[go: up one dir, main page]

WO2017213486A2 - Combinación de reguladores metabólicos bioenergéticos y nutra-epigenéticos, compuestos nutracéuticos en combinaciónes convencionales y nanotecnológicas para revertir y prevenir la sesencencia celular acelerada por daño crónico producida por diabetes y otras enfermedades complejas crónico-degenerativas - Google Patents

Combinación de reguladores metabólicos bioenergéticos y nutra-epigenéticos, compuestos nutracéuticos en combinaciónes convencionales y nanotecnológicas para revertir y prevenir la sesencencia celular acelerada por daño crónico producida por diabetes y otras enfermedades complejas crónico-degenerativas Download PDF

Info

Publication number
WO2017213486A2
WO2017213486A2 PCT/MX2017/000061 MX2017000061W WO2017213486A2 WO 2017213486 A2 WO2017213486 A2 WO 2017213486A2 MX 2017000061 W MX2017000061 W MX 2017000061W WO 2017213486 A2 WO2017213486 A2 WO 2017213486A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
formulation
diabetes
composition
cells
combination
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/MX2017/000061
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2017213486A3 (es
Inventor
Horacio ASTUDILLO DE LA VEGA
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US15/176,422 external-priority patent/US10285963B2/en
Priority to RU2018147077A priority Critical patent/RU2749950C2/ru
Priority to EP17810608.4A priority patent/EP3470060B1/en
Priority to CA3027048A priority patent/CA3027048A1/en
Priority to BR112018075395-5A priority patent/BR112018075395A2/pt
Priority to CN201780046806.6A priority patent/CN109890369B/zh
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to ES17810608T priority patent/ES2988151T3/es
Priority to JP2019517750A priority patent/JP2019521184A/ja
Publication of WO2017213486A2 publication Critical patent/WO2017213486A2/es
Publication of WO2017213486A3 publication Critical patent/WO2017213486A3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
    • A61K31/05—Phenols
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics

Definitions

  • the present invention focuses on the definition of pharmaceutical compositions and the proposed method for the treatment of metabolic syndrome, diabetes mellitus and aging. Compounds and compositions of natural origin are described in the description. More particularly, this invention relates to a method of disease treatment based on the use of responses developed in cellular systems and mammalian organisms (animals and humans) with pharmaceutically acceptable doses of the compounds that are part of Formulation I, such as control of metabolism and growth cells.
  • Metabolic syndrome formerly known as syndrome X, is an intermediate state between normal metabolism and type 2 diabetes mellitus. It is an emerging epidemic that has been defined as a series of metabolic risk factors that predispose to heart disease and coronary and chronic renal failure, among other pathological states.
  • the metabolic syndrome is associated with abdominal obesity, atherogenic dyslipidemia, hypertension, proinflammatory and prothrombotic state, with or without glucose deterioration, that is, diabetes.
  • Symptoms are related to high levels of triglycerides, low levels of high density lipoproteins, increased blood pressure or hypertension and increased glucose levels. and symptoms of inflammation. Each tub of these characteristics is a significant risk factor for the development of vascular dysfunction and cardiovascular, renal and hepatic diseases (EcJcel R.
  • Metabolic syndrome increases the risk of premature death, therefore, effective and affordable strategies to help reduce cardiometabolic alteration factors and to control the syndrome are important goals to benefit a large population that is at high risk.
  • the treatment of metabolic syndrome includes changes in lifestyle, along with drug treatment.
  • a series of medications designed to control altered levels of metabolites associated with the manifestation of disease status have been developed, incorporating various Biologically active nutritional compounds aimed at the same objective.
  • the functional knowledge of the impact of nutrients, especially amino acids and polyphenols in the diet on different molecular objectives makes it possible to develop a composition of natural compounds to treat obesity, metabolic syndrome, diabetes and aging.
  • Patented pharmaceutical compositions comprising D-tagatose with or without stilbene or stilbeneide, or derivatives thereof, to prevent or treat atherosclerosis, metabolic syndrome, obesity or diabetes.
  • Silbenoids such as resveratrol (3,5,4-trihydroxy-trans-stilbene) which is a type of natural phenol and a phytoalexin produced in plants was applied during the response to attack by pathogens or other injury. Large amounts of resveratrol can be found in different types of berries, grapes, blueberries, etc. (Fremont in Life Sci, 2000, 66: 663).
  • Sirtuins are enzymes with histone deacetylase activity and some transcription factor activity that regulate the metabolic pathways involved in the development of cardiovascular diseases, aging and stress resistance (Jiang WJ Biochem. Biophya. Rea. Commun., 2008, 373 (3): 341). Resveratrol is considered to directly or indirectly activate SIRT1 (NAD-dependent deacetylase sirtuine-1) and PGC-1 (co-activator of the gamma receptor activated by the peroxisome proliferator) and affects the functioning of mitochondria (Lagouge M.
  • SIRT1 NAD-dependent deacetylase sirtuine-1
  • PGC-1 co-activator of the gamma receptor activated by the peroxisome proliferator
  • Resveratrol has also been found to act as a 6PER agonist (GPR30) (estrogen receptor 1 coupled to protein G, also known as receptor 30 bound to protein G) (Frossnitz ER and Barton M. in Mol. Cell. Endocrin. , 2014, 389 (1-2): 71).
  • GPR30 estrogen receptor 1 coupled to protein G, also known as receptor 30 bound to protein G
  • a possible mechanism of action of resveratrol can be attributed to the modulation of autophagy (autophagocytosis - aimed at eliminating the components of the dysfunctional mechanism) (Ghosh HS et al., In PLoS ONE, 2010, 5 (2) e9199).
  • Peroxisomes are organelles that can cause diseases and aging processes while not working properly.
  • the ability to stimulate the activity of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and inhibit platelet aggregation is attributed to resveratrol (Vita JA Duffy SJ in Curr Opinion Lipid, 2003, 14 (1), 21; Olas B. and Wachowicz B. in Platelets, 2005, 16 (5): 251).
  • Vegetable extracts can be considered as Resveratrol analogs of antioxidant origin.
  • U.S. Patent No. 2016 / 9,278,104 of March 8, 2016, to Romero T. established the use of Nelumbo Nucifer leaf extract to reduce and / or eliminate one or more risk factors associated with metabolic syndrome.
  • the composition considers the presence of creatinine - a nitrogenous organic acid very similar to the amino acid structure located in the muscles and nerve cells of different living organisms. It is naturally synthesized in the liver, pancreas and kidneys from amino acids such as arginine, glycine and methionine at a rate of one gram of creatine per day. It is considered as an immediate and direct vector for transporting ATP and supplying energy to muscle myofibrils.
  • 016 / 9,241,964, of January 26, 2016, establishes the composition of phytochemical fractions for pharmaceutical use or as a dietary supplement derived from indigenous Sphaeranthua and / or Garcinia mangostana.
  • the composition is applied for obesity, metabolic syndrome, diabetes and other metabolic disorders of control, prevention and treatment, and also to regulate energy expenditure, prevention of atherosclerotic plaques in the coronary artery and abdominal aorta, increase sensitivity to insulin, control of glucose levels, triglyceride levels and balance of glucose levels in mammals. Extracts containing amino acids are mentioned among other components; However, those are not revealed.
  • composition can be selected for the treatment and prevention of metabolic syndrome, obesity, diabetes and aging.
  • Varfolomeev S.D. and Gurevich K. G. performed a biocomputer analysis demonstrating that the amino acid glycine is found more frequently (37.5%) at defined positions of primary sequences in different enzyme families.
  • the authors attribute this property to the role of glycine in the enzymatic architecture: to be an amino acid with the chiral atom that allows movement and flexibility to protein chains. This demonstrates the importance of glycine for metabolism.
  • the following 5 amino acids are aspartic acid (12.9%), cysteine (6.7%), histidine (6.2%) and arginine (5.5%). Cysteine is responsible for maintaining the conformation of several proteins due to the formation of sulfur bridges. Histidine and arginine as aspartic acid are common in the active sites of enzymes playing a role in the catalytic site as nuclear and electrophilic agents.
  • Cysteine is the limiting substrate for glutathione synthesis, responsible for protecting cells against viruses, bacteria, fungi, carcinogens, as well as against other pathological conditions. Oral cysteine applied without other components is not recommended because it is rapidly catabolized in the gastrointestinal tract into a toxic state. Cysteine has antioxidant properties, because to the ability of the thiols to participate in redox reactions. These antioxidant properties of cysteine are mostly expressed in tripeptide glutathione. The availability of oral glutathione is insufficient, so it must be biosynthesized from the amino acids that constitute cysteine, glycine and glutamic acid, of which cysteine is the limiting substrate.
  • the control of cell proliferation is essential for the proper functioning of any organism.
  • the alteration of this regulation is the cause of diseases such as cancer - with unlimited and uncontrolled cell proliferation due to genetic mutations.
  • a loss of cell proliferation capacity is one of the factors that cause aging.
  • Extracellular control of cell division can be performed by cell cycle mitogens, various growth factors as well as survival factors.
  • the mitogens are proteins that stimulate cell division, counteracting the mechanisms of intracellular arrest (Rb) that block the progression of the cycle.
  • any organism or organ depends on growth as well as cell division. If cells divide without growing, they would be more and more little. Growth factors stimulate cell growth (increase in cell mass) by promoting the synthesis and inhibition of proteins and other macromolecules. Cell growth does not depend on the cell cycle. For example, nerve and muscle cells grow especially after cell division. Like most mitogens, growth factors bind to cell surface receptors that then activate different intracellular signaling pathways, which can induce: increased protein synthesis or decreased protein degradation. All this will lead to cell growth.
  • Survival factors favor cell survival by suppressing intracellular death programs or apoptosis. These signals need other cells to survive help cells survive only when and where it is required. Neurons, for example, are produced in excess and compete with each other to obtain growth factors and those with the greatest amount will survive. As mitogens and growth factors, survival factors tend to bind to cell membrane receptors that activate intracellular signaling pathways that inhibit cell death, usually regulating proteins belonging to the Bcl-2 family. Some survival factors are IL-3, SCF, IGF-1, which are secreted primarily by the liver in response to growth hormone (6H) signals.
  • 6H growth hormone
  • the object of the present invention is to provide the use of a formulation consisting of resveratrol, glycine, arginine and cysteine, setting the range of component concentrations based on the Art model study / girl 9 saline What is patented in this case is the use of the formulation, and the method of its application for the treatment of diseases.
  • the formulation has the new effect of stimulating the proliferation of cell cultures and lymphocytes in vitro, without evidence of genotoxicity, revealing the ability to decrease the formation of visceral fat observed in healthy laboratory animals induced to diabetes, controllability of the glyceraic index with less insulin or without insulin shown in the model of aloxane-induced diabetes, the cytoprotective effect of the treatment presented in the pancreas of animals treated with aloxane, the correction of the symptoms of metabolic syndrome and obesity in patients treated for a period of 6 months.
  • the formulation has a revitalizing ingredient that acts at the level of energy production, restoration of oxygen metabolism and reactivation of various enzymatic cycles related to the metabolism of sugar, fatty acids and cholesterol, increasing the energy available in the cells for greater functionality and vitality expressed in terms of increased proliferation.
  • Examples show that when said formulation is applied in animals and humans, altered functions related to negative factors of diabetes, obesity and / or metabolic syndrome are normalized. According to these examples, treatment with the designed formulation is a method to control aging, metabolic syndrome, obesity and diabetes.
  • FIG. 1 Toxicity expressed in terms of mortality of A. salina, shown by the components resveratrol (R), glycine (G), arginine (A) and cysteine (C) applied at different concentrations.
  • Figure 2. Viability of A. salina in the presence of different concentrations of Formulation i.
  • Figure 4 Test genotaxicity of Formulation I applied at different concentrations in nononuclear cells (lymphocytes) above, - electrophoresis plates; in the middle, - percentage of integrated DNA (head) (* p ⁇ 0.05 vs. control with REME); below - the calculation based on the results of the end of the electrophoresis sample (* p ⁇ 0.05 versus the positive control with 3 ⁇ 4 (1 ⁇ 4 0.1 nM).
  • Figure 5 Effect of different concentrations of Formulation I on the viability of the culture of HEK-293 cells of the embryonic human kidney cell line (above) and culture of African green monkey kidney cells (Vero).
  • Figure 6 Graphical representation of the values for blood chemistry parameters in animals with and without treatment with Formulation I: top - male rabbits; below - male rats, before the application of the single dose and after 14 days of application of 1000 mg / kg.
  • FIG. 7 Dynamics of weight change (upper part) and glucose concentration (capillary glycemia) (below) in different groups of laganorphic animals undergoing treatment: I - insulin and 50, 70, 90 mg / kg - in Formulation dose I.
  • Figure 8 Dynamics of weight change (above) and glucose concentration (capillary glycemia) (below) in different groups of rodents undergoing treatment with insulin and 50, 70, 90 mg / kg - in Formulation I dose.
  • FIG. 9 Comparison of the histological changes observed at the pancreas level in rabbits with induced diabetes, treated and not treated with Formulation I and insulin. Top - histological section of tissue removed from treated female pancreas only with insulin, complete destruction of the demonstrated organ: only adipose tissue with congested blood vessels and two lymph nodes with reactive changes was found, deliberate search was performed without identifying feasible pancreatic tissue.
  • FIG. 10 Comparison of histological changes observed at the renal level in rabbits of induced diabetes treated and not treated with Formulation I and insulin.
  • the characteristic details of the invention consist in defining Formulation I, defining its application, biological effects in living systems at different levels (cellular animals, healthy or diabetes-induced animals, human organism).
  • the following paragraphs describe the purpose of defining the invention, illustrating the novelty and utility of the present invention, but without limiting its scope and not intended to unduly limit it.
  • the following examples are based on tests performed to define Formulation I, as well as to test their effects on in vivo and in vivo systems.
  • composition according to claim 1 further characterized in that it comprises one of the modalities of the potential combinations of compounds of the present invention with greater therapeutic effect for cases of advanced disease, as well as the integration of a modality nanoparticles that decrease the dosage regimen
  • Formulation I is exemplified here, the following composition of biologically active components is considered: 5.7 mg of resveratrol, 74.3 mg of glycine, 5.7 mg of arginine and 2.9 mg of cysteine / kg of weight or kg of solvent, for use in mammals (including humans) or cell cultures, respectively.
  • Resveratrol concentration was selected considering the results defined in Example 1, that is, approximately 15 times less than its CL5 0 to prevent the manifestation of toxicity.
  • the weight of arginine was taken equivalent to resveratrol, cysteine approximately 2 times less than resveratrol and glycine as 13 times the weight of resveratrol.
  • Formulation I is an example of the mixture of biologically active components, which should not limit the scope of the invention.
  • the dose of Formulation I of 88.6 mg / kg is defined in this case.
  • Formulation I an assay similar to that described in Example 1 was performed to define the interval of toxicity thereof. The results are presented in Figure 2. It is shown that at a concentration less than or equal to 500 ppm, 100% of A. salina nauplii are kept alive and at 1000 ppm of Formulation I only 58% are alive. This indicates that, according to the model applied, Formulation I is not toxic up to a concentration of up to 500 ppm, but at concentrations higher up to 1000 ppm a moderately toxic behavior is shown. This demonstrates that using Formulation I, its concentration can be varied over a wide range of concentrations and doses considering the absence of toxicity.
  • Formulation I was applied to an assay to determine its effects on human cells, that is, to stimulate growth effects (mitogenic effect) or cause cell death (cytotoxic effect).
  • an in vitro biological system using mononuclear cells cultured from peripheral blood mononuclear cells-peripheral human lymphocytes was used.
  • the system was selected because they form 25 to 35% of leukocytes and are the main promoters of the immune response since they recognize foreign antigens and activate mediators of cellular immune response, causing proliferation or suppression phenomena before endogenous or exogenous stimuli.
  • These cultures are widely used in research to evaluate the effects of various compounds (Marti-Cencken R. et al., In J. Med Chem Eur, 2015, 103: 488).
  • peripheral blood mononuclear cells isolated by a FicollHypaque density gradient (Sigma-Aldrich) were obtained by centrifugation at 1200 revolutions per minute (rpm) for 30 minutes at 25 ° C.
  • the PBMCs were washed twice with PBS IX, the cell pellet was finally resuspended in culture medium.
  • PBMCs consist of monocytes and lymphocytes. Monocytic cells are characterized as adherent cells that lack proliferative potential.
  • lymphocytes which are cells in suspension, capable of proliferating after an endogenous or exogenous stimulus.
  • the PBMCs obtained were grown horizontally. in boxes of 25 cm 3 so that the monocytes adhered to the surface for a period of 5 hours at 37 ° C with a humidified atmosphere, in an atmosphere of 5% CO 2 . After the incubation time, the lymphocytes - the cells that remained in suspension were separated into sterile 1.5 ml tubes and centrifuged at 1200 rpm for 10 minutes (Eppendorf Centrifuge 5810-R), and then 1 mL of culture medium was added to the cell container.
  • a suspension of 500,000 cells / mL in Eppendorf tubes was prepared to which different concentrations of Formulation I (200, 400, 600, 800, 1000 and 2000 ppm) were added by adding a positive control of 1.25 mg / ml of concanavalin A - a cell proliferation inducer and untreated blank cells, the culture medium was added. Samples were incubated at 37 ° C in a humidified atmosphere with 5% CO 2 for 48 hours, sufficient for lymphocytes to complete cell division showing a similar positive control proliferation (With A) by the product or causing cellular toxicity of the contrary.
  • Formulation I 200, 400, 600, 800, 1000 and 2000 ppm
  • the Eppendorf tubes containing the different samples were centrifuged at 1200 rpm for 10 minutes, the supernatant was decanted and the cell packet was resuspended in 1 mL of RPMI-1640.
  • Example 3 shows that the proliferative effect and the inhibitory effect shown in Example 3 are not related to the level of DNA damage (acid deoxyribonucleic).
  • the comet assay was developed, a fast, sensitive, simple and quantifiable method to measure the degree of damage at the level of deoxyribonucleic acid (DNA).
  • This assay is accepted as a tool to investigate deleterious compounds or effects on DNA repair (Azgueta A. and AR Arch Toxicol Colline, 2013, 87: 949). It is used in in vivo, in vitro, ex vivo systems in different scientific disciplines for genotoxicity tests, preclinical and clinical studies, ecotoxicological genetic tests, cytogenetics, photogenotoxicity and the like.
  • the cells were resuspended in 1 ml of RPMI 1640 medium and centrifuged again at 1200 rpm for 5 min, the supernatant was discarded and the cells were incubated with 1 mL of lysis solution (2.5 M NaCl, 100 mM Na 2 EDTA, 10 mM Tris HCl and 1% Triton) at 4 ° C for 24 h. After 24 h, the vials are centrifuged at 1200 rpm at 4 ° C. The supernatant was discarded and the cells were treated with 1 mL of neutralization buffer (0.4 M Tris pH 7.5) for 5 min at 4 ° C.
  • 1 mL of neutralization buffer 0.4 M Tris pH 7.5
  • the vials were centrifuged at 1200 rpm for 5 min at 4 ° C, the cells were resuspended in 0.02 mL of charge pH regulator (0.25% bromophenol blue, 50% glycerol, 10 mM TrisHCl and 50 mM NaaEDTA).
  • Agarose gels were prepared by dissolving 1% in saline phosphate pH regulator (PBS) in a heating plate at 100 ° C. Once dissolved, and at 60 ° C, 0.01 mL of Gelred (compound of fluorescent staining DNA) was added. This mixture was placed in a horizontal electrophoresis chamber for 60 min.
  • the lysed cells were loaded on agarose gels and incubated with the electrophoresis solution (1 mM Na2EDTA and 300 mM NaOH at pH 13.5) for 20 minutes at 4 ° C. Electrophoretic operation was performed at 25 V and 300 ⁇ for 30 min at 4 ° C. The gels were removed from the electrophoresis chamber and revealed in a fluorescent signal analysis chamber. The generated images were acquired with a high resolution digital camera ( Figure 4, above) and analyzed with ImageQuant TL v8.1 software. The area of the comet's head that represents the intact DNA was quantified by densitometric analysis and was plotted as a percentage against the negative control (culture medium) ( Figure 4, in the middle).
  • the comet's tail representing the damaged DNA was measured in millimeters and represented as the percentage of the positive control (H 2 O 2 ). Data were expressed as mean ⁇ mean standard deviation ( Figure 4, below). The data obtained were analyzed by analysis of variance (ANOVA) using, in case of any difference, a post-hoc Tukey test using GraphPad Frism v6.0 software, at p ⁇ 0.05.
  • MTT is a yellow dye reduced to formazaxy (blue dye) by mitochondrial dehydrogenases, which are part of the respiratory chain of viable cells (Hwa et al., 2015). It is used in a quantitative method of colorimetric microdilution applied for the determination of survival and proliferative capacity of mammalian cells (Mosmann T. in J. Immunol Methods, 1983, 65 (1-2): 55). It is an adequate in vitro test to evaluate cell proliferation and cytotoxicity because it is simple, efficient, economical, reproducible, sensitive, safe and effective in terms of the viable cell population.
  • DMEM / F12 Eagle Minimum Essential medium modified by Dulbecco / F12
  • FBS fetal bovine serum
  • FBS fetal bovine serum
  • a 0.25% trypsin (Difco) solution was prepared.
  • Serial dilutions were prepared from a 2000 ppm stock solution of Formulation I and Triton X-100 as DMEM / F12 solvent. 1 mL of each dilution were prepared to obtain concentrations of 1.95, 3.91, 7.81, 15.63, 31.25, 62.50, 125, 250, 500 and 1000 ppm.
  • the cells of each cell culture were grown using DMEM / F12 culture plates of 25 was 3 until a confluent monolayer was obtained on the plate surface.
  • the conditions used for cell culture were 37 ° C, humidified atmosphere with 5% CO 2 .
  • the confluent cell monolayer was removed from plates 25 cm 3 using 0.25% trypsin.
  • DMEM / F12 medium was removed, then the monolayer was washed 1 to 3 times with pH regulator of saline phosphate IX, then 0.5 mL of 0.25% trypsin was added and the content was incubated at 37 ° C in a humidified atmosphere with 5 % of CO 2 for 5 min.
  • DMEM / F12 3 mL of DMEM / F12 was added on the raised cells, the cells were resuspended with a 0.1-1 mL micropipette and placed in a sterile 15 mL conical tube, then centrifuged at 1000 rpm for 5 min. DMEM / F12 was removed from the conical tube. 3 mL of DMEM / F12 was added to the cell pack, the cells were resuspended and counted in a Neubauer chamber. Then a cell suspension of 250,000 cells / mL was prepared.
  • 0.1 mL of the 250,000 cell / ml microplate cell suspension per well was added to all wells of a 96-well microplate, the microplate was incubated at 37 ° C in a humidified atmosphere with 5% CO 2 for 24 h.
  • DMEM / F12 medium was removed from each well in vacuo, keeping the monolayer at the bottom of each well, then 0.1 mL of each dilution prepared from Formulation I and Triton X-100 (1.95, 3.91, 7.81, 15.63, 31.25, 62.50, 125, 250, 500, 1000 and 2000 ppm).
  • Formulation I solutions were tested in quintuplicate and positive control solutions were tested in triplicate. The trial was held in three separate events.
  • the LC 50 data of Formulation I and Triton X-100 were estimated using the Graph Pad Prism version 6 Statistical Package, using Student's t-test (p ⁇ 0.05). The results of the data analysis are expressed as the average ⁇ standard deviation ( Figure 5).
  • the positive control (Triton X-100) showed a dose-dependent effect, since a decrease in absorbance was observed increasing the concentration of this substance, as expected, since it is a cytotoxic compound , without any increase in viability (values greater than 100%), at any of the concentrations tested, but a decrease in absorbance was detected compared to the vaccine (without treatment).
  • LC 50 were estimated for Formulation I and Triton X-100 with values of 2,417.00 ⁇ 65.77 and 764.10 ⁇ 21.93 ppm for the HEK-293 cell line and 4,289.00 ⁇ 289.90 and 42.80 ⁇ 1.60 ppm for the Vero cell line, respectively.
  • the animals were kept in individual cages and were continuously observed during the first 24 h after the administration of Formulation I, continuing the observation and intermediate veterinary care necessary for each trial period that is recorded in a log book for any animal response. Body weight was determined and recorded at the beginning and end of the experiment. Also in the case of rabbits, clinical laboratory tests were performed before and after each test: blood count, blood chemistry and transaminase enzyme activity: aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (TGP) and gamma glutamyl transaminase (GGT transpeptidase ). In rats, these parameters were determined only at the end of the test to prevent blood loss.
  • AST aspartate aminotransferase
  • TGP alanine aminotransferase
  • GTT transpeptidase gamma glutamyl transaminase
  • the animals were euthanized by applying a series of anesthetics and potassium chloride (KCl). Subsequently, a macroscopic and necroscopic examination of fundamental organs and tissues was performed, mainly including heart, kidney, spleen, pancreas, lung, liver, ovaries and testicles, as appropriate. The samples taken were sent for a histopathological study.
  • KCl potassium chloride
  • the maximum dose evaluated in the acute toxicity test was 1350 mg / kg, since the maximum volume applied by the orogastric cannula was 1 or 3 mL for rodents and lagomorphs, respectively, and the use of higher doses led to obtaining a solution more orogastric cannula.
  • the concentrations tested no death of laboratory animals was observed, so the value of LD50 was not determined.
  • the test was performed in rats and rabbits with alloxane-induced diabetes.
  • treatments were applied at three doses of Formulation I (50, 70 and 90 mg / kg).
  • Five groups of animals were examined with treatments (insulin plus Formulation I at the three doses mentioned, Formulation I at 70 mg / kg and insulin alone).
  • Insulin glargine was administered subcutaneously at a dose of 0.7 U / kg in a single morning administration every 24 h.
  • the results of rabbit blood blood count biometrics before and after 21 days of treatment application showed a decrease in parameters related to the presence of monocytes and platelets and hemoglobin as a result of diabetes induced in animals.
  • Monocytosis is a condition in which an increase in the presence of a type of white blood cells known as monocytes is present.
  • Monocytes form in the bone marrow and play an important role in the normal functioning of the immune system. Platelets are involved in blood clotting, helping to stop bleeding in case of injury. The changes observed indicate that during the treatment of diabetes Alloxane-induced blood or bone marrow disorders formed.
  • Figure 8 shows average values of weight change per group of rats with induced diabetes. In the case of group animals treated with pure insulin (I), a tendency to decrease weight loss is much more visible when compared to the other groups tested with the study treatment.
  • Figure 8 shows the average values of glucose concentration change (capillary glucose). For rats treated with insulin only, an increase in the tendency to capillary glucose is observed up to 19 days of treatment. It is appreciated that in this period the increase in glucose is controlled more effectively by applying only Formulation I at 70 mg / kg. The greatest decrease in glucose levels in type 1 diabetic animals is observed for doses of 70 mg / kg.
  • the physical examination showed an obese person with a body weight of 87 kg, height 170 cm, with a BMI of 32 kg / m 2 .
  • Blood pressure was 160/110 mm Hg
  • fasting plasma glucose was 150 mg / dL
  • LDL-C 212 mg / dL HDL-C 37 mg / dL
  • HbAlc of 8.46%.
  • the patient was treated with Formulation I as described in Example 2, three times a day after each food intake for the next 6 months.
  • Formulation I The form of application of Formulation I was prepared in a glass of water or juice suspension. Periodic evaluations were performed to estimate affinity therapy and avoid side effects. After this period of treatment with Formulation I, biochemical studies were carried out. The values detected were: GA 115 mg / dL, HbAlc 6.69%, TC 235 mg / dL, LDL-C 123.7 mg / dL, HDL-C 40 mg / dL, Tg 119 mg / dL and its weight decreased to 74 kg. The level of 11-dehydro thromboxane B2 and platelet aggregation were reduced respectively by 75% and 90% compared to the baseline. The response to treatment was 100%. With this procedure, the patient had a considerable modification of the risk factors for the syndrome. metabolic
  • Gokaraju G.R. Gokaraju, R.R. , Golakoti, V.K.R.R. ,

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

La invención se refiere a compuestos de origen natural y su mezcla farmacéuticamente aceptable y activa para disminuir los altos niveles de glucosa, colesterol, ácido úrico y grasa corporal, citoprotección de órganos dañados, activación del metabolismo y la proliferación celular. Se ejemplifica con la composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz de los compuestos de la Formulación I, y su método en sistemas in vitro e in vivo. La Formulación I y sus variables pueden usarse para tratar hiperglucemia, gota, dislipidemia, obesidad, resistencia a la insulina, diabetes mellitus, diabetes insípida, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, complicaciones microvasculares, complicaciones macrovasculares, trastornos lipídicos, prediabetes, arritmias, infarto de miocardio, complicaciones renales y pancreáticas, complicaciones cardiovasculares.

Description

COMBINACION DE REGULADORES METABOLICOS BIOENERGETICOS Y NOTRA-
EPIGENÉTICOS, COMPUESTOS NUTRACEUTICOS EN COMBINACIONES CONVENCIONALES Y NANOTECNOLOGIGAS PARA REVERTIR Y PREVENIR ZA SENESCENCIA CELULAR ACELERADA POR DANO CRONICO PRODUCIDA POR DIABETES Y OTRAS ENFERMEDADES COMPLEJAS CRONICO-DEGENERATIVAS
CAMPO TÉCNICO
La presente invención se centra en la definición de composiciones farmacéuticas y el método propuesto para el tratamiento del síndrome metabólico, la diabetes mellitus y el envejecimiento. Compuestos y composiciones de origen natural se describen en la descripción. Más particularmente, esta invención se refiere a un método de tratamiento de enfermedades basado en el uso de respuestas desarrolladas en sistemas celulares y organismos mamíferos (animales y seres humanos) con las dosis farmacéuticamente aceptables de los compuestos que forman parte de la Formulación I, tales como control del metabolismo y células crecimiento.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El síndrome metabólico, antes conocido como síndrome X, es un estado intermedio entre el metabolismo normal y la diabetes mellitus tipo 2. Se trata de una epidemia emergente que se ha definido como una serie de factores de riesgo metabólicos que predisponen a la enfermedad cardíaca y coronaria y la insuficiencia renal crónica, entre otros estados patológicos. El síndrome metabólico está asociado con obesidad abdominal, dislipidemia aterogénica, hipertensión, estado proinflamatorio y protrombótico, con o sin deterioro de glucosa, es decir, diabetes. Los síntomas están relacionados con altos niveles de triglicéridos, bajos niveles de lipoproteínas de alta densidad, aumento de la presión arterial o hipertensión y aumento de los niveles de glucosa y síntomas de inflamación. Cada tina de estas características es un factor de riesgo significativo para el desarrollo de disfunción vascular y enfermedades cardiovasculares, renales y hepáticas (EcJcel R. H et al., en Lancet, 2005, 365: 1415) . El síndrome metabólico aumenta el riesgo de muerte prematura, por lo tanto, las estrategias eficaces y asequibles para ayudar a reducir los factores de alteración cardiometabólica y para controlar el síndrome son objetivos importantes para beneficiar a una gran población que está bajo alto riesgo.
Actualmente los principales enfoques para tratar a las personas con síndrome metabólico están dirigidos a reducir las causas subyacentes, el tratamiento de la hipertensión y otros factores de riesgo cardiovascular, y controlar la resistencia a la insulina. El tratamiento del síndrome metabólico incluye cambios en el estilo de vida, junto con el tratamiento farmacológico. Además de tratar el síndrome metabólico implementando pautas dietéticas y la actividad física adecuada para abordar los muchos mecanismos subyacentes del síndrome metabólico, una serie de medicamentos diseñados para controlar los niveles alterados de metabolítos asociados con la manifestación del estado de enfermedad se han desarrollado, incorporando diversos compuestos nutricionales biológicamente activos dirigidos al mismo objetivo. El conocimiento funcional del impacto de nutrientes, especialmente aminoácidos y polifenoles en la dieta en diferentes objetivos moleculares, hace posible desarrollar una composición de compuestos naturales para tratar la obesidad, el síndrome metabólico, la diabetes y el envejecimiento. A continuación se describen algunos conceptos y patentes relacionados con el objeto de la presente invención.
Lodder y Cassis (Lodder RA y Cassis LA en la patente de E.U.A. No. 2015/9060962, 23 de junio de 2015), composiciones farmacéuticas patentadas que comprenden D- tagatosa con o sin estilbeno o estilbenoide, o derivados del mismo, para prevenir o tratar la aterosclerosis, el síndrome metabólico, la obesidad o la diabetes. Los silbenoides como el resveratrol (3,5,4-trihidroxi-trans-estilbeno) que es un tipo de fenol natural y una fitoalexina producida en las plantas se aplicó durante la respuesta al ataque por patógenos u otra lesión. Grandes cantidades de resveratrol se pueden encontrar en diferentes tipos de bayas, uvas, arándanos, etc. (Fremont en Life Sci, 2000, 66: 663). Antes de esa patente, Baur et al. (J.A. Baur et al., en Nature, 2006, 444 (7117), 337) y Do et al. (Do GM et al., in Biochem Biophya Rea Commun, 2008, 374 (1) , 55) informaron el efecto del resveratrol para mejorar la salud y la supervivencia de los ratones en dietas altas en calorías, alteraciones de control en los niveles de colesterol, entre otras capacidades. Otro compuesto químicamente relacionado con el resveratrol, pteroestilbeno conocido como 3,5-dimetoxi-4 ' - hidroxiestilbeno, se caracteriza por mostrar efectos similares al resveratrol.
Las sirtuinas son enzimas con actividad histona desacetilasa y alguna actividad del factor de transcripción que regulan las vías metabólicas implicadas en el desarrollo de enfermedades cardiovasculares, el envejecimiento y la resistencia al estrés (Jiang WJ Biochem. Biophya. Rea. Commun., 2008, 373 (3): 341). Se considera que el resveratrol activa directa o indirectamente SIRT1 (sirtuina- 1 deacetilasa dependiente de NAD) y PGC-1 (coactivador del receptor gamma activado por el proliferador de peroxisoma) y afecta el funcionamiento de las mitocondrias (Lagouge M. et al., Celia, 2006, 127 (6): 1109; Alcain FJ y Villalba JM en Expert Opin Ther Pat, 2009, 19 (4): 403; Beher D. et al., en Chem Biol Drug Dea, 2009, 74 (6) : 619) . En las células tratadas con resveratrol, se observa un aumento de la acción de la S0D2 (MnSOD) (superóxido dismutasa 2, mitocondrial, también conocida como superóxido dismutasa dependiente de manganeso) que reduce la superóxido, que implica resistencia a la disfunción mitocondrial, transición de permeabilidad y muerte por apoptosis en varias enfermedades. Se ha encontrado que el resveratrol también actúa como un agonista de 6PER (GPR30) (receptor 1 de estrógeno acoplado a proteína G, también conocido como receptor 30 unido a proteína G) (Frossnitz E.R. y Barton M. en Mol. Cell. Endocrín. , 2014, 389 (1-2) : 71) . Un posible mecanismo de acción del resveratrol puede atribuirse a la modulación de la autofagia (autofagocitosis - dirigida a eliminar los componentes del mecanismo disfuncional) (Ghosh H. S. et al., en PLoS ONE, 2010, 5 (2) e9199) . Los animales de laboratorio han mostrado los efectos positivos del resveratrol como tratamiento antidiabético (Baur JA et al., ATature, 2006, 444 (7117): 337; Lagouge M. et al., en Cells, 2006, 127 (6), 1109). Este compuesto actúa como agonista de PPAR gamma (receptor gamma activado por proliferador de peroxisoma (PPAR-γ o PPARG) , también conocido como receptor de glitazona, o R1C3 (receptor nuclear de subfamilia 1, grupo C, miembro 3) es un receptor nuclear tipo II) , considerado como un objetivo farmacológico para el tratamiento de la diabetes tipo 2 (L. Wang et al., en Biochem Pharmacol 2014, 92 (1) : 73) . Los peroxisomas son orgánulos que pueden causar enfermedades y procesos de envejecimiento mientras no funcionan adecuadamente. La capacidad de estimular la actividad de la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) e inhibir la agregación plaquetaria se atribuye al resveratrol (Vita J.A. Duffy SJ en Curr Opinión Lipid, 2003, 14 (1), 21; Olas B. y Wachowicz B. en Platelets, 2005, 16 (5): 251).
Los extractos vegetales pueden considerarse como análogos de resveratrol de origen antioxidante. La patente de E.U.A. No. 2016/9,278,104, de 8 de marzo de 2016, para Romero T., estableció el uso de extracto de hoja de Nelumbo nucífera para reducir y/o eliminar uno o más factores de riesgo asociados con el síndrome metabólico. La composición considera la presencia de creatinina -un ácido orgánico nitrogenado muy parecido a la estructura de aminoácidos localizada en los músculos y células nerviosas de diferentes organismos vivos. Se sintetiza naturalmente en el hígado, el páncreas y los ríñones a partir de aminoácidos como arginina, glicina y metionina a una tasa de un gramo de creatina por día. Se considera como un vector inmediato y directo para transportar ATP y suministrar energía a las miofibrillas musculares.
Gokaraju 6. R. et al., en la patente de E.U.A. No.
016/9,241,964, de 26 de enero de 2016, establece la composición de fracciones fitoguímicas para uso farmacéutico o como suplemento dietético derivado de Sphaeranthua indicua y/o Garcinia mangostana. La composición se aplica para la obesidad, el síndrome metabólico, la diabetes y otros trastornos metabólicos de control, prevención y tratamiento, y también para regular el gasto energético, la prevención de placas ateroscleróticas en la arteria coronaria y la aorta abdominal, aumentar la sensibilidad a la insulina, el control de los niveles de glucosa, niveles de triglicéridos y equilibrio de los niveles de glucosa en los mamíferos. Se mencionan extractos que contienen aminoácidos entre otros componentes; sin embargo, esos no se revelan.
Es ampliamente conocido que los aminoácidos son una parte importante en la síntesis de varias proteínas implicadas en el metabolismo humano. Se considera que esta invención es la razón por la cual la composición puede seleccionarse para el tratamiento y la prevención del síndrome metabólico, la obesidad, la diabetes y el envejecimiento.
Varfolomeev S.D. y Gurevich K. G. (en Ruasian Chemical Bulletin, 2001, 50 (10) : 1709) realizaron un análisis por biocomputadora que demuestra que el aminoácido glicina se encuentra con más frecuencia (37.5%) en posiciones definidas de secuencias primarias en diferentes familias de enzimas. Los autores atribuyen esta propiedad al papel de la glicina en la arquitectura enzimática: ser un aminoácido con el átomo quiral que permite el movimiento y la flexibilidad a las cadenas de proteínas. Esto demuestra la importancia de la glicina para el metabolismo. Los 5 aminoácidos siguientes son ácido aspártico (12.9%), cisteína (6.7%), histidina (6.2%) y arginina (5.5%). La cisteína es responsable de mantener la conformación de varias proteínas debido a la formación de puentes de azufre. La histidina y la arginina como el ácido aspártico son comunes en los sitios activos de las enzimas desempeñando un papel en el sitio catalítico como agentes nucleares y electrófilos.
En el caso de la arginina (Wu GAB et al . , en Curr
Opin Clin Nutr Metabol Care, 2000, 3 (1) : 59) se informa de su capacidad para ayudar a reducir la resistencia a la insulina, permitiendo una disminución en la cantidad de insulina en tratamientos de diabetes, aumento de la tolerancia a la glucosa y mejora de la sensibilidad a la insulina en diabetes mellitus tipo 2.
La cisteína es el sustrato limitante para la síntesis de glutatión, responsable de proteger las células contra virus, bacterias, hongos, carcinógenos, así como contra otros estados patológicos. La cisteína oral aplicada sin otros componentes no se recomienda porque se cataboliza rápidamente en el tracto gastrointestinal pasando a un estado tóxico. La cisteína tiene propiedades antioxidantes, debido a la capacidad de los tioles de participar en reacciones redox. Estas propiedades antioxidantes de la cisteína se expresan en su mayor parte en glutatión tripéptido. La disponibilidad de glutatión oral es insuficiente, por lo que debe ser biosintetizado a partir de los aminoácidos que lo constituyen cisteína, glicina y ácido glutámico, de los cuales la cisteína es el sustrato limitante. Diferentes ensayos complementados por pruebas de laboratorio han demostrado que el envejecimiento está directamente asociado con una disminución progresiva en la concentración plasmática de cisteína y glutatión intracelular. Esta disminución conduce al estrés oxidativo relacionado con la edad. La suplementación con cisteína por encima de la dieta normal reduce los diversos procesos de envejecimiento al ayudar a los sistemas óseos y musculares, reduciendo la inflamación y los niveles de citoquinas (L. Wang et al., en Biochem. Pharmacol. 2014, 92 (1) : 73) .
El control de la proliferación celular es esencial para el buen funcionamiento de cualquier organismo. La alteración de esta regulación es la causa de enfermedades como el cáncer - con proliferación celular ilimitada e incontrolada debido a mutaciones genéticas. Por el contrario, una pérdida de la capacidad de proliferación celular es uno de los factores que causan el envejecimiento.
El control extracelular de la división celular puede realizarse mediante mitógenos del ciclo celular, varios factores de crecimiento así como por factores de supervivencia. Los mitógenos son proteínas que estimulan la división celular, contrarrestando los mecanismos de parada intracelular (Rb) que bloquean la progresión del ciclo.
El crecimiento de cualquier organismo u órgano depende tanto del crecimiento como de la división celular. Si las células se dividieran sin crecer, cada vez serían más pequeñas. Los factores de crecimiento estimulan el crecimiento celular (aumento de la masa celular) promoviendo la síntesis y la inhibición de proteínas y otras macromoléculas . El crecimiento celular no depende del ciclo celular. Por ejemplo, las células nerviosas y musculares crecen especialmente después de la división celular. Al igual que la mayoría de los mitógenos, los factores de crecimiento se unen a los receptores de la superficie celular que luego activan diferentes vías de señalización intracelular, lo que puede inducir: aumento de la síntesis proteica o disminución de la degradación proteica. Todo esto llevará al crecimiento celular.
Los factores de supervivencia favorecen la supervivencia celular mediante la supresión de los programas de muerte intracelular o la apoptosis. Estas señales necesitan de otras células para sobrevivir ayudan a las células a sobrevivir sólo cuando y donde se requiera. Las neuronas, por ejemplo, se producen en exceso y compiten entre sí para obtener factores de crecimiento y las que tengan la mayor cantidad sobrevivirán. Como mitógenos y factores de crecimiento, los factores de supervivencia tienden a unirse a los receptores de membrana celular que activan las vías de señalización intracelular que inhiben la muerte celular, usualmente regulando proteínas pertenecientes a la familia Bcl-2. Algunos factores de supervivencia son IL-3, SCF, IGF-1, que son secretados principalmente por el hígado en respuesta a las señales de la hormona del crecimiento (6H) .
Con base en lo anterior y con el propósito de resolver los problemas mencionados anteriormente, el objeto de la presente invención es proporcionar el uso de una formulación que consiste en resveratrol, glicina, arginina y cisteína, fijando el intervalo de concentraciones de componentes basándose en el estudio de modelo de Arte/nia 9 salina. Lo que se patenta en este caso es el uso de la formulación, y el método de su aplicación para el tratamiento de enfermedades. La formulación tiene el nuevo efecto de estimular la proliferación de cultivos celulares y linfocitos ín vltro, sin evidencia de genotoxicidad, revelando la capacidad para disminuir la formación de grasa visceral observada en animales de laboratorio sanos inducidos a diabetes, controlabilidad del índice glucéraico con menos insulina o sin insulina mostrado en en el modelo de diabetes inducida por aloxano, el efecto citoprotector del tratamiento presentado en el páncreas de animales tratados con aloxano, la corrección de los síntomas del síndrome metabólico y la obesidad en pacientes tratados durante un período de 6 meses. En los ejemplos descritos a continuación se demuestra que la formulación tiene un ingrediente revitalizador que actúa a nivel de producción de energía, restauración del metabolismo del oxígeno y reactivación de diversos ciclos enzimáticos relacionados con el metabolismo del azúcar, los ácidos grasos y el colesterol, aumentando la energía disponible en las células para mayor funcionalidad y vitalidad expresadas en términos de aumento de la proliferación. Ejemplos demuestran que cuando dicha formulación se aplica en animales y seres humanos, se normalizan funciones alteradas relacionadas con factores negativos de diabetes, obesidad y/o síndrome metabólico. De acuerdo con estos ejemplos, el tratamiento con la formulación diseñada es un método para controlar el envejecimiento, el síndrome metabólico, la obesidad y la diabetes.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Figura 1. Toxicidad expresada en términos de mortalidad de A. salina, mostrada por los componentes resveratrol (R) , glicina (G) , arginina (A) y cisteína (C) aplicados a diferentes concentraciones. Figura 2. Viabilidad de A. salina en presencia de diferentes concentraciones de la Formulación i.
Figura 3. Numero de linfocitos (parte superior) y su viabilidad (parte inferior) en nuestras tratadas con la Formulación I a diferentes concentraciones.
Figura 4. Genotaxicidad de prueba de la Formulación I aplicada a diferentes concentraciones en células nononucleares (linfocitos) arriba, - placas de electroforesis; en el medio, - porcentaje de ADN integrado (cabeza) (*p <0.05 vs. control con REME) ; abajo - el cálculo basado en los resultados del final de la muestra de electroforesis (*p <0.05 frente al control positivo con ¾(¼ 0.1 nM) .
Figura 5. Efecto de diferentes concentraciones de la Formulación I en la viabilidad del cultivo de células HEK-293 de la linea de células renales humanas embrionarias (arriba) y cultivo de células de riñon de mono verde africano (Vero) .
Figura 6. Representación gráfica de los valores para los parámetros de química sanguínea en animales con y sin tratamiento con la Formulación I: arriba - conejos macho; abajo - ratas macho, antes de la aplicación de la dosis única y después de 14 días de aplicación de 1000 mg/Kg.
Figura 7. Dinámica de cambio de peso (parte superior) y concentración de glucosa (glicemia capilar) (abajo) en diferentes grupos de animales laganorfos sometidos a tratamiento: I - insulina y 50, 70, 90 mg/kg - en dosis de Formulación I.
Figura 8. Dinámica de cambio de peso (arriba) y concentración de glucosa (glicemia capilar) (abajo) en diferentes grupos de roedores sometidos a tratamiento con insulina y 50, 70, 90 mg/kg - en dosis de Formulación I.
Figura 9. Comparación de los cambios histológicos observados a nivel de páncreas en conejos con diabetes inducida, tratados y no tratados con la Formulación I e insulina. Arriba - sección histológica de tejido extraída de páncreas femenino tratado sólo con insulina, destrucción completa del órgano demostrada: sólo se encontró tejido adiposo con vasos sanguíneos congestionados y dos ganglios linfáticos con cambios reactivos, se realizó búsqueda deliberada sin identificar tejido pancreático factible. Abajo - sección histológica (10X) de tejido pancreático femenino tratado sólo con la Formulación I (izquierda) , identificando acinos de preservación de páncreas de porción excretora sin cambios histológicos asociados, sin embargo, no se identifica el ccmponente endocrino (células de los islotes) ; la imagen (40X) corresponde a un enfoque para integrar la porción excretora pancreática (acinos) (derecha) .
Figura 10. Comparación de los cambios histológicos observados a nivel renal en conejos de diabetes inducida tratados y no tratados con la Formulación I e insulina. Arriba - Sección histológica de tejido renal de femenina tratada sólo con insulina: a nivel glomerular con aumento de las células mesangiales sin atipia, espesamiento focal de la pared de los vasos sanguíneos sin formación de nodulos escleróticos, que corresponde a nefropatía diabética temprana caracterizada por ligero aumento mesangial (izquierda) ; corte de riñón masculino tratado sólo con insulina, con buena preservación de la corteza ósea, gloraérulos abundantes con buena celularidad con ligera congestión, sin cambios en esclerosis. En el componente tubular hay cambios por necrosis coagulativa y picnosis de núcleos (derecha) . En el corte histológico medio de riñon femenino tratado con insulina y Fbrtrulación I a 90 mg/kg, mostrando buena conservación de la corteza ósea, identificando glamérulos abundantes con buena celularidad con congestión muy ligera, sin cambios en la esclerosis. En el componente tubular, los cambios iniciales son observados por necrosis coagulativa y núcleos de picnosis. Abajo - sección histológica del tejido renal congestivo macho bajo tratamiento con Formulación I a 70 mg/kg (izquierda, -10X) con extravasación de eritrocitos (sangrado microscópico) en la médula y corteza, identificando estructuras que muestran células mesangiales glomerulares aumentadas sin atipia, ligera congestión; el dibujo corresponde a una aproximación de glcméruloa congestivos (derecha - a 40X) .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Los detalles característicos de la invención consisten en definir la Formulación I, definiendo su aplicación, efectos biológicos en sistemas vivos a diferentes niveles (animales celulares, animales sanos o inducidos por la diabetes, organismo humano) . Los párrafos siguientes describen el propósito de definir la invención, ilustrar la novedad y utilidad de la presente invención, pero sin limitar su alcance y no pretender limitarla indebidamente. Los siguientes ejemplos se basan en ensayos realizados para definir la Formulación I, así como para probar sus efectos en sistemas in vítro e in vivo.
La descripción de la formulación que comprende las composiciones básicas y la preparación a la luz de la invención, de acuerdo con la presente invención, se muestra en la Tabla 1.
Figure imgf000014_0001
La composición de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada además porgue comprende una de las modalidades de las combinaciones potenciales de compuestos de la presente invención con mayor efecto terapéutico para casos de enfermedad avanzada, así como la integración de una modalidad nanopartículas que disminuye el régimen de dosificación
Figure imgf000015_0001
EJEMPLO 1
El ensayo se realizó para evaluar la toxicidad de los componentes propuestos para la Formulación I (resveratrol, glicina, arginina y cisteína) , sobre náuplios de Artemia salina. Artemia salina es un crustáceo sensible a una amplia gama de compuestos con actividad biológica y estructuras químicas muy diferentes. Michael et al. (Michael A.S. et al., en Science, 1956, 123: 464) y Vanhaecke et al. (Vanhaecke et al., en Ecotoxicol Environ Saf 1981, 5: 382) propuso su uso para pruebas de toxicidad. Es una prueba que permite llevar a cabo estudios prácticos y económicos de toxicidad de diferentes sustancias naturales. Ha habido una correlación muy buena con otras pruebas de citotoxicidad específicas. Este modelo es aceptado por la FDA (Food and Drug Administration) y EPA (Agencia de Protección Ambiental en 2002) , como una prueba para evaluar la toxicidad y la ecotoxicidad de los productos farmacéuticos y/o alimenticios . El ensayo se realizó de acuerdo con el método estandarizado usando diferentes diluciones de cada uno de los componentes de la Formulación I. En un incubador de Artemia salina, se incubaron 0.5 g de quistes de Artemia salina en agua de mar artificial a 37 g/L a una temperatura de 27°C con aireación constante durante 24 h. En cada 5 pocilios de una placa de 96 pocilios, se aplicó 0.1 mL de agua de mar artificial (37 g/L) con una pipeta de un solo canal con diez nauplios, separados de la incubadora y contados uno a uno para lograr una separación exacta de 10 nauplios. A partir de una solución madre de 2000 ppm de resveratrol, se realizaron diluciones en serie de glicina, arginina y cisteína. Usando una micropipeta multicanal, se añadieron 0.1 mL de las soluciones preparadas en la placa, logrando una concentración final de 62.5, 125, 250, 500 y 1000 ppm por cinco pocilios de nauplios. Para muestras en blanco, se colocaron 10 nauplios sin tratar en un volumen de agua artificial de 0.2 mL (37 g/L) . La microplaca se incubó a 25°C durante 24 h. Después del período de incubación, los nauplios vivos y muertos de A. salina se contaron con un microscopio estereoscópico y se determinó el porcentaje de mortalidad. La toxicidad se expresó como porcentaje de mortalidad de nauplios de A. salina: 0-10% no tóxico, moderadamente tóxico 11-50%, 51-90% altamente tóxico y 100% extremadamente tóxico, considerando la escala de Gualdron et al. (Gualdron R. et al., Chem Rev. Col. Farm, 1997, 26: 15 a 19) . Las soluciones componentes de la Formulación I se sometieron a ensayo 5 veces. Los datos se analizaron con el Statistical Package Qraph Pad Prism versión 6, mediante análisis de varianza (ANOVA) y las comparaciones múltiples de Tukey (p <0.05).
Los resultados del análisis de los datos se expresaron como el promedio ± desviación estándar y se presentan en la Figura 1. La glicina, la arginina y la cisteína están libres de toxicidad en cualquiera de las concentraciones ensayadas, lo que sugiere que si la toxicidad puede ocurrir, sólo puede ser justo por encima de 1000 ppm (Figura 1) . En el caso del resveratrol, en la solución de 62.6 ppm se observó una mortalidad del 38% (toxicidad moderada) , mientras que la LC50 (concentración letal hasta el 50% de los nauplios) se estimó en 89.48 ppm, lo que sugiere que a partir de esta concentración el resveratrol es altamente tóxico. Estos datos se tienen en cuenta para definir la Formulación I: se seleccionó la concentración de resveratrol por debajo de CL50; en el caso de los aminoácidos se puede usar cualquier concentración por debajo de 1000 ppm.
EJEMPLO 2
Como se ejemplifica aquí la Formulación I, se considera la siguiente composición de los componentes biológicamente activos: 5.7 mg de resveratrol, 74.3 mg de glicina, 5.7 mg de arginina y 2.9 mg de cisteína/kg de peso o kg de solvente, para su uso en mamíferos (incluyendo humanos) o cultivos celulares, respectivamente. La concentración de resveratrol se seleccionó considerando los resultados definidos en el Ejemplo 1, es decir, aproximadamente 15 veces menos que su CL50 para prevenir la manifestación de toxicidad. El peso de arginina se tomó equivalente a resveratrol, cisteína aproximadamente 2 veces menos que resveratrol y glicina como 13 veces peso de resveratrol. La Formulación I es un ejemplo de la mezcla de componentes biológicamente activos, que no debe limitar el alcance de la invención. La dosis de la Formulación I de 88.6 mg/kg se define en este caso.
Usando la Formulación I se realizó el ensayo similar al descrito en el Ejemplo 1 para definir el intervalo de toxicidad del mismo. Los resultados se presentan en la Figura 2. Se muestra que a una concentración inferior o igual a 500 ppm, el 100% de los nauplios de A. salina se mantienen vivos y a 1000 ppm de la Formulación I sólo el 58% están vivos. Esto indica que, de acuerdo con el modelo aplicado, la Formulación I no es tóxica hasta una concentración de hasta 500 ppm, pero a concentraciones mayores hasta 1000 ppm se muestra un comportamiento moderadamente tóxico. Esto demuestra que usando la Formulación I, su concentración puede variarse en un amplio intervalo de concentraciones y dosis considerando la ausencia de toxicidad.
EJEMPLO 3
La Formulación I se aplicó a un ensayo para determinar sus efectos sobre células humanas, es decir, para estimular efectos de crecimiento (efecto mitógeno) o causar muerte celular (efecto citotóxico) .
Para el ensayo, se usó un sistema biológico in vitro que usa células mononucleares cultivadas a partir de células mononucleares de sangre periférica-linfocitos humanos periféricos. El sistema se seleccionó porque forman de 25 a 35% de leucocitos y son las principales células promotoras de la respuesta inmune ya que reconocen antígenos extraños y activan mediadores de respuesta inmune celular, causando fenómenos de proliferación o de supresión ante estímulos endógenos o exógenos. Estos cultivos se usan ampliamente en la investigación para evaluar los efectos de diversos compuestos (Marti-Centelles R. et al., en J. Med Chem Eur, 2015, 103: 488) . Se determinaron los efectos sobre la proliferación celular y se determinaron las concentraciones de LC5o y LCioo (concentraciones que disminuyen la cantidad de células vivas a 50 y 100%, respectivamente) de la Formulación I en linfocitos humanos in vitro. Como control positivo se realizó la prueba con concanavalina A (Con A) , que es una proteína globular de origen vegetal que induce la mitosis en los linfocitos que causan la proliferación clonal (Ganem y Martin González Baez FA 0. en universo Diagnóstico, 2000, 1 (1) :1) . El ensayo con RPMI-1640 (medio sin tratamiento) se realizó como blanco. El efecto de la Formulación I, aplicado en un intervalo de concentraciones de 200 a 2000 ppm, se evaluó contando el número total de células y células muertas teñidas con colorante azul de tripano.
Se preparó 1 L de cultivo de medio RPMI-1640 (SIGMA) suplementado con FES al 10%, añadiendo 1 mL de solución IX de estreptomicina y anfotericina B (SIGMA) , esterilizada a través de unidades de filtración estériles (Corning) usando membranas de 0.22 mieras. Se prepararon diluciones en serie a partir de una solución madre de 2000 ppm de Formulación I a 200, 400, 600, 800, 1000 y 2000 ppm.
Se obtuvieron 30 mL de sangre periférica de donantes voluntarios sanos por punción venosa, que se recogió en tubos de plástico que contenían EDTA como anticoagulante. A continuación, se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas mediante un gradiente de densidad FicollHypaque (Sigma-Aldrich) por centrifugación a 1200 revoluciones por minuto (rpm) durante 30 minutos a 25°C. Las PBMC se lavaron dos veces con PBS IX, el sedimento celular finalmente se resuspendió en medio de cultivo. Las PBMC consisten en monocitos y linfocitos. Las células monocíticas se caracterizan por ser células adherentes que carecen de potencial proliferativo.
De lo contrario representan los linfocitos, que son células en suspensión, capaces de proliferar después de un estímulo endógeno o exógeno. Para separar monocitos de linfocitos, las PBMC obtenidas se cultivaron horizontalmente en cajas de 25 cm3 de modo que los monocitos se adherían a la superficie durante un periodo de 5 horas a 37°C con una atmósfera humidificada, en una atmósfera de CO2 al 5%. Después del tiempo de incubación, los linfocitos - las células que quedaban en suspensión se separaron en tubos estériles de 1.5 mi y se centrifugaron a 1200 rpm durante 10 minutos (Eppendorf Centrifuge 5810-R) , y luego se añadió 1 mL de medio de cultivo al envase celular. Se preparó una suspensión de 500,000 células/mL en tubos Eppendorf a los que se añadieron diferentes concentraciones de la Formulación I (200, 400, 600, 800, 1000 y 2000 ppm) añadiendo un control positivo de 1.25 mg/ml de concanavalina A - un inductor de proliferación celular y células en blanco no tratadas, se añadió el medio de cultivo. Las muestras se incubaron a 37°C en atmósfera humidificada con CO2 al 5% durante 48 horas, suficiente para que los linfocitos completaran la división celular mostrando una proliferación de control positivo similar (Con A) por el producto o causando toxicidad celular de lo contrario. Al terminar la incubación, se centrifugaron los tubos Eppendorf que contenían las diferentes muestras a 1200 rpm durante 10 minutos, se decantó el sobrenadante y se resuspendió el paquete de células en 1 mL de RPMI-1640.
Se usó un microscopio óptico de luz con un objetivo de 40X. Las células se contaron con cámara de Neubauer usando 0.05 mL de suspensión de cada muestra resuspendida en 0.4 mL de PBS IX y 0.05 mL de azul de tripano. El ensayo se realizó por triplicado en tres eventos independientes. Los resultados se analizaron mediante el análisis de varianza (ANOVA) con SPSS versión 16 y luego se aplicó el test de Dunnet para discernir si existía una diferencia entre los tratamientos control y experimental, tomando valores de p <0.05 como significativos. La Figura 3 muestra los resultados de la prueba. El efecto de la Formulación I aplicada a 200 ppm para aumentar la concentración de células es evidente (número de células por mililitro) hasta 15% significativamente (p <0.05) cuando se compara con el blanco sin tratar: 6,372,333 y 5,518,333 cel/mL, respectivamente. Como concanavalina A que contó un aumento en el número de células al 65% para obtener 9,101,667 células/mL (Figura 3) confirmando su actividad mitogénica. Por otra parte, en presencia de concentraciones de 1000 y 2000 ppm de Formulación I se observó una disminución en el número de células: 4,291,667 y 3,540,333 células/mL, respectivamente.
Se calcularon los porcentajes de viabilidad celular relativa (VCR) y se encontró que en presencia de concentraciones de 200, 400 y 600 ppm, el 97% de las células estaban vivas como en controles en blanco y positivos. De 800 ppm, así como 1000 y 2000 ppm de Formulación I, la viabilidad celular de los linfocitos humanos disminuyó significativamente (Figura 3 abajo) , con los siguientes porcentajes de 90.58%, 84.38% y 64.96%, respectivamente. LC50 y LC100 para la Formulación I se estimaron en 2,726.8 ppm y 5,165.82 ppm, respectivamente. Este valor es significativamente más alto que el detectado en el ensayo con A. salina y demuestra que la Formulación I carece de citotoxicidad a las dosis aplicadas. A dosis de 50-90 ppm la Formulación I no es citotóxica según ambos ensayos. Estas dosis están en el rango de estimulación de la proliferación de linfocitos confirmando su importante efecto en el método de tratamiento de envejecimiento.
EJEMPLO 4
El siguiente ejemplo muestra que el efecto proliferativo y el efecto inhibidor mostrados en el Ejemplo 3 no están relacionados con el nivel de daño del ADN (ácido desoxirribonucleico) . Para ello se desarrolló el ensayo cometa, un método rápido, sensible, simple y cuantificable para medir el grado de daño a nivel del ácido desoxirribonucleico (ADN) . Este ensayo se acepta como una herramienta para investigar compuestos o efectos deletéreos sobre la reparación del ADN (Azgueta A. y A. R. Arch Toxicol Colline, 2013, 87:949). Se usa en sistemas in vivo, in vitro, ex vivo en diferentes disciplinas científicas para pruebas de genotoxicidad, estudios preclínicos y clínicos, pruebas genéticas ecotoxicológicas, citogenética, fotogenotoxicidad y similares.
Las células mononucleares y los linfocitos de sangre periférica humana se separaron de acuerdo con la misma metodología descrita en el Ejemplo 3. Mediante el uso de medio de cultivo se ajustó la concentración de células a 1 x 10c células/mL. Las células obtenidas se sembraron en viales de Eppendorf a una densidad de 3 x 10* células/mL y se incubaron a 37°C y 5% de CO2 durante 24 horas para estabilizarse. Posteriormente, los viales se centrifugaron a 1250 rpm durante 5 rain a 22°C y el sobrenadante se reemplazó con soluciones de la Formulación I a 7.81, 15.63, 31.25, 62.50, 125, 250, 500 y 1000 ppm (n = 4 cada uno). Las células de ensayo en blanco se resuspendieron en medio de cultivo (n = 8) y otras con 0.1 mM de peróxido de hidrógeno (control positivo, n = 8) . Las células se incubaron durante 24 h para posteriormente precipitarse por centrifugación a 1200 rpm durante 5 min y se trataron con 0.1 mL de tripsina (0.25%) durante 3 min a 37°C y 5% de CO2. Las células se resuspendieron en 1 mi de medio RPMI 1640 y se centrifugaron de nuevo a 1200 rpm durante 5 min, se desechó el sobrenadante y se incubaron las células con 1 mL de solución de lisis (NaCl 2.5 M, Na2EDTA 100 mM, Tris HCl 10 mM y 1% Tritón) a 4°C durante 24 h. Después de 24 h, los viales se centrifugaron a 1200 rpm a 4°C. El sobrenadante se descartó y las células se trataron con 1 mL de tampón de neutralización (Tris 0.4 M pH 7.5) durante 5 min a 4°C. Los viales se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 min a 4°C, las células se resuspendieron en 0.02 mL de regulador de pH de carga (azul de bromofenol 0.25%, glicerol al 50%, TrisHCl 10 mM y NaaEDTA 50 mM) . Los geles de agarosa se prepararon disolviendo 1% en regulador de pH de fosfato salino (PBS) en una placa de calentamiento a 100°C. Una vez disuelto, y a 60°C, se añadieron 0.01 mL de Gelred (compuesto de ADN de tinción fluorescente) . Esta mezcla se colocó en una cámara de electroforesis horizontal durante 60 min. Las células lisadas se cargaron en geles de agarosa y se incubaron con la solución de electroforesis (Na2EDTA 1 mM y NaOH 300 mM a pH 13.5) durante 20 minutos a 4°C. El funcionamiento electroforético se realizó a 25 V y 300 ηλ durante 30 min a 4°C. Los geles se retiraron de la cámara de electroforesis y se revelaron en una cámara de análisis de señales fluorescentes. Las imágenes generadas se adquirieron con una cámara digital de alta resolución (Figura 4, arriba) y se analizaron con el software ImageQuant TL v8.1. El área de la cabeza del cometa que representa el ADN intacto se cuantificó por análisis densitométrico y fue representada gráficamente como porcentaje frente al control negativo (medio de cultivo) (Figura 4, en el medio) . La cola del cometa que representa el ADN dañado se midió en milímetros y se representó como el porcentaje del control positivo (H2O2) . Los datos se expresaron como media ± desviación estándar media (Figura 4, a continuación) . Los datos obtenidos se analizaron por análisis de varianza (ANOVA) usando en caso de cualquier diferencia una prueba de Tukey post-hoc usando el software GraphPad Frism v6.0, en p <0.05.
Los resultados (Figura 4) muestran que las células mononucleares de sangre periférica humana tratadas con diversas concentraciones de Formulación I en medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con FBS al 10% no mostraron ningún daño en dsDNA (dsDNA) . Un daño aparente no se generó en la cabeza del cometa (ADN intacto) (Figura 4, en el centro) . Por el contrario, el peróxido de hidrógeno (0.1 mM) , conocido por ejercer efectos genotóxicos, muestra el comportamiento en el que se detecta una difusión de dsDNA mucho más rápida (Figura 4, arriba y abajo) , que es una indicación de genotoxicidad y debido a este fenómeno el área de medición de la lectura es mucho más alta en comparación con el espacio en blanco (Figura 4, abajo) . El comportamiento de las muestras tratadas con la Formulación I fue similar al blanco, indicando que el tratamiento con esto durante 24 h no genera efectos deletéreos en el ADN de las células sanguíneas periféricas mononucleares (Figura 4) . Además, se reprodujo el efecto genotóxico inducido por peróxido de hidrógeno (Azqueta A. y A. R. Collins en Arch Toxicol, 2013, 87: 949), lo que indica que bajo condiciones experimentales, la metodología desarrollada es sensible y confiable. La formulación I produce efectos sobre el crecimiento celular sin generar efectos deletéreos en el ADN de células mononucleares humanas.
EJEMPLO 5
El efecto de diferentes concentraciones de la Formulación I se evaluó en la línea celular de riñón embrionario humano (HEK-293) y la línea celular Vero (células de riñón de mono verde africano) , usando un ensayo de microdilución con 3- (4, 5-dimetil-2tiazolil) -2, 5- difeniltetrazolio (MTT) (Mosmann T. en J. Inammol Methoda, 1983, 65 (1-2) : 55) . MTT, basado en la reducción del bromuro de 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difeniltetrazolio, es un ensayo que refleja la función metabólica de las células. MTT es un colorante amarillo reducido a formazaxi (colorante azul) por deshidrogenasas mitocondriales, que son parte de la cadena respiratoria de células viables (Hwa et al., 2015) . Se usa en un método cuantitativo de microdilución colorimétrica aplicado para la determinación de la supervivencia y la capacidad proliferativa de células de mamífero (Mosmann T. en J. Immunol Methods, 1983, 65 (1-2) : 55) . Es una prueba in vítro adecuada para evaluar la proliferación celular y la citotoxicidad porque es simple, eficiente, económica, reproducible, sensible, segura y eficaz en cuanto a la población celular viable.
Se usó medio de cultivo Eagle Mínimum Essential modificado por Dulbecco/F12 (DMEM/F12) , suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) y 1 mL de una mezcla de antibióticos (200,000 UI de penicilina y 0.5 g de estreptomicina) . Se preparó una solución de tripsina (Difco) 0.25%. Se prepararon diluciones en serie a partir de una solución madre de 2000 ppm de la Formulación I y Tritón X- 100 como solvente DMEM/F12. Se prepararon 1 mL de cada dilución para obtener concentraciones de 1.95, 3.91, 7.81, 15.63, 31.25, 62.50, 125, 250, 500 y 1000 ppm. Las células de cada cultivo celular se hicieron crecer usando placas de cultivo DMEM/F12 de 25 era3 hasta que se obtuvo una monocapa confluente en la superficie de la placa. Las condiciones usadas para el cultivo celular fueron 37°C, atmósfera humidificada con CO2 al 5%. La monocapa de células confluentes se retiró de placas de 25 cm3 usando tripsina al 0.25%. Se eliminó el medio DMEM/F12, después se lavó la monocapa 1 a 3 veces con regulador de pH de fosfato salino IX, luego se añadieron 0.5 mL de tripsina al 0.25% y el contenido se incubó a 37 °C en atmósfera humidificada con 5% de CO2 durante 5 min. Se añadieron 3 mL de DMEM/F12 sobre las células elevadas, las células se resuspendieron con una micropipeta de 0.1-1 mL y se colocaron en un tubo cónico estéril de 15 mL, posteriormente se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 min. DMEM/F12 se retiró del tubo cónico. Se añadieron 3 mL de DMEM/F12 en el paquete de células, se resuspendieron las células y se realizó un recuento en una cámara de Neubauer. Después se preparó una suspensión celular de 250,000 células/mL. Se añadieron 0.1 mL de la suspensión celular de microplaca de 250,000 células/ml por pocilio en todos los pocilios de una microplaca de 96 pocilios, la microplaca se incubó a 37°C en atmósfera humidificada con CO2 al 5% durante 24 h. Se eliminó el medio DMEM/F12 de cada pocilio con vacío, manteniendo la monocapa en el fondo de cada pocilio, luego se añadieron 0.1 mL de cada dilución preparada a partir de la Formulación I y Tritón X-100 (1.95, 3.91, 7.81, 15.63, 31.25, 62.50, 125, 250, 500, 1000 y 2000 ppm) . Además se dejaron 8 pocilios con células no tratadas usadas como control para la viabilidad celular (medio de cultivo celular sin tratamiento - Blanco) , a las que se añadieron 0.1 mL de DMEM/F12. Posteriormente, la microplaca se incubó a 37°C en atmósfera humidificada con 5% de CO2 durante 24 h. A continuación, se eliminó el medio DMEM/F12 con las muestras de la Formulación I y Tritón X- 100, los pocilios se lavaron una vez con solución salina de pH regulado con fosfato. Se añadió 0.02 mL a una solución de MTT a 5 mg/mL y el contenido se incubó a 37°C durante 2 h, para llevar a cabo un proceso de reducción completo de MTT a formazán mediante mitocondrias) dehidrogenasas de células vivas. Posteriormente, se retiró la solución de MTT, reteniendo las sales de formazano formadas, luego se añadieron 0.1 mL de alcohol isopropílico y la absorbancia a 540 nm se leyó en un lector de microplacas Synergy HT con software incorporado GEN 5. En el cálculo del la absorbancia en pocilios detectada por porcentaje de viabilidad celular en pocilios con células proliferadas en medio de cultivo no tratado se consideró el 100% de células vivas. Las soluciones de Formulación I se ensayaron en quintuplicado y se probaron las soluciones de control positivo por triplicado. El juicio se llevó a cabo en tres eventos separados. Los datos de LC50 de la Formulación I y Tritón X-100 se estimaron usando el Paquete Estadístico Graph Pad Prism versión 6, mediante la prueba t de Student (p <0.05). Los resultados del análisis de los datos se expresan como el promedio ± desviación estándar (Figura 5) .
Se demostró que para la Formulación I en concentraciones inferiores a 500 ppm, se observó la estimulación de la proliferación y actividad mitocondril de celulares HEK-293 y Vero. El aumento de la línea HEK-293 fue de 140% a 1.95 ppm y más de 40% a 62.5 ppm de concentración, mientras que en el caso de las células Vero sólo el 10% en comparación con Blanco. Los resultados demuestran el efecto de la Formulación I para estimular la proliferación celular.
Se observó un efecto citotóxico dependiente de la dosis por encima de 500 ppm ya que a medida que se incrementaba la concentración de Formulación I se observaba una disminución en la viabilidad celular (Figura 5) .
En ambas líneas celulares, el control positivo (Tritón X-100) mostró un efecto dependiente de la dosis, ya que se observó una disminución en la absorbancia aumentando la concentración de esta sustancia, de acuerdo con lo esperado, ya que es un compuesto citotóxico, sin aumento alguno en la viabilidad (valores superiores al 100%) , en cualquiera de las concentraciones ensayadas, pero se detectó una disminución en la absorbancia en comparación con la vacuna (sin tratamiento) .
Se estimaron LC50 para la Formulación I y Tritón X-100 con valores de 2,417.00 ± 65.77 y 764.10 ± 21.93 ppm para la línea celular HEK-293 y 4,289.00 ± 289.90 y 42.80 ± 1.60 ppm para la línea celular Vero, respectivamente.
Los resultados obtenidos demuestran que no se observa citotoxicidad de la Formulación I en concentraciones de 50-90 ppm. A esta dosis se observa estimulación del metabolismo celular. El fenómeno observado es similar al descrito en el Ejemplo 3 y demuestra que la Formulación I debe ser considerada como un promotor del factor de metabolismo celular y del crecimiento.
EJEMPLO 6
El efecto de la Formulación I se observó en animales de laboratorio sanos, como modelos de roedores y lagomorfos (ratas Wistar y conejos de Nueva Zelanda) en el ensayo de toxicidad aguda (aplicación única, monitorización durante 14 días) con dosis altas - superior a LC5o del ensayo de A. salina descrito en el Ejemplo 2 (1000 y 1350 mg/kg) y prueba de toxicidad subcrónica (aplicación diaria dos veces al día por dosis de 90, 90 y 90 mg/kg durante noventa días) . Los mismos procedimientos de adición de placebo (agua purificada) , medición de peso y glucemia se realizaron en paralelo en animales de control negativo de cada especie animal .
En todos los ensayos realizados en animales de laboratorio, el tratamiento se administró por vía oral en una medida dependiente del peso, a través de la cánula orogástrica, después del consumo de piensos convencional para roedores y lagomorfos (Comisión de las Comunidades Europeas en Off. J. Eur. Chem (L 383 A), 1992, 35: 110), respectivamente.
Los animales se mantuvieron en jaulas individuales y se observaron continuamente durante las primeras 24 h después de la administración de la Formulación I, continuando la observación y el cuidado veterinario intermedio necesario para cada periodo de prueba que se registra en un libro de registro para cualquier respuesta animal. El peso corporal se determinó y se registró al inicio y al final del experimento. También en el caso de conejos, se realizaron pruebas clínicas de laboratorio antes y después de cada prueba: biometría hemática, química sanguínea y actividad de las enzimas transaminasas : aspartato aminotransferasa (AST) , alanina aminotransferasa (TGP) y transpeptidasa gamma glutamil transaminasa (GGT) . En ratas, estos parámetros se determinaron sólo al final de la prueba para prevenir la pérdida de sangre. Finalmente, se procedió con el paso de eutanasia a animales aplicando una serie de anestésicos y cloruro de potasio (KCl) . Posteriormente, se realizó un examen macroscópico y necroscópico de órganos y tejidos fundamentales, incluyendo principalmente corazón, riñón, bazo, páncreas, pulmón, hígado, ovarios y testículos, según cada caso. Las muestras tomadas fueron enviadas para realizar un estudio histopatológico.
La dosis máxima evaluada en el ensayo de toxicidad aguda fue de 1350 mg/kg, ya que el volumen máximo aplicado por la cánula orogástrica fue de 1 ó 3 mL para roedores y lagomorfos, respectivamente, y el uso de dosis más elevadas condujo a obtener una solución más cánula orogástrica. Con las concentraciones ensayadas no se observó ninguna muerte de animales de laboratorio, por lo que no se determinó el valor de LD50. Con respecto a la presente invención, se demostró que la mayoría de los parámetros evaluados, incluyendo el peso y la actividad de las enzimas hepáticas y la biometría sanguínea, no mostraron diferencias significativas antes y después del tratamiento y se compararon con el blanco (sin tratamiento) . Sin embargo, en animales tratados se apreció una disminución de los niveles de glucosa, una disminución del ácido úrico y del colesterol (Figura 6) . Debido a que estos parámetros están relacionados con el síndrome metabólico, la gota y la diabetes, los resultados de la prueba indican que la aplicación de una única dosis alta de Formulación I conduce a una disminución de los niveles de metabolitos por encima y confirma el efecto del uso de este tratamiento para patologías mencionadas.
La misma tendencia se observó en el caso de los resultados del estudio de toxicidad subcrónica. Se observaron niveles disminuidos de glucosa, colesterol, ácido úrico, creatinina e enzimas hepáticas con la aplicación de la Formulación I en diferentes dosis. Sin embargo, la diferencia estadísticamente probada sólo se obtuvo con el control de la glucosa mientras que el cambio de otros parámetros se caracteriza por una gran desviación estándar asociada con la individualidad del sujeto en los animales en estudio. El aumento de peso corporal en el caso de los animales tratados fue menor que en el control. Además, se observó una disminución repetida en la actividad enzimática hepática que puede considerarse como evidencia de un efecto de la Formulación I para mejorar la actividad hepática. La observación característica durante la modalidad de las autopsias fue que los animales tratados con la Formulación I en la evaluación macroscópica enfrentaron un desarrollo muscular significativo y un bajo desarrollo de la grasa corporal, al igual que no presentaron esteatosis hepática. Todo esto a pesar de mantenerse durante 90 días con muy poco movimiento dentro de las jaulas, es decir, sin ejercicio y la ingesta normal de alimentos según el peso y la edad. Estos resultados también confirman que la aplicación de la Formulación I permite el control del peso mediado por una disminución de la cantidad de tejido adiposo, el control de la glucosa y ocasionalmente otras características de la química sanguínea, sin alterar la biometría sanguínea y la función hepática en mamíferos sanos.
EJEMPLO 7
Además, se realizó la prueba en ratas y conejos con diabetes inducida por aloxano. En esta prueba, así como en el estudio de toxicidad subcrónica, se aplicaron tratamientos a tres dosis de la Formulación I (50, 70 y 90 mg/kg) . Se examinaron 5 grupos de animales con tratamientos (insulina más Formulación I a las tres dosis mencionadas, Formulación I a 70 mg/kg e insulina sola) . Insulina glargina se administró por vía subcutánea a una dosis de 0.7 U/kg en una sola administración de la mañana cada 24 h.
La comparación de los resultados del análisis de la química sanguínea en conejos inducidos por la diabetes al comienzo y al final del ensayo, encontró que incluso bajo tratamiento, la glucemia se manifiesta en un nivel alto. Se observó un aumento de la urea y la creatinina, lo que confirma el daño renal. Sin embargo, en el caso de conejos tratados con la Formulación I, se observó una disminución de los niveles de ácido úrico y colesterol.
Los resultados de biometría hemática de sangre de conejo antes y después de 21 días de aplicación de tratamientos mostraron disminución de parámetros relacionados con la presencia de monocitos y plaquetas y la hemoglobina como resultado de la diabetes inducida en animales. La monocitosis es una condición en la que está presente un aumento en la presencia de un tipo de glóbulos blancos conocidos como monocitos. Los monocitos se forman en la médula ósea y juegan un papel importante en el funcionamiento normal del sistema inmune. Las plaquetas están involucradas en la coagulación de la sangre, ayudando a detener el sangrado en caso de lesión. Los cambios observados indican que durante el tratamiento de la diabetes inducida por aloxano se formaron trastornos sanguíneos o médula ósea.
Durante el seguimiento clínico, varios especímenes de conejo mostraron pérdida de peso asociada con alteraciones en la ingesta de alimentos y agua (períodos de anorexia con polidipsia) , datos clínicos esperados en cualquier cuerpo diabético. Algunos conejos del grupo de animales tratados con 90 mg/kg de Formulación I e insulina, no se detectó pérdida de peso como todos los demás animales, incluso teniendo evidencia de aumento de peso, lo que muestra que la Formulación I muestra protección orgánica. La Figura 7 (arriba) muestra la tendencia del cambio de peso en diferentes grupos de animales ensayados en el estudio. Se aprecia que la aplicación de la Formulación I conduce a menos pérdida de peso. Para los grupos tratados con la Formulación I y la insulina, el mayor aumento de peso se observa en el grupo con aplicación de 90 mg/kg. Esto demuestra que el efecto es dosis-dependiente.
Igualmente, todos los especímenes tratados con Insulina y la Formulación I corroboraron que muestran un efecto hipoglucémico como en los Ejemplos 5 y 6. La Figura 7 (a continuación) muestra los valores medios de los niveles de glucosa capilar en diferentes días de aplicación del tratamiento. Se observa que el efecto varía con diferentes dosis y es superior a 50 y 70 mg/kg en comparación con 90 mg/kg.
La Figura 8 (arriba) muestra valores medios de cambio de peso por grupo de ratas con diabetes inducida. En el caso de animales de grupo tratados con insulina pura (I) , una tendencia a la disminución de la pérdida de peso es mucho más visible cuando se compara con los otros grupos ensayados con el tratamiento del estudio. La figura 8 (abajo) presenta los valores medios de cambio de la concentración de glucosa (glucosa capilar) . Para ratas tratadas sólo con insulina se observa un aumento en la tendencia a la glucosa capilar hasta 19 días de tratamiento. Se aprecia que en este periodo el aumento de la glucosa se controla de manera más eficaz aplicando solamente la Formulación I a 70 mg/kg. La mayor disminución de los niveles de glucosa en loe animales diabéticos de tipo 1 se observa para dosis de 70 mg/kg.
En el seguimiento clínico de ratas con diabetes inducida (diabetes tipo 1) , los especímenes de los grupos tratados sólo con insulina o Formulación I mostraron cambios en el consumo de alimento y agua (períodos de anorexia con polidipsia) , como en conejos, se esperan estos datos clínicos en cualquier cuerpo diabético. Sin embargo, los grupos sujetos a tratamiento con la Formulación I más insulina no mostraron estos datos clínicos tan marcadamente, es decir, la aplicación de tratamientos ayudó a mejorar la calidad de vida de los animales y el manejo conjunto con insulina podría mejorar el estado clínico de los animales con diabetes que muestran el efecto reivindicado en la presente invención.
Los niveles de glucosa en ratas tratadas con 50 y
70 mg/kg de Formulación I más insulina (Glargina) tendieron a la normalización (Figura 8, abajo) . Con respecto al monitoreo del grupo tratado con 90 mg/kg e insulina (Glargina) , aunque la glicemia tendió a no normalizarse en este corto período de exposición, se observaron datos muy similares a los obtenidos en la especie lagomorfa con las mismas dosis de tratamiento (Figura 7) . En ambos casos los resultados demuestran que la Formulación I muestra protección orgánica de mamíferos con diabetes.
La comparación de los resultados del análisis de la química sanguínea entre diferentes grupos de ratas en la prueba demuestra que aún bajo tratamiento, la glucemia se manifiesta en altos niveles y se observan altos valores de urea y creatinina, confirmando daño a los ríñones. Los resultados de la biometría hemática no muestran diferencias significativas entre los diferentes grupos examinados.
En el estudio macroscópico después de la autopsia de conejo y rata con diabetes tipo I, se observó que los grupos tratados con suplemento o insulina presentan las alteraciones pancreáticas más graves, habiéndose confirmado en las secciones histopatológicas (Figura 9) . Por lo tanto, el aloxano como inductor de la diabetes, afecta a este órgano y se esperaba una alteración en todos los animales. Sin embargo, los animales tratados con la Formulación I y la insulina, no mostraron alteraciones macroscópicamente detectables. Se conoce el efecto del resveratrol para aumentar la sensibilidad de los receptores de insulina (Chachay V.S. et al., en Br J Clin Pharmacol, 2011, 72 (1) : 27) . Sin embargo, en la descripción de la presente invención, la formulación I también demuestra un efecto citoprotector adicional sobre órganos de animales y un efecto de recuperación de tejidos dañados cuando actúa en presencia de insulina.
Según los resultados histopatológicos realizados con muestras de animales inducidos con diabetes, se observa daño renal (resultado consistente con el análisis de la química sanguínea) . Sin embargo, en los especímenes de los grupos tratados con insulina y Formulación I, se observó menos daño renal que en muestras tratadas sólo con la Formulación I o insulina sola. Junto con los resultados del control de peso y la glucemia capilar, estos resultados proporcionan evidencia de que durante el período de prueba (21 días) el tratamiento aplicado con la formulación I junto con la insulina conduce a la protección de órganos como el riñón y el páncreas contra los cambios causados por la diabetes. Los ejemplos mostrados en este documento confirman la capacidad de la Formulación I para proteger los órganos de los mamíferos de diabetes tipo 1 contra el deterioro cuando se aplican con insulina. Además, se observa la capacidad de controlar el azúcar en la sangre, que se incrementa en presencia de insulina, y se observa que el efecto mantiene el aumento de peso, disminuyendo el colesterol y el ácido úrico.
EJEMPLO 8
Un hombre de 48 años presentó molestias en el pecho y posteriormente se le diagnosticó síndrome metabólico. El examen físico mostró una persona obesa con un peso corporal de 87 kg, altura 170 cm, con un IMC de 32 kg/m2. La presión arterial era de 160/110 mm Hg, la glucosa plasmática en ayunas era de 150 mg/dL, los triglicéridos (Tg) de 215 mg/dL, el colesterol total (TC) 320 mg/dL, el LDL-C 212 mg/dL, HDL- C 37 mg/dL y HbAlc de 8.46%. El paciente fue sometido a tratamiento con la Formulación I como se describe en el Ejemplo 2, tres veces al día después de cada ingesta de alimento durante los siguientes 6 meses. La forma de aplicación de la Formulación I se preparó en un vaso de agua o suspensión de jugo. Se realizaron evaluaciones periódicas para estimar la terapia de afinidad y evitar efectos secundarios. Después de este periodo de tratamiento con la Formulación I, se procedió a realizar estudios bioquímicos. Los valores detectados fueron: GA 115 mg/dL, HbAlc 6.69%, TC 235 mg/dL, LDL-C 123.7 mg/dL, HDL-C 40 mg/dL, Tg 119 mg/dL y su peso disminuyó a 74 kg. El nivel de 11-deshidro tromboxano B2 y la agregación plaquetaria se redujeron respectivamente en un 75% y 90% en comparación con la línea de base. La respuesta al tratamiento fue del 100%. Con este procedimiento, el paciente tuvo una modificación considerable de los factores de riesgo para el síndrome metabólico .
Finalmente, debe entenderse que el uso de glicina, cisteína, arginina y resveratrol para tratar y prevenir el síndrome metabólico, la diabetes, la obesidad y como tratamiento antienvej ecimiento, no se limita a la Formulación I y las modalidades descritas anteriormente , y los expertos en la técnica serán entrenados por las enseñanzas expuestas en la presente memoria para realizar cambios en la composición de tratamiento de la presente invención, el alcance será establecido únicamente por las reivindicaciones .
Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a cabo la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Bibliografía
Alcaín, F.J. , Villalba, J.M. (2009) . "Sirtuin activators" . Expert Opín Ther Pat. , 19 (4) : 403-414. doi: 10.1517/13543770902762893. EMZD 19441923.
Azqueta, Ά. , Oollins A.R. (2013) . "The essential carnet assay: a corprehensive guide to measuring EKA damage and repair" . Archives of taxlcology, 87: 949-968.
Baur, J.A. et al. , (2006) . "Resveratrol improves health and survival of mi ce en a high calorie diet" . Jfeture, 444 (7117) : 337-342.
Beber, D. , Wu, J. , Cumine, S. , Kim, K.W. , Lu, S.C. , Atangan, L. , Wang, M. (2009) . "Resveratrol is not a direct activator of SIRT1 enzyme activity" . Chem Biol Drvg Dea. , 74 (6) : 619-624. doi :10.1111/ j .1747- 0285.2009.00901. x.MD 19843076.
Chachay, V.S, Kirkpatrick, C.M.J. , Hictanan, I.J. ,
Ferguson, M. , Prins, J.B. , Martin, J.M. (2011) . "Resveratrol - pills to replace a healthy diet?" Br J din Phaimacol . 72 (1) : 27-38
Ccmndssion of the European Gomnunities. (1992) . "Annex to Commissicn Directive 92/69/EEC of 31 July 1992 adapting to technical progrese for the seventeenth time Ccuncil Dixective 67/548/EEC on the apprcodination of laws, regulations and adodnistrative provisions relating to the classification, packaging and labelling of dangerous substances. B.1 Acute toxicity (oral)". Off. J. Eur. Oanrn. (L 383 Ά) 35: 110-112.
Do, G.M. et al., (2008) . "Lcng-term effects of resvexatrol supplementation on suppression of at-herogenic lesión formation and cholesterol synthesis in apo E-deficient mice". Biochem. Bicphye. Res. Oaamm., 374(1): 55-59.
Duffy, S.J. , Vita, J.A. (2003). "Effects of phenolics cn vascular endothelial function". Current Opinicti in Lipidolagy, 14 (1) : 21-27. dbi:10.1097/01.mol.0000052857. 26236.f2, £MZD 12544657.
Eckel, R.H., Grundy, S.M., Zinmet, P. Z. (2005). "Ihe metabolic syndratne". Lancet, 365: 1415-1428.
En^ronmental Protection Agency (2002) . "Methods for measuring the acute tcxicity of effluents and receiving waters to freshwater and marine organisms" . Quinta Edición. U.S. Emrirarimental Protection Agency Office of Water (4303T) 1200 Pennsylvania Avenue, NW Washington, DC 20460 PP. 178184.
Fremont, L. (2000). "Biological effects of resveratrol" . LifeSci., 66: 663-673.
Ganem Baez, F.A. , Martin González, 0. (2000). "Lectina ccncanavalina A: obtención y purificación1*. Universo Diagnostico. 1(1):1-41.
Ghosh, H.S., McBumey, M. , Robbins, P.D., McBumey, R. (2010) . "SIRT1 negatively regulates the mamnalian target of rapa-nycin" . PLoS CKE 5 (2): e9199. Büxxxie:2010PLoSO...5.9199G. doi:10.1371/journal.pone.0009199. EMC 2821410.ΡΜΠ) 20169165.
Gokaraju G.R. , Gokaraju, R.R. , Golakoti, V.K.R.R. ,
Bhupathiraju, T., Sengupta, K., Alluri, K. , Raju, V.K. (2016). Gomposition from Sphaeranthus indicus and Garcinia mangostana for the control of metabolic syndrome. patente de E.U.A. No. 2016/9,241,964, enero 26, 2016.
Gualdrón, R. , López, S., Sanabria, A. (1997). Estudio fitoqiiímico preliminar y letalidad sobre Artenda salina de plantas colombianas. Rev. Gol. Quím. Farm. 26:15-19.
Jiang, W.J. (2008) . "Sirtuins: novel targets for metabolic disease in drug development" . Biochem. Biophys. Rea. Cbrmun. 373(3): 341-344.
Lagouge, M., Argmann, C. , Gerbart-Hines, Z., Meziane, H. , Lerin, C, Daussin, F., Messadeq, N., Milne, J. , Lambert, P., Elliott, P., Geny, B., Laakso, M. , Puigserver, P., Auwerx, J. (2006). "Resveratrol improves mitocdxxxirial function and protects against metabolic disease by activating SIRT1 and PGC-lalpha". Cell 127 (6) : 1109-1122. doi:10.1016/j.cell.2006.11.013. JRMZD 17112576.
Lodder, R.A. , Cassis L. Ά. (2016) . D-tagatoee-based compositions and methcds for preventing and treating atherosclerosis, metabolic syndrame, and synptcms thereof. patente de E.U.A. No. 2015/9,060,962, junio 23, 2015.
Martí-Centelles, R. , Falomir, E. , Murga, J. , Carda, M. , Marco, J.A. (2015) . Inhibitory effect of cytotoxic stilbenes related to resveratrol on the expresaion of the VEGF, hTERT and c-Myc genes. Eur J Med Chem. 103 : 488-496.
Michael, A.S., Thompson, C.G. , Abramovitz, M. (1956). Artenda salina as test organims for a bioassay. Science. 123: 464.
Mosmartn, T. (1983) . Rapid oolorimetric assay for cellular growth and survival: applicaticn to proliferation and cytotcocicity assays. J Innunol Methcds. 65(1-2): 55-63.
Olas, B. , Wachowicz, B. (2005). "Resveratrol, a phenolic antioxidant with effects on blood platelet functione". Platelete 16 (5) : 251-260.
Prossnitz, E.R. , Barton, M. (2014). "Estregen biology: New insights into 6PER function and clixiieal opportunities1* . Molecular and Cellular Endocrinology. 389 (1-2): 71-83. doi; 10.1016/j.nce.2014.02.002, ISSN 0303-7207. Ronero, T. (2016) . Methods and materials for reducing múltiple risk factors asaociated with the metabolic syndrcme. patente de E.U.A. No. 2016/9,278,104, marzo 8, 2016.
Vanhaecke, P., Persoone, 6., Claus, C. , Sorgeloos, P. (1981) . "Proposal for a short-térra toxicity test with Artemia nauplii" . Ecotoxicol Envircn Saf. 5: 382-387.
Varfolcmeev, S. D., Gurevich, K. G. (2001). Enzyme active sites: bioinformatics, architecture, and mechanisms of action. Russian Chemical Bulletin. 50 (10): 1709-1717.
Wang, L. , Waltehberger, B. , Pferschy-Wenzig, E.M. ,
Blunder, M. , Liu, X., Malainer, C, Blazevic, T., Schwaiger, S., Bollinger, J.M. , Heiss, E.H., Schuster, D., Kopp, B., Bauer, R. , Stuppner, H. , Dirsch, V.M., Atanascv, A.6. (2014) ."Natural product agonists of peraxiscme proliferatoractivated receptor gamma (PPARy) : a review" . Biochem JRhazmacol 92 (1): 73-89. doi: 10.1016/j.bcp.2014.07.018. EMC 4212005. ΡΜΠ) 25083916.
Wu, G.A.B., Meininger, C.J., Knabe, D.A. , Baze, F.W.A. , Rhoads, J.M. (2000) "Arginine nutrition in develcpment, health and disease" . Current Opinión in dinical Nutrition & Metabolic Care. 3 (1): 59-66.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Un método para disminuir los niveles elevados de grasa corporal, colesterol, ácido úrico e índice glucémico en animales y seres humanos, el método está caracterizado porque comprende: administrar una composición que contiene una cantidad farmacéuticamente eficaz de aminoácidos glicina, arginina y cisteína, en cualquier presentación química aceptable, y una cantidad farmacéuticamente eficaz de resveratrol o sus derivados en cualquier presentación química aceptable (hidrato, éster, amida, polimorfo, isómero o profármaco o combinación de los mismos) logrando así para corregir síntomas de síndrome metabólico en sujetos.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la composición aplicada comprende la siguiente proporción de los componentes biológicamente activos (Formulación I) : 100-2,500 mg de resveratrol, 3,000- 7,000 mg de glicina, 300-5,000 mg de arginina y 200-2,500 mg de cisteína.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la composición de los componentes biológicamente activos se aplica como una suspensión acuosa, tabletas, cápsulas poliméricas.
4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la composición es eficaz para reducir el nivel de colesterol sérico total en la sangre del paciente .
5. El método de conformidad con la reivindicación
1, caracterizado porque la composición es eficaz para disminuir la concentración de ácido úrico en la sangre del paciente .
6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la composición es una cantidad eficaz para disminuir el volumen de placa en las arterias del paciente.
7. El método de conformidad con la reivindicación
1, caracterizado porgue la composición es una cantidad eficaz para disminuir la cantidad de grasa corporal de un paciente.
8. El método de conformidad con la reivindicación
1, caracterizado porgue la composición es eficaz para reducir una alta concentración de glucosa en la sangre del paciente.
9. El método de conformidad con la reivindicación
2, caracterizado porque se aplican otros aminoácidos.
10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porgue la enfermedad es síndrome metabólico, aterosclerosis, obesidad, diabetes, gota, o una combinación de las mismas.
11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la composición es eficaz para reducir la gravedad de la progresión de una enfermedad asociada con un nivel de aumento anormal de colesterol sérico, glucosa, ácido úrico, grasa corporal o una combinación de los miemos.
12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la composición es eficaz para actuar como agente citoprotector, estimulador del metabolismo y proliferación celular de órganos dañados por síndrome metabólico, aterosclerosis, obesidad, diabetes, envejecimiento o una combinación de los mismos.
PCT/MX2017/000061 2015-06-08 2017-06-08 Combinación de reguladores metabólicos bioenergéticos y nutra-epigenéticos, compuestos nutracéuticos en combinaciónes convencionales y nanotecnológicas para revertir y prevenir la sesencencia celular acelerada por daño crónico producida por diabetes y otras enfermedades complejas crónico-degenerativas Ceased WO2017213486A2 (es)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019517750A JP2019521184A (ja) 2015-06-08 2017-06-08 糖尿病および他の変性慢性複合疾患によって生じる慢性損傷促進性細胞老化を元の状態に戻すおよび予防するための、代謝バイオエネルギー調節因子とニュートラエピジェネティック調節因子の組合せ、従来技術とナノテクノロジーを組み合わせた栄養補助化合物
EP17810608.4A EP3470060B1 (en) 2016-06-08 2017-06-08 Composition comprising resveratrol, glycine, arginine and cysteine for use in treating metabolic syndrome
CA3027048A CA3027048A1 (en) 2015-06-08 2017-06-08 Combination of metabolic regulators and nutraceuticals for the prevention of chronic damage from diabetes
BR112018075395-5A BR112018075395A2 (pt) 2015-06-08 2017-06-08 combinação de reguladores metabólicos bioenergé-ticos e nutra-epigenéticos, compostos nutracêuti-cos em combinações convencionais e baseadas em na-notecnologia para reverter e prevenir a senescên-cia celular acelerada por lesão crônica causada por diabetes e outras doenças complexas crônico-degenerativas
CN201780046806.6A CN109890369B (zh) 2015-06-08 2017-06-08 用于预防和减轻由糖尿病引起的慢性损伤的严重性的代谢调节剂和化合物的组合
RU2018147077A RU2749950C2 (ru) 2015-06-08 2017-06-08 Применение композиции, состоящей из аминокислот глицина, аргинина, цистеина и ресвератрола, для снижения тяжести диабета и высокого содержания жира в организме, холестерина, мочевой кислоты, глюкозы в крови и ускоренного старения у животных и человека
ES17810608T ES2988151T3 (es) 2015-06-08 2017-06-08 Composición que comprende resveratrol, glicina, arginina y cisteína para su uso en el tratamiento del síndrome metabólico

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US15/176,422 US10285963B2 (en) 2015-06-08 2016-06-08 Combination of metabolic bio-energetic and nutra-epigentic regulators, nutraceutical compounds in conventional and nanotechnologies combination to revert and prevent the chronic damage accelerated cellular senescence produced by diabetes and other degenerative chronic complex diseases
US15/176,422 2016-06-08
MX2017007448A MX365886B (es) 2015-06-08 2017-06-07 Combinación de reguladores metabólicos bioenergéticos y nutra-epigenéticos, compuestos nutracéuticos en combinaciones convencionales y nanotecnológicas para revertir y prevenir la senescencia celular acelerada por daño crónico producida por diabetes y otras enfermedades complejas crónico-degenerativas.
MXMX/A/2017/007448 2017-06-07

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2017213486A2 true WO2017213486A2 (es) 2017-12-14
WO2017213486A3 WO2017213486A3 (es) 2018-04-12

Family

ID=60578835

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/MX2017/000061 Ceased WO2017213486A2 (es) 2015-06-08 2017-06-08 Combinación de reguladores metabólicos bioenergéticos y nutra-epigenéticos, compuestos nutracéuticos en combinaciónes convencionales y nanotecnológicas para revertir y prevenir la sesencencia celular acelerada por daño crónico producida por diabetes y otras enfermedades complejas crónico-degenerativas

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP3470060B1 (es)
CL (1) CL2018003531A1 (es)
WO (1) WO2017213486A2 (es)

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7709539B2 (en) * 2004-08-11 2010-05-04 Chang Gung University Therapeutic use of resveratrol for hyperglycemia
WO2007035612A2 (en) * 2005-09-16 2007-03-29 Ordway Research Institute, Inc. Polyphenol conjugates as rgd-binding compounds and methods of use
US20080286254A1 (en) * 2007-05-17 2008-11-20 Kaneka Corporation Composition comprising licorice polyphenol
JP6550370B2 (ja) * 2013-03-15 2019-07-24 ニューサート サイエンシーズ， インコーポレイテッド 脂質レベルを低下させるロイシンおよびニコチン酸
WO2015017625A1 (en) * 2013-07-31 2015-02-05 Wikifoods, Inc. Encapsulated functional food compositions
US10285963B2 (en) * 2015-06-08 2019-05-14 Horacio Astudillo de la Vega Combination of metabolic bio-energetic and nutra-epigentic regulators, nutraceutical compounds in conventional and nanotechnologies combination to revert and prevent the chronic damage accelerated cellular senescence produced by diabetes and other degenerative chronic complex diseases

Also Published As

Publication number Publication date
EP3470060A2 (en) 2019-04-17
EP3470060A4 (en) 2020-04-15
CL2018003531A1 (es) 2019-06-28
WO2017213486A3 (es) 2018-04-12
EP3470060C0 (en) 2024-07-31
EP3470060B1 (en) 2024-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Jukić et al. Carnosine, small but mighty—prospect of use as functional ingredient for functional food formulation
Shen et al. Resveratrol pretreatment attenuates injury and promotes proliferation of neural stem cells following oxygen-glucose deprivation/reoxygenation by upregulating the expression of Nrf2, HO-1 and NQO1 in vitro
Alsolmei et al. Polyphenol-enriched plum extract enhances myotubule formation and anabolism while attenuating colon cancer-induced cellular damage in C2C12 cells
Turska et al. A review of the health benefits of food enriched with kynurenic acid
Jing et al. Excessive lithium of water induced a toxic effect on kidney via oxidative damage and inflammation in carp
US10039798B2 (en) Extracts of rosemary or hemerocallis fulva and methods of using same to promote circadian rhythm
Satora et al. Panther cap Amanita pantherina poisoning case report and review
Lee Regulation of cytochrome c oxidase by natural compounds resveratrol,(–)-epicatechin, and betaine
JP6510004B2 (ja) イミダゾールジペプチドを含有するエクソソーム調節剤、およびエクソソームを含有する神経細胞活性化剤
CN117229351A (zh) 一种可穿透血脑屏障改善学习记忆力的核桃衍生肽及其应用
JP6557893B1 (ja) 熱中症の予防、軽減及び／又は治療のための組成物
CN103446166B (zh) 肝功能改善剂
ES2988151T3 (es) Composición que comprende resveratrol, glicina, arginina y cisteína para su uso en el tratamiento del síndrome metabólico
Emami et al. Effects of high intensity interval training and curcumin supplement on glutathione peroxidase (GPX) activity and malondialdehyde (MDA) concentration of the liver in STZ induced diabetic rats
WO2017213486A2 (es) Combinación de reguladores metabólicos bioenergéticos y nutra-epigenéticos, compuestos nutracéuticos en combinaciónes convencionales y nanotecnológicas para revertir y prevenir la sesencencia celular acelerada por daño crónico producida por diabetes y otras enfermedades complejas crónico-degenerativas
OA19128A (en) Combination of metabolic regulators and nutraceuticals for the prevention of chronic damage from diabetes.
He et al. Design, Synthesis, Biological Evaluation and Molecular Docking Studies of Quercetin‐Linker‐H2S Donor Conjugates for the Treatment of Diabetes and Wound Healing
Olawale et al. Comparative histoarchitectural and biochemical studies of the hippocampus in peroxisome proliferative activated receptor gamma agonist treated insulin resistant rats
Carrera et al. Preventive Role of Cocoa-Enriched Extract Against Neuroinflammation in Mice
DK2388011T3 (en) ANTIOXIDAN COMPOSITION TO REDUCE OXIDATIVE STRESS FOR DOGS
Ariyo Performance and Molecular Responses to Glucose Supplementation of Meat-Type Chickens Raised Under Thermoneutral or Heat Stress Environment
Turska et al. A Review of the Health Benefits of Food Enriched with Kynurenic Acid. Nutrients 2022, 14, 4182
Ding et al. Dietary propionate induces intestinal oxidative stress via inhibition of SIRT3-mediated SOD2 depropionylation
Gunes et al. Effects of meloxicam on oxidative deterioration due to exercise in horses
HK40010029B (en) Combination of metabolic regulators and compounds for preventing and reducing the severity of chronic damage caused by diabetes

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17810608

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3027048

Country of ref document: CA

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019517750

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112018075395

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017810608

Country of ref document: EP

Effective date: 20190108

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17810608

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01E

Ref document number: 112018075395

Country of ref document: BR

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01Y

Ref document number: 112018075395

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Free format text: ANULADA A PUBLICACAO CODIGO 1.5 NA RPI NO 2515 DE 19/03/2019 POR TER SIDO INDEVIDA.

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112018075395

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20181207