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WO2017125892A2 - Anticuerpos monoclonales específicos para el antígeno piii de adenovirus humano (adv), producidos y secretados por hibridomas celulares, útiles para la detección y el diagnóstico de la infección causada por adv - Google Patents

Anticuerpos monoclonales específicos para el antígeno piii de adenovirus humano (adv), producidos y secretados por hibridomas celulares, útiles para la detección y el diagnóstico de la infección causada por adv Download PDF

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WO2017125892A2
WO2017125892A2 PCT/IB2017/050312 IB2017050312W WO2017125892A2 WO 2017125892 A2 WO2017125892 A2 WO 2017125892A2 IB 2017050312 W IB2017050312 W IB 2017050312W WO 2017125892 A2 WO2017125892 A2 WO 2017125892A2
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WO
WIPO (PCT)
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adv
antibody
seq
vitro
plll
Prior art date
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PCT/IB2017/050312
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English (en)
French (fr)
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WO2017125892A3 (es
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Susan Marcela Bueno Ramírez
Alexis Mikes Kalergis Parra
Jorge Eugenio Mora Alarcón
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pontificia Universidad Catolica de Chile
Original Assignee
Pontificia Universidad Catolica de Chile
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Priority to EP17741167.5A priority patent/EP3406262B1/en
Priority to BR112018014538-6A priority patent/BR112018014538A2/pt
Priority to CN201780007470.2A priority patent/CN108697796B/zh
Priority to US16/070,730 priority patent/US10766948B2/en
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Priority to CA3011569A priority patent/CA3011569A1/en
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Publication of WO2017125892A3 publication Critical patent/WO2017125892A3/es
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses

Definitions

  • Monoclonal antibodies specific for human adenovirus II I (ADV) antigen produced and secreted by cellular hybridomas, useful for the detection and diagnosis of ADV infection.
  • ADV adenovirus II I
  • the present invention relates to monoclonal antibodies, or fragments thereof, that recognize the adenovirus plll protein (ADV), useful for the development of diagnostic methods for ADV infection in humans.
  • ADV adenovirus plll protein
  • ADV human adenovirus
  • conjunctivitis conjunctivitis
  • gastroenteritis to respiratory diseases of all kinds such as mild pharyngitis to acute respiratory diseases of the lower respiratory tract, such as pneumonia.
  • ADV is known to be a persistent virus, remaining dormant in previously infected individuals and being able to reactivate by various factors, leading to a more severe disease generation.
  • Its genome contains double stranded DNA, which has no nuclear envelope and codes for 9 proteins.
  • the capsid that covers it has an icosahedra shape and is composed of 3 main proteins: Hexon, Pentón (highly conserved) and fiber. Studies have reported that penton protein and fiber are responsible for the attack and entry into the host cell, the latter promoting the internalization of the virus by interacting with receptors on the cell surface. There are more than 50 ADV serotypes in humans, which are grouped into 6 species that are subdivided from AF. Within the subdivision some strains - B, C and E - have greater clinical relevance in respiratory diseases, where the degree of severity of the disease will depend on the age (children ⁇ 4 years and adults) and the immune status of infected patients.
  • ADV diagnostic and detection methods performed by Public Health services include a test based on the detection of viral antigens by direct immunofluorescence in swab or nasopharyngeal aspirate samples, polymerase chain reaction (PCR) and culture cell, from blood sample.
  • PCR polymerase chain reaction
  • RVP Respiratory Viral Panel
  • the monoclonal antibodies of the invention appear as a necessary alternative to meet said need, since they allow the specific recognition of viral antigens in samples of patients infected with ADV.
  • antibodies used for research purposes Thermo Scientific Cat. # MS-587) and diagnosis (abcam® ab6982), however there have been no reported monoclonal antibodies that specifically recognize the plll protein of this virus.
  • a monoclonal antibody is a type of homogeneous antibody that is characterized by specifically recognizing a single antigen. They are produced by a single hybrid cell (hybridoma), which is the product of the fusion of a B-lymphocyte clone and a tumor plasma cell.
  • hybrida the product of the fusion of a B-lymphocyte clone and a tumor plasma cell.
  • the property of specifically binding and with high affinity to an antigen has driven the development of monoclonal antibodies as a tool very useful for the detection of molecules that generate a great scientific, clinical and industrial use interest.
  • monoclonal antibodies are widely used, both in basic and applied research, due to their specificity and reproducibility, which allows to better support research.
  • monoclonal antibodies have had enormous practical applications, either for diagnosis and treatment of multiple infectious diseases, and as therapy for other pathologies. While it is true that monoclonal antibodies are used in all types of detection and diagnostic techniques, it is in the design of in vitro diagnostic kits where the best results have been obtained. To this end, there are currently several rapid detection kits, such as the pregnancy test, which is based on the determination of chorionic gonadotrophin (hCG) levels in the urine using anti hCG antibody. In addition, monoclonal antibodies for therapeutic use have gained great relevance. At present there are therapeutic treatments for different pathologies, through the use of commercial monoclonal antibodies such as: Alemtuzumad, Gemtuzumab ozogamicin, Rituximab, Trastumab, among others.
  • hCG chorionic gonadotrophin
  • US201 10262892A1 describes methods of virus detection or measurement, wherein one of the viruses detected is Adenovirus, however this The document does not speak of specific monoclonal antibodies or fragments thereof that recognize Adenovirus plll protein as if the present application does.
  • the present invention comprises products, such as monoclonal antibodies, and an alternative method that uses them for rapid, efficient and accurate detection and diagnosis in patients infected with ADV with 100% specificity in clinical samples and capable of detecting by ELISA. equivalent concentrations 1.5 ng of the specific antigen. This will allow clinical professionals to determine early an appropriate clinical protocol for individuals suffering from a respiratory infection caused by this virus.
  • the present invention relates to two monoclonal antibodies against Adenovirus (ADV).
  • ADV Adenovirus
  • the present invention involves two murine monoclonal antibodies, secreted by hybridoma cell lines designated 7E1 1 and 6F1 1, and which react against the ADV plll antigen. These antibodies do not compete with each other for the antigen binding site, nor do they exert an impediment to simultaneously bind to it.
  • Said monoclonal antibodies can be used for tests of detection, diagnosis and / or determination of ADV infection. These antibodies can be used. simultaneously to increase the sensitivity of detection in clinical samples where there is little quantity and availability of antigen.
  • antibodies from hybridoma 7E1 1 are capable of efficiently capturing the ADV plll protein in clinical samples.
  • hybridoma 6F1 1 The invention provides the opportunity to develop methods of ex vivo or in vitro diagnosis and detection of the ADV plll viral antigen, in which the monoclonal antibodies produced and secreted by hybridomas 7E1 1 and 6F1 1 are used in assays such as ELISA, microscopy of fluorescence and immunoblot.
  • the samples to be analyzed can be: in vitro cells infected with ADV, nasal secretions, nasal washes, pharyngeal secretions and / or lavages or bronchial secretions, serum, cerebrospinal fluid, among others.
  • the invention provides the ability to detect ADV in biological samples and cell cultures, using the monoclonal antibodies produced and / or secreted by the hybridoma cell lines mentioned above, coupled to any type of solid support, such as nitrocellulose, nylon membrane, spheres. magnetic, fluorescent spheres or other support; or coupled to any other molecule, such as enzymes, proteins, fluorophores, radioactive isotopes or any other chemical compound.
  • the invention can be used in detection kits for ADV, comprising the antibodies produced by the mentioned hybridomas.
  • the present invention includes within its scope to incorporate any type of chemically bound molecule or substrate, such as markers, fluorophores, biotin, radioisotopes, metals, enzymes and / or any chemical element coupled to monoclonal antibodies secreted by hybridomas 7E1 1 and 6F1 1, wherein said chemically bonded molecule or substrate makes it possible to visualize or detect the antibody.
  • the invention also provides antibodies that specifically recognize the plll protein coupled to molecules, substrates or markers other than the antibody, as part of the method of detection, analysis and / or diagnosis in biological samples.
  • Figure 1 Detection of ADV plll protein by monoclonal antibodies produced by hybridomas 7E11 and 6F11, by an indirect ELISA assay.
  • the plate was activated with 50 ng of plll recombinant protein from purified ADV, or with 1 x 10 6 pfu of ADV.
  • the wells were incubated with the anti-plll antibodies from hybridoma 7E1 1, in the amount of 170 ng (A) and the hybridoma 6F1 1 in the amount of 170 ng (B).
  • the data shown in the graph expresses the absorbance detected at 450 nm, emitted by the conversion of the Tetramethylbenzidine substrate to a colored compound, catalyzed by the Horseradish peroxidase enzyme (HRP) present in a secondary mouse anti-IgG antibody that specifically bound to antibodies secreted by hybridomas 7E1 1 and 6F1 1.
  • the values correspond to the average +/- standard deviation of the absorbance emitted by each sample in at least two independent experiments.
  • the data shown in the graph expresses the absorbance at 450 nm emitted by the conversion of the Tetramethylbenzidine substrate to a colored compound catalyzed by the Horseradish peroxidase enzyme (HRP) present in the anti-plll antibodies from hybridomas 7E1 1 and 6F1 1 in quantity of 170 ng (A and B).
  • HRP Horseradish peroxidase enzyme
  • FIG. 3 Assay of serial dilutions of ADV anti-plll monoclonal antibodies produced by hybridomas 7E11 and 6F11, for the detection of purified ADV antigens.
  • ELISA plates were activated with 50 ng of ADV plll recombinant protein and the antigen was detected with 1: 2 serial dilutions of the 7E1 1 or 6F1 1 anti-plll antibodies, starting at a concentration of 3.4 ⁇ g / ml (170 ng)
  • Data are expressed as the average value of absorbance emitted at 450 nm of each duplicate sample, in at least two independent experiments.
  • FIG. 4 Confirmation of specificity of monoclonal antibodies secreted by hybridomas 7E11 and 6F11, by dot blot.
  • ADV anti-plll antibodies produced by hybridomas 7E1 1 or 6F1 1 were incubated for 1 hour with a nitrocellulose membrane containing the following immobilized samples (in the form of spots or "dots"): hVRS (1 x10 6 pfu) , ADV (1 x10 6 pfu), BSA (1 ⁇ g), ADV plll protein (1 ⁇ , 500 ng and 50 ng), and 20 ⁇ g of extract of uninfected A549 cells and infected with ADV.
  • the membrane was washed and incubated for 1 hour with a secondary anti-mouse IgG antibody conjugated to the HRP protein.
  • visualization of the junction of the monoclonal antibodies to the antigen was performed by capturing the chemiluminescence produced by catalysis of the commercial substrate "enhanced chemiluminescence Western blot detection system" (ECL, Amersham, Uppsala, Sweden). It is observed that the antibodies produced by the 7E1 1 or 6F1 1 hybridoma bind only to the "dots" where ADV plll protein, ADV virus and ADV infected cells are present, confirming the specificity of these antibodies.
  • FIG. 5 Detection of ADV plll protein by immunofluorescence in AD5 infected A549 cells.
  • A549 cells were grown in vitro to reach a confluence of 70-90%, to be infected for 48 hours with ADV. Subsequently, these were fixed with paraformaldehyde and prepared for indirect immunofluorescence. For this, it was used as a primary monoclonal antibody derived from hybridoma 7E1 1 or hybridoma 6F1 1, in addition to a commercial anti-ADV antibody (Abcam).
  • a commercial anti-mouse IgG antibody conjugated to Alexa Fluor 488 fluorophore or a rabbit anti-IgG conjugate with the same fluorophore was used, which emits fluorescence at 519 nm (strong signal).
  • the nuclei of the cells were stained with the phosphorophore TOPRO-3 iodide, which emits fluorescence at 661 nm (filled circles).
  • a strong reactivity is observed in the cytoplasm (white arrows) only in infected cells when either of the two primary antibodies is used.
  • FIG. 6 Detection of ADV in clinical samples by sandwich ELISA, using the combination of monoclonal antibodies secreted by hybridomas 7E11 and 6F11.
  • ELISA plates were activated with 170 ng of antibody secreted by hybridoma 7E1 1, functioning as capture antibody.
  • Wells activated with the capture antibody were incubated with 50 ⁇ of nasopharyngeal swab (HNF) samples from patients presenting with viral respiratory conditions.
  • HNF nasopharyngeal swab
  • 10 samples of control patients negative for respiratory viruses
  • 20 samples of ADV positive patients were used and as a control of specificity, 20 samples of patients positive for RSV were included.
  • As a positive control wells were added to which purified ADV plll protein was added.
  • the antibodies produced by the hybridoma 6F1 1, conjugated to the HRP enzyme were used in a 1: 2000 dilution (75 ng per well).
  • the data shown are the average +/- the standard deviation of the absorbance value emitted at 450 nm from each sample ( *** P ⁇ 0.001 by the one-way ANOVA test compared to hVRS positive patients or healthy patients).
  • the present invention relates to two monoclonal antibodies, or fragments thereof, of the lgG1 isotype, which specifically recognize the plll protein (also referred to herein as anti-plll antibodies), of the Adenovirus (ADV). These antibodies are produced by hybridomas 7E1 1 and 6F1 1.
  • the amino acid sequences of the variable regions of both chains of the antibody produced by hybridoma 7E11 are described in SEQ ID No: 1 for the heavy chain and SEQ ID No: 2 for the light chain.
  • the nucleotide sequences encoding them are described in SEQ ID No: 3 and SEQ ID No: 4, respectively.
  • amino acid sequences of the variable regions of both chains of the antibody produced by the hybridoma 6F11 are described in SEQ ID No: 5 for the heavy chain and SEQ ID No: 6 for the light chain.
  • the nucleotide sequences encoding them are described in SEQ ID No: 7 and SEQ ID No: 8, respectively.
  • variable sequences From these variable sequences, chimeric antibodies are constructed that comprise them, including either only one of the variable regions, or mixing them in all possible combinations. All such embodiments are within the scope of the present invention. That is, the present invention includes antibodies comprising at least one of the sequences SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 5 and SEQ ID No: 6 and similar sequences with up to 90%, 95% or 99% homology or identity with respect to any of said amino acid sequences.
  • nucleotide sequences comprising at least one of the sequences SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 7 and SEQ ID No: 8, as well as their complementary reverses and similar sequences with up to 80% , 85%, 90%, 95% and 99% homology or identity with respect to any of said nucleotide sequences.
  • the highest degree of homology considered in nucleotide sequences is based on the degeneracy of the genetic code.
  • the present invention also includes a set of nucleotide sequences encoding a monoclonal antibody, or fragment thereof, that specifically recognizes the ADV plll protein.
  • said antibodies or fragments thereof are conjugated to a label that allows their detection, such as biotin, metals, enzymes, proteins, fluorophores, radioactive isotopes or any other chemical compound.
  • the invention also provides methods of ex vivo or in vitro diagnosis and detection of the ADV plll viral antigen in a biological sample, in which the monoclonal antibodies produced and secreted by hybridomas 7E1 1 and 6F1 1 are used in binding detection assays. of the antibody with the antigen.
  • the method comprises contacting a biological sample selected from: in vitro cells infected with ADV, nasal secretions, nasal washes, cerebrospinal fluid, pharyngeal secretions and / or lavages or bronchial secretions, among others, with the monoclonal antibody against ADV or a fragment of him secreted by hybridomas 7E1 1 and 6F1 1, and then detect the binding of the antibody with the antigen with an assay selected from: ELISA, immunoblot, immunofluorescence, immuno istochemistry, immunochromatography, flow cytometry, cell sorter, immunoprecipitation and / or Western blot.
  • an assay selected from: ELISA, immunoblot, immunofluorescence, immuno istochemistry, immunochromatography, flow cytometry, cell sorter, immunoprecipitation and / or Western blot.
  • the method of the present invention comprises antibodies or fragments thereof produced and / or secreted by the hybridoma cell lines mentioned above, coupled with any type of solid support, such as nitrocellulose, nylon membrane, magnetic spheres, fluorescent spheres or other support
  • the antibodies or fragments thereof used in the method are conjugated with a label that allows their detection, such as biotin, metals, enzymes, proteins, fluorophores, radioactive isotopes or any other chemical compound.
  • the invention also describes a detection kit for ADV, which comprises at least one antibody produced by the mentioned hybridomas.
  • the antibodies or fragments thereof produced and / or secreted by the cell lines of the aforementioned hybridomas used in said kits are coupled with any type of solid support, such as nitrocellulose, nylon membrane, magnetic spheres, fluorescent spheres or other support.
  • the antibodies or fragments thereof used in the kit are conjugated with a label that allows their detection, such as biotin, metals, enzymes, proteins, fluorophores, radioactive isotopes or any other chemical compound. .
  • the diagnostic kit corresponds to an immunochromatographic test, luminex, flow cytometry, immunofluorescence, radioimmunoassay, Western blot, Dot plot, ELISA, immunodiffusion or immunoprecipitation.
  • the invention also provides antibodies that recognize specifically the plll protein coupled to molecules or substrates or markers other than the antibody, as part of the method of detection, analysis and / or diagnosis in biological samples.
  • Example 1 Determination of the nucleotide sequence encoding the light (VL) and heavy (VH) chains of the variable region of the ADV anti-plll antibody secreted by the 7E11 hybridoma and the ADV anti-plll antibody secreted by the 6F11 hybridoma.
  • hybridomas 7E1 1 and 6F1 1 separately.
  • the hybridoma was grown in DMEM-high glucose culture medium supplemented with 3.7 g / L of Sodium Bicarbonate and 10% fetal bovine serum, at 37 ° C with 10% C0 2 , to a cell density of 700,000 cells / ml.
  • the total RNA of 3.5 x 10 6 cells was obtained, performing a treatment with the compound Trizol (Invitrogen).
  • 0.5 ⁇ g of RNA was used to generate the cDNA by retrotranscription reaction with the Impron II kit (Promega).
  • the variable region of the genes encoding the kappa and lambda chains of immunoglobulins was amplified by PCR.
  • the products PCR were cloned into the cloning vector pTOPO-TA (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions and sequenced by the sequencing service of the Pontifical Catholic University of Chile in an Abl prism 3130x1 sequencer (Applied Biosystem).
  • the deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 for hybridoma 7E1 1 and SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 for hybridoma 6F1 1) were obtained using the bioinformatic program Vector NTI (Invitrogen ).
  • Example 2 ADV antigen detection assay, determination of specificity of ADV anti-plll monoclonal antibodies for purified ADV antigens by indirect ELISA assay. This test aims to demonstrate the specificity for the plll protein of
  • Antigen detection was carried out by the indirect ELISA technique, where the ELISA plate was activated with 50 ng of purified antigen for 1 hour at 37 ° C. In the same way, the plate was activated with 1 x 10 6 ADV plate-forming units (pfu).
  • hVRS Human Respiratory Syncytial Virus
  • hVRS Human Respiratory Syncytial Virus
  • each antibody (7E1 1 and 6F1 1) was incubated at a final concentration of 3.4 ⁇ g / ml, diluted in 10% PBS / FBS, for 1 hour at room temperature (each antibody on a separate plate). No commercial antibody control was used, because no monoclonal or polyclonal antibodies against portein plll have been found commercially.
  • the assay was performed to determine the maximum dilution of protein and viruses that ADV anti-plll monoclonal antibodies from hybridomas 7E1 1 and 6F1 1 are capable of detecting by indirect ELISA.
  • the plate was activated with 1 1 serial dilutions 1: 2 of ADV plll protein, starting with 50 ng of purified antigen.
  • the plaque was activated with serial dilutions of 1: 2, from 1 x 10 5 pfu of virus.
  • the anti-plll 7E1 1 or 6F1 1 antibodies were used in a concentration of 3.4 ⁇ g / ml (170 ng / well), diluted in PBS / 10% FBS.
  • the mouse anti-lgG detection antibody was added in a dilution of 1: 2,000 (25 ng / well).
  • the results showed that the anti-plll antibody 7E1 1 is capable of recognizing up to 1.56 nanograms (ng) of the ADV plll protein.
  • Antibody anti-plll from hybridoma 6F1 1 was able to detect up to 3.12 ng of ADV plll protein (Figure 2A).
  • anti-plll antibodies from hybridoma 7E1 1 can detect all dilutions made of the virus, in the same way as the antibody from of hybridoma 6F1 1, which would be equivalent to approximately 390 viral particles.
  • the two monoclonal antibodies would be efficient and sensitive in the detection of the virus, knowing that there is no commercial antibody until the moment it detects the plll protein ( Figure 2B). Controls that allowed to rule out nonspecific reactions of the antibodies were included in all the trials, which contained all the test components except the sample (plll protein or ADV virus).
  • Example 4 Test to determine the efficiency of monoclonal antibodies to detect viral antigens.
  • the assay was performed to determine the maximum dilution of the ADV anti-plll monoclonal antibodies from the 7E1 1 and 6F1 1 hybridomas, which allow the detection of the viral antigen.
  • the same indirect ELISA technique as in Example 2 was used.
  • the plate was activated with 50 ng of purified antigen and the anti-plll antibodies 7E1 1 or 6F1 1 were used making 1 1 dilutions 1: 2 starting with a concentration of 3.4 ⁇ g / ml, using a 10% PBS / FBS solution as diluent.
  • Figure 3 shows that at all dilutions that were used in the assay, the anti-plll antibodies 7E1 1 and 6F1 1 are capable of detecting the ADV plll protein.
  • the negative control included in this test corresponds to a well that does not contain a sample (plll protein), was blocked with 10% PBS / FBS, it was not added primary antibody (anti-plll 7E1 1 or anti-plll 6F1 1) and only contains mouse anti-lgG antibody conjugated to HRP.
  • Example 5 Clinical diagnosis of samples of patients infected with ADV, using ADV anti-plll monoclonal antibody using the sandwich ELISA technique.
  • the reading of the Plaque was performed on an Epoch ELISA reader, certified for clinical diagnosis.
  • the figure shows that the antibodies produced are specific since they do not recognize cells from patients infected with other viruses (hVRS).
  • hVRS Treatment of clinical samples.
  • the samples that were used for the tests were obtained from nasopharyngeal swabs contained in universal transport, from the Medical Research Center of the Pontifical Catholic University of Chile. The samples were centrifuged at 2,000 rpm for 10 minutes at 4 e C. Subsequently, the supernatant (SN1) was separated from the pellet; The latter was incubated with 100 ⁇ .
  • RIPA Buffer 50 mM Tris-HCI pH 8.0, 150 mM NaCI, 1% NP-40, 0.5% Sodium Deoxycholate, 0.1%, SDS and a cocktail of protease inhibitors
  • Example 6 Detection of ADV infection in A549 cells by Immunoflourescence, using ADV anti-plll monoclonal antibodies This test was performed to broaden the spectrum of techniques that allow ADV infection to be detected, using the described invention.
  • a fluorescence microscopy assay was carried out, where A549 cells infected or uninfected with ADV were incubated with the ADV anti-plll monoclonal antibodies derived from the 7E1 1 or 6F1 1 hybridomas, in addition to the commercial polyclonal anti-ADV antibody ( Abcam, # ab1039).
  • the protocol used was as follows: the cells were fixed with 4% paraformaldehyde diluted in PBS, for 10 minutes at 25 ° C.
  • the cells were washed with PBS and permeabilized with 0.2% saponin diluted in PBS / FBS 10 % for 30 minutes at 25 ° C.
  • Monoclonal antibodies derived from hybridomas 7E1 1 or 6F1 1 and commercial anti-ADV were added at a concentration of 3.4 ⁇ g / ml, diluted in PBS / 10% FBS for 1 hour at 25 ° C.
  • Two washes were subsequently carried out with PBS and the secondary anti-IgG mouse antibody conjugated to the fluorine Alexa fluorine 488 (Life Technologies), and a secondary anti-rabbit IgG antibody, conjugated to the fluorophore Alexa fluorine 488 was added.
  • Example 7 Specificity test of ADV anti-plll monoclonal antibodies for purified ADV antigens, by Dot-Blot assay.
  • This test aims to confirm the specificity for the ADV plll protein of the antibodies produced by hybridomas 7E1 1 and 6F1 1, using the immunoblot methodology.
  • Antigen detection was carried out by technique. dot-blot, where a nitrocellulose membrane is used as a solid support to immobilize the antigen present in a drop of suspension. For this purpose, 2 ⁇ was deposited on the nitrocellulose membrane, each containing: 1 x10 6 pfu of hVRS, 1 x10 6 pfu ADV, purified ADV plll protein ( ⁇ g, 500 ng and 50 ng), 20 ⁇ g of extract of A549 cells infected with ADV and 20 ⁇ g of extract of uninfected A549 cells.
  • Antibodies bound to the antigen was performed using an anti-mouse IgG antibody conjugated to HRP (Invitrogen, Life Technologies # 62-6520), which was diluted in blocking solution for 1 h at 25 ° C, to subsequently remove excess non-antibody bound by three washes with 0.05% PBS-Tween-20 at 25 ° C.
  • Visualization of the binding of the monoclonal antibodies to the antigen was performed by capturing the chemiluminescence produced by the commercial substrate catalysis "enhanced chemiluminescence Western blot detection system "(ECL, Ame rsham, Uppsala, Sweden), mediated by HRP enzyme bound to mouse anti-IgG antibody.
  • Chemiluminescence capture was performed with the MyECL (Thermo Fisher) photodocumentation system.
  • antibodies from hybridomas 7E1 1 and 6F1 1 only bind to "dots" that contain ADV, plll protein or ADV-infected cells, and do not bind nonspecifically to "dots. "containing unrelated proteins, other viruses or uninfected cells.
  • the examples described in this specification demonstrate the specificity, efficiency, sensitivity and versatility of these monoclonal anti-plll antibodies.
  • the examples presented here are a demonstration of some of the uses of ADV anti-plll monoclonal antibodies, but in no case limit the scope of the present invention.

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Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales, o fragmentos de los mismos, que reconocen la proteína pIII del Adenovirus (ADV), útiles para el desarrollo de métodos de diagnóstico de infección por ADV en humanos. En particular se refiere a un anticuerpo monoclonal o un fragmento de él que comprende una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia con al menos un 90%, 95% o 99% de identidad con la SEQ ID No: o SEQ ID No: 5 y una región variable de la cadena liviana que tiene una secuencia con al menos un 90%, 95% o 99% de identidad con la SEQ ID No: 2 o SEQ ID No: 6. También se dirige a las secuencias nucleotídicas que definen dichos anticuerpos, métodos in vitro y/o ex vivo de diagnóstico de infección por ADV en una muestra biológica que utilizan dichos 10 anticuerpos monoclonales, y kits de diagnóstico para detectar ADV, que comprenden al menos un anticuerpo monoclonal contra ADV de acuerdo a lo descrito anteriormente.

Description

Anticuerpos Monoclonales específicos para el antígeno II I de Adenovirus humano (ADV), producidos y secretados por hibridomas celulares, útiles para la detección y el diagnóstico de la infección causada por ADV.
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales, o fragmentos de los mismos, que reconocen la proteína plll del Adenovirus (ADV), útiles para el desarrollo de métodos de diagnóstico de infección por ADV en humanos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El virus denominado Adenovirus humano (ADV) es responsable de producir diversos cuadros clínicos en la población, que incluyen desde conjuntivitis, gastroenteritis hasta enfermedades respiratorias de todo tipo (como faringitis leves hasta enfermedades respiratorias agudas del tracto respiratorio bajo, como neumonía). Estudios han demostrado que este virus produce un alto porcentaje de morbilidad e incluso la muerte en infantes, reclutas militares y personas inmunocomprometidas a nivel mundial. ADV se conoce por ser un virus persistente, permaneciendo latente en individuos previamente infectados y pudiéndose reactivar por diversos factores, llevando a la generación una enfermedad más severa. Su genoma contiene ADN de doble hebra, el que no posee envoltura nuclear y codifica para 9 proteínas. La cápside que lo recubre tiene forma icosaedra y está compuesta por 3 proteínas principales: Hexón, Pentón (altamente conservado) y la fibra. Estudios han reportado que la proteína pentón y la fibra son las que se encargan del ataque y entrada a la célula hospedera, promoviendo esta última la internalización del virus al interactuar con receptores en la superficie celular. Existen más de 50 serotipos de ADV en humanos, los cuales se agrupan en 6 especies que se subdividen de la A-F. Dentro de la subdivisión algunas cepas -la B, C y E- tienen mayor relevancia clínica en enfermedades respiratorias, donde el grado de severidad de la enfermedad dependerá de la edad (niños <4 años y adultos) y del estado inmunológico de los pacientes infectados.
En la actualidad los métodos de diagnósticos y detección de ADV realizados por los servicios de Salud Pública incluyen un test basado en la detección de antígenos virales por Inmunofluorescencia directa en muestras de hisopado o aspirado nasofaríngeo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y cultivo celular, a partir de muestra de sangre. De las técnicas mencionadas, es el panel viral basado en Inmunofluorescencia el que permiten detectar un mayor número de virus respiratorios, siendo 12 tipos en el caso de Respiratory Viral Panel (RVP) PCR utilizing Luminex xTAG y 14 tipos para el eSensor Respiratory Viral Panel. Pese a este amplio rango de detección, es importante notar los factores de costo y tiempo de respuesta que estos utilizan (en el caso del primero el costo es aproximadamente USD 60 - 80 (CLP 42.000 -56.000) y un tiempo de respuesta entre 12 a 18 horas).
Con base en los antecedentes previos, se hace fundamental generar y contar con un test de diagnóstico ex vivo o ¡n vitro rápido, eficaz y de bajo costo para la detección de ADV que pueda competir contra las características de los métodos de diagnóstico disponibles. Ante tal problemática, los anticuerpos monoclonales de la invención aparecen como una alternativa necesaria para suplir dicha necesidad, puesto que permiten el reconocimiento específico de antígenos virales en muestras de pacientes infectados con ADV. Actualmente existen anticuerpos utilizados para fines de investigación (Thermo Scientific Cat. #MS-587) y diagnóstico (abcam® ab6982), sin embargo no se han reportado anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente la proteína plll de este virus.
Un anticuerpo monoclonal es un tipo de anticuerpo homogéneo que se caracteriza por reconocer específicamente un solo antígeno. Son producidos por una única célula híbrida (hibridoma), que es producto de la fusión de un clon de linfocito B y una célula plasmática tumoral. La propiedad de unirse específicamente y con alta afinidad a un antígeno ha impulsado el desarrollo de los anticuerpos monoclonales como una herramienta de gran utilidad para la detección de moléculas que generan un gran interés científico, clínico y de uso industrial. En la actualidad, los anticuerpos monoclonales son ampliamente utilizados, tanto en investigación básica como aplicada, debido a su especificidad y reproducibilidad, lo que permite fundamentar de mejor manera la investigación. Sin embargo, es en el área de la biomedicina donde los anticuerpos monoclonales han tenido enormes aplicaciones prácticas, ya sea para diagnóstico y tratamiento de múltiples enfermedades infecciosas, y como terapia para otras patologías. Si bien es cierto que los anticuerpos monoclonales se utilizan en todo tipo de técnicas de detección y diagnóstico, es en el diseño de kits para diagnóstico in vitro donde se han obtenido los mejores resultados. Para ello, existen en la actualidad diversos kits de detección rápida, tal como el test de embarazo, que se basa en la determinación de los niveles de gonadotrofina coriónica (hCG) en la orina utilizando anticuerpo anti hCG. Además, los anticuerpos monoclonales para uso terapéutico han cobrado gran relevancia. En la actualidad existen tratamientos terapéuticos para distintas patologías, mediante el uso de anticuerpos monoclonales comerciales como: Alemtuzumad, Gemtuzumab ozogamicina, Rituximab, Trastumab, entre otros.
En la actualidad existen anticuerpos monoclonales frente a diferentes proteínas del adenovirus; sin embargo se destaca la producción de anticuerpos contra la proteína del hexón y la fibra de la cápside en varios de los trabajos publicados. Un ejemplo claro de lo anterior, se observa en la patente US4487829, donde logran generar anticuerpos llamados anti 2-Hx-2 capaces de detectar el antígeno del hexón en el subgrupo C (1 ,2,5) de adenovirus humano. Por otro lado, la presente solicitud muestra la existencia de nuevos anticuerpos monoclonales, o fragmentos de los mismos, que reconocen la proteína plll del Adenovirus (ADV).
Adicionalmente, el documento US201 10262892A1 describe métodos de detección o medición de virus, en donde uno de los virus detectados es Adenovirus, sin embargo este documento no habla de anticuerpos monoclonales específicos o fragmentos de los mismos que reconocen la proteína plll de Adenovirus como si lo hace la presente solicitud.
Teniendo en cuenta la alta producción y competitividad en el mercado de anticuerpos monoclonales anti hexón, se requiere de la búsqueda y desarrollo de nuevos anticuerpos monoclonales dirigidos contra proteínas conservadas y abundantes en la estructura del virión. Tal es el caso de los anticuerpos monoclonales de esta invención, los cuales están dirigidos contra la proteína plll (pentón base), una proteína altamente conservada entre subgrupos de ADV. Estos son los primeros anticuerpos monoclonales producidos contra esta proteína, los cuales demostraron ser capaces de detectar partículas virales a partir de muestras clínicas con alta sensibilidad.
De este modo la presente invención comprende productos, tales como anticuerpos monoclonales, y un método alternativo que los usa para detección y diagnóstico rápido, eficaz y certero en pacientes infectados con ADV con un 100% de especificidad en muestras clínicas y capaces de detectar por ELISA concentraciones equivalente 1 ,5 ng del antígeno específico. Esto permitirá a los profesionales clínicos determinar de manera temprana un protocolo clínico adecuado para individuos que sufran de una infección respiratoria causada por este virus.
RESUMEN DEL INVENTO
La presente invención se refiere a dos anticuerpos monoclonales contra Adenovirus (ADV). Concretamente, la presente invención involucra dos anticuerpos monoclonales murinos, secretados por líneas celulares de hibridomas denominados 7E1 1 y 6F1 1 , y que reaccionan contra el antígeno plll de ADV. Estos anticuerpos no compiten entre sí por el sitio de unión al antígeno, ni ejercen un impedimento para unirse simultáneamente a este. Dichos anticuerpos monoclonales pueden ser utilizados para ensayos de detección, diagnóstico y/o determinación de infección por ADV. Estos anticuerpos pueden ser utilizados simultáneamente para incrementar la sensibilidad de detección en muestras clínicas donde existe escasa cantidad y disponibilidad de antígeno. Por ejemplo, como se muestra en la figura 6, anticuerpos provenientes de hibridoma 7E1 1 son capaces de capturar eficientemente la proteína plll de ADV en muestras clínicas. Estas proteínas capturadas e inmovilizadas fueron detectadas posteriormente por el anticuerpo generado por el hibridoma 6F1 1 , el cual se encontraba conjugado a una enzima que actúa sobre un sustrato cromógeno. Esta cualidad permite la combinación de ambos anticuerpos con diferente marca para detectar el mismo antígeno en muestras donde éste se encuentre en escasa cantidad. La invención proporciona la oportunidad de desarrollar métodos de diagnóstico ex vivo o in vitro y detección del antígeno viral plll de ADV, en los cuales se utilizan los anticuerpos monoclonales producidos y secretados por los hibridomas 7E1 1 y 6F1 1 en ensayos como ELISA, microscopía de fluorescencia e inmunoblot. Las muestras a analizar pueden ser: células in vitro infectadas con ADV, secreciones nasales, lavados nasales, secreciones faríngeas y/o lavados o secreciones bronquiales, suero, líquido cefalorraquídeo, entre otras. La invención proporciona la capacidad de detectar ADV en muestras biológicas y cultivos celulares, utilizando los anticuerpos monoclonales producidos y/o secretados por las líneas celulares de los hibridomas antes mencionados, acoplados en cualquier tipo de soporte sólido, como nitrocelulosa, membrana de nylon, esferas magnéticas, esferas fluorescentes u otro soporte; o acoplado a cualquier otra molécula, como enzimas, proteínas, fluoróforos, isótopos radiactivos o cualquier otro compuesto químico. El invento puede ser usado en kits de detección para ADV, que comprenda los anticuerpos producidos por los hibridomas mencionados. Además la presente invención comprende dentro de su alcance incorporar cualquier tipo de molécula o sustrato unido químicamente, tales como marcadores, fluoróforos, biotina, radioisótopos, metales, enzimas y/o cualquier elemento químico acoplado a los anticuerpos monoclonales secretados por los hibridomas 7E1 1 y 6F1 1 , donde dicha molécula o sustrato unido químicamente permite visualizar o detectar al anticuerpo. De esta manera la invención también provee anticuerpos que reconocen específicamente la proteína plll acoplada a moléculas, sustratos o marcadores diferentes del anticuerpo, como parte del método de detección, análisis y/o diagnóstico en muestras biológicas.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Detección de proteína plll de ADV por los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas 7E11 y 6F11 , mediante un ensayo de ELISA indirecto.
La placa fue activada con 50 ng de proteína recombinante plll de ADV purificada, o con 1 x106 ufp de ADV. Como controles negativos, se activaron otros pocilios con 1 x106 ufp de Virus Respiratorio Sincicial humano (hVRS) o con 50 ng de proteína albúmina de suero bovino (BSA). Se incluyeron además otros pocilios control: sin antígeno (con anticuerpo primario y anticuerpo anti-lgG de ratón conjugado con HRP, denominados en el experimento como "sin activar") y pocilios sin antígeno ni anticuerpo primario, solo con anticuerpo anti- IgG de ratón (HRP). Posteriormente, los pocilios se incubaron con los anticuerpos anti-plll provenientes del hibridoma 7E1 1 , en cantidad de 170 ng (A) y el hibridoma 6F1 1 en cantidad de 170 ng (B). Los datos mostrados en el gráfico expresan la absorbancia detectada a 450 nm, emitida por la conversión del sustrato Tetrametilbenzidina a un compuesto coloreado, catalizada por la enzima Horseradish peroxidase (HRP) presente en un anticuerpo secundario anti-lgG de ratón que se unió específicamente a los anticuerpos secretados por los hibridomas 7E1 1 y 6F1 1 . Los valores corresponden al promedio +/- la desviación estándar de la absorbancia emitida por cada muestra en al menos dos experimentos independientes. ** P <0,01 *** P <0,0001 por el test de ANOVA de una vía comparado al control negativo y comprobación mediante comparaciones múltiples de Dunnett's; ns, no hay diferencia significativa comparado con el control negativo. Figura 2. Determinación de sensibilidad de anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas 7E11 y 6F11 en la detección de la proteína plll de ADV. Placas de ELISA fueron activadas con diluciones seriadas 1 :2, iniciando con 50 ng de proteína plll y finalizando con 0,04 ng (A) y diluciones seriadas de un inoculo 1 x105 ufp de ADV partiendo de 1 :2 hasta la dilución 1 :5120 (B). Se incluyeron pocilios sin activar como control negativo. Los datos mostrados en el gráfico expresan la absorbancia a 450 nm emitida por la conversión del sustrato Tetrametilbenzidina a un compuesto coloreado catalizada por la enzima Horseradish peroxidase (HRP) presente en los anticuerpos anti-plll provenientes de los hibridomas 7E1 1 y 6F1 1 en cantidad de 170 ng (A y B). Los valores corresponden al promedio de la absorbancia emitida por cada muestra en al menos dos experimentos independientes.
Figura 3. Ensayo de diluciones seriadas de los anticuerpos monoclonales anti-plll de ADV producidos por los hibridomas 7E11 y 6F11 , para la detección de antígenos purificados de ADV. Se activaron placas de ELISA con 50 ng de proteína recombinante plll de ADV y se detectó el antígeno con diluciones seriadas 1 :2 de los anticuerpos anti-plll 7E1 1 o 6F1 1 , partiendo de una concentración de 3,4 μg/ml (170 ng). Los datos se expresan como el promedio del valor de la absorbancia emitida a 450 nm de cada muestra en duplicado, en al menos dos experimentos independientes.
Figura 4. Confirmación de especificidad de anticuerpos monoclonales secretados por los hibridomas 7E11 y 6F11 , mediante dot blot. Los anticuerpos anti-plll de ADV producidos por los hibridomas 7E1 1 o 6F1 1 se incubaron por 1 hora con una membrana de nitrocelulosa que contenía las siguientes muestras inmovilizadas (en forma de manchas o "dots"): hVRS (1 x106 ufp), ADV (1 x106 ufp), BSA (1 μg), proteína plll de ADV (1 μς, 500 ng y 50 ng), y 20 μg de extracto de células A549 sin infectar e infectadas con ADV. Tras la incubación, la membrana se lavó y se incubó por 1 hora con un anticuerpo secundario anti- IgG de ratón conjugado con la proteína HRP. Tras la incubación, la visualización de la unión de los anticuerpos monoclonales al antígeno se realizó mediante la captura de la quimioluminiscencia producida por la catálisis del sustrato comercial "enhanced chemiluminescence Western blot detection system" (ECL, Amersham, Uppsala, Sweden). Se observa que los anticuerpos producidos por los hibridoma 7E1 1 o 6F1 1 se unen sólo a los "dots" donde se encuentra presente la proteína plll de ADV, el virus ADV y células infectadas con ADV, confirmando la especificidad de estos anticuerpos.
Figura 5. Detección de la proteína plll de ADV por immunofluorescencia en células A549 infectadas con ADV. Células A549 fueron crecidas in vitro hasta alcanzar una confluencia de 70-90%, para ser infectadas por 48 horas con ADV. Posteriormente, estas fueron fijadas con paraformaldehido y preparadas para inmunofluorescencia indirecta. Para ello se utilizó como un anticuerpo primario monoclonal derivado del hibridoma 7E1 1 ó del hibridoma 6F1 1 , además de un anticuerpo comercial anti-ADV (Abcam). Como anticuerpo secundario se utilizó un anticuerpo comercial anti-lgG de ratón conjugado al fluoroforo Alexa Fluor 488 ó un anti-lgG de conejo conjugado con el mismo fluoóforo, que emite fluorescencia a 519 nm (señal intensa). Los núcleos de las células se tiñeron con el flouróforo TOPRO-3 iodide, que emite fluorescencia a 661 nm (círculos rellenos). Se observa una fuerte reactividad en el citoplasma (flechas blancas) solo en células infectadas cuando se utiliza cualquiera de los dos anticuerpos primarios.
Figura 6. Detección de ADV en muestras clínicas mediante ELISA en sándwich, utilizando la combinación de los anticuerpos monoclonales secretados por los hibridomas 7E11 y 6F11. Placas de ELISA fueron activadas con 170 ng de anticuerpo secretado por el hibridoma 7E1 1 , funcionando como anticuerpo de captura. Los pocilios activados con el anticuerpo de captura se incubaron con 50 μΙ de muestras de hisopado nasofaríngeo (HNF) de pacientes que presentaban cuadros respiratorios virales. Como controles negativos se analizaron 10 muestras de pacientes controles (negativos para virus respiratorios). Se utilizaron 20 muestras de pacientes positivos para ADV y como control de especificidad, se incluyeron 20 muestras de pacientes positivos para el VRS. Como control positivo se incluyeron pocilios a los que se adicionó proteína plll de ADV purificada. Para la detección de la proteína capturada por el anticuerpo 7E1 1 , se utilizaron los anticuerpos producidos por el hibridoma 6F1 1 , conjugados a la enzima HRP, en una dilución 1 :2000 (75 ng por pocilio). Los datos mostrados son el promedio +/- la desviación estándar del valor de la absorbancia emitida a 450 nm de cada muestra (***P <0,001 mediante el test de ANOVA de una vía comparados con pacientes positivos a hVRS o pacientes sanos).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DEL INVENTO
La presente invención se refiere a dos anticuerpos monoclonales, o fragmentos de los mismos, del isotipo lgG1 , que reconocen específicamente la proteína plll (también aquí denominados como anticuerpos anti-plll), del Adenovirus (ADV). Estos anticuerpos son producidos por los hibridomas 7E1 1 y 6F1 1 . Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de ambas cadenas del anticuerpo producido por el hibridoma 7E11 se describen en las SEQ ID No: 1 para la cadena pesada y SEQ ID No: 2 para la cadena liviana. Las secuencias nucleotídicas que las codifican están descritas en las SEQ ID No: 3 y SEQ ID No: 4, respectivamente. Del mismo modo, las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de ambas cadenas del anticuerpo producido por el hibridoma 6F11 se describen en las SEQ ID No: 5 para la cadena pesada y SEQ ID No: 6 para la cadena liviana. Las secuencias nucleotídicas que las codifican están descritas en las SEQ ID No: 7 y SEQ ID No: 8, respectivamente.
A partir de estas secuencias variables, se contruyen anticuerpos quiméricos que las comprendan, incluyendo ya sea sólo una de las regiones variables, o mezclándolas en todas las combinaciones posibles. Todas esas realizaciones se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Es decir, la presente invención incluye anticuerpos que comprendan al menos una de las secuencias SEQ ID No: 1 , SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 5 y SEQ ID No: 6 y secuencias similares con hasta un 90%, 95% o 99% de homología o identidad respecto a cualquier de dichas secuencias de aminoácidos. Así como las secuencias nucleotídicas que comprendan al menos una de las secuencias SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 7 y SEQ ID No: 8, así como sus reversos complementarios y secuencias similares con hasta un 80%, 85%, 90%, 95% y 99% de homología o identidad respecto a cualquiera de dichas secuencias nucleotídicas. El mayor grado de homología considerado en las secuencias nucleotídicas se basa en la degeneración del código genético. De esta manera, la presente invención también incluye un conjunto de secuencias nucleotídicas que codifican para un anticuerpo monoclonal, o fragmento del mismo, que reconoce específicamente la proteína plll de ADV. En una realización específica de la invención, dichos anticuerpos o fragmentos de los mismos están conjugados con un marcador que permite su detección, tales como, biotina, metales, enzimas, proteínas, fluoróforos, isótopos radiactivos o cualquier otro compuesto químico.
Como se muestra en las figuras 1 y 4, estos anticuerpos no reaccionan con otras proteínas o moléculas presentes en virus relacionados o muestras de pacientes con otros virus asociados a infecciones respiratorias. Esto disminuye notablemente la posibilidad de falsos negativos al utilizarlos en métodos de diagnóstico.
La invención también proporciona métodos de diagnóstico ex vivo o in vitro y detección del antígeno viral plll de ADV en una muestra biológica, en los cuales se utilizan los anticuerpos monoclonales producidos y secretados por los hibridomas 7E1 1 y 6F1 1 en ensayos de detección de unión del anticuerpo con el antígeno.
El método comprende poner en contacto una muestra biológica seleccionada de: células in vitro infectadas con ADV, secreciones nasales, lavados nasales, líquido cefalorraquídeo, secreciones faríngeas y/o lavados o secreciones bronquiales, entre otras, con el anticuerpo monoclonal contra ADV o un fragmento de él secretados por los hibridomas 7E1 1 y 6F1 1 , y luego detectar la unión del anticuerpo con el antígeno con un ensayo seleccionado de: ELISA, inmunoblot, inmunofluorescencia, inmuno istoquímica, inmunocromatografía, citometría de flujo, cell sorter, inmunoprecipitación y/o Western blot.
Además el método de la presente invención comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos producidos y/o secretados por las líneas celulares de los hibridomas antes mencionados, acoplados con cualquier tipo de soporte sólido, como nitrocelulosa, membrana de nylon, esferas magnéticas, esferas fluorescentes u otro soporte. En otra realización específica de la invención, los anticuerpos o fragmentos de los mismos usados en el método están conjugados con un marcador que permite su detección, tales como biotina, metales, enzimas, proteínas, fluoróforos, isótopos radiactivos o cualquier otro compuesto químico.
La invención también describe un kit de detección para ADV, que comprende al menos un anticuerpo producido por los hibridomas mencionados. En una realización específica de la invención, los anticuerpos o fragmentos de los mismos producidos y/o secretados por las líneas celulares de los hibridomas antes mencionados utilizados en dichos kits, están acoplados con cualquier tipo de soporte sólido, como nitrocelulosa, membrana de nylon, esferas magnéticas, esferas fluorescentes u otro soporte. Además, en una realización específica de la invención, los anticuerpos o fragmentos de los mismos usados en el kit están conjugados con un marcador que permite su detección, tales como biotina, metales, enzimas, proteínas, fluoróforos, isótopos radiactivos o cualquier otro compuesto químico.
En otra realización especifica de la invención, el kit de diagnóstico corresponde a un test inmunocromatográfico, luminex, citometría de flujo, inmunofluorescencia, radioinmunoanálisis, Western blot, Dot plot, ELISA, inmunodifusión o inmunoprecipitación.
De esta manera la invención también provee anticuerpos que reconocen específicamente la proteína plll acoplada a moléculas o sustratos o marcadores diferentes del anticuerpo, como parte del método de detección, análisis y/o diagnóstico en muestras biológicas.
EJEMPLOS DE APLICACIÓN A continuación se describen ejemplos que permiten demostrar las distintas aplicaciones de los anticuerpos monoclonales de la invención.
Ejemplo 1 : Determinación de la secuencia nucleotídica que codifica las cadenas livianas (VL) y pesadas (VH) de la región variable del anticuerpo anti-plll ADV secretado por el hibridoma 7E11 y del anticuerpo anti-plll ADV secretado por el hibridoma 6F11.
El siguiente protocolo fue utilizado para los hibridomas 7E1 1 y 6F1 1 por separado. Se creció el hibridoma en medio de cultivo DMEM-high glucose suplementado con 3,7 g/L de Bicarbonato de Sodio y 10% de suero fetal bovino, a 37° C con 10% C02, hasta una densidad celular de 700.000 células/ml. Se obtuvo el RNA total de 3,5 x106 células, realizando un tratamiento con el compuesto Trizol (Invitrogen). Se utilizó 0,5 μg de RNA para generar el cDNA mediante reacción de retrotranscripción con el kit Impron II (Promega). Mediante PCR se amplificó la región variable de los genes que codifican las cadenas kappa y lambda de las inmunoglobulinas. Para esto se utilizaron los partidores universales del kit Ig Primer set de Novagen (ne catálogo 69831 -3) y se siguieron las instrucciones del fabricante. La región variable de la cadena liviana se amplificó con los partidores MulgKVL5'-B: 5'GGGAATTCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT 3' (SEQ ID NO: 9) y MulgKVL5'-C: 5'ACTAGTCGACATGGAGWCAGACACACTSCTGYTATGGGT3' (SEQ ID NO: 10) y la cadena pesada se amplificó con los partidores MulgVH5'-A: 5'GGGAATTCATGRASTTSKGGYTMARCTKGRTTT3' (SEQ ID NO: 1 1 ) y MulgVH5'-F: 5'ACTAGTCGACATGAACTTYGGGYTSAGMTTGRTTT3' (SEQ ID NO: 12). Los productos de PCR fueron clonados en el vector de clonamiento pTOPO-TA (Invitrogen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante y secuenciado por el servicio de secuenciación de la Pontificia Universidad Católica de Chile en un secuenciador Abl prism 3130x1 (Applied Biosystem). La secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 para el hibridoma 7E1 1 y SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 para el hibridoma 6F1 1 ) se obtuvieron utilizando el programa bioinformático Vector NTI (Invitrogen).
Ejemplo 2: Ensayo de detección de antígenos de ADV, determinación de especificidad de los anticuerpos monoclonales anti-plll de ADV para antígenos purificados de ADV mediante ensayo de ELISA indirecto. Este ensayo tiene como objetivo demostrar la especificidad por la proteína plll de
ADV de los anticuerpos producidos por los hibridomas 7E1 1 y 6F1 1 . La detección del antígeno se llevó a cabo mediante la técnica de ELISA indirecto, donde la placa de ELISA se activó con 50 ng de antígeno purificado por 1 hora a 37°C. De igual manera se activó la placa con 1 x106 unidades formadoras de placas (ufp) del ADV. Como controles negativos se incluyó Virus Sincicial Respiratorio humano (hVRS) bajo las mismas condiciones en que se incubó el ADV, y además se incluyeron 50 ng de proteína de BSA en un pocilio independiente. Posteriormente, la placa se lavó dos veces con buffer fosfato salino (PBS) /Tween 0,05%. Luego la placa se bloqueó por 2 horas a 37° C con PBS /FBS 10%. Posteriormente se repitieron los lavados y a continuación se incubaron cada uno de los anticuerpos (7E1 1 y 6F1 1 ) a una concentración final de 3,4 μg/ml, diluidos en PBS/FBS 10%, por 1 hora a temperatura ambiente (cada anticuerpo en una placa independiente). No se utilizó control de anticuerpo comercial, debido a que en el comercio no se han encontrado anticuerpos monoclonales o policlonales contra la porteína plll. Transcurrido el tiempo de incubación, se repitieron los lavados y se agregó a cada uno de los pocilios un anticuerpo secundario anti-lgG de ratón marcado con la enzima peroxidasa de rábano (Horseradish peroxidase, HRP) en dilución 1 en 2000 (25 ng por pocilio) en PBS/FBS 10%, por 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, se realizaron los lavados y se reveló con 50 μΙ de buffer citrato/Tetrametilbenzidina (TMB, 3-3'-5-5'tetramethylbenzidine, 1 mg/ml, Becton Dickinson). Para detener la reacción se adicionaron 50 μΙ de H2S04 2N y el resultado se leyó en un lector de ELISA, a 450nm. Para determinar que la reacción del anticuerpo secundario era especifica en reconocer al anticuerpo primario y además que la señal obtenida no sea provocada por unión inespecífica del anticuerpo secundario al antígeno viral, se realizaron controles en los cuales se utilizó solamente el anticuerpo secundario sin anticuerpo primario ni muestra (pocilio sin activar). Otro control para determinar que la reacción del anticuerpo primario es específica para el antígeno, consistió en el uso de los anticuerpos sobre una placa de ELISA que no ha sido activada con el antígeno (sin antígeno) o usando los anticuerpos sobre una placa de ELISA activada previamente con 50 ng de la proteína BSA ó un virus diferente (hVRS). Los resultados muestran que los anticuerpos monoclonales de la invención son capaces de reconocer 50 ng de antígeno purificado, de manera especifica, ya que no reconocen la proteína BSA, ni proteínas de otro virus relacionado (Figura 1 A y 1 B). Ejemplo 3: Ensayo para determinar la sensibilidad de los anticuerpos monoclonales para la detección de antígenos virales.
El ensayo se realizó para determinar la máxima dilución de proteína y virus que los anticuerpos monoclonales anti-plll de ADV provenientes de los hibridomas 7E1 1 y 6F1 1 son capacez de detectar mediante ELISA indirecto. Para esto, se ocupó la misma técnica descrita en el ejemplo 2. Se activó la placa con 1 1 diluciones seriadas 1 :2 de proteína plll de ADV, partiendo con 50 ng de antígeno purificado. Respecto al virus, se activó la placa con diluciones seriadas de 1 :2, a partir de 1 x105 ufp de virus. Los anticuerpos anti-plll 7E1 1 o 6F1 1 , se utilizaron en una concentración de 3,4 μg/ml (170 ng/pocillo), diluidos en PBS/FBS 10%. Posteriormente se adicionó el anticuerpo de detección anti-lgG de ratón en una dilución de 1 :2.000 (25 ng/pocillo). Los resultados mostraron que el anticuerpo anti-plll 7E1 1 es capaz de reconocer hasta 1 ,56 nanógramos (ng) de la proteína plll de ADV. El anticuerpo anti-plll proveniente del hibridoma 6F1 1 , fue capaz de detectar hasta 3,12 ng de proteína plll de ADV (Figura 2A).
En cuanto a la sensibilidad de los anticuerpos representada en su capacidad de detectar el ADV en altas diluciones, se pudo observar que los anticuerpos anti-plll provenientes del hibridoma 7E1 1 pueden detectar todas las diluciones realizadas del virus, de igual manera que el anticuerpo proveniente del hibridoma 6F1 1 , lo que sería equivalente a 390 partículas virales aproximadamente. Los dos anticuerpos monoclonales serían eficiencientes y sensibles en la detección del virus, conociéndose que no existe algún anticuerpo comercial hasta el momento que detecte la proteína plll (Figura 2B). Se incluyeron en todos los ensayos controles que permitieran descartar reacciones inespecíficas de los anticuerpos, los cuales contenían todos los componentes del ensayo exceptuando la muestra (proteína plll o virus ADV).
Ejemplo 4: Ensayo para determinar la eficiencia de los anticuerpos monoclonales para detectar antígenos virales. El ensayo se realizó para determinar la máxima dilución de los anticuerpos monoclonales anti-plll de ADV provenientes de los hibridomas 7E1 1 y 6F1 1 , que permiten la detección del antígeno viral. Para esto, se ocupó la misma técnica de ELISA indirecto del ejemplo 2. Se activó la placa con 50 ng de antígeno purificado y los anticuerpos anti-plll 7E1 1 o 6F1 1 se utilizaron realizando 1 1 diluciones 1 :2 iniciando con una concentración de 3,4 μg/ml, utilizando como diluyente una solución de PBS/FBS 10%. En la figura 3 se observa que a todas las diluciones que se utilizaron en el ensayo, los anticuerpos anti-plll 7E1 1 y 6F1 1 son capaces de detectar la proteína plll de ADV.
El control negativo incluido en este ensayo, corresponde a un pocilio que no contiene muestra (proteína plll), fue bloqueado con PBS/FBS 10%, no se le adicionó anticuerpo primario (anti-plll 7E1 1 ó anti-plll 6F1 1 ) y sólo contiene anticuerpo anti-lgG de ratón conjugado con HRP.
Ejemplo 5: Diagnóstico clínico de muestras de pacientes infectados con ADV, utilizando anticuerpo monoclonal anti-plll de ADV mediante la técnica de ELISA en Sándwich.
Debido a que la disponibilidad y concentración de las proteínas virales en muestras clínicas obtendidas de hisopados nasofarígeos es baja, fue necesario modificar el método de detección y utilizar el método de ELISA en sandwich, usando como anticuerpo de captura el anticuerpo anti-plll proveniente del hibridoma 7E1 1 y como anticuerpo de detección el clon anti-plll 6F1 1 , conjugado con HRP. Para el ensayo se activaron pocilios de una placa de ELISA con 3,4 μg/ml (170 ng /pocilio) del anticuerpo anti-plll proveniente del hibridoma 7E1 1 , diluido en PBS, durante 1 hora a 37eC. Se realizaron 2 lavados con PBS-Tween20 al 0,05% y posteriormente se bloqueó la placa con 200 μΐ de PBS/FBS al 10% durante 2 horas a 37eC. Se lavó nuevamente y se incubó toda la noche a 4eC cada pocilio con 50 μΐ de aspirados nasofaríngeos de pacientes positivos para ADV de acuerdo al método de diagnóstico ".- D3 Ultra DFA Respiratory Virus Screening and ID Kit de DHI (Diagnostics Hibryds) USA", denominado de manera rutinaria como "panel viral", y que fueron tratadas como se describe posteriormente*. Como controles se incluyeron: 1 ) control de especificidad (50 μΐ de muestra de pacientes diagnosticados con hVRS mediante el panel viral), 2) control positivo (50 ng de proteína recombinante plll de ADV) y 3) Control negativo correspondiente a muestras de pacientes sanos (negativos para virus mediante el panel viral). Al día siguiente se realizaron los lavados y cada pocilio se incubó por 1 hora a temperatura ambiente con 50 μΐ del anticuerpo anti-plll proveniente del hibridoma 6F1 1 conjugado con HRP. Se lavó la placa 2 veces más y se reveló con 50 μΐ de solución TMB, se incubó de 10 a 15 minutos en oscuridad. La reacción se detuvo con 50 μΐ de H2S04 2N. La lectura de la placa se realizó en un lector de ELISA Epoch, certificado para diagnóstico clínico. Los resultados obtenidos para este ensayo se muestran en la figura 6, donde se puede observar que la técnica de ELISA en sandwich utilizando el anticuerpo proveniente del hibridoma 7E1 1 como anticuerpo de captura y el anticuerpo proveniente del hibridoma 6F1 1 -HRP como anticuerpo de detección, permite detectar el antígeno en muestras de pacientes infectados con ADV, los cuales fueron previamente confirmados por Inmunofluorescencia directa en un laboratorio clínico certificado utilizando el panel viral. El número de pacientes incluidos en el ensayo fue de 20, de los cuales 17 fueron detectados como positivo por ELISA con una densidad óptica (OD) por encima de 0,1 . Este ensayo demuestra además la versatilidad que presentan los anticuerpos provenientes de los hibridomas 7E1 1 y 6F1 1 , ya que son capases de unirse simultáneamente al antígeno sin competir ni interferir entre sí, permitiendo la captura y posterior detección de la proteína plll en muestras de pacientes. Además en la figura se muestra que los anticuerpos producidos son específicos ya que no reconocen células de pacientes infectados con otros virus (hVRS). *: Tratamiento de muestras clínicas. Las muestras que se utilizaron para los ensayos fueron obtenidas a partir de hisopados nasofarígeos contenidos en medio de transporte universal, desde el Centro de Investigaciones Médicas de la Pontificia Universidad Católica de Chile. Se centrifugaron las muestras a 2.000 rpm durante 10 minutos a 4eC. Posteriormente se separó el sobrenadante (SN1 ) del pellet; este ultimo fue incubado con 100 μί. de Buffer RIPA (50 mM Tris-HCI pH 8,0, 150 mM NaCI, 1 % NP-40, 0,5% Deoxicolato de Sodio, 0,1 %, SDS e un coctel de inhibidores de proteasas) durante 15 minutos a 4eC, agitando por vortex cada 5 minutos. A continuación se centrifugó a 2.000 rpm durante 10 minutos a 4eC. Al finalizar se tomó el sobrenadante obtenido (SN2) y se mezcló con el SN1 .
Ejemplo 6: Detección de infección por ADV en células A549 mediante Inmunoflourescencia, utilizando anticuerpos monoclonales anti-plll ADV Este ensayo fue realizado para ampliar el espectro de técnicas que permiten detectar infección por ADV, utilizando la invención descrita. Se llevó a cabo un ensayo por microscopía de fluorescencia, donde células A549 infectadas o sin infectar con ADV fueron incubadas con los anticuerpos monoclonales anti-plll de ADV derivados de los hibridomas 7E1 1 o 6F1 1 , además del anticuerpo policlonal comercial anti-ADV (Abcam, #ab1039). El protocolo utilizado fue el siguiente: las células fueron fijadas con paraformaldehido 4% diluido en PBS, por 10 minutos a 25° C. Luego, las células fueron lavadas con PBS y se permeabilizaron con saponina 0,2% diluida en PBS/FBS 10% por 30 minutos a 25° C. Se adicionaron los anticuerpos monoclonales derivados de los hibridomas 7E1 1 ó 6F1 1 y el anti-ADV comercial a una concentración de 3,4 μg/ml, diluidos en PBS/FBS 10% por 1 hora a 25° C. Se realizaron posteriormente dos lavados con PBS y se adicionó el anticuerpo secundario anti-lgG de ratón conjugado al fluoróforo Alexa flúor 488 (Life Technologies), y un anticuerpo secundario anti-lgG de conejo, conjugado al fluoróforo Alexa flúor 488 (ThermoFisher), para detectar el anticuerpos policlonal anti-ADV, en dilución 1 en 200 en PBS/FBS 10% por 1 hora a 25° C, en oscuridad. Se repitieron los lavados y se tiñeron los núcleos con TOPRO-3 iodide 642/661 (Invitrogen, #T3605) a una dilución 1 :5.000 por 15 minutos a 25° C, en oscuridad. Por último se lavó con PBS y se realizó el montaje de los cubreobjeto para su posterior observación en un microscopio de epifluorescencia. Los resultados obtenidos muestran que los anticuerpos constituyente de la invención también son útiles para poder reconocer específicamente células infectadas mediante inmunofluorescencia, sin unirse de manera inespecífica a células no infectadas (Figura 5).
Ejemplo 7: Ensayo de especificidad de los anticuerpos monoclonales anti-plll ADV para antígenos purificados de ADV, mediante el ensayo de Dot-Blot.
Este ensayo tiene como objetivo confirmar la especificidad por la proteína plll de ADV de los anticuerpos producidos por los hibridomas 7E1 1 y 6F1 1 , utilizando la metodología de immunoblot. La detección del antígeno se llevó a cabo mediante la técnica de dot-blot, donde una membrana de nitrocelulosa es utilizada como soporte sólido para inmovilizar el antígeno presente en una gota de suspensión. Para ello, se depositó sobre la membrana de nitrocelulosa 2 μΙ que contenían cada uno: 1 x106 ufp de hVRS, 1 x106 ufp ADV, proteína plll de ADV purificada (^g, 500 ng y 50 ng), 20 μg de extracto de células A549 infectadas con ADV y 20 μg de extracto de células A549 sin infectar. Como control negativo se aplicaron ^g de BSA, contenidos en 2 μΙ. Se permitió que las soluciones aplicadas sobre la membrana secaran al aire por 15 minutos. Posteriormente, la membrana se bloqueó con BSA al 5% en PBS conteniendo Tween-20 0,05%, por 1 h a 25° C. Las membranas fueron incubadas con 3,4 μg/ml de anticuerpo monoclonal anti-plll proveniente del hibridoma 7E1 1 ó del hibridoma 6F1 1 en solución de bloqueo por 1 h a 25° C. Luego se retiró el exceso de anticuerpo no adherido al antígeno mediante tres lavados con PBS- Tween-20 0,05% a 25° C. La detección de los anticuerpos unidos al antígeno se realizó mediante un anticuerpo anti IgG de ratón conjugado a HRP (Invitrogen, Life Technologies #62-6520), el cual fue diluido en solución de bloqueo por 1 h a 25° C, para posteriormente eliminar el exceso de anticuerpo no unido mediante tres lavados con PBS-Tween-20 0,05% a 25° C. La visualización de la unión de los anticuerpos monoclonales al antígeno se realizó mediante la captura de la quimioluminiscencia producida por la catálisis de sustrato comercial "enhanced chemiluminescence Western blot detection system" (ECL, Amersham, Uppsala, Sweden), mediado por la enzima HRP unida al anticuerpo anti-lgG de ratón. La captura de la quimioluminiscencia se realizó con el sitema de fotodocumentación MyECL (Thermo Fisher). Como se observa en la figura 4, los anticuerpos proveniente de los hibridomas 7E1 1 y 6F1 1 sólo se unen a los "dots" que contienen ADV, proteína plll ó células infectadas con ADV, y no se unen de manera inespecífica a los "dots" que contienen proteínas no relacionadas, otros virus o células no infectadas. Los ejemplos descritos en esta memoria descriptiva demuestran la especificidad, eficiencia, sensibilidad y versatilidad que tiene estos anticuerpos monoclonales anti-plll de ADV secretados por las líneas celulares de los hibridomas 7E1 1 y 6F1 1 . Los ejemplos aquí presentados constituyen una demostración de algunos de los usos de los anticuerpos monoclonales anti-plll de ADV, pero en ningún caso limitan el alcance de la presente invención.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Anticuerpo monoclonal o un fragmento de él que se une a la proteína plll del Adenovirus (ADV), CARACTERIZADO porque comprende una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia con al menos un 90%, 95% o 99% de identidad con la SEQ ID No: 1 o SEQ ID No: 5 y una región variable de la cadena liviana que tiene una secuencia con al menos un 90%, 95% o 99% de identidad con la SEQ ID No: 2 o SEQ ID No: 6.
2. Anticuerpo monoclonal o un fragmento de él, de acuerdo con la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque el anticuerpo o fragmento además se encuentra unido a un marcador seleccionado del grupo compuesto por fluoróforos, biotina, radioisótopos, metales, proteínas, enzimas, o cualquier otro compuesto químico.
3. Conjunto de secuencias nucleotídicas que codifican un anticuerpo monoclonal o un fragmento de él, de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2, CARACTERIZADO porque comprende una secuencia con al menos un 80%, 85%, 90%, 95% y 99% de identidad con la SEQ ID No: 3, o la SEQ ID No: 7 y sus reversos complementarios, que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo y comprende una secuencia con al menos un 80%, 85%, 90%, 95% y 99% de identidad con la SEQ ID No: 4 o la SEQ ID No: 8 y sus reversos complementarios, que codifican la región variable de la cadena liviana del anticuerpo.
4. Método in vitro y/o ex vivo de diagnóstico de infección por ADV en una muestra biológica, CARACTERIZADO porque el método comprende poner en contacto la muestra biológica con el anticuerpo monoclonal contra ADV o un fragmento de él de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2 y detectar la unión del anticuerpo con el antígeno.
5. Método in vitro y/o ex vivo de diagnóstico de acuerdo a la reivindicación 4, CARACTERIZADO porque la muestra biológica se selecciona del grupo compuesto por células in vitro infectadas con ADV, secreciones nasales, lavados nasales, líquido cefalorraquídeo, secreciones faríngeas y/o lavados o secreciones bronquiales.
6. Método in vitro y/o ex vivo de diagnóstico de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, CARACTERIZADO porque la técnica utilizada para la detección del anticuerpo con el antígeno se selecciona de: ELISA, inmunofluorescencia, inmunohistoquimica, inmunocromatografía, citometría de flujo, cellsorter, inmunoprecipitación y/o Western blot.
7. Método in vitro y/o ex vivo de diagnóstico de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, CARACTERIZADO porque el anticuerpo o fragmento de él de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, se encuentra conjugado con un marcador que permite su detección.
8. Método in vitro y/o ex vivo de diagnóstico de acuerdo a la reivindicación 7, CARACTERIZADO porque el anticuerpo se encuentra unido a un marcador seleccionado del grupo compuesto por biotina, metales, enzimas, proteínas, fluoroforos, isótopos radiactivos o cualquier otro compuesto químico.
9. Método in vitro y/o ex vivo de diagnóstico de acuerdo a la reivindicación 7, CARACTERIZADO porque el anticuerpo se encuentra adosado a un soporte sólido.
10. Método in vitro y/o ex vivo de diagnóstico de acuerdo a la reivindicación 7, CARACTERIZADO porque el soporte sólido es nitrocelulosa, membrana de nylon, esferas magnéticas, esferas fluorescentes u otro soporte.
1 1 . Kit de diagnóstico para detectar ADV, CARACTERIZADO porque comprende al menos un anticuerpo monoclonal contra ADV de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2.
12. Kit de diagnóstico de acuerdo a la reivindicación 9, CARACTERIZADO porque el anticuerpo se encuentra adosado a un soporte sólido.
13. Kit de diagnóstico de acuerdo a la reivindicación 10, CARACTERIZADO porque el soporte sólido es nitrocelulosa, membrana de nylon, esferas magnéticas, esferas fluorescentes u otro soporte.
14. Kit de diagnóstico de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 9 a 1 1 , CARACTERIZADO porque corresponde a un test inmunocromatográfico, luminex, citometría de flujo, inmunofluorescencia, radioinmunoanálisis, Western blot, Dot plot, ELISA, inmunodifusión o inmunoprecipitación, para detectar al ADV.
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