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WO2018030437A1 - ブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法 - Google Patents

ブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法 Download PDF

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WO2018030437A1
WO2018030437A1 PCT/JP2017/028841 JP2017028841W WO2018030437A1 WO 2018030437 A1 WO2018030437 A1 WO 2018030437A1 JP 2017028841 W JP2017028841 W JP 2017028841W WO 2018030437 A1 WO2018030437 A1 WO 2018030437A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
solution
contaminated
pcv
treating
porcine circovirus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2017/028841
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English (en)
French (fr)
Inventor
幹弘 柚木
健 浦山
薫 坂井
朋之 宮林
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Asahi Kasei Medical Co Ltd
Original Assignee
Asahi Kasei Medical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Asahi Kasei Medical Co Ltd filed Critical Asahi Kasei Medical Co Ltd
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Priority to CN201780047764.8A priority patent/CN109563488B/zh
Priority to US16/323,996 priority patent/US20190167823A1/en
Priority to EP17839505.9A priority patent/EP3498828B1/en
Priority to JP2018533518A priority patent/JP6731055B2/ja
Publication of WO2018030437A1 publication Critical patent/WO2018030437A1/ja
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2/00—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor
    • A61L2/0005—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts
    • A61L2/0011—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts using physical methods
    • A61L2/0017—Filtration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses

Definitions

  • the present invention relates to a method for treating a solution contaminated with porcine circovirus.
  • Countermeasures against viruses mixed in the production process of plasma fractionation preparations and biopharmaceuticals are detection, inactivation and removal of viruses.
  • the method for inactivating viruses include a heat treatment method and a chemical treatment method (for example, Solvent / Detergent: S / D treatment). These methods are known as particularly effective inactivation treatment methods for envelope viruses such as human immunodeficiency virus (HIV) and hepatitis C virus (Hepatitis C virus; HCV).
  • non-enveloped viruses such as human parvovirus B19 (Human parvovirus B19; B19) and hepatitis A virus (Hepatitis A virus; HAV) have resistance to the above-mentioned virus inactivation methods, and the envelope virus Cannot be expected to be as effective as
  • membrane filtration methods and the like as methods for removing viruses. Since the membrane filtration method performs the separation operation according to the size of the particles, it has the advantage that the virus can be removed only according to the size, regardless of the chemical characteristics and thermal properties of the object to be separated. It is thought that there is. Therefore, in recent years, a membrane filtration method using a virus removal membrane has been generally adopted.
  • Cellulosic virus-removing membranes are hydrophilic natural materials, and are therefore used in the manufacture of a wide range of formulations because of the low adsorption of protein formulations to the membrane.
  • parvoviruses that are non-enveloped viruses
  • B19 is a linear single-stranded DNA virus belonging to the family Parvoviridae and has a size of about 18 to 24 nm.
  • a membrane filtration method using a virus removal membrane has been widespread. The basic principle of this membrane filtration method is achieved by setting conditions under which the target protein passes through the virus removal membrane but cannot pass through the virus, depending on the pore size of the virus removal membrane used.
  • Patent Document 1 discloses a method for removing B19 by aggregating B19 by adjusting the amino acid solution to pH 4 to 8, and trapping B19 on the membrane.
  • Patent Document 2 discloses that hydrophilicity having a membrane pore size larger than the monodispersed virus size is obtained by aggregating B19 by maintaining the protein solution at a pH of less than 6 and having an electric conductivity of 7 mS / cm or less.
  • a method for removing viruses in a protein solution, characterized by allowing the protein solution to permeate through a membrane, is disclosed.
  • PCV Porcine circovirus
  • PCV Porcine circovirus
  • PCV is the smallest virus currently known, and its particle size is 16 to 20.7 nm.
  • PCV belongs to the circoviridae family and is classified into, for example, PCV1, PCV2, and the like.
  • PCV is one of viruses with a high risk of being mixed in the manufacturing process of biopharmaceuticals, and a case of contamination was reported in 2010.
  • PCV is resistant to low pH treatment and heat treatment, and according to examination in Non-Patent Document 1, the removal rate of the virus removal membrane in a solution in which PCV is monodispersed is 0.1-0 in Planova 20N.
  • Non-Patent Document 1 discloses that PCV can be adsorbed and removed by ion exchanger treatment, it can be said that methods for removing PCV more effectively have been sufficiently studied so far. Absent.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a novel method for treating a solution contaminated with porcine circovirus.
  • the present inventors have determined that a solution contaminated with porcine circovirus adjusted to a specific pH is treated with a specific filtration membrane as a treatment method for a porcine circovirus contaminated solution.
  • the present invention has been completed by finding that a novel processing method can be provided.
  • the present invention is as follows. (1) Adjusting the pH of a solution contaminated with porcine circovirus to 3.0 to 7.0, and treating the pH-adjusted solution with a filtration membrane having an LRV for bacteriophage PP7 of 4 or more. A method for treating a solution contaminated with circovirus. (2) The method for treating a solution contaminated with porcine circovirus according to (1), wherein the solution adjusted to pH includes 0.50 M or less glycine. (3) The method for treating a solution contaminated with porcine circovirus according to (2), comprising 0.010 to 0.40 M glycine. (4) The method for treating a solution contaminated with porcine circovirus according to (2), comprising 0.20 to 0.35 M glycine.
  • a novel method for treating a solution contaminated with porcine circovirus can be provided.
  • Example 1 it is a figure which shows the result of having confirmed the change of the PCV removal capability on the conditions of pH 3.0-8.0 using 0.30M glycine buffer.
  • Example 2 it is a figure which shows the result of having confirmed the change of PCV removal ability on the conditions of 0.10-2.0M glycine buffer (pH 4.0).
  • Example 3 it is a figure which shows the result of having confirmed the influence which acts on PCV removal of pH under 0.10% IgG and 0.10M glycine conditions.
  • Example 4 it is a figure which shows the result of having confirmed the influence which it has on 0.10% IgG and pH6.0 conditions on the PCV removal of the glycine concentration.
  • Example 5 it is a figure which shows the result of having confirmed the influence which it has on 0.30M glycine buffer (pH 6.0) conditions on the PCV removal of IgG concentration.
  • Example 6 it is a figure which shows the result of having confirmed the IgG recovery rate after filtration by P-15 and P-20 on 0.30M glycine (pH 6.0) containing 1.0% IgG.
  • the present embodiment a mode for carrying out the present invention (hereinafter referred to as “the present embodiment”) will be described.
  • the present invention is not limited to the following embodiments, and various modifications can be made within the scope of the gist.
  • a method for treating a solution contaminated with porcine circovirus is as follows: Adjusting the pH of the solution contaminated with porcine circovirus to 3.0 to 7.0, and treating the pH-adjusted solution with a filtration membrane having an LRV of 4 or more for bacteriophage PP7.
  • the sample used for the processing method of this embodiment is a solution in which PCV is contaminated.
  • the “solution in which PCV is contaminated” may be a solution in which PCV is present in the solution, and includes a solution in which PCV may be contaminated.
  • the PCV-contaminated solution does not have to be actually contaminated with PCV, and may be a solution that may be contaminated with PCV in the process of preparing the solution.
  • the solution that may be contaminated with PCV does not prevent the PCV from being contaminated.
  • the PCV-contaminated solution may be, for example, a solution containing a protein that may be PCV-contaminated, or may be a PCV-contaminating protein that does not contain a protein.
  • the solution in which PCV is contaminated may be a solution containing protein, or may be a solution containing no protein and contaminated with PCV.
  • the solution in which PCV is contaminated include body fluids, which are body fluid components such as humans and mammals. Specific examples of body fluids are not particularly limited, but blood (serum and plasma), Saliva, sweat, urine, runny nose, semen, plasma, lymph, enzyme, tissue fluid and the like.
  • the solution contaminated with PCV may be a solution obtained by refining these body fluids or the like as raw materials, or a solution containing body fluids obtained by diluting body fluids or the like.
  • the solution in which PCV is contaminated may be a medium after cell culture, a culture supernatant after cell culture, or the like, and the cell may be a cell used for gene recombination techniques.
  • the solution in which PCV is contaminated may be a solution obtained by refining these media or the like as raw materials, or a solution containing a medium or the like obtained by diluting the media or the like.
  • the solution contaminated with PCV may be a vaccine produced by cell culture, an antibody drug, a gene recombination preparation, or the like.
  • the formulation etc. which use the enzyme derived from a biological tissue in the manufacturing process may be sufficient.
  • the PCV-contaminated solution may or may not contain protein, but contains 5.0 w / v% or less of protein, that is, 0 to 5.0 w / v%. It is preferable that the protein is contained.
  • protein is contained in a solution obtained by purification using a body fluid, a medium, or the like as a raw material.
  • the protein contained in the PCV-contaminated solution is not particularly limited.
  • antibody erythropoietin, thrombopoietin, tissue type plasminogen activator, prourokinase, thrombomodulin, antithrombin III , Protein C, blood coagulation factor VII, blood coagulation factor VIII, blood coagulation factor IX, blood coagulation factor X, blood coagulation factor XI, blood coagulation factor XII, prothrombin complex, fibrinogen, albumin, gonadotropin, thyroid stimulating hormone, Epidermal growth factor (EGF), hepatocyte growth factor (HGF), keratinocyte growth factor, activin, osteogenic factor, stem cell factor (SCF) such as G-CSF, M-CSF, interferon ⁇ , interferon ⁇ , interferon ⁇ , i Proteins such as turleukin 2, interleukin 6, interleukin 10, interleukin 11, soluble interleukin 4 receptor,
  • the protein contained in the PCV-contaminated solution includes a radioisotope, a low molecular weight drug, a high molecular weight drug, or a different protein or a protein portion thereof as the above protein or a partial fragment thereof. It may be a protein obtained by chemically or genetically binding fragments or the like, or a partial fragment of the protein.
  • an antibody such as an immunoglobulin is preferable, and IgG is preferable among immunoglobulins.
  • a specific example of the PCV-contaminated solution is not particularly limited, and examples thereof include a solution obtained in the antibody preparation production process.
  • the solubility of the protein contained in the raw plasma is controlled and the specific protein is precipitated by appropriately combining the ion concentration, alcohol concentration, reaction temperature and protein concentration of the raw plasma. Then, after separating the precipitated protein and the supernatant with a high-speed centrifuge, the necessary precipitate or supernatant is collected. And another protein is precipitated by setting suitably the conditions different from the said conditions with respect to the obtained deposit or supernatant.
  • a solution containing a highly pure antibody can be obtained. Any of the solutions obtained during the antibody separation / purification step can be used as a solution contaminated with PCV in this embodiment.
  • antibodies include humanized antibodies such as human antibodies, human chimeric antibodies, and human complementarity determining region-grafted antibodies, and antibody fragments thereof.
  • the antibody is composed of a variable region (V region) and a constant region (C region).
  • the heavy chain variable region is VH
  • the light chain variable region is VL
  • the heavy chain constant region is CH
  • the light chain constant region is CL. That's it.
  • the human chimeric antibody refers to an antibody comprising VH and VL of a non-human animal antibody and CH and CL of a human antibody.
  • Human-type chimeric grafted antibodies are designed by constructing and constructing cDNAs encoding VH and VL of non-human animal antibodies and inserting them into expression vectors for animal cells having cDNAs encoding human antibodies CH and CL, respectively.
  • a type chimera graft antibody expression vector can be constructed and introduced into animal cells for expression and production.
  • the CH of the human chimeric antibody may be any as long as it belongs to a human immunoglobulin (hereinafter referred to as hIg), but is preferably of the hIgG class, and more preferably hIgG1, hIgG2, hIgG3 belonging to the hIgG class, Any of the subclasses such as hIgG4 can be used.
  • the CL of the human chimeric antibody may be any as long as it belongs to hIg, and those of ⁇ class or ⁇ class can be used.
  • Non-human animals refer to mice, rats, hamsters, rabbits and the like. Further, it is known that coexistence of IgG inhibits the aggregation of MVM and PPV.
  • antibody fragment examples include Fab, F (ab ′) 2, Fab ′, scFv, diabody, dsFv, and a peptide containing CDR.
  • Fab is a fragment obtained by treating an IgG-type antibody molecule with the proteolytic enzyme papain (cleaved at the amino acid residue at position 224 of the H chain). It is an antibody fragment having an antigen-binding activity having a molecular weight of about 50,000 bound by a disulfide bond.
  • the Fab is prepared by treating an antibody with the proteolytic enzyme papain or by inserting the DNA encoding the Fab of the antibody into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector, and inserting the vector into a prokaryotic or eukaryotic organism. It can be manufactured by introducing into
  • the step of adjusting the pH of the solution contaminated with PCV to 3.0 to 7.0 is to measure the pH of the solution contaminated with PCV and adjust the pH to 3.0 to 7.0. Is done.
  • the protein concentration of the solution contaminated with PCV is less than 0.10 w / v%, it is preferable to adjust the pH of the solution contaminated with PCV to pH 3.0 to 6.0.
  • the protein concentration of the solution contaminated with PCV is 0.10 to 1.5 w / v%, it is preferable to adjust the pH of the solution contaminated with PCV to 3.8 to 7.0, more preferably pH 5 Adjust to 5 to 6.5.
  • the pH can be adjusted using a base, an acid and a buffer.
  • sodium hydroxide can be used, and as the acid, either an inorganic acid or an organic acid can be used.
  • hydrochloric acid can be used, and as the buffer, for example, acetic acid buffer, citric acid. Examples thereof include a buffer solution and a phosphate buffer solution.
  • the solution obtained by adjusting the pH preferably contains glycine.
  • the glycine concentration in the pH adjusted solution is preferably 0.50 M or less, that is, 0 to 0.50 M, more preferably 0.010 to 0.40 M, and still more preferably 0.20 to 0.35 M. It is.
  • the protein concentration of the PCV-contaminated solution is 0.10 to 1.5 w / v%, it is preferable to adjust the glycine concentration in the solution with adjusted pH to 0.010 to 0.50 M, more preferably Adjust to 0.010-0.30M.
  • the glycine concentration and pH in the solution whose pH is adjusted are appropriately adjusted depending on the concentration of the protein.
  • PCV can be effectively removed by filtration without affecting the properties and yield of the target protein.
  • PCV can be more effectively removed by adjusting the glycine concentration to a suitable range. This is not bound by theory, but because the PCV that is contaminated in the sample aggregates and the aggregated PCV becomes larger than the molecules of the target protein contained in the sample, it is efficiently removed. it is conceivable that.
  • the step of treating the pH-adjusted solution with a filtration membrane having an LRV of 4 or more for bacteriophage PP7 is obtained by adding the pH-adjusted solution to the filter membrane having an LRV of 4 or more for bacteriophage PP7 This is done by passing the liquid.
  • PCV can be effectively removed by treatment with a filtration membrane having an LRV of 4 or more for bacteriophage PP7.
  • a filtration membrane having an LRV of 4 or more for bacteriophage PP7 is a membrane having an LRV of 4 or more when a solution containing bacteriophage PP7 is loaded at 50 L / m 2 on the filtration membrane to be used.
  • a solution containing bacteriophage PP7 a 1 mg / mL BSA solution (PBS buffer, pH 7.4) and a bacteriophage PP7 concentration of 10 7 pfu / mL are used.
  • the shape of the filtration membrane to be used is not particularly limited, but may be, for example, a flat membrane or a hollow fiber membrane. When a flat membrane is used, filtration may be performed with one sheet, or filtration may be performed with multiple sheets.
  • the pH adjusted solution is treated with a filter membrane having an LRV of 4 or more for bacteriophage PP7 by passing the solution with adjusted pH through a filter membrane having an LRV of 4 or more for bacteriophage PP7. Is done.
  • the filtration method may be performed by total filtration or a cross flow method.
  • a pretreatment may be performed with a membrane having an average pore size larger than 20 nm.
  • filtration membranes having an LRV of 4 or more for bacteriophage PP7 include Planova TM 15N (Asahi Kasei Medical) and Planova TM 20N (Asahi Kasei Medical) made of cellulose.
  • Planova TM BioEX manufactured by Asahi Kasei Medical
  • Pegasus SV4 manufactured by Pall
  • Virosart CPV manufactured by Sartorius
  • Viresolve Prolisolve which consist of hydrophilized PES Etc.
  • a preferred membrane can be defined by the average pore size of the pores of the virus removal membrane.
  • the average pore diameter of the pores of the virus removal membrane is, for example, 13 nm or more and 21 nm or less.
  • the average pore diameter of the pores can be calculated by the following calculation formula with reference to the method described in International Publication No. 2015/156401.
  • Average pore diameter (nm) 2 ⁇ 103 ⁇ ⁇ (V ⁇ d ⁇ ⁇ / P ⁇ A ⁇ Pr)
  • V water permeability (mL / min)
  • d film thickness ( ⁇ m)
  • ⁇ water viscosity (cp)
  • P pressure difference (mmHg)
  • A membrane area (cm 2 )
  • Pr is empty.
  • the porosity (%) is shown.
  • the water permeability is 10 bundles of yarn, a module is made to have an effective length of 16 cm, one end of the obtained module is closed, a pressure of 200 mmHg is applied to the other end, and water is passed at 37 ° C. did. At this time, the amount of water coming out through the membrane was measured as the water permeability.
  • the membrane area was calculated by measuring the inner diameter in a dry state.
  • the film thickness means the film thickness in a dry state.
  • the apparent density ⁇ a of the hollow fiber is calculated by the following calculation formula, and ⁇ p means the density (g / cm 3 ) of cellulose.
  • Wd means the absolute dry weight (g) of the hollow fiber
  • Vw means the apparent volume (cm 3 ) of the hollow fiber
  • l is the length (cm) of the hollow fiber
  • Do is the outer diameter (cm) of the hollow fiber.
  • Di means the inner diameter (cm) of the hollow fiber.
  • the viral load of bacteriophage PP7 is not particularly limited, it can be measured by a plaque assay method.
  • the plaque assay is described in Journal of Pharmaceutical Sciences and Technology 2008; Supplement Volume 62 No. It can be carried out according to the method described in S-4.
  • a solution sample containing bacteriophage PP7 is serially diluted and each sample is mixed with Pseudomonas aeruginosa, followed by the addition of soft agar. The mixed solution is poured onto an agar plate, solidified, and cultured at 37 ° C. for one day.
  • the number of plaques is measured with the naked eye, and the phage concentration pfu (place forming unit) / mL contained in the original solution is calculated by the following formula. (Number of plaques ⁇ dilution ratio) pfu / sample amount (mL) pfu / mL
  • the LRV for PCV can be determined by measuring the viral load of PCV in the above formula.
  • the viral load of PCV is not particularly limited, but can be measured by quantitative PCR (Quantitative Polymerization Chain Reaction: Q-PCR).
  • the quantitative PCR method can be performed according to the method of Yang et al. (Described in Non-Patent Document 1). In this case, PCV-1 TM Fwd. : AGAAAGGCGGGAATTGAAGATAC (SEQ ID NO: 1), PCV-1 TM Rev.
  • the pH-adjusted solution supplied to the filtration membrane having an LRV of 4 or more for bacteriophage PP7 can be treated at 50 to 100 L / m 2 as the amount of filtrate per virus removal membrane area. Is preferred.
  • the virus removal membrane area is calculated as the area of the filtration surface (primary side surface). In the case of a flat membrane, it is the area calculated from the length of two sides, and in the case of a hollow fiber membrane, it is the area inside (inner surface) of the hollow fiber.
  • the amount of filtrate can be adjusted by the filtration time in filtration under a constant filtration pressure condition.
  • PCV smaller than the pore size of a general virus removal membrane is aggregated, and the virus removal membrane is used. Can be removed.
  • the processing method of the solution in which the PCV is contaminated according to the present embodiment can provide an effect that safety can be ensured for a solution (including a case in which the PCV is not contaminated) that may be contaminated with PCV.
  • a step of adjusting the pH of the solution to be treated to 3.0 to 7.0, and a step of treating the pH adjusted solution with a filtration membrane having an LRV of 4 or more for bacteriophage PP7 There is also provided a method of treating a solution comprising: When the solution in which the PCV of this embodiment is contaminated contains a protein, safety and protein permeability can be satisfied simultaneously by treating with a virus removal membrane. Moreover, when the solution which PCV of this embodiment contaminates does not contain protein, PCV can be removed by processing with a virus removal film
  • the PCV can be removed from the solution by filtering it from the solution containing PCV using a membrane of LRV4 or higher. By filtering, safety can be ensured.
  • PCV can be removed by this method regardless of the presence or absence of protein, and if the protein-containing solution, high permeability and safety should be satisfied at the same time. Can do.
  • the target protein recovery rate was 80% or more. That is, the processing method of this embodiment can provide a highly safe product from which PCV has been removed.
  • Example 1 Examination of optimum pH under glycine buffer conditions Changes in PCV removal ability under pH 3.0 to 8.0 conditions were confirmed by LRV using 0.30 M glycine buffer.
  • PCV Materials / Uses / Virus strain
  • PK (15) cell ATCC No. CCL-33
  • PK (15) cells 1.0 ⁇ 10 5 cells / mL were seeded and cultured in Dulbecco's modified Eagle medium containing 5% fetal bovine serum (37 ° C., 5% CO 2 ), and the culture supernatant on day 4 of culture was used as a virus source. Used as. Storage of the virus source was performed at ⁇ 80 ° C. The genome concentration of the virus source was 10.17 Log copies / mL.
  • Glycine buffer 27.0 g of glycine (purchased manufacturer: WAKO) was added to 1.2 L of pure water, and the mixture was stirred and dissolved with a stirrer. After glycine was completely dissolved, 0.50 M hydrochloric acid or aqueous sodium hydroxide solution was added to adjust to the desired pH while stirring with a stirrer.
  • the membrane area was 0.001 m 2 and the LRV for PP7 was> 6.5 for P-15 and P-20 and 0 for P-35.
  • ⁇ Reagent for PCR QuantiTect Probe PCR Kit, source QIAGEN ⁇ IgG: donated blood Venoglobulin IH (Japan Blood Products Organization), 10% concentration, human species
  • the PCV removal capability was determined based on the removal coefficient (LRV) calculated by the following equation.
  • LRV Log [(V 1 ⁇ T 1 ))] / [(V 2 ⁇ T 2 ))]
  • V 1 PCV genome capacity T 1 of the sample before the virus removal treatment step
  • T 1 PCV genome amount
  • V 2 PCV genome volume
  • T 2 of the sample after the virus removal treatment step PCV after the virus removal treatment step
  • Example 2 Examination of Optimum Glycine Concentration
  • changes in PCV removal ability under conditions of 0.10 to 2.0 M glycine buffer (pH 4.0) were confirmed.
  • Each sample was prepared in the same manner as in Example 1 except that the pH of the glycine buffer was fixed at 4 and the glycine concentration was 0.1 to 2.0 M.
  • LRV at glycine concentrations of 0.10M and 0.30M was ⁇ 4.5 and ⁇ 5.0, respectively, when using either P-15 or P-20.
  • the LRV was 4.2 and 3.9, respectively.
  • the LRV at glycine concentrations of 0.10 M and 0.30 M was 4.5 and 3.8, respectively (Table 2).
  • the part of the arrow shown in FIG. 2 shows that the virus decreased below the detection limit.
  • Example 3 Examination of optimum pH under 0.10% IgG and 0.10M glycine conditions In this example, the effect of pH under 0.10% IgG and 0.10M glycine conditions on PCV removal It was confirmed.
  • Each sample was prepared in the same manner as in Example 1 except that 0.10% IgG was added to 0.10 M glycine buffer (pH 3.5 to 6.0).
  • Each sample was filtered under the same conditions as in Example 1 using P-15, and LRV was calculated. The results are shown in FIG.
  • Example 4 Examination of optimal glycine concentration under 0.10% IgG and pH 6.0 conditions In this example, the effect of glycine concentration under 0.10% IgG and pH 6.0 conditions on PCV removal It was confirmed.
  • Each sample was prepared in the same manner as in Example 1 except that 0.10% IgG was added to 0.10 to 0.50 M glycine buffer (pH 6.0).
  • Each sample was filtered using P-15 and P-20 under the same conditions as in Example 1, and LRV was calculated. The results are shown in FIG.
  • Example 5 Examination of protein concentration under conditions of 0.30 M glycine and pH 6.0 In this example, the effect of IgG concentration under the condition of 0.30 M glycine buffer (pH 6) on PCV removal was confirmed.
  • Each sample was prepared in the same manner as in Example 1 except that 0.10 to 5.0% IgG was added to 0.30 M glycine buffer (pH 6).
  • Each sample was filtered under the same conditions as in Example 1 using two P-15s and two P-20s at IgG concentration of 1.0%, and P-20 at the other IgG concentrations. LRV was calculated. The results are shown in FIG.
  • Example 6 Protein recovery by filtration under conditions of 0.30M glycine (pH 6.0) containing 1% IgG
  • P under conditions of 0.30M glycine (pH 6.0) containing 1% IgG The IgG recovery after filtration with -15 and P-20 was confirmed.
  • the recovery rate of IgG after filtration was measured with an absorptiometer (A280 nm). When 150 mL and 53 mL of sample liquid were loaded on P-15 and P-20, the recovered liquid volume after filtration was 147.6 mL and 50.7 mL.
  • the recovery rate (%) indicates the amount of IgG in the sample after filtration when the amount of IgG in the loaded sample is 100%.
  • the recovery rate was 98% for P-20 and 94% for P-15 (FIG. 6).
  • the method of the present invention is particularly useful in the production of plasma fractionated preparations and biopharmaceuticals.
  • SEQ ID NO: 1 shows the base sequence of the primer (PCV-1 TM Fwd.).
  • SEQ ID NO: 2 shows the nucleotide sequence of a primer (PCV-1 TM Rev.).
  • SEQ ID NO: 3 shows the base sequence of the probe (TaqMan probe).

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Abstract

本発明は、ブタサーコウイルスが夾雑する溶液のｐＨを３.０～７.０に調整する工程、及びｐＨを調製した溶液を、バクテリオファージ　ＰＰ７に対するＬＲＶが４以上であるろ過膜で処理する工程を含む、ブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法を提供する。

Description

ブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法
　本発明は、ブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法に関する。
　血漿分画製剤やバイオ医薬品の製造工程に混入したウイルスに対する対策は、ウイルスの検出、不活化及び除去である。
　ウイルスを不活化する方法には、加熱処理法や化学薬品処理法（例えば、Ｓｏｌｖｅｎｔ／Ｄｅｔｅｒｇｎｔ：Ｓ／Ｄ処理）等がある。これらの方法は、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ；ＨＩＶ）やＣ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｃ　ｖｉｒｕｓ；ＨＣＶ）等のエンベロープウイルスに対して特に有効な不活化処理方法として知られている。
　しかし、ヒトパルボウイルスＢ１９（Ｈｕｍａｎ　ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ　Ｂ１９；Ｂ１９）やＡ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ａ　ｖｉｒｕｓ；ＨＡＶ）等のノンエンベロープウイルスは、上記ウイルス不活化方法に対して抵抗性を有しており、エンベロープウイルスに対するほどの効果が期待できない。
　ウイルスを除去する方法には、膜ろ過法等がある。膜ろ過法は、粒子の大きさに応じて分離操作を行うので、分離する対象の化学的特性や熱的性質に拘わらず、大きさのみに応じて、ウイルスを除去することができるという利点があると考えられている。そのため、近年、ウイルス除去膜による膜ろ過法が一般的に採用されている。また、セルロース系ウイルス除去膜は素材が親水性の天然素材であるため、タンパク製剤の膜への吸着が少なく、幅広い製剤の製造において用いられている。
　ノンエンベロープウイルスであるパルボウイルスとしては、例えば、Ｂ１９、マウス微小ウイルス（Ｍｉｎｕｔｅ　ｖｉｒｕｓ　ｏｆ　ｍｉｃｅ；ＭＶＭ）、ブタパルボウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ　ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ；ＰＰＶ）等がある。
　Ｂ１９はパルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）に属する直鎖一本鎖ＤＮＡウイルスであり、その大きさは約１８～２４ｎｍである。
　パルボウイルス等に対する堅牢性の高いウイルス除去方法としても、ウイルス除去膜による膜ろ過法が普及している。この膜ろ過法の基本原理は、使用するウイルス除去膜の孔径によって、目的タンパク質はウイルス除去膜を通過するが、ウイルスは通過できない条件を設定することによって達成される。
　特許文献１には、Ｂ１９の除去について、アミノ酸溶液をｐＨ４～８に調整することによりＢ１９を凝集させ、膜にＢ１９を捕捉させる手法が開示されている。
　また、特許文献２には、タンパク質溶液をｐＨ６未満かつ電気伝導度７ｍＳ／ｃｍ以下に調整して保持することによりＢ１９を凝集させ、次いで単分散状態のウイルス径よりも大きい膜孔径を有する親水性膜に該タンパク質溶液を透過させることを特徴とする、タンパク質溶液中のウイルスを除去する方法が開示されている。
　ブタサーコウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ　Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ；以下、「ＰＣＶ」という場合がある。）は現在知られている最も小さなウイルスであり、その粒子径は１６～２０．７ｎｍである。ＰＣＶは、サーコウイルス科に属し、例えばＰＣＶ１、ＰＣＶ２等に分類される。ＰＣＶはバイオ医薬品の製造工程に混入するリスクの高いウイルスの一つであり、２０１０年に混入事例が報告されている。ＰＣＶは、低ｐＨ処理、加熱処理にも耐性であり、非特許文献１における検討によれば、ＰＣＶを単分散させた溶液中でのウイルス除去膜の除去率は、Ｐｌａｎｏｖａ２０Ｎで０．１－０．７ｌｏｇ、Ｐｌａｎｏｖａ１５Ｎで１．３－１．８ｌｏｇと低いウイルス除去性能しか得られず、多くのバイオ医薬品の製造工程で導入されているウイルス除去膜では除去できない。
　一方、非特許文献１には、ＰＣＶはイオン交換体処理では吸着除去できることが開示されているものの、これまでに、より効果的にＰＣＶを除去する方法の検討が十分にされているとはいえない。
特開２００４－３３９０７９号公報 特開２００６－１５１８４０号公報
Ｙａｎ　Ｂ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｏｒｃｉｎｅ　Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ　（ＰＣＶ）　ｒｅｍｏｖａｌ　ｂｙ　Ｑ　ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ｆａｓｔ　ｆｌｏｗ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｐｒｏｇ．　２０１３；　２９：１４６４－１４７１．
　本発明が解決しようとする課題は、ブタサーコウイルスが夾雑する溶液の新規な処理方法を提供することである。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法として、特定のｐＨに調整したブタサーコウイルスが夾雑する溶液を、特定のろ過膜で処理する、新規な処理方法を提供することができることを見出し、本発明を完成した。
　本発明は、以下のとおりである。
（１）
　ブタサーコウイルスが夾雑する溶液のｐＨを３.０～７.０に調整する工程、及び
　ｐＨを調製した溶液を、バクテリオファージ　ＰＰ７に対するＬＲＶが４以上であるろ過膜で処理する工程を含む、ブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
（２）
　前記ｐＨを調製した溶液が０．５０Ｍ以下のグリシンを含む、（１）に記載のブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
（３）
　０.０１０～０.４０Ｍのグリシンを含む、（２）に記載のブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
（４）
　０.２０～０.３５Ｍのグリシンを含む、（２）に記載のブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
（５）
　前記ブタサーコウイルスが夾雑する溶液が５．０ｗ／ｖ％以下のタンパク質を含む、（１）～（４）のいずれかに記載のブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
（６）
　前記ブタサーコウイルスが夾雑する溶液のタンパク質濃度が０.１０ｗ／ｖ％未満の場合、前記ブタサーコウイルスが夾雑する溶液のｐＨを３.０～６.０に調整する、（５）に記載のブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
（７）
　前記ブタサーコウイルスが夾雑する溶液のタンパク質濃度が０.１０～１.５ｗ／ｖ％の場合、前記ブタサーコウイルスが夾雑する溶液のｐＨを３.８～７.０に調整する、（５）に記載のブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
（８）
　前記タンパク質がＩｇＧである、（５）～（７）のいずれかに記載のブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
（９）
　前記ｐＨを調製した溶液を、５０～１００Ｌ／ｍ2で処理する、（１）～（８）のいずれかに記載のブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
（１０）
　ブタサーコウイルスに対するＬＲＶが２以上である、（１）～（９）のいずれかに記載のブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
（１１）
　被処理溶液のｐＨを３.０～７.０に調整する工程、及び
　ｐＨを調製した溶液を、バクテリオファージ　ＰＰ７に対するＬＲＶが４以上であるろ過膜で処理する工程を含む、溶液の処理方法。
　本発明によれば、ブタサーコウイルスが夾雑する溶液の新規な処理方法を提供することができる。
実施例１において、０．３０Ｍグリシンバッファーを用いて、ｐＨ３．０～８．０の条件下でのＰＣＶ除去能力の変化を確認した結果を示す図である。 実施例２において、０．１０～２．０Ｍグリシンバッファー（ｐＨ４．０）の条件下での、ＰＣＶ除去能力の変化を確認した結果を示す図である。 実施例３において、０．１０％ＩｇＧ及び０．１０Ｍグリシン条件下でのｐＨのＰＣＶ除去に及ぼす影響を確認した結果を示す図である。 実施例４において、０．１０％ＩｇＧ及びｐＨ６．０条件下でのグリシン濃度のＰＣＶ除去に及ぼす影響を確認した結果を示す図である。 実施例５において、０．３０Ｍグリシンバッファー（ｐＨ６．０）条件下でのＩｇＧ濃度のＰＣＶ除去に及ぼす影響を確認した結果を示す図である。 実施例６において、１．０％ＩｇＧ含有０．３０Ｍグリシン（ｐＨ６．０）条件下でのＰ－１５及びＰ－２０でのろ過後のＩｇＧ回収率を確認した結果を示す図である。
　以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」と言う。）について説明する。本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施できる。
　本実施形態の、ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）が夾雑する溶液の処理方法は、
　ブタサーコウイルスが夾雑する溶液のｐＨを３.０～７.０に調整する工程、及び
　ｐＨを調製した溶液を、バクテリオファージ　ＰＰ７に対するＬＲＶが４以上であるろ過膜で処理する工程を含む。
　本実施形態の処理方法に供される試料は、ＰＣＶが夾雑する溶液である。
　本明細書において「ＰＣＶが夾雑する溶液」は、ＰＣＶが溶液中に存在する溶液であってもよく、ＰＣＶの夾雑可能性がある溶液を含む。
　ＰＣＶの夾雑可能性がある溶液としては、ＰＣＶが実際に夾雑している必要はなく、溶液の作成過程において、ＰＣＶが夾雑する可能性がある溶液であってよい。ＰＣＶの夾雑可能性がある溶液としては、ＰＣＶが夾雑していることを妨げるものではない。
　ＰＣＶが夾雑する溶液としては、例えば、ＰＣＶの夾雑可能性があるタンパク質を含む溶液であってもよいし、ＰＣＶの夾雑可能性があり、タンパク質を含まない溶液であってもよく、ＰＣＶが夾雑し、タンパク質を含む溶液であってもよく、ＰＣＶが夾雑し、タンパク質を含まない溶液であってもよい。
　ＰＣＶが夾雑する溶液としては、例えば、ヒトや哺乳動物等の体内液体成分である体液等が挙げられ、体液の具体例としては、特に限定されるものではないが、血液（血清及び血漿）、唾液、汗、尿、鼻水、精液、血漿、リンパ液、酵素及び組織液等が挙げられる。
　ＰＣＶが夾雑する溶液としては、これらの体液等を原料として精製して得られた溶液であってもよく、体液等を希釈して得られる体液等を含有する溶液であってもよい。
　ＰＣＶが夾雑する溶液には、細胞培養後の培地、細胞培養後の培養上清等であってもよく、細胞としては遺伝子組換えの技術のために使用される細胞であってもよい。
　ＰＣＶが夾雑する溶液としては、これらの培地等を原料として精製して得られた溶液であってもよく、培地等を希釈して得られる培地等を含有する溶液であってもよい。
　ＰＣＶが夾雑する溶液としては、細胞培養で作られるワクチン、抗体医薬、遺伝子組み換え製剤等であってもよい。また、その製造工程において生体組織由来の酵素を用いるような製剤等であってもよい。
　本明細書において、ＰＣＶが夾雑する溶液には、タンパク質を含んでいても含んでいなくてもよいが、５．０ｗ／ｖ％以下のタンパク質を含む、すなわち、０～５．０ｗ／ｖ％のタンパク質を含むことが好ましい。
　本実施形態において体液や培地等を原料として精製して得られた溶液には、タンパク質が含まれる。
　本実施形態において、ＰＣＶが夾雑する溶液に含有されるタンパク質としては、特に限定されないが、例えば、抗体、エリスロポイエチン、トロンボポイエチン、組織型プラスミノーゲンアクチベータ、プロウロキナーゼ、トロンボモジュリン、アンチトロンビンＩＩＩ、プロテインＣ、血液凝固因子ＶＩＩ、血液凝固因子ＶＩＩＩ、血液凝固因子ＩＸ、血液凝固因子Ｘ、血液凝固因子ＸＩ、血液凝固因子ＸＩＩ、プロトロンビン複合体、フィブリノゲン、アルブミン、性腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子、アクチビン、骨形成因子、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ等の幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン２、インターロイキン６、インターロイキン１０、インターロイキン１１、可溶性インターロイキン４受容体、腫瘍壊死因子α、Ｄｎａｓｅｌ、ガラクトシダーゼ、αグルコシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヘモグロビン、トランスフェリン等のタンパク質、及びこれらタンパク質の部分断片が挙げられる。
　本実施形態において、ＰＣＶが夾雑する溶液に含有されるタンパク質としては、上述のタンパク質又はそのタンパク質の部分断片に放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、又は異なるタンパク質又はそのタンパク質の部分断片等を化学的又は遺伝子工学的に結合させたタンパク質又はそのタンパク質の部分断片であってもよい。
　ＰＣＶが夾雑する溶液に含有されるタンパク質としては、免疫グロブリン等の抗体が好ましく、免疫グロブリンのうちでもＩｇＧが好適である。
　ＰＣＶが夾雑する溶液にタンパク質を含有する場合、ＰＣＶが夾雑する溶液の具体例としては、特に限定されるものではないが、抗体製剤の製造工程で得られる溶液が挙げられる。
　抗体の分離精製工程では、原料血漿のイオン濃度、アルコール濃度、反応温度及びタンパク濃度を適切に組み合わせることによって、原料血漿中に含まれているタンパク質の溶解度をコントロールし、特定のタンパクを沈殿させる。そして、沈殿させたタンパク質と上澄みを高速遠心分離器で分離した後、必要な沈殿物又は上澄みを採取する。そして、その得られた沈殿物又は上澄みに対し、前記条件とは異なる条件を適宜設定することで別のタンパク質を沈殿させる。以上の工程を繰り返して原料血漿から不純物を順次除去していくことで、高純度の抗体を含有する溶液が得られる。抗体の分離精製工程中に得られる溶液のいずれも、本実施形態におけるＰＣＶが夾雑する溶液として用いることができる。
　抗体としては、例えば、ヒト抗体、ヒト型キメラ抗体及びヒト型相補性決定領域移植抗体等のヒト化抗体、並びにこれらの抗体断片等が挙げられる。
　抗体は可変領域（Ｖ領域）と定常領域（Ｃ領域）より構成され、重鎖の可変領域をＶＨ、軽鎖の可変領域をＶＬ、重鎖の定常領域をＣＨ、軽鎖の定常領域をＣＬという。
　ヒト型キメラ抗体とは、ヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬとヒト抗体のＣＨ及びＣＬとからなる抗体をいう。ヒト型キメラ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを設計、構築し、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするｃＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒト免疫グロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
　ヒト以外の動物とは、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等をいう。また、ＩｇＧの共存によってＭＶＭ、ＰＰＶの凝集が阻害されることが知られている。
　抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ及びＣＤＲを含むペプチド等が挙げられる。
　Ｆａｂは、ＩｇＧ型抗体分子をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。Ｆａｂは、抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理することにより又は、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより、製造することができる。
　本実施形態において、ＰＣＶが夾雑する溶液のｐＨを３.０～７.０に調整する工程は、ＰＣＶが夾雑する溶液のｐＨを測定し、ｐＨを３.０～７.０に調整することにより行われる。
　ＰＣＶが夾雑する溶液のタンパク質濃度が０．１０ｗ／ｖ％未満の場合には、ＰＣＶが夾雑する溶液のｐＨをｐＨ３．０～６．０に調整するのが好ましい。
　ＰＣＶが夾雑する溶液のタンパク質濃度が０．１０～１．５ｗ／ｖ％の場合には、ＰＣＶが夾雑する溶液のｐＨを３．８～７．０に調整するのが好ましく、より好ましくはｐＨ５．５～６．５に調整する。
　ｐＨ調整は塩基、酸及び緩衝液を用いて行なうことができる。塩基としては、例えば、水酸化ナトリウムが挙げられ、酸としては、無機酸及び有機酸のいずれを用いてもよく、例えば、塩酸が挙げられ、緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液及びリン酸緩衝液等が挙げられる。
　ウイルス除去の観点から、ｐＨを調整して得られた溶液は、グリシンを含むことが好ましい。
　ｐＨを調整した溶液におけるグリシン濃度は０．５０Ｍ以下、すなわち、０～０．５０Ｍであることが好ましく、より好ましくは０．０１０～０．４０Ｍであり、さらに好ましくは０．２０～０．３５Ｍである。
　ＰＣＶが夾雑する溶液のタンパク質濃度が０．１０～１．５ｗ／ｖ％の場合には、ｐＨを調整した溶液におけるグリシン濃度を０．０１０～０．５０Ｍに調整するのが好ましく、より好ましくは０．０１０～０．３０Ｍに調整する。
　ＰＣＶが夾雑する溶液にタンパク質が含有される場合、ｐＨを調整した溶液におけるグリシン濃度やｐＨは、当該タンパク質の濃度によっても適宜調整される。
　本実施形態においては、ｐＨを調整することによって、目的タンパク質の性質及び収率に影響を与えることなく、ろ過によりＰＣＶを効果的に除去することができる。また、グリシン濃度を好適な範囲に調整することによって、より効果的にＰＣＶを除去することができる。
　これは、理論に束縛されるものではないが、試料中に夾雑するＰＣＶが凝集し、試料中に含有される目的タンパク質の分子よりも凝集したＰＣＶが大きくなることにより、効率的に除去されたためと考えられる。
　本実施形態において、ｐＨを調製した溶液を、バクテリオファージ　ＰＰ７に対するＬＲＶが４以上であるろ過膜で処理する工程は、バクテリオファージ　ＰＰ７に対するＬＲＶが４以上であるろ過膜に、ｐＨを調製した溶液を通液することにより行われる。
　本実施形態においては、バクテリオファージ　ＰＰ７に対するＬＲＶが４以上であるろ過膜で処理することで、ＰＣＶを効果的に除去することができる。
　バクテリオファージ　ＰＰ７に対するＬＲＶが４以上であるろ過膜とは、使用するろ過膜に対し、バクテリオファージ　ＰＰ７を含む溶液を５０Ｌ／ｍ2負荷した場合におけるＬＲＶが４以上となる膜である。バクテリオファージ　ＰＰ７を含む溶液としては、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ溶液（ＰＢＳバッファー、ｐＨ　７．４）にバクテリオファージ　ＰＰ７濃度を１０7ｐｆｕ／ｍＬとしたものが用いられる。
　使用するろ過膜の形状は、特に限定されるものではないが、例えば、平膜であってもよいし、中空糸膜であってもよい。平膜を用いる場合、一枚でろ過を行ってもよいし、複数枚重ねてろ過を行ってもよい。
　バクテリオファージ　ＰＰ７に対するＬＲＶが４以上であるろ過膜に、ｐＨを調製した溶液を通液してろ過することにより、ｐＨを調製した溶液は、バクテリオファージ　ＰＰ７に対するＬＲＶが４以上であるろ過膜で処理される。
　ろ過方法は、全ろ過で行ってもよいし、クロスフロー方式で行ってもよい。
　バクテリオファージ　ＰＰ７に対するＬＲＶが４以上であるろ過膜で処理する前に、平均孔径が２０ｎｍよりも大きい孔径の膜で予備的に処理してもよい。
　バクテリオファージ　ＰＰ７に対するＬＲＶが４以上であるろ過膜の具体例としては、セルロースからなるＰｌａｎｏｖａTM１５Ｎ（旭化成メディカル（Ａｓａｈｉ　Ｋａｓｅｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ）社製）及びＰｌａｎｏｖａTM２０Ｎ（旭化成メディカル（Ａｓａｈｉ　Ｋａｓｅｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ）社製）、親水化ＰＶＤＦからなるＰｌａｎｏｖａTMＢｉｏＥＸ（旭化成メディカル（Ａｓａｈｉ　Ｋａｓｅｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ）社製）及びＰｅｇａｓｕｓ　ＳＶ４（Ｐａｌｌ社製）、並びに親水化ＰＥＳからなるＶｉｒｏｓａｒｔ　ＣＰＶ　（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）及びＶｉｒｅｓｏｌｖｅ　Ｐｒｏ　（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）等が挙げられる。
　バクテリオファージ　ＰＰ７に対するＬＲＶが４以上であるろ過膜として、セルロースからなるウイルス除去膜の場合、ウイルス除去膜が有する空孔の平均孔径によって好ましい膜を規定することもできる。ウイルス除去膜が有する空孔の平均孔径は、例えば、１３ｎｍ以上２１ｎｍ以下である。
　空孔の平均孔径は、国際公開第２０１５／１５６４０１号に記載の方法を参考にして、以下の計算式により算出することができる。
　平均孔径（ｎｍ）＝２×１０３×√（Ｖ・ｄ・μ／Ｐ・Ａ・Ｐｒ）
　ここで、Ｖは透水量（ｍＬ／分）、ｄは膜厚（μｍ）、μは水の粘度（ｃｐ）、Ｐは圧力差（ｍｍＨｇ）、Ａは膜面積（ｃｍ2）、Ｐｒは空孔率（％）を示す。
　透水量は、１０本の糸を束ね、１６ｃｍの有効長さになるようにモジュールを作成し、得られたモジュールの一端を閉とし、他端に２００ｍｍＨｇの圧力をかけ、３７℃で水を通した。このとき膜を通して出てくる水の量を透水量として測定した。
　膜面積は、乾燥状態での内径を測定して算出した。また、膜厚は、乾燥状態における膜厚を意味する。
　空孔率は、以下の計算式により算出する。
　空孔率（％）＝（１－ρａ／ρｐ）×１００
　中空糸の見掛け密度ρａは、以下の計算式により算出し、ρｐはセルロースの密度（ｇ／ｃｍ3）を意味する。
　中空糸の見掛け密度（ｇ／ｃｍ3）＝Ｗｄ／Ｖｗ＝４Ｗｄ／πｌ（Ｄｏ2－Ｄｉ2）
　ここで、Ｗｄは中空糸の絶乾重量（ｇ）、Ｖｗは中空糸の見かけ体積（ｃｍ3）を意味し、ｌは中空糸の長さ（ｃｍ）、Ｄｏは中空糸の外径（ｃｍ）、Ｄｉは中空糸の内径（ｃｍ）を意味する。
　本実施形態において、ＬＲＶとは、ウイルス除去係数（Ｌｏｇ　Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　Ｖａｌｕｅ）を意味し、対数で表されるウイルスの減少度であって、除去係数ともいう。
ＬＲＶは、以下の計算式により求められる。
ＬＲＶ＝Ｌｏｇ［（Ｖ1×Ｔ1））］／［（Ｖ2×Ｔ2））］
Ｖ1：ウイルス除去処理工程前の試料の容量
Ｔ1：ウイルス除去処理工程前のウイルス量（力価）
Ｖ2：ウイルス除去処理工程後の試料の容量
Ｔ2：ウイルス除去処理工程後のウイルス量（力価）
　バクテリオファージ　ＰＰ７のウイルス量は、特に限定されるものではないが、プラークアッセイ法（Ｐｌａｑｕｅ　ａｓｓａｙ　ｍｅｔｈｏｄ）で測定することができる。
　プラークアッセイ法は、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２００８；Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　Ｖｏｌｕｍｅ　６２　Ｎｏ．Ｓ－４に記載の方法に従い、実施することができる。
　バクテリオファージ　ＰＰ７を含む溶液サンプルを段階希釈し、それぞれのサンプルを緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）と混合した後、軟寒天を加える。混合溶液を寒天プレート上に注ぎ、固化させた後に３７℃で一日培養する。翌日肉眼でプラーク数を計測し、下記式により元の溶液に含まれていたファージ濃度ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔ）／ｍＬを算出する。
（プラーク数×希釈倍率）ｐｆｕ／サンプル量（ｍＬ）　ｐｆｕ／ｍＬ
　本実施形態においては、本実施形態に処理方法によるＰＣＶ除去の指標として、ＬＲＶにより確認することができる。
　ＰＣＶに対するＬＲＶは、上記式において、ＰＣＶのウイルス量測定することにより求めることができる。
　ＰＣＶのウイルス量は、特に限定されるものではないが、定量ＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ：　Ｑ－ＰＣＲ）で測定することができる。
　定量ＰＣＲ法は、Ｙａｎｇらの方法（非特許文献１に記載）に従い、実施することができる。この場合、プライマーとしてＰＣＶ－１　ＴＭ Ｆｗｄ．： ＡＧＡＡＡＧＧＣＧＧＧＡＡＴＴＧＡＡＧＡＴＡＣ（配列番号１）、ＰＣＶ－１　ＴＭ Ｒｅｖ．：ＣＡＣＡＣＣＣＣＧＣＣＴＴＣＡＧＡＡ（配列番号２）、プローブとしてＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ：６ＦＡＭ－ＣＧＴＣＴＴＴＣＧＧＣＧＣＣＡＴＣＴＧＴＡＡＣＧ－ＴＡＭＲＡ（配列番号３）を使用する。
　本実施形態においては、ＰＣＶのＬＲＶを測定した場合に、２以上である場合に効果的にＰＣＶが除去されたと判断することができる。
　本実施形態において、バクテリオファージ　ＰＰ７に対するＬＲＶが４以上であるろ過膜に供されるｐＨを調整した溶液は、ウイルス除去膜面積当たりのろ過液量として、５０～１００Ｌ／ｍ2で処理することが好適である。
　５０～１００Ｌ／ｍ2で処理することにより、ウイルス除去膜にタンパク質等の目詰まりを生じることなく、効果的に試料をろ過することができる。
　ウイルス除去膜面積は、ろ過面（一次側の表面）の面積として計算する。平膜の場合は、２辺の長さから算出した面積であり、中空糸膜の場合は、中空糸の内側（内表面）の面積となる。
　ろ過液量は、一定のろ過圧力条件下でのろ過において、ろ過時間により調節することができる。
　本実施形態のＰＣＶが夾雑する溶液の処理方法により、ＰＣＶを含む溶液を所定のｐＨに溶液調製を行うことで、一般的なウイルス除去膜の孔径よりも小さいＰＣＶを凝集させ、ウイルス除去膜で除去することができる。また、本実施形態のＰＣＶが夾雑する溶液の処理方法により、ＰＣＶの夾雑可能性がある溶液（夾雑していない場合を含む）に対して安全性を担保できるという効果を得ることができる。
　したがって、本実施形態においては、被処理溶液のｐＨを３.０～７.０に調整する工程、及びｐＨを調製した溶液を、バクテリオファージ　ＰＰ７に対するＬＲＶが４以上であるろ過膜で処理する工程を含む、溶液の処理方法をも提供する。
　本実施形態のＰＣＶが夾雑する溶液がタンパク質を含有する場合には、ウイルス除去膜で処理することにより、安全性とタンパク質透過性を同時に満足させることができる。また、本実施形態のＰＣＶが夾雑する溶液がタンパク質を含有しない場合には、ウイルス除去膜で処理することにより、ＰＣＶを除去することができる。
　すなわち、本実施形態の処理方法により、ＰＣＶを含む溶液から、ＬＲＶ４以上の膜を用いてろ過することにより、溶液からＰＣＶを除去することができ、また、ＰＣＶの夾雑可能性のある溶液に対し、ろ過することにより、安全性を担保できる。加えて、本実施形態の処理方法により、タンパク質含有の有無によらず、本方法によりＰＣＶを除去することができ、また、タンパク質含有液であれば、高い透過性・安全性を同時に満足することができる。
　以下の実施例に示すとおり、ある態様においては、本実施形態の処理方法によれば、目的タンパク質の回収率は８０％以上であった。すなわち、本実施形態の処理方法により、ＰＣＶが除去された安全性の高い製品を提供することができる。
　本発明の理解を助けるために、以下に実施例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明は本実施例に限定されるものでないことはいうまでもない。
（実施例１）グリシンバッファー条件下での至適ｐＨの検討
　０.３０Ｍグリシンバッファーを用いて、ｐＨ３．０～８．０の条件下でのＰＣＶ除去能力の変化をＬＲＶにより確認した。
１．材料・使用
・ウイルス株（ＰＣＶ）：ＰＣＶのウイルスソースは豚腎臓由来株化細胞（ＰＫ（１５）細胞: ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ－３３）の培養液を用いた。ＰＫ（１５）細胞、１.０ｘ１０5　ｃｅｌｌｓ／ｍＬを５％ウシ胎児血清含有ダルベッコ改変イーグル培地に播種・培養し（３７℃、５％ＣＯ2）、培養４日目の培養上清をウイルスソースとして用いた。ウイルスソースの保存は－８０℃で行った。ウイルスソースのゲノム濃度は１０．１７Ｌｏｇ ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬであった。
・グリシンバッファー：１．２Ｌの純水に対し、２７．０ｇのグリシン（購入メーカー：ＷＡＫＯ）を加え、スターラーで撹拌し、溶解させた。グリシンが完全に溶解した後、スターラーで撹拌しながら０．５０Ｍの塩酸または水酸化ナトリウム水溶液を加えて目的のｐＨに調整した。
・使用ろ過膜：旭化成メディカル株式会社製のＰｌａｎｏｖａ１５Ｎ（以下、「Ｐ－１５」と称する）、Ｐｌａｎｏｖａ２０Ｎ（以下、「Ｐ－２０」と称する）、Ｐｌａｎｏｖａ３５Ｎ（以下、「Ｐ－３５」と称する）を用いた。膜面積は０.００１ｍ2であり、ＰＰ７に対するＬＲＶは、Ｐ－１５及びＰ－２０は＞６．５であり、Ｐ－３５は０であった。
・ＰＣＲ用試薬：ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｐｒｏｂｅ ＰＣＲ Ｋｉｔ、入手先ＱＩＡＧＥＮ
・ＩｇＧ：献血ヴェノグロブリンＩＨ（日本血液製剤機構）、濃度１０％、生物種ヒト
２．方法
　ｐＨ３．０～８．０に調整した０．３０Ｍグリシンバッファー０．１Ｌに、それぞれＰＣＶを１ｍＬ加えた（１／１００量に相当）。これらの試料を使用ろ過膜に対し、ろ過圧０．０８ＭＰａ、処理溶液量０．０３Ｌの条件で、デッドエンドろ過を行った。
　ろ過膜は、実施例としてＰ－１５、Ｐ－２０、比較例としてＰ－３５を用いた。ろ過前後のＰＣＶゲノム量をＱ－ＰＣＲ法により測定し、ＬＲＶを算出した。
　結果を図１及び表１に示す。
３．ＰＣＶ除去能力は、以下の式で算出される除去係数（ＬＲＶ）に基づいて判断した。
ＬＲＶ＝Ｌｏｇ　［（Ｖ1×Ｔ1））］／［（Ｖ2×Ｔ2））］
Ｖ1：ウイルス除去処理工程前の試料のＰＣＶゲノム容量
Ｔ1：ウイルス除去処理工程前のＰＣＶゲノム量
Ｖ2：ウイルス除去処理工程後の試料のＰＣＶゲノム容量
Ｔ2：ウイルス除去処理工程後のＰＣＶゲノム量
４．結果
　上記の濃度の、グリシンバッファー存在下においてＰＣＶは、ｐＨ依存的にウイルス除去膜で除去されることが確認された。ｐＨ４．０におけるＰ－１５及びＰ－２０ＬＲＶは≧５．０であった（表１・図１）。ｐＨ４．０におけるＰ－３５のＬＲＶは３．８であった。なお、図１に示す矢印の箇所は、検出限界以下にウイルスが減少したことを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（実施例２）至適グリシン濃度の検討
　本実施例では、０．１０～２．０Ｍグリシンバッファー（ｐＨ４．０）の条件下でのＰＣＶ除去能力の変化を確認した。グリシンバッファーのｐＨを４に固定し、グリシン濃度を０．１～２．０Ｍ条件とした他は、実施例１と同様に各試料を調製した。各試料について実施例１と同手法によりろ過を行い、ＬＲＶを算出した。結果を図２及び表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　Ｐ－１５、Ｐ－２０のいずれを用いた場合でも、グリシン濃度０．１０Ｍ、０．３０ＭにおけるＬＲＶはそれぞれ≧４．５、≧５．０であった。グリシン濃度が０．５０Ｍの場合、ＬＲＶはそれぞれ４．２、３．９であった。Ｐ－３５を用いた場合には、グリシン濃度０．１０Ｍ、０．３０ＭにおけるＬＲＶはそれぞれ４．５、３．８であった（表２）。なお、図２に示す矢印の箇所は、検出限界以下にウイルスが減少したことを示す。
　０．１０Ｍグリシンバッファー（ｐＨ４．０）の条件下ではＩｇＧ濃度が低い条件でウイルス除去能力が高かった。
（実施例３）０．１０％ＩｇＧ及び０．１０Ｍグリシン条件下での至適ｐＨの検討
　本実施例では、０．１０％ＩｇＧ及び０．１０Ｍグリシン条件下でのｐＨのＰＣＶ除去に及ぼす影響を確認した。０．１０Ｍグリシンバッファー（ｐＨ３．５～６．０）に０．１０％ＩｇＧを添加した他は、実施例１と同様に各試料を調製した。Ｐ－１５を用いて実施例１と同条件にて各試料のろ過を行い、ＬＲＶを算出した。結果を図３及び表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（実施例４）０．１０％ＩｇＧ及びｐＨ６．０条件下での至適グリシン濃度の検討
　本実施例では、０．１０％ＩｇＧ及びｐＨ６．０条件下でのグリシン濃度のＰＣＶ除去に及ぼす影響を確認した。０．１０～０．５０Ｍのグリシンバッファー（ｐＨ６．０）に０．１０％ＩｇＧを添加した他は、実施例１と同様に各試料を調製した。Ｐ－１５及びＰ－２０を用いて実施例１と同条件にて各試料のろ過を行い、ＬＲＶを算出した。結果を図４及び表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（実施例５）０．３０Ｍグリシン及びｐＨ６．０条件下でのタンパク質濃度の検討
　本実施例では、０．３０Ｍグリシンバッファー（ｐＨ６）条件下でのＩｇＧ濃度のＰＣＶ除去に及ぼす影響を確認した。０．３０Ｍグリシンバッファー（ｐＨ６）に０．１０～５．０％ＩｇＧを添加した他は、実施例１と同様に各試料を調製した。ＩｇＧ濃度１．０％の条件では、Ｐ－１５とＰ－２０をそれぞれ２本ずつ用い、それ以外のＩｇＧ濃度ではＰ－２０を用いて、実施例１と同条件にて各試料のろ過を行い、ＬＲＶを算出した。結果を図５及び表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（実施例６）１％ＩｇＧ含有０．３０Ｍグリシン（ｐＨ６．０）条件下でのろ過によるタンパク質回収率
　本実施例では、１％ＩｇＧ含有０．３０Ｍグリシン（ｐＨ６．０）条件下でのＰ－１５及びＰ－２０でのろ過後のＩｇＧ回収率を確認した。ろ過後のＩｇＧの回収率は吸光光度計により測定した（Ａ２８０ｎｍ）。Ｐ－１５及びＰ－２０に対し１５０ｍＬ及び５３ｍＬの試料液量を負荷したとき、ろ過後の回収液量は、１４７．６ｍＬ及び５０．７ｍＬであった。回収率（％）は、それぞれ負荷したサンプルのＩｇＧ量を１００％としたときのろ過後サンプルのＩｇＧ量を示した。Ｐ－２０では９８％、Ｐ－１５では９４％の回収率であった（図６）。
　本出願は、２０１６年８月９日出願の日本特許出願（特願２０１６－１５６５０６号）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
　本発明の方法は、特に、血漿分画製剤やバイオ医薬品の製造において有用である。
配列番号１は、プライマー（ＰＣＶ－１　ＴＭ Ｆｗｄ．）の塩基配列を示す。
配列番号２は、プライマー（ＰＣＶ－１　ＴＭ Ｒｅｖ．）の塩基配列を示す。
配列番号３は、プローブ（ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ）の塩基配列を示す。

Claims (11)

  1. 　ブタサーコウイルスが夾雑する溶液のｐＨを３.０～７.０に調整する工程、及び
    　ｐＨを調製した溶液を、バクテリオファージ　ＰＰ７に対するＬＲＶが４以上であるろ過膜で処理する工程を含む、ブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
  2. 　前記ｐＨを調製した溶液が０．５０Ｍ以下のグリシンを含む、請求項１に記載のブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
  3. 　０.０１０～０.４０Ｍのグリシンを含む、請求項２に記載のブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
  4. 　０.２０～０.３５Ｍのグリシンを含む、請求項２に記載のブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
  5. 　前記ブタサーコウイルスが夾雑する溶液が５．０ｗ／ｖ％以下のタンパク質を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
  6. 　前記ブタサーコウイルスが夾雑する溶液のタンパク質濃度が０.１０ｗ／ｖ％未満の場合、前記ブタサーコウイルスが夾雑する溶液のｐＨを３.０～６.０に調整する、請求項５に記載のブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
  7. 　前記ブタサーコウイルスが夾雑する溶液のタンパク質濃度が０.１０～１.５ｗ／ｖ％の場合、前記ブタサーコウイルスが夾雑する溶液のｐＨを３.８～７.０に調整する、請求項５に記載のブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
  8. 　前記タンパク質がＩｇＧである、請求項５～７のいずれか一項に記載のブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
  9. 　前記ｐＨを調製した溶液を、５０～１００Ｌ／ｍ2で処理する、請求項１～８のいずれか一項に記載のブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
  10. 　ブタサーコウイルスに対するＬＲＶが２以上である、請求項１～９のいずれか一項に記載のブタサーコウイルスが夾雑する溶液の処理方法。
  11. 　被処理溶液のｐＨを３.０～７.０に調整する工程、及び
    　ｐＨを調製した溶液を、バクテリオファージ　ＰＰ７に対するＬＲＶが４以上であるろ過膜で処理する工程を含む、溶液の処理方法。
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