモジュール（高砂電気工業株式会社）を用いてもよい。
　ペリスタポンプ（登録商標）、チュービングポンプ、及びダイヤフラムポンプ等の密閉型ポンプを用いると、血液送液路２０２内部の血液にポンプが直接接触することなく、送液することが可能である。後述する他のポンプにおいても同様である。あるいは、ポンプ２０４、並びに後述するポンプ２０７、ポンプ２１６、ポンプ２２２、ポンプ２２５、ポンプ２３４、ポンプ２４２、及びポンプ２５２としては、シリンジポンプを使用してもよい。密閉型ポンプ以外のポンプであっても、加熱滅菌処理等により再利用が可能である。
　単核球分離部２０３には、分離剤保存部２０５から、送液路２０６及びポンプ２０７を介して、赤血球凝固剤が送られる。分離剤保存部２０５としては、例えばチューブが使用可能である。分離剤保存部２０５には、バーコード等の識別子を付けて、分離剤の情報を管理してもよい。赤血球凝固剤としては、例えば、ＨｅｔａＳｅｐ（登録商標、ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）や赤血球凝固剤（ニプロ）等が使用可能である。単核球分離部２０３内において、赤血球凝固剤によって赤血球が沈降し、単核球細胞が分離される。単核球分離部２０３内の単核球細胞を含む上澄みは、単核球送液路２０８及びポンプ２０９を介して、単核球精製フィルター２１０に送られる。単核球精製フィルター２１０において、単核球細胞以外の成分が除去され、単核球細胞を含む溶液が得られる。単核球精製フィルター２１０としては、Ｐｕｒｅｃｅｌｌ（登録商標、ＰＡＬＬ）、セルソーバＥ（旭化成株式会社）、セパセルＰＬ（旭化成株式会社）、アダカラム（登録商標、ＪＩＭＲＯ）、及び分離バック（二プロ株式会社）等が使用可能である。
　図１４においては、単核球分離部２０３、分離剤保存部２０５、単核球精製フィルター２１０、及びポンプ２０４、２０７、２０９等が、分離装置を構成している。
　単核球細胞を含む溶液は、導入前細胞送液路２１１及びポンプ２１２を介して、因子導入部２１３に送られる。因子導入部２１３としては、例えばチューブが使用可能である。因子導入部２１３には、多能性誘導因子を含む因子保存部２１４から、因子送液路２１５及びポンプ２１６を介して、多能性誘導因子が送られる。因子保存部２１４としては、例えばチューブが使用可能である。因子保存部２１４には、バーコード等の識別子を付けて、多能性誘導因子の情報を管理してもよい。因子保存部２１４及びポンプ２１６等が、誘導因子送液機構を構成している。因子導入装置としての因子導入部２１３において、多能性誘導因子が、例えばＲＮＡリポフェクション法によって細胞に導入され、誘導因子導入細胞が作製される。ただし、誘導因子のトランスフェクションの方法は、ＲＮＡリポフェクション法に限定されない。例えば、多能性誘導因子を含むセンダイウイルスベクターを用いてもよい。あるいは、多能性誘導因子がタンパク質であってもよい。
　誘導因子導入細胞は、導入細胞送液路２１７及びポンプ２１８を介して、細胞塊作製装置の一部としての初期化浮遊培養器２１９に送られる。導入細胞送液路２１７は、例えば、温度透過性かつ二酸化炭素透過性である。初期化浮遊培養器２１９は、例えば、図４から図１０に示したような構造を備える。この場合、誘導因子導入細胞は、透析チューブ内に入れられる。あるいは、初期化浮遊培養器２１９は、例えば、図１１及び図１２に示したような構造を備える。この場合、誘導因子導入細胞は、容器内に入れられる。
　図１４に示す初期化浮遊培養器２１９には、細胞に多能性誘導因子が導入されてから最初の数日間、血液細胞培地を含む血液細胞培地保存部２２０から、培地送液路２２１及びポンプ２２２を介して、血液細胞培地が補給される。培地送液路２２１は、例えば、温度透過性かつ二酸化炭素透過性である。血液細胞培地保存部２２０には、バーコード等の識別子を付けて、血液細胞培地の情報を管理してもよい。血液細胞培地保存部２２０、培地送液路２２１、及びポンプ２２２は、培地補給装置を構成している。ポンプ２２２は、血液細胞培地を連続的に補給してもよいし、血液細胞培地を所定のタイミングで補給してもよい。
　その後、初期化浮遊培養器２１９には、幹細胞培地を含む幹細胞培地保存部２２３から、培地送液路２２４及びポンプ２２５を介して、幹細胞培地が補給される。幹細胞培地保存部２２３には、バーコード等の識別子を付けて、幹細胞培地の情報を管理してもよい。培地送液路２２４は、例えば、温度透過性かつ二酸化炭素透過性である。幹細胞培地保存部２２３、培地送液路２２４、及びポンプ２２５は、培地補給装置を構成している。ポンプ２２５は、幹細胞培地を連続的に補給してもよいし、幹細胞培地を所定のタイミングで補給してもよい。
　血液細胞培地保存部２２０及び幹細胞培地保存部２２３は、例えば、冷蔵保存部２６０で４℃等の低温で冷蔵保存されていてもよい。血液細胞培地保存部２２０及び幹細胞培地保存部２２３から送られる培地は、例えば、冷蔵保存部２６０の外の加熱器で３７℃に昇温されてから培養器に送れてもよい。あるいは、低温保存されていた培地は、送液路を進む間に３７℃に昇温するよう、送液路の周囲の温度を設定してもよい。初期化浮遊培養器２１９内の古くなった培地は、廃液送液路２２６及びポンプ２２７を介して、廃液保管部２２８に送られる。廃液保管部２２８には、バーコード等の識別子を付けて、廃液の情報を管理してもよい。
　初期化浮遊培養器２１９で培養された細胞塊は、導入細胞送液路２２９、ポンプ２３０、及び細胞塊分割器２３１を介して、細胞塊作製装置の一部としての第１の拡大浮遊培養器２３２へ送られる。細胞塊分割器２３１を通過することにより、細胞塊は、より小さな細胞塊に分割される。第１の拡大浮遊培養器２３２は、例えば、図４から図１０に示したような構造を備える。この場合、細胞塊は、透析チューブ内に入れられる。あるいは、第１の拡大浮遊培養器２３２は、例えば、図１１及び図１２に示したような構造を備える。この場合、細胞塊は、容器内に入れられる。
　図１４に示す第１の拡大浮遊培養器２３２には、幹細胞培地を含む幹細胞培地保存部２２３から、培地送液路２３３及びポンプ２３４を介して、幹細胞培地が補給される。導入細胞送液路２２９及び培地送液路２３３は、例えば、温度透過性かつ二酸化炭素透過性である。幹細胞培地保存部２２３、培地送液路２３３、及びポンプ２３４は、培地補給装置を構成している。ポンプ２３４は、幹細胞培地を連続的に補給してもよいし、幹細胞培地を所定のタイミングで補給してもよい。
　第１の拡大浮遊培養器２３２内の古くなった培地は、廃液送液路２３５及びポンプ２３６を介して、廃液保管部２２８に送られる。
　第１の拡大浮遊培養器２３２で培養された細胞塊は、導入細胞送液路２３７、ポンプ２３８、細胞塊分割器２３９を経て、細胞塊作製装置の一部としての第２の拡大浮遊培養器２４０へ送られる。細胞塊分割器２３９を通過することにより、細胞塊は、より小さな細胞塊に分割される。図１４に示す第２の拡大浮遊培養器２４０、例えば、図４から図１０に示したような構造を備える。この場合、細胞塊は、透析チューブ内に入れられる。あるいは、第２の拡大浮遊培養器２４０、例えば、図１１及び図１２に示したような構造を備える。この場合、細胞塊は、容器内に入れられる。
　図１４に示す第２の拡大浮遊培養器２４０には、幹細胞培地を含む幹細胞培地保存部２２３から、培地送液路２４１及びポンプ２４２を介して、幹細胞培地が補給される。導入細胞送液路２３７及び培地送液路２４１は、例えば、温度透過性かつ二酸化炭素透過性である。幹細胞培地保存部２２３、培地送液路２４１、及びポンプ２４２は、培地補給装置を構成している。ポンプ２４２は、幹細胞培地を連続的に補給してもよいし、幹細胞培地を所定のタイミングで補給してもよい。
　第２の拡大浮遊培養器２４０内の古くなった培地は、廃液送液路２４３及びポンプ２４４を介して、廃液保管部２２８に送られる。
　第２の拡大浮遊培養器２４０で培養された細胞塊は、導入細胞送液路２４５及びポンプ２４６を経て、溶液置換器２４７へ送られる。溶液置換器２４７は、例えば図１３に示す構成を備えていてもよい。図１４に示す溶液置換器２４７内において、細胞塊はフィルターで保持され、培地は、廃液送液路２４８及びポンプ２４９を介して、廃液保管部２２８に送られる。
　ポンプ２４９の駆動停止により廃液送液路２４８内の溶液の流動を停止した後、あるいは弁等で廃液送液路２４８を閉じた後、溶液置換器２４７には、凍結保存液を含む凍結保存液保存部２５０から、送液路２５１及びポンプ２５２を介して、凍結保存液が入れられる。これにより、凍結保存液中に細胞塊が分散する。
　細胞塊を分散させた凍結保存液は、パッケージ装置の一部としての送液路２５３及びポンプ２５４を介して、凍結保存容器２５５内に送られる。凍結保存容器２５５は、低温保管庫２５６に入れられている。低温保管庫２５６には、液体窒素保管庫２５７から送液路２５８を介して、例えば－８０℃の液体窒素が送られる。これにより、凍結保存容器２５５内の細胞塊が凍結させられる。ただし、細胞塊の凍結は、液体窒素に依らなくともよい。例えば、低温保管庫２５６が、圧縮式冷凍庫、吸収式冷凍庫、あるいはペルチェ式冷凍庫等の冷凍庫であってもよい。
　上述した送液路には、適宜、逆流防止弁を設けてもよい。上述した送液路、単核球分離部２０３、単核球精製フィルター２１０、因子導入部２１３、初期化浮遊培養器２１９、第１の拡大浮遊培養器２３２、第２の拡大浮遊培養器２４０、及び溶液置換器２４７等は、例えば部材２５９に配置されている。部材２５９の材料は、例えば樹脂であるが、これに限定されない。部材２５９は、例えば、滅菌処理可能な耐熱性材料からなる。部材２５９の形状は、板状であってもよいし、カセット状であってもよい。また、部材２５９は、可撓性のバックであってもよい。培地が流れる送液路は、例えば、二酸化炭素透過性材料からなる。また、上述した送液路、単核球分離部２０３、単核球精製フィルター２１０、因子導入部２１３、初期化浮遊培養器２１９、第１の拡大浮遊培養器２３２、第２の拡大浮遊培養器２４０、及び溶液置換器２４７等は、複数のケースに分割されて格納されてもよい。
　例えば、部材２５９及び部材２５９に設けられた流路等は使い捨て可能であり、細胞塊の凍結が完了した後は、廃棄して、新しいものと交換してもよい。あるいは、部材２５９及び部材２５９に設けられた流路等を再利用する場合は、部材２５９にバーコード等の識別子を付け、使用回数等を管理してもよい。
　以上説明した実施形態に係る細胞処理装置によれば、自動的にｉＰＳ細胞等の幹細胞を誘導することが可能である。
　上記のように、本発明を実施形態によって記載したが、この開示の一部をなす記述及び図面はこの発明を限定するものであると理解するべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施形態、実施形態及び運用技術が明らかになるはずである。例えば、因子導入装置３０は、エレクトロポレーションやＲＮＡリポフェクションではなく、レトロウイルス、レンチウイルス、及びセンダイウイルス等のウイルスベクターや、プラスミドを用いるトランスフェクション、あるいはタンパク質トランスフェクションにより、細胞を誘導してもよい。また、導入前細胞送液路２０、導入細胞送液路３１、細胞塊送液路５１、拡大培養送液路７１、細胞塊送液路７２、及びパッケージ前細胞流路９１はマイクロフルイディクス技術により基板上に設けられていてもよい。この様に、本発明はここでは記載していない様々な実施形態等を包含するということを理解すべきである。
　（実施例１）
　ゲル培地ではない液体培地である、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）に懸濁した５×１０６個の繊維芽細胞（ＨＤＦ１４１９、Ｃｅｌｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　Ｉｎｃ．）を、ウェルディッシュの各ウェルに播種し、ウェルディッシュを３７℃のＣＯ２インキュベーター中に静置して、繊維芽細胞を接着培養した。２４時間後、パントロピックレトロウイルス発現システム（Ｐｌａｔ－ＧＰ、Ｐａｎｔｒｏｐｉｃ、Ｐｌａｔ－ＧＰ）を用いて、繊維芽細胞に初期化因子ＯＳＫＭ（ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ－ＭＹＣ）を導入した。その後７日間、２４時間ごとに培地を交換した。
　０．２５％のトリプシンを利用して細胞をウェルからはがし、細胞数を測定した。さらに、ｂＦＧＦを含有していないｈＥＳ培地（Ｐｒｉｍａｔｅ　ＥＳ　Ｃｅｌｌ　Ｍｅｄｉｕｍ、リプロセル）に脱アシル化ジェランガムが０．０２質量％になるよう添加して、ゲル培地を用意した。用意したゲル培地に、濃度が１×１０５個／ｍＬになるよう細胞を懸濁し、培養器の容器に入れた。その後、マグネットとスターラーを利用して、ＣＯ２インキュベーター中で細胞の攪拌浮遊培養を２２日間行った。その間、４８時間ごとに、１０ｍＬの培地を培養器に添加した。
　培養後、図１５の写真に示すように、細胞塊の形成が確認された。後述するゲル培地ではない液体培地を使った場合（図１８）と比較して、細胞塊の大きさは均一であった。回収した細胞の一部を、未分化であることを示す細胞表面マーカーであるＴＲＡ－１－６０に対する抗体を用いて、ＦＡＣＳで解析したところ、図１６に示すように、細胞がＴＲＡ－１－６０陽性であることが確認された。回収した残りの細胞は、フィーダー細胞上に播種し、５日間培養した。その後、パラホルムアルデヒドで細胞コロニーを固定し、ＯＣＴ３／４に対する抗体で細胞を免疫染色したところ、図１７に示すように、細胞がＯＣＴ３／４陽性であることが確認された。したがって、繊維芽細胞からｉＰＳ細胞が誘導されたことが示された。
　（実施例２）
　実施例１と同様に、繊維芽細胞に初期化因子ＯＳＫＭ（ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ－ＭＹＣ）を導入した。その後７日間、２４時間ごとに培地を交換した。
　０．２５％のトリプシンを利用して細胞をウェルからはがし、細胞数を測定した。さらに、ｂＦＧＦを含有しているｈＥＳ培地（Ｐｒｉｍａｔｅ　ＥＳ　Ｃｅｌｌ　Ｍｅｄｉｕｍ、リプロセル）を用意した。当該培地は、ポリマーを添加しておらず、ゲル培地ではない液体培地であった。用意した液体培地に、濃度が１×１０５個／ｍＬになるよう細胞を懸濁し、培養器の容器に入れた。その後、マグネットとスターラーを利用して、ＣＯ２インキュベーター中で細胞の攪拌浮遊培養を８日間行った。その間、４８時間ごとに、１０ｍＬの培地を培養器に添加した。
　培養後、図１８の写真に示すように、細胞塊の形成が確認された。回収した細胞の一部を、未分化であることを示す細胞表面マーカーであるＴＲＡ－１－６０に対する抗体を用いて、ＦＡＣＳで解析したところ、図１９に示すように、細胞がＴＲＡ－１－６０陽性であることが確認された。回収した残りの細胞は、フィーダー細胞上に播種し、５日間培養した。その後、パラホルムアルデヒドで細胞コロニーを固定し、ＯＣＴ３／４に対する抗体で細胞を免疫染色したところ、図２０に示すように、細胞がＯＣＴ３／４陽性であることが確認された。したがって、繊維芽細胞を初期化し、ｉＰＳ細胞が誘導されたことが示された。
　（実施例３）
　実施例１と同様に、繊維芽細胞に初期化因子ＯＳＫＭ（ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃ－ＭＹＣ）を導入した。その後７日間、２４時間ごとに培地を交換した。
　０．２５％のトリプシンを利用して細胞をウェルからはがし、細胞数を測定した。さらに、ｂＦＧＦを含有していないｈＥＳ培地（Ｐｒｉｍａｔｅ　ＥＳ　Ｃｅｌｌ　Ｍｅｄｉｕｍ、リプロセル）に脱アシル化ジェランガムが０．０２質量％になるよう添加して、ゲル培地を用意した。用意したゲル培地に、濃度が１×１０５個／ｍＬになるよう細胞を懸濁し、透析チューブを有しない培養器又は図５に示すような培養器の透析チューブに入れた。
　いずれの培養器も、ＣＯ２インキュベーター中に配置した。その後、透析チューブを有しない培養器においては、ゲル培地を撹拌することなく、細胞を２０日間浮遊培養した。一方、透析チューブを有する培養器においては、マグネットとスターラーを利用して、透析チューブの外側の容器内のゲル培地を撹拌し、細胞の浮遊培養を２０日間行った。その間、４８時間ごとに、１０ｍＬの培地を培養器に添加した。
　培養後、図２１の写真に示すように、細胞塊の形成が確認された。回収した細胞の数を計測したところ、図２２に示すように、細胞を透析チューブに入れて撹拌培養した場合の方が、透析チューブに入れなかった場合より、細胞数が多かった。このことは、透析チューブの外側の撹拌されている培地から、栄養成分等が透析チューブ内の細胞に効率的に補給されていたことを示している。回収した細胞は、フィーダー細胞上に播種し、５日間培養した。その後、パラホルムアルデヒドで細胞コロニーを固定し、ＯＣＴ３／４に対する抗体で細胞を免疫染色したところ、図２３（透析チューブを用いて培養）及び図２４（透析チューブを用いずに培養）に示すように、細胞がＯＣＴ３／４陽性であることが確認された。したがって、繊維芽細胞からｉＰＳ細胞が誘導されたことが示された。
　１０・・・分離装置、２０・・・導入前細胞送液路、２１・・・誘導因子送液機構、３０・・・因子導入装置、３１・・・導入細胞送液路、４０・・・細胞塊作製装置、５０・・・初期化培養装置、５１・・・細胞塊送液路、６０・・・分割機構、７０・・・拡大培養装置、７１・・・拡大培養送液路、７２・・・細胞塊送液路、７４・・・駆動装置、７５・・・透析チューブ、７６・・・容器、８０・・・分割機構、９０・・・細胞魂搬送機構、９１・・・パッケージ前細胞流路、１００・・・パッケージ装置、１０１・・・溶液置換器、１０２・・・フィルター、１０３・・・送液流路、１０４・・・送液流路、１０５・・・排出流路、１０６・・・排出流路、１１０・・・凍結保存液送液機構、２０１・・・血液保存部、２０２・・・血液送液路、２０３・・・単核球分離部、２０４・・・ポンプ、２０５・・・分離剤保存部、２０６・・・送液路、２０７・・・ポンプ、２０８・・・単核球送液路、２０９・・・ポンプ、２１０・・・単核球精製フィルター、２１１・・・導入前細胞送液路、２１２・・・ポンプ、２１３・・・因子導入部、２１４・・・因子保存部、２１５・・・因子送液路、２１６・・・ポンプ、２１７・・・導入細胞送液路、２１８・・・ポンプ、２１９・・・初期化浮遊培養器、２２０・・・血液細胞培地保存部、２２１・・・培地送液路、２２２・・・ポンプ、２２３・・・幹細胞培地保存部、２２４・・・培地送液路、２２５・・・ポンプ、２２６・・・廃液送液路、２２７・・・ポンプ、２２８・・・廃液保管部、２２９・・・導入細胞送液路、２３０・・・ポンプ、２３１・・・細胞塊分割器、２３２・・・拡大浮遊培養器、２３３・・・培地送液路、２３４・・・ポンプ、２３５・・・廃液送液路、２３６・・・ポンプ、２３７・・・導入細胞送液路、２３８・・・ポンプ、２３９・・・細胞塊分割器、２４０・・・拡大浮遊培養器、２４１・・・培地送液路、２４２・・・ポンプ、２４３・・・廃液送液路、２４４・・・ポンプ、２４５・・・導入細胞送液路、２４６・・・ポンプ、２４７・・・溶液置換器、２４８・・・廃液送液路、２４９・・・ポンプ、２５０・・・凍結保存液保存部、２５１・・・送液路、２５２・・・ポンプ、２５３・・・送液路、２５４・・・ポンプ、２５５・・・凍結保存容器、２５６・・・低温保管庫、２５７・・・液体窒素保管庫、２５８・・・送液路、２５９・・・部材、２６０・・・冷蔵保存部、２７１・・・攪拌部材、２７２・・・溝、２７３・・・連通孔、２７４・・・連通孔、２７５・・・連通孔、２７６・・・連通孔

Claims (36)

  1. 　細胞に多能性誘導因子を導入して誘導因子導入細胞を作製する因子導入装置と、
    　前記因子導入装置で作製された誘導因子導入細胞を浮遊培養するための浮遊培養器と、
    　を備える、細胞処理装置。
  2. 　前記浮遊培養器内で前記誘導因子導入細胞が初期化される、請求項１に記載の細胞処理装置。
  3. 　前記浮遊培養器内で前記誘導因子導入細胞が初期化され、拡大培養される、請求項１に記載の細胞処理装置。
  4. 　前記浮遊培養器が、
    　前記誘導因子導入細胞と培地が入れられる半透膜と、
    　前記半透膜が入れられ、前記半透膜の周囲に培地が入れられる容器と、
    　前記容器内の培地を攪拌させるための駆動装置と、
    　を備える、請求項１に記載の細胞処理装置。
  5. 　前記容器内に攪拌部材が設けられている、請求項４に記載の細胞処理装置。
  6. 　前記駆動装置が、磁力を介して、前記攪拌部材を回転させる、請求項５に記載の細胞処理装置。
  7. 　前記浮遊培養器が、
    　前記誘導因子導入細胞と培地が入れられる半透膜と、
    　前記半透膜が入れられ、前記半透膜の周囲に培地が入れられる容器であって、内側面にらせん状の溝が設けられている容器と、
    　前記容器内の溝に沿って前記培地が流れるよう、前記容器内に前記培地を供給するポンプと、
    　を備える、請求項１に記載の細胞処理装置。
  8. 　前記因子導入装置で作製された誘導因子導入細胞が、前記浮遊培養器の半透膜内に送られる、請求項４から７のいずれか１項に記載の細胞処理装置。
  9. 　前記浮遊培養器が、
    　培地が入れられる半透膜と、
    　前記半透膜が入れられ、前記半透膜の周囲に前記誘導因子導入細胞と培地が入れられる容器と、
    　前記半透膜内に前記培地の液流が生じるよう、前記半透膜内に前記培地を供給するポンプと、
    　を備える、請求項１に記載の細胞処理装置。
  10. 　前記因子導入装置で作製された誘導因子導入細胞が、前記容器内の前記半透膜の外に送られる、請求項９に記載の細胞処理装置。
  11. 　前記浮遊培養器が、
    　前記誘導因子導入細胞と培地が入れられる容器と、
    　前記容器内の培地を攪拌させるための駆動装置と、
    　を備える、請求項１に記載の細胞処理装置。
  12. 　前記容器内に攪拌部材が設けられている、請求項１１に記載の細胞処理装置。
  13. 　前記駆動装置が、磁力を介して、前記攪拌部材を回転させる、請求項１２に記載の細胞処理装置。
  14. 　前記浮遊培養器が、
    　前記誘導因子導入細胞と培地が入れられる容器であって、内側面にらせん状の溝が設けられている容器と、
    　前記容器内の溝に沿って前記培地が流れるよう、前記容器内に前記培地を供給するポンプと、
    　を備える、請求項１に記載の細胞処理装置。
  15. 　前記因子導入装置で作製された誘導因子導入細胞が、前記浮遊培養器の容器内に送られる、請求項１１から１４のいずれか１項に記載の細胞処理装置。
  16. 　前記培地が液体培地である、請求項４から１５のいずれか１項に記載の細胞処理装置。
  17. 　前記培地がゲル培地である、請求項４から１５のいずれか１項に記載の細胞処理装置。
  18. 　細胞と培地が入れられる半透膜と、
    　前記半透膜が入れられ、前記半透膜の周囲に培地が入れられる容器と、
    　前記容器内に設けられた攪拌部材と、
    　を備える、浮遊培養器。
  19. 　前記容器内の培地を攪拌させるための駆動装置をさらに備える、請求項１８に記載の浮遊培養器。
  20. 　前記駆動装置が、磁力を介して、前記攪拌部材を回転させる、請求項１９に記載の浮遊培養器。
  21. 　細胞と培地が入れられる半透膜と、
    　前記半透膜が入れられ、前記半透膜の周囲に培地が入れられる容器であって、内側面にらせん状の溝が設けられている容器と、
    　を備える、浮遊培養器。
  22. 　前記容器内の溝に沿って前記培地が流れるよう、前記容器内に前記培地を供給するポンプをさらに備える、請求項２１に記載の浮遊培養器。
  23. 　細胞と培地が入れられる容器であって、内側面にらせん状の溝が設けられている容器を備える、浮遊培養器。
  24. 　前記容器内の溝に沿って前記培地が流れるよう、前記容器内に前記培地を供給するポンプをさらに備える、請求項２３に記載の浮遊培養器。
  25. 　培地が入れられる半透膜と、
    　前記半透膜が入れられ、前記半透膜の周囲に細胞と培地が入れられる容器と、
    　を備える、浮遊培養器。
  26. 　前記半透膜内に前記培地の液流が生じるよう、前記半透膜内に前記培地を供給するポンプをさらに備える、請求項２５に記載の浮遊培養器。
  27. 　前記培地が液体培地である、請求項１８から２６のいずれか１項に記載の浮遊培養器。
  28. 　前記培地がゲル培地である、請求項１８から２６のいずれか１項に記載の浮遊培養器。
  29. 　細胞に多能性誘導因子を導入して誘導因子導入細胞を作製することと、
    　前記誘導因子導入細胞を浮遊培養して前記誘導因子導入細胞を初期化することと、
    　を含む、幹細胞の誘導方法。
  30. 　前記浮遊培養が、攪拌培養である、請求項２９に記載の幹細胞の誘導方法。
  31. 　前記誘導因子導入細胞を浮遊培養する際に液体培地が用いられる、請求項２９又は３０に記載の幹細胞の誘導方法。
  32. 　前記誘導因子導入細胞を浮遊培養する際にゲル培地が用いられる、請求項２９又は３０に記載の幹細胞の誘導方法。
  33. 　細胞に誘導因子を導入して誘導因子導入細胞を作製することと、
    　前記誘導因子導入細胞を浮遊培養して目的とする体細胞を誘導することと、
    　を含む、細胞の誘導方法。
  34. 　浮遊培養が、攪拌培養である、請求項３３に記載の細胞の誘導方法。
  35. 　前記誘導因子導入細胞を浮遊培養する際に液体培地が用いられる、請求項３３又は３４に記載の細胞の誘導方法。
  36. 　前記誘導因子導入細胞を浮遊培養する際にゲル培地が用いられる、請求項３３又は３４に記載の細胞の誘導方法。
     
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7146211B2 (ja) 2017-02-24 2022-10-04 剛士 田邊 人工多能性幹細胞の作製方法
WO2024122714A1 (ko) * 2022-12-07 2024-06-13 주식회사 팡세 투석장치 및 이를 포함하는 생물반응기 시스템
WO2024176440A1 (ja) * 2023-02-24 2024-08-29 公益財団法人京都大学ｉＰＳ細胞研究財団 人工多能性幹細胞の製造方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3053891C (en) * 2017-02-27 2023-05-23 I Peace, Inc. Somatic cell production system

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006075041A (ja) * 2004-09-08 2006-03-23 Ishikawajima Harima Heavy Ind Co Ltd 細胞培養装置及び方法
JP2008017716A (ja) * 2006-07-10 2008-01-31 Takagi Ind Co Ltd 細胞又は組織の培養方法
JP4183742B1 (ja) 2005-12-13 2008-11-19 国立大学法人京都大学 誘導多能性幹細胞の製造方法
JP2014114997A (ja) 2012-12-07 2014-06-26 Koken Ltd 局所空気清浄化装置
WO2014136581A1 (ja) * 2013-03-06 2014-09-12 国立大学法人京都大学 多能性幹細胞の培養システム及び多能性幹細胞の継代方法
JP2015502747A (ja) * 2011-12-01 2015-01-29 ザ ニューヨーク ステム セル ファウンデーション 人工多能性幹細胞または分化細胞を作製するための自動化されたシステム
JP2015534826A (ja) * 2012-11-09 2015-12-07 バイオエヌテック アーゲーＢｉｏＮＴｅｃｈ ＡＧ 細胞のｒｎａ発現方法
WO2017038887A1 (ja) * 2015-08-31 2017-03-09 アイ・ピース株式会社 多能性幹細胞製造システム

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6472200B1 (en) * 1999-07-23 2002-10-29 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Device and method for performing a biological modification of a fluid
US20130011921A1 (en) * 2010-02-16 2013-01-10 Saitama Medical University Method for production of artificial pluripotent stem cell
US20150072416A1 (en) * 2012-05-29 2015-03-12 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotech Metabolite for improving production, maintenance and proliferation of pluripotent stem cells, composition comprising the same, and method of culturing pluripotent stem cell using the same
US20160355774A1 (en) * 2014-02-17 2016-12-08 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Cell culturing device
JP6422221B2 (ja) * 2014-03-04 2018-11-14 旭化成株式会社 多能性幹細胞からなる細胞塊製造方法
JP6291429B2 (ja) * 2015-01-20 2018-03-14 富士フイルム株式会社 細胞培養装置および細胞培養方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006075041A (ja) * 2004-09-08 2006-03-23 Ishikawajima Harima Heavy Ind Co Ltd 細胞培養装置及び方法
JP4183742B1 (ja) 2005-12-13 2008-11-19 国立大学法人京都大学 誘導多能性幹細胞の製造方法
JP2008017716A (ja) * 2006-07-10 2008-01-31 Takagi Ind Co Ltd 細胞又は組織の培養方法
JP2015502747A (ja) * 2011-12-01 2015-01-29 ザ ニューヨーク ステム セル ファウンデーション 人工多能性幹細胞または分化細胞を作製するための自動化されたシステム
JP2015534826A (ja) * 2012-11-09 2015-12-07 バイオエヌテック アーゲーＢｉｏＮＴｅｃｈ ＡＧ 細胞のｒｎａ発現方法
JP2014114997A (ja) 2012-12-07 2014-06-26 Koken Ltd 局所空気清浄化装置
WO2014136581A1 (ja) * 2013-03-06 2014-09-12 国立大学法人京都大学 多能性幹細胞の培養システム及び多能性幹細胞の継代方法
WO2017038887A1 (ja) * 2015-08-31 2017-03-09 アイ・ピース株式会社 多能性幹細胞製造システム

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3587556A4

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7146211B2 (ja) 2017-02-24 2022-10-04 剛士 田邊 人工多能性幹細胞の作製方法
WO2024122714A1 (ko) * 2022-12-07 2024-06-13 주식회사 팡세 투석장치 및 이를 포함하는 생물반응기 시스템
WO2024176440A1 (ja) * 2023-02-24 2024-08-29 公益財団法人京都大学ｉＰＳ細胞研究財団 人工多能性幹細胞の製造方法

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