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WO2018142880A1 - バイオチップ、バイオチップユニット、バイオチップ読取装置、及びバイオチップ製造方法 - Google Patents

バイオチップ、バイオチップユニット、バイオチップ読取装置、及びバイオチップ製造方法 Download PDF

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WO2018142880A1
WO2018142880A1 PCT/JP2018/000676 JP2018000676W WO2018142880A1 WO 2018142880 A1 WO2018142880 A1 WO 2018142880A1 JP 2018000676 W JP2018000676 W JP 2018000676W WO 2018142880 A1 WO2018142880 A1 WO 2018142880A1
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WO
WIPO (PCT)
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biochip
site
microlens
fluorescence
protrusion
Prior art date
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Ceased
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PCT/JP2018/000676
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English (en)
French (fr)
Inventor
田名網　健雄
朋之 田口
祐樹 宮内
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yokogawa Electric Corp
Original Assignee
Yokogawa Electric Corp
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Publication date
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Priority to EP18747577.7A priority patent/EP3578957A4/en
Priority to US16/479,806 priority patent/US11293867B2/en
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Definitions

  • the present invention relates to a biochip for fluorescence measurement, a biochip unit, a biochip reader, and a biochip manufacturing method.
  • a biochip for fluorescence measurement in which a plurality of sites is formed is known (for example, see Patent Document 1).
  • the fluorescence measurement using this biochip is performed by irradiating each biochip site with excitation light and measuring the fluorescence emitted from each site in the biochip reader.
  • FIG. 8 is a schematic diagram showing an example of a conventional biochip reader.
  • the biochip reader 5 shown in FIG. 8 includes a biochip 51, an excitation optical system 52, and a photographing optical system 53 (imaging side optical system 53).
  • a biochip 51 in which a plurality of sites 512 are arranged on the surface of a transparent substrate 511 is used.
  • the site 512 is for fluorescence observation. When immersed in the sample solution, a molecular reaction occurs at the site 512, and when excitation light is irradiated, fluorescence proportional to the amount of the sample in the solution is generated.
  • the excitation light emitted from the light source 521 of the excitation optical system 52 becomes parallel light by the first lens 522 and is condensed by the microlens array 523.
  • the microlens array 523 a plurality of microlenses 523a are arranged in an arrangement corresponding to the arrangement of the plurality of sites 512 of the biochip 51.
  • the excitation light is collected by each microlens array 523a. Thereafter, the excitation light becomes parallel light again by the second lens 524, is reflected by the dichroic mirror 525, and is condensed on the site 512 by the third lens 526.
  • the fluorescence becomes parallel light by the third lens 526, passes through the dichroic mirror 525, passes through the filter 531 of the imaging optical system 53 (imaging-side optical system 53), and passes through the first lens 526.
  • the light is condensed on the photographing camera 533 by the four lenses 532.
  • the third lens 526 and the dichroic mirror 525 also serve as an optical element of the photographing optical system 53 (image forming side optical system 53).
  • the third lens 526 serves as an objective lens in the photographing optical system 53 (image forming side optical system 53).
  • Fluorescence images at a plurality of sites 512 can be obtained at a time without performing optical scanning by photographing the fluorescence image formed on the photographing camera 533 by condensing with the photographing optical system.
  • Such fluorescence measurement by the biochip reader 5 is widely used for analysis of gene groups related to a certain phenomenon, measurement of the expression levels of a large number of genes, gene expression profiles, and the like.
  • FIG. 9 is a schematic diagram showing an example of a conventional biochip in which the sensitivity of fluorescence measurement is improved by increasing the amount of excitation light and efficiently collecting fluorescence.
  • a plurality of sites 542 are arranged on the bottom surface of a container 541 that encloses a sample solution to be measured.
  • a plurality of microlenses 544 are arranged on the outer surface of the transparent substrate 543 covering the container 541 so as to correspond to the plurality of sites 542 on a one-to-one basis.
  • a microlens array as shown in FIG. 8 is not necessary.
  • the excitation light is collected by the objective lens 55 and further collected by the microlens 544 toward the site 542.
  • the distance to the site 512 is long, so the numerical aperture becomes small and the excitation light may be lost.
  • the amount of excitation light can be increased.
  • the fluorescence of each site 542 is collected by the microlens 544 and then travels to the objective lens 55, the fluorescence can be efficiently collected.
  • Non-Patent Document 1 a biochip with a stable site shape has been proposed in order to improve the sensitivity of fluorescence measurement (see, for example, Non-Patent Document 1).
  • FIG. 10 is a schematic diagram showing an example of a conventional biochip with a stable site shape.
  • a plurality of protrusions 562 are formed on the surface of the transparent substrate 561, and a site 563 is formed on the top of each protrusion 562.
  • the formation position of the site 563 is limited to the top of the protrusion 562, so that the formation position and shape of each site 563 is stabilized, and variations in the site 563 are suppressed.
  • JP 2002-207007 A JP 2006-058044 A "Development of ultra-sensitive DNA chip with columnar structure", Chemical Engineering Vol.72, No.9, p470-p472, 2008
  • the fluorescence emitted from the biochip site as described above has a very wide divergence angle. For this reason, the fluorescence of one site may become optical noise in fluorescence measurement as stray light or crosstalk with respect to the fluorescence of another site.
  • the fluorescence 545a generated from the first site 542a from the left enters the adjacent micro lens 544b, and similarly, the fluorescence from the second site 542b from the left enters the adjacent micro lens 544a. .
  • These mixed fluorescence becomes stray light and crosstalk via the objective lens 55. Since such optical noise reduces the accuracy of fluorescence measurement, it is desirable to be suppressed as much as possible.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and an object thereof is to provide a biochip, a biochip unit, a biochip reader, and a biochip manufacturing method that can suppress optical noise in fluorescence measurement.
  • the biochip of the present invention is a biochip for fluorescence measurement, and includes a transparent substrate and a plurality of arrays formed on the first surface on the excitation light irradiation side of the transparent substrate.
  • the opening angle of the side surface of the protrusion may be equal to or greater than the opening angle of the microlens.
  • the side surface of the protrusion may totally reflect at least a part of the fluorescence emitted from the site and passing through the inside of the protrusion toward the microlens.
  • the end portion of the site and the most adjacent microlens is smaller than the angle formed by the line connecting the lens and the boundary line between the flat surface of the first surface and the optical axis of the microlens at the opposite position. Also good.
  • the biochip unit of the present invention is a biochip unit including a biochip for fluorescence measurement and a support container for the biochip, and the biochip is the above-described biochip unit.
  • the biochip of the present invention wherein the support container seals the second surface of the transparent substrate together with a plurality of the sites, and a sample solution for fluorescence measurement is enclosed therein and the sites are immersed therein It is characterized by being.
  • the sample solution may be a black solution.
  • the site may be a molecular reaction site for nucleic acid hybridization or antigen-antibody reaction.
  • the biochip reader of the present invention includes a biochip for fluorescence measurement, and is a biochip reader that reads fluorescence from the biochip.
  • the biochip of the present invention wherein an excitation optical system that irradiates excitation light from the microlens side to the site of the biochip, and fluorescence that is emitted from the site and passes through the microlens is collected by a light receiving optical system. And a photographing optical system for photographing with a light receiving element.
  • the aperture angle of the microlens on the light receiving optical system side may be larger than the aperture angle on the biochip side of the light receiving optical system.
  • the numerical aperture of the light receiving optical system may be smaller than the numerical aperture of the microlens.
  • the biochip manufacturing method of the present invention is a biochip manufacturing method of manufacturing a biochip for fluorescence measurement, and the biochip is the above-described biochip of the present invention,
  • a well container in which a probe solution for forming the site is stored in each of a plurality of recesses that are arranged to face the second surface of the transparent substrate and correspond to the protrusions on a one-to-one basis.
  • a coating step of forming an active functional group for fixing the probe is performed by a surface treatment on the second surface including the protrusion. Also good.
  • the second surface including the protrusion is immersed in a blocking liquid for inactivating the active functional group, and the site formation site You may perform the blocking process which inactivates the said unreacted active functional groups other than.
  • a site is provided at each apex of the plurality of protrusions formed to correspond to the microlenses on a one-to-one basis.
  • the fluorescence emitted from the site passes through the inside of the protrusion and travels toward the microlens. For this reason, a part of the fluorescence having a wide divergence angle at a certain site is reflected inside the side surface of the protrusion when it is directed to the adjacent microlens, Crosstalk is suppressed.
  • optical noise in fluorescence measurement can be suppressed.
  • FIG. 5 is a flowchart showing a biochip manufacturing method for manufacturing the biochip shown in FIGS. It is a figure which shows typically the biochip manufacturing method shown with the flowchart in FIG.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a biochip reader according to an embodiment of the present invention.
  • the biochip reader 1 shown in FIG. 1 is a device that includes a biochip 110 for fluorescence measurement and reads fluorescence from the biochip 110.
  • the biochip 110 constitutes the biochip unit 11 together with a support container 115 in which a sample solution 116 for fluorescence measurement is enclosed.
  • a black solution is used as the sample solution 116 in order to suppress background light in fluorescence measurement.
  • the biochip reader 1 includes a biochip unit 11, an excitation optical system 12, and a photographing optical system 13.
  • the excitation optical system 12 includes a light source 121, an excitation lens 122, and a dichroic mirror 123.
  • the excitation light emitted from the light source 121 is converted into parallel light by the excitation lens 122, reflected by the dichroic mirror 123, and irradiated onto the biochip unit 11.
  • the dichroic mirror 123 also serves as an optical element of the photographing optical system 13.
  • the photographing optical system 13 includes a dichroic mirror 123, a relay lens 131 including a first lens 131a and a second lens 131b, a photographing camera 132, and a barrier filter 133.
  • the fluorescence generated in the biochip unit 11 passes through the dichroic mirror 123 and is condensed to the photographing camera 132 by the relay lens 131 that is a light receiving optical system.
  • a fluorescence image formed on the photographing camera 132 is photographed by the relay lens 131.
  • the relay lens 131 is a telecentric optical system in order to reduce the light amount distribution and image distortion over a large area of the biochip 110. In order to obtain an accurate imaging relationship, it is better to calculate the focal position and aberration in addition to the dichroic mirror 123 and the barrier filter 133 as a light receiving optical system in a broad sense.
  • a computer that controls the photographing camera 132 and analyzes the photographed image to calculate the amount of fluorescence, and a record that records the photographed image and the calculation result Equipment etc. are also provided.
  • the photographing camera 132 a color or monochrome CCD or CMOS camera, an EM-CCD or digital CMOS capable of high-sensitivity photographing is suitable as a light receiving element. Further, it may be a set of single detectors PD corresponding one-to-one with a plurality of sites described later in the biochip unit 11.
  • Such a biochip reader 1 is applied to dry image measurement by fluorescence molecular light quantity measurement in the DNA chip method, in-liquid measurement and real-time measurement of the fluorescence molecular light quantity in the biochip unit 11 and the like.
  • the FISH method fluorescence in situ hybridization
  • FIA method fluorescence immunoassay method
  • IFA method indirect for measuring serum (antibody) reaction in which a fluorescent substance is labeled on an antigenic pathogen or the like.
  • fluorescent antibody method can be applied to bacterial species discrimination by gene / polymer analysis, oncogenes, animal and plant discrimination, intestinal bacteria inspection, and the like.
  • the biochip unit 11 included in the biochip reader 1 includes the biochip 110 for fluorescence measurement and the support container 115 as described above.
  • the sample solution 116 for fluorescence measurement in the various application examples described above is enclosed.
  • FIG. 2 is an enlarged view of the biochip shown in FIG.
  • the biochip 110 includes a transparent substrate 111, a plurality of microlenses 112, a plurality of protrusions 113, and a site 114.
  • the plurality of microlenses 112 are formed in an array on the first surface 111a on the transparent substrate 111 on the excitation light irradiation side.
  • Each microlens 112 is a spherical lens formed in a hemispherical shape.
  • the plurality of protrusions 113 are formed to have a one-to-one correspondence with the microlenses 112 on the second surface 111b on the side opposite to the first surface 111a of the transparent substrate 111 and on the molecular reaction site side.
  • Each protrusion 113 has a truncated cone shape with the optical axis 112 a of the microlens 112 as the central axis.
  • the site 114 for molecular reaction is formed in a substantially circular shape in a plan view on the flat top of the frustoconical projection 113.
  • the transparent substrate 111, the microlens 112, and the protrusion 113 in the biochip 110 are integrally formed of the following materials. That is, as the forming material, glass, silicon, single crystal, transparent ceramics, and a resin material are suitable. Examples of the resin material include COP (cycloolefin polymer) excellent in optical characteristics and chemical / thermal stability, polycarbonate, acrylic resin, and polyethylene resin used for resin lenses.
  • COP cycloolefin polymer
  • examples of the luminescent dye constituting the site 114 include the following.
  • FITC having an excitation wavelength of 490 nm and an emission wavelength of 520 nm
  • Physerythrin having an excitation wavelength of 488 nm and an emission wavelength of 570 nm
  • Cy3 having an excitation wavelength of 550 nm and an emission wavelength of 570 nm
  • Cy5 having an excitation wavelength of 649 nm and an emission wavelength of 670 nm can be mentioned.
  • Alexa Fluor (registered trademark) 488 having an excitation wavelength of 495 nm and an emission wavelength of 519 nm
  • Alexa Fluor (registered trademark) 555 having an excitation wavelength of 555 nm and an emission wavelength of 565 nm
  • Alexa Fluor (registered trademark) 647 having an excitation wavelength of 650 nm and an emission wavelength of 665 nm.
  • the molecular reaction site using these fluorescent dyes is designed, for example, so that the fluorescence light intensity increases in proportion to the amount of the sample.
  • the luminescent dye constituting the site 114 is selected according to the applied fluorescence measurement, and the microlens 112 is designed according to the excitation wavelength of the selected fluorescent dye.
  • the focal point of the microlens 112 is set at the optical axis position behind the site 114.
  • the excitation light is defocused at the site 114, and the irradiation range is widened.
  • the irradiation range is a range that matches the outer diameter of the site 114.
  • the excitation light that irradiates the site 114 increases due to the light collection effect of the microlens 112. In addition, the amount of light irradiating the site is drastically reduced.
  • the opening angle ⁇ 1 of the side surface of the protrusion 113 is larger than the opening angle ⁇ 2 of the microlens 112 so that the condensing optical path of the microlens 112 does not reach the inside of the side surface of the protrusion 113.
  • the angle formed by the optical axis and the line connecting the focal point on the optical axis and the outer periphery of the effective range of the lens corresponding to the boundary line between the lens and the flat surface is determined by the lens. Is called the opening angle ( ⁇ 2 in FIG. 2).
  • the angle formed by the optical axis 112a of the lens and the side surface of the protrusion 113 on the same plane is referred to as an opening angle ( ⁇ 1 in FIG. 2).
  • Fluorescence emitted from the site 114 excited by such excitation light follows the following optical path and travels toward the first lens 131a (chip side lens) closest to the biochip 110 in the relay lens 131.
  • the first lens 131a is shown as one single lens, but it may be a lens group in which a plurality of lenses are arranged on the optical axis. The same applies to other lenses constituting the excitation optical system 12 and the photographing optical system 13.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing an optical path of the fluorescence emitted from the site toward the first lens of the relay lens.
  • the dichroic mirror 123 and the barrier filter 133 disposed between the biochip 110 and the first lens 131a are not shown.
  • Fluorescence emitted from the site 114 passes through the inside of the protrusion 113 and travels toward the microlens 112, and is condensed on the first lens 131 a by the microlens 112.
  • the opening angle ⁇ 2 on the fluorescence incident side of the microlens 112 is larger than the opening angle ⁇ 3 on the fluorescence emitting side of the microlens 112.
  • Fluorescence generated from the site 114 with a wide divergence angle is collected with a large amount of light by the microlens 112 having a large aperture angle ⁇ 2 as described above. If the site 114 is the focal point of the micro lens 112, the light emitted from the micro lens 112 to the first lens 131a becomes parallel light, but the site 114 is at the defocus position. For this reason, the light emitted from the microlens 112 has an angle slightly opened from the parallel light, such as the opening angle ⁇ 3 on the fluorescence emission side.
  • the fluorescence generated from the site 114 with a large divergence angle and incident on the microlens 112 at the aperture angle ⁇ 2 on the fluorescence incident side is converted into the aperture angle ⁇ 3 on the fluorescence exit side, which is a narrow angle, so that the fluorescence is highly efficient. Condensation is possible. This is because, when the opening angle ⁇ 5 of the first lens 131a is smaller than the divergence angle from the site 114, the fluorescence from the site 114 causes a loss in a portion having a large opening angle in the first lens 131a as shown by the broken line.
  • the loss portion can be improved by converting the aperture angle ⁇ 2 on the fluorescence incident side to the aperture angle ⁇ 3 on the fluorescence exit side by the microlens 112.
  • the opening angle ⁇ 5 of the first lens 131a is smaller than the opening angle ⁇ 2 on the fluorescence incident side of the microlens 112, which is important for ensuring a wide field of view for measuring a plurality of sites 114 simultaneously.
  • the effect of increasing the amount of light collected by the microlens 112 is proportional to the square ratio of the numerical aperture NA of each lens.
  • the numerical aperture corresponding to the emission angle from the microlens 112 (that is, the opening angle ⁇ 3 on the fluorescence emission side) is 0.2, and the opening angle ⁇ 2 on the fluorescence incidence side to the microlens 112 (that is, the emission angle of the site 114).
  • the numerical aperture is 0.6
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing a state in which the fluorescence emitted from the site passes through the inside of the protrusion and toward the microlens.
  • the side surface of the protrusion 113 is configured to totally reflect at least a part of the fluorescence emitted from the site 114 and passing through the inside of the protrusion 113.
  • This total reflection condition is the following condition known as Snell's law.
  • n1 is the refractive index of the material for forming the protrusion 113
  • n2 is the refractive index outside the protrusion 113. Fluorescence satisfying such conditions among the fluorescence is totally reflected by the side surface of the protrusion 113 and travels toward the inside of the microlens 112. This condition can be easily realized by setting the biochip to resin or glass (n1 ⁇ 1.5) and the sample solution to an aqueous solution (n2 ⁇ 1.3).
  • the microlens 112 also collects the fluorescence from outside the original opening angle. It can be considered that the opening angle is widened.
  • the increase in the amount of light collected by the microlens 112 due to this is proportional to the ratio of the square of the numerical aperture NA1 of the microlens 112 and the apparent numerical aperture NA1 ′ of the microlens 112 by the protrusion 113.
  • NA1 of the microlens 112 0.6
  • the opening angle ⁇ 1 of the side surface of the protrusion 113 is also the following angle.
  • the opening angle ⁇ 1 of the side surface of the protrusion 113 is smaller than the angle ⁇ 4.
  • FIG. 5 is a bar graph showing the increase in light intensity in the fluorescence measurement per one site.
  • an increase in the amount of light in the fluorescence measurement per site 512 in the conventional biochip reader 5 described with reference to FIG. 8 is shown as a comparative example.
  • the horizontal axis indicates the comparative example and another embodiment, and the vertical axis indicates the increase rate of the light amount.
  • the increase in the amount of excitation light by the microlens 112 is 25 times
  • the increase in the amount of condensed light by the microlens 112 is 9 times
  • the concentration of fluorescence by the protrusion 113 is increased.
  • the increase in the amount of light is 2.7 times.
  • an increase in the amount of fluorescent light of 607 times can be expected as an increase in the total amount of light with respect to the comparative example. Note that the structure in FIG. 9 is not compared here because no countermeasure is taken against stray light.
  • the site 114 is provided on each apex of the plurality of protrusions 113 formed to correspond to the microlens 112 on a one-to-one basis.
  • the fluorescence emitted from the site 114 travels toward the microlens 112 through the protrusion 113.
  • a part of the fluorescence having a wide divergence angle at a certain site 114 is reflected on the inner side of the side surface of the protrusion 113 when it is directed to the adjacent microlens 112, and Stray light and crosstalk for fluorescence can be suppressed.
  • optical noise in fluorescence measurement can be suppressed.
  • the opening angle ⁇ 1 of the side surface of the protrusion 113 is larger than the opening angle ⁇ 2 of the microlens 112.
  • the side surface of the protrusion 113 is configured to totally reflect at least a part of the fluorescence emitted from the site 114 and passing through the inside of the protrusion 113 toward the microlens 112.
  • Condensing efficiency can be further improved by total reflection inside the side surface of the protrusion 113. That is, due to such total reflection, each microlens 112 collects fluorescence from the outside of the original opening angle ⁇ 2, which can be regarded as a widening of the opening angle. Thereby, the measurement light quantity can be further increased and the accuracy of fluorescence measurement can be further increased.
  • the side opening angle ⁇ 1 of the protrusion 113 is also the following angle.
  • a plane including the optical axis 112a of the microlens 112 at a position facing an arbitrary site 114 and the optical axis 112a of the adjacent microlens 112 is assumed.
  • the opening angle ⁇ 1 is smaller than the angle ⁇ 4 formed by the optical axis 112a of 112.
  • the support container 115 seals the second surface 111b of the transparent substrate 111 together with the plurality of sites 114. Further, the sample solution 116 for fluorescence measurement is sealed inside the support container 115 so as not to leak to the outside, and the site 114 is immersed in the sample solution 116. According to this biochip unit 11, stray light and crosstalk with respect to the fluorescence of the adjacent site 114 can be suppressed in the biochip 110 of the present embodiment. Thereby, the optical noise in fluorescence measurement can be suppressed.
  • a black solution is adopted as the sample solution 116 in the support container 115.
  • the black solution absorbs stray light other than fluorescence and crosstalk light from adjacent sites.
  • the site since the site is directly coupled to the microlens, it goes to the reading device without passing through the black solution. Thereby, since the background light in fluorescence measurement is suppressed, the optical noise in fluorescence measurement can be suppressed further.
  • the biochip reader 1 captures and images the excitation optical system 12 that irradiates the site 114 of the biochip 110 according to the present embodiment with excitation light and the fluorescence emitted from the site 114 with a lens. And an imaging optical system 13 for performing the above-described operation. According to the biochip reader 1, stray light and crosstalk with respect to the fluorescence of the adjacent site 114 can be suppressed in the biochip 110 of the present embodiment described above. Thereby, the optical noise in fluorescence measurement can be suppressed.
  • the aperture angle ⁇ 2 on the fluorescence incident side of the microlens 112 is larger than the aperture angle ⁇ 3 on the fluorescence exit side of the microlens 112. Then, the fluorescence of the opening angle ⁇ 3 on the emission side of the microlens is received at the opening angle ⁇ 5 of the first lens.
  • the microlens 112 can collect the fluorescence of each site 114 at an opening angle ⁇ 2 wider than the opening angle ⁇ 5 of the first lens 131a. Thereby, the measurement light quantity can be further increased and the accuracy of fluorescence measurement can be further increased.
  • FIG. 6 is a flowchart showing a biochip manufacturing method for manufacturing the biochip shown in FIGS.
  • FIG. 7 is a figure which shows typically the biochip manufacturing method shown by the flowchart in FIG.
  • a step of forming DNA hybridization as a molecular reaction and forming a DNA probe for reaction as a site is shown.
  • a well container 14 having a plurality of recesses 141 formed so as to correspond to the protrusions 113 of the biochip 110 ′ before the site 114 is formed is prepared.
  • a probe solution 142 for a DNA probe for molecular reaction for forming the site 114 is placed in each recess 141 in the well container 14 (step S1).
  • a coating process step S2 for forming an active functional group for fixing the probe of the probe solution 142 by surface treatment on the second surface 111b including the protrusion 113 of the biochip 110 ′ before the site 114 is formed. Done.
  • step S3 the protrusion 113 is made to enter the recess 141 of the well container 14 and the top of the protrusion 113 is immersed in the probe solution 142 and then pulled up, thereby attaching the probe solution 142 to the top (step S3). ) Is performed.
  • this adhesion process step S3) is performed under high-humidity conditions in order to prevent intermediate drying.
  • the biochip 110 is dried to evaporate the buffer solution of the probe solution 142 and fix the probe to the top of the projection 113, thereby forming the site 114 (step S4). ) Is performed.
  • incubation is performed at 80 ° C. for 1 hour for the progress of the probe binding reaction.
  • step S5 the blocking step (step S5), the second surface 111b including the protrusion 113 is immersed in a blocking liquid for inactivating the active functional group for 5 minutes. By this immersion, the blocking agent molecules of the blocking solution are bonded to the unreacted active functional groups other than the site formation sites to inactivate them.
  • step S6 for cleaning the blocking solution of the biochip 110 with the cleaning solution is performed.
  • the biochip 110 is taken out by being immersed in hot water and cold water for 2 minutes respectively without drying, and the remaining water droplets are removed with an air duster or the like.
  • biochip 110 in which the site 114 is formed by the probe fixation is appropriately stored until use, and this biochip manufacturing method is completed (step S7).
  • the biochip manufacturing method of the present embodiment described above stray light and crosstalk with respect to the fluorescence of the adjacent site 114 can be suppressed in the manufactured biochip 110 of the present embodiment. Thereby, the optical noise in fluorescence measurement can be suppressed.
  • the plurality of sites 114 can be formed at an accurate formation position at a time by causing the protrusion 113 to enter the recess 141 of the well container 14.
  • a high-precision biochip 110 can be manufactured easily and inexpensively compared to a conventional manufacturing method such as attaching a probe solution to a transparent substrate one by one using a pin or an inkjet spot device. can do.
  • the coating process (step S2) which forms an active functional group by the surface treatment with respect to the 2nd surface 111b containing the projection part 113 is performed prior to an adhesion process (step S3).
  • the probe 114 can be fixed to the top of each protrusion 113 with high accuracy to form the site 114, and thus the biochip 110 with higher accuracy can be manufactured.
  • a blocking step (step S5) is performed in which the second surface 111b including the protrusions 113 is immersed in a blocking solution.
  • a blocking step (step S5) is performed in which the second surface 111b including the protrusions 113 is immersed in a blocking solution.
  • the protrusion 113 having a truncated cone shape is illustrated as an example of the protrusion according to the present invention, but the protrusion according to the present invention is not limited thereto.
  • the protrusions referred to in the present invention are not limited to specific shapes as long as they are a plurality of protrusions formed on the second surface of the transparent substrate so as to correspond to the microlenses on a one-to-one basis.
  • the projecting portion 113 that is formed in a truncated cone shape with a transparent material is exemplified. It is not a thing.
  • the protrusions referred to in the present invention may be those whose outer surfaces are mirror-coated with a metal film, a dielectric multilayer film or the like.
  • the microlens 112 as a hemispherical spherical lens is illustrated as an example of the microlens according to the present invention, but the microlens according to the present invention is not limited to this.
  • the microlens referred to in the present invention may be, for example, a spherical lens other than a hemisphere, or an aspherical lens or a Fresnel lens.
  • the numerical aperture NA1 is exemplified for the microlens according to the present invention.
  • the microlens according to the present invention is not limited to this, and the numerical aperture is appropriately determined according to the use situation. Can be designed to. The same applies to the numerical aperture of the first lens 131a as an example of the chip side lens referred to in the present invention.
  • the excitation optical system 12 and the imaging optical system 13 in which the dichroic mirror 123 is a common optical element are illustrated as an example of the excitation optical system and the imaging optical system according to the present invention.
  • the excitation optical system and the photographing optical system referred to in the present invention are not limited to this, and may be optical systems independent of each other.
  • the specific optical configuration such as the arrangement and the number of lenses is not limited to the configuration exemplified in the present embodiment, and can be appropriately designed.

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Abstract

蛍光測定における光学ノイズを抑える。　蛍光測定用のバイオチップ１１０が、透明基板１１１と、透明基板１１１における第１面１１１ａに分散形成された複数のマイクロレンズ１１２と、透明基板１１１における第２面１１１ｂにおいてマイクロレンズ１１２と一対一に対応するように形成された複数の突起部１１３と、突起部１１３の頂部に形成された蛍光測定用のサイト１１４と、を備えたことを特徴とする。

Description

バイオチップ、バイオチップユニット、バイオチップ読取装置、及びバイオチップ製造方法
　蛍光測定用のバイオチップ、バイオチップユニット、バイオチップ読取装置、及びバイオチップ製造方法に関する。
　従来、複数のサイトが形成された蛍光測定用のバイオチップが知られている（例えば、特許文献１参照。）。このバイオチップを用いた蛍光測定は、バイオチップ読取装置において、バイオチップの各サイトに励起光を照射し、各サイトが発する蛍光を測定することで行われる。
　図８は、従来のバイオチップ読取装置の一例を示す模式図である。
　この図８に示されているバイオチップ読取装置５は、バイオチップ５１と、励起光学系５２と、撮影光学系５３（結像側光学系５３）と、を備えている。このバイオチップ読取装置５では、透明基板５１１の表面上に複数のサイト５１２を配置したバイオチップ５１が用いられる。サイト５１２は、蛍光観察のためのものであり、試料溶液に浸漬されるとサイト５１２において分子反応が起こり、励起光が照射されると溶液中の試料の量に比例した蛍光が発生する。
　まず、励起光学系５２の光源５２１から出た励起光が、第１レンズ５２２で平行光となり、マイクロレンズアレイ５２３によって集光される。マイクロレンズアレイ５２３には、バイオチップ５１の複数のサイト５１２の配置に応じた配置で複数のマイクロレンズ５２３ａが配列されている。励起光の集光は各マイクロレンズアレイ５２３ａによって行われる。その後、励起光は、第２レンズ５２４で再び平行光となり、ダイクロイックミラー５２５で反射され、第３レンズ５２６によってサイト５１２へと集光される。
　励起光によってサイト５１２が蛍光を発すると、その蛍光は、第３レンズ５２６で平行光となり、ダイクロイックミラー５２５を通過し、撮影光学系５３（結像側光学系５３）のフィルター５３１を通り、第４レンズ５３２で撮影カメラ５３３へと集光される。第３レンズ５２６及びダイクロイックミラー５２５は、撮影光学系５３（結像側光学系５３）の光学要素も兼ねている。第３レンズ５２６は撮影光学系５３（結像側光学系５３）において対物レンズの役割を果たす。
　この撮影光学系での集光によって撮影カメラ５３３に結像された蛍光の像を撮影することで、光走査を行うことなく、複数のサイト５１２での蛍光の像を一度に得ることができる。バイオチップ読取装置５によるこのような蛍光測定は、ある現象に関わる遺伝子群の分析や、多数の遺伝子の発現量の測定、遺伝子の発現プロファイル等に広く用いられる。
　ここで、励起光の光量の増加や、蛍光の効率的な集光により、蛍光測定の感度を向上させたバイオチップが提案されている（例えば、特許文献２参照。）。
　図９は、励起光の光量の増加や、蛍光の効率的な集光により、蛍光測定の感度を向上させた従来のバイオチップの一例を示す模式図である。
　この図９に示されているバイオチップ５４では、測定対象の試料溶液を封入する容器５４１の底面に複数のサイト５４２が配置されている。そして、この容器５４１を覆う透明基板５４３の外面上に、複数のサイト５４２と一対一に対応するように複数のマイクロレンズ５４４が配置されている。このバイオチップ５４を用いるバイオチップ読取装置における励起光学系では、図８に示されているようなマイクロレンズアレイは不要となる。
　励起光は、対物レンズ５５で集光され、更にマイクロレンズ５４４でサイト５４２に向かって集光される。図８に示されているバイオチップ読取装置５では、マイクロレンズアレイ５２３での集光の後、サイト５１２に至るまでの距離が長いために開口数が小さくなり励起光にロスが生じることがある。これに対し、図９に示されているバイオチップ５４では、マイクロレンズ５４３がサイト５４２に接近して設けられているので、励起光の光量の増加が図られる。また、このバイオチップ５４では、各サイト５４２の蛍光がマイクロレンズ５４４で集光されてから対物レンズ５５へと向かうので、蛍光の効率的な集光も図られることとなる。
　また、蛍光測定の感度の向上のために、サイトの形状を安定させたバイオチップも提案されている（例えば、非特許文献１参照。）。
　図１０は、サイトの形状を安定させた従来のバイオチップの一例を示す模式図である。
　この図１０に示されているバイオチップ５６は、透明基板５６１の表面上に複数の突起部５６２が形成され、各突起部５６２の頂部にサイト５６３が形成される。このバイオチップ５６は、サイト５６３の形成場所を突起部５６２の頂部に限定することで、各サイト５６３の形成位置や形状を安定化し、サイト５６３のばらつきを抑えたものである。
特開２００２－２０７００７号公報 特開２００６－０５８０４４号公報 "柱状構造による超高感度ＤＮＡチップの開発"、化学工学７２巻９号、ｐ４７０～ｐ４７２、２００８
　ここで、上述したようなバイオチップのサイトを発した蛍光は、非常に広い発散角を持っている。このため、あるサイトの蛍光が、別のサイトの蛍光に対して迷光やクロストークとして蛍光測定における光学ノイズとなってしまう可能性がある。例えば図９において、左から１つ目のサイト５４２ａから発生する蛍光５４５ａは隣接するマイクロレンズ５４４ｂに混入し、同様に、左から２つ目のサイト５４２ｂの蛍光は隣接するマイクロレンズ５４４ａに混入する。これらの混入した蛍光は対物レンズ５５を経由して迷光やクロストークとなる。このような光学ノイズは、蛍光測定の精度を低下させてしまうので、なるべく抑制されていることが望ましい。
　本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、蛍光測定における光学ノイズを抑えることができるバイオチップ、バイオチップユニット、バイオチップ読取装置、及びバイオチップ製造方法を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するため、本発明のバイオチップは、蛍光測定用のバイオチップであって、透明基板と、前記透明基板における励起光の照射側となる第１面にアレイ状に形成された複数のマイクロレンズと、前記透明基板における第２面において前記マイクロレンズと一対一に対応するように形成された複数の突起部と、前記突起部の頂部に形成された蛍光測定用のサイトと、を備えたことを特徴とする。
　ここで、本発明のバイオチップにおいて、前記突起部における側面の開き角が、前記マイクロレンズの開口角と同等以上であってもよい。
　また、本発明のバイオチップにおいて、前記突起部における側面が、前記サイトから発して当該突起部の内部を通過する蛍光の少なくとも一部を前記マイクロレンズへと向けて全反射してもよい。
　また、本発明のバイオチップにおいて、任意の前記サイトと対向する位置のマイクロレンズの光軸と最も隣接したマイクロレンズの光軸とを含む平面において、前記サイトの端部と、前記最も隣接したマイクロレンズと前記第１面における平坦面との境界線と、を最短で結ぶ線と、前記対向する位置のマイクロレンズの光軸とがなす角度よりも、前記突起部における側面の開き角が小さくてもよい。
　また、上記課題を解決するため、本発明のバイオチップユニットは、蛍光測定用のバイオチップと、当該バイオチップの支持容器と、を備えたバイオチップユニットであって、前記バイオチップが、上述した本発明のバイオチップであり、前記支持容器が、前記透明基板における第２面を、複数の前記サイトごと密閉するとともに、内部に蛍光測定用の試料溶液が封入されて前記サイトが浸漬されたものであることを特徴とする。
　また、本発明のバイオチップユニットにおいて、前記試料溶液が、黒色溶液であってもよい。
　また、本発明のバイオチップユニットにおいて、前記サイトは、核酸ハイブリダイゼーション、又は抗原抗体反応の分子反応サイトであってもよい。
　また、上記課題を解決するため、本発明のバイオチップ読取装置は、蛍光測定用のバイオチップを備え、当該バイオチップからの蛍光を読み取るバイオチップ読取装置であって、前記バイオチップが、上述した本発明のバイオチップであり、前記バイオチップの前記サイトへと、前記マイクロレンズの側から励起光を照射する励起光学系と、前記サイトが発し前記マイクロレンズを通過した蛍光を受光光学系で集光して受光素子により撮影する撮影光学系と、を備えたことを特徴とする。
　また、本発明のバイオチップ読取装置において、前記受光光学系のうち前記バイオチップ側の開口角よりも、前記マイクロレンズの前記受光光学系側の開口角が大きくてもよい。言い換えると、本発明のバイオチップ読取装置において、前記受光光学系の開口数は、前記マイクロレンズの開口数よりも小さくてもよい。
　また、上記課題を解決するため、本発明のバイオチップ製造方法は、蛍光測定用のバイオチップを製造するバイオチップ製造方法であって、前記バイオチップが、上述した本発明のバイオチップであり、前記透明基板における第２面と対向して配置され、前記突起部と一対一に対応するように形成された複数の凹部それぞれに、前記サイトを形成するためのプローブ溶液が溜められたウェル容器を用意し、当該ウェル容器の前記凹部に前記突起部を進入させて、当該突起部の頂部を前記プローブ溶液に液浸させた後引き上げることで、前記頂部に前記プローブ溶液を付着させる付着工程と、前記プローブ溶液が前記頂部に付着した前記突起部を乾燥させることで、前記プローブ溶液のプローブを前記頂部に固定して前記サイトを形成する乾燥工程と、を備えたことを特徴とする。
　また、本発明のバイオチップ製造方法において、前記付着工程に先立って、前記突起部を含む前記第２面に対する表面処理により、前記プローブを固定するための活性官能基を形成するコーティング工程を行ってもよい。
　また、本発明のバイオチップ製造方法において、前記乾燥工程の後に、前記突起部を含む前記第２面を、前記活性官能基を不活性化するためのブロッキング液に液浸し、前記サイトの形成箇所以外の未反応の前記活性官能基を不活性化するブロッキング工程を行ってもよい。
　本発明によれば、マイクロレンズと一対一に対応するように形成された複数の突起部の各頂部にサイトが設けられている。サイトを発した蛍光は、突起部の内部を通ってマイクロレンズへと向かう。このため、あるサイトにおいて広い発散角を持つ蛍光の一部が、隣のマイクロレンズへと向かおうとしたときに突起部の側面の内側で反射されることとなり、隣のサイトの蛍光に対する迷光やクロストークが抑えられる。このように、本発明によれば、蛍光測定における光学ノイズを抑えることができる。
本発明の一実施形態にかかるバイオチップ読取装置を示す模式図である。 図１に示されているバイオチップの拡大図である。 サイトが発する蛍光がリレーレンズの第１レンズへと向かう光路を示す模式図である。 サイトを発した蛍光が、突起部の内部を通ってマイクロレンズへと向かう様子を示す模式図である。 サイトの１つ当たりの蛍光測定における光量増加を示す棒グラフである。 図１～図４に示されているバイオチップを製造するバイオチップ製造方法を示すフローチャートである。 図６にフローチャートで示されているバイオチップ製造方法を模式的に示す図である。 従来のバイオチップ読取装置の一例を示す模式図である。 励起光の光量の増加や、蛍光の効率的な集光により、蛍光測定の感度を向上させた従来のバイオチップの一例を示す模式図である。 サイトの形状を安定させた従来のバイオチップの一例を示す模式図である。
　以下、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。
　図１は、本発明の一実施形態にかかるバイオチップ読取装置を示す模式図である。
　図１に示されているバイオチップ読取装置１は、蛍光測定用のバイオチップ１１０を備え、このバイオチップ１１０からの蛍光を読み取る装置である。バイオチップ１１０は、蛍光測定用の試料溶液１１６が封入された支持容器１１５とともにバイオチップユニット１１を構成している。尚、本実施形態では、この試料溶液１１６として、蛍光測定におけるバックグラウンド光を抑えるために黒色溶液が採用されている。
　このバイオチップ読取装置１は、バイオチップユニット１１と、励起光学系１２と、撮影光学系１３と、を備えている。
　励起光学系１２は、光源１２１と、励起用レンズ１２２と、ダイクロイックミラー１２３と、を備えている。光源１２１を出た励起光が、励起用レンズ１２２で平行光となり、ダイクロイックミラー１２３で反射され、バイオチップユニット１１へと照射される。ダイクロイックミラー１２３は、撮影光学系１３の光学要素も兼ねている。なお、光源１２１としてはレーザ光源を用いることにより、大きな励起光量と蛍光波長へのリークの少ない鋭い励起波長帯域を実現できる。一方で、最終的な性能条件が許せば価格の安価なLED、ハロゲンランプなどを励起用波長フィルターと組み合わせて使用することも可能である。
　撮影光学系１３は、ダイクロイックミラー１２３と、第１レンズ１３１ａ及び第２レンズ１３１ｂからなるリレーレンズ１３１と、撮影カメラ１３２と、バリアフィルタ１３３と、を備えている。励起光を受けて、バイオチップユニット１１において発生した蛍光は、ダイクロイックミラー１２３を通過して、受光光学系であるリレーレンズ１３１によって撮影カメラ１３２へと集光される。このリレーレンズ１３１により撮影カメラ１３２に結像された蛍光の像が撮影される。なお、バイオチップ１１０の広い面積に対して光量分布及び画像歪みを低減させるためにリレーレンズ１３１はテレセントリック光学系としている。また正確な結像関係を得るためには、ダイクロイックミラー１２３やバリアフィルタ１３３も広義の受光光学系として加えて焦点位置や収差を計算したほうが良い。
　本実施形態では、図示されているこれらの構成要素の他に、撮影カメラ１３２をコントロールするとともに撮影された画像を分析して蛍光の光量を計算するコンピュータや、撮影画像と計算結果を記録する記録装置等も備えている。また、撮影カメラ１３２としては、受光素子として、カラーあるいはモノクロのＣＣＤやＣＭＯＳカメラを始め、高感度撮影が可能なＥＭ－ＣＣＤやデジタルＣＭＯＳ等が好適である。また、バイオチップユニット１１における後述の複数のサイトと一対一に対応した単一検出器ＰＤの集合等であってもよい。
　このようなバイオチップ読取装置１は、ＤＮＡチップ法における蛍光分子光量計測によるドライ画像測定や、バイオチップユニット１１における蛍光分子光量の液中測定及びリアルタイム測定等に応用される。
　また、臨床検査等に使用される標識抗体法等の次のような固相法にも応用される。例えば、組織や細胞内の特定の染色体や遺伝子の発現を、蛍光物質を用いて蛍光測定するＦＩＳＨ法（蛍光　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼーション）が一例として挙げられる。この他にも、以下のような各種の手法への応用が一例として挙げられる。即ち、ユーロピウム等の蛍光発光物質を標識として抗原抗体反応を測定するＦＩＡ法（蛍光免疫測定法）や、抗原となる病原体等に蛍光物質をラベルした血清（抗体）反応を測定するＩＦＡ法（間接蛍光抗体法）が挙げられる。更に、遺伝子・高分子分析による菌種判別や、がん遺伝子、動植物判別、腸内細菌の検査等への応用も挙げられる。
　このバイオチップ読取装置１が備えるバイオチップユニット１１は、上述したように、蛍光測定用のバイオチップ１１０と、支持容器１１５と、を備えている。支持容器１１５には、上述した各種応用例における蛍光測定用の試料溶液１１６が封入される。
　図２は、図１に示されているバイオチップの拡大図である。
　バイオチップ１１０は、透明基板１１１と、複数のマイクロレンズ１１２と、複数の突起部１１３と、サイト１１４と、を備えている。複数のマイクロレンズ１１２は、透明基板１１１における励起光の照射側となる第１面１１１ａにアレイ状に形成されている。各マイクロレンズ１１２は、半球状に形成された球面レンズとなっている。複数の突起部１１３は、前記透明基板１１１の前記第１面１１１ａと反対側で分子反応用サイト側である第２面１１１ｂにおいてマイクロレンズ１１２と一対一に対応するように形成されている。各突起部１１３は、マイクロレンズ１１２の光軸１１２ａを中心軸とした円錐台形状を有している。そして、分子反応用のサイト１１４は、この円錐台形状の突起部１１３における平らな頂部に平面視でほぼ円形に形成されている。
　このバイオチップ１１０における透明基板１１１とマイクロレンズ１１２と突起部１１３とは、次のような材料で一体に形成されている。即ち、この形成材料としては、ガラス、シリコン、単結晶、透明セラミックス、及び樹脂材料が適している。樹脂材料としては、光学的特性、化学的／熱的安定性に優れたＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）を始め、樹脂レンズに利用されるポリカーボネイト、アクリル系樹脂、ポリエチレン樹脂等が挙げられる。
　また、サイト１１４を構成する発光色素としては、次のようなものが挙げられる。例えば、励起波長が４９０ｎｍで発光波長が５２０ｎｍのＦＩＴＣや、励起波長が４８８ｎｍで発光波長が５７０ｎｍのＰｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎが挙げられる。また、励起波長が５５０ｎｍで発光波長が５７０ｎｍのＣｙ３や、励起波長が６４９ｎｍで発光波長が６７０ｎｍのＣｙ５も挙げられる。また、励起波長が４９５ｎｍで発光波長が５１９ｎｍのＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８や、励起波長が５５５ｎｍで発光波長が５６５ｎｍのＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５も挙げられる。更には、励起波長が６５０ｎｍで発光波長が６６５ｎｍのＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７も挙げられる。これらの蛍光色素を用いた分子反応サイトは、例えば試料の量に比例して蛍光の光強度が強くなるように設計される。
　サイト１１４を構成する発光色素は、適用する蛍光測定に応じて選択され、その選択された蛍光色素の励起波長に応じてマイクロレンズ１１２の設計が行われる。
　このバイオチップ１１０では、マイクロレンズ１１２の焦点が、サイト１１４よりも奥の光軸位置に設定されている。その結果、励起光は、サイト１１４ではデフォーカス状態となり、照射範囲が広くなっている。本実施形態では、照射範囲が、サイト１１４の外径に合わせた範囲となっている。これにより、サイト１１４には、マイクロレンズ１１２からの励起光がもれなく照射され、サイト１１４の周辺の余計な箇所に励起光が当たることが防がれて、バックグラウンド光を抑えることが可能となっている。
　サイト１１４を照射する励起光は、マイクロレンズ１１２の集光効果により増大する。またサイト以外への照射光は激減する。サイト１１４に対する励起光量は、レンズの有効範囲と照射範囲の面積比に比例する。このため、例えばレンズ有効径を１．０ｍｍ、照射面径を０．２ｍｍとすると、光量は、１．０２／０．２２＝２５倍となる。このとき、マイクロレンズ１１２の集光光路が、突起部１１３の側面の内側に掛からないように、突起部１１３における側面の開き角θ１が、マイクロレンズ１１２の開口角θ２よりも大きくなっている。尚、ここでは、レンズの光軸を含む平面において、光軸上の焦点と、レンズと平坦面との境界線に相当するレンズの有効範囲の外周とを結ぶ線と光軸がなす角度をレンズの開口角（図２ではθ２）と呼ぶ。また、同じ平面においてレンズの光軸１１２ａと突起部１１３における側面がなす角を開き角（図２ではθ１）と呼ぶ。
　このような励起光によって励起されたサイト１１４が発する蛍光は次のような光路を辿ってリレーレンズ１３１においてバイオチップ１１０に最も近い第１レンズ１３１ａ（チップ側レンズ）へと向かう。尚、図１では、この第１レンズ１３１ａが、１つの単レンズで図示されているが、複数のレンズを光軸上に並べて構成したレンズ群であってもよい。これは、励起光学系１２や撮影光学系１３を構成する他のレンズについても同様である。　
　図３は、サイトが発する蛍光がリレーレンズの第１レンズへと向かう光路を示す模式図である。尚、この図３では、バイオチップ１１０と第１レンズ１３１ａとの間に配置されるダイクロイックミラー１２３とバリアフィルタ１３３の図示が省略されている。
　サイト１１４が発する蛍光は、突起部１１３の内側を通って、マイクロレンズ１１２へと向かい、このマイクロレンズ１１２で第１レンズ１３１ａへと集光される。このとき、本実施形態では、マイクロレンズ１１２の蛍光出射側の開口角θ３よりも、マイクロレンズ１１２の蛍光入射側の開口角θ２が大きくなっている。
　サイト１１４から広い発散角で発生する蛍光が、上記のような大きな開口角θ２を持つマイクロレンズ１１２により多くの光量で集光される。サイト１１４がマイクロレンズ１１２の焦点であれば、マイクロレンズ１１２から第1レンズ１３１aへ出射する光は平行光となるが、サイト１１４はデフォーカス位置にある。このためマイクロレンズ１１２から出射する光は蛍光出射側の開口角θ３のように、平行光からわずかに開いた角度となる。すなわちサイト１１４から大きな発散角で発生し蛍光入射側の開口角θ２でマイクロレンズ１１２に入射した蛍光が、狭い角度である蛍光出射側の開口角θ３に変換されたことにより、蛍光の高効率な集光が可能となっている。これは、第１レンズ１３１ａの開口角θ５が、サイト１１４からの発散角よりも小さい場合、破線のようにサイト１１４からの蛍光は第１レンズ１３１ａで開口角の大きな部分にロスが発生するが、前記のマイクロレンズ１１２による蛍光入射側の開口角θ２から蛍光出射側の開口角θ３への開口角度変換によって、このロス部分を改善できるためである。なお、第１レンズ１３１ａの開口角θ５がマイクロレンズ１１２の蛍光入射側の開口角θ２よりも小さいことは、同時に複数のサイト１１４を計測するための広い視野を確保するために重要である。このマイクロレンズ１１２により集光される光量の増大効果は、各レンズにおける開口数ＮＡの二乗の比に比例する。例えばマイクロレンズ１１２からの出射角（即ち、蛍光出射側の開口角θ３）に応じた開口数を０．２、マイクロレンズ１１２への蛍光入射側の開口角θ２（即ち、サイト１１４の出射角）に応じた開口数を０．６とすると、光量は、０．６２／０．２２＝９
倍に増大する。
　図４は、サイトを発した蛍光が、突起部の内部を通ってマイクロレンズへと向かう様子を示す模式図である。
　蛍光の一部は、突起部１１３の内部を通ってマイクロレンズ１１２の内部へとそのまま向かう。また、蛍光の他の一部は、突起部１１３の側面で反射されてマイクロレンズ１１２の内部へと向かう。このとき、本実施形態では、突起部１１３における側面が、サイト１１４を発して当該突起部１１３の内部を通過する蛍光の少なくとも一部を全反射するように構成されている。この全反射条件は、いわゆるスネルの法則として知られる以下の条件となる。
　即ち、蛍光と、突起部１１３の側面の法線と、がなす角度が、ａｒｃｓｉｎ（ｎ２／ｎ１）以上の角度となるときに全反射が生じる。ｎ１は、突起部１１３の形成材料の屈折率であり、ｎ２は、突起部１１３の外部における屈折率である。蛍光のうちこのような条件を満たす蛍光が、突起部１１３の側面で全反射されてマイクロレンズ１１２の内部へと向かう。この条件はバイオチップを樹脂又はガラス（ｎ１≒１．５）、試料溶液を水溶液（ｎ２≒１．３）程度とすることで容易に実現できる。
　また、このように一部の蛍光については全反射が起きるように形成することで、マイクロレンズ１１２には、本来の開口角の外側からも蛍光が集まってくることとなり、このことは見かけ上、開口角を広げたものと見なせる。このことによるマイクロレンズ１１２での集光の光量の増加は、マイクロレンズ１１２の開口数ＮＡ１と、突起部１１３によるマイクロレンズ１１２の見かけの開口数ＮＡ１'と、の二乗の比に比例する。例えばマイクロレンズ１１２の開口数ＮＡ１を０．６、見かけの開口数ＮＡ１'を１．０とすると、光量は、１．０２／０．６２＝２．７倍に増加する。
　また、本実施形態では、突起部１１３における側面の開き角θ１が、次のような角度にもなっている。まず、図４に示されているように、任意のサイト１１４と、前記任意サイトに励起光を集光する対向する位置のマイクロレンズ１１２の光軸１１２ａと最も隣接するマイクロレンズ１１２の光軸１１２ａとを含む平面を想定する。そして、この平面において、サイト１１４の最外周の端部と、上記の最も隣接したマイクロレンズ１１２と第１面１１１ａにおける平坦面との境界線と、を最短で結ぶ線Ｌ１と、サイト１１４と対向する位置のマイクロレンズ１１２の光軸１１２ａとがなす角度θ４に注目する。本実施形態では、この角度θ４よりも、突起部１１３における側面の開き角θ１が小さくなっている。これにより、各サイト１１４の発する蛍光のほとんどが、隣のマイクロレンズ１１２へと向かう光路から外れることとなる。
　ここまで、マイクロレンズ１１２による励起光の光量増加、蛍光の集光の光量増加、さらに、突起部１１３での見かけの開口数ＮＡ１'による蛍光の集光の光量増加、について説明した。これにより、本実施形態のバイオチップ読取装置１では、全体として次のようなサイト１１４の１つ当たりの蛍光測定における光量増加および迷光の低減が期待できる。
　図５は、サイトの１つ当たりの蛍光測定における光量増加を示す棒グラフである。尚、この図５には、図８を参照して説明した従来のバイオチップ読取装置５でのサイト５１２の１つ当たりの蛍光測定における光量増加が、比較例として示されている。
　図５に示されるグラフＧ１１では、横軸に、比較例と、本実施形態との別が示され、縦軸に、光量の増加率が示されている。
　上述したように、本実施形態における上述の計算例では、マイクロレンズ１１２による励起光の光量増加が２５倍、マイクロレンズ１１２による蛍光の集光の光量増加が９倍、突起部１１３による蛍光の集光の光量増加が２．７倍となる。その結果、比較例に対する全体の光量増加としては６０７倍の蛍光光量増加が期待できることとなる。なお、図９の構造は、迷光に対して対策が行われていないためここでは比較を行っていない。
　以上に説明した本実施形態のバイオチップ１１０によれば、マイクロレンズ１１２と一対一に対応するように形成された複数の突起部１１３の各頂部にサイト１１４が設けられている。サイト１１４を発した蛍光は、突起部１１３の内部を通ってマイクロレンズ１１２へと向かう。このため、あるサイト１１４において広い発散角を持つ蛍光の一部が、隣のマイクロレンズ１１２へと向かおうとしたときに突起部１１３の側面の内側で反射されることとなり、隣のサイト１１４の蛍光に対する迷光やクロストークが抑えられる。このように、本実施形態のバイオチップ１１０によれば、蛍光測定における光学ノイズを抑えることができる。
　また、本実施形態のバイオチップ１１０では、突起部１１３における側面の開き角θ１が、マイクロレンズ１１２の開口角θ２より大きい。これにより、励起光が突起部１１３の側面に当たって散乱することなくサイト１１４へ照射できるため、一層、光学ノイズを抑えることができる。また、上記のような効率の良い集光により各サイト１１４についての測定光量を増加させて、蛍光測定の精度を高めることもできる。
　また、本実施形態のバイオチップ１１０では、突起部１１３における側面が、サイト１１４を発して突起部１１３の内部を通過する蛍光の少なくとも一部をマイクロレンズ１１２へと向けて全反射するように構成されている。突起部１１３の側面の内側での全反射により更に集光効率を向上することができる。即ち、このような全反射により、各マイクロレンズ１１２には、本来の開口角θ２の外側からも蛍光が集まってくることとなり、このことは見かけ上、開口角を広げたものと見なせる。これにより、一層測定光量を増加させて、蛍光測定の精度を更に高めることができる。
　また、本実施形態のバイオチップ１１０では、突起部１１３における側面の開き角θ１が、次のような角度ともなっている。まず、任意のサイト１１４と対向する位置のマイクロレンズ１１２の光軸１１２ａと隣のマイクロレンズ１１２の光軸１１２ａとを含む平面を想定する。この平面において、サイト１１４の端部と、上記の最も隣接したマイクロレンズ１１２と第１面１１１ａにおける平坦面との境界線と、を最短で結ぶ線Ｌ１と、サイト１１４と対向する位置のマイクロレンズ１１２の光軸１１２ａとがなす角度θ４よりも、開き角θ１が小さくなっている。これにより、各サイト１１４の発する蛍光のほとんどが、隣のマイクロレンズ１１２へと向かう光路から外れることとなるので、更に光学ノイズを抑えることができる。また、このように構成することで、マイクロレンズ１１２相互間の間隔をある程度詰めることができるので、バイオチップ１１０の高集積化を図ることもできる。
　また、本実施形態のバイオチップユニット１１は、支持容器１１５が、透明基板１１１における第２面１１１ｂを、複数のサイト１１４ごと密閉する。更に、支持容器１１５の内部には蛍光測定用の試料溶液１１６が外部に対して漏れることのないように封入されており、サイト１１４がこの試料溶液１１６に浸漬されている。このバイオチップユニット１１によれば、本実施形態のバイオチップ１１０において、隣のサイト１１４の蛍光に対する迷光やクロストークが抑えられる。これにより、蛍光測定における光学ノイズを抑えることができる。
　また、本実施形態のバイオチップユニット１１では、支持容器１１５内の試料溶液１１６として黒色溶液が採用されている。黒色溶液は、蛍光以外の迷光や隣接するサイトからのクロストーク光を吸収する。一方でサイトは直接マイクロレンズに結合しているため黒色溶液を経由せず読取装置へ向かう。これにより、蛍光測定におけるバックグラウンド光が抑えられるので、蛍光測定における光学ノイズを一層抑えることができる。
　また、本実施形態のバイオチップ読取装置１は、本実施形態のバイオチップ１１０のサイト１１４へと励起光を照射する励起光学系１２と、サイト１１４が発した蛍光をレンズで集光して撮影する撮影光学系１３と、を備えている。このバイオチップ読取装置１によれば、上述した本実施形態のバイオチップ１１０において、隣のサイト１１４の蛍光に対する迷光やクロストークが抑えられる。これにより、蛍光測定における光学ノイズを抑えることができる。
　また、本実施形態のバイオチップ読取装置１では、マイクロレンズ１１２の蛍光出射側の開口角θ３よりも、マイクロレンズ１１２の蛍光入射側の開口角θ２が大きくなっている。そして、このマイクロレンズの出射側の開口角θ３の蛍光を第一レンズの開口角θ５で受光している。その結果、マイクロレンズ１１２により、第１レンズ１３１ａの開口角θ５よりも広い開口角θ２で、各サイト１１４の蛍光を集光できることとなる。これにより、一層測定光量を増加させて、蛍光測定の精度を更に高めることができる。
　次に、バイオチップ１１０を製造するバイオチップ製造方法について説明する。
　図６は、図１～図４に示されているバイオチップを製造するバイオチップ製造方法を示すフローチャートである。また、図７は、図６にフローチャートで示されているバイオチップ製造方法を模式的に示す図である。
　本実施形態のバイオチップ製造方法では、分子反応としてＤＮＡハイブリダイゼーション、サイトとして反応用のＤＮＡプローブを形成する工程を示す。まず、サイト１１４形成前のバイオチップ１１０'の突起部１１３と一対一に対応するように形成された複数の凹部１４１を有するウェル容器１４が用意される。そして、このウェル容器１４における各凹部１４１に、サイト１１４を形成するための分子反応用のＤＮＡプローブのためのプローブ溶液１４２が入れられる（ステップＳ１）。次に、サイト１１４形成前のバイオチップ１１０'の突起部１１３を含む第２面１１１ｂに対する表面処理により、プローブ溶液１４２のプローブを固定するための活性官能基を形成するコーティング工程（ステップＳ２）が行われる。
　そして、ウェル容器１４の凹部１４１に突起部１１３を進入させて、当該突起部１１３の頂部をプローブ溶液１４２に液浸させた後引き上げることで、頂部にプローブ溶液１４２を付着させる付着工程（ステップＳ３）が行われる。本実施形態では、この付着工程（ステップＳ３）は、途中の乾燥を防ぐために、高湿条件下で行われる。
　付着工程（ステップＳ３）に続いて、バイオチップ１１０を乾燥させることで、プローブ溶液１４２のバッファ液を蒸発させてプローブを突起部１１３の頂部に固定してサイト１１４を形成する乾燥工程（ステップＳ４）が行われる。本実施形態では、この乾燥工程（ステップＳ４）では、プローブ結合反応進行のために８０℃で１時間のインキュベーションが行われる。
　乾燥工程（ステップＳ４）の後に、次のようなブロッキング工程（ステップＳ５）が行われる。ブロッキング工程（ステップＳ５）では、突起部１１３を含む第２面１１１ｂが、活性官能基を不活性化するためのブロッキング液に５分間液浸される。この液浸により、サイトの形成箇所以外の未反応の活性官能基にブロッキング液のブロッキング剤分子を結合させて不活性化する。
　次に、バイオチップ１１０のブロッキング液を洗浄液で洗浄する洗浄工程（ステップＳ６）が行われる。この洗浄工程（ステップＳ６）では、途中乾燥させずに、バイオチップ１１０を、熱水と冷水とに、それぞれ２分間ずつ液浸して取り出し、残った水滴をエアダスター等で除去する。
　最後に、プローブ固定によりサイト１１４が形成されたバイオチップ１１０が、使用時まで適宜に保管されて、このバイオチップ製造方法が終了する（ステップＳ７）。
　以上に説明した本実施形態のバイオチップ製造方法によれば、製造される本実施形態のバイオチップ１１０において、隣のサイト１１４の蛍光に対する迷光やクロストークが抑えられる。これにより、蛍光測定における光学ノイズを抑えることができる。また、本実施形態のバイオチップ製造方法によれば、ウェル容器１４の凹部１４１に突起部１１３を進入させることで、複数のサイト１１４を、正確な形成位置に、一度に形成することができる。これにより、例えばピンやインクジェットによるスポット装置等を用いて透明基板上に一箇所ずつプローブ溶液を付着させる等といった従来の製造方法と比較して、容易かつ安価に、高精度のバイオチップ１１０を製造することができる。
　また、本実施形態のバイオチップ製造方法では、付着工程（ステップＳ３）に先立って、突起部１１３を含む第２面１１１ｂに対する表面処理により活性官能基を形成するコーティング工程（ステップＳ２）が行われる。この活性官能基の形成により、各突起部１１３の頂部に高い精度でプローブを固定してサイト１１４を形成することができるので、一層高精度のバイオチップ１１０を製造することができる。
　また、本実施形態のバイオチップ製造方法では、乾燥工程（ステップＳ４）の後に、突起部１１３を含む第２面１１１ｂをブロッキング液に液浸するブロッキング工程（ステップＳ５）が行われる。その結果、サイト１１４の形成箇所以外の未反応の活性官能基が不活性化される。これにより、サイト１１４の形成箇所以外での不要な蛍光の発生等が抑えられた一層高精度のバイオチップ１１０を製造することができる。
　尚、以上に説明した実施形態は本発明の代表的な形態を示したに過ぎず、本発明は、この実施形態に限定されるものではない。即ち、本発明の骨子を逸脱しない範囲で種々変形して実施することができる。かかる変形によってもなお本発明のバイオチップ、バイオチップユニット、バイオチップ読取装置、及びバイオチップ製造方法の構成を具備する限り、勿論、本発明の範疇に含まれるものである。
　例えば、上述した実施形態では、本発明にいう突起部の一例として円錐台形状を有する突起部１１３が例示されているが、本発明にいう突起部はこれに限るものではない。本発明にいう突起部は、透明基板における第２面においてマイクロレンズと一対一に対応するように形成された複数の突起部であれば、その具体的な形状を問うものではない。
　また、上述した実施形態では、本発明にいう突起部の一例として、透明材料で円錐台形状に形成されたままの突起部１１３が例示されているが、本発明にいう突起部はこれに限るものではない。本発明にいう突起部は、その外側面が金属膜や誘電体多層膜等でミラーコーティングされたものであってもよい。
　また、上述した実施形態では、本発明にいうマイクロレンズの一例として、半球状の球面レンズとしてのマイクロレンズ１１２が例示されているが、本発明にいうマイクロレンズはこれに限るものではない。本発明にいうマイクロレンズは、例えば半球状以外の球面レンズであってもよく、あるいは非球面レンズやフレネルレンズであってもよい。
　また、上述した実施形態では、本発明にいうマイクロレンズについて開口数ＮＡ１が例示されているが、本発明にいうマイクロレンズはこれに限るものではなく、その開口数は、使用状況に応じて適宜に設計し得る。これは、本発明にいうチップ側レンズの一例としての第１レンズ１３１ａの開口数についても同様である。
　また、上述した実施形態では、本発明にいう励起光学系や撮影光学系の一例として、ダイクロイックミラー１２３が共通の光学要素となった励起光学系１２や撮影光学系１３が例示されている。しかしながら、本発明にいう励起光学系や撮影光学系はこれに限るものではなく、個々に独立した光学系であってもよい。また、例えばレンズの配置や個数等といった具体的な光学構成は、本実施形態で例示した構成に限るものではなく、適宜に設計し得る。
　１　　　バイオチップ読取装置
　１１　　バイオチップユニット
　１２　　励起光学系
　１３　　撮影光学系
　１４　　ウェル容器
　１１０　バイオチップ
　１１１　透明基板
　１１１ａ　第１面
　１１１ｂ　第２面
　１１２　マイクロレンズ
　１１２ａ　光軸
　１１３　突起部
　１１４　サイト
　１１５　支持容器
　１１６　試料溶液
　１２１　光源
　１２２　励起用レンズ
　１２３　ダイクロイックミラー
　１３１　リレーレンズ
　１３１ａ　第１レンズ
　１３１ｂ　第２レンズ
　１３２　撮影カメラ
　１３３　バリアフィルタ
　Ｌ１　　線
　θ１　　開き角
　θ２，θ３，θ５　　開口角
　θ４　　角度

Claims (11)

  1. 　蛍光測定用のバイオチップであって、
    　透明基板と、
    　前記透明基板における第１面にアレイ状に形成された複数のマイクロレンズと、
    　前記透明基板における第２面において前記マイクロレンズと一対一に対応するように形成された複数の突起部と、
    　前記突起部の頂部に形成された蛍光測定用のサイトと、
    を備えたことを特徴とするバイオチップ。
  2. 　前記突起部における側面の開き角が、前記マイクロレンズの開口角と同等以上であることを特徴とする請求項１に記載のバイオチップ。
  3. 　前記突起部における側面が、前記サイトから発して当該突起部の内部を通過する蛍光の少なくとも一部を前記マイクロレンズへと向けて全反射することを特徴とする請求項１又は２に記載のバイオチップ。
  4. 　任意の前記サイトと対向する位置のマイクロレンズの光軸と最も隣接したマイクロレンズの光軸とを含む平面において、前記サイトの端部と、前記最も隣接したマイクロレンズと前記第１面における平坦面との境界線と、を最短で結ぶ線と、前記対向する位置のマイクロレンズの光軸とがなす角度よりも、前記突起部における側面の開き角が小さいことを特徴とする請求項１～３のうち何れか一項に記載のバイオチップ。
  5. 　蛍光測定用のバイオチップと、当該バイオチップの支持容器と、を備えたバイオチップユニットであって、
    　前記バイオチップが、請求項１～４のうち何れか一項に記載のバイオチップであり、
    　前記支持容器が、前記透明基板における第２面を、複数の前記サイトごと密閉するとともに、内部に蛍光測定用の試料溶液が封入されて前記サイトが浸漬されたものであることを特徴とするバイオチップユニット。
  6. 　前記試料溶液が、黒色溶液であることを特徴とする請求項５に記載のバイオチップユニット。
  7. 　蛍光測定用のバイオチップを備え、当該バイオチップからの蛍光を読み取るバイオチップ読取装置であって、
    　前記バイオチップが、請求項１～４のうち何れか一項に記載のバイオチップであり、
    　前記バイオチップの前記サイトへと、前記マイクロレンズの側から励起光を照射する励起光学系と、
    　前記サイトが発し前記マイクロレンズを通過した蛍光を受光光学系で集光して受光素子により撮影する撮影光学系と、を備えたことを特徴とするバイオチップ読取装置。
  8. 　前記受光光学系のうち前記バイオチップ側の開口角よりも、前記マイクロレンズの前記受光光学系側の開口角が大きいことを特徴とする請求項７に記載のバイオチップ読取装置。
  9. 　蛍光測定用のバイオチップを製造するバイオチップ製造方法であって、
    　前記バイオチップが、請求項１～４のうち何れか一項に記載のバイオチップであり、
    　前記透明基板における第２面と対向して配置され、前記突起部と一対一に対応するように形成された複数の凹部それぞれに、前記サイトを形成するためのプローブ溶液が溜められたウェル容器を用意し、当該ウェル容器の前記凹部に前記突起部を進入させて、当該突起部の頂部を前記プローブ溶液に液浸させた後引き上げることで、前記頂部に前記プローブ溶液を付着させる付着工程と、
    　前記プローブ溶液が前記頂部に付着した前記突起部を乾燥させることで、前記プローブ溶液のプローブを前記頂部に固定して前記サイトを形成する乾燥工程と、を備えたことを特徴とするバイオチップ製造方法。
  10. 　前記付着工程に先立って、前記突起部を含む前記第２面に対する表面処理により、前記プローブを固定するための活性官能基を形成するコーティング工程を行うことを特徴とする請求項９に記載のバイオチップ製造方法。
  11. 　前記乾燥工程の後に、前記突起部を含む前記第２面を、前記活性官能基を不活性化するためのブロッキング液に液浸し、前記サイトの形成箇所以外の未反応の前記活性官能基を不活性化するブロッキング工程を行うことを特徴とする請求項１０に記載のバイオチップ製造方法。
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