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WO2018080038A1 - 에티오나마이드를 이용한 줄기세포 증식능 향상 방법 - Google Patents

에티오나마이드를 이용한 줄기세포 증식능 향상 방법 Download PDF

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WO2018080038A1
WO2018080038A1 PCT/KR2017/010772 KR2017010772W WO2018080038A1 WO 2018080038 A1 WO2018080038 A1 WO 2018080038A1 KR 2017010772 W KR2017010772 W KR 2017010772W WO 2018080038 A1 WO2018080038 A1 WO 2018080038A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
stem cells
ethionamide
umbilical cord
medium
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2017/010772
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
나덕렬
장종욱
손효진
명수현
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Samsung Life Public Welfare Foundation
Original Assignee
Samsung Life Public Welfare Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020170125324A external-priority patent/KR101985095B1/ko
Application filed by Samsung Life Public Welfare Foundation filed Critical Samsung Life Public Welfare Foundation
Priority to US16/627,875 priority Critical patent/US20200131480A1/en
Publication of WO2018080038A1 publication Critical patent/WO2018080038A1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to US18/152,464 priority patent/US12195760B2/en
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0665—Blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. from umbilical cord blood
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere

Definitions

  • the present invention relates to a medium composition for improving stem cell proliferation comprising ethionamide, and use thereof.
  • Mesenchymal stem cells are known to be involved in tissue regeneration, treatment, and immune response, as well as their multipotency, and by using such characteristics to separate and culture mesenchymal stem cells from umbilical cord blood, bone marrow, etc. Efforts have been made to develop it. However, as the stem cells are passaged, aging progresses and cell differentiation occurs, so there is a problem of losing stem cell ability (stemness).
  • the present inventors have conducted intensive studies on methods for inhibiting aging of stem cells and improving cell survival and proliferation rate, and thus, ethionamide, known as an antibiotic, can effectively propagate stem cells.
  • the present invention was completed by discovering.
  • an object of the present invention is to provide a stem cell survival / proliferation medium composition comprising ethionamide, and its use.
  • the present invention provides a medium composition for improving stem cell proliferation, comprising ethionamide.
  • the ethionamide is characterized in that contained in the medium at a concentration of 1 to 500 ⁇ M.
  • the medium is characterized in that the fetal bovine serum (FBS) and gentamicin (gentamicin) added ⁇ -MEM (Minimum Essential Media) medium.
  • FBS fetal bovine serum
  • gentamicin gentamicin
  • ⁇ -MEM Minimum Essential Media
  • the stem cells are characterized in that the embryonic stem cells or adult stem cells.
  • the adult stem cells are mesenchymal stem cells derived from one or more tissues selected from the group consisting of umbilical cord, umbilical cord blood, bone marrow, fat, muscle, nerve, skin, amniotic membrane and placenta. It features.
  • the present invention also provides a method for improving stem cell proliferation, comprising culturing stem cells in the medium composition.
  • the present invention also provides a stem cell obtained by the above method, improved proliferative capacity.
  • the stem cells are mesenchymal stem cells derived from one or more tissues selected from the group consisting of umbilical cord, umbilical cord blood, bone marrow, fat, muscle, nerves, skin, amniotic membrane and placenta. do.
  • the present invention it is possible to mass-produce the next generation of high efficiency stem cells through a simple and safe method of controlling the culture environment without using genetic manipulations or viral vectors.
  • Fig. 1 is a BrdU assay confirming the improvement of proliferation of human mesenchymal stem cells by ethionamide treatment, the human umbilical cord according to the treatment concentration (Fig. 1a) and the treatment time (Fig. 1b) of ethionamide. This is a result of comparing the proliferation rate of mesenchymal stem cells.
  • FIG. 2 is a flow cytometry result confirming surface antigen expression of human mesenchymal stem cells by ethionamide treatment, which is a control group cultured without treatment with ethionamide and a human umbilical cord intermediate Leaf stem cells (Ethionamide-primed MSCs) is a result of comparing the expression of the positive markers (Fig. 2a) and negative markers (Fig. 2b) of human mesenchymal stem cells.
  • Figure 3 shows the differentiation ability of human mesenchymal stem cells by ethionamide treatment, a control (cultivation) without treatment with ethionamide and human umbilical cord mesenchymal stem cells (Ethionamide-)
  • the results show the differentiation efficiency of adipocytes (FIG. 3A), osteocytes (FIG. 3B), and chondrocytes (FIG. 3C) of primed MSCs.
  • the present invention provides a medium composition for improving stem cell proliferation, comprising ethionamide.
  • ethionamide (2-ethylpyridine-4-carbothioamide) has been known to be used for treating infectious diseases caused by bacteria as a thionamide-based antibiotic, but the present invention first discovers the use of ethionamide to improve stem cell performance. It was.
  • the present inventors confirmed the ability to enhance the proliferation of stem cells by treatment with ethionamide through specific examples.
  • the concentration of the treatment was 50 uM or more. It was confirmed that the proliferation of the mesenchymal stem cells significantly increased, and when the ethionamide was treated for 72 hours, it was confirmed that the highest growth efficiency was shown (see Example 2).
  • the concentration of ethionamide contained in the medium is not limited, but may be preferably included in a concentration of 1 to 500 uM, more preferably 50 to 500 uM, and more preferably in a concentration of 100 uM. Can be.
  • fetal bovine serum (FBS) and gentamicin are preferably ⁇ -MEM (Minimum Essential Media) medium, and more preferably the fetal bovine serum is 10 %, Gentamycin may be included at a concentration of 50 ug / ml.
  • 'stem cell' refers to a cell having an ability to differentiate into two or more different types of cells while having an autologous ability as an undifferentiated cell.
  • Stem cells of the present invention may be autologous or allogeneic stem cells, may be from any type of animal, including humans and non-human mammals, and is not limited to whether the stem cells are derived from adults or embryos Do not.
  • Stem cells of the present invention include embryonic stem cells or adult stem cells, preferably adult stem cells.
  • the adult stem cells may be mesenchymal stem cells, human tissue-derived mesenchymal stromal cells, human tissue-derived mesenchymal stem cells, multipotent stem cells or amniotic epithelial cells, preferably mesenchymal stem cells
  • the mesenchymal stem cells may be mesenchymal stem cells derived from umbilical cord, umbilical cord blood, bone marrow, fat, muscle, nerve, skin, amnion, and placenta, but is not limited thereto.
  • 'Wharton's Jelly-derived stem cells' includes all stem cells that are properly separated from each other, and a line connecting the mother and the embryo so that the mammalian fetus can grow in the placenta. In general, it may mean three vessels surrounded by Wharton's Jelly, that is, a tissue consisting of two umbilical arteries and one umbilical vein.
  • the term 'placenta-derived stem cells' includes all stem cells separated from the placenta, and preferably, four types of stem cells separated from the human placenta separated in vitro.
  • Cells human chorionic mesenchymal stromal cells or human chorionic mesenchymal stem cells (hCMSC)
  • hCTC human chorionic trophoblastic cells
  • Isolation of mesenchymal stem cells can be performed by methods known to those skilled in the art, for example, by Pittenger et al. (Science 284: 143, 1997) and van et al. (J. Clin. Invest., 58: 699, 1976). It can be separated by the method disclosed in the literature.
  • Stem cell proliferation improvement in the present invention includes the meaning that stem cell characteristics are maintained by suppressing cell aging and improving cell proliferation ability and protein homeostasis, thereby increasing expression of stem cell markers such as Nanog, Oct4 or KLF4 genes. Can be. These genes are known as genes that play an important role in maintaining the pluripotency of stem cells expressed in embryonic stem cells, that is, stem cell characteristics.
  • the present invention provides a method for improving stem cell proliferation, comprising a step of culturing stem cells in the medium composition, and a stem cell having improved proliferation ability.
  • the present invention also provides a cell therapeutic agent for treating various diseases, including the stem cells.
  • Human umbilical cord mesenchymal stem cells were obtained by umbilical cord according to the criteria approved by IRB (IRB # 2015-09-023-003) of Samsung Seoul Hospital, and then the mesenchymal stem cells were separated by the following method.
  • the human umbilical cord mesenchymal stem cells (1 ⁇ 10 4 cells) prepared according to the method of Example 1 were dispensed into 96 well plates and cultured for 24 hours. Thereafter, ethionamide was treated at various concentrations (1 to 500 ⁇ M) and after 72 hours, a cell proliferation assay was performed. To this end, it was analyzed by BrdU cell proliferation assay kit (Cell Signaling Technology, USA) using 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) which is bound during DNA synthesis of cells. Specifically, BrdU was added to the cells and allowed to react for 24 hours, after which the cells were fixed and denatured.
  • BrdU 5-bromo-2'-deoxyuridine
  • the cells were treated with an Anti-BrdU antibody, reacted with a TMB (Tetramethylbenzidine) substrate using a secondary antibody connected with a horse-radish peroxidase (HRP), and the absorbance value was measured at 450 nm with an ELISA reader.
  • TMB Tetramethylbenzidine
  • HRP horse-radish peroxidase
  • FACS fluorescence-activated cell sorting
  • human umbilical cord mesenchymal stem cells (2 ⁇ 10 5 ) are equally divided into 1.5 ml microtubes and treated with 100 ⁇ l of PBS (phosphate-buffered saline) containing 2% FBS, followed by fluorescein isothiocyanate (FITC). ), PE (phycoerythrin) or APC (allophycocyanin) containing the antibody was treated and reacted for 20 minutes at room temperature.
  • expression was observed using CD44, CD73, CD90, CD105, CD166, CD11b, CD14, CD19, CD34, CD45, and HLA-DR antibodies including positive and negative markers.
  • the antibody reaction was neutralized with PBS containing 2% FBS, and the expression of positive and negative markers was confirmed by flow cytometry.
  • Example 3 In addition to the results of Example 3, in order to determine whether the differentiation capacity of human umbilical cord mesenchymal stem cells treated with ethionamide is well maintained, the differentiation is induced after adduction into adipocytes, bone cells, and chondrocytes, respectively. The extent was quantified.
  • human umbilical mesenchymal stem cells (1 ⁇ 10 5 ) cultured in ethionamide-treated medium to induce differentiation into adipocytes or osteocytes were dispensed into 6 well plates, followed by adipogenesis and osteogenesis differentiation.
  • the kit (Gibco, USA) was used to induce differentiation for about 3 weeks while changing medium twice a week. Thereafter, oil red O staining and Alizarin Red S staining were performed on the cells differentiated into adipocytes and osteocytes, respectively.
  • To quantify the adipocytes remove all medium from the differentiated culture vessels, dry them completely, add 100% isopropanol, and incubate for 10 minutes at room temperature.
  • chondrocyte induction medium high-glucose DMEM (Biowest, France), 100 nM dexamethasone (dexamethasone, Sigma-Aldrich, USA), 50 mg / mL L-ascorbic acid (Sigma-Aldrich, USA), 100 mg / mL sodium pyruvate (Sigma-Aldrich, USA), 40 mg / mL L-proline (L -proline, Sigma-Aldrich, USA), 10 ng / mL TGF- ⁇ 3 (transforming growth factor ⁇ 3, R & D Systems, USA), 500 ng / mL BMP-6 (bone morphogenic protein 6, R & D Systems, USA), 50 mg / mL ITS + premix (Becton Dickinson, USA)) induced differentiation for about 4 weeks.
  • chondrocytes differentiated into chondrocytes were fixed with OCT compound (Tissue-Tek, USA), cut to 10 ⁇ m thickness, and the slide sections were stained with 0.1% safranin-O solution. It was confirmed. In addition, quantification of chondrocytes was quantified staining degree using the Image J analysis program (National Institutes of Health, USA).
  • human umbilical cord mesenchymal stem cells (Ethionamide-primed MSCs) cultured with ethionamide as shown in FIGS. 3A to 3C were compared with controls without ethionamide treatment, respectively.
  • the differentiation of adipocytes, bone cells, and chondrocytes was confirmed well.
  • Ethionamide according to the present invention is to effectively improve the proliferation of cells while maintaining the properties of human mesenchymal stem cells, the media composition comprising the ethionamide and the same are the basic research, therapeutic agent And it is expected to be useful to secure a large amount of high quality stem cells in related industries such as cosmetic development.

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Abstract

본 발명은, 에티오나마이드(ethionamide)를 포함하는 줄기세포 증식 향상용 배지 조성물, 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 유전자 조작이나 바이러스 벡터 등을 사용하지 않으면서 배양환경 조절이라는 간편하고도 안전한 방법을 통하여, 차세대 고효율 줄기세포를 대량 생산할 수 있다.

Description

에티오나마이드를 이용한 줄기세포 증식능 향상 방법
본 발명은, 에티오나마이드(ethionamide)를 포함하는 줄기세포 증식 향상용 배지 조성물, 및 이의 용도에 관한 것이다.
중간엽 줄기세포는 그 다분화능과 함께, 조직의 재생, 치료 및 면역 반응에 관여하는 세포로 알려져 있어, 이와 같은 특성을 이용하여 제대혈, 골수 등으로부터 중간엽 줄기세포를 분리 배양하여 다양한 질환의 치료제로 개발하고자 하는 노력이 있어왔다. 그러나 줄기세포를 계대배양함에 따라 노화가 진행되며 세포 분화가 일어나므로 줄기세포능(stemness)을 잃게 되는 문제가 있다.
즉, 윤리적인 문제가 없는 성체줄기세포를 이용한 세포치료제의 개발을 위해서는, 세포의 줄기세포능을 유지하면서 효과적으로 증식시킬 수 있는 방법을 확립하는 것이 필수적이나, 성체줄기세포는 증식율이 낮고, 쉽게 노화되어 한 조직에서 얻을 수 있는 세포의 수가 한정적이라는 한계가 있다.
이러한 문제를 해결하여 줄기세포 효율을 증진시키기 위한 방안으로서, 바이러스 벡터를 이용한 유전자 조작이나 특정 단백질을 과발현시키는 방법이 제안되어 왔으나(한국 등록특허, KR10-1101835), 이는 안정성 문제로 인하여 임상 적용에는 한계가 있는 바, 1세대 줄기세포 연구를 통해 특정질환 치료를 위한 임상적용 가능성은 검증되었으나 낮은 효율과 효과기전 규명이 미흡하고 안전성 확보 또한 해결되지 않고 있다.
이와 관련하여, 최근 분화세포(differentiated cell)에 비하여 배아줄기세포(ESC)와 유도만능줄기세포(iPS)에서 해당(glycolysis) 대사과정이 증가하고 산화적 인산화(oxidative phosphorylation) 대사과정이 감소되어 있음이 보고됨으로써, 대사과정을 조절하는 리프로그래밍(reprogramming)을 통해 줄기세포의 줄기세포능(stemness) 유지 및 세포 노화억제를 통한 고효율 줄기세포 개발 가능성이 제시되고 있다. 그러나 이에 대한 분자생물학적 기전은 거의 밝혀지지 않았으며, 아직 효율적인 조절기술은 개발되지 못하고 있는 실정이다.
이에, 본 발명자는 줄기세포의 노화를 억제하고 세포 생존 및 증식율을 향상시킬 수 있는 방법에 대하여 예의 연구한 결과, 종래 항생제로 알려져 있는 에티오나마이드(ethionamide)가 줄기세포를 효과적으로 증식시킬 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은, 에티오나마이드(ethionamide)를 포함하는, 줄기세포 생존/증식 향상용 배지 조성물, 및 이의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은, 에티오나마이드(ethionamide)를 포함하는, 줄기세포 증식 향상용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예로서, 상기 에티오나마이드는 배지에 1 내지 500 μM의 농도로 포함되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구체예로서, 상기 배지는 소태아혈청(FBS) 및 젠타마이신(gentamicin)이 첨가된 α-MEM(Minimum Essential Media) 배지인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구체예로서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구체예로서, 상기 성체줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 배지 조성물에 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포 증식 향상방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 얻어진, 증식능이 향상된 줄기세포를 제공한다.
본 발명의 일 구체예로서, 상기 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의하면, 유전자 조작이나 바이러스 벡터 등을 사용하지 않으면서 배양환경 조절이라는 간편하고도 안전한 방법을 통하여, 차세대 고효율 줄기세포를 대량 생산할 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면, 줄기세포의 대사 과정을 선택적으로 조절할 수 있는 분자생물학적 기전, 대사조절 마커를 규명함으로써 고효율 줄기세포 개발에 대한 새로운 방법론을 제시할 수 있다.
도 1은, 에티오나마이드 처리에 의한 인간 중간엽 줄기세포의 증식 향상을 검증한 BrdU 어세이 결과로서, 에티오나마이드의 처리 농도(도 1a) 및 처리 시간(도 1b)에 따른 인간 제대 중간엽 줄기세포의 증식률을 비교한 결과이다.
도 2는, 에티오나마이드 처리에 의한 인간 중간엽 줄기세포의 표면 항원 발현을 검증한 유세포 분석 결과로서, 에티오나마이드를 처리하지 않고 배양한 대조군(Control) 및 처리하여 배양한 인간 제대 중간엽 줄기세포(Ethionamide-primed MSCs)에 대하여 인간 중간엽 줄기세포의 양성 마커(도 2a) 및 음성 마커(도 2b)의 발현양상을 비교한 결과이다.
도 3은, 에티오나마이드 처리에 의한 인간 중간엽 줄기세포의 분화능 검증 결과로서, 에티오나마이드를 처리하지 않고 배양한 대조군(Control) 및 처리하여 배양한 인간 제대 중간엽 줄기세포(Ethionamide-primed MSCs)의 지방세포(도 3a), 골세포(도 3b), 및 연골세포(도 3c)로의 분화효율을 나타낸 결과이다.
본 발명은, 에티오나마이드를 포함하는, 줄기세포 증식 향상용 배지 조성물을 제공한다.
종래, 에티오나마이드(2-ethylpyridine-4-carbothioamide)는 티오나마이드 계열의 항생제로서 세균에 의한 감염 질환 치료 용도가 알려져 있었으나, 본 발명에서는 에티오나마이드의 줄기세포능 향상 용도를 최초로 발견하였다.
[ethionamaide]
Figure PCTKR2017010772-appb-I000001
본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 에티오나마이드 처리에 의한 줄기세포의 증식 향상능을 확인하였다.
본 발명의 일실시예에서는, 에티오나마이드를 다양한 농도 즉, 1, 10, 50, 100, 및 500 uM의 농도로 처리한 배지에서 인간 제대 중간엽 줄기세포를 배양하였을 때 50 uM 이상의 처리농도에서 상기 중간엽 줄기세포의 증식이 유의하게 증가하는 것을 확인하였고, 에티오나마이드를 72시간 동안 처리하는 경우 증식향상 효율이 가장 높게 나타나는 것을 확인하였다(실시예 2 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 에티오나마이드를 처리하여 배양한 인간 제대 중간엽 줄기세포의 표면 항원의 발현양상을 분석하여 에티오나마이드를 처리하지 않은 대조군과 동일한 것을 확인하였고, 또한 지방세포, 골세포, 및 연골세포로 분화를 유도하여 대조군과 분화능에 차이가 없는 것을 통해 중간엽 줄기세포의 특성이 잘 유지되는 것을 확인하였다(실시예 3 및 4 참조).
상기 결과들은 에티오나마이드 처리를 통해 인간 중간엽 줄기세포의 특성은 그대로 유지하면서 증식을 효과적으로 향상시킬 수 있음을 보여주는 것이다.
본 발명에서 배지에 포함되는 에티오나마이드의 농도에 제한은 없으나, 바람직하게는 1∼500 uM의 농도, 보다 바람직하게는 50~500 uM로 포함될 수 있으며 더욱 바람직하게는 100 uM의 농도로 포함될 수 있다.
본 발명에서 세포 배양에 이용되는 배지에 제한은 없으나, 예컨대 소태아혈청(FBS) 및 젠타마이신이 첨가된 α-MEM(Minimum Essential Media) 배지인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게 상기 소태아혈청은 10%, 젠타마이신은 50 ug/ml의 농도로 포함될 수 있다.
본 발명에서 '줄기세포'란 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다. 본 발명의 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있으며, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있고, 상기 줄기세포가 성체로부터 유래된 것이든 배아로부터 유래된 것이든 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 포함하며, 바람직하게는 성체 줄기세포이다. 상기 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 또는 양막상피세포일 수 있으며, 바람직하게는 중간엽 줄기세포이나, 이에 한정되지 않는다. 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반 등으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서, '제대-유래 줄기세포(Wharton's Jelly-derived stem cells)'라 함은 제대로부터 분리된 줄기세포를 모두 포함하며, 포유류의 태아가 태반에서 성장할 수 있도록 모체와 배를 연결해주는 줄을 의미할 수 있으며, 일반적으로 와튼 젤리(Wharton's Jelly)로 둘러싸인 3개의 혈관, 즉, 2개의 배꼽 동맥과 1개의 배꼽 정맥으로 구성된 조직을 의미할 수 있다.
본 발명에서, '태반-유래 줄기세포(placenta-derived stem cells)'라 함은 태반으로부터 분리된 줄기세포를 모두 포함하며, 바람직하게는 체외로 분리된 인간의 태반으로부터 분리된 4종류의 줄기세포, 즉 (1) 양막 상피세포(human amniotic epithelial cells, hAEC), (2) 양막에서 유래한 중간엽 줄기세포(human amniotic mesenchymal stromal cells 또는 human amniotic mesenchymal stem cells, hAMSC), 3) 융모막 중간엽 줄기세포(human chorionic mesenchymal stromal cells 또는 human chorionic mesenchymal stem cells, hCMSC), 및 (4) 융모 영양막 세포(human chorionic trophoblastic cells, hCTC)를 포함한다.
중간엽줄기세포의 분리는 당업자에게 자명한 방법으로 수행될 수 있으며, 예를 들면, Pittenger 등(Science 284: 143, 1997)와 van 등(J. Clin. Invest., 58: 699, 1976)의 문헌들에 개시되어 있는 방법으로 분리할 수 있다.
본 발명에서 줄기세포 증식 향상이란, 세포노화가 억제되고 세포증식능 및 단백질 항상성이 향상됨으로써 줄기세포 특성이 유지되는 의미를 포함하며, 이에 의해 줄기세포 마커인 Nanog, Oct4 또는 KLF4 유전자 등의 발현이 증가될 수 있다. 이들 유전자는 배아줄기세포에서 많이 발현하는 줄기세포의 전분화능, 즉 줄기세포 특성을 유지하는데 중요한 역할을 하는 유전자로 알려져 있다.
또한, 본 발명은 상기 배지 조성물에 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 증식 향상방법, 및 이에 의해 얻어진 증식능이 향상된 줄기세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 줄기세포를 포함하는, 다양한 질환 치료용 세포 치료제를 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 인간 제대 중간엽 줄기세포의 준비
인간 제대 중간엽 줄기세포는 삼성서울병원의 IRB(IRB# 2015-09-023-003)에 의해 승인된 기준에 따라 탯줄을 확보한 후, 다음의 방법으로 중간엽 줄기세포를 분리하였다.
우선, 3-4 cm의 탯줄 조직을 잘게 자르고, 세포 외 기질을 분해하기 위해 콜라게나아제 용액(Gibco, USA)을 60-90분 동안 처리한 후, 0.25% 트립신(Gibco, USA)을 넣고 30분 동안 37℃에서 분해시켰다. 이후, 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)(Biowest, USA)을 넣고 1000×g에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 얻고, 10% FBS와 50 ug/ml 젠타마이신(Gibco, USA)이 첨가된 MEM 배지(Minimum Essential Media) (Gibco, USA)를 이용하여 37℃, 5% CO2 환경에서 세포를 배양하여, passage 5 또는 6의 중간엽 줄기세포를 실험에 사용하였다.
실시예 2. 인간 중간엽 줄기세포의 증식 향상 확인
에티오나마이드 처리에 따른 세포 증식 향상효과를 알아보기 위해, 상기 실시예 1의 방법에 따라 준비한 인간 제대 중간엽 줄기세포(1×104 세포)를 96 well plate에 분주하여 24시간 동안 배양한 후, 에티오나마이드를 다양한 농도(1~500 μM)로 처리하고 72시간 후에 세포증식 분석을 수행하였다. 이를 위해, 세포의 DNA 합성 시에 결합되는 5-bromo-2'-deoxyuridine(BrdU)를 이용한 BrdU cell proliferation assay kit(Cell Signaling Technology, USA)로 분석하였다. 구체적으로는, BrdU를 세포에 첨가하고 24시간 동안 반응시킨 후 세포를 고정하고 DNA를 변성시켰다. 다음으로 상기 세포에 Anti-BrdU 항체를 처리하고, HRP(horse-radish peroxidase)가 연결된 2차 항체를 사용하여 TMB(Tetramethylbenzidine) 기질과 반응시킨 후, ELISA reader로 450 nm에서 흡광도 수치를 측정하였다.
그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 에티오나마이드를 50 uM 이상으로 처리하였을 때 세포의 증식률이 유의하게 향상된 것을 확인하였다. 또한, 에티오나마이드를 각각 10 uM 또는 100 uM로 처리하고 처리 시간에 따른 증식효율을 비교한 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이 에티오나마이드를 72시간 동안 처리하였을 때 가장 유의한 증식률 향상을 확인하였다.
실시예 3. 에티오나마이드가 처리된 인간 중간엽 줄기세포의 세포 표면 항원 분석
에티오나마이드 약물이 처리된 상태에서 배양한 인간 제대 중간엽 줄기세포의 특성을 확인하기 위하여, 유세포 분석(fluorescence-activated cell sorting; FACS)을 통해 상기 중간엽 줄기세포의 표면항원의 발현을 관찰하였다.
보다 구체적으로, 인간 제대 중간엽 줄기세포(2×105)를 1.5 ml 마이크로 튜브에 동등하게 나누어 담고 2% FBS가 포함된 PBS(phosphate-buffered saline)를 100 ㎕씩 처리한 후 FITC(fluorescein isothiocyanate), PE(phycoerythrin) 또는 APC(allophycocyanin)가 포함된 항체를 처리하고 상온에서 20분 동안 반응시켰다. 본 실시예에서는 양성, 음성 마커를 포함하여 CD44, CD73, CD90, CD105, CD166, CD11b, CD14, CD19, CD34, CD45, 및 HLA-DR 항체를 사용하여 발현여부를 관찰하였다. 상기 반응 후 2% FBS가 포함된 PBS로 항체 반응을 중화시킨 다음 유세포 분석기를 이용하여 양성과 음성 마커들의 발현여부를 확인하였다.
먼저 양성 마커인 CD44, CD73, CD90, CD105, CD166의 발현여부를 확인한 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이 에티오나마이드를 처리하지 않은 대조군(control)과 비교할 때 에티오나마이드를 처리하여 배양한 인간 중간엽 줄기세포(Ethionamide-primed MSCs)가 상기 마커들을 유사한 수준으로 발현하고 있는 것을 확인하였으며, 음성 마커인 CD11b, CD14, CD19, CD34, CD45, HLA-DR 역시 대조군과 동일하게 발현하지 않는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해 에티오나마이드를 처리하여 배양하였음에도 중간엽 줄기세포의 특성이 잘 유지되고 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 4. 에티오나마이드가 처리된 인간 중간엽 줄기세포의 분화능 분석
상기 실시예 3의 결과에 더하여, 에티오나마이드를 처리하여 배양한 인간 제대 중간엽 줄기세포의 분화능이 잘 유지되는지 알아보기 위해 각각 지방세포, 골세포, 및 연골세포로 분화를 유도한 후 분화정도를 정량화하였다.
구체적으로, 지방세포 또는 골세포로의 분화를 유도하기 위해 에티오나마이드가 처리된 배지에서 배양한 인간 제대 중간엽 줄기세포(1×105)를 6 well plate에 분주한 후 adipogenesis, osteogenesis differentiation kit(Gibco,USA)를 이용하여 1주일에 2회씩 배지를 교환하면서 약 3주 동안 분화를 유도하였다. 이후 지방세포와 골세포로 분화시킨 세포에 대하여 각각 Oil red O 염색과 Alizarin Red S 염색을 실시하여 지방세포 및 골세포로의 분화여부를 확인하였다. 지방세포의 정량화는 분화한 배양용기에서 배지를 모두 제거한 후 완전히 마르게 하여 100% 이소프로판올(isopropanol)을 넣고 상온에서 10분간 배양한 후 100% 이소프로판올과 분화된 세포가 골고루 섞이게 한 뒤 500 nm에서 흡광도를 측정하여 분화 정도를 수치화 하였다. 골세포의 정량화는 Alizarin Red S 염색 정량화 assay kit(Sciencell, USA)를 사용하여 분화 정도를 정량화 하였다.
한편, 연골세포로의 분화를 유도하기 위해서 15 ml 튜브에 5×105개의 pellet 상태의 세포를 연골세포 유도 배지(high-glucose DMEM(Biowest, France), 100 nM 덱사메타손(dexamethasone, Sigma-Aldrich, USA), 50 mg/mL L-아스코르브산(L-ascorbic acid, Sigma-Aldrich, USA), 100 mg/mL 피루브산 나트륨(sodium pyruvate, Sigma-Aldrich, USA), 40 mg/mL L-프롤린(L-proline, Sigma-Aldrich, USA), 10 ng/mL TGF-β3(transforming growth factor β3, R&D Systems, USA), 500 ng/mL BMP-6(bone morphogenic protein 6, R&D Systems, USA), 50 mg/mL ITS+ premix(Becton Dickinson, USA))로 약 4주 동안 분화를 유도하였다. 연골세포로 분화한 세포는 OCT compound(Tissue-Tek, USA)를 이용하여 고정시킨 후 10 μm 두께로 절단한 후 슬라이드 절편을 0.1% 사프라닌-O(Safranin-O) 용액으로 염색하여 분화여부를 확인하였다. 또한, 연골세포의 정량화는 Image J analysis program(National Institutes of Health, USA)을 이용하여 염색 정도를 정량화 하였다.
분석 결과, 도 3a 내지 도 3c에 나타낸 바와 같이 에티오나마이드를 처리하여 배양한 인간 제대 중간엽 줄기세포(Ethionamide-primed MSCs)는 에티오나마이드를 처리하지 않은 대조군(control)과 비교할 때 각각 지방세포, 골세포, 및 연골세포로 분화가 잘 이루어진 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해 에티오나마이드를 처리하여 배양하였음에도 중간엽 줄기세포의 분화능이 잘 유지되고 있는 것을 알 수 있었다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명에 따른 에티오나마이드는 인간 중간엽 줄기세포의 특성은 그대로 유지하면서 세포의 증식을 효율적으로 향상시키는 바, 상기 에티오나마이드 및 이를 포함하는 배지 조성물은 줄기세포를 이용한 기초연구, 치료제 및 화장품 개발 등의 관련 산업 분야에서 양질의 줄기세포를 다량 확보하는데 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (9)

  1. 에티오나마이드(ethionamide)를 포함하는, 줄기세포 증식 향상용 배지 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 에티오나마이드는 배지에 1 내지 500 μM의 농도로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 배지는 소태아혈청(FBS) 및 젠타마이신(gentamicin)이 첨가된 α-MEM(Minimum Essential Media) 배지인 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 성체줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
  6. 제 1 항의 배지 조성물에 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포 증식 향상방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 줄기세포 증식 향상방법.
  8. 제 6 항의 방법에 의해 얻어진, 증식능이 향상된 줄기세포.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 줄기세포.
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