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WO2018065730A1 - Diagnostique et pronostique précoce de la prééclampsie - Google Patents

Diagnostique et pronostique précoce de la prééclampsie Download PDF

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Publication number
WO2018065730A1
WO2018065730A1 PCT/FR2017/052728 FR2017052728W WO2018065730A1 WO 2018065730 A1 WO2018065730 A1 WO 2018065730A1 FR 2017052728 W FR2017052728 W FR 2017052728W WO 2018065730 A1 WO2018065730 A1 WO 2018065730A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
marker
markers
concentration
lifr
preeclampsia
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2017/052728
Other languages
English (en)
Inventor
Daniel VAIMAN
Jean-Luc Vilotte
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite Paris Descartes
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite Paris Descartes
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National de la Recherche Agronomique INRA, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Universite Paris Descartes filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority to EP17787235.5A priority Critical patent/EP3523660A1/fr
Priority to US16/339,298 priority patent/US20200209260A1/en
Publication of WO2018065730A1 publication Critical patent/WO2018065730A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/689—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to pregnancy or the gonads
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    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/715—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
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    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2857—Seizure disorders; Epilepsy
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    • G01N2800/36—Gynecology or obstetrics
    • G01N2800/368—Pregnancy complicated by disease or abnormalities of pregnancy, e.g. preeclampsia, preterm labour
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • the invention relates to a new method for the diagnosis or in vitro prognosis of preeclampsia.
  • PE Preeclampsia
  • a major pregnancy disorder affecting 2-5% of pregnant women in industrialized countries It is usually characterized by (i) abnormal blood pressure from the second trimester of gestation with a systolic pressure greater than 140 mm Hg, and a diastolic pressure greater than 90 mm Hg and (ii) a proteinuria greater than 300 mg per day.
  • the disease appears earlier than the 20 th week of pregnancy, but may be triggered late for example after the 37th week, the normal length of pregnancy in women is about 41 weeks.
  • the consequences for the mother range from very moderate to fatal, as preeclampsia can be complicated by cerebral (eclampsia), liver (HELLP syndrome) and / or vascular disorders.
  • pre-eclampsia that lead to maternal death in about 10 cases per year.
  • the consequences on the fetus are also important because the management of the pathology is to try to contain hypertension, but often requires the extraction of the fetus-placental unit, which makes preeclampsia a major provider of prematurity iatrogenic.
  • about 1/3 of preeclampsia are complicated by intra-uterine growth retardation, without necessarily being associated with prematurity. It is estimated that around 500 children die each year in France from the consequences of preeclampsia (extreme prematurity or too little birth weight).
  • preeclampsia The therapy of preeclampsia is very limited, as it is often the case for the pathologies of the pregnant woman. It is possible to use antihypertensives (eg nimodipine, hydralazine, labetalol, diazoxide, ketanserin), but all these molecules have disadvantages in their kinetics of action.
  • antihypertensives eg nimodipine, hydralazine, labetalol, diazoxide, ketanserin
  • presymptomatic markers of preeclampsia has therefore become a priority in order to be able to diagnose or predict preeclampsia early so that the pathology can be treated effectively.
  • presymptomatic serum markers include the soluble VEGF receptor (sFLT1), soluble endoglin (sENG), PAPP-A (Pregnancy-Associated Plasma Protein-A) and PIGF (Placental Growth Factor).
  • sFLT1 soluble VEGF receptor
  • sENG soluble endoglin
  • PAPP-A Pregnancy-Associated Plasma Protein-A
  • PIGF Pecental Growth Factor
  • the present invention aims to propose a new method for the diagnosis or in vitro prognosis of preeclampsia, allowing very early detection of preeclampsia or very early detection of a risk of developing the pathology.
  • the invention relates to a method for in vitro diagnosis or prognosis of pre-eclampsia comprising: a) measuring in a biological fluid sample from a pregnant woman the concentration of one or more markers selected from LIFR, TTR (Transthyretin), ApoA2 and Pzp (A2), preferably LIFR and / or TTR, alone or in combination with one or more other markers, b) the use of the result of the measurement of step a) in the diagnosis or prognosis of the pre-eclase, in which a positive diagnosis or a positive prognosis is given by an increase or a decrease of the concentration of the or marker (s) in relation to the normal concentration of the marker (s) obtained in pregnant women.
  • the invention relates to the use of one or more markers in the in vitro evaluation of preeclampsia in a biological fluid sample from a pregnant woman, in which a positive diagnosis or a positive prognosis is given by an increase or decrease in the concentration of the marker (s) relative to the normal concentration of the marker (s) obtained in the pregnant women, the said marker (s) being (are) chosen from LIFR, TTR (Transthyretin), ApoA2 and Pzp (A2M), preferably LIFR and / or TTR, alone or in combination with one or more other markers.
  • LIFR LIFR
  • TTR Transthyretin
  • ApoA2 and Pzp A2M
  • the invention relates to the use of one or more antibodies directed against one or more markers in the in vitro evaluation of preeclampsia in a biological fluid sample from a pregnant woman, in which a diagnosis is made.
  • positive or a positive prognosis is given by an increase or a decrease in the concentration of the marker (s) relative to the normal concentration of the marker (s) obtained in the pregnant women, the said marker (s) being (are) chosen from LIFR, TTR (transthyretin), ApoA2 and Pzp (A2M), preferably LIFR and / or TTR, alone or in combination with one or more other markers.
  • the invention relates to a diagnosis or prognosis kit useful for implementing the method according to the invention.
  • the invention relates to a method of treating preeclampsia in a pregnant woman, comprising:
  • the term "prognosis” refers to the determination of a probability, risk or possibility of developing preeclampsia in a pregnant woman. In particular the pregnant woman is suspected of being affected or to be able to develop a pre-eclampsia.
  • the term “diagnosis” refers to the determination of a probability or a possibility of having preeclampsia in a pregnant woman.
  • the term encompasses the early diagnosis (detection) of preeclampsia.
  • the term “biological fluid” denotes any fluid taken from a pregnant woman from which it is possible to measure the concentration of the markers of the invention.
  • the biological fluid is selected from blood, plasma, serum, urine, saliva or amniotic fluid, preferably serum.
  • the biological fluid can be taken at any time during pregnancy, preferably the pregnant woman is in a gestation period less than or equal to 20 weeks, preferably less than or equal to 16 weeks, preferably in a gestation period between 7 weeks and 16 weeks. This period, which corresponds to the first trimester of gestation, prepares important vascular rearrangements at the maternal-feto interface and it has been shown that effective treatment requires very early detection of the warning signs of the disease.
  • LIFR Leukemia Inhibitory Factor Receptor
  • CD118 cytokine receptor
  • LIF cytokine receptor
  • the measurement of LIFR in a biological fluid sample can be carried out by conventional methods, for example by ELISA using an antibody that binds to LIFR.
  • LIFR exists in a soluble form and in a membrane form. In the context of the present invention, LIFR is soluble LIFR.
  • ApoA2 is a protein present in the plasma as a monomer, homodimer or heterodimer with apolipoprotein D.
  • the measurement of ApoA2 in a biological fluid sample can be performed by methods conventional, e.g. by ELISA using an antibody that binds to ApoA2.
  • A2 Alpha-2-macroglobulin
  • Pzp Pregnancy Zone Protein
  • A2M also exists in dimeric and monomeric form. A2M is synthesized by the liver.
  • the measurement of A2M in a biological fluid sample can be performed by conventional methods, for example by EUSA using an antibody that binds to A2M.
  • Transthyretin is a tetrameric protein found in plasma and cerebrospinal fluid that has four identical subunits. It is notably synthesized in the liver and in the choroid plexuses. It is one of the binding proteins of thyroxine (T4), a thyroid hormone, and vitamin A (retinol). It also has a role in neurogenesis, axon growth, and nerve regeneration.
  • Measurement of TTR in a biological fluid sample can be performed by conventional methods, for example by immunoprecipitation and matrix-assisted laser desorption / ionization (MALDI) (Théberge et al., 2000, Detection of transmethyretin variants using immunoprecipitation and matrix- assisted laser desorption / ionization bioactive probes: a clinical application of mass spectrometry, J Am Soc Mass Spectrom).
  • MALDI matrix-assisted laser desorption / ionization
  • PAPPA Pregnancy-associated plasma protein A
  • preeclampsia is a protein that has been described as having a role in preeclampsia (Dugoff et al., 2004 First-trimester maternal serum PAPP-A and free-beta subunit human chorionic gonadotropin concentrations and nuchal translucency are associated with obstetric complications: A population-based screening study (The FASTER Trial), Am J Obstet Gynecol). This protein has been discovered as specific to the placenta and some cancers; it is assumed that it could be an inhibitor of the complement cascade with proteolytic activity. There is a decrease in the serum concentration of PAPPA in preeclampsia. For example, it can be detected using a specific antibody in an EUSA test.
  • sFLTl Soluble fms-like tyrosine kinase-1
  • sFLT1 Soluble fms-like tyrosine kinase-1
  • HEM Soluble endoglin and other circulating antiangiogenic factors in preeclampsia
  • sENG (endoglin) is a protein that has been shown to be a marker of preeclampsia with an increase in serum concentration in affected patients. sENG acts as a soluble and therefore inactive receptor of the BMP signaling pathway (Bone Morphogenetic Protein, of thery family), molecules having a pro-angiogenic impact. From this point of view, the operation of sENG in preeclampsia would be very comparable to that of trio VEGF / sFLT1 / VEGFRs.
  • PIGF Peak Growth Factor
  • Fetal hemoglobin is one of the hemoglobins of the ⁇ -hemoglobin family produced by the fetus and placenta. Fetal hemoglobin is found in the serum of pregnant women. Recent studies indicate that it is increased early in pre-eclamptic patients (approximately twice, with however a very important interindividual variation (Anderson et al., Pregnancy Hypertension 6 (2016) 103-109).
  • Hemopexin is a protein that has also been reported as a marker of preeclampsia with a decrease in serum concentration in patients with pre-eclampsia.
  • the decrease in hemopexin concentration is proportional to the severity of the pathology. Its essential biological role is the elimination of hematin, product of the degradation of extracellular theme. It has been known since 1978 that hemolytic disorders may be associated with preeclampsia. If its rate decreases, then the elimination of the Theme product will no longer occur.
  • the peptide sequences of the markers mentioned above are defined with respect to the sequences currently referenced in the sequence databases, at the priority date of the present application. In addition, the specific sequences of the markers are examples. It is known to those skilled in the art that polymorphic variants may exist in the human population. These polymorphic variants generally differ only by a few amino acids (for example 1 to 5 or from 1 to 3 amino acids).
  • concentration must be taken in its primary sense, that is to say the quantity of the entity of interest with respect to a given volume.
  • the concentration can be expressed in molar concentration (eg mol / L) or in mass concentration (eg g / L).
  • concentration of the marker (s) can be determined using any suitable method, preferably an immunological method. Methods for performing immunological analyzes are well known to those skilled in the art, for example the Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) method, the IRMA (Immunoradiometric Assay) method, mass spectrometry, chromatography or the method RIA (Radioimmuno Assay).
  • the concentration of the marker (s) is determined by ELISA.
  • the normal concentration obtained in pregnant women hereafter "normal concentration” is determined classically, for example for the whole population or a specific population.
  • the specific population may be defined on the basis of, for example, ethnic origin or any other characteristic that may affect the normal concentration of the marker (s).
  • the population for establishing the normal level of markers is, for example, chosen on the basis of a low risk of developing pre-eclampsia (that is to say without antecedent risk for preeclampsia, for example without previous preeclampsia, without diabetes, or without hypertension).
  • the determined concentrations of the marker (s) can be compared and the significance of the difference determined using standard statistical methods. Statistical methods make it possible to evaluate the specificity and sensitivity of the measurement. For example, OCR curves can be used to define a threshold of significance. In a particular embodiment, if there is a significant difference between the determined concentration of the marker (s) and the normal concentration (i.e., a statistically significant difference), then there is a clinically significant likelihood that the pregnant woman has or risk of developing a Preeclampsia. The risk of developing preeclampsia will be quantified and expressed in probability by the use of likelihood ratios. The determination of the risk of developing preeclampsia may also make use of statistical parameters or algorithms widely known to those skilled in the art, such as, for example, the standard deviation score (Z score) for each marker.
  • Z score standard deviation score
  • the term “marker” is a biological entity, for example a protein, RNA or DNA, which can be used for the diagnosis or prognosis of the disease. preeclampsia.
  • the marker is preferably a protein.
  • a protein is a biological macromolecule formed from one or more polypeptide chains, each of which chains consists of amino acid residues linked together by peptide bonds.
  • the marker is in a soluble form.
  • the present invention results from the surprising advantages demonstrated by the inventors that increasing or decreasing the concentration of certain markers in a biological fluid can diagnose or prognose preeclampsia.
  • the resulting set of applications are described below.
  • the invention relates in fact to a method for in vitro diagnosis or prognosis of preeclampsia comprising: a) measuring in a biological fluid sample from a pregnant woman the concentration of one or more markers chosen from LIFR, TTR (Transthyretin), ApoA2 and Pzp (A2M), preferably LIFR and / or TTR, alone or in combination with one or more other markers,
  • step b) using the result of the measurement of step a) in the diagnosis or prognosis of pre-eclampsia, in which a positive diagnosis or a positive prognosis is given by an increase or a decrease in the concentration of the marker (s) in relation to the normal concentration of the marker (s) obtained in pregnant women.
  • the biological fluid is selected from blood, plasma, serum, urine, saliva or amniotic fluid, preferably serum.
  • the biological fluid can be analyzed immediately after sampling or at a later time.
  • the sample can be frozen or dried (eg freeze-dried) then stored. Freezing or drying allows easy storage and subsequent analysis by limiting the risk of sample spoilage (eg, denaturation of proteins).
  • the sample may also be stored with an agent that stabilizes the marker (s).
  • the sample may also be prepared to increase the detectability of the marker (s), for example by fractionating and / or concentrating the sample.
  • said pregnant woman is in a gestation period of less than or equal to 20 weeks, preferably less than or equal to 16 weeks, preferably in a gestation period of between 7 weeks and 16 weeks.
  • a positive diagnosis or a positive prognosis is given by an increase or a decrease in the concentration of the marker (s) relative to the normal concentration of the marker (s) obtained in pregnant women.
  • a positive diagnosis or prognosis may be in the form of a quantification of the risk of having or developing preeclampsia, for example expressed as a percentage. For example, if there is a significant difference between the specific concentration of the marker (s) and the normal concentration achieved in pregnant women (ie a statistically significant difference), then there is a clinically important risk that the pregnant woman or at risk of developing preeclampsia.
  • markers of the invention are present in the body in a circulating form and a membrane form (e.g. LIFR).
  • the label is in a circulating form (e.g., circulating LIFR or sLIFR; circulating TTR or sTTR; circulating ApoA2 or sApoA2; circulating Pzp or sPzp).
  • the method according to the invention can also be associated with other methods which implement other markers and / or which measure physiological parameters associated with (are indicators of) preeclampsia.
  • This may include, for example, (i) detecting the concentration of other markers, eg, sENG, sFLT1, PIGF, PAPP-A, fetal hemoglobin and / or hemopexin, (ii) measurement of certain physiological parameters, for example by measuring velocity in the uterine or placental arteries (eg ultrasound Doppler test), by the BOLD test in Resonance Imaging Magnetic (MRI), and / or (iii) the detection of genetic predisposition markers for example genes coding for HLA risk variants, genes coding for proteins of the coagulation cascade or genes coding for proteins of the complement cascade.
  • markers eg, sENG, sFLT1, PIGF, PAPP-A, fetal hemoglobin and / or hemopexin
  • measurement of certain physiological parameters for example by measuring velocity in the
  • said one or more other markers of step a) are selected from sENG, sFLT1, PIGF, PAPP-A, fetal hemoglobin and / or hemopexin.
  • the measurement of the concentration of several other markers makes it possible to calculate ratios, for example the ratio sFLT1 / PIGF.
  • the measurement of the concentration of one or more markers chosen from LIFR, TTR (Transthyretin), ApoA2 and Pzp (A2M) makes it possible to calculate ratios, for example the ratio LIFR / TTR, sFLT1 / PIGF, s LIFR x sFLT1, LIFR / ApoA2 and / or LIFR / Pzp.
  • the present invention may comprise a step a ') calculating one or more ratios of two markers and possibly calculating one or more ratios of two other markers, preferably calculating a ratio sFLT1 / PIGF and / or sLIFR x sFLTl.
  • step b) will therefore be: step b) the use of the result of the measurement of step a) and / or the calculation of step a ') in the diagnosis or the prognosis pre-eclampsia, in which a positive diagnosis or a positive prognosis is given by an increase or a decrease in (i) the concentration of the marker (s) and / or (ii) of the ratio (s) of two markers per in relation to the normal concentration of the marker (s) obtained in pregnant women.
  • the method of the invention comprises a preliminary step of obtaining a biological fluid sample from a pregnant woman. This step is upstream of the measurement of the concentration of the marker (s) in said biological fluid sample.
  • the concentration of the marker (s) may be normalized to the total protein concentration of the biological fluid sample.
  • the method according to the invention may comprise a step of determining the total protein concentration of the biological fluid sample. This determination does not pose any particular difficulty and can be easily implemented by those skilled in the art by conventional methods for determining the total protein concentration.
  • the invention may also be defined as an in vitro diagnostic or prognostic method for preeclampsia comprising determining the increase or decrease in concentration, relative to the normal concentration achieved in pregnant women, of one or more markers in a biological fluid sample from a pregnant woman, said marker (s) being chosen from LIFR, TTR (Transthyretin), ApoA2 and Pzp (A2M), preferably LIFR and / or TTR, alone (s) or in combination with one or more other markers.
  • LIFR LIFR
  • TTR Transthyretin
  • ApoA2 and Pzp A2M
  • a positive diagnosis or a positive prognosis is given by a concentration of marker (s) above or below the normal concentration of the marker (s) obtained in pregnant women.
  • the method further comprises determining the increase or decrease in the concentration, relative to the normal concentration obtained in pregnant women, of one or more other markers in the sample of biological fluid, the one or more other markers being selected from sENG, sFLT1, PIGF, PAPP-A, fetal hemoglobin and / or hemopexin.
  • the invention also relates to the use of one or more markers in the in vitro evaluation of pre-eclampsia in a biological fluid sample from a pregnant woman, in which a positive diagnosis or a positive prognosis is given by an increase or decrease in the concentration of the marker (s) relative to the normal concentration of the marker (s) obtained in the pregnant women, the said marker (s) being chosen from UFR, TTR (Transthyretin), ApoA2 and Pzp (A2M ), preferably LIFR and / or TTR, alone or in combination with one or more other markers.
  • the invention also relates to the use of one or more antibodies directed against one or more markers in the in vitro evaluation of pre-eclampsia in a biological fluid sample from a pregnant woman, wherein a positive or a positive prognosis is given by an increase or a decrease in the concentration of the marker (s) relative to the normal concentration of the marker (s) obtained in pregnant women, the said marker (s) being (are) chosen from LIFR, TTR (Transthyretin), ApoA2 and Pzp (A2M), preferably LIFR and / or TTR, alone or in combination with one or more other markers.
  • LIFR LIFR
  • TTR Transthyretin
  • ApoA2 and Pzp A2M
  • a positive diagnosis or a positive prognosis is given by an increase or decrease in one or more two marker concentration ratios relative to the normal concentration of the marker (s) obtained in women for example the ratio LIFR / TTR, sFLT1 / PIGF, sLIFR x sFLT1, LIFR / ApoA2 and / or LIFR / Pzp, preferably the ratio sFLT1 / PIGF and / or sLIFR x sFLT1.
  • antibody refers to immunoglobulin molecules or other molecules that include at least one antigen binding domain. It includes, in particular, whole antibodies, antibody fragments comprising an antigen binding domain (eg Fab, Fab 'and F (ab) 2, scFv, the fragments comprising either a VL domain or a VH domain), monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, primatized antibodies, monospecific antibodies, multi-specific antibodies, single-chain antibodies (eg of the camelid type).
  • an antigen binding domain eg Fab, Fab 'and F (ab) 2, scFv, the fragments comprising either a VL domain or a VH domain
  • monoclonal antibodies eg Fab, Fab 'and F (ab) 2, scFv, the fragments comprising either a VL domain or a VH domain
  • monoclonal antibodies eg Fab, Fab 'and F (ab) 2, scFv,
  • the antibodies according to the invention may be molecules of any type, for example IgG, IgE, IgM, IgD, IgA and IgY, of any class, for example IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl and IgA2 or any subclass.
  • the polyclonal antibodies can be obtained by immunizing an animal with the marker in question (or a marker fragment), followed by the recovery of the desired antibodies in purified form, by taking the serum of said animal, and separating said antibodies from the other antibodies.
  • components of the serum in particular by affinity chromatography on a column on which is fixed an antigen specifically recognized by the antibodies, in particular said marker.
  • the monoclonal antibodies can be obtained by the hybridoma technique, the general principle of which is recalled below. Firstly, an animal, usually a mouse, is immunized with the marker of interest (or a marker fragment), the B lymphocytes of which are then capable of producing antibodies against said antigen. These antibody-producing lymphocytes are then fused with "immortal" (eg, murine) myeloma cells to give rise to hybridomas.
  • "immortal" eg, murine
  • Each hybridoma is multiplied in the form of a clone, each leading to the production of a monoclonal antibody whose recognition properties with respect to said marker can be tested for example by ELISA, by immunoblotting (Western blot) in one or two dimensions, in immunofluorescence, or using a biosensor.
  • the monoclonal antibodies thus selected are subsequently purified, in particular according to the chromatography technique.
  • the monoclonal antibodies can also be recombinant antibodies obtained by genetic engineering, by techniques well known to those skilled in the art.
  • the antibody (s) directed against one or more markers are monoclonal antibodies.
  • the one or more monoclonal antibodies directed against one or more markers are used for measuring an increase or a decrease in the concentration in an ELISA test.
  • the method according to the invention can also be used to monitor the effectiveness of a prophylactic treatment to prevent the development of preeclampsia, in which a reduction in the risk of developing preeclampsia will be a sign of the effectiveness of the treatment. prophylactic treatment.
  • the method according to the invention is particularly useful for diagnosing or prognosing early preeclampsia, which allows both to manage patients early so that they can receive appropriate care, but also not to treat patients who do not require treatment.
  • the present invention also relates to a method for treating preeclampsia in a pregnant woman, comprising: (i) the implementation of a diagnostic or prognostic method according to the invention, and
  • said appropriate treatment is one or more drugs selected from aspirin (acetylsalicylic acid), magnesium sulfate, antihypertensives, corticosteroids, low molecular weight heparins, cholesterol regulators (eg pravastatin) and oxidative stress regulators (eg related to circulating heme, such as alpha-1-microglobulin), preferably aspirin.
  • aspirin acetylsalicylic acid
  • magnesium sulfate e.g., antihypertensives, corticosteroids, low molecular weight heparins
  • cholesterol regulators eg pravastatin
  • oxidative stress regulators eg related to circulating heme, such as alpha-1-microglobulin
  • Kits The invention also relates to diagnostic or prognostic kits useful for implementing the methods according to the invention.
  • Kits usually include one or several reagents (for example, one or more antibodies that bind to the marker (s) of interest) for determining the concentration of the marker (s).
  • the kits may also include one or more containers and / or one or more tubes adapted to mix the biological fluid sample with the reagent (s).
  • the kits may include one or more surfaces that have affinity for the one or more markers that can be contacted with the biological fluid sample (e.g., one or more ELISA plates).
  • the kits may contain one or more suitable wash solutions.
  • kits may also include other components, such as one or more buffering agents, one or more preservatives, or one or more protein stabilizing agents.
  • the kit may further comprise one or more components necessary for detecting the marker (s) (for example an enzyme and / or a substrate).
  • Figure 1 Diagram showing the results of the iTRAQ experiment showing the increase or decrease in the concentration of several markers present in the plasma of mice with preeclamptic gestation relative to the normal concentration of these markers in the plasma of mice having normal gestation at 6.5 days gestation (the total gestation time for the studied mouse line is 18.5 days).
  • the concentration of which is modified in the preeclamptic mouse which can be used in humans because of the homology of the genes, it can be noted that the concentrations of the LIFR and TTR proteins are strongly modulated.
  • SERPIN family A (Serpina #) are not very transposable to humans because of a significant polygenism of this gene in mice.
  • Figure 2 Diagram showing the concentration of LIFR circulating in the plasma of 30 preeclamptic women and 30 control women collected at the time of delivery (A. gross measurement and B. total protein ratio). Preeclamptic women have a significantly higher circulating LIFR concentration in their plasma than women control.
  • Figure 3 Diagram showing the concentration of circulating circulating LIFR and sFLT1 in the plasma of 20 preeclamptic patients and 20 control patients, in gross or total protein ratio. Preeclamptic women have a significantly higher circulating LIFR concentration in their plasma than women control. The results show that the LIFR marker appears more discriminating than the marker sFLT1, the current reference marker.
  • Figure 4 curve representing the concentration of LIFR circulating in the plasma of 20 preeclamptic patients and 20 control patients, in gross measurement according to the gestation date. It is noted that regardless of the stage of gestation, the circulating LIFR concentration is increased in the plasma of preeclamptic patients compared to the circulating LIFR concentration in the control patients.
  • the control patients are defined as pregnant patients in good health and without known medical complication (no diabetes mellitus, pre-existing hypertension, renal or cardiovascular pathology, twin pregnancy or other multiple pregnancy).
  • Figure 5 Diagram showing the concentration of PIGF and sENG (already known markers) in first-trimester plasma in 100 patients who developed preeclampsia later and 50 control patients.
  • Figure 6 Diagram showing the concentration of TTR in first-trimester plasma in 100 patients who developed preeclampsia later and 50 control patients.
  • Figure 7 Diagram showing the concentration of sFLT1 (known marker) in first-trimester plasma in 100 patients who developed preeclampsia later and 50 control patients.
  • Figure 8 Diagram showing concentration of sLIFR in plasma in first-trimester plasma in 100 patients who developed preeclampsia later and 50 patients control.
  • Figure 9 ROC curve representing the efficiency of the sFLT1 / PIGF concentration ratio in first trimester plasma in 100 patients who developed preeclampsia later and 50 control patients. The closer the area under the curve is to 1, and different from 0.5 (and so the higher the area under the curve (ROC area), the more effective the marker is.
  • Figure 10 Diagram and curve showing the sLIFR x sFLT1 concentration ratio in first trimester plasma in 100 patients who developed preeclampsia later and 50 control patients. The closer the area under the curve is to 1, and different from 0.5 (and so the higher the area under the curve (ROC area), the more effective the marker is.
  • the full open reading frame (ORF) cDNA of the human STOX1 gene (isoform A) was microinjected into a male pronucleus after fertilization.
  • the pronucleus thus transfected was implanted in the uterus of a female mouse. After 18.5 days of gestation, transgenic mice were obtained.
  • the copy number of the STOX1 transgene was evaluated by quantitative polymerase chain reaction (qPCR) from the transgenic mouse DNA against a single copy gene.
  • Example 2 Demonstration of the Markers of the Invention in the Mouse Pooled or isolated plasma samples were collected from heparinized jugular vein blood of transgenic mice of Example 1 carrying fetuses at 6.5 days gestation (preeclamptic mice) or non-preeclamptic mice at 6.5 days gestation (control group). These plasmas were depleted of major plasma proteins on MARS-3 (Agilent) columns to remove albumin, IgG and transferrin. To do this, the plasmas were diluted 20-fold in the equilibration buffer provided with the MARS-3 column, and then filtered by microcentrifugation on 0.22 ⁇ filters.
  • labeled samples Samples containing labeled peptides are hereinafter referred to as "labeled samples".
  • the marked samples were identified according to their status: preeclampsia or controls. Then, the labeled samples were combined and lyophilized.
  • labeled peptides (hereinafter “peptides”) were washed and fractionated by cation exchange chromatography. 200 ⁇ g of dry peptides were resuspended in 1 ml of 5 mM KH 2 PO 4 and 20% of acetonitrile (Carlo Erba) pH 2.8 (buffer A).
  • CHCA ⁇ -cyano-4-hydrocinnamic acid
  • Mass spectra were measured with a MALDI-TOF-TOF 4800 spectrometer (Applied Biosystems) version 3.5.28193 build 1011 with a positive reflection mode at a fixed laser frequency. For each fraction 50 spectra were collected between 850 and 4000 Da with a laser frequency set at 200 Hz. 500 spectra per sample were summed, and processed to obtain monoisotopic values with a raw spectrum whose signal-to-noise ratio was greater than 20. Each spectrum allowed the selection of the 8 most abundant peaks, with a signal-to-noise ratio> 15. 1000 MS / MS spectra were summed for each precursor with the subtracted baseline using the Savitsky-Golay algorithm ( regression on a polynomial of degree 4). To identify non-dominant proteins, an exclusion list was made from a duplicate series.
  • Peptide identification was performed with ProteinPilot version 2.0.1 (Applied Biosytems, MDS-Sciex, Foster City, CA). The analysis was made by comparison with the 'Human Protein Database' of ⁇ (International Protein Index version 3.38). The data were processed taking into account the trypsin cleavage performed, carbamidomethylated cysteines, with the search strength set to 'thorough'. A protein is considered significantly identified when at least two surely identified peptides are assigned with a confidence score> 95%, and a difference rate on iTRAQ> 1.2 with p ⁇ 0.05.
  • Serine (Gold cysteine) peptidase inhibitor clade A, member 6
  • the "number of peptides" column indicates the number of peptides that have been clearly identified on the protein during iTRAQ. The more peptides identified, the more the identification of the corresponding protein is sure. The number of peptides therefore indicates the reliability of the identification of the protein and therefore of the measurement. It can be considered that the good protein has been identified Beyond 2 peptides identified on the same protein. The overall results at 6.5 days are shown in Figure 1.
  • the concentration of markers shown in Table 1 is either increased or decreased in mice with preeclampsia. These markers can therefore be used in the context of the invention.
  • the markers exhibiting a large number of peptides and a concentration increase or decrease of at least 20% relative to wild-type mice are TTR (Transthyrethin), LIFR, ApoA2 and Obpla. LIFR emerged as a particularly interesting marker for the diagnosis or prognosis in vitro pre ⁇ eclampsia.
  • Example 3 Study of the LIFR marker in pregnant women at 25 weeks of pregnancy
  • the measurement of the concentration of LIFR in the plasma of pregnant women at 25 weeks of pregnancy was carried out for Figure 2 and Figure 3 with the BOSTER kit (reference ⁇ 120 ⁇ ) and following with precision the technical recommendations recommended by the supplier .
  • the detail can be obtained on www.bosterbio.com.
  • the protocol is standardized to operate in strips constituting a 96-well plate.
  • the kit provides a standard that allows for a range of response by successive dilutions, to calibrate the unknown samples. After adding the last solution a more or less intense yellow color was read in absorbance at 450 nm. The results were integrated into the standard range (from 156 pg / ml to 10 ng / ml) by linear regression.
  • the diluted LIFR standard was prepared 2 hours prior to the experiment by consecutive dilutions, in a diluent provided in the kit.
  • the range was duplicated in 16 wells (8 concentrations) of the 96 well plate provided.
  • the other 80 samples were dilutions of human samples, serum from pre-eclamptic or non-pre-pregnant women.
  • the plate was then placed at 30 ° C. at 37 ° C. After emptying the supernatant, 100 ⁇ l of the anti-LIFR antibody from the BOSTER kit (reference EK1200) diluted in the diluent provided in the kit was added.
  • the plate was then incubated at 37 ° C.
  • the wells are then rinsed 3 times with 300 ⁇ l of PBS.
  • the protocol is identical to the one presented for LIFR measurement.
  • the protocol is standardized to operate in strips constituting a 96-well plate.
  • the kit provides a standard that allows for a range of response by successive dilutions, to calibrate the unknown samples. After adding the last solution a more or less intense yellow color was read in absorbance at 450 nm. The results have been integrated into the standard range by linear regression.
  • the average concentration of LIFR detected in the plasma of pregnant women was 11.1 ng / ml in controls (pregnant women without PE), compared with 12.9 ng / ml in PE patients (unilateral T-test, 0.028 , on paired cases 0.023). The results confirm that the concentration of the LIFR marker increases in the plasma of pregnant women with PE.
  • Figure 3 shows the normalization of the LIFR concentration relative to the total amount of protein, calculated by the Bradford colorimetric assay against a range of Bovine Serum Albumin.
  • controls had a lower LIFR concentration than PE patients.
  • the data suggest that sLIFR is more efficient than sFLT1 in discriminating a sample from a PE or control patient.
  • the observed differences are as important early as late in pregnancy (Figure 4).
  • Example 4 LIFR marker studies. TTR. sFLTl, PAPP-A. PIGF and sFLTtl / PIGF ratio in pregnant women around 13-14 weeks of gestation
  • Plasma samples from pregnant women collected around 13-14 weeks of gestation and then developed PE were recovered. These samples are systematically analyzed by a plate ELISA method, for all the desired markers LIFR (BOSTER Kit), TTR (Abcam Kit), sFLTl (R & D Kit), PAPP-A (Thermofisher Kit) and PLGF (R & D Kit).
  • LIFR BOSTER Kit
  • TTR Abcam Kit
  • sFLTl R & D Kit
  • PAPP-A Thermofisher Kit
  • PLGF R & D Kit
  • the standard ELISA measurement protocol is as follows. The kit provides a standard that allows for a range of response by successive dilutions, to calibrate the unknown samples. After adding the last solution a more or less intense yellow color can be read in absorbance at 450 nm. The results are integrated into the standard range (from 156 pg / ml to 10 ng / ml) by linear regression.
  • the marker concentration is deduced by the implementation of similar protocols, detailed by each of the kits.
  • the diluted LIFR standard is prepared 2 hours prior to the experiment by consecutive dilutions, in a diluent provided in the kit.
  • the range is duplicated in 16 wells (8 concentrations) of the 96 well plate provided.
  • the other 80 samples are a dilution of the human samples.
  • the plate is then placed at 30 ° C. at 37 ° C. After emptying the supernatant, 100 ⁇ l of the diluted anti-LIFR antibody is added to the diluent provided in the kit.
  • the plate is then incubated at 37.degree.
  • Example 5 Studies of the LIFR, TTR, sFLT1, sENG, PIGF markers, the ratio of sFLTt1 / PIGF and sLIFR x sFLT in pregnant women during the first trimester of pregnancy ( ⁇ 12 weeks)
  • Plasma samples were diluted in an ELISA compatible diluent in a 96-well microtiter plate.
  • the sFLTl, sLIFR, sENG, PIGF and TTR ELISA kits were purchased from Origene, BosterBio, NetBiotech, Cohesion Biosciences and NetBiotech, respectively.
  • the ELISA tests were performed according to the general recommendations of the suppliers, as detailed below.
  • FIG. 5 The markers PIGF and sENG (markers of the prior art) were tested on the 150 human plasma samples.
  • the concentration of the PIGF marker is decreased in the PE (Preeclampsia) samples compared to the control (CTL) samples.
  • the concentration of the sENG marker is increased in the PE (Preeclampsia) samples compared to the control (CTL) samples.
  • TTR marker concentration was significantly decreased in parametric and non-parametric tests in PE (Preeclampsia) versus control (CTL) samples. Nevertheless, we observed recoveries.
  • Figure 7 The concentration of the sFLT1 marker is significantly increased in parametric and non-parametric tests in PE (Preeclampsia) versus control (CTL) samples. This marker gave excellent results in the detection of pre-eclampsia with an average factor of 6 times more in pathological cases.
  • Figure 8 The concentration of the sLIFR marker is significantly increased in parametric and non-parametric tests in the PE (Preeclampsia) samples compared to control (CTL) samples. This marker was extremely effective in detecting pre-eclampsia, especially after elimination of the aberrantly behaving control sample (the same as for sENG and PIGF). The average difference was of the order of 6 times.
  • Figures 9 and 10 the curves combining two markers show an excellent result of the "synthetic" markers sFLT1 / PIGF and sFLT1 x sLIFR. For example, values of the order of 10 times higher in the PE group, and a very good predictive power of the occurrence of preeclampsia for sFLT1 x sLIFR.
  • the area under the ROC curve (0.87) was maximal compared to isolated markers or in other combinations.

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Abstract

L'invention concerne un procédé de diagnostic ou de pronostique in vitro de la prééclampsie comprenant la détermination de l'augmentation ou la diminution de la concentration d'un ou plusieurs marqueurs dans un échantillon de fluide biologique.

Description

Diagnostique et pronostique précoce de la prééclampsie
Domaine technique
L'invention concerne un nouveau procédé de diagnostic ou de pronostic in vitro de la prééclampsie.
Arrière-plan technologique
La prééclampsie (PE) est une maladie majeure de la grossesse affectant 2 à 5 % des femmes enceintes dans les pays industrialisés. Elle est généralement caractérisée par (i) une tension artérielle anormale à partir du second trimestre de la gestation avec une pression systolique supérieure à 140 mm de mercure, et une pression diastolique supérieure à 90 mm de mercure et (ii) une protéinurie supérieure à 300 mg par jour. La maladie apparaît au plus tôt à la 20eme semaine de grossesse, mais peut se déclencher tardivement par exemple après la 37ème semaine, la durée normale de gestation chez la femme étant d'environ 41 semaines. Les conséquences pour la mère vont de très modérées à mortelles, dans la mesure où la prééclampsie peut se compliquer d'atteintes cérébrales (éclampsie), hépatiques (HELLP syndrome) et/ou vasculaires. Sur 830 000 naissances annuelles en France, environ 40 000 présentent une prééclampsie qui aboutissent à la mort maternelle dans environ 10 cas par an. Les conséquences sur le fœtus sont également importantes car la prise en charge de la pathologie revient à tenter de contenir l'hypertension, mais nécessite souvent l'extraction de l'unité foeto-placentaire, ce qui fait de la prééclampsie une pourvoyeuse majeure de prématurité iatrogène. Par ailleurs, environ 1/3 des prééclampsies se compliquent d'un retard de croissance intra- utérin, sans être forcément associé à une prématurité. On estime que 500 enfants environ meurent chaque année en France des conséquences d'une prééclampsie (prématurité extrême ou trop petit poids de naissance).
La thérapeutique de la prééclampsie est très limitée, comme c'est souvent le cas pour les pathologies de la femme enceinte. Il est possible d'utiliser des antihypertenseurs (par exemple nimodipine, hydralazine, labétalol, diazoxide, kétansérine), mais toutes ces molécules présentent des inconvénients dans leur cinétique d'action. Plusieurs études concordent pour accorder à l'aspirine à faible dose un rôle marginal mais bénéfique ; il semble cependant que l'effet de l'aspirine pourrait être important quand il est administré très tôt, c'est-à-dire avant 16 semaines de grossesse (Bujold et al., Prévention of preeclampsia and intrauterine growth restriction with aspirin started in early pregnancy: a meta-analysis. Obstetrics and Gynecoiogy 2010 Aug ; 116, p 402-414). On se trouve donc confronté à une difficulté thérapeutique majeure : des symptômes apparaissant au plus tôt au second trimestre de la grossesse et un traitement potentiellement efficace uniquement s'il est administré au premier trimestre de la grossesse.
La recherche de marqueurs présymptomatiques de la prééclampsie est donc devenue une priorité pour pouvoir diagnostiquer ou pronostiquer la prééclampsie de façon précoce afin de pouvoir traiter la pathologie de manière efficace. De ce point de vue, l'effort international a été considérable, et des marqueurs sériques présymptomatiques ont été identifiés. Il s'agit en particulier du récepteur soluble du VEGF (sFLTl), de l'endogline soluble (sENG), de la PAPP-A (Pregnancy-Associated Plasma Protein-A) et du PIGF (Placental Growth Factor). Les deux premiers marqueurs sont augmentés en cas de prééclampsie, les deux autres sont diminués. Certaines sociétés produisent d'ores et déjà des kits « prédictifs » (Alere, Roche), dont l'efficacité est loin d'être parfaite en termes de spécificité et de sensibilité à des stades précoces de la grossesse, notamment avant la 16e semaine. Il existe donc un réel besoin d'identifier des nouveaux marqueurs permettant de diagnostiquer ou pronostiquer précocement la prééclampsie, notamment dans la période de gestation inférieure ou égale à 16 semaines.
Résumé de l'invention
La présente invention vise à proposer un nouveau procédé de diagnostic ou de pronostique in vitro de la prééclampsie, permettant une détection très précoce de la prééclampsie ou une détection très précoce d'un risque de développer la pathologie.
Selon un premier aspect, l'invention concerne un procédé de diagnostic ou de pronostic in vitro de la pré-éclampsie comprenant : a) la mesure dans un échantillon de fluide biologique issu d'une femme enceinte de la concentration d'un ou de plusieurs marqueurs choisi parmi LIFR, TTR (Transthyrétine), ApoA2 et Pzp (A2 ), de préférence LIFR et/ou TTR, seul(s) ou en combinaison avec un ou plusieurs autres marqueurs, b) l'utilisation du résultat de la mesure de l'étape a) dans le diagnostic ou le pronostique de la pré-éclam sie, dans lequel un diagnostic positif ou un pronostic positif est donné par une augmentation ou une diminution de la concentration du ou des marqueur(s) par rapport à la concentration normale du ou des marqueur(s) obtenue chez les femmes enceintes.
Selon un deuxième aspect, l'invention concerne l'utilisation d'un ou plusieurs marqueurs dans l'évaluation in vitro de la prééclampsie dans un échantillon de fluide biologique issu d'une femme enceinte, dans laquelle un diagnostic positif ou un pronostic positif est donné par une augmentation ou une diminution de la concentration du ou des marqueurs par rapport à la concentration normale du ou des marqueur(s) obtenue chez les femmes enceintes, le ou lesdits marqueurs étant choisis parmi LIFR, TTR (Transthyrétine), ApoA2 et Pzp (A2M), de préférence LIFR et/ou TTR, seul(s) ou en combinaison avec un ou plusieurs autres marqueurs.
Selon un troisième aspect, l'invention concerne l'utilisation d'un ou plusieurs anticorps dirigés contre un ou plusieurs marqueurs dans l'évaluation in vitro de la prééclampsie dans un échantillon de fluide biologique issu d'une femme enceinte, dans laquelle un diagnostic positif ou un pronostic positif est donné par une augmentation ou une diminution de la concentration du ou des marqueurs par rapport à la concentration normale du ou des marqueurs obtenue chez les femmes enceintes, le ou lesdits marqueurs étant choisis parmi LIFR, TTR (Transthyrétine), ApoA2 et Pzp (A2M), de préférence LIFR et/ou TTR, seul(s) ou en combinaison avec un ou plusieurs autres marqueurs.
Selon un quatrième aspect, l'invention concerne un kit de diagnostic ou de pronostic utile pour la mise en œuvre du procédé selon l'invention. Selon un cinquième aspect, l'invention concerne une méthode de traitement d'une prééclampsie chez une femme enceinte, comprenant :
(i) la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention, et
(H) lorsque le diagnostic est positif ou le pronostic est positif, instaurer un traitement approprié chez la femme enceinte. Description détaillée de l'invention
Définitions
Au sens de l'invention, le terme « pronostique » désigne la détermination d'une probabilité, d'un risque ou d'une possibilité de développer une prééclampsie chez une femme enceinte. En particulier la femme enceinte est suspectée d'être atteinte ou de pouvoir développer une pré-éclampsie.
Au sens de l'invention, le terme « diagnostic » désigne la détermination d'une probabilité ou d'une possibilité d'avoir une prééclampsie chez une femme enceinte. Le terme englobe le diagnostic (la détection) précoce de la prééclampsie. Au sens de l'invention, les termes « fluide biologique » désignent tout fluide prélevé chez une femme enceinte à partir duquel il est possible de mesurer la concentration des marqueurs de l'invention. Par exemple, le fluide biologique est choisi parmi le sang, le plasma, le sérum, l'urine, la salive ou le liquide amniotique, de préférence le sérum. Le fluide biologique peut être prélevé à tout moment de la grossesse, de préférence la femme enceinte se trouve dans une période de gestation inférieure ou égale à 20 semaines, de préférence inférieure ou égale à 16 semaines, de préférence dans une période de gestation comprise entre 7 semaines et 16 semaines. Cette période, qui correspond au premier trimestre de gestation, prépare des remaniements vasculaires importants à l'interface foeto-maternelle et il a été montré qu'un traitement efficace nécessite une détection très précoce des signes avant-coureurs de la maladie.
Le LIFR (Leukemia Inhibitory Factor Receptor), également connu sous la dénomination « CD118 », est le récepteur d'une cytokine (LIF) qui agit sur la différenciation, la survie et la prolifération d'une grande variété de cellules. La mesure de LIFR dans un échantillon de fluide biologique peut s'effectuer par des méthodes classiques, par exemple par ELISA en utilisant un anticorps qui se lie au LIFR. LIFR existe sous une forme soluble et sous une forme membranaire. Dans le cadre de la présente invention, le LIFR est le LIFR soluble.
ApoA2 (Apolipoprotein A-II) est une protéine présente dans le plasma sous la forme de monomère, d'homodimère ou d'hétérodimère avec l'apolipoprotéine D. La mesure de ApoA2 dans un échantillon de fluide biologique peut s'effectuer par des méthodes classiques, par exemple par ELISA en utilisant un anticorps qui se lie à ApoA2. A2 (Alpha-2-macroglobuline), également connue sous le nom de Pzp (Pregnancy Zone Protein), est une protéine plasmatique composée de quatre sous-unités identiques liées entre elles par des ponts disulfure. A2M existe également sous forme dimérique et monomérique. A2M est notamment synthétisée par le foie. La mesure de A2M dans un échantillon de fluide biologique peut s'effectuer par des méthodes classiques, par exemple par EUSA en utilisant un anticorps qui se lie à A2M.
La transthyretin (TTR) est une protéine tétramérique présente dans le plasma et le liquide cérébro-spinal qui possède quatre sous-unités identiques. Elle est notamment synthétisée dans le foie et dans les plexus choroïdes. Elle constitue une des protéines de liaison de la thyroxine (T4), une hormone thyroïdienne, et de la vitamine A (rétinol). Elle a également un rôle dans la neurogenèse, la croissance des axones et la régénération nerveuse. Son rôle dans la prééclampsie a été décrit dans la littérature où il a été montré une diminution de la concentration de la transthyretin dans le sérum de patientes symptomatiques à un stade tardif de la pathologie (Kalkunte et al. 2013, Transthyretin is dysregulated in preeclampsia, and its native form prevents the onset of disease in a preclinical mouse model, Am J Pathology, et Zhu et al., Exp Ther Med, 2014). La mesure de TTR dans un échantillon de fluide biologique peut s'effectuer par des méthodes classiques, par exemple par immunoprecipitation et MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionization) (Théberge et al. 2000, Détection of transmethyretin variants using immunoprecipitation and matrix- assisted laser desorption/ionization bioactive probes : a clinical application of mass spectrometry, J Am Soc Mass Spectrom).
PAPPA (Pregnancy-associated plasma protein A) est une protéine qui a été décrite comme ayant un rôle dans la prééclampsie (Dugoff et al. 2004 First-trimester maternai sérum PAPP-A and free-beta subunit human chorionic gonadotropin concentrations and nuchal translucency are associated with obstetric complications: A population-based screening study (The FASTER Trial), Am J Obstet Gynecol). Cette protéine a été découverte comme spécifique du placenta et de certains cancers ; on suppose qu'elle pourrait être un inhibiteur de la cascade du complément avec une activité protéolytique. On observe une une diminution de la concentration sérique de PAPPA en cas de prééclampsie. Elle peut par exemple être détectée en utilisant un anticorps spécifique dans un test EUSA. sFLTl (Soluble fms-like tyrosine kinase-1) est une protéine de la famille des tyrosines kinases qui a été décrite comme marqueur de la prééclampsie (Levine et al. (2006), Soluble endoglin and other circulating antiangiogenic factors in preeclampsia, HEM). sFLTl entrerait en compétition avec les récepteurs membranaires du VEGF, VEGFR 1, 2 et 3, empêchant son activation cellulaire et diminuant ainsi l'angiogenèse, en particulier placentaire. On observe une augmentation de la concentration sérique de sFLTl en cas de prééclampsie. sENG (endoglin) est une protéine qui a été présentée comme un marqueur de la prééclampsie avec une augmentation de sa concentration sérique chez les patientes atteintes. sENG agit comme un récepteur soluble et donc inactif de la voie de signalisation des BMP (Bone Morphogenetic Protein, de la famille du ΤΰΡ ), molécules ayant un impact pro-angiogénique. De ce point de vue le fonctionnement de sENG dans la prééclampsie serait fort comparable à celui du trio VEGF/sFLTl/VEGFRs.
PIGF (Placental Growth Factor) est une protéine qui a également été présentée comme un marqueur de la prééclampsie avec une diminution de sa concentration sérique chez les patientes atteintes. Il faut noter que PIGF interagit aussi avec le récepteur VEGFR1 (fltl) et est donc un contributeur majeur de la vascularisation placentaire active, ce qui expliquerait l'effet délétère de sa diminution dans le cas de la prééclampsie.
L'Hémoglobine fœtale est une des hémoglobines de la famille des hémoglobines β produite par le fœtus et le placenta. On trouve l'Hémoglobine fœtale dans le sérum des femmes enceintes. Des études récentes indiquent qu'elle est augmentée précocement chez les patientes prééclamptiques (environ deux fois, avec cependant une variation interindividuelle très importante (Anderson et al. Pregnancy Hypertension 6 (2016) 103- 109).
L'Hémopexine est une protéine qui a également été présentée comme marqueur de la prééclampsie avec une diminution de sa concentration sérique chez les patientes atteintes. La diminution de la concentration en hémopexine est proportionnelle à la gravité de la pathologie. Son rôle biologique essentiel est l'élimination de l'hématine, produit de la dégradation de Thème extracellulaire. Il est connu depuis 1978 que des troubles hémolytiques peuvent être associés à une prééclampsie. Si son taux diminue, alors l'élimination du produit de Thème ne se fera plus. La dernière étude publiée montre une concentration de 1143 pg/ml chez les patientes contrôles, 947 chez les prééclampsies les plus sévères (p = 0.04) et 1085 chez les prééclampsies plus modérées (non significatif), (Anderson et al. Pregnancy Hypertension 6 (2016) 103-109). Les séquences peptidiques des marqueurs mentionnés ci-dessus sont définies par rapport aux séquences actuellement référencées dans les bases de données de séquences, à la date de priorité de la présente demande. De plus, les séquences spécifiques des marqueurs sont des exemples. L'homme de l'art sait que des variants polymorphes peuvent exister dans la population humaine. Ces variants polymorphes ne diffèrent généralement que par quelques acides aminés (par exemple 1 à 5 ou de 1 à 3 acides aminés).
Au sens de l'invention, le terme « concentration » doit être pris en son sens premier, c'est-à-dire la quantité de l'entité d'intérêt par rapport à un volume donné. La concentration peut être exprimée en concentration molaire (e.g. mol/L) ou en concentration massique (e.g. g/L). La concentration du ou des marqueurs peut être déterminée en utilisant n'importe quelle méthode appropriée, de préférence une méthode immunologique. Des méthodes pour effectuer des analyses immunologiques sont bien connues de l'homme de l'art, par exemple la méthode ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), la méthode IRMA (Immunoradiometric Assay), la spectrométrie de masse, la chromatographie ou la méthode RIA (Radioimmuno Assay). Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, la concentration du ou des marqueurs est déterminée par ELISA. La concentration normale obtenue chez les femmes enceintes, ci- après « concentration normale », est déterminée classiquement, par exemple pour l'ensemble de la population ou une population spécifique. La population spécifique peut être définie sur la base, par exemple, de l'origine ethnique ou toute autre caractéristique qui peut affecter la concentration normale du ou des marqueurs. La population pour établir le niveau normal des marqueurs est, par exemple, choisie sur la base d'un faible risque de développer une prééclampsie (c'est à dire sans antécédent à risque pour la prééclampsie, par exemple sans prééclampsie antérieure, sans diabète, ou sans hypertension). Une fois que les concentrations normales sont connues, les concentrations déterminées du ou des marqueurs peuvent être comparées et l'importance de la différence déterminée en utilisant des méthodes statistiques standard. Les méthodes statistiques permettent notamment d'évaluer la spécificité et la sensibilité de la mesure. On peut par exemple citer les courbes de ROC qui permettent de définir un seuil de signification. Dans un mode de réalisation particulier, s'il y a une différence significative entre la concentration déterminée du ou des marqueurs et la concentration normale (à savoir une différence statistiquement significative), alors il y a une probabilité cliniquement significative que la femme enceinte aie ou risque de développer une prééclampsie. Le risque de développer une prééclampsie sera ainsi quantifié et exprimé en probabilité par l'utilisation de rapports de vraisemblance. La détermination du risque de développer une prééclampsie peut également faire appel à des paramètres ou algorithmes statistiques largement connus de l'homme de l'art, comme par exemple le score de déviation standard (Z score) pour chaque marqueur.
Au sens de l'invention, le terme « marqueur » (ou « biomarqueur ») est une entité biologique, par exemple une protéine, de l'ARN ou de l'ADN, qui peut être utilisé pour le diagnostic ou le pronostique de la prééclampsie. Au sens de l'invention, le marqueur est de préférence une protéine. Une protéine est une macromolécule biologique formée d'une ou de plusieurs chaînes polypeptidiques, chacune de ces chaînes est constituée de résidus d'acides aminés liés entre eux par des liaisons peptidiques. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le marqueur est sous une forme soluble.
Procédé de diagnostic ou de pronostic
La présente invention découle des avantages surprenants mis en évidence par les inventeurs que l'augmentation ou la diminution de la concentration de certains marqueurs dans un fluide biologique permettent de diagnostiquer ou pronostiquer une prééclampsie. L'ensemble des applications qui en découlent sont décrites ci-après.
L'invention concerne en effet un procédé de diagnostic ou de pronostic in vitro de la prééclampsie comprenant : a) la mesure dans un échantillon de fluide biologique issu d'une femme enceinte de la concentration d'un ou de plusieurs marqueurs choisis parmi LIFR, TTR (Transthyrétine), ApoA2 et Pzp (A2M), de préférence LIFR et/ou TTR, seul(s) ou en combinaison avec un ou plusieurs autres marqueurs,
b) l'utilisation du résultat de la mesure de l'étape a) dans le diagnostic ou le pronostique de la pré-éclampsie, dans lequel un diagnostic positif ou un pronostic positif est donné par une augmentation ou une diminution de la concentration du ou des marqueur(s) par rapport à la concentration normale du ou des marqueur(s) obtenue chez les femmes enceintes.
Dans un mode de réalisation particulier, le fluide biologique est choisi parmi le sang, le plasma, le sérum, l'urine, la salive ou le liquide amniotique, de préférence le sérum. Le fluide biologique peut être analysé immédiatement après le prélèvement ou à un moment ultérieur. Par exemple, l'échantillon peut être congelé ou séché (e.g. lyophilisé) puis stocké. La congélation ou le séchage permet un stockage facile et une analyse ultérieure en limitant le risque d'altération de l'échantillon (par exemple, la dénaturation des protéines). L'échantillon peut également être stocké avec un agent qui stabilise le ou les marqueurs. L'échantillon peut également être préparé de manière à augmenter la détectabilité du ou des marqueurs, par exemple en fractionnant et/ou en concentrant l'échantillon.
Comme détaillé plus haut, l'un des avantages majeurs du procédé selon l'invention est de pouvoir diagnostiquer ou pronostiquer de manière précoce la prééclampsie. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, ladite femme enceinte se trouve dans une période de gestation inférieure ou égale à 20 semaines, de préférence inférieure ou égale à 16 semaines, de préférence dans une période de gestation comprise entre 7 semaines et 16 semaines.
Dans un mode de réalisation particulier, un diagnostic positif ou un pronostic positif est donné par une augmentation ou une diminution de la concentration du ou des marqueur(s) par rapport à la concentration normale du ou des marqueur(s) obtenue chez les femmes enceintes. A titre d'exemple, un diagnostic positif ou un pronostique peut se présenter sous la forme d'une quantification du risque d'avoir ou de développer une prééclampsie, par exemple exprimée en pourcentage. A titre d'exemple, s'il y a une différence importante entre la concentration déterminée du ou des marqueurs et la concentration normale obtenue chez les femmes enceintes (à savoir une différence statistiquement significative), alors il y a un risque cliniquement important que la femme enceinte aie ou risque de développer une prééclampsie.
Certains des marqueurs de l'invention sont présents dans le corps sous une forme circulante et une forme membranaire (e.g. LIFR). Dans un mode de réalisation préféré, le marqueur est sous une forme circulante (e.g. LIFR circulant ou sLIFR ; TTR circulant ou sTTR ; ApoA2 circulant ou sApoA2 ; Pzp circulant ou sPzp).
Le procédé selon l'invention peut également être associé à d'autres procédés qui mettent en uvre d'autres marqueurs et/ou qui mesurent des paramètres physiologiques associés à (sont des indicateurs de) la prééclampsie. Cela peut inclure, par exemple, (i) la détection de la concentration d'autres marqueurs, par exemple sENG, sFLTl, PIGF, PAPP- A, l'hémoglobine fœtale et/ou l'hémopexine, (ii) la mesure de certains paramètres physiologiques, par exemple par la mesure de la vélocité dans les artères utérines ou placentaires (e.g. test doppler par ultrasons), par le test BOLD en Imagerie Résonance Magnétique (IRM), et/ou (iii) la détection de marqueurs de prédisposition génétiques par exemple des gènes codant des variants à risque de HLA, des gènes codant pour des protéines de la cascade de coagulation ou des gènes codant pour des protéines de la cascade du complément. Dans un mode de réalisation particulier, lesdits un ou plusieurs autres marqueurs de l'étape a) sont choisis parmi sENG, sFLTl, PIGF, PAPP-A, hémoglobine fœtale et/ou l'hémopexine. Dans un mode de réalisation particulier, la mesure de la concentration de plusieurs autres marqueurs permet de calculer des ratios, par exemple le ratio sFLTl/PIGF. Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, la mesure de la concentration d'un ou de plusieurs marqueurs choisis parmi LIFR, TTR (Transthyrétine), ApoA2 et Pzp (A2M) permet de calculer des ratios, par exemple le ratio LIFR/TTR, sFLTl/PIGF, s LIFR x sFLTl, LIFR/ApoA2 et/ou LIFR/Pzp. Ainsi, la présente invention peut comprendre une étape a') le calcul d'un ou plusieurs ratios de deux marqueurs et éventuellement le calcul d'un ou plusieurs ratios de deux autres marqueurs, de préférence le calcul d'un ratio sFLTl/PIGF et/ou sLIFR x sFLTl. Dans ce mode de réalisation particulier, l'étape b) sera donc : étape b) l'utilisation du résultat de la mesure de l'étape a) et/ou du calcul de l'étape a') dans le diagnostic ou le pronostique de la pré-éclampsie, dans lequel un diagnostic positif ou un pronostic positif est donné par une augmentation ou une diminution de (i) la concentration du ou des marqueur(s) et/ou (ii) du ou des ratios de deux marqueurs par rapport à la concentration normale du ou des marqueur(s) obtenue chez les femmes enceintes.
Dans certains modes de réalisation, le procédé de l'invention comprend une étape préliminaire d'obtention d'un échantillon de fluide biologique à partir d'une femme enceinte. Cette étape est en amont de la mesure de la concentration du ou des marqueurs dans ledit échantillon de fluide biologique.
Comme il est largement répandu dans l'art antérieur, la concentration du ou des marqueurs peut être normalisée par rapport à la concentration en protéines totales de l'échantillon de fluide biologique. Ainsi, le procédé selon l'invention peut comprendre une étape de détermination de la concentration en protéines totales de l'échantillon de fluide biologique. Cette détermination ne pose aucune difficulté particulière et peut être facilement mise en œuvre par l'homme de l'art par des méthodes classiques de détermination de la concentration en protéines totales. L'invention peut également se définir comme étant un procédé de diagnostic ou de pronostic in vitro de la prééclampsie comprenant la détermination de l'augmentation ou de la diminution de la concentration, par rapport à la concentration normale obtenue chez les femmes enceintes, d'un ou plusieurs marqueurs dans un échantillon de fluide biologique issu d'une femme enceinte, le ou lesdits marqueurs étant choisis parmi LIFR, TTR (Transthyrétine), ApoA2 et Pzp (A2M), de préférence LIFR et/ou TTR, seul(s) ou en combinaison avec un ou plusieurs autres marqueurs.
Dans un mode de réalisation particulier, un diagnostic positif ou un pronostic positif est donné par une concentration du ou des marqueurs supérieure ou inférieure à la concentration normale du ou des marqueurs obtenue chez les femmes enceintes. Dans un mode de réalisation particulier, le procédé comprend en outre la détermination de l'augmentation ou de la diminution de la concentration, par rapport à la concentration normale obtenue chez les femmes enceintes, d'un ou plusieurs autres marqueurs dans l'échantillon de fluide biologique, le ou lesdits autres marqueurs étant choisis parmi sENG, sFLTl, PIGF, PAPP-A, hémoglobine fœtale et/ou l'hémopexine.
Utilisations
L'invention concerne également l'utilisation d'un ou plusieurs marqueurs dans l'évaluation in vitro de la pré-éclampsie dans un échantillon de fluide biologique issu d'une femme enceinte, dans laquelle un diagnostic positif ou un pronostic positif est donné par une augmentation ou une diminution de la concentration du ou des marqueurs par rapport à la concentration normale du ou des marqueur(s) obtenue chez les femmes enceintes, le ou lesdits marqueurs étant choisis parmi UFR, TTR (Transthyrétine), ApoA2 et Pzp (A2M), de préférence LIFR et/ou TTR, seul(s) ou en combinaison avec un ou plusieurs autres marqueurs. L'invention concerne également l'utilisation d'un ou plusieurs anticorps dirigés contre un ou plusieurs marqueurs dans l'évaluation in vitro de la pré-éclampsie dans un échantillon de fluide biologique issu d'une femme enceinte, dans laquelle un diagnostic positif ou un pronostic positif est donné par une augmentation ou une diminution de la concentration du ou des marqueurs par rapport à la concentration normale du ou des marqueurs obtenue chez les femmes enceintes, le ou lesdits marqueurs étant choisis parmi LIFR, TTR (Transthyrétine), ApoA2 et Pzp (A2M), de préférence LIFR et/ou TTR, seul(s) ou en combinaison avec un ou plusieurs autres marqueurs. Dans un mode de réalisation particulier, un diagnostic positif ou un pronostic positif est donné par une augmentation ou une diminution d'un ou plusieurs ratios de concentration de deux marqueurs par rapport à la concentration normale du ou des marqueur(s) obtenue chez les femmes enceintes, par exemple le ratio LIFR/TTR, sFLTl/PIGF, sLIFR x sFLTl, LIFR/ApoA2 et/ou LIFR/Pzp, de préférence le ratio sFLTl/PIGF et/ou sLIFR x sFLTl.
Le terme « anticorps » tel qu'il est utilisé ici fait référence à des molécules d'immunoglobulines ou d'autres molécules qui comprennent au moins un domaine de liaison à un antigène. Il englobe notamment des anticorps entiers, des fragments d'anticorps comprenant un domaine de liaison à l'antigène (e.g. Fab, Fab' et F(ab)2, scFv, les fragments comprenant soit un domaine VL soit un domaine VH), des anticorps monoclonaux, des anticorps polyclonaux, des anticorps chimériques, des anticorps humanisés, des anticorps primatisés, des anticorps monospécifiques, des anticorps multi- spécifiques, des anticorps mono-chaine (e.g. de type camélidé). Les anticorps selon l'invention peuvent être des molécules de tout type, par exemple, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA et IgY, de toute classe, par exemple, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl et IgA2 ou de toute sous-classe.
Généralement, les anticorps polyclonaux peuvent être obtenus par immunisation d'un animal avec le marqueur concerné (ou un fragment de marqueur), suivie de la récupération des anticorps recherchés sous forme purifiée, par prélèvement du sérum dudit animal, et séparation desdits anticorps des autres constituants du sérum, notamment par chromatographie d'affinité sur une colonne sur laquelle est fixé un antigène spécifiquement reconnu par les anticorps, notamment ledit marqueur.
Généralement, Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus par la technique des hybridomes dont le principe général est rappelé ci-après. Dans un premier temps, on immunise un animal, généralement une souris avec le marqueur d'intérêt (ou un fragment de marqueur), dont les lymphocytes B sont alors capables de produire des anticorps contre ledit antigène. Ces lymphocytes producteurs d'anticorps sont ensuite fusionnés avec des cellules myélomateuses "immortelles" (par exemple murines) pour donner lieu à des hybridomes. Chaque hybridome est multiplié sous la forme de clone, chacun conduisant à la production d'un anticorps monoclonal dont les propriétés de reconnaissance vis-à-vis dudit marqueur pourront être testées par exemple en ELISA, par immunotransfert (Western blot) en une ou deux dimensions, en immunofluorescence, ou à l'aide d'un biocapteur. Les anticorps monoclonaux ainsi sélectionnés, sont par la suite purifiés notamment selon la technique de chromatographie. Les anticorps monoclonaux peuvent être également des anticorps recombinants obtenus par génie génétique, par des techniques bien connues de l'homme du métier. Dans un mode de réalisation préféré, le ou les anticorps dirigés contre un ou plusieurs marqueurs sont des anticorps monoclonaux. De préférence, le ou les anticorps monoclonaux dirigés contre un ou plusieurs marqueurs sont utilisés pour la mesure d'une augmentation ou d'une diminution de la concentration dans un test ELISA.
Méthode de traitement Le procédé selon l'invention peut également être utilisé afin de surveiller l'efficacité d'un traitement prophylactique pour prévenir le développement de la prééclampsie, dans lequel une réduction du risque de développer une prééclampsie sera le signe de l'efficacité du traitement prophylactique. Comme décrit plus haut, le procédé selon l'invention est notamment utile pour diagnostiquer ou pronostiquer de manière précoce la prééclampsie, ce qui permet à la fois de prendre en charge les patientes de manière précoce afin qu'elles puissent recevoir des soins adaptés, mais également de ne pas traiter des patientes qui ne nécessitent pas de traitement.
Ainsi, la présente invention concerne également une méthode de traitement d'une prééclampsie chez une femme enceinte, comprenant : (i) la mise en œuvre d'un procédé de diagnostic ou de pronostic selon l'invention, et
(ii) lorsque le diagnostic est positif ou le pronostic est positif, instaurer un traitement approprié chez la femme enceinte.
Dans un mode de réalisation particulier, ledit traitement approprié est un ou plusieurs médicaments choisis parmi l'aspirine (acide acétylsalicylique), le sulfate de magnésium, les anti-hypertenseurs, les corticostéroïdes, les héparines de bas poids moléculaire, les régulateurs du cholestérol (e.g. pravastatine) et les régulateurs du stress oxydatif (e.g. liés au hème circulant, tels l'Alpha-1- microglobuline), de préférence l'aspirine.
Kits L'invention concerne également des kits de diagnostic ou de pronostic utiles pour la mise en œuvre des procédés selon l'invention. Les kits comprennent généralement un ou plusieurs réactifs (par exemple, un ou plusieurs anticorps qui se lient au(x) marqueur(s) d'intérêt) permettant de déterminer la concentration du ou des marqueurs. Les kits peuvent également comprendre un ou plusieurs récipients et/ou un ou plusieurs tubes adaptés pour mélanger l'échantillon de fluide biologique avec le ou les réactifs. Dans certains modes de réalisation, les kits peuvent comprendre une ou plusieurs surfaces qui possèdent une affinité pour le ou les marqueurs qui peuvent être mise en contact avec l'échantillon de fluide biologique (par exemple une ou plusieurs plaques ELISA). Les kits peuvent contenir une ou plusieurs solutions de lavage appropriées. Les kits, dans certains modes de réalisation, peuvent également comprendre d'autres composants, tel qu'un ou plusieurs agents tampon, un ou plusieurs conservateurs ou un ou plusieurs agents stabilisants des protéines. Le kit peut comprendre en outre un ou des composants nécessaires à la détection du ou des marqueurs (par exemple une enzyme et/ou un substrat).
Légendes des figures
Figure 1 : diagramme représentant les résultats de l'expérience iTRAQ montrant l'augmentation ou la diminution de la concentration de plusieurs marqueurs présents dans le plasma de souris ayant une gestation prééclamptique par rapport à la concentration normale de ces marqueurs dans le plasma de souris ayant une gestation normale, à 6,5 jours de gestation (la durée totale de gestation pour la lignée de souris étudiée est de 18,5 jours). Parmi les marqueurs étudiés dont la concentration est modifiée chez la souris prééclamptique, utilisables chez l'Homme en raison de l'homologie des gènes, il peut être noté que les concentrations des protéines LIFR et TTR sont fortement modulées. A noter que les SERPIN de la famille A (Serpina#) sont peu transposables à l'Homme en raison d'un polygénisme important de ce gène chez la souris.
Figure 2 : diagramme représentant la concentration de LIFR circulant dans le plasma de 30 femmes prééclamptiques et 30 femmes contrôle prélevé au moment de l'accouchement (A. mesure brute et B. rapportée aux protéines totales). Les femmes prééclamptiques ont une concentration de LIFR circulant significativement plus importante dans leur plasma que les femmes contrôle.
Figure 3 : diagramme représentant la concentration de LIFR et de sFLTl circulants dans le plasma de 20 patientes prééclamptiques et 20 patientes contrôle, en mesure brute ou rapportée aux protéines totales. Les femmes prééclamptiques ont une concentration de LIFR circulant significativement plus importante dans leur plasma que les femmes contrôle. Les résultats montrent que le marqueur LIFR apparaît plus discriminant que le marqueur sFLTl, marqueur de référence actuel.
Figure 4 : courbe représentant la concentration de LIFR circulant dans le plasma de 20 patientes prééclamptiques et 20 patientes contrôle, en mesure brute en fonction de la date de gestation. On note que quel que soit le stade de gestation, la concentration de LIFR circulant est augmentée dans le plasma des patientes prééclamptiques par rapport à la concentration de LIFR circulant chez les patientes contrôles. Les patientes contrôles étant définies comme des patientes enceintes en bonne santé et sans complication médicale connue (pas de diabète sucré, d'hypertension préexistante, de pathologie rénale ou cardiovasculaire, de grossesse gémellaire ou autre grossesse multiple). Figure 5 : diagramme représentant la concentration de PIGF et sENG (marqueurs déjà connus) dans le plasma de premier trimestre chez 100 patientes qui ont développé une prééclampsie plus tard et 50 patientes contrôle.
Figure 6 : diagramme représentant la concentration de TTR dans le plasma de premier trimestre chez 100 patientes qui ont développé une prééclampsie plus tard et 50 patientes contrôle.
Figure 7 : diagramme représentant la concentration de sFLTl (marqueur connu) dans le plasma de premier trimestre chez 100 patientes qui ont développé une prééclampsie plus tard et 50 patientes contrôle. Figure 8 : diagramme représentant la concentration de sLIFR dans le plasma dans le plasma de premier trimestre chez 100 patientes qui ont développé une prééclampsie plus tard et 50 patientes contrôle.
Figure 9 : Courbe ROC représentant l'efficacité du rapport de concentration sFLTl/PIGF dans le plasma de premier trimestres chez 100 patientes qui ont développé une prééclampsie plus tard et 50 patientes contrôle. Plus l'aire sous la courbe est proche de 1, et différente de 0.5 (et donc plus l'aire sous la courbe (ROC area) est élevée, plus le marqueur est efficace.
Figure 10 : diagramme et courbe représentant le rapport de concentration sLIFR x sFLTl dans le plasma de premier trimestres chez 100 patientes qui ont développé une prééclampsie plus tard et 50 patientes contrôle. Plus l'aire sous la courbe est proche de 1, et différente de 0.5 (et donc plus l'aire sous la courbe (ROC area) est élevée, plus le marqueur est efficace.
Exemples
Exemple 1 : préparation du modèle murîn de prééclampsie par surexpression de STOXl
L'ADNc du cadre de lecture ouvert complet (ORF) du gène STOXl humain (isoforme A) a été micro-injecté dans un pronucléus mâle après fécondation. Le pronucléus ainsi transfecté a été implanté dans l'utérus d'une souris femelle. Après 18,5 jours de gestation, des souris transgéniques ont été obtenues. Le nombre de copies du transgène STOXl a été évalué par la réaction en chaîne par polymérase quantitative (qPCR) à partir de l'ADN de la souris transgénique par rapport à un gène à copie unique.
Trois lignées de souris transgéniques ont été obtenues et amplifiées. L'analyse de la transmission du transgène STOXl à travers les générations a montré qu'il y avait un seul locus d'insertion du transgène STOXl sur les 3 lignées de souris transgéniques qui ont été amplifiées. Le phénotypage des souris transgéniques a été effectuée comme décrit dans Doridot et al., Hypertension, 2013, avec la mesure de la pression sanguine quotidienne tout au long de la gestation, et des prélèvements d'urine destinés à mesurer la protéinurie. Dans l'article Doridot et al. il a été montré également que des marqueurs caractéristiques de la prééclampsie (sFLTl et sENG) sont augmentés dans le sérum/plasma des souris transgéniques porteuses de fœtus et donc prééclamptiques.
Exemple 2 : mise en évidence des marqueurs de l'invention chez la souris Des échantillons de plasma poolés ou isolés ont été collectés à partir de sang hépariné de la veine jugale de souris transgéniques de l'exemple 1 porteuses de fœtus à 6,5 jours de gestation (souris prééclamptiques) ou de souris non-prééclamptiques à 6,5 jours de gestation (groupe contrôle). Ces plasmas ont été dépiétés des protéines majeures du plasma sur des colonnes MARS-3 (Agilent) permettant d'éliminer l'albumine, les IgG et la transferrine. Pour ce faire, les plasmas ont été dilués 20 fois dans le tampon d'équilibration fourni avec la colonne MARS-3, puis filtré par microcentrifugation sur filtres à 0,22 μΜ. Deux lavages à 100g pendant 2,5 min ont été réalisés, et la fraction obtenue a été concentré à l'aide d'un concentrateur 5K MWCO. La quantité de protéines restantes a été évaluée par le 2D Quant protein assay (GE Healthcare, France). La fraction a ensuite été aliquotée et stockée à -80 C. Par la suite des échantillons contenant 50pg de protéines ont été lyophilisés, puis resuspendus dans 25μΙ de tampon TEAB 500 mM (Sigma) avec 1% de SDS. Les protéines contenues dans les échantillons ont ensuite été alkylées, digérées et marquées avec les réactifs iTRAQ selon les protocoles du fournisseur (Applied Biosystems), pour obtenir des peptides marqués. Les échantillons contenant les peptides marqués sont appelés ci-après « échantillons marqués ». Les échantillons marqués ont été identifiés en fonction de leur statut : prééclampsie ou contrôles. Puis, les échantillons marqués ont été combinés et lyophilisés. Pour limiter la complexité, les peptides marqués (ci-après « peptides ») ont été lavés et fractionnés par chromatographîe sur colonne d'échange de cations. 200 pg de peptides secs ont été resuspendus dans 1 ml de KH2P04 à 5 mM et 20% d'acetonitrile (Carlo Erba), pH 2.8 (buffer A). 80% des peptides ont été préfractionnés avec une colonne PolySULFOETHYL A column (PolyLC, Columbia, MD) 5 pm de 200 mm de longueur x 2,1 mm de diamètre et une taille de pore de 300 Â, sur une HPLC (Waters625 HPLC) avec un flux constant de 0,2 ml/min. La colonne a d'abord été lavée avec le tampon A du fournisseur pendant 30 min, puis un gradient de 19 min a été appliqué pour augmenter la concentration en tampon B à 63% puis un plateau de 5 min et à nouveau 100% de tampon A pendant 5 min. Des fractions ont été collectées toutes les 30 sec, poolées en fonction de l'absorbance UV à 210 nm (16pg/pool). Pour l'extraction à forte concentration en sel, un dessalage a été réalisé avec une cartouche C18-Sep-Pak (Waters). Les fractions ont ensuite été lyophilisées et conservées à -20°C. Puis les fractions ont été resuspendues dans le tampon TFA 0,1% (Fluka) et 10% acetonitrile (Carlo Erba), puis 2pg ont été injectés à deux reprises dans une nano-HPLC Ultimate 3000 (Dionex). Puis les peptides ont été purifiés à l'aide d'une colonne C18 PepMap (Dionex, 0,3 mm I.D. x 5 mm, taille des pores 100 Â, Particules de 3 pm) à 30 μΙ/min dans du TFA 0,1% (Fluka) et 2% acétonitrile (Carlo Erba). Puis les peptides ont été séparés avec une colonne C18 PepMap 100 (Dionex, 75 μΜ I.D. x 150 mm, taille des pores 100 Â, Particules de 3 pm) à 300 nl/min (solution A: 0,1% TFA, 2% acétonitrile; solution B: 20% solution A mélangée vol/vol avec 80% d'acétonitrile). Après équilibration à 7% de B et un gradient multi-pallier est commencé 3 min après l'injection, avec 16% de B 14 min post-injection, 19% à 22 min, 23% à 25 min, 32% à 51 min, 50% à 65 min et un plateau à 95% pendant 79 min avant une équilibration pendant 16 min. Un fractionnement a ensuite été réalisé pour chaque duplicat de 2pg avec un robot Dionex (Probot), 18 min après le début de l'injection, et la collecte a été couplée directement avec les plaques de MALDI, toutes les 10 secondes pour 384 points par fraction. L'éluant et la solution de matrice ont été mélangés, puis placées sur les plaques de MALDI. La matrice d'acide a-cyano-4- hydrocinnamique (CHCA) a été dissoute à 2 mg/ml dans une solution d'acétonitrile (70%) avec 0,1% de TFA et 110 μ de glu-fibrinopeptide-B pour calibration interne (m/z = 1570.677).
Les spectres de masse ont été mesurés avec un spectromètre 4800 MALDI-TOF-TOF (Applied Biosystems) version 3.5.28193 build 1011 avec un mode de réflexion positive à une fréquence laser fixée. Pour chaque fraction 50 spectres ont été collectés entre 850 et 4000 Da avec une fréquence laser fixée à 200 Hz. 500 spectres par échantillons ont été sommés, et traités pour obtenir les valeurs monoisotopiques avec un spectre brut dont le rapport signal/bruit était supérieur à 20. Chaque spectre a permis de sélectionner les 8 pics les plus abondants, avec un rapport signal/bruit > 15. 1000 spectres MS/MS ont été sommés pour chaque précurseur avec la ligne de base soustraite utilisant l'algorithme de Savitsky-Golay (régression sur un polynôme de degré 4). Pour identifier des protéines non dominantes, une liste d'exclusion a été réalisée à partir d'une série dupliquée.
L'identification des peptides a été réalisée avec ProteinPilot version 2.0.1 (Applied Biosytems, MDS-Sciex, Foster City, CA). L'analyse a été faite par comparaison avec la 'Human Protein Database' de ΙΡΙ (International protein Index version 3.38). Les données ont été traitées en tenant compte du clivage à la trypsine effectué, des cystéines carbamidomethylées, avec la force de recherche fixée à 'thorough'. Une protéine est considérée significativement identifiée quand au moins deux peptides sûrement identifiés sont assignés avec un score de confiance > 95%, et un taux de différence sur l'iTRAQ > 1,2 avec p<0,05.
Les résultats sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous.
TABLEAU 1 : liste des marqueurs présentant une augmentation de la concentration ou une diminution de la concentration, chez les souris transgéniques par rapport à la concentration normale des marqueurs obtenue chez les souris sauvages (groupe contrôle ou « WT »), à 6,5 jours de gestation. Nom du Nombre de
Nom complet Tq/WT à marqueur peptides 6,5 jours
Protein Gm20547 OS=Mus musculus GN=Gm20547 PE=2
Gm20547 SV=1 3 1,34
Putative uncharacterized protein OS=Mus musculus
LIFR GN=Lifr PE=2 SV=1 44 1,24
Serpinalb protein OS= us musculus GN=Serpinalb PE=2
Serpinalb SV=1 9 1,24
Histidine-rich glycoprotein OS=Mus musculus GN=Hrg PE=1
Hrg SV=2 8 1,10
Kngl Kininogen-1 OS= us musculus GN=Kngl PE=1 SV=1 39 1,08
Alpha-l-antitrypsin 1-1 OS=Mus musculus GN=Serpinala
Serpinala PE=1 SV=4 6 1,07
F2 Coagulation factor II OS=Mus musculus GN=F2 PE=2 SV=1 16 1,05
Serine (Or cysteine) peptidase inhibitor, clade A, member 6
Serpinaô OS=Mus musculus GN=Serpina6 PE=2 SV=1 28 0,97
Cycs Cytochrome c OS=Mus musculus GN=Cycs PE=2 SV=1 1 0,97
Carboxylesterase 1C OS=Mus musculus GN=Ceslc PE=1
Ceslc SV=4 51 0,88
Cp Ceruloplasmin OS=Mus musculus GN=Cp PE=2 SV=1 63 0,88
Alpha-2-macroglobulin OS=Mus musculus GN=Pzp
Pzp(A2M) PE=2 SV=1 45 0,85
Kng2 Kng2 protein OS=Mus musculus GN=Kng2 PE=2 SV=1 5 0,82
Apoa2 APOAII OS=Mus musculus GN=Apoa2 PE=4 SV=1 25 0,79
Obpla MCG117626 OS=Mus musculus GN=Obpla PE=2 SV=2 10 0,76
TTR Transthyretin OS = Mus musculus GN=Ttr PE=2 SV=1 18 0,54
La colonne « nombre de peptides » indique le nombre de peptides qui ont clairement été identifiés sur la protéine lors de l'iTRAQ. Plus il y a de peptides identifiés, plus l'identification de la protéine correspondante est sure. Le nombre de peptide indique donc la fiabilité de l'identification de la protéine et donc de la mesure. On peut considérer que la bonne protéine a été identifiée Au-delà de 2 peptides identifiés sur une même protéine. Les résultats globaux à 6,5 jours sont présentés Figure 1. Conclusion :
La concentration des marqueurs présentés dans le tableau 1 est soit augmentée, soit diminuée chez les souris présentant une prééclampsie. Ces marqueurs peuvent donc être utilisés dans le cadre de l'invention.
Les marqueurs présentant un grand nombre de peptides et une augmentation ou une diminution de concentration au moins égale à 20 % par rapport aux souris sauvages sont TTR (Transthyrethin), LIFR, ApoA2 et Obpla. LIFR est apparu comme un marqueur particulièrement intéressant pour le diagnostic ou de pronostic in vitro de la pré¬ éclampsie.
Exemple 3 : étude du marqueur LIFR chez la femme enceinte à 25 semaines de grossesse
La mesure de la concentration de LIFR dans le plasma de femmes enceintes à 25 semaines de grossesse a été réalisée pour la figure 2 et la figure 3 avec le kit de BOSTER (référence ΕΚ120Ό) et en suivant avec précision les recommandations techniques préconisées par le fournisseur. Le détail peut être obtenu sur www.bosterbio.com. Le protocole est standardisé pour fonctionner dans des barrettes constituant une plaque de 96 puits. Le Kit fournit un standard qui permet de réaliser une gamme de réponse par dilutions successives, permettant de calibrer les échantillons inconnus. Après ajout de la dernière solution une coloration jaune plus ou moins intense a été lue en absorbance à 450 nm. Les résultats ont été intégrés dans la gamme standard (de 156 pg/ml à 10 ng/ml) par régression linéaire. Plus précisément, le standard LIFR dilué a été préparé 2 heures avant l'expérience par dilutions consécutives, dans un diluant fourni dans le kit. La gamme a été déposée en duplicats dans 16 puits (8 concentrations) de la plaque de 96 puits fournie. Les 80 autres échantillons étaient des dilutions des échantillons humains, de sérum de femmes enceintes prééclamptiques ou non. La plaque a ensuite été placée lh30 à 37°C. Après avoir vidé le surnageant, on a ajouté 100 μΙ de l'anticorps anti LIFR du kit de BOSTER (référence EK1200) dilué dans le diluant fourni dans le kit. Puis la plaque a été incubée lh à 37°C. Les puits sont alors rincés 3 fois avec 300 pl de PBS. On a ajouté ensuite 100 μΙ par puits de la solution ABC (Avidin-Biotin-Peroxidase Complex) diluée dans le tampon de dilution fourni. On a incubé à 37°C pendant 30 minutes. On a rincé les puits 5 fois en PBS, puis on a ajouté 90 μΙ de tampon T B (contenant le substrat de la peroxydase). Une incubation a été réalisée à 37°C pendant 30 minutes, puis la solution stop du TMB a été ajoutée (100 μΙ). L'absorbance a ensuite pu être mesurée à 450 nM avec un spectrophotomètre. La mesure de la quantité de sFLTla été réalisée pour les figures 3 et 4 avec le kit commercialisé par MyBioSource, sous le numéro catalogue MBS175839, et en suivant avec précision les recommandations techniques préconisées par le fournisseur. Le détail peut être obtenu à http://www.mybiosource.com/. Le protocole est identique à celui présenté pour la mesure de LIFR. Le protocole est standardisé pour fonctionner dans des barrettes constituant une plaque de 96 puits. Le Kit fournit un standard qui permet de réaliser une gamme de réponse par dilutions successives, permettant de calibrer les échantillons inconnus. Après ajout de la dernière solution une coloration jaune plus ou moins intense a été lue en absorbance à 450 nm. Les résultats ont été intégrés dans la gamme standard par régression linéaire.
Marqueur LIFR
Les résultats sont présentés aux Figure 2, 3 et 4. Conclusion pour la première cohorte (figure 2) :
La moyenne de la concentration de LIFR détectée dans le plasma des femmes enceintes était de 11,1 ng/ml dans les contrôles (femmes enceintes sans PE), contre 12,9 ng/ml chez les patientes PE (T-test unilatéral, 0,028, sur cas appariés 0,023). Les résultats confirment que la concentration du marqueur LIFR augmente dans le plasma de femmes enceintes ayant une PE.
Conclusion pour la deuxième cohorte et comparaison avec sFLTl (figures 3 et 41:
Des différences très significatives pour la concentration de s LIFR ont été observées entre les patientes PE et les contrôles (moyenne = 5,1 ng/ml dans les contrôles, 10,6 ng/ml dans les patientes PE (p=l,7 10"5)). Le marqueur de référence, sFLTl a également été testé sur les mêmes échantillons de plasma ; dans ce cas la différence était respectivement de 92 ng/ml et 135 ng/ml dans les contrôles et les patientes PE (p=0,056).
La figure 3 présente la normalisation de la concentration de LIFR par rapport à la quantité totale de protéines, calculée par le test colorimétrique de Bradford par rapport à une gamme d'Albumine de Sérum Bovin. Nous avons obtenu un résultat significatif (1,7 ng/ml vs 3,8 ng/ml, p=0,007). Sur les échantillons les plus précoces (4 contrôles et 3 PE de 6-7 mois, soit 25-30 semaines) les contrôles présentaient une concentration moins élevée en LIFR que les patientes PE. Les données suggèrent que sLIFR est plus performant que sFLTl dans la discrimination d'un échantillon provenant d'une patiente PE ou contrôle. En outre, en dépit du nombre limité d'échantillons précoces (autour de 25 semaines), les écarts observés sont aussi importants précocement que tardivement dans la grossesse (figure 4).
Exemple 4 : études des marqueurs LIFR. TTR. sFLTl, PAPP-A. PIGF et du ratio sFLTtl/PIGF chez la femme enceinte autour de 13-14 semaines de gestation
Des échantillons de plasmas de femmes enceintes prélevés autour de 13-14 semaines de gestation et qui ont ensuite développé une PE ont été récupérés. Cette échantillons sont systématiquement analysés par une méthode ELISA en plaque, pour tous les marqueurs recherchés LIFR (Kit BOSTER), TTR (Kit Abcam), sFLTl (Kit R&D), PAPP-A (Kit Thermofisher) et PLGF (Kit R&D). Pour rappel, le protocole standard de mesure ELISA est le suivant. Le Kit fournit un standard qui permet de réaliser une gamme de réponse par dilutions successives, permettant de calibrer les échantillons inconnus. Après ajout de la dernière solution une coloration jaune plus ou moins intense peut être lue en absorbance à 450 nm. Les résultats sont intégrés dans la gamme standard (de 156 pg/ml à 10 ng/ml) par régression linéaire.
La concentration en marqueur est déduite par la mise en œuvre de protocoles similaires, détaillés par chacun des kits. Par exemple, pour le marqueur LIFR, le standard LIFR dilué est préparé 2 heures avant l'expérience par dilutions consécutives, dans un diluant fourni dans le kit. La gamme est déposée en duplicats dans 16 puits (8 concentrations) de la plaque de 96 puits fournie. Les 80 autres échantillons sont une dilution des échantillons humains. La plaque est ensuite placée lh30 à 37°C. Après avoir vidé le surnageant, on ajoute 100 μΙ de l'anticorps anti LIFR dilué dans le diluant fourni dans le kit. Puis la plaque est incubée lh à 37°C. On ajoute ensuite 100 μΙ par puits de la solution ABC (Avidin- Biotin-Peroxidase Complex) diluée dans le tampon de dilution fourni. On incube à 37°C pendant 30 minutes. On rince les puits 5 fois en PBS, puis on ajoute 90 pl de tampon TMB (contenant le substrat de la peroxydase). Une incubation est réalisée à 37°C pendant 30 minutes, puis la solution stop du TMB est ajoutée (100 μΙ). L'absorbance peut ensuite être mesurée à 450 nM avec un spectrophotomètre. Les concentrations en protéines seront déduites par régression linéaire ou régression puissance par rapport aux gammes fournies. Example 5 : études des marqueurs LIFR, TTR, sFLTl, sENG, PIGF, du ratio sFLTtl/PIGF et de sLIFR x sFLT chez la femme enceinte lors du premier trimestre de grossesse (<12 semaines)
Matériel et Méthodes Echantillons humains : 150 échantillons de plasma humain ont été obtenus en collaboration avec l'équipe du Pr Stefan Hansson (Lund, Suède). Les échantillons ont été collectés lors du premier trimestre de grossesse de patients après signature du consentement éclairé à l'hôpital de Lund. Après analyse, 50 échantillons contrôles et 100 échantillons de patientes atteintes de pré-éclampsie ont été inclus dans l'étude.
Analyse biochimique
Les échantillons de plasma ont été dilués dans un diluant compatible avec la technique ELISA dans un plaque 96 puits pour microtitration. Les kits ELISA sFLTl, sLIFR, sENG, PIGF et TTR ont été achetés respectivement auprès de Origene, BosterBio, NetBiotech, Cohésion Biosciences et NetBiotech. Les tests ELISA ont été réalisé selon les recommandations générales des fournisseurs, tel que détaillé ci-dessous.
Pour chaque test ELISA, 10 μΙ de plasma ont été dilués dans 90 μΙ de diluant, sauf pour l'ELISA TTR pour lequel les échantillons de plasma ont été dilués au 1/10 000, puis les échantillons dilués ont été analysés sur plaques 96 puits dans lesquels sont fixés des anticorps capables de reconnaître la protéine d'intérêt (sFLTl, sLIFR, sENG, PIGF ou TTR) pendant lh30 à 2h à 37°C. Le liquide a ensuite été enlevé des puits et un anticorps secondaire capable de reconnaître la protéine d'intérêt a été ajouté (100 μΙ, dilué au 1/100) puis incubé lh à 37°C. Les échantillons ont ensuite été lavés 3-4 fois avec 300μΙ de PBS 0.01X ou un tampon spécifique de lavage. Après chaque étape de lavage, le liquide a été enlevé et la plaque retournée sur un papier absorbant, tout en évitant aux échantillons de sécher. Puis un second anticorps anti-Fc couplé à la HRP (Horse Radish Peroxidase) a été ajouté dans les puits (ΙΟΟμΙ, dilué au 1/100) puis la plaque a été incubée 30 min à 37°C. Les échantillons ont ensuite à nouveau été lavés avec du PBS 0.01X ou un tampon spécifique de lavage 5 fois, et à chaque lavage le liquide a été enlevé et la plaque retournée sur un papier absorbant. En fin, le substrat de la HRP a été ajouté dans les puits (90μΙ) ce qui a entraîné une coloration bleue proportionnelle à la quantité de protéine d'intérêt présente dans l'échantillon. En parallèle, 2 x 8 puits ont été utilisés pour préparer des échantillons standards pour chacune des protéines d'intérêt qui ont servi à faire les gammes étalon correspondantes (de 10 ng à 156 pg de protéine d'intérêt et un blanc). Ensuite, une solution stop acide (50μΙ ou ΙΟΟμΙ, selon les instructions du manuel d'utilisation), a été ajouté dans chacun des puits ce qui a entraîné un changement de couleur du bleu au jaune d'intensité proportionnelle. La plaque a ensuite été lue automatiquement par un lecteur de plaques (Berthold) ajusté à 450 nm. Les résultats ont été stockés dans un fichier Excel.
Analyse mathématique Une courbe étalon a été construite par analyse de régression (linéaire ou non-linéaire pour obtenir l'ajustement optimal évalué par le coefficient de détermination, R2) à partir des échantillons standards, puis les concentrations en protéine d'intérêt de chaque échantillon de plasma ont été estimées en appliquant la courbe de régression et en tenant compte du facteur de dilution. Puis les résultats de l'analyse des échantillons de plasma ont été analysés par des tests paramétriques (Student t-tests) et non paramétriques (Mann-Whitney) en utilisant le logiciel StatisfXL d'Excel. De plus, le regroupement des marqueurs a été analysé en utilisant un outil de classification en arbre hiérarchique de StatisfXL à partir de la matrice de corrélation inter marqueurs. Les courbes ROC ont été calculées avec le logiciel développé par John Eng sur le site internet http://www.rad.jhmi.edu/jeng/javarad/roc/JROCFrn.html
Résultats
Les résultats sont présentés aux figures 5 à 10
Figure 5 : les marqueurs PIGF et sENG (marqueurs de l'art antérieur) ont été testés sur les 150 échantillons de plasma humain. La concentration du marqueur PIGF est diminuée dans les échantillons PE (Prééclampsie) par rapport aux échantillons contrôle (CTL). La concentration du marqueur sENG est augmentée dans les échantillons PE (Prééclampsie) par rapport aux échantillons contrôle (CTL). Ces résultats sont donc cohérents avec ce qui est déjà décrit dans la littérature pour les marqueurs PIGF et sENG. Par contre, les marqueurs PIGF et sENG pour le diagnostic de la prééclampsie n'ont pas semblé donner des différences statistiquement significatives. Néanmoins, un échantillon a semblé être problématique (point aberrant) dans la cohorte CTL (contrôle). En retirant cet échantillon, le diagnostic de la prééclampsie avec le marqueur sENG est devenu statistiquement significatif.
Figure 6 : la concentration du marqueur TTR est significativement diminuée en tests paramétriques et en tests non paramétriques dans les échantillons PE (Prééclampsie) par rapport aux échantillons contrôle (CTL). Nous avons néanmoins observé des recouvrements.
Figure 7 : la concentration du marqueur sFLTl est significativement augmentée en tests paramétriques et en tests non paramétriques dans les échantillons PE (Prééclampsie) par rapport aux échantillons contrôle (CTL). Ce marqueur a donné d'excellents résultats dans la détection de la pré-éclampsie avec un facteur moyen de 6 fois plus dans les cas pathologiques.
Figure 8 : la concentration du marqueur sLIFR est significativement augmentée en tests paramétriques et en tests non paramétriques dans les échantillons PE (Prééclampsie) par rapport aux échantillons contrôle (CTL). Ce marqueur s'est montré extrêmement performant dans la détection de la pré-éclampsie, en particulier après l'élimination de l'échantillon contrôle se comportant de façon aberrante (le même que pour sENG et PIGF). L'écart moyen a été de l'ordre de 6 fois.
Figures 9 et 10 : les courbes combinant deux marqueurs montrent un excellent résultat des marqueurs « synthétique » sFLTl/PIGF et sFLTl x sLIFR. Par exemple des valeurs de l'ordre de 10 fois supérieures dans le groupe PE, et une très bonne puissance prédictive de l'occurrence de la prééclampsie pour sFLTl x sLIFR. L'aire sous la courbe de ROC (0.87) a été maximale par rapport aux marqueurs isolés ou dans d'autres combinaisons.

Claims

Revendications
Procédé de diagnostic ou de pronostic in vitro de la pré-éclampsie comprenant : a) la mesure dans un échantillon de fluide biologique issu d'une femme enceinte de la concentration d'un ou de plusieurs marqueurs choisi parmi LJFR, TTR (Transthyrétine), ApoA2 et Pzp (A2M), de préférence LIFR et/ou TTR, seul(s) ou en combinaison avec un ou plusieurs autres marqueurs,
b) l'utilisation du résultat de la mesure de l'étape a) dans le diagnostic ou le pronostique de la pré-éclampsie, dans lequel un diagnostic positif ou un pronostic positif est donné par une augmentation ou une diminution de la concentration du ou des marqueur(s) par rapport à la concentration normale du ou des marqueur(s) obtenue chez les femmes enceintes.
Procédé selon la revendication 1, ledit fluide biologique est choisi parmi le sang, le plasma, le sérum, le plasma, l'urine, la salive ou le liquide amniotique, de préférence le sérum.
Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, ladite femme enceinte se trouve dans une période de gestation inférieure ou égale à 20 semaines, de préférence inférieure ou égale à 16 semaines, de préférence dans une période de gestation comprise entre 7 semaines et 16 semaines.
Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, ledit marqueur est sous une forme circulante (sLIFR, sTTR, sApoA2 et sPzp).
Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, ledit un ou plusieurs autres marqueurs étant choisis parmi sENG, sFLTl, PIGF, PAPP-A, hémoglobine f tale et/ou hémopexine.
Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, comprenant une étape a^ le calcul d'un ou plusieurs ratios de deux marqueurs et éventuellement le calcul d'un ou plusieurs ratios de deux autres marqueurs, de préférence le calcul du ratio LIFR/TTR, sFLTl/PIGF et/ou s LIFR x sFLTl. Utilisation d'un ou plusieurs marqueurs dans l'évaluation in vitro de la pré- éclampsie dans un échantillon de fluide biologique issu d'une femme enceinte, dans laquelle un diagnostic positif ou un pronostic positif est donné par une augmentation ou une diminution de la concentration du ou des marqueurs par rapport à la concentration normale du ou des marqueur(s) obtenue chez les femmes enceintes, le ou lesdits marqueurs étant choisi parmi LIFR, TTR (Transthyrétine), ApoA2 et Pzp (A2M), de préférence LIFR et/ou TTR, seul(s) ou en combinaison avec un ou plusieurs autres marqueurs.
Utilisation d'un ou plusieurs anticorps dirigés contre un ou plusieurs marqueurs dans l'évaluation in vitro de la pré-éclampsie dans un échantillon de fluide biologique issu d'une femme enceinte, dans laquelle un diagnostic positif ou un pronostic positif est donné par une augmentation ou une diminution de la concentration du ou des marqueurs par rapport à la concentration normale du ou des marqueurs obtenue chez les femmes enceintes, le ou lesdits marqueurs étant choisi parmi LIFR, TTR (Transthyrétine), ApoA2 et Pzp (A2 ), de préférence LIFR et/ou TTR, seul(s) ou en combinaison avec un ou plusieurs autres marqueurs.
Utilisation selon l'une quelconque des revendications 7 ou 8, ledit un ou plusieurs autres marqueurs étant choisi parmi sENG, sFLTl, PIGF, PAPP-A, hémoglobine foetale et/ou hémopexine.
10. Kit de diagnostic ou de pronostic utile pour la mise en œuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 6.
11. Méthode de traitement d'une prééclampsie chez une femme enceinte, comprenant :
(iii) la mise en œuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, et
(iv) lorsque le diagnostic est positif ou le pronostic est positif, instaurer un traitement approprié chez la femme enceinte.
12. Méthode selon la revendication 11, ledit traitement approprié est un ou plusieurs médicaments choisis parmi l'aspirine (acide acétylsalicylique), le sulfate de magnésium, les anti-hypertenseurs, les corticostéroïdes, les héparines de bas poids moléculaire, les régulateurs du cholestérol et les régulateurs du stress oxydatif, de préférence l'aspirine.
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