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WO2018008729A1 - 虚血性疾患の治療剤 - Google Patents

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WO2018008729A1
WO2018008729A1 PCT/JP2017/024857 JP2017024857W WO2018008729A1 WO 2018008729 A1 WO2018008729 A1 WO 2018008729A1 JP 2017024857 W JP2017024857 W JP 2017024857W WO 2018008729 A1 WO2018008729 A1 WO 2018008729A1
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WO
WIPO (PCT)
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hemoglobin
therapeutic agent
albumin
reperfusion
ischemic
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2017/024857
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English (en)
French (fr)
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小松　晃之
亮佑 船木
武雄 鐙谷
正幸 月花
清博 寳金
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Hokkaido University NUC
Chuo University
Original Assignee
Hokkaido University NUC
Chuo University
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Publication date
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    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent for ischemic diseases.
  • the death rate due to ischemic disease is high, and in particular, stroke is the fourth leading cause of death in Japan. 60% of the cause of death is cerebral infarction. In Japan, the number of cerebral infarcts has exceeded 500,000 people annually since 2010.
  • the first step in cerebral infarction treatment is to eliminate vascular occlusion.
  • the vascular occlusion is resolved by intravenous therapy with tissue plasminogen activator (tPA) or removal treatment of intravascular thrombus.
  • tissue plasminogen activator tPA
  • the time limit from onset to treatment is 4.5 hours for intravenous tPA therapy and up to 8 hours for intravascular thrombectomy. Rescue of the brain tissue becomes more difficult as the decrease in cerebral blood flow is more significant and the longer it takes to resume blood flow.
  • ischemia-reperfusion I / R
  • ischemia-reperfusion an inflammatory reaction or the like is caused in a microvessel in the reperfusion region, a blood vessel wall is broken, and cerebral edema or hemorrhagic infarction may be worsened. Therefore, treatment of cerebral infarction requires not only reopening of blood flow but also handling of ischemia / reperfusion injury.
  • Non-Patent Document 2 As one of the mechanisms causing ischemia / reperfusion injury, inflammatory reaction by leukocytes is considered (see Non-Patent Document 2).
  • ICM-1 intercellular adhesion molecule-1
  • MMP-9 matrix metalloproteinase-9
  • Non-Patent Document 4 ischemia-reperfusion injury can be reduced when the LEH solution is administered to the internal carotid artery after reopening of the occluded blood vessel.
  • intramolecular cross-linked hemoglobin obtained by intramolecular cross-linking of human hemoglobin for example, see Patent Document 3
  • hemoglobin polymer obtained by binding human hemoglobin with a cross-linking agent for example, see Patent Document 4
  • bovine hemoglobin bound by a cross-linking agent Hemoglobin polymer see, for example, Patent Document 5
  • PEG-modified hemoglobin in which poly (ethylene glycol) (PEG), which is a water-soluble polymer, is bound to the molecular surface of human hemoglobin for example, see Patent Document 6
  • the inventors of the present invention have synthesized a core-shell type hemoglobin-albumin complex in which albumin is bound to hemoglobin, and clarified that this is a substitute for red blood cells (see Patent Document 7).
  • Albumin is the most abundant protein in plasma and plays a role in transporting and storing exogenous and endogenous substances in addition to maintaining colloid osmotic pressure.
  • the hemoglobin-albumin complex with the structure in which hemoglobin, an oxygen transport protein is wrapped in albumin is strongly negatively charged on the molecular surface, so that leakage to the outside of the blood vessel is reduced and the residence time in the blood is increased. Yes.
  • the hemoglobin-albumin complex since the hemoglobin-albumin complex has high biocompatibility, it functions as a safe red blood cell substitute (see Non-Patent Document 5).
  • An object of the present invention is to provide a therapeutic agent for ischemic disease, which exhibits a tissue protective effect against tissue damage associated with ischemia.
  • the ischemic disease is selected from the group of ischemic cerebrovascular disease, ischemic heart disease, ischemic lung disease, ischemic nephropathy, ischemic hepatitis, and limb ischemic disease. It is preferable that it is at least one selected.
  • the therapeutic agent for ischemic disease of the present invention is preferably administered to deliver oxygen to a tissue that cannot deliver oxygen by erythrocytes.
  • the therapeutic agent for ischemic disease of the present invention is preferably used without being used in combination with a treatment for eliminating vascular occlusion or vascular stenosis.
  • the therapeutic agent for ischemic disease of the present invention is preferably used in combination with a treatment for eliminating vascular occlusion or vascular stenosis.
  • the therapeutic agent for ischemic disease of the present invention is preferably administered into a blood vessel during recurrent treatment or after ischemia-reperfusion and used to reduce ischemia-reperfusion injury.
  • the cerebral infarction volume and cerebral edema volume are as described above. It is preferable that the cerebral infarction volume and / or cerebral edema volume of an individual administered with the therapeutic agent is significantly smaller than the cerebral infarction volume and / or cerebral edema volume of an individual who has undergone normal reperfusion.
  • the therapeutic agent for ischemic disease comprises an individual that has undergone normal reperfusion with respect to the abundance of 4-HNE and the expression level of matrix metalloproteinase-9 at the site of cerebral infarction, and the therapeutic agent described above together with reperfusion.
  • the abundance of 4-HNE and / or the expression level of matrix metalloproteinase-9 in the individual administered with the therapeutic agent described above was found to be higher than that in the normal reperfused individual. And / or expression level of matrix metalloprotease-9.
  • the therapeutic agent for ischemic disease of the present invention is the above-mentioned when comparing an individual who has undergone normal reperfusion with an individual who has received the therapeutic agent described above together with reperfusion for neuropathy after cerebral infarction. It is preferred that the neuropathy of the individual administered the therapeutic agent is significantly improved over the neuropathy of the individual who has undergone normal reperfusion.
  • the dose per administration to an individual is preferably 100 to 1000 mg per kg of the body weight of the individual as a hemoglobin component.
  • the average particle size of the hemoglobin-albumin complex is preferably 30 nm or less.
  • the hemoglobin-albumin complex is such that the binding site of the hemoglobin with the cross-linking agent is lysine, and the binding site of the albumin with the cross-linking agent is cysteine 34. preferable.
  • the bond between the hemoglobin and the cross-linking agent is an amide bond
  • the bond between the albumin and the cross-linking agent is either a sulfide bond or a disulfide bond.
  • the number of albumins in the hemoglobin-albumin complex is preferably 1 to 7.
  • the hemoglobin is selected from the group consisting of human hemoglobin, bovine hemoglobin, porcine hemoglobin, horse hemoglobin, dog hemoglobin, cat hemoglobin, rabbit hemoglobin, recombinant human hemoglobin, and intramolecular cross-linked hemoglobin. It is preferable that it is at least one selected.
  • the albumin is human serum albumin, bovine serum albumin, porcine serum albumin, horse serum albumin, dog serum albumin, cat serum albumin, rabbit serum albumin, recombinant human serum albumin, set It is preferably at least one selected from the group consisting of recombinant bovine serum albumin, recombinant canine serum albumin, and recombinant feline serum albumin.
  • the crosslinking agent is at least one selected from the group consisting of compounds represented by the following general formulas (1) to (3) and chemical formula (1): Is preferred.
  • R 1 represents either a hydrogen atom or SO 3 ⁇ Na +
  • n represents an integer of 1 to 10.
  • R 2 represents either a hydrogen atom or SO 3 - Na +
  • n represents an integer of 1 to 10.
  • the crosslinking agent is preferably a compound represented by the following general formula (4).
  • R 3 represents any one of a hydrogen atom and SO 3 ⁇ Na +
  • R 4 is represented by the following general formulas (5) to (6) and the following chemical formulas (2) to (4). Represents either.
  • n represents an integer of 1 to 10.
  • n represents an integer of 2, 4, 6, 8, 10 or 12.
  • the method of the present invention is a method for treating an ischemic disease by administering to a patient a hemoglobin-albumin complex formed by binding albumin as a shell to hemoglobin as a core via a crosslinking agent.
  • the hemoglobin-albumin complex of the present invention is a hemoglobin-albumin complex formed by binding albumin as a shell to hemoglobin as a core via a cross-linking agent, and is used as a therapeutic agent for ischemic diseases. To do.
  • the use of the present invention is the use of a hemoglobin-albumin complex formed by binding albumin as a shell to hemoglobin as a core via a crosslinking agent for the production of a therapeutic agent for ischemic disease.
  • ischemic diseases that exhibits a tissue protective effect against tissue damage associated with ischemia.
  • FIG. 1 is a diagram showing an embodiment of a hemoglobin-albumin complex contained in the therapeutic agent of the present invention.
  • FIG. 2 is a bar graph showing the degree of neuropathy in rats 24 hours after reperfusion. The vertical axis represents the degree of neuropathy.
  • FIG. 3A is a photograph of a TTC-stained brain section of a rat 24 hours after reperfusion.
  • FIG. 3B is a bar graph showing the cerebral infarct volume (%) determined from the continuous section cerebral infarct area of a TTC-stained brain section of a rat 24 hours after reperfusion.
  • FIG. 1 is a diagram showing an embodiment of a hemoglobin-albumin complex contained in the therapeutic agent of the present invention.
  • FIG. 2 is a bar graph showing the degree of neuropathy in rats 24 hours after reperfusion. The vertical axis represents the degree of neuropathy.
  • FIG. 3A is a photograph of a TTC-stained brain section of a rat 24 hours after reperfusion.
  • FIG. 3C is a bar graph showing the brain edema volume (%) determined from the continuous section brain edema area of TTC-stained brain sections of rats 24 hours after reperfusion.
  • FIG. 4A is a photograph of the amount of 4-HNE present and ⁇ -actin expressed by Western blotting using rat brain 24 hours after reperfusion as a sample.
  • FIG. 4B is a bar graph showing the ratio of the amount of 4-HNE present to the amount of ⁇ -actin expressed.
  • FIG. 5A is a photograph of the expression level of MMP-9 and ⁇ -actin measured by Western blotting using a rat brain 24 hours after reperfusion as a sample.
  • FIG. 5B is a bar graph showing the ratio of the expression level of MMP-9 to the expression level of ⁇ -actin.
  • FIG. 6 is a photograph in which the reperfusion region of the rat brain in the reperfusion hyperacute phase was immunostained with an anti-human-albumin antibody or an anti-rat erythrocyte antibody.
  • FIG. 7 is a bar graph showing the number of antibody-positive microvessels in the reperfusion region of the rat brain in the reperfusion hyperacute phase.
  • FIG. 8 is a diagram for explaining a method of measuring the microvascular diameter and the ratio of the difference between the perivascular space and the microvascular diameter with respect to the microvascular diameter.
  • FIG. 9 is a photograph of the microvasculars immunostained in the reperfusion region of the rat brain in the reperfusion hyperacute phase.
  • FIG. 10 is a line graph showing the ratio of the difference between the perivascular space and the microvascular diameter to the microvascular diameter and the microvascular diameter in the reperfusion region of the rat brain in the reperfusion hyperacute phase.
  • FIG. 11 is a line graph showing the cerebral blood flow and the cerebral tissue oxygen partial pressure in the reperfusion region of the rat brain in the reperfusion hyperacute phase.
  • the therapeutic agent for ischemic disease according to the present invention (hereinafter also simply referred to as “therapeutic agent”) is a hemoglobin-albumin complex formed by binding albumin as a shell to hemoglobin as a core via a crosslinking agent.
  • the active ingredient is a hemoglobin-albumin complex formed by binding albumin as a shell to hemoglobin as a core via a crosslinking agent.
  • the active ingredient is a hemoglobin-albumin complex as an active ingredient and, if necessary, other ingredients.
  • the ischemia is a state where blood supply is blocked or narrowed due to thrombosis, embolism, vascular stenosis, or the like, and blood supply to a body organ, tissue, or site is reduced. Being ischemic can lead to direct ischemic damage, i.e. tissue damage caused by reduced oxygen supply.
  • the ischemic disease is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • ischemic cerebrovascular disorder ischemic heart disease, ischemic lung disease, ischemic nephropathy, ischemic hepatitis, And limb ischemic disease.
  • the pathogenesis of the ischemic disease mainly includes (i) occlusion and / or stenosis of blood vessels, (ii) direct tissue damage caused thereby, and (iii) ischemia re-occurring after blood flow is restored by reperfusion. Perfusion injury. Due to such pathogenesis, dysfunction occurs in each organ in ischemic diseases.
  • the therapeutic agent of the present invention exhibits a tissue protective effect against direct tissue damage and ischemia / reperfusion injury among the above-mentioned etiologies, and particularly has a high tissue protection effect against ischemia / reperfusion injury. .
  • the ischemia reperfusion is to supply blood again to a tissue that has undergone ischemia due to decreased blood supply.
  • the reperfusion can be performed by eliminating vascular occlusion or stenosis.
  • the reperfusion can restore viable ischemic tissue and thereby suppress necrosis.
  • reperfusion itself can further damage ischemic tissue.
  • vascular occlusion or vascular stenosis can be resolved by procedures such as intravenous administration of tissue plasminogen activator (tPA), surgery for removing thrombus or infarction, and surgery such as stent introduction.
  • tPA tissue plasminogen activator
  • ischemia reperfusion injury refers to tissue damage that occurs when blood flow is reperfused into ischemic tissue after the occlusion and / or stenosis of the blood vessel is released.
  • ischemic reperfusion injury which is an ischemic disease, is often severe in the brain and heart, it is not limited to these organs and occurs in various organs such as lungs, kidneys, and extremities by the same mechanism.
  • cerebral infarction means that the blood vessels in the brain are occluded and / or constricted, causing ischemia, and the brain tissue becomes necrotic or close to necrosis.
  • the pathogenesis of the cerebral infarction is mainly due to (i) cerebrovascular occlusion and / or stenosis, (ii) direct tissue damage caused thereby, and (iii) ischemia re-occurrence after blood flow is restored by reperfusion. Perfusion injury. Due to such pathogenesis, brain dysfunction occurs in cerebral infarction.
  • the therapeutic agent of the present invention exhibits a tissue protective effect against direct tissue damage and ischemia / reperfusion injury among the above-mentioned etiologies, and particularly has a high tissue protection effect against ischemia / reperfusion injury. .
  • the individual to which the therapeutic agent is applied is not limited to humans, but may be mammals other than humans such as mice, rats, monkeys, rabbits, dogs, cats and horses.
  • the type of albumin is preferably selected according to the type of animal to be applied.
  • the therapeutic agent is preferably administered to deliver oxygen to a tissue that cannot deliver oxygen with red blood cells.
  • oxygen can be delivered from the occluded or constricted blood vessel to the distal tissue, and the etiology of the direct tissue damage can be reduced. .
  • the above therapeutic agent may be used without being used in combination with a treatment for eliminating vascular occlusion or vascular stenosis, or may be used in combination with a treatment for eliminating vascular occlusion or vascular stenosis.
  • a treatment for alleviating tissue damage by quickly administering the therapeutic agent to a patient with ischemic disease requiring first aid. And the point that treatment of alleviating tissue damage can be achieved by administering the therapeutic agent when it is difficult to eliminate vascular occlusion or stenosis. Note that it is difficult to eliminate vascular occlusion or stenosis, for example, when treatment to eliminate vascular occlusion or stenosis cannot be performed, or even if a drug that enhances fibrinolysis is administered, thrombus fibrinolysis may occur. There are cases where it is expected not to proceed sufficiently.
  • the therapeutic agent in combination with a treatment for eliminating vascular occlusion or stenosis, it effectively reduces not only vascular occlusion or vascular stenosis but also ischemia reperfusion injury that may occur due to vascular occlusion or stenosis. What can be done.
  • the hemoglobin-albumin complex contained in the above therapeutic agent is approximately 1/800 the size of the red blood cells, so that it can flow into a site where vascular stenosis occurs and red blood cells cannot flow. Therefore, even when the blood vessel is constricted, it can flow into the ischemic tissue and has an effect of reducing tissue damage. Therefore, even when the therapeutic agent is administered in combination with a treatment for eliminating vascular occlusion or vascular stenosis, tissue damage can be alleviated.
  • ischemia / reperfusion injury can be remarkably reduced as compared with the case of performing only the treatment for eliminating vascular occlusion or vascular stenosis. Therefore, when the therapeutic agent of the present invention is administered in combination with a treatment for eliminating vascular occlusion or stenosis, it is possible to effectively achieve reduction of ischemia / reperfusion injury as well as elimination of the occlusion or stenosis state.
  • the dose of the therapeutic agent per individual is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose.
  • the dose is such that the hemoglobin component is 100 to 1000 mg per kg of the body weight of the individual.
  • the dose is preferably 200 to 700 mg.
  • the dose is 100 mg or more as the hemoglobin component, ischemia / reperfusion injury is further reduced, and when it is 1000 mg or less, it is preferable in terms of cost efficiency. It is more advantageous for the same reason that the dose is within the more preferable range.
  • the therapeutic agent may be administered once a day, or may be divided into a plurality of times.
  • the dose is appropriately determined according to individual cases in consideration of symptoms, age, sex and the like.
  • the administration of the therapeutic agent may be continuous or intermittent.
  • the cerebral infarct volume of the individual who received the therapeutic agent of the present invention and / or the cerebral edema volume is significantly smaller than the cerebral infarction volume and / or cerebral edema volume of a normal reperfused individual.
  • the abundance of 4-HNE and the expression level of matrix metalloproteinase-9 at the site of cerebral infarction when comparing an individual who had undergone normal reperfusion with an individual who had received the therapeutic agent of the present invention together with reperfusion, is equal to the abundance of 4-HNE and / or matrix metalloprotease in an individual who has undergone normal reperfusion. Significantly lower than the expression level of -9.
  • the neurological disorder of the individual who has been administered the therapeutic agent of the present invention Is significantly improved over the neuropathy of normal reperfused individuals.
  • the normal reperfusion refers to the above-described vascular occlusion or stenosis such as infusion of tissue plasminogen activator (tPA), surgery for removing thrombus or infarction, and surgery such as stent introduction. It is a treatment.
  • Cerebral infarction volume and cerebral edema volume are morphological indicators for evaluating cerebral ischemic injury.
  • 4-HNE 4-hydroxy-2-nonenal
  • Matrix metalloprotease-9 MMP-9
  • Neuropathy after cerebral infarction is an index indicating the state of brain function of the individual after cerebral infarction.
  • the hemoglobin-albumin complex has hemoglobin as a core, and albumin as a shell bound to the hemoglobin via a cross-linking agent, and further has other sites as necessary.
  • a hemoglobin-albumin complex (star-shaped heterocluster) 100 contained in the therapeutic agent of the present invention has hemoglobin 10 as a core and three albumins 20 as shells.
  • hemoglobin 10 and albumin 20 are bonded via a cross-linking agent (not shown).
  • the above-mentioned hemoglobin-albumin complex has a molecular size of about 10 nm when 3 molecules of albumin are bound to 1 molecule of hemoglobin by a crosslinking agent. This size is about 1/800 of the diameter of human erythrocytes (about 8 ⁇ m), and about 1/20 of the above-mentioned LEH diameter (200 to 250 nm). Since the hemoglobin-albumin complex is extremely small, it can flow into regions where red blood cells and LEH cannot physically flow.
  • the above-mentioned hemoglobin-albumin complex has a molecular size of about 10 nm when 3 molecules of albumin are bound to 1 molecule of hemoglobin by a cross-linking agent. By further binding these components, the size of the hemoglobin-albumin complex can be increased.
  • the average particle size of the hemoglobin-albumin complex is preferably 30 nm or less, and more preferably 20 nm or less. If the average particle size of the hemoglobin-albumin complex is 30 nm or less, it is advantageous in that it can flow even with a slight gap, and if the average particle size is 20 nm or less, it is more advantageous for the same reason.
  • the isoelectric point of the hemoglobin-albumin complex is not particularly limited and can be appropriately adjusted according to the purpose, but is preferably 4.0 to 6.5, more preferably 4.2 to 5.5. . Since the isoelectric point of the hemoglobin-albumin complex is lower than 7, the molecular surface is negatively charged under physiological conditions. Therefore, it is difficult to leak out of the blood vessel due to electrostatic repulsion with the basement membrane (negatively charged) outside the vascular endothelial cells. Therefore, the hemoglobin-albumin complex has no side effects such as increased blood pressure associated with renal excretion or leakage from blood vessels, and functions as a safe red blood cell substitute.
  • hemoglobin-albumin complex since hemoglobin is an oxygen binding site, a stable oxygenated body can be formed, and oxygen can be efficiently supplied to the body tissue. Moreover, since hemoglobin and albumin are biological substances, they are highly biocompatible and considered to be well metabolized. Furthermore, the hemoglobin-albumin complex has a clear three-dimensional structure despite being relatively easy to prepare.
  • the hemoglobin-albumin complex has an effect of improving oxygen carrying ability when the oxygen binding dissociation curve becomes an S-shaped curve because hemoglobin is an oxygen binding site, and particularly when the oxygen partial pressure of peripheral cells is reduced. Is expected to have
  • albumin is configured to coat hemoglobin, the type of albumin tends to affect the immune response in the body of the administered individual. Therefore, the albumin of the hemoglobin-albumin complex is desirably derived from the same species as the animal to be administered. On the other hand, since hemoglobin is coated with albumin, the type of hemoglobin hardly affects the immune response in the body of the administered individual. Therefore, the animal from which hemoglobin is derived is not particularly limited from the viewpoint of immune response. In the hemoglobin-albumin complex, the animal from which albumin is derived may be different from the animal from which hemoglobin is derived.
  • Hemoglobin The molecule of hemoglobin is composed of four subunits, and each subunit has one protoheme. Oxygen binds to iron atoms in the protoheme. That is, four oxygen molecules are bonded to one hemoglobin molecule.
  • the hemoglobin is not particularly limited as long as it is a vertebrate, and can be appropriately selected according to the purpose. From the viewpoint of availability, for example, human hemoglobin, bovine hemoglobin, porcine hemoglobin, horse hemoglobin Dog hemoglobin, feline hemoglobin, rabbit hemoglobin, recombinant human hemoglobin, intramolecularly crosslinked hemoglobin, and the like. These may be used individually by 1 type and may use 2 or more types together.
  • the hemoglobin includes hemoglobin obtained by lysing red blood cells, recombinant hemoglobin obtained by gene recombination technology, intramolecular cross-linked hemoglobin obtained by intramolecular cross-linking of these hemoglobin subunits with a cross-linking agent, and the like. Can be mentioned. These may be used individually by 1 type and may use 2 or more types together. Among these, bovine hemoglobin, porcine hemoglobin, and equine hemoglobin, particularly bovine hemoglobin and porcine hemoglobin, are readily available as industrial animal hemoglobin from the viewpoint of supply amount, so that a large amount of hemoglobin-albumin complex can be produced. This is advantageous.
  • Albumin is a simple protein whose main role is to adjust colloid osmotic pressure in blood, but also functions as a transport protein for nutrient substances, drugs, etc., and has pH buffering action, esterase activity, and the like.
  • albumin is a plasma protein, it is particularly advantageous for application to living bodies, particularly for use as a substitute for red blood cells. Since the isoelectric point of albumin is lower than 7 and the physiological surface is strongly negatively charged under physiological conditions, the hemoglobin-albumin complex having the albumin as a shell is basal outside the vascular endothelial cell. It is difficult to leak out of the blood vessel due to electrostatic repulsion with the membrane (negatively charged).
  • the albumin is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose. From the viewpoint of availability, for example, human serum albumin, bovine serum albumin, porcine serum albumin, horse serum albumin, dog serum albumin Feline serum albumin, rabbit serum albumin, recombinant human serum albumin, recombinant bovine serum albumin, recombinant canine serum albumin, recombinant feline serum albumin, and the like. These may be used individually by 1 type and may use 2 or more types together.
  • the number of albumins bound to the above hemoglobin via a crosslinking agent is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose, but 1 to 7 is preferable. Eight or more are considered difficult to combine due to steric hindrance. When the number of albumin is 2 to 5, it is advantageous in that it can sufficiently surround hemoglobin. Further, the number of hemoglobins constituting the hemoglobin-albumin complex is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose, but one is preferable. The method for measuring the number of albumins is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose.
  • the cyanomethemoglobin method for example, Alfresa Pharma, Nescoat Hemokit N, No. 138016-14.
  • a method of calculating based on the protein concentration calculated by protein quantification using the 660 nm method for example, Pierce 660 nm Protein Assay Kit, Thermo Fisher Scientific
  • (3) a method of observing with an electron microscope It is done.
  • the method for isolating the hemoglobin-albumin complex having a predetermined number of albumins from a mixture of hemoglobin-albumin complexes having different numbers of albumin is not particularly limited and is appropriately selected according to the purpose. Examples thereof include isolation methods by column chromatography (eg, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography, etc.).
  • the cross-linking agent is not particularly limited as long as it is a bifunctional cross-linking agent capable of linking hemoglobin and albumin, and can be appropriately selected according to the purpose.
  • the cross-linking agent is not particularly limited as long as it is a bifunctional cross-linking agent capable of linking hemoglobin and albumin, and can be appropriately selected according to the purpose.
  • the following general formulas (1) to (4) ) And a compound represented by the chemical formula (1) may be used individually by 1 type and may use 2 or more types together.
  • ⁇ - (N-succinimidyl) - ⁇ -pyridyldithio crosslinking agent in the following general formula (1), R 1 is a hydrogen atom and n is 5
  • R 1 represents either a hydrogen atom or SO 3 ⁇ Na +
  • n represents an integer of 1 to 10.
  • R 2 represents either a hydrogen atom or SO 3 - Na +
  • n represents an integer of 1 to 10.
  • R 4 is represented by the following general formulas (5) to (6) and the following chemical formulas (2) to (4). Represents either.
  • n represents an integer of 1 to 10.
  • n represents an integer of 2, 4, 6, 8, 10 or 12.
  • the succinimidyl group in the crosslinking agent and the amino group (—NH 2 ) of lysine in hemoglobin form an amide bond (covalent bond).
  • Examples of the method for forming the amide bond include stirring the hemoglobin and the crosslinking agent at 4 to 30 ° C. for 0.2 to 8 hours.
  • the pyridyldithio group in the crosslinking agent and cysteine 34 (reduced cysteine) in the albumin molecule form a new disulfide bond (covalent bond) by an exchange reaction.
  • the disulfide bond has a characteristic that it is easily cleaved.
  • Examples of the method for forming the disulfide bond include stirring albumin and a crosslinking agent at 4 ° C. to 30 ° C.
  • the maleimide group in the crosslinking agent and cysteine 34 (reduced cysteine) in the albumin molecule form a sulfide bond (covalent bond).
  • Examples of the method for forming the sulfide bond include stirring albumin and a crosslinking agent at 4 ° C. to 30 ° C. for 1 hour to 72 hours. Since there is only one cysteine 34 (reduced cysteine) in the albumin molecule, the hemoglobin-albumin complex as the active ingredient of the therapeutic agent of the present invention has a star-shaped cluster structure (for example, the structure of FIG. 1), The molecular structure is clear.
  • ⁇ Form of therapeutic agent formulation >>
  • a form of the formulation of the said therapeutic agent According to the objective, it can select suitably, For example, a liquid form, the form of the freeze-dried formulation, etc. are mentioned. In the case of a lyophilized preparation, it can be used by dissolving or suspending in a sterile solvent such as sterile water before use.
  • the therapeutic agent is preferably sterilized by filtration with a filter, heating, blending of a bactericide, or irradiation with energy rays.
  • ⁇ Other ingredients are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • an aqueous or non-aqueous solution a pH buffer agent , Tonicity agents, preservatives, stabilizers, emulsifiers, dispersants, local anesthetics, and the like. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the concentration of the hemoglobin-albumin complex in the therapeutic agent is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the hemoglobin component is 30 to 70 mg / It is preferably mL, and more preferably 40 to 60 mg / mL.
  • PBS phosphate buffere
  • reaction solution was filtered with a DISMIC filter (DISMIC-25CS, pore size 0.2 ⁇ m), and then subjected to gel filtration chromatography (Sephadex G-25 Superfine, 5.0 cm ⁇ , eluent: PBS (pH 7.4)). Unreacted crosslinker was removed.
  • the obtained bovine hemoglobin-crosslinking agent conjugate (Hb-SMCC) in PBS (pH 7.4) solution was concentrated to 120 mL using a centrifugal ultrafilter (VIVA SPIN20, ultramolecular weight: 10 kDa), and 0.1 mM. It was.
  • Hb-HSA 3 bovine hemoglobin-human serum albumin complex
  • HSA human serum albumin
  • PBS PBS
  • 0.1 mM bovine hemoglobin-crosslinking agent conjugate
  • the Hb concentration was quantified by the cyanomethemoglobin method (Nescort hemokit N, Alfresa Pharma), and the protein concentration was quantified by the 660 nm method (Pierce 660 nm Protein Assay Kit, Thermo Fisher Scientific).
  • the HSA / Hb ratio was 3.0, and it was found to be a bovine hemoglobin-human serum albumin complex [(Hb-HSA 3 ) SMCC] in which an average of 3 HSAs were bound to Hb.
  • Ischemia reperfusion test An ischemia reperfusion test was performed using a transient middle cerebral artery occlusion (MCAO) model generally used as a model of cerebral infarction.
  • MCAO transient middle cerebral artery occlusion
  • An 8-9 week old rat (280-320 g male from Sparague-Dawley Rat (SD Rat)) was placed under isoflurane inhalation anesthesia, and a thread plug (4-0 nylon thread silicon-coated) was inserted from the internal carotid artery Then, the thread plug was fixed by ascending until the beginning of the middle cerebral artery was occluded, and an ischemic state was completed in the middle cerebral artery region.
  • a group in which the thread plug was removed without administering therapeutic agent A was used as a control group (Comparative Example 1, control group).
  • control group A group in which the thread plug was removed without administering therapeutic agent A was used as a control group.
  • control group A group in which the thread plug was removed without administering therapeutic agent A was used as a control group.
  • the degree of neuropathy was evaluated. Thereafter, the brain was euthanized and the brain was removed and used for pathological evaluation and molecular biological evaluation.
  • the pathological evaluation was performed by staining brain sections with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining, measuring continuous section cerebral infarction area and continuous section cerebral edema area, and cerebral infarction volume. (%) And brain edema volume (%) were calculated. It shows that the disorder
  • TTC-stained photographs of coronal slices of the brain were arranged in the coronal plane from front to back.
  • the vertical axes in FIGS. 3B and 3C indicate cerebral infarction volume (%) and cerebral edema volume (%), respectively.
  • the cerebral infarction volume 24 hours after reperfusion was 55.2 ⁇ 3.6% in the control group of Comparative Example 1, whereas the hemoglobin-albumin composite of Example 1
  • the body administration group was reduced to 20.2 ⁇ 3.1% (37% of the control group), and a statistically significant reduction effect was observed.
  • the brain edema volume was 26.4 ⁇ 2.8% in the control group, whereas the hemoglobin-albumin complex administration group was 14.1 ⁇ 1.75%, which was a statistically significant reduction.
  • the effect was recognized (FIG. 3).
  • Molecular biological evaluation was performed by quantifying the abundance of 4-HNE and the expression level of MMP-9 by Western blotting using brain tissue as a sample. The amount of ⁇ -actin in the sample was measured to determine the ratio of 4-HNE abundance / ⁇ -actin expression and MMP-9 expression / ⁇ -actin expression. Densitometry was used to quantify the abundance and expression level. The higher the amount of 4-HNE present, the more the tissue was affected by oxidative stress, and the higher the expression level of MMP-9, the greater the inflammatory state. The results are shown in FIGS. As shown in FIGS.
  • the pathological model of cerebral infarction which is a type of ischemic disease
  • ischemia-reperfusion injury is reduced and a tissue protective effect is obtained. Therefore, it is confirmed that the therapeutic agent of the present invention is useful for the treatment of ischemic diseases.
  • the therapeutic agent of the present invention is not limited to the brain. A good therapeutic effect can be obtained for ischemic diseases.
  • a transient MCAO model was created, reperfused after 2 hours of ischemia, the rats were euthanized at 15 minutes, 2 hours, and 6 hours after reperfusion, and the brain was removed. Then, perfusion state evaluation of the hemoglobin-albumin complex in the microvessel and morphological change of the microvessel were evaluated. Further, another rat was used to evaluate the cerebral tissue oxygen partial pressure and the cerebral blood flow in a state where the rat survived before the MCAO operation, immediately after the operation, immediately before the reperfusion, immediately after the reperfusion, 2 hours and 6 hours later.
  • Example 1 The ischemia, reperfusion, and drug administration were performed in the same manner as in the above “(2) ischemia reperfusion test”, and the hemoglobin-albumin complex administration group (Example 1) and the control group (comparison) Comparison was made in Example 1).
  • FIG. 6 shows the microscopic observation at ⁇ 400, and the scale bar in FIG. 6 shows 20 ⁇ m.
  • the black arrowhead indicates a microvessel that is antibody-positive.
  • FIG. 7 counts the number of antibody-positive microvessels in one visual field ( ⁇ 400), and compares them in a bar graph between the control group and the hemoglobin-albumin complex administration group.
  • the number of microvessels perfused with autologous red blood cells was significantly reduced over time at 15 minutes, 2 hours, and 6 hours after reperfusion.
  • the number of microvessels perfused with hemoglobin-albumin complex does not change over time after 15 minutes after reperfusion, 2 hours, 6 hours, and perfusion in the microvessels even after time. It was suggested that was maintained.
  • FIG. 8 shows a method for measuring the ratio (%) of the difference between the perivascular space and the microvascular diameter relative to the microvascular diameter.
  • FIGS. FIG. 9 shows a microscopic observation at ⁇ 400.
  • the microvascular inner diameter narrowed and the ratio of the difference between the perivascular space and the microvascular diameter with respect to the microvascular diameter increased, Vascular narrowing due to swelling of the perivascular space in the reperfusion hyperacute phase was observed.
  • the hemoglobin-albumin complex administration group significantly reduced the narrowing of the blood vessel diameter after 6 hours of reperfusion and the ratio of the difference between the perivascular space and the microvascular diameter relative to the microvascular diameter. Suppression of the increase was observed, suggesting that the hemoglobin-albumin complex suppresses the expansion of astrocytes around the blood vessels.
  • Brain tissue partial pressure and cerebral blood flow The brain tissue oxygen partial pressure in the reperfusion region in the reperfusion hyperacute phase (immediately before MCAO, immediately after MCAO, immediately before reperfusion, immediately after reperfusion, 2 hours, and 6 hours) Changes in cerebral blood flow were measured and quantified.
  • a tissue oxygen partial pressure measuring device (POG-203, Unique Medical, Tokyo) was used for measuring the brain tissue oxygen partial pressure.
  • a small hole was made in the skull 3mm posteriorly from the rat bregma (intersection of sagittal and coronary suture), 3mm right outside, oxygen electrode was inserted 3mm from the brain surface, and partial pressure of oxygen tissue in the penumbra region was measured.
  • the cerebral blood flow was measured by using the laser blood flow meter (FLO-C1; Omegawave) described above and placing the probe over the dura mater in the right middle cerebral artery region.
  • the results are shown in FIG.
  • the cerebral blood flow and cerebral tissue oxygen partial pressure decreased sharply from 2 to 6 hours after reperfusion, and the penumbra significantly after 6 hours of reperfusion compared to the group administered with the hemoglobin-albumin complex. Decreased cerebral blood flow and cerebral tissue oxygen partial pressure were observed. This result suggested that the hemoglobin-albumin complex administration group suppressed and maintained the decrease in cerebral blood flow and cerebral tissue oxygen partial pressure in the penumbra region in the reperfusion hyperacute phase.
  • the hemoglobin-albumin complex-administered group had perfusion / microvessels in the persistent and good microcirculation of the hemoglobin-albumin complex in the reperfusion hyperacute penumbra region. Narrowing of the cerebral blood flow and maintenance of cerebral blood flow and partial pressure of oxygen in the brain tissue were observed. Microvascular narrowing due to astrocyte swelling in the reperfusion hyperacute phase is regarded as one of the important pathological conditions that exacerbate ischemia-reperfusion injury. It is considered that the hemoglobin-albumin complex can suppress the narrowing of microvessels in the reperfusion hyperacute phase, transport oxygen by maintaining cerebral blood flow, and improve the ischemic state of brain tissue. It was.
  • Example 2 and Comparative Example 2 (1) Preparation of therapeutic agent-Preparation Example 4: Preparation of therapeutic agent B- Therapeutic agent B containing liposome-encapsulated hemoglobin (LEH) was prepared by the following method. 336 g of water was added to a uniformly mixed lipid composed of 182 g of hydrogenated soybean phosphatidylcholine, 89 g of cholesterol, and 65 g of stearic acid, and heated at 80 ° C. for 30 minutes to prepare a hydrated and swollen uniformly mixed lipid.
  • LSH liposome-encapsulated hemoglobin
  • Hemoglobin was purified and concentrated from the expired concentrated erythrocyte preparation, and a concentrated high-purity hemoglobin solution having a hemoglobin concentration of 45 w / w% was prepared by adding equimolar amount of inositol hexaphosphate to hemoglobin. 2,688 g of the concentrated high-purity hemoglobin solution was added to 672 g of the hydrated and swollen uniformly mixed lipid and emulsified by a high-speed stirring method at a temperature of 45 ° C. or lower to obtain a hemoglobin-containing liposome mixed emulsion.
  • the emulsion was diluted with physiological saline, and the particle size was controlled by circulating filtration through a membrane having a pore size of 0.45 ⁇ m. Furthermore, hemoglobin and inositol hexaphosphate that were not contained in the liposomes were removed and concentrated by a hydroconcentration operation using physiological saline, using a circulating filtration system using ultrafiltration with a molecular weight cut off of 300,000. A suspension with physiological saline was obtained.
  • hemoglobin-containing liposome suspension is added to a physiological saline solution of polyethylene glycol (PEG) -phosphatidylethanolamine, and a suspension of hemoglobin-containing PEG-modified liposomes having a hemoglobin concentration of 6 g / dL in physiological saline (treatment) Agent B) was obtained.
  • PEG polyethylene glycol
  • Table 1 shows the hemoglobin component concentrations of the therapeutic agents A and B, the particle sizes of the hemoglobin-albumin complex and LEH, the surface charges of the hemoglobin-albumin complex and LEH, and the oxygen saturation of the hemoglobin-albumin complex and LEH. Shown in
  • Ischemic reperfusion test 8-9 week old rats (280-320 g males from Sparague-Dawley Rat (SD Rat)) were placed under isoflurane inhalation anesthesia and thread plugs (4-0 nylon thread coated with silicone) was inserted from the internal carotid artery, and the thread plug was fixed by ascending until the middle cerebral artery origin was occluded to complete the ischemic state in the middle cerebral artery region.
  • the decrease in cerebral blood flow during ischemia was confirmed with a laser blood flow meter (FLO-C1; Omegawave), and only the decrease to 30% of the previous value was used in subsequent experiments.
  • FLO-C1 laser blood flow meter
  • a tube for infusion (PE10 tube) is newly inserted into the internal carotid artery in which the thread plug is inserted, and therapeutic agent A or therapeutic agent B is transarterially introduced into the area where ischemia has occurred.
  • the administration was performed under the conditions described in Table 2 (Example 2, Comparative Example 2).
  • a group in which the therapeutic agent was not administered and the thread plug was removed was taken as a control group.
  • Euthanasia was performed 24 hours after reperfusion, and the brain was removed and used for pathological evaluation by TTC staining.
  • the relative ratio (%) of the cerebral infarction area of Example 2 and Comparative Example 2 was measured when the cerebral infarction area of the control group rats not administered with the therapeutic agent was taken as 100%. The lower the relative proportion of the cerebral infarction area, the less the brain ischemic injury. The results are shown in Table 2.
  • Example 2 When Example 2 and Comparative Example 2 are compared, when the therapeutic agent A, which is the therapeutic agent of the present invention, is administered to a transient middle cerebral artery occlusion model rat, the therapeutic agent B containing LEH as an active ingredient is administered. The tissue damage due to infarction was significantly reduced.
  • the present invention can provide a therapeutic agent for ischemic diseases that reduces ischemia-reperfusion injury and exhibits a tissue protective effect.

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Abstract

本発明は、虚血に伴う組織障害に対し組織保護効果を示す、虚血性疾患の治療剤を提供することを目的とする。本発明の治療剤は、コアとしてのヘモグロビンに架橋剤を介してシェルとしてのアルブミンを結合してなる、ヘモグロビン－アルブミン複合体を有効成分とし、虚血性疾患の治療に用いる。

Description

虚血性疾患の治療剤
　本発明は、虚血性疾患の治療剤に関する。
　虚血性疾患に起因する死亡の割合は高く、特に、脳卒中は日本国内の死因の第４位の疾患となっている。その死因の６０％が脳梗塞である。日本では２０１０年以降、脳梗塞の発症数が年間５０万人を超えている。
　脳梗塞治療の第一着手は、血管閉塞を解消することである。血管閉塞の解消は、組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）の静注療法や血管内血栓の除去療法により行われる。これらの治療で血流を再開通する場合、再開通までの時間が短ければ、虚血に伴う変化は可逆的となるが、再開通までの時間が長ければ、不可逆的な組織損傷となる（非特許文献１を参照）。発症から治療までのタイムリミットは、ｔＰＡ静注療法で４．５時間、血管内血栓除去療法で最大８時間である。脳組織のレスキューは、脳血流の低下が著しいほど、また、血流の再開通までの時間が長いほど難しくなる。
　血流を再開通すると、逆に組織障害の悪化をきたすことがあり、このような現象を虚血再灌流傷害（ｉｓｃｈｅｍｉａ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ：Ｉ／Ｒ）という。虚血状態にある組織へ血流が再灌流すると、再灌流領域の微小血管などで、炎症反応などが惹起され、血管壁の破綻が生じ、脳浮腫、出血性梗塞が悪化することがある。そのため、脳梗塞治療では、血流の再開通だけではなく、虚血再灌流傷害の対応も必要となる。
　虚血再灌流傷害が生じるメカニズムの一つとして、白血球による炎症反応が考えられている（非特許文献２を参照）。血管内皮上に発現したｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ－１（ＩＣＡＭ－１）に白血球が接着すると、白血球が活性化して、マトリックスメタロプロテアーゼ－９（ＭＭＰ－９）を産生する。ＭＭＰ－９は、微小血管の破綻に関与し、浮腫や出血をもたらすことが知られている。白血球の活性化を抑制することで梗塞を軽減できることが、動物実験で確認されているが、白血球の活性化を全身的に抑制してしまうと、免疫能が低下する懸念（感染症リスクが増す懸念）があり、更なる改善が望まれる。
　このような背景のもと、虚血再灌流傷害を改善するさまざまな脳保護療法が検討されている。１つの手法として、人工酸素運搬体を用いた脳保護療法が挙げられる。これまでに、人工酸素運搬体として、フッ化炭素エマルジョン（特許文献１を参照）、酸素ナノバブル（特許文献２を参照）、ヘモグロビンをリポソーム内に封入したｌｉｐｏｓｏｍｅ－ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ　ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（ＬＥＨ）（非特許文献３を参照）、を用いた例が報告されている。
　再灌流領域に白血球が流入するのを防ぐ目的で、本発明の発明者らは、白血球を含まないＬＥＨ溶液を閉塞血管再開通後の内頚動脈に投与する検討を行っており、これまでに、ラットの一過性中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）モデルで、閉塞血管再開通後の内頚動脈にＬＥＨ溶液を投与したときに、虚血再灌流傷害を軽減できることを明らかにしている（非特許文献４を参照）。
　ところで、赤血球代替物としての人工酸素運搬体の開発は、１９８０年代から欧米や日本を中心に展開され、これまで多くの製剤が評価されてきた。しかし半世紀近くに亘る努力にもかかわらず、いまだ実用化された製剤がない。米国では、ヒトヘモグロビンを分子内架橋した分子内架橋ヘモグロビン（例えば、特許文献３参照）、ヒトヘモグロビンを架橋剤で結合したヘモグロビン重合体（例えば、特許文献４参照）、ウシヘモグロビンを架橋剤で結合したヘモグロビン重合体（例えば、特許文献５参照）、ヒトヘモグロビンの分子表面に水溶性高分子であるポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を結合させたＰＥＧ修飾ヘモグロビン（例えば、特許文献６参照）、などが開発され、臨床試験が実施されている。これらの人工酸素運搬体は、サブユニット間を架橋したり、分子サイズ（分子量）を大きくすることにより、ヘモグロビンのサブユニットの解離に伴う腎排泄を回避する設計がされている。しかしながら、これまでに臨床試験で検討されてきた人工酸素運搬体には、血管収縮による血圧亢進を起こすものや、人工酸素運搬体投与群と生理食塩水投与群との間で効果の差を認められないものがあり、例えば、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の認可は未だに得られていない。
　本発明の発明者らは、ヘモグロビンにアルブミンを結合させたコア－シェル型のヘモグロビン－アルブミン複合体を合成し、これが赤血球代替物となることを明らかにした（特許文献７を参照）。アルブミンは、血漿に最も多く含まれる蛋白質であり、コロイド浸透圧を維持する役割のほか、外因性・内因性物質を運搬・貯蔵する役割も担っている。酸素輸送蛋白質であるヘモグロビンをアルブミンで包んだ構造のヘモグロビン－アルブミン複合体は、その分子表面が強く負に帯電しているため、血管外への漏出が低減され、血中滞留時間が長くなっている。また、ヘモグロビン－アルブミン複合体は、生体適合性が高いことから、安全な赤血球代替物として機能する（非特許文献５を参照）。
特表平７－５０９３９７号公報 特開２０１１－００１２７１号公報 特開平１０－３０６０３６号公報 特開平１１－５０２８２１号公報 特表２００６－５１６９９４号公報 特表２００５－５１５２２５号公報 国際公開第２０１２／１１７６８８号
Ｚ．Ｓ．Ｓｈｉら、Ｓｔｒｏｋｅ、４５（７）、１９７７－１９８４（２０１４） Ｇ．Ｊ．ｄｅｌ　Ｚｏｐｐｏら、Ｓｔｒｏｋｅ、２２、１２７６－１２８３（１９９１） Ａ．Ｔ．Ｋａｗａｇｕｓｈｉら、Ａｒｔｉｆ．Ｏｒｇａｎｓ、３３、１５３－１５８（２００９） Ｄ．Ｓｈｉｍｂｏら、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．、１５５４、５９－６６（２０１４） Ｒ．Ｈａｒｕｋｉら、Ｓｃｉ．　Ｒｅｐ．、５、１２７７８、１－９（２０１５）
　本発明は、虚血に伴う組織障害に対し組織保護効果を示す、虚血性疾患の治療剤を提供することを目的とする。
　本発明の虚血性疾患の治療剤は、コアとしてのヘモグロビンに架橋剤を介してシェルとしてのアルブミンを結合してなる、ヘモグロビン－アルブミン複合体を有効成分とする。
　本発明の虚血性疾患の治療剤は、前記虚血性疾患が、虚血性脳血管障害、虚血性心疾患、虚血性肺疾患、虚血性腎症、虚血性肝炎、及び四肢虚血性疾患の群から選択される少なくとも１種である、ことが好ましい。
　本発明の虚血性疾患の治療剤は、前記虚血性疾患が、脳梗塞である、ことが好ましい。
　本発明の虚血性疾患の治療剤は、赤血球で酸素の送達ができない組織に、酸素を送達するために投与する、ことが好ましい。
　本発明の虚血性疾患の治療剤は、血管閉塞又は血管狭窄を解消する処置と併用しないで用いられる、ことが好ましい。
　本発明の虚血性疾患の治療剤は、血管閉塞又は血管狭窄を解消する処置と併用して用いられる、ことが好ましい。
　本発明の虚血性疾患の治療剤は、再開通治療時または虚血再灌流後に血管内に投与され、虚血再灌流傷害を軽減するために用いる、ことが好ましい。
　本発明の虚血性疾患の治療剤は、脳梗塞体積及び脳浮腫体積について、通常の再灌流をした個体と、再灌流と共に上記記載の治療剤を投与した個体とを比較したときに、上記記載の治療剤を投与した個体の脳梗塞体積及び／又は脳浮腫体積が、通常の再灌流をした個体の脳梗塞体積及び／又は脳浮腫体積より有意に小さい、ことが好ましい。
　本発明の虚血性疾患の治療剤は、脳梗塞部位における４－ＨＮＥの存在量及びマトリックスメタロプロテアーゼ－９の発現量について、通常の再灌流をした個体と、再灌流と共に上記記載の治療剤を投与した個体とを比較したときに、上記記載の治療剤を投与した個体の４－ＨＮＥの存在量及び／又はマトリックスメタロプロテアーゼ－９の発現量が、通常の再灌流をした個体の４－ＨＮＥの存在量及び／又はマトリックスメタロプロテアーゼ－９の発現量より有意に低い、ことが好ましい。
　本発明の虚血性疾患の治療剤は、脳梗塞後の神経障害について、通常の再灌流をした個体と、再灌流と共に上記記載の治療剤を投与した個体とを比較したときに、上記記載の治療剤を投与した個体の神経障害が、通常の再灌流をした個体の神経障害より有意に改善される、ことが好ましい。
　本発明の虚血性疾患の治療剤は、個体への１回あたりの投与量が、ヘモグロビン成分として個体の体重１ｋｇあたり１００～１０００ｍｇである、ことが好ましい。
　本発明の虚血性疾患の治療剤は、前記ヘモグロビン－アルブミン複合体の粒径の平均が、３０ｎｍ以下である、ことが好ましい。
　本発明の虚血性疾患の治療剤は、前記ヘモグロビン－アルブミン複合体が、前記ヘモグロビンにおける架橋剤との結合部位がリシンであり、前記アルブミンにおける架橋剤との結合部位がシステイン３４である、ことが好ましい。
　本発明の虚血性疾患の治療剤は、前記ヘモグロビンと前記架橋剤との結合がアミド結合であり、前記アルブミンと前記架橋剤との結合がスルフィド結合及びジスルフィド結合のいずれかである、ことが好ましい。
　本発明の虚血性疾患の治療剤は、前記ヘモグロビン－アルブミン複合体の前記アルブミンの数が１個～７個である、ことが好ましい。
　本発明の虚血性疾患の治療剤は、前記ヘモグロビンが、ヒトヘモグロビン、ウシヘモグロビン、ブタヘモグロビン、ウマヘモグロビン、イヌヘモグロビン、ネコヘモグロビン、ウサギヘモグロビン、組換えヒトヘモグロビン、及び分子内架橋ヘモグロビンからなる群から選択される少なくとも１種である、ことが好ましい。
　本発明の虚血性疾患の治療剤は、前記アルブミンが、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ブタ血清アルブミン、ウマ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン、ネコ血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、組換えヒト血清アルブミン、組換えウシ血清アルブミン、組換えイヌ血清アルブミン、組換えネコ血清アルブミン、からなる群から選択される少なくとも１種である、ことが好ましい。
　本発明の虚血性疾患の治療剤は、前記架橋剤が、下記一般式（１）～（３）及び化学式（１）で表される化合物からなる群から選択される少なくとも１種である、ことが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 　一般式（１）中、Ｒ1は、水素原子及びＳＯ3 -Ｎａ+のいずれかを表し、ｎは、１～１０の整数を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 　一般式（２）中、ｎは、１～１０の整数を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 　一般式（３）中、Ｒ2は、水素原子及びＳＯ3 -Ｎａ+のいずれかを表し、ｎは、１～１０の整数を表す。
　本発明の虚血性疾患の治療剤は、前記架橋剤が、下記一般式（４）で表される化合物である、ことが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 　一般式（４）中、Ｒ3は、水素原子及びＳＯ3 -Ｎａ+のいずれかを表し、Ｒ4は、下記一般式（５）～（６）及び下記化学式（２）～（４）のいずれかを表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 　一般式（５）中、ｎは、１～１０の整数を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 　一般式（６）中、ｎは、２、４、６、８、１０又は１２の整数を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　本発明の方法は、コアとしてのヘモグロビンに架橋剤を介してシェルとしてのアルブミンを結合してなるヘモグロビン－アルブミン複合体を、患者に投与することにより虚血性疾患を治療する方法である。
　本発明のヘモグロビン－アルブミン複合体は、コアとしてのヘモグロビンに架橋剤を介してシェルとしてのアルブミンを結合してなるヘモグロビン－アルブミン複合体であり、虚血性疾患の治療剤として使用することを特徴とする。
　本発明の使用は、コアとしてのヘモグロビンに架橋剤を介してシェルとしてのアルブミンを結合してなるヘモグロビン－アルブミン複合体の、虚血性疾患の治療剤の製造のための使用である。
　本発明によれば、虚血に伴う組織障害に対し組織保護効果を示す、虚血性疾患の治療剤を提供することができる。
図１は、本発明の治療剤に含まれるヘモグロビン－アルブミン複合体の一実施形態を示す図である。 図２は、再灌流から２４時間後のラットの神経障害度を示す棒グラフである。縦軸は、神経障害度の点数を示す。 図３Ａは、再灌流から２４時間後のラットのＴＴＣ染色脳切片の写真である。図３Ｂは、再灌流から２４時間後のラットのＴＴＣ染色脳切片の連続切片脳梗塞面積から求めた脳梗塞体積（％）を示す棒グラフである。図３Ｃは、再灌流から２４時間後のラットのＴＴＣ染色脳切片の連続切片脳浮腫面積から求めた脳浮腫体積（％）を示す棒グラフである。 図４Ａは、再灌流から２４時間後のラットの脳を試料に用いて、４－ＨＮＥの存在量及びβ－アクチンの発現量をウェスタンブロッティングで測定したときの写真である。図４Ｂは、β－アクチンの発現量に対する４－ＨＮＥの存在量の割合を示す棒グラフである。 図５Ａは、再灌流から２４時間後のラットの脳を試料に用いて、ＭＭＰ－９及びβ－アクチンの発現量をウェスタンブロッティングで測定したときの写真である。図５Ｂは、β－アクチンの発現量に対するＭＭＰ－９の発現量の割合を示す棒グラフである。 図６は、再灌流超急性期におけるラットの脳の再灌流領域を、抗ヒト－アルブミン抗体又は抗ラット赤血球抗体を用いて免疫染色をした写真である。 図７は、再灌流超急性期におけるラットの脳の再灌流領域の、抗体陽性となる微小血管数を示す棒グラフである。 図８は、微小血管径、及び微小血管径に対する血管周囲腔と微小血管径との差の比率の測定方法を説明する図である。 図９は、再灌流超急性期におけるラットの脳の再灌流領域の、微小血管を免疫染色した写真である。 図１０は、再灌流超急性期におけるラットの脳の再灌流領域の、微小血管径に対する血管周囲腔と微小血管径との差の比率及び微小血管径を示す折れ線グラフである。 図１１は、再灌流超急性期におけるラットの脳の再灌流領域の、脳血流量及び脳組織酸素分圧を示す折れ線グラフである。
　以下に本発明を実施するための一実施形態を例示する。
（治療剤）
　本発明に係る、虚血性疾患の治療剤（以下、単に「治療剤」ともいう）は、コアとしてのヘモグロビンに架橋剤を介してシェルとしてのアルブミンを結合してなる、ヘモグロビン－アルブミン複合体を有効成分とする。
　本発明の治療剤は、有効成分としてヘモグロビン－アルブミン複合体を含み、必要に応じてその他の成分を含む。
＜虚血＞
　上記虚血とは、血栓症、塞栓症又は血管狭窄などにより、血管が閉塞又は狭窄されて、体の器官、組織又は部位への血液の供給が低下した状態である。虚血となることにより、直接的な虚血性損傷、すなわち、酸素供給の低下によって生じる組織損傷を招くことがある。
＜虚血性疾患＞
　上記虚血性疾患としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、虚血性脳血管障害、虚血性心疾患、虚血性肺疾患、虚血性腎症、虚血性肝炎、及び四肢虚血性疾患、などが挙げられる。
　前記虚血性疾患の病因としては、主に、（ｉ）血管の閉塞及び又は狭窄、（ｉｉ）それによる直接的な組織障害、及び（ｉｉｉ）再灌流で血流が回復した後に起こる虚血再灌流傷害、が挙げられる。このような病因により、虚血性疾患では、各臓器で機能障害が生じる。
　本発明の治療剤は、前記病因のうち、直接的な組織障害、及び虚血再灌流傷害に対して、組織保護効果を示し、特に、虚血再灌流傷害に対しての組織保護効果が高い。
＜＜虚血再灌流＞＞
　上記虚血再灌流は、血液供給が低下して虚血を起こした組織に、血液を再び供給することである。前記再灌流は、血管閉塞又は血管狭窄を解消することにより行うことができる。前記再灌流により、生存可能な虚血性組織を回復させ、それによって壊死を抑制することができる。しかし、再灌流そのものが、虚血性組織をさらに損傷させることもある。
　上記血管閉塞又は血管狭窄の解消は、組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）の点滴投与、血栓又は梗塞を除去する外科手術、ステント導入等の外科手術、などの処置により行うことができる。
－虚血再灌流傷害－
　本明細書において、「虚血再灌流傷害」とは、血管の閉塞及び／又は狭窄が解除された後に、血流が虚血性組織に再灌流するときに生じる組織障害である。
　虚血性疾患の虚血再灌流傷害は、脳や心臓で重症化することが多いが、これらの臓器に限らず、肺、腎臓、四肢などの様々な臓器で、同様のメカニズムで発症する。
＜＜脳梗塞＞＞
　上記脳梗塞は、脳の血管が閉塞及び／又は狭窄されるために、虚血をきたし、脳組織が壊死、または壊死に近い状態になることをいう。
　前記脳梗塞の病因としては、主に、（ｉ）脳血管の閉塞及び又は狭窄、（ｉｉ）それによる直接的な組織障害、及び（ｉｉｉ）再灌流で血流が回復した後に起こる虚血再灌流傷害、が挙げられる。このような病因により、脳梗塞では、脳の機能障害が生じる。
　本発明の治療剤は、前記病因のうち、直接的な組織障害、及び虚血再灌流傷害に対して、組織保護効果を示し、特に、虚血再灌流傷害に対しての組織保護効果が高い。
　上記治療剤を適用する個体としては、虚血性疾患と診断された患者、虚血性疾患を治療している患者、具体的な症状が認められないが虚血性疾患が疑われる健常者、などが挙げられる。
　また、前記治療剤を適用する個体は、ヒトに限らず、マウス、ラット、サル、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ等のヒト以外の哺乳動物であってもよい。
　前記治療剤は、適用しようとする動物の種類に応じて、アルブミンの種類を選択するのがよい。ヘモグロビン－アルブミン複合体を構成するアルブミンを同じ種の動物に由来するものとすることにより、個体の体内にヘモグロビン－アルブミン複合体を投与したときに、個体の体内でヘモグロビン－アルブミン複合体が異種抗原と認識されにくくなり、ヘモグロビン－アルブミン複合体に対する免疫反応を回避することができる。
＜＜投与方法＞＞
　上記治療剤の個体への投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、静脈への投与、動脈への投与、などが挙げられる。これらは、１種単独でもよいし２種以上を併用してもよい。
　治療剤の投与前に閉塞又は狭窄している部位を把握できている場合には、前記治療剤を閉塞又は狭窄がある血管に直接投与することによって、より効率良くヘモグロビン－アルブミン複合体を虚血性組織に流入させることができる。
　上記治療剤は、赤血球で酸素の送達ができない組織に、酸素を送達するために投与するのが好ましい。この構成により、血管が閉塞若しくは狭窄した状態でも、閉塞又は狭窄した血管から末端側の組織に酸素を送達することが可能となり、上記の直接的な組織障害の病因を軽減することが可能である。
　上記治療剤は、血管閉塞又は血管狭窄を解消する処置と併用しないで用いてもよいし、血管閉塞又は血管狭窄を解消する処置と併用して用いてもよい。
　前記治療剤を、血管閉塞又は血管狭窄を解消する処置と併用しない利点としては、応急処置が必要な虚血性疾患の患者に対し、前記治療剤をいち早く投与することで、組織障害を緩和する処置をできる点、及び、血管閉塞又は血管狭窄を解消することが難しい場合に、前記治療剤を投与することで組織障害を緩和する処置をできる点、が挙げられる。なお、血管閉塞又は血管狭窄を解消することが難しい場合としては、例えば、血管閉塞又は血管狭窄を解消する処置を施せない場合や、線溶を亢進させる薬剤を投与しても血栓の線溶が十分に進まないことが見込まれる場合、などがある。
　前記治療剤を、血管閉塞又は血管狭窄を解消する処置と併用する利点としては、血管閉塞又は血管狭窄の解消と共に、血管閉塞又は血管狭窄の解消により生じ得る虚血再灌流傷害までも有効に軽減できる点が挙げられる。
　上記治療剤に含まれるヘモグロビン－アルブミン複合体は、赤血球の直径に比べて、およそ１／８００の大きさであるため、血管狭窄が生じて赤血球が流入できない部位へも流入が可能である。そのため、血管が狭窄した状態でも、虚血組織への流入は可能であり、組織障害を軽減する効果がある。そのため、前記治療剤は、血管閉塞又は血管狭窄を解消する処置と併用しないで投与しても、組織障害を緩和できる。
　上記治療剤の投与を、血管閉塞又は血管狭窄を解消する処置と併用すると、血管閉塞又は血管狭窄を解消する処置のみを行う場合に比べて、虚血再灌流傷害を著しく軽減できる。
　そのため、本発明の治療剤の投与を、血管閉塞又は血管狭窄を解消する処置と併用して行うと、閉塞又は狭窄状態の解消と共に、虚血再灌流傷害の軽減も有効に達成できる。
＜＜投与量＞＞
　上記治療剤の１回あたりの個体への投与量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ヘモグロビン成分が個体の体重１ｋｇあたり１００～１０００ｍｇとなる投与量であることが好ましく、２００～７００ｍｇとなる投与量であることがより好ましい。
　前記投与量が、ヘモグロビン成分として１００ｍｇ以上であると、虚血再灌流傷害がより軽減され、１０００ｍｇ以下であると、費用効率の点で好ましい。前記投与量が、前記より好ましい範囲内であると、同様の理由でより有利である。
　前記治療剤は、１日に１回の投与としてもよいし、複数回に分けて投与してもよい。投与量は、症状、年齢、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定される。また、前記治療剤の投与は、連続的であってもよいし、断続的であってもよい。
　脳梗塞体積及び脳浮腫体積について、通常の再灌流をした個体と、再灌流と共に本発明の治療剤を投与した個体とを比較したときに、本発明の治療剤を投与した個体の脳梗塞体積及び／又は脳浮腫体積が、通常の再灌流をした個体の脳梗塞体積及び／又は脳浮腫体積より有意に小さくなる。
　また、脳梗塞部位における４－ＨＮＥの存在量及びマトリックスメタロプロテアーゼ－９の発現量について、通常の再灌流をした個体と、再灌流と共に本発明の治療剤を投与した個体とを比較したときに、本発明の治療剤を投与した個体の４－ＨＮＥの存在量及び／又はマトリックスメタロプロテアーゼ－９の発現量が、通常の再灌流をした個体の４－ＨＮＥの存在量及び／又はマトリックスメタロプロテアーゼ－９の発現量より有意に低くなる。
　さらに、脳梗塞後の神経障害について、通常の再灌流をした個体と、再灌流と共に本発明の治療剤を投与した個体とを比較したときに、本発明の治療剤を投与した個体の神経障害が、通常の再灌流をした個体の神経障害より有意に改善される。
　なお、前記通常の再灌流とは、上記の、組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）の点滴投与、血栓又は梗塞を除去する外科手術、ステント導入等の外科手術、などの血管閉塞又は血管狭窄を解消する処置である。
　脳梗塞体積及び脳浮腫体積は、脳の虚血障害を評価するための形態的指標である。４－ＨＮＥ（４－ヒドロキシ－２－ノネナール）は、酸化ストレス産物であり、その存在量は組織における酸化状態の指標となる。マトリックスメタロプロテアーゼ－９（ＭＭＰ－９）は、主に白血球で産生されるプロテアーゼであり、その発現量は、組織での炎症状態の指標となる。脳梗塞後の神経障害は、脳梗塞後の個体の脳機能の状態を示す指標となる。
　本発明の治療剤が、虚血性疾患において、虚血再灌流傷害を低減し組織保護効果を示すことができるのは、ヘモグロビン－アルブミン複合体が極めて小さな人工酸素運搬体であり、虚血再灌流傷害でみられるような内腔が狭小化した微小血管においても効率よく酸素を運搬することができることが１つの理由と考えられる。本発明の治療剤を投与すると、内皮細胞の障害が抑えられるため、血管内皮細胞でのＩＣＡＭ－１の発現が抑制され、それにより、巡廻してきた白血球の接着が抑制され、ひいては白血球の活性化を回避することができると考えられる。そして、白血球からの分解酵素の分泌が抑制され、神経や血管などの組織の保護効果を発揮できると考えられる。
＜ヘモグロビン－アルブミン複合体＞
　上記ヘモグロビン－アルブミン複合体は、コアとしてのヘモグロビンと、前記ヘモグロビンに架橋剤を介して結合されたシェルとしてのアルブミンを有し、さらに必要に応じて、その他の部位を有する。
　例えば、図１に示すように、本発明の治療剤に含まれるヘモグロビン－アルブミン複合体（星型へテロクラスター）１００は、コアとしてのヘモグロビン１０と、シェルとしての３個のアルブミン２０とを有する。図１において、ヘモグロビン１０とアルブミン２０とは、架橋剤（不図示）を介して結合されている。
　上記ヘモグロビン－アルブミン複合体は、１分子のヘモグロビンに対して、３分子のアルブミンが架橋剤によって結合されている場合、約１０ｎｍの分子サイズである。この大きさは、ヒト赤血球の直径（約８μｍ）に比べて約１／８００の大きさであり、上述のＬＥＨの径（２００～２５０nｍ）と比べても約１／２０である。前記ヘモグロビン－アルブミン複合体は、極めて小さいため、赤血球やＬＥＨが物理的に流入できない領域にも流入できる。
　上記ヘモグロビン－アルブミン複合体は、１分子のヘモグロビンに対して、３分子のアルブミンが架橋剤によって結合されている場合、約１０ｎｍの分子サイズであるが、結合させるアルブミンの数を増やしたり、アルブミン以外の成分をさらに結合させることにより、ヘモグロビン－アルブミン複合体のサイズを大きくできる。
　前記ヘモグロビン－アルブミン複合体の平均粒径としては、３０ｎｍ以下が好ましく、２０ｎｍ以下がより好ましい。
　前記ヘモグロビン－アルブミン複合体の平均粒径が３０ｎｍ以下であると、わずかな隙間でも流入できる点で有利であり、平均粒径が２０ｎｍ以下であると、同様の理由でより有利である。
　上記ヘモグロビン－アルブミン複合体の等電点としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜調整することができるが、４．０～６．５が好ましく、４．２～５．５がより好ましい。前記ヘモグロビン－アルブミン複合体の等電点は、７よりも低いため、生理条件では、分子表面が負に帯電している。そのため、血管内皮細胞の外側にある基底膜（負に帯電）との静電反発により、血管外に漏れ出しにくい。よって、ヘモグロビン－アルブミン複合体は、腎排泄や血管からの漏出に伴う血圧亢進などの副作用がなく、安全な赤血球代替物として機能する。
　上記ヘモグロビン－アルブミン複合体は、ヘモグロビンが酸素結合サイトであるため、安定な酸素化体を形成することが可能であり、体組織に効率良く酸素を供給することができる。また、ヘモグロビン及びアルブミンは生体物質であるため、生体適合性が高く、また、代謝が良いと考えられる。さらに、前記ヘモグロビン－アルブミン複合体は、調製が比較的容易であるにもかかわらず、三次元構造は明確である。
　上記ヘモグロビン－アルブミン複合体は、ヘモグロビンが酸素結合部位であることにより、酸素結合解離曲線がＳ字曲線となり、特に、末梢細胞の酸素分圧が低下した場合に、酸素運搬能力が向上するという効果を有することが予測される。
　アルブミンは、ヘモグロビンを被覆するように構成されているため、アルブミンの種類は、投与した個体の体内での免疫反応に影響し易い。したがって、ヘモグロビン－アルブミン複合体のアルブミンは、投与しようとする動物と同種に由来するものであることが望ましい。
　一方、ヘモグロビンは、アルブミンにより被覆されているため、ヘモグロビンの種類は、投与した個体の体内での免疫反応に影響しにくい。したがって、免疫反応の観点で、ヘモグロビンの由来となる動物は、特に限定されない。
　前記ヘモグロビン－アルブミン複合体は、アルブミンの由来となる動物と、ヘモグロビンの由来となる動物とが、異なっていてもよい。
＜＜ヘモグロビン＞＞
　上記ヘモグロビンの分子は、４つのサブユニットから構成され、各サブユニットは、それぞれ１つのプロトヘムを有する。酸素は、該プロトヘム内の鉄原子に結合する。即ち、１つのヘモグロビン分子には、４つの酸素分子が結合する。
　前記ヘモグロビンとしては、脊椎動物のものである限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、入手容易性の観点からは、例えば、ヒトヘモグロビン、ウシヘモグロビン、ブタヘモグロビン、ウマヘモグロビン、イヌヘモグロビン、ネコヘモグロビン、ウサギヘモグロビン、組換えヒトヘモグロビン、及び分子内架橋ヘモグロビン、などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
　また、前記ヘモグロビンは、赤血球を溶解して得られるヘモグロビン、遺伝子組換え技術により得られる組換えヘモグロビン、これらのヘモグロビンのサブユニットを架橋剤で分子内架橋して得られる分子内架橋ヘモグロビン、などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
　これらの中でも、ウシヘモグロビン、ブタヘモグロビン、ウマヘモグロビン、特には、ウシヘモグロビン、ブタヘモグロビンは、産業動物のヘモグロビンとして、供給量の観点で入手が容易なため、ヘモグロビン－アルブミン複合体を大量に製造できるようになる点で有利である。
＜＜アルブミン＞＞
　上記アルブミンは、血液中ではコロイド浸透圧調整を主な役割とする単純タンパク質であるが、栄養物質、薬物等の輸送タンパク質としても機能し、その他、ｐＨ緩衝作用、エステラーゼ活性、などを有する。また、前記アルブミンは、血漿タンパク質であるから、生体への適用、特に、赤血球代替物としての利用に関して格段に有利である。
　前記アルブミンの等電点は、７よりも低く、生理条件では、分子表面が強く負に帯電しているため、当該アルブミンをシェルとするヘモグロビン－アルブミン複合体は、血管内皮細胞の外側にある基底膜（負に帯電）との静電反発により、血管外に漏れ出しにくい。
　上記アルブミンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、入手容易性の観点からは、例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ブタ血清アルブミン、ウマ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン、ネコ血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、組換えヒト血清アルブミン、組換えウシ血清アルブミン、組換えイヌ血清アルブミン、組換えネコ血清アルブミン、などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
　上記ヘモグロビンに架橋剤を介して結合するアルブミンの数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１個～７個が好ましい。８個以上は、立体障害のため結合することが困難と考えられる。アルブミンの数が２～５個であると、ヘモグロビンを十分に囲むことができる点で、有利である。また、ヘモグロビン－アルブミン複合体を構成するヘモグロビンの数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１個が好ましい。
　前記アルブミンの数の測定方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、（１）電気泳動法により測定したヘモグロビン－アルブミン複合体全体の分子量と、ヘモグロビンの分子量及びアルブミンの分子量とに基づいて算出する方法、（２）シアノメトヘモグロビン法（例えば、アルフレッサファーマ社、ネスコートヘモキットＮ、Ｎｏ．１３８０１６－１４）を用いたヘムの定量により算出したヘモグロビンの濃度、及び６６０ｎｍ法（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ６６０ｎｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、サーモフィシャーサイエンティフィック社）を用いたタンパク質の定量により算出したタンパク質の濃度に基づいて算出する方法、（３）電子顕微鏡で観察する方法などが挙げられる。
　また、アルブミンの数が異なるヘモグロビン－アルブミン複合体の混合物から、アルブミンの数が所定の個数であるヘモグロビン－アルブミン複合体を単離する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カラムクロマトグラフィー（例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーなど）による単離方法、などが挙げられる。
＜＜架橋剤＞＞
　上記架橋剤としては、ヘモグロビンとアルブミンとを連結可能な２官能性架橋剤である限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、下記一般式（１）～（４）及び化学式（１）で表される化合物、などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
　これらの中でも、α－（Ｎ－スクシンイミジル）－ω―ピリジルジチオ架橋剤（下記一般式（１）において、Ｒ1が水素原子であり、ｎが５であるもの）、α－（Ｎ－スクシンイミジル）－ω―マレイミド架橋剤（下記一般式（４）において、Ｒ3が水素原子であり、Ｒ4が一般式（５）であるもの、さらには、Ｒ3が水素原子であり、Ｒ4が一般式（５）であり、かつｎ＝５またはｎ＝２であるもの、さらには、Ｒ3が水素原子であり、Ｒ4が化学式（３）であるもの）が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 一般式（１）中、Ｒ1は、水素原子及びＳＯ3 -Ｎａ+のいずれかを表し、ｎは、１～１０の整数を表す。例えば、ｎ＝５のものなどが一般的に挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
 一般式（２）中、ｎは、１～１０の整数を表す。例えば、ｎ＝２のものなどが一般的に挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
 一般式（３）中、Ｒ2は、水素原子及びＳＯ3 -Ｎａ+のいずれかを表し、ｎは、１～１０の整数を表す。例えば、ｎ＝５のものなどが一般的に挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
 一般式（４）中、Ｒ3は、水素原子及びＳＯ3 -Ｎａ+のいずれかを表し、Ｒ4は、下記一般式（５）～（６）及び下記化学式（２）～（４）のいずれかを表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
 一般式（５）中、ｎは、１～１０の整数を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
 一般式（６）中、ｎは、２、４、６、８、１０又は１２の整数を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
　上記架橋剤におけるスクシンイミジル基と、ヘモグロビンにおけるリシンのアミノ基（－ＮＨ2）とは、アミド結合（共有結合）を形成する。
　前記アミド結合を形成するための方法としては、例えば、ヘモグロビン及び架橋剤を４℃～３０℃で０．２時間～８時間攪拌すること、などが挙げられる。
　前記架橋剤におけるピリジルジチオ基と、アルブミン分子におけるシステイン３４（還元型システイン）とは、交換反応により新たなジスルフィド結合（共有結合）を形成する。なお、該ジスルフィド結合は、切断されやすいという特性を有する。
　前記ジスルフィド結合を形成するための方法としては、例えば、アルブミン及び架橋剤を４℃～３０℃で１時間～４０時間攪拌すること、などが挙げられる。
　前記架橋剤におけるマレイミド基と、アルブミン分子におけるシステイン３４（還元型システイン）とは、スルフィド結合（共有結合）を形成する。
　前記スルフィド結合を形成するための方法としては、例えば、アルブミン及び架橋剤を４℃～３０℃で１時間～７２時間攪拌すること、などが挙げられる。
　アルブミン分子において、システイン３４（還元型システイン）は１つしか存在しないため、本発明の治療剤の有効成分のヘモグロビン－アルブミン複合体は、星型のクラスター構造（例えば、図１の構造）となり、分子構造が明確である。
＜＜その他の部位＞＞
　上記その他の部位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アルブミン表面に共有結合により導入されたポリ（エチレングリコール）、アルブミンとともにヘモグロビンに結合されたタンパク質、などが挙げられる。
＜＜治療剤の製剤の形態＞＞
　上記治療剤の製剤の形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、液状の形態、凍結乾燥された製剤の形態、などが挙げられる。凍結乾燥された製剤の場合は、使用前に無菌水等の無菌の溶媒で溶解又は懸濁して使用することができる。
　前記治療剤は、フィルターによる濾過、加熱、殺菌剤の配合又はエネルギー線照射によって無菌化することが好ましい。
＜＜その他の成分＞＞
　上記ヘモグロビン－アルブミン複合体以外の、上記治療剤に含まれ得るその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水性又は非水性の溶液、ｐＨ緩衝剤、等張化剤、防腐剤、安定化剤、乳化剤、分散剤、局所麻酔剤、などが挙げられる。これらは１種単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。
＜＜ヘモグロビン－アルブミン複合体の濃度＞＞
　上記治療剤中の上記ヘモグロビン－アルブミン複合体の濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、治療剤が液状の形態の場合、ヘモグロビン成分が、３０～７０ｍｇ／ｍＬであることが好ましく、４０～６０ｍｇ／ｍＬであることがより好ましい。
　以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は下記の実施例になんら限定されるものではなく、その要旨を変更しない範囲において適宜変更可能である。
（実施例１及び比較例１）
（１）治療剤の調製
－調製例１：ウシヘモグロビン－架橋剤結合体（Ｈｂ－ＳＭＣＣ）の調製－
　ナス型フラスコ（３００ｍＬ容量）にＣＯ化ウシヘモグロビン（Ｈｂ）のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）溶液（０．１ｍＭ）１２０ｍＬを入れ、撹拌子で撹拌（３００ｒｐｍ）しながら、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－４－（Ｎ－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）（ＳＭＣＣ、和光純薬工業社）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液（２０ｍＭ）１２ｍＬをゆっくり添加し［ＳＭＣＣ／Ｈｂ＝２０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）］、４℃、遮光下で６時間撹拌した（攪拌速度：１００ｒｐｍ）。得られた反応溶液をＤＩＳＭＩＣフィルター（ＤＩＳＭＩＣ－２５ＣＳ、孔径０．２μｍ）でろ過した後、ゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５　Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ、５．０ｃｍφ、溶出液：ＰＢＳ（ｐＨ７．４））にかけ、未反応の架橋剤を除去した。得られたウシヘモグロビン－架橋剤結合体（Ｈｂ－ＳＭＣＣ）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液を遠心限外ろ過器（ＶＩＶＡ　ＳＰＩＮ２０、限外分子量：１０ｋＤａ）を用いて１２０ｍＬまで濃縮し、０．１ｍＭとした。
－調製例２：ウシヘモグロビン－ヒト血清アルブミン複合体（Ｈｂ－ＨＳＡ3）ＳＭＣＣの調製－
　ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液（１．０ｍＭ）１２０ｍＬをナス型フラスコ（５００ｍＬ容量）に入れ、撹拌子で撹拌（３００ｒｐｍ）しながら、ウシヘモグロビン－架橋剤結合体（Ｈｂ－ＳＭＣＣ）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液（０．１ｍＭ）１２０ｍＬをゆっくりと滴下し［ＨＳＡ／Ｈｂ－ＳＭＣＣ＝１０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）］、４℃、遮光下で１６時間攪拌した（攪拌速度：１００ｒｐｍ）。
　該反応溶液から、ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｇｅｌ　Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＧＦＣ）を用いて、未反応のＨＳＡのみを除去することで、ウシヘモグロビン－ヒト血清アルブミン複合体を得た。具体的には、得られた反応溶液をＤＩＳＭＩＣフィルター（ＤＩＳＭＩＣ－２５ＣＳ、孔径０．２μｍ）でろ過した後、ＵＶ検出器（２８０ｎｍ）及びレコーダーを連結したゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００ｐｇ、１Ｌ、溶出液：ＰＢＳ（ｐＨ７．４））にかけ、ＨＳＡ以外の高分子量成分を回収した。必要に応じて、遠心限外ろ過器（ＶＩＶＡＳＰＩＮ、限外分子量：３０ｋＤａ）を用いて溶液を濃縮した。シアノメトヘモグロビン法（ネスコートヘモキットＮ、アルフレッサファーマ社）によりＨｂ濃度を、また６６０ｎｍ法（Ｐｉｅｒｃｅ６６０ｎｍ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）によりタンパク質濃度を定量した。ＨＳＡ／Ｈｂ比は３．０となり、ＨｂにＨＳＡが平均３つ結合したウシヘモグロビン－ヒト血清アルブミン複合体［（Ｈｂ－ＨＳＡ3）ＳＭＣＣ］であることがわかった。
－調製例３：治療剤Ａの調製－
　得られたヘモグロビン－アルブミン複合体（Ｈｂ－ＨＳＡ3）ＳＭＣＣを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で、［Ｈｂ］＝５ｇ／ｄＬに溶解して、治療剤Ａを調製した。ラットへの投与に際しては、３７℃に加温したものを用いた。
（２）虚血再灌流試験
　脳梗塞のモデルとして一般的に用いられる一過性中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）モデルを用いて、虚血再灌流試験を行った。
　８－９週齢のラット（Ｓｐａｒａｇｕｅ－Ｄａｗｅｌｙ　Ｒａｔ（ＳＤ　Ｒａｔ）の雄２８０－３２０ｇ）をイソフルレン吸入麻酔下に置き、糸栓子（４－０ナイロン糸にシリコンコートしたもの）を内頚動脈から挿入し、中大脳動脈起始部を閉塞するまで上行させて糸栓子を固定し、中大脳動脈領域に虚血状態を完成させた。虚血中の脳血流量の低下はレーザー血流計（ＦＬＯ－Ｃ１；Ｏｍｅｇａｗａｖｅ）で確認し、前値の３０％に低下したものだけをそのあとの実験に用いた。２時間の虚血後に再度ラットを麻酔下に置き、糸栓子を抜去し再灌流状態を作成した。再灌流では糸栓子が挿入されていた内頚動脈に新たに輸液のためのチューブ（ＰＥ１０チューブ）を挿入し、虚血が生じていた領域に経動脈的に治療剤Ａを８０ｍＬ／ｋｇ／ｈで５分間投与した（実施例１、ヘモグロビン－アルブミン複合体投与群）。また、治療剤Ａを投与せず糸栓子の抜去を行った群をコントロール群とした（比較例１、コントロール群）。
　灌流後２４時間において、神経障害度を評価した。その後、安楽死させて脳を摘出して、病理評価及び分子生物学的な評価に用いた。
（３）神経障害度の評価
　神経障害度は、Ｇａｒｃｉａらの方法（Ｓｔｒｏｋｅ、２６、６２７－６３４（１９９５））を用いて評価した。症状改善について、活動性、歩行状態、四肢の動きなどを１８ポイントでスケール化し（正常状態で、最高の１８点となる）、その点数を比較することで評価した。点数が高いほど、神経障害度が低いことを示す。結果を図２に示す。図２の縦軸は、神経障害度の点数を示す。
　図２に示すように、再灌流２４時間後の時点で、比較例１のコントロール群が８．６±０．７点であったのに対し、実施例１のヘモグロビン－アルブミン複合体投与群では１２．９±０．５点と高く、統計学的に有意な症状改善効果が認められた（図２）。
（４）病理評価
　病理評価は、脳の切片を２，３，５－塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）染色で染色して、連続切片脳梗塞面積及び連続切片脳浮腫面積を測定し、脳梗塞体積（％）及び脳浮腫体積（％）を算出した。脳梗塞体積、脳浮腫体積が大きいほど、脳梗塞による障害が大きいことを示す。結果を図３に示す。図３Ａでは、脳の冠状面切片のＴＴＣ染色写真を、冠状面で前方から後方の順に配置した。図３Ｂ、図３Ｃの縦軸は、ぞれぞれ、脳梗塞体積（％）、脳浮腫体積（％）を示す。
　図３に示すように、再灌流２４時間後の脳梗塞体積については、比較例１のコントロール群が５５．２±３．６％であったのに対して、実施例１のヘモグロビン－アルブミン複合体投与群は２０．２±３．１％に縮小しており（コントロール群の３７％）、統計学的に有意な縮小効果が観測された。また、脳浮腫体積もコントロール群が２６．４±２．８％であったのに対し、ヘモグロビン－アルブミン複合体投与群は１４．１±１．７５％と小さく、統計学的に有意な縮小効果が認められた（図３）。
（５）分子生物学的な評価
　分子生物学的な評価は、脳組織を試料としたウエスタンブロティングにより、４－ＨＮＥの存在量、及びＭＭＰ－９の発現量を定量することで行った。試料中のβ－アクチン量を測定して、４－ＨＮＥ存在量／β－アクチン発現量の割合、及びＭＭＰ－９発現量／β－アクチン発現量の割合を求めた。存在量、発現量の定量には、デンシトメトリーを用いた。４－ＨＮＥの存在量が高いほど、組織が酸化ストレスの影響を受けたこと示し、ＭＭＰ－９の発現量が高いほど、炎症状態が亢進したことを示す。結果を図４、５に示す。
　図４、５に示すように、４－ＨＮＥの存在量及びＭＭＰ－９の発現量が、実施例１のヘモグロビン－アルブミン複合体投与群で有意に低下していることがわかった。これらの結果は、ヘモグロビン－アルブミン複合体の投与によってＲＯＳ等の活性酸素種の産生が抑制されること、及びヘモグロビン－アルブミン複合体の投与によって炎症反応が抑制されることを示唆している。したがって、ヘモグロビン－アルブミン複合体の投与によって、組織保護効果が発現していることが、分子生物学的な観点からも強く示唆されている（図４、５）。
　以上の結果から、コントロール群と比較してヘモグロビン－アルブミン複合体投与群では、神経症状の有意な改善、脳梗塞体積、脳浮腫体積の有意な減少が認められることがわかった。また、４－ＨＮＥの存在量およびＭＭＰ－９の発現量が、ヘモグロビン－アルブミン複合体投与群で有意に低下することがわかった。ヘモグロビン－アルブミン複合体は、狭小化している微小血管にまで酸素を効果的に運搬できるため、内皮細胞障害が抑えられ、最終的には活性酸素種産生及びＭＭＰ－９発現が抑制されて、神経・血管保護効果が発揮されるものと考えられる。
　上記の通り、虚血性疾患の一種である脳梗塞の病態モデルにおいて、本発明の治療剤を投与することで、虚血再灌流傷害が低減され、組織保護効果が得られている。したがって、本発明の治療剤が、虚血性疾患の治療に有用であることが裏付けられている。実施例１では、脳梗塞の病態モデルの例を示したが、虚血性疾患は、脳に限らず、他の臓器においても同様のメカニズムで発症するため、本発明の治療剤は、脳以外の虚血性疾患についても、良好な治療効果が得られる。
　次に、再灌流超急性期に生じる微小血管周囲のアストロサイトの膨化現象に及ぼす、ヘモグロビン－アルブミン複合体の影響を検証した。一過性ＭＣＡＯモデルを作製し、２時間の虚血後に再灌流状態とし、再灌流超急性期である１５分後、２時間後、６時間後において、ラットを安楽死させて脳を摘出し、ヘモグロビン－アルブミン複合体の微小血管での灌流状態評価及び微小血管の形態変化を評価した。また別のラットを用いて、ＭＣＡＯ術前、術直後、再灌流直前、再灌流直後、２時間後、６時間後において生存した状態で脳組織酸素分圧と脳血流量を評価した。なお、虚血、再灌流、及び薬剤の投与は、上述の「（２）虚血再灌流試験」と同様の方法で行い、ヘモグロビン－アルブミン複合体投与群（実施例１）とコントロール群（比較例１）で比較した。
（６）微小血管での灌流状態の評価
　摘出した脳をパラフィン切片とし、免疫組織学的染色にて再灌流超急性期における再灌流領域のヘモグロビン－アルブミン複合体とラット自己赤血球との灌流状態の定量化を行った。ヘモグロビン－アルブミン複合体投与群では、抗ヒト－アルブミン抗体を用いてヘモグロビン－アルブミン複合体を検出し、コントロール群では、抗ラット赤血球抗体を用いてラット自己赤血球を検出した。再灌流領域において、それぞれの抗体陽性となる直径１５μｍ以下の微小血管をカウントすることにより定量化した。結果を図６、７に示す。図６は、×４００にて検鏡した所見を示し、図６中のスケールバーは２０μｍを示している。黒矢頭は、抗体陽性となっている微小血管を示している。図７は、一視野（×４００）における、抗体陽性となる微小血管の数をカウントし、コントロール群とヘモグロビン－アルブミン複合体投与群で棒グラフにて比較している。自己赤血球が灌流する微小血管の数は、再灌流１５分後、２時間後、６時間後で時間を追うごとに有意に低下していた。一方、ヘモグロビン－アルブミン複合体が灌流する微小血管の数は、再灌流１５分後、２時間後、６時間後と時間が経過しても変化はなく、時間が経過しても微小血管において灌流が保たれていることが示唆された。
（７）微小血管の形態変化
　ヘモグロビン－アルブミン複合体の灌流評価の際と同様に、摘出した脳をパラフィン切片とし、免疫組織学的染色にて再灌流超急性期における再灌流領域の微小血管の血管内径変化の定量化を行った。抗Ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ　Ｆａｃｔｏｒ抗体を用いて、血管内皮細胞を免疫染色し、血管内径（微小血管径）及び血管周囲腔の長さを計測し（図８）、ヘモグロビン－アルブミン複合体投与群とコントロール群で比較した。図８は、微小血管径に対する血管周囲腔と微小血管径との差の比率（％）の測定方法を示している。血管内径１５μｍ以下の微小血管を計測対象とした。結果を図９、１０に示す。図９では、×４００で検鏡した所見を示している。図１０では、コントロール群では、再灌流２時間後、６時間後と時間の経過と共に微小血管内径の狭小化と微小血管径に対する血管周囲腔と微小血管径との差の比率の上昇を認め、再灌流超急性期における血管周囲腔の膨化による血管狭小化を認めた。一方、ヘモグロビン－アルブミン複合体投与群は、コントロール群に比較して、再灌流６時間後には有意に血管径の狭小化抑制及び微小血管径に対する血管周囲腔と微小血管径との差の比率の上昇抑制を認め、ヘモグロビン－アルブミン複合体が血管周囲のアストロサイトの膨化抑制を来していることが示唆された。
（８）脳組織分圧と脳血流量
　再灌流超急性期（ＭＣＡＯ直前、ＭＣＡＯ直後、再灌流直前、再灌流直後、２時間後、６時間後）における再灌流領域における脳組織酸素分圧と脳血流量の変化を計測し定量化した。脳組織酸素分圧の測定には、組織酸素分圧測定装置（ＰＯＧ－２０３、Ｕｎｉｑｕｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｔｏｋｙｏ）を用いた。ラットのブレグマ（矢状縫合と冠状縫合の交点）から後方３ｍｍ、右外側３ｍｍの場所に頭蓋骨に小孔を穿ち、脳表から３ｍｍの位置に酸素電極を刺入しペナンブラ領域の酸素組織分圧を計測した。脳血流量は前述のレーザー血流計（ＦＬＯ－Ｃ１；Ｏｍｅｇａｗａｖｅ）を使用し、プローブを右中大脳動脈領域の硬膜越しに当てて計測した。結果を図１１に示す。コントロール群では、再灌流２時間後から６時間後にかけて急激な脳血流量・脳組織酸素分圧の低下をきたし、再灌流６時間後にはヘモグロビン－アルブミン複合体投与群に比較して有意にペナンブラ領域の脳血流量・脳組織酸素分圧の低下を認めた。この結果により、ヘモグロビン－アルブミン複合体投与群は、再灌流超急性期においてペナンブラ領域の脳血流及び脳組織酸素分圧の低下を抑制し、維持することが示唆された。
　以上の結果から、コントロール群と比較して、ヘモグロビン－アルブミン複合体投与群では、再灌流超急性期のペナンブラ領域における、ヘモグロビン－アルブミン複合体の持続的で良好な微小循環での灌流・微小血管の狭小化の抑制・脳血流量と脳組織酸素分圧の維持が認められた。再灌流超急性期の、アストロサイトの膨化による微小血管狭小化は虚血再灌流障害を増悪させる重要な病態の一つとされている。ヘモグロビン－アルブミン複合体は、再灌流超急性期の微小血管の狭小化を抑制し、脳血流量を維持することにより酸素を運搬し、脳組織の虚血状態を改善させることができると考えられた。
（実施例２及び比較例２）
（１）治療剤の調製
－調製例４：治療剤Ｂの調製－
　ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ　ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（ＬＥＨ）を含有する治療剤Ｂを、下記の方法で調製した。
　水素添加大豆ホスファチジルコリン１８２ｇ、コレステロール８９ｇ、ステアリン酸６５ｇから成る均一混合脂質に水３３６ｇを加えて、８０℃で３０分間加温して水和膨潤均一混合脂質を調製した。期限切れ濃厚赤血球製剤からヘモグロビンを精製、濃縮し、イノシトールヘキサリン酸をヘモグロビンに対して等モル添加したヘモグロビン濃度４５ｗ／ｗ％の濃厚高純度ヘモグロビン溶液を調製した。前記水和膨潤均一混合脂質６７２ｇに前記濃厚高純度ヘモグロビン溶液２，６８８ｇを添加し、４５℃以下の温度で、高速攪拌法により乳化し、ヘモグロビン含有リポソーム混合乳化液を得た。前記乳化液を生理食塩水により希釈して、孔径０．４５μｍの膜による循環濾過により粒子径の制御を行なった。更に、分画分子量３０万の限外濾過による循環濾過システムを用いて、生理食塩水による加水濃縮操作で、リポソームに含有されなかったヘモグロビン及びイノシトールヘキサリン酸を除去、濃縮し、ヘモグロビン含有リポソームの生理食塩水による懸濁液を得た。
　さらに、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－フォスファチジルエタノールアミンの生理食塩水溶液に上記ヘモグロビン含有リポソーム懸濁液を加え、ヘモグロビン濃度が６ｇ／ｄＬのヘモグロビン含有ＰＥＧ修飾リポソームの生理食塩水による懸濁液（治療剤Ｂ）を得た。
　治療剤Ａ及び治療剤Ｂのヘモグロビン成分濃度、ヘモグロビン－アルブミン複合体及びＬＥＨの粒径、ヘモグロビン－アルブミン複合体及びＬＥＨの表面電荷、並びに、ヘモグロビン－アルブミン複合体及びＬＥＨの酸素飽和性を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
（２）虚血再灌流試験
　８－９週齢のラット（Ｓｐａｒａｇｕｅ－Ｄａｗｅｌｙ　Ｒａｔ（ＳＤ　Ｒａｔ）の雄２８０－３２０ｇ）をイソフルレン吸入麻酔下に置き、糸栓子（４－０ナイロン糸にシリコンコートしたもの）を内頚動脈から挿入し、中大脳動脈起始部を閉塞するまで上行させて糸栓子を固定し、中大脳動脈領域に虚血状態を完成させた。虚血中の脳血流量の低下はレーザー血流計（ＦＬＯ－Ｃ１；Ｏｍｅｇａｗａｖｅ）で確認し、前値の３０％に低下したものだけをそのあとの実験に用いた。２時間の虚血後に再度ラットを麻酔下に置き、糸栓子を抜去し再灌流状態を作成した。再灌流では糸栓子が挿入されていた内頚動脈に新たに輸液のためのチューブ（ＰＥ１０チューブ）を挿入し、虚血が生じていた領域に経動脈的に、治療剤Ａ又は治療剤Ｂを表２に記載の条件で投与した（実施例２、比較例２）。また、治療剤を投与せず糸栓子を抜去した群を、コントロール群とした。
　再灌流から２４時間後に安楽死させて脳を摘出して、ＴＴＣ染色による病理評価に用いた。治療剤の投与を行わなかったコントロール群のラットの脳梗塞面積を１００％としたときの、実施例２及び比較例２の脳梗塞面積の相対割合（％）を測定した。脳梗塞面積の相対割合が低いほど、脳の虚血傷害が軽減されたことを示す。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
　実施例２と比較例２とを比較すると、本発明の治療剤である治療剤Ａを一過性中大脳動脈閉塞モデルラットに投与すると、ＬＥＨを有効成分とする治療剤Ｂを投与するよりも、梗塞による組織障害を著しく軽減できた。
　本発明により、虚血再灌流傷害を低減し組織保護効果を示す、虚血性疾患の治療剤を提供できる。
　　１０　ヘモグロビン
　　２０　アルブミン
　１００　ヘモグロビン－アルブミン複合体

Claims (19)

  1. 　コアとしてのヘモグロビンに架橋剤を介してシェルとしてのアルブミンを結合してなる、ヘモグロビン－アルブミン複合体を有効成分とする、虚血性疾患の治療剤。
  2. 　前記虚血性疾患が、虚血性脳血管障害、虚血性心疾患、虚血性肺疾患、虚血性腎症、虚血性肝炎、及び四肢虚血性疾患の群から選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の虚血性疾患の治療剤。
  3. 　前記虚血性疾患が、脳梗塞である、請求項１に記載の虚血性疾患の治療剤。
  4. 　赤血球で酸素の送達ができない組織に、酸素を送達するために投与する、請求項１～３の何れか１項に記載の虚血性疾患の治療剤。
  5. 　血管閉塞又は血管狭窄を解消する処置と併用しないで用いられる、請求項１～３の何れか１項に記載の虚血性疾患の治療剤。
  6. 　血管閉塞又は血管狭窄を解消する処置と併用して用いられる、請求項１～３の何れか１項に記載の虚血性疾患の治療剤。
  7. 　再開通治療時または虚血再灌流後に血管内に投与され、虚血再灌流傷害を軽減するために用いる、請求項６に記載の虚血性疾患の治療剤。
  8. 　脳梗塞体積及び脳浮腫体積について、通常の再灌流をした個体と、再灌流と共に請求項３に記載の治療剤を投与した個体とを比較したときに、請求項３に記載の治療剤を投与した個体の脳梗塞体積及び／又は脳浮腫体積が、通常の再灌流をした個体の脳梗塞体積及び／又は脳浮腫体積より有意に小さい、請求項３に記載の虚血性疾患の治療剤。
  9. 　脳梗塞部位における４－ＨＮＥの存在量及びマトリックスメタロプロテアーゼ－９の発現量について、通常の再灌流をした個体と、再灌流と共に請求項３に記載の治療剤を投与した個体とを比較したときに、請求項３に記載の治療剤を投与した個体の４－ＨＮＥの存在量及び／又はマトリックスメタロプロテアーゼ－９の発現量が、通常の再灌流をした個体の４－ＨＮＥの存在量及び／又はマトリックスメタロプロテアーゼ－９の発現量より有意に低い、請求項３に記載の虚血性疾患の治療剤。
  10. 　脳梗塞後の神経障害について、通常の再灌流をした個体と、再灌流と共に請求項３に記載の治療剤を投与した個体とを比較したときに、請求項３に記載の治療剤を投与した個体の神経障害が、通常の再灌流をした個体の神経障害より有意に改善される、請求項３に記載の虚血性疾患の治療剤。
  11. 　個体への１回あたりの投与量が、ヘモグロビン成分として個体の体重１ｋｇあたり１００～１０００ｍｇである、請求項１～１０の何れか１項に記載の虚血性疾患の治療剤。
  12. 　前記ヘモグロビン－アルブミン複合体の粒径の平均が、３０ｎｍ以下である、請求項１～１１の何れか１項に記載の虚血性疾患の治療剤。
  13. 　前記ヘモグロビン－アルブミン複合体が、前記ヘモグロビンにおける架橋剤との結合部位がリシンであり、前記アルブミンにおける架橋剤との結合部位がシステイン３４である、請求項１～１２の何れか１項に記載の虚血性疾患の治療剤。
  14. 　前記ヘモグロビンと前記架橋剤との結合がアミド結合であり、前記アルブミンと前記架橋剤との結合がスルフィド結合及びジスルフィド結合のいずれかである、請求項１３に記載の虚血性疾患の治療剤。
  15. 　前記ヘモグロビン－アルブミン複合体の前記アルブミンの数が１個～７個である、請求項１～１４の何れか１項に記載の虚血性疾患の治療剤。
  16. 　前記ヘモグロビンが、ヒトヘモグロビン、ウシヘモグロビン、ブタヘモグロビン、ウマヘモグロビン、イヌヘモグロビン、ネコヘモグロビン、ウサギヘモグロビン、組換えヒトヘモグロビン、及び分子内架橋ヘモグロビンからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１～１５の何れか１項に記載の虚血性疾患の治療剤。
  17. 　前記アルブミンが、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ブタ血清アルブミン、ウマ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン、ネコ血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、組換えヒト血清アルブミン、組換えウシ血清アルブミン、組換えイヌ血清アルブミン、組換えネコ血清アルブミン、からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１～１６の何れか１項に記載の虚血性疾患の治療剤。
  18. 　前記架橋剤が、下記一般式（１）～（３）及び化学式（１）で表される化合物からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１４に記載の虚血性疾患の治療剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     　一般式（１）中、Ｒ1は、水素原子及びＳＯ3 -Ｎａ+のいずれかを表し、ｎは、１～１０の整数を表す。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     　一般式（２）中、ｎは、１～１０の整数を表す。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     　一般式（３）中、Ｒ2は、水素原子及びＳＯ3 -Ｎａ+のいずれかを表し、ｎは、１～１０の整数を表す。
  19. 　前記架橋剤が、下記一般式（４）で表される化合物である、請求項１４に記載の虚血性疾患の治療剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     　一般式（４）中、Ｒ3は、水素原子及びＳＯ3 -Ｎａ+のいずれかを表し、Ｒ4は、下記一般式（５）～（６）及び下記化学式（２）～（４）のいずれかを表す。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     　一般式（５）中、ｎは、１～１０の整数を表す。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     　一般式（６）中、ｎは、２、４、６、８、１０又は１２の整数を表す。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
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