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WO2017179720A1 - Ｃｄ８陽性ｔ細胞を誘導する方法 - Google Patents

Ｃｄ８陽性ｔ細胞を誘導する方法 Download PDF

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WO2017179720A1
WO2017179720A1 PCT/JP2017/015358 JP2017015358W WO2017179720A1 WO 2017179720 A1 WO2017179720 A1 WO 2017179720A1 JP 2017015358 W JP2017015358 W JP 2017015358W WO 2017179720 A1 WO2017179720 A1 WO 2017179720A1
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cells
cell
antigen
specific
ips
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PCT/JP2017/015358
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French (fr)
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宏 河本
卓也 前田
喬子 増田
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Kyoto University NUC
Original Assignee
Kyoto University NUC
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Publication date
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    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for inducing CD4 ⁇ CD8 + T cells from pluripotent stem cells.
  • TCRs T cell receptors
  • T cells immortalized, expanded and cloned A method for infinite increase by immortalizing T cells has also been proposed.
  • One cell is immortalized, expanded and cloned.
  • Examples of the immortalization of cells include a method by fusion with cancer cells and a method such as long-term culture by TCR stimulation and cytokine stimulation.
  • the T cells immortalized in this way are so-called cancer cells, and autotransplantation to return to the patient himself is dangerous. There is also a problem that the function is lowered in the cloning step.
  • Patent Documents 1 to 7 and non-patent documents A method for producing a pluripotent stem cell having a specific antigen-specific TCR gene, particularly an iPS cell, and a method for regenerating a T cell maintaining TCR from the iPS cell have been reported (Patent Documents 1 to 7 and non-patent documents). Patent Documents 1 to 6). These methods make it possible to obtain a large amount of T cells having a specific TCR gene and are expected to be applied to immune cell therapy.
  • iPS cells when iPS cells are induced from human cytotoxic T cells (CTL cells) and the CTL cells are regenerated from the obtained iPS cells, the antigen-specific cytotoxic activity of the regenerated CTLs is different from that of the original CTL cells. There is no report that the equivalent was obtained.
  • CTL cells human cytotoxic T cells
  • CD8 ⁇ type T cells are a type of T cell called innate immunity, do not have sufficient binding properties with MHC class I molecules, and have a weak effect as a co-receptor of T cell receptor (TCR). CD8 ⁇ type T cells are scarcely contained in lymphoid tissues and are often found in mucosal tissues.
  • the present application aims to provide a method for producing CD4 ⁇ CD8 + T cells from pluripotent stem cells. More specifically, an object of the present application is to provide a method for inducing differentiation of CD4 ⁇ CD8 + T cells having desired antigen-specific cytotoxic activity from pluripotent stem cells.
  • CD8 T cell simply means CD4 ⁇ CD8 + T cell.
  • the present application aims to provide a CD4 ⁇ CD8 + T cell population having the same antigen specificity and high antigen specificity.
  • + includes the step of differentiation to T cells, CD4 - provides a method of inducing CD8 + T cells.
  • pluripotent stem cells induced to differentiate, CD4 - CD8 - T cells, as well as to obtain a cell culture comprising CD4 + CD8 + T cells, (2) Differentiation of CD4 + CD8 + T cells in the cell culture obtained in (1) into CD4 ⁇ CD8 + T cells in the presence of a substance that suppresses the cytotoxic activity of CD4 ⁇ CD8 ⁇ T cells
  • a method of inducing CD4 ⁇ CD8 + T cells is provided.
  • examples of pluripotent stem cells include those having a specific receptor for a desired antigen.
  • a reconstituted T cell receptor (TCR) or a chimeric antigen receptor (CAR) The thing which has is mentioned.
  • CD4 ⁇ CD8 + T cells derived from the pluripotent stem cells having reconstituted TCRs by the method of the present application exhibit antigen-specific cytotoxic activity while maintaining the antigen specificity of the original TCR. The same is true for pluripotent stem cells with reconstituted CAR.
  • Examples of pluripotent stem cells include pluripotent stem cells that do not have TCR or CAR.
  • antigen-specificity having a desired antigen specificity can be obtained by inducing the desired TCR to the obtained CD4 ⁇ CD8 + T cells by a known method. Can be obtained.
  • CD4 ⁇ CD8 + T cells having the same antigen specificity are 80% or more, 85% or more, 90% or more of the cells constituting the cell culture. % Or 95% or more of the cell culture can be obtained.
  • the present application also provides such cell cultures.
  • immune cell therapy comprising administering to a patient antigen-specific CD4 ⁇ CD8 + T cells obtained by the methods of the present application.
  • a CD4 ⁇ CD8 + T cell culture having a desired antigen specificity and having a strong antigen-specific cytotoxic activity can be obtained.
  • the FACS analysis result when LMP2-T-iPS cells are induced to differentiate for 35 days by the conventional T cell induction method.
  • 1 is a schematic diagram of a procedure for inducing T cells from the pluripotent stem cells of Example 1.
  • FIG. 5 is a graph showing the percentage of viable cells in DP cells (top) and the ratio of viable cells to DP cells at the start of culture (bottom) when cultured for 5 hours in the presence of CD3 antibody.
  • the graph which shows the WT1 peptide specific cytotoxic activity of the CD8SP cell induced
  • the cytotoxic activity of the CD8SP cell induced
  • pluripotent stem cell is a stem cell that has pluripotency that can be differentiated into many cells existing in a living body and also has a self-proliferating ability.
  • pluripotent stem cells include embryonic stem (ES) cells, embryonic stem (ntES) cells derived from cloned embryos obtained by nuclear transfer, embryonic germ cells (“EG cells”), induced pluripotent stems ( Examples include iPS) cells, cultured fibroblasts, bone marrow stem cells-derived pluripotent cells (Muse cells), and the like.
  • the pluripotent stem cell is preferably a mammalian pluripotent stem cell, more preferably a human pluripotent stem cell, such as an ES cell or an iPS cell.
  • a human pluripotent stem cell such as an ES cell or an iPS cell.
  • iPS cells In consideration of producing a bank of cells used for immunotherapy using cells derived from humans having a specific HLA, it is preferable to use iPS cells.
  • T cell means a cell expressing an antigen receptor called T cell receptor (TCR) on its surface.
  • TCR T cell receptor
  • CD4 + CD8 + T cell both mean CD4 positive CD8 positive T cells.
  • CD4 ⁇ CD8 ⁇ T cell double negative T cell” and “DN cell” all mean CD4 negative CD8 negative T cells.
  • CD4 - CD8 + T cells both CD8T cell and CD8SP cell” both refers to CD4-negative CD8-positive T cells.
  • CD8 T cell includes both CD8 ⁇ homodimer and CD8 ⁇ heterodimer.
  • TCR means T cell receptor.
  • CTL cell means a cytotoxic T cell.
  • a T cell having a reconstituted T cell receptor (TCR) having a desired antigen specificity induces iPS cells from a T cell having a reconstituted TCR specific for the desired antigen.
  • TCR T cell receptor
  • the T cells induced into iPS cells are preferably T cells that express CD3 and express at least one molecule selected from the group consisting of CD4 and CD8.
  • human T cells examples include helper / regulatory T cells that are CD4 positive cells, cytotoxic T cells that are CD8 positive cells, naive T cells (CD45RA + CD62L + cells), central memory T cells ( CD45RA ⁇ CD62L + cells), effector memory T cells (CD45RA ⁇ CD62L ⁇ cells), and terminal effector T cells (CD45RA + CD62L ⁇ cells).
  • helper / regulatory T cells that are CD4 positive cells
  • cytotoxic T cells that are CD8 positive cells
  • naive T cells CD45RA + CD62L + cells
  • central memory T cells CD45RA ⁇ CD62L + cells
  • effector memory T cells CD45RA ⁇ CD62L ⁇ cells
  • terminal effector T cells CD45RA + CD62L ⁇ cells.
  • CTL Cytotoxic T cells
  • Human T cells can be isolated from human tissues by a known technique.
  • the human tissue is not particularly limited as long as it is a tissue containing the T cell, and examples thereof include peripheral blood, lymph nodes, bone marrow, thymus, spleen, umbilical cord blood, and lesioned tissue. Among these, peripheral blood and umbilical cord blood are preferable from the viewpoint of low invasiveness to humans and easy preparation.
  • a known technique for isolating human T cells includes, for example, flow cytometry using an antibody against a cell surface marker such as CD3 and a cell sorter.
  • desired T cells can be isolated using cytokine secretion or functional molecule expression as an index.
  • T cells have different cytokines secreted depending on Th1 type or Th2 type. Therefore, T cells having a desired Th type can be isolated by selecting such cytokines as indicators. .
  • cytotoxic (killer) T cells can be isolated using secretion or production of granzyme or perforin as an index.
  • a cytotoxic T cell specific for an antigen associated with cancer or an infectious disease is a cancer that expresses the antigen or a patient suffering from the target infectious disease or a subject with a history of such cancer or infectious disease. It may be isolated from and proliferated, or derived from cells obtained from healthy individuals.
  • a method of purifying from a cultured human cell or human tissue containing the antigen-specific T cell using an affinity column to which the target antigen is immobilized is employed.
  • T cells having a specific antigen specificity from human tissues using tetramerized MHC (major histocompatibility complex) to which a desired antigen is bound can also be employed.
  • Cytotoxic T cells specific for a certain antigen can be obtained by stimulating lymphocytes obtained from humans by a conventional method, such as peripheral blood mononuclear cells, with the antigen or its epitope peptide.
  • Antigen proteins or epitope peptides thereof related to many diseases such as cancer, autoimmune diseases, infectious diseases and the like are known, and may be appropriately selected according to the purpose.
  • a method for inducing antigen-specific CTL cells by stimulating lymphocytes with an antigen is well known.
  • T cells having the desired antigen specificity also include CAR-T cells having a chimeric antigen receptor (CAR) obtained by genetic manipulation.
  • CAR-T cells can be obtained by methods described in the literature, Themeli, M. et al., Nat Biotechnol 31, 928-933 (2013) and Themeli, M. et al., Cell Stem Cell 16, 357-366 ( 2015). (This document constitutes a part of this application by reference.)
  • IPS cells are induced from T cells having the desired antigen specificity obtained as described above.
  • T cells for example, the methods described in Vizcardo et al., Cell Stem Cell 12, 31-36 2013 may be used.
  • a desired antigen-specific T cell can be obtained from a subject who has acquired immunity to the disease to be treated, and T-iPS cells can be obtained by introducing a yamanaka factor into this cell (Takahashi and Yamanaka, Cell 126, 663). -673 (2006), Takahashi et al., Cell 131, 861-872 (2007) and Grskovic et al., Nat. Rev. Drug Dscov. 10,915-929 (2011)). (The literature cited here constitutes part of this application by reference.)
  • An iPS cell is an artificial stem cell derived from a somatic cell having characteristics almost equivalent to those of an ES cell, which can be produced by allowing a specific reprogramming factor to act on the somatic cell (K. Takahashi and S. Yamanaka). (2006) Cell, 126: 663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131: 861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318: 1917-1920; Nakagawa, M Et al., Nat. Biotechnol. 26: 101-106 (2008); International Publication WO 2007/069666).
  • the reprogramming factor is a gene specifically expressed in ES cells, its gene product or non-coding RNA, a gene that plays an important role in maintaining undifferentiation of ES cells, its gene product or non-coding RNA, or It may be constituted by a low molecular compound.
  • genes included in the reprogramming factor include Oct3 / 4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, Eras, and ECAT15.
  • -2 Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3, or Glis1, etc.
  • the reprogramming factor may be brought into contact with or introduced into a somatic cell by a known method according to its form.
  • a protein form it may be introduced into a somatic cell by techniques such as lipofection, fusion with a cell membrane permeable peptide (eg, HIV-derived TAT and polyarginine), and microinjection.
  • a cell membrane permeable peptide eg, HIV-derived TAT and polyarginine
  • DNA it can be introduced into somatic cells by techniques such as vectors such as viruses, plasmids, artificial chromosomes, lipofection, liposomes, and microinjection.
  • viral vectors include retroviral vectors and lentiviral vectors (above, Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007 ), Adenovirus vectors (Science, 322, 945-949, 2008), adeno-associated virus vectors, Sendai virus vectors (WO 2010/008054), and the like.
  • the artificial chromosome vector examples include human artificial chromosome (HAC), yeast artificial chromosome (YAC), and bacterial artificial chromosome (BAC, PAC).
  • HAC human artificial chromosome
  • YAC yeast artificial chromosome
  • BAC bacterial artificial chromosome
  • a plasmid a plasmid for mammalian cells can be used (Science, 322: 949-953, 2008).
  • the vector can contain regulatory sequences such as a promoter, an enhancer, a ribosome binding sequence, a terminator, a polyadenylation site, etc., so that a nuclear reprogramming substance can be expressed.
  • selectable marker sequences such as kanamycin resistance gene, ampicillin resistance gene, puromycin resistance gene), thymidine kinase gene, diphtheria toxin gene, reporter gene sequences such as green fluorescent protein (GFP), ⁇ -glucuronidase (GUS), FLAG, etc.
  • GFP green fluorescent protein
  • GUS ⁇ -glucuronidase
  • FLAG FLAG
  • RNA incorporating 5-methylcytidine and pseudoouridine may be used as an initialization factor (Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7: 618-630). (The literature cited here constitutes part of this application by reference.)
  • the culture medium for inducing iPS cells is, for example, DMEM, DMEM / F12 or DME culture medium containing 10 to 15% FBS (in addition to LIF, penicillin / streptomycin, puromycin, L-glutamine, Non-essential amino acids, ⁇ -mercaptoethanol, etc. may be included as appropriate.) Or a commercially available culture medium [eg, culture medium for mouse ES cell culture (TX-WES culture medium, Thrombo X), primate ES cell culture Medium (primate ES / iPS cell culture medium, Reprocell), serum-free medium (mTeSR, STEMCELL Technologies)] and the like.
  • FBS penicillin / streptomycin
  • puromycin puromycin
  • L-glutamine Non-essential amino acids
  • ⁇ -mercaptoethanol etc.
  • a commercially available culture medium eg, culture medium for mouse ES cell culture (TX-WES culture medium, Thrombo X), primate
  • iPS cell induction can be, for example, 37 ° C., 5% CO at 2 presence of about 4-7 days contacting the somatic cell with reprogramming factor on 10% FBS-containing DMEM or DMEM / F12 culture medium
  • the cells are then cultured on feeder cells (for example, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.), and bFGF-containing primate ES cell culture medium is cultured about 10 days after contact between the somatic cells and the reprogramming factor. Incubating at about 30 to about 45 days or more after the contact can give rise to ES-like colonies.
  • DMEM culture medium containing 10% FBS (including LIF, penicillin / streptomycin, etc.) on feeder cells for example, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.
  • feeder cells for example, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.
  • Puromycin, L-glutamine, non-essential amino acids, ⁇ -mercaptoethanol, etc. can be included as appropriate.
  • ES-like colonies can be generated.
  • feeder cells somatic cells to be reprogrammed themselves are used (Takahashi K, et al. (2009), PLoS One.
  • extracellular matrix eg, Laminin- 5 (WO2009 / 123349), Laminin-10 (US2008 / 0213885), fragments thereof (WO2011 / 043405) and Matrigel (BD)
  • Laminin- 5 WO2009 / 123349
  • Laminin-10 US2008 / 0213885
  • fragments thereof WO2011 / 043405
  • Matrigel Matrigel
  • iPS cells may be established under hypoxic conditions (oxygen concentration of 0.1% or more and 15% or less) (YoshidaoshiY, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5 : 237-241 or WO2010 / 013845). (The literature cited here constitutes part of this application by reference.)
  • HDAC histone deacetylase
  • small molecule inhibitors such as valproic acid (VPA), trichostatin A, sodium butyrate, MC1293, M344, siRNA against HDAC And shRNA (eg, nucleic acid expression inhibitors such as HDAC1 siRNA Smartpool (TM) (Millipore), HuSH29mer shRNA Constructs against HDAC1 etc.), MEK inhibitors (for example, PD184352, PD98059, U0126, SL327 and PD0325901).
  • VPA valproic acid
  • TM HDAC1 siRNA Smartpool
  • HuSH29mer shRNA Constructs against HDAC1 etc. HuSH29mer shRNA Constructs against HDAC1 etc.
  • MEK inhibitors for example, PD184352, PD98059, U0126, SL327 and PD0325901.
  • Glycogen synthase kinase-3 inhibitors eg, Bio and CHIR99021
  • DNA methyltransferase inhibitors eg, 5-azacytidine
  • histone methyltransferase inhibitors eg, BIX-012
  • Small molecule inhibitors such as 4, nucleic acid expression inhibitors such as siRNA and shRNA against Suv39hl, Suv39h2, SetDBl and G9a), L-channel calcium agonist (eg Bayk8644), butyric acid, TGF ⁇ inhibitor or ALK5 inhibitor (eg LY364947, SB431542, 616453 and A-83-01), p53 inhibitors (eg siRNA and shRNA against p53), ARID3A inhibitors (eg siRNA and shRNA against ARID3A), miR-291-3p, miR-294, miR MiRNAs such as -295 and mir-302, Wnt Signaling (eg soluble Wnt3a), neuropeptide Y, prostaglandin
  • the culture medium is exchanged with a fresh culture medium once a day from the second day after the start of the culture.
  • the number of somatic cells used for nuclear reprogramming is not limited, but ranges from about 5 ⁇ 10 3 to about 5 ⁇ 10 6 cells per 100 cm 2 of culture dish.
  • IPS cells can be selected according to the shape of the formed colonies.
  • a culture medium selective culture medium
  • a corresponding drug introduced by introducing a drug resistance gene expressed in conjunction with a gene expressed when somatic cells are initialized (for example, Oct3 / 4, Nanog)
  • somatic cells for example, Oct3 / 4, Nanog
  • iPS cells can be selected by adding a luminescent substrate in the case of a luminescent enzyme gene. Induced iPS cells (T-iPS cells) maintain the T cell receptor (TCR) gene of the derived T cells.
  • a method for introducing a desired antigen-specific TCR gene into the pluripotent stem cell can be mentioned.
  • the TCR gene may also be used to isolate a desired antigen-specific T cell from a cancer patient, or from a healthy person, and isolate the TCR gene from the T cell.
  • Antigen-specific TCR genes also include chimeric antigen receptor genes with specific antigen specificity.
  • a desired antigen-specific TCR gene is introduced into a pluripotent stem cell such as an iPS cell.
  • Introduction of the TCR gene into iPS cells may be carried out by a conventional method, for example, according to the method described in Morgan R.A. et al, Science, 314: 126. 2006.
  • the TCR gene may be placed on an appropriate vector and introduced into iPS cells.
  • it can be introduced into somatic cells by techniques such as viruses, plasmids, artificial chromosomes, vectors, lipofection, liposomes, microinjection and the like.
  • virus vectors include retrovirus vectors, lentivirus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, Sendai virus vectors, and the like.
  • artificial chromosome vector examples include human artificial chromosome (HAC), yeast artificial chromosome (YAC), and bacterial artificial chromosome (BAC, PAC).
  • a plasmid a plasmid for mammalian cells can be used.
  • the vector can contain regulatory sequences such as a promoter, an enhancer, a ribosome binding sequence, a terminator, a polyadenylation site, etc. so that TCR can be expressed, and, if necessary, a drug resistance gene (for example, kanamycin resistance).
  • Gene ampicillin resistance gene, puromycin resistance gene), thymidine kinase gene, diphtheria toxin gene and other selectable marker sequences, green fluorescent protein (GFP), ⁇ -glucuronidase (GUS), FLAG and other reporter gene sequences it can.
  • GFP green fluorescent protein
  • GUS ⁇ -glucuronidase
  • the pluripotent stem cells may be iPS cells or ES cells derived from somatic cells other than T cells.
  • the term “somatic cell” refers to any animal cell except germline cells or pluripotent cells such as sperm, spermatocytes, eggs, oocytes, ES cells (preferably Refers to mammalian cells including humans). Somatic cells include fetal (pup) somatic cells, neonatal (pup) somatic cells, and mature healthy individual somatic cells or somatic cells of diseased individuals. Moreover, all of primary culture cells, subculture cells, and established cell lines are included.
  • somatic cells are differentiated cells, for example, neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, tissue stem cells such as dental pulp stem cells (somatic stem cells), tissue precursor cells, lymphocytes, epithelial cells, endothelial cells, muscles Examples include cells, fibroblasts (skin cells, etc.), hair cells, hepatocytes, gastric mucosa cells, intestinal cells, spleen cells, pancreatic cells (exocrine pancreatic cells, etc.), brain cells, lung cells, kidney cells, fat cells, etc. Is done.
  • a method for inducing iPS cells from somatic cells the same method as that for inducing iPS cells from T cells can be used.
  • Pluripotent stem cells are induced to differentiate into T cell populations including DP cells and DN cells.
  • methods for inducing differentiation from pluripotent stem cells to T cells include the methods described in Timmermans et al., Journal of Immunology, 2009, 182: 6879-6888 (this document is incorporated by reference in part). Constitute).
  • pluripotent stem cells are co-cultured with OP9 stromal cells, eg, mouse OP9 stromal cell culture, to obtain blood cell progenitor cells.
  • the resulting blood cell progenitor cells are then co-cultured with OP9 / DLL1 cells.
  • OP9 / DLL1 co-culture IL-7, FIT-3L and SCF (Stem Cell Factor) are added to the medium.
  • SCF Ste Cell Factor
  • DN cells kill DP cells when a mixture of DN cells and DP cells is stimulated with CD3 antibody.
  • the cell culture excluding DN cells is preferably substantially free of DN cells.
  • the content of DN cells is preferably 5% or less, preferably 3% or less, more preferably less than 1%.
  • DP cell concentration the process of removing DN cells from a cell culture containing DP cells and DN cells
  • enriched DP cell culture When cells other than DN cells are removed simultaneously or individually from the cell culture, they are also referred to as “DP cell enrichment” and “enriched DP cell culture”.
  • the cell culture containing DN cells and DP cells may contain CD8SP cells.
  • CD8SPC cells may be CD8 ⁇ homodimeric T cells, and it is preferable to remove CD8SP cells, particularly CD8 ⁇ homodimeric T cells at the same time when DP cells are concentrated, that is, DN cells are removed.
  • the method for removing DN cells and CD8SP cells from the cell culture is not limited.
  • CD8SP cells and DN cells can be removed by collecting CD4 positive cells using a carrier to which a CD4 antibody is bound, such as MACS beads.
  • CD8 ⁇ homodimeric T cells can be removed by recovering CD8SP ⁇ heterodimeric T cells using a carrier to which CD8 ⁇ is bound, for example, MACS beads.
  • a cell culture substantially free of DN cells is removed by removing the DN cell fraction with a cell sorter, or a DN cell or CD8SP cell is collected by collecting the DP cell fraction with a cell sorter.
  • a substantially free cell culture can be obtained.
  • cell cultures substantially free of CD8SP ⁇ homozygous cells can be collected by collecting the CD8SP ⁇ heterozygous cell fraction using a cell sorter.
  • the concentrated DP cell culture is then induced to differentiate into CD8SP cells.
  • Induction of CD8SP cells from DP cells can be performed by directly activating any of the activation pathways that are generated when a T cell receptor is stimulated.
  • T cells can be activated in a manner similar to TCR stimulation by adding PMA and Ionomysin.
  • Examples of stimulation via TCR include culturing DP cells while stimulating with CD3 antibody.
  • IL-7 and IL-2 are preferably added to the culture medium.
  • the culture period using the culture solution containing the CD3 antibody may be 3 to 10 days, for example, 4 to 8 days, for example, about 6 days.
  • the DP cell culture is a DP cell culture derived from a pluripotent stem cell having a specific receptor for a desired antigen, such as TCR
  • stimulation with the antigen or antigen presentation presenting the antigen Differentiation from DP cells to CD8SP cells can also be induced by applying stimulation with cells.
  • the antigen recognized by CAR is added as a soluble molecule, coated on beads and incubators, co-cultured, or expressed in another cell and co-cultured. Can be put.
  • CD8SP cells obtained by inducing differentiation by directly activating any of the activation pathways generated when stimulating the T cell receptor in the enriched DP cell culture are CD8 ⁇ expressing CD8 ⁇ heterodimer.
  • Type of T cells In Reference Example 2 shown below, when CD8SP cells were induced by CD3 antibody stimulation from a cell culture containing DN cells and CD8SP cells without DP cell concentration, most of the obtained cells were CD8 ⁇ homodimers. . CD8 ⁇ homodimeric T cells have a low antigen-specific cytotoxic activity but a relatively high NK-like cytotoxic activity.
  • culturing may be performed that includes a medium containing the following CD3 antibody together with a substance that suppresses the cytotoxic activity of DN cells without removing the DN cells.
  • substances that suppress the cytotoxic activity of DN cells include perforin inhibitors, granzyme inhibitors, Fas pathway inhibitors, caspase inhibitors, NK activating receptor inhibitory antibodies, and the like.
  • CD8SP cells induced to differentiate from pluripotent stem cells having a TCR gene or CAR gene reconstituted by the method of the present application exhibit strong antigen-specific cytotoxic activity.
  • a CD8SP cell regenerated CTL cell
  • the original CTL cell is finally obtained as a regenerated CTL cell.
  • WO2016 / 010148 describes that in order to prevent further reconstitution of the TCR gene and the like before inducing the T cell.
  • the Rag1 or Rag2 gene may be disrupted by a genome editing technique or the like at the stage of pluripotent stem cells, and then differentiation induction into T cells may be started.
  • a method for producing a pluripotent stem cell having a CAR gene and differentiation induction of a CAR-expressing T cell from the pluripotent stem cell can be obtained by the method described in the distribution [Themeli, M. et al., Nat Biotechnol 31, 928-933 (2013) and Themeli, M. et al., Cell Stem Cell 16, 357-366 (2015)]. (The literature cited here constitutes part of this application by reference.)
  • a cytotoxic T cell specific for a desired antigen is expressed by expressing a TCR gene having a desired antigen specificity in a CD8SP cell culture induced to differentiate from pluripotent stem cells.
  • the pluripotent stem cell may have a TCR gene or a CAR gene, or may not have such a gene.
  • it may be performed according to the above-described method for expressing a desired antigen-specific TCR gene in a pluripotent stem cell.
  • the TCR expressed by the generated CD8SP cells may be suppressed by siRNA or the like.
  • T cells having a chimeric antigen receptor (CAR) specific for a desired antigen may be prepared from a CD8SP cell culture. By introducing the CAR gene into CD8SP cells, CAR-expressing cells can be obtained.
  • Antigen-specific CTL cells obtained by the method of the present application are used after further proliferating by a known method such as stimulation with the antigen itself, antigen-presenting cells presenting the antigen, or stimulation with an anti-CD3 antibody. May be.
  • proteins including LMP2, WT1, and NY-ESO1 are known as proteins expressed in many cancers. Epitope peptides of these proteins are also known as cancer antigen peptides. There are also many known TCR genes specific for these cancer antigens. The method of the present application makes it possible to obtain a cell population containing high-quality CD8SP cells having specific cytotoxic activity against cancer with high purity, and is useful in immune cell therapy.
  • the therapeutic effect on a human tumor-seeded mouse model was confirmed by administering CD8SP cells obtained by the method of the present application.
  • side effects such as damage to other tissues were not observed in mice administered with the regenerative cells.
  • no event has been observed in which the administered cells become cancerous.
  • the method of the present invention is considered to be substantially close to the level that can be clinically applied in both the effectiveness and safety in immunocell therapy in which CTL cells specific for an antigen specific for cancer or infection are administered to a patient.
  • the present application provides T cell preparations for immune cell therapy targeting various antigens.
  • a specific antigen-specific T cell is induced from a healthy person, a T-iPS cell is produced from such a cell, and a CD8SP cell can be produced from the T-iPS cell by the method of the present application.
  • the T-iPS cell is banked and stored. deep.
  • CD8SP cells are prepared and proliferated and divided into banks and stored.
  • induced CD8SP cells are suspended in an appropriate medium, such as physiological saline or PBS, and administered to a target patient whose HLA matches a certain level or more.
  • an appropriate medium such as physiological saline or PBS
  • HLA haplotype homo homo (homozygous type)
  • the case where at least one of the HLA haplotypes is matched is exemplified.
  • Administration to the patient may be performed intravenously. The dose is not limited, but it is intravenously administered to the patient one or more times at 10 6 -10 7 cells / kg.
  • a project to construct a highly versatile iPS cell bank by using a homozygous person with a high frequency HLA haplotype as a donor is currently underway in Japan (CYRANOSKI, Nature vol. 488, 139 (2012)). (This document constitutes a part of the present application by reference.)
  • IPS cells derived from are particularly preferably used.
  • the number of cells administered is not particularly limited, and may be appropriately determined according to the patient's age, sex, height, weight, target disease, symptom, and the like.
  • the optimal number of cells to be administered may be appropriately determined by clinical trials.
  • T cells can target various antigens, and the method of the present application can be applied to immune cell therapy for various diseases such as cancer, infectious diseases, autoimmune diseases, and allergies.
  • peripheral blood mononuclear cells preparation of peripheral blood mononuclear cells, autologous LCL cell line and C1R-A * 24: 02 cell line
  • PBMC Peripheral blood mononuclear cells
  • HLA-A * 24: 02 Isolated from leukemia patients according to conventional methods.
  • Peripheral blood B lymphocytes were transformed with Epstein-Barr virus (EBV) to obtain autologous B-lymphoblastoid cell lines (self).
  • ESV Epstein-Barr virus
  • the C1R-A * 24: 02 cell line expressing only HLA A * 24: 02 was obtained by introducing the HLA-A * 24: 02 gene into C1R, which is a human LCL cell line.
  • LMP2 and WT1 peptide-specific CTL PBMC2.5 ⁇ 10 5 obtained from healthy volunteers was seeded in each well of a 96-well U-bottom plate (Falcon), and 10% human AB serum (Sigma), penicillin (100 U / ml) -streptomycin (100 ⁇ g / ml) mixed solution (Nacalaitesque) and LMP2 (TYGPVFMSL: SEQ ID NO: 1) or WT1 (CYTWNQMNL: SEQ ID NO: 2) (Tsuboi, A et al.
  • CD8 positive T cells containing antigen-specific CTLs were isolated by tetramer staining. Preincubated with 100 nM of LMP2 or WT1 synthetic peptides, were co-cultured cells obtained with HLA-A * 24:02 + LCL that were irradiated. After 2 days in culture, IL-2, IL-7 and IL-21 were added at the same concentration as the initial stimulus. CTL cells were then amplified by stimulation with LCL every 2 weeks. The obtained CTL cells are referred to as “original CTL cells”.
  • Tumor antigen-specific T-iPS cells were established by a slightly modified method described in Non-Patent Document 1. Briefly, tumor antigen specific CTLs were enriched with CD8 microbeads (Milteny Biotec) or FACSAria III cell sorter (BD Biosciences). 1 ⁇ 10 6 enriched tumor antigen-specific CTLs were transformed with Sendai virus vector containing 4 Yamanaka factors and MOI 3 SV40 large T antigen (LTa) (Addgene) (Nishimura, K. et al. (2011) J Biol Chem 286, 4760-4771).
  • LTa Sendai virus vector containing 4 Yamanaka factors and MOI 3 SV40 large T antigen (LTa) (Addgene)
  • transformed cells are seeded onto mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, 10% human AB serum and IL-2 (12.5 U / ml), IL-7 (10 ng / ml)
  • MEF mouse embryonic fibroblast
  • the cells were cultured in RPMI-1640, a T cell medium supplemented with IL-21 (30 ng / ml).
  • RPMI-1640 a T cell medium supplemented with IL-21 (30 ng / ml).
  • half of the medium was supplemented with 20% knockout serum replacement supplement (Gibco), non-essential amino acids (0.1 mM) (Gibco), 2-mercaptoethanol (10 mM) (Nacalai Tesque) and basic fibroblasts.
  • the culture medium was replaced with Dulbecco's modified Eagle medium / F12 (Sigma), which is a human iPSC medium supplemented with growth factors (5 ng / ml) (Wako). Colonies began to appear on days 21-35. Each colony was picked and expanded.
  • T-iPS cells obtained from LMP2 peptide-specific CTL were selected one by one and subjected to the following experiment.
  • LMP2-T-iPS cells and WT1-T-iPS cells were selected one by one and subjected to the following experiment.
  • LMP2-T-iPS cells and WT1-T-iPS cells were selected one by one and subjected to the following experiment.
  • T cells were induced from LMP2-T-iPS cells obtained in Reference Example 1 by the method of Non-Patent Document 1. Up to the 35th day, the same operation as in Example 1 was performed. Cells on day 35 of induction were analyzed by FACS. In the cell culture containing LMP2 antigen-specific T cells, 12.0% of DP cells and 68.0% of DN cells were contained (FIG. 1). When these cells were cultured for 6 days under stimulation with CD3 antibody, a cell culture containing 68.9% of CD8SP cells was obtained. The obtained CD8SP cells were specific for LMP2 tetramer, and almost all were CD8 ⁇ homodimeric T cells (FIG. 2). Further, when the TCR gene of the obtained cells was analyzed, it was the same as the TCR gene of the original LMP2-specific CTL (data not shown). Hereinafter, the obtained cells are referred to as regenerative CTL cells.
  • THP1 is an HLA A * 24: 02-positive human leukemia cell line pulsed with LMP2 peptide.
  • CTL cells and leukemia cell lines are mixed at an effector: target (E: T) ratio of 0: 1, 1: 9, 1: 3, 1: 1, 3: 1, 9: 1 and then 37 ° C, 5% CO2.
  • E target
  • the culture was performed in the environment of Thereafter, the cytotoxic activity was evaluated based on the ratio of Annexin V positive cells. The results are shown in FIG. 3 and FIG. In addition, FIG. 5 shows the cytotoxic activity of both when fixed at an ET ratio of 3: 1.
  • the peptide-specific cytotoxic activity of regenerated CTL cells was about 1/100 that of the original CTL cells.
  • NK cell-like cytotoxic activity of regenerated CTL cells against K562 cells was examined. The results are shown in FIG. Regenerated CTL cells were confirmed to have high NK-like cytotoxic activity.
  • the LMP2-T-iPS cell clone obtained in Reference Example 1 was used. T cells were regenerated from T-iPS cells by the procedure outlined in FIG. 1) Differentiation from T-iPS cells to cell groups containing DP cells and DN cells The media used were as follows. * The penicillin / streptomycin solution consisted of 10000 U / mL penicillin and 10000 ⁇ g / mL streptomycin, with final concentrations of 100 U / mL and 100 ⁇ g / mL, respectively.
  • OP9 cells 5 ml of 0.1% gelatin / PBS solution was placed in a 10 cm culture dish and allowed to stand at room temperature for 30 minutes or more. Confluent OP9 cells were detached with a trypsin / EDTA solution, and seeded on a 10 cm culture dish coated with gelatin corresponding to 1/4. Medium A was added to medium A to 10 ml. 10 ml of medium A was newly added to the OP9 cell culture dish seeded after 4 days so that the total volume became 20 ml.
  • iPS cell colony was collected from a T-iPS cell- derived T-iPS cell culture dish (6 cm dish) using a dissociation solution, and finely crushed by pipetting. Centrifugation was performed at 4 ° C. and 1200 rpm for 5 minutes, and the pellet was suspended in 10 ml of medium A. A roughly crushed iPS cell cluster for one 6 cm dish was seeded on OP9 cells prepared in advance.
  • Day 1 (medium exchange) It was confirmed whether the iPS cell mass started to adhere and differentiate, and the medium was replaced with 20 ml of fresh medium A.
  • Day 5 (change medium half amount) Half of the medium was replaced with 10 ml of fresh medium A.
  • Day 9 (medium exchange) Half of the medium was replaced with 10 ml of fresh medium A.
  • Day 13 (Induced mesoderm cells were transferred from OP9 cells to OP9 / DLL1 cells) The medium was aspirated and the medium on the cell surface was washed away with HBSS (+ Mg + Ca). Thereafter, 6 ml of a 250 U collagenase IV / HBSS (+ Mg + Ca) solution was added, followed by incubation at 37 ° C. for 45 minutes.
  • the Collagenase solution was aspirated and washed away with 10 ml of PBS ( ⁇ ). Thereafter, 2 ml of 0.05% trypsin / EDTA solution was added, followed by incubation at 37 ° C. for 25 minutes. After culturing, 8 ml of medium A was added, and the cells were peeled off into a membrane. The cells were physically made fine by pipetting, and the adherent cells were separated. The culture was further continued at 37 ° C. for 45 minutes.
  • the supernatant containing floating cells was collected through a 70 ⁇ m mesh. After centrifuging at 4 ° C. and 1200 rpm for 5 minutes, the pellet was suspended in 10 ml of medium B. Among these, 1/50 was seeded on newly prepared OP9 / DLL1 cells, particularly for FACS analysis. When cells obtained from a plurality of dishes were pooled, the cells were redistributed so as to have the same number as the original number, and the cells were reseeded.
  • CD8SP cells were 95.3%.
  • CD8SP cells were analyzed by FACS, 87.5% of them were CD8 ⁇ type T cells.
  • the obtained cells are referred to as regenerated CD8 ⁇ SP cells.
  • the cell fraction containing only DN cells was concentrated to obtain a cell culture containing about 99% of DN cells.
  • the obtained DN cell enriched culture was stimulated with CD3 antibody and cultured for 6 days in the same manner as described above.
  • CD8SP cells positive for LMP2 tetramer and CD3 were obtained, but about 87% of the obtained CD8SP cells were CD8 ⁇ type T cells.
  • TYGPVFMSL SEQ ID NO: 1
  • LCL was collected from the culture bottle and irradiated with 50 Gy radiation. After centrifuging at 4 ° C. and 1200 rpm for 5 minutes, the pellet was suspended in medium A at a concentration of 5 ⁇ 10 6 / ml. Peptides were added to a final concentration of 100 nM and incubated for 2 hours at 37 ° C.
  • Antigen-specific cytotoxic activity of regenerated CD8 ⁇ T cells was tested in the same manner as in Reference Example 2. The results are shown in FIG. In addition, the cytotoxic activity was compared with the original CTL cell obtained in Reference Example with an E: T ratio of 3: 1. The results are shown in FIG. Regenerated CD8 ⁇ T cells (regenerated CD8 ⁇ CTL cells) showed peptide-specific cytotoxic activity comparable to the original CTL cells.
  • Regenerated CD8SP cells were induced from the WT1-T-iPS cells obtained in Reference Example 1 of WT1 peptide-specific cytotoxic activity of WT1-specific CD8SP cells by the same procedure as in Example 1. On day 40, a concentrated DP cell culture containing 84.7% DP cells was obtained. The obtained concentrated DP cell culture was stimulated with CD3Ab to obtain a cell culture containing regenerated CD8SP cells. 89.2% of the regenerated CD8SP cell cultures obtained were CD8 ⁇ type T cells. The WT1 antigen-specific cytotoxic activity of regenerated CD8SP cells was evaluated.
  • WT1 peptide (CYTWNQMNL: SEQ ID NO: 2) was added to C1R A * 24: 02 (human LCL cell line) at various concentrations and cultured for 2 hours. After collecting each C1R A * 24: 02 and mixing regenerated CD8SP cells and C1R A * 24: 02 in the ratio of E: T ratio 0: 1, 1: 3, 1: 1, 3: 1, 9: 1 The cells were cultured for 6 hours in an environment of 37 ° C. and 5% CO 2. Thereafter, the cytotoxic activity was evaluated by the ratio of Annexin V positive cells. The results are shown in FIG. It was shown that the cytotoxic activity was increased depending on the peptide concentration and the number of cells, confirming that the regenerated CD8SP cells have a cytotoxic activity specific to WT1 antigen.
  • the cytotoxic activity of the regenerated CD8SP cells was compared with that of the original WT1-specific CTL cells. The results are shown in FIG.
  • the regenerated CD8SP cells were found to have WT1 peptide-specific killer activity almost equivalent to the original CTL.
  • regenerated CD8SP cells are referred to as regenerated CTL cells.
  • TCR-specific cytotoxic activity of WT1-specific CD8SP cells (versus leukemia cell lines)
  • HL60 and THP1 which are human leukemia cell lines that express WT1 protein endogenously and are positive for HLA A * 24: 02.
  • an HLA-I inhibitory antibody (clone: W6 / 32) was added at 10 ng / ml and allowed to react for 1 hour.
  • Cytotoxic activity increased for all leukemia cell lines depending on the number of cells. On the other hand, cytotoxic activity was inhibited by the HLA-I inhibitory antibody. From these results, it was confirmed that regenerative CTL cells derived from WT1-T-iPS cells exhibited TCR-specific cytotoxic activity against endogenous WT1 antigen.
  • TCR-specific cytotoxic activity of WT1-specific CD8SP cells (vs. primary leukemia cells) Cytotoxic activity against leukemia cells derived from WT1 highly expressing HLA A * 24: 02 positive patients was evaluated in the same manner as in Example 3. In order to evaluate whether the cytotoxic activity is TCR-dependent, in the negative control well, leukemia cells were added with HLA-I inhibitory antibody (clone: W6 / 32) at 10 ng / ml and reacted for 1 hour. . Three types of leukemia cells that highly expressed WT1 were selected and tested.
  • Regenerated CTL cells and leukemia cells were mixed at a ratio of 0: 1, 1: 3, 1: 1, 3: 1, 9: 1 and cultured for 6 hours in an environment of 37 ° C. and 5% CO2. Thereafter, the cytotoxic activity was evaluated by the ratio of Annexin V positive cells. The results are shown in FIG.
  • CTL cells regenerated from WT1-T-iPS cells also have WT1 antigen-specific cytotoxic activity against patient-derived primary leukemia cells.
  • FIG. 19 shows an outline of an in vivo functional evaluation experiment using a mouse xenograft system .
  • An immunodeficient mouse, NOD.Cg- Prkdcscid Il2rgtm1Sug / Jic (NOG) purchased from the Central Institute for Experimental Animals
  • NOG NOD.Cg- Prkdcscid Il2rgtm1Sug / Jic
  • 8-10 week-old NOG mice were intraperitoneally administered WT1-expressing HLA A * 24: 02 positive, CD33 positive leukemia cell line HL60, 2 ⁇ 10 4 cells suspended in PBS (day 0) ).
  • PBS control
  • regenerated CD8SP cells regenerated CTL cells
  • mice administered with PBS tumor cells flowed into the peripheral blood, and no CD8T cells were observed in the blood.
  • mice administered with regenerated CTL cells the migration of CD8 T cells into the blood was confirmed, and the migration of tumor cells into the peripheral blood was not observed.
  • a significantly longer survival time was confirmed in mice administered with regenerated CTL cells compared to controls.
  • mice were dissected and examined for tissue damage. In mice administered with regenerated CTL cells, no tissue damage was observed.
  • IPS cells into which a WT1 peptide-specific TCR gene was introduced were prepared by the method described in WO 2016/010154.
  • the WT1 peptide-specific TCR gene used was cloned from the regenerated WT1-specific CTL shown in Example 2.
  • the TCR to be introduced is referred to as WT1-TCR.
  • TCR-iPS cells iPS cells were transformed into complete single cells using Tryp LE Select (Life Technologies). After centrifugation, the pellet was suspended in the lentivirus supernatant, centrifuged at 3000 rpm for 1 hour at 30 ° C., and infected with iPS cells to introduce WT1-TCR into iPS cells. After infection, the cells were seeded and cultured on feeder cells (MFF), and after 14 days, iPS cells into which WT1-TCR had been introduced were selected under the fluorescence microscope by the expression of Venus protein. Each clone was established individually. One clone was selected for the following test. Hereinafter, iPS cells obtained by introducing TCR are referred to as “TCR-iPS cells”.
  • the cell culture containing DP cells and DN cells was obtained from the obtained TCR-iPS cells in the same procedure as in Example 1 (FIG. 7) (FIG. 22).
  • the obtained cell culture contained 79.1% DP cells, 12.0% DN cells, and 6.60% CD8SP cells.
  • DP cells were concentrated using MACS beads, and induced into CD8SP cells by the same method as in Example, except that the following (medium) D ') was used instead of the medium (medium D) from the concentrated DP cell culture.
  • the concentrated DP cell culture was suspended in medium D ′ so that the final concentration was 5 ⁇ 10 5 cells / ml.
  • the culture medium of the OP9 / DLL1 cell culture dish prepared in advance was aspirated, and the cell suspension was seeded at 1 ml / well and cultured. After 6 days, the cells were collected and confirmed by FACS. The results are shown in FIG.
  • CD8SP cells were 87.86%.
  • CD8SP cells were analyzed by FACS, 79.7% of the obtained CD8SP cells were CD8 ⁇ type T cells.
  • CD8SP cells were 87.86%.
  • CD8SP cells were analyzed by FACS, 79.7% of the obtained CD8SP cells were CD8 ⁇ type T cells.
  • the cytotoxic activity of CTL regenerated from TCR-iPS cells and CTL regenerated from T-iPS cells shown in Example 2 were compared. Both express the same TCR.
  • WT1 peptide CYTWNQMNL: SEQ ID NO: 2
  • C1R A * 24: 02 human LCL cell line
  • Each C1R A * 24: 02 was recovered, and the regenerated CD8SP cells and C1R A * 24: 02 were mixed at a ratio of E: T ratio of 3: 1 and then cultured for 6 hours in an environment of 37 ° C and 5% CO2. . Thereafter, the cytotoxic activity was evaluated based on the ratio of Annexin V positive cells. The results are shown in FIG. CTL regenerated from TCR-iPS cells and CTL regenerated from T-iPS cells showed equivalent antigen-specific cytotoxic activity.

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Abstract

（１）多能性幹細胞を分化誘導して、ＣＤ４－ＣＤ８－Ｔ細胞並びにＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む細胞培養物を得る工程、（２）（１）で得られた細胞培養物よりＣＤ４－ＣＤ８－Ｔ細胞を除く工程、および　（３）（２）で得られた細胞培養物中のＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞へと分化させる工程を含む、多能性幹細胞から抗原特異的な細胞傷害活性を有するＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞Ｔ細胞を誘導する方法を提供する。

Description

ＣＤ８陽性Ｔ細胞を誘導する方法
　多能性幹細胞からＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導する方法に関する。
　個々のＴ細胞は異なる特異性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現している。感染症が生じた時、特定の特異性の細胞が増殖し、細胞集団（クローン）を形成して病原体の対処にあたる。これが獲得免疫系の基本型である。特定の特異性のＴ細胞を人為的に増殖（クローニングという）できれば治療に用いることができることが期待される。実際に、特定の抗原に対する特異性を示すＴ細胞を患者から採取し、増やして患者に戻す（自家移植）方法は免疫細胞療法として臨床応用されている。ただしこのような試みの殆どはクローニングというほど純化されていないし、また、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで何代も継代培養するうちに、抗原特異的細胞傷害活性が低下するという問題もあった。
　Ｔ細胞を不死化することにより無限に増やす方法も提案されている。１つの細胞を不死化して増殖させ、クローニングする。細胞の不死化はがん細胞との融合による方法と、ＴＣＲ刺激とサイトカインの刺激による長期間培養などの方法が挙げられる。しかしながら、こうして不死化したＴ細胞は、いわばがん細胞であり、患者本人に戻す自家移植は危険である。また、クローニング工程において機能が低下するという問題もあった。
　特定の抗原特異的ＴＣＲ遺伝子を有する多能性幹細胞、特にｉＰＳ細胞を製造する方法、並びに当該ｉＰＳ細胞からＴＣＲを維持したＴ細胞を再生させる方法が報告されている(特許文献１～７および非特許文献１～６）。これらの方法によって、特定のＴＣＲ遺伝子を有するＴ細胞を大量に得ることが可能となり、免疫細胞療法への応用が期待されている。
　しかしながら例えばヒトの細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ細胞）からｉＰＳ細胞を誘導し、得られたｉＰＳ細胞からＣＴＬ細胞を再生させた場合に、再生ＣＴＬの抗原特異的細胞傷害活性として元のＣＴＬ細胞と同等のものが得られたという報告は無い。
　生体内で生成されるＣＴＬ細胞はＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞であり、ＣＤ８はＣＤ８αβヘテロダイマー型であることが知られている。ＣＤ８αα型Ｔ細胞は自然免疫型と呼ばれるタイプのＴ細胞であり、ＭＨＣクラスＩ分子と十分な結合性を有しておらず、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のコレセプターとしての作用は弱い。ＣＤ８αα型Ｔ細胞はリンパ系組織においてはほとんど含まれておらず、粘膜組織において多く見られる。
ＷＯ２０１１／０９６４８２ ＷＯ２０１３／１７６１９７ ＷＯ２０１５／０９９１３４ ＷＯ２０１６／０１０１４８ ＷＯ２０１６／０１０１５３ ＷＯ２０１１／０９６４８２ ＷＯ２０１１／０９６４８２
Vizcardo, R., Masuda, K., Yamada, D., Ikawa, T., Shimizu, K., Fujii, S., Koseki, H., and Kawamoto, H. (2013). Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells. Cell Stem Cell 12, 31-36. Nishimura, T., Kaneko, S., Kawana-Tachikawa, A., Tajima, Y., Goto, H., Zhu, D., Nakayama-Hosoya, K., Iriguchi, S., Uemura, Y., Shimizu, T., et al. (2013). Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell 12, 114-126. Wakao, H., Yoshikiyo, K., Koshimizu, U., Furukawa, T., Enomoto, K., Matsunaga, T., Tanaka, T., Yasutomi, Y., Yamada, T., Minakami, H., et al. (2013). Expansion of functional human mucosal-associated invariant T cells via reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell 12, 546-558. Themeli, M., Kloss, C.C., Ciriello, G., Fedorov, V.D., Perna, F., Gonen, M., and Sadelain, M. (2013). Generation of tumor-targeted human T lymphocytes from induced pluripotent stem cells for cancer therapy. Nat Biotechnol 31, 928-933. Ando, M., Nishimura, T., Yamazaki, S., Yamaguchi, T., Kawana-Tachikawa, A., Hayama, T., Nakauchi, Y., Ando, J., Ota, Y., Takahashi, S., et al. (2015). A Safeguard System for Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Rejuvenated T Cell Therapy. Stem Cell Reports 5, 597-608. Kitayama, S., Zhang, R., Liu, T.Y., Ueda, N., Iriguchi, S., Yasui, Y., Kawai, Y., Tatsumi, M., Hirai, N., Mizoro, Y., et al. (2016). Cellular Adjuvant Properties, Direct Cytotoxicity of Re-differentiated Vα24 Invariant NKT-like Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports 6, 213-227.ここに挙げる文献はいずれも引用により本願の一部を構成する。
　一の態様において、本願は多能性幹細胞からＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞を製造する方法を提供することを目的とする。より詳細には、本願は多能性幹細胞から所望の抗原特異的細胞傷害活性を有するＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞を分化誘導する方法を提供することを目的とする。なお、以下単に「ＣＤ８Ｔ細胞」という場合はＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞を意味するものとする。他の態様において、本願は同一抗原特異性を有し、高い抗原特異性を有するＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞集団を提供することを目的とする。
　本願の一の態様においては、
　（１）多能性幹細胞を分化誘導して、ＣＤ４－ＣＤ８－Ｔ細胞並びにＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む細胞培養物を得る工程、
　（２）（１）で得られた細胞培養物よりＣＤ４－ＣＤ８－Ｔ細胞を除く工程、および
　（３）（２）で得られた細胞培養物中のＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞へと分化させる工程
を含む、ＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導する方法を提供する。
　本願の他の態様においては、
　（１）多能性幹細胞を分化誘導して、ＣＤ４－ＣＤ８－Ｔ細胞並びにＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む細胞培養物を得る工程、
　（２）ＣＤ４－ＣＤ８－Ｔ細胞の細胞傷害活性を抑制する物質の共存下で、（１）で得られた細胞培養物中のＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞へと分化させる工程
を含む、ＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導する方法を提供する。
　本願の方法において、多能性幹細胞としては所望の抗原に対して特異的な受容体を有するものが例示され、例えば再構成されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）や、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有しているものが挙げられる。再構成されたＴＣＲを有している多能性幹細胞から本願の方法により誘導されたＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞は、元のＴＣＲの抗原特異性を維持した、抗原特異的細胞傷害活性を示す。再構成されたＣＡＲを有している多能性幹細胞も同様である。
　多能性幹細胞としてはまた、ＴＣＲやＣＡＲを有していない多能性幹細胞が例示される。ＴＣＲやＣＡＲを有していない多能性幹細胞を用いる場合には、得られたＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞へ公知の方法にて所望のＴＣＲを誘導することによって所望の抗原特異性を有する抗原特異的細胞傷害活性を示す細胞を得ることができる。
　本願の方法によって、同一の抗原特異性を有するＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞、特に同一のTCR遺伝を有するＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞が細胞培養物を構成する細胞の８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上含まれる細胞培養物を得ることができる。本願はまた、かかる細胞培養物を提供する。
　別の態様において、本願の方法によって得られる抗原特異的ＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞を患者へ投与することを含む、免疫細胞療法を提供する。
　本願の方法により、所望の抗原特異性を有し、かつ強い抗原特異的細胞傷害活性を有するＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞培養物を得ることができる。
LMP2-T-iPS細胞を従来のT細胞誘導法にて35日間分化誘導した場合の、FACS解析結果。 図１の細胞培養物を、CD3抗体にて刺激して6日間培養して得られた細胞培養物のFACS解析結果。 LMP2-T-iPS細胞を作成する際に使用した元のCTL細胞の、ペプチド特異的細胞傷害活性を示すグラフ。 従来法でLMP2-T-iPS細胞から誘導した再生CD8SP細胞(再生CTL細胞）の、ペプチド特異的細胞傷害活性を示すグラフ。 従来法でLMP2-T-iPS細胞から誘導した再生CD8SP細胞(再生CTL細胞）と、元のCTL細胞の、ペプチド特異的細胞傷害活性を比較したグラフ。 従来法でLMP2-T-iPS細胞から誘導した再生CD8SP細胞(再生CTL細胞）の、NK細胞様細胞傷害活性を示すグラフ。 実施例１の多能性幹細胞からT細胞を誘導する手順の概略。 実施例１のT細胞分化誘導13日目の細胞のFACS解析結果。 実施例１のT細胞への分化誘導40日目の細胞培養物の、濃縮前、DP細胞濃縮後のFACS解析結果。 実施例１の40日目にDP細胞を濃縮した細胞培養物をCD３抗体にて刺激して誘導したCD8SP細胞のFACS解析結果。LMP2抗原特異的であり、CD8αβ型T細胞である。 図１０のCD8SP細胞をさらにLMP2抗原でパルスしたAPCにて刺激して増殖させた細胞のFACS解析結果。 図１０のCD8SP細胞をさらにLMP2抗原でパルスしたAPCにて刺激して増殖させた場合の細胞の増殖曲線。 図１１の再生CD8SP細胞（再生CD8αβCTL細胞）の、ペプチド特異的細胞傷害活性を示すグラフ(左）、およびLMP2-T-iPS細胞を作成する際に使用した元のCTL細胞の、ペプチド特異的細胞傷害活性と比較したグラフ(右)。 iPS細胞からT細胞分化誘導40日目の細胞をDP細胞とDN細胞に分け、DP細胞とDN細胞の混合比が1:0、3:1、1:1、1:3となるよう混合し、CD3抗体の存在下で5時間培養した場合の、DP細胞中の生存細胞の％（上）および培養開始時のDP細胞に対する生存細胞の割合（下）を示すグラフ。 WT1-T-iPS細胞から図７に示す工程にて誘導したCD8SP細胞のWT1ペプチド特異的細胞傷害活性を示すグラフ。 WT1-T-iPS細胞から図７に示す工程にて誘導したCD8SP細胞のWT1ペプチド特異的細胞傷害活性と、WT1-T-iPS細胞を作成する際に使用した元のCTL細胞の同ペプチド特異的細胞傷害活性を比較するグラフ。 WT1-T-iPS細胞から図７に示す工程にて誘導したCD8SP細胞の、内因性WT1タンパク質を有するヒト白血病細胞株HL60およびTHP1に対する細胞傷害活性。HLA-I阻害抗体で標的細胞のHLAをブロックした場合、細胞傷害活性がほぼ消失したことから、CD8SP細胞の細胞傷害活性はTCR依存性であることが確認された。 WT1-T-iPS細胞から図７に示す工程にて誘導したCD8SP細胞の、内因性WT1タンパク質を有する患者由来代白血病細胞に対する細胞傷害活性。WT1を高発現する3種類の白血病細胞に対する細胞傷害活性はいずれも、HLA-I阻害抗体によりブロックされた。 実施例５のヒト急性骨髄性白血病細胞株を播種した免疫不全マウスに対する、WT1-T-iPS細胞から図７に示す工程にて誘導したWT1特異的CD8SP細胞（再生CTL細胞）の投与スケジュール。 実施例５のヒト急性骨髄性白血病細胞株を播種した免疫不全マウスに対してPBS/再生CTL細胞を投与した後の末梢血のFACS解析結果。 ヒト急性骨髄性白血病細胞株を播種した免疫不全マウスに対してPBS/再生CTL細胞を投与した後の、生存曲線。再生CTL細胞はマウスの生存期間を延長した。 実施例６でTCR-iPS細胞からT細胞への分化誘導40日目の細胞培養物。 実施例６の40日目にDP細胞を濃縮した細胞培養物をCD３抗体にて刺激して誘導したCD8SP細胞のFACS解析結果。WT1抗原特異的であり、CD8αβ型T細胞である。 実施例６で得たTCR-iPS細胞から再生したCTLと実施例２で得たT-iPS細胞から再生したCTLの細胞傷害活性を比較した図。いずれも同等のCTL活性を示した。
　本明細書ならびに請求の範囲において「多能性幹細胞」とは、生体に存在する多くの細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、自己増殖能を併せもつ幹細胞である。多能性幹細胞には、例えば胚性幹（ＥＳ）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ｎｔＥＳ）細胞、胚性生殖細胞（「ＥＧ細胞」）、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Ｍｕｓｅ細胞）などが例示される。多能性幹細胞は、好ましくは哺乳動物の多能性幹細胞であり、より好ましくはヒト多能性幹細胞、例えばＥＳ細胞やｉＰＳ細胞である。特定のＨＬＡを有するヒト由来の細胞を用いて、免疫療法に用いられる細胞のバンクを製造することを考慮すると、ｉＰＳ細胞を用いるのが好ましい。
　本願明細書および請求の範囲において、「Ｔ細胞」とは表面にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と称される抗原受容体を発現している細胞を意味する。
　本願明細書並びに請求の範囲において、「ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞」「ダブルポジティブＴ細胞」および「ＤＰ細胞」はいずれもＣＤ４陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞を意味する。「ＣＤ４－ＣＤ８－Ｔ細胞」、「ダブルネガティブＴ細胞」および「ＤＮ細胞」はいずれもＣＤ４陰性ＣＤ８陰性Ｔ細胞を意味する。「ＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞」、「ＣＤ８Ｔ細胞」および「ＣＤ８ＳＰ細胞」はいずれも、ＣＤ４陰性ＣＤ８陽性Ｔ細胞を意味する。特に断りの無い限り、「ＣＤ８Ｔ細胞」とする場合にはＣＤ８ααホモダイマーおよびＣＤ８αβヘテロダイマーの両方を包含する。「ＴＣＲ」はＴ細胞受容体を意味する。「ＣＴＬ細胞」は細胞傷害性Ｔ細胞を意味する。
　所望の抗原特異性を有する再構成されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有しているＴ細胞は、所望の抗原に特異的な再構成されたＴＣＲを有するＴ細胞からｉＰＳ細胞を誘導することによって得ることができる。Ｔ細胞からｉＰＳ細胞を誘導しても再構成済のＴＣＲが維持されることは、例えばＷＯ２０１１／０９６４８２およびVizcardo et al., Cell Stem Cell 12, 31-36 2013（本文献は引用により本願の一部を構成する。）等に報告されている。ｉＰＳ細胞へと誘導されるＴ細胞としては、好ましくはＣＤ３を発現しており、且つＣＤ４及びＣＤ８からなる群から選択される少なくとも一の分子が発現しているＴ細胞である。このようなヒトＴ細胞としては、例えば、ＣＤ４陽性細胞であるヘルパー／制御性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性細胞である細胞傷害性Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋細胞）、セントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２Ｌ＋細胞）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２Ｌ－細胞）、及びターミナルエフェクターＴ細胞（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ－細胞）が挙げられる。細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）細胞が好適に用いられる。
　ヒトＴ細胞は、ヒトの組織から公知の手法により単離することができる。ヒトの組織としては、前記Ｔ細胞を含む組織であれば特に制限はないが、例えば、末梢血、リンパ節、骨髄、胸腺、脾臓、臍帯血、病変部組織が挙げられる。これらの中では、ヒトに対する侵襲性が低く、調製が容易であるという観点から、末梢血、臍帯血が好ましい。ヒトＴ細胞を単離するための公知の手法としては、例えば、ＣＤ３等の細胞表面マーカーに対する抗体と、セルソーターとを用いたフローサイトメトリーが挙げられる。また、サイトカインの分泌や機能性分子の発現を指標に、所望のＴ細胞を単離することも出来る。かかる場合、例えば、Ｔ細胞は、Ｔｈ１タイプかＴｈ２タイプかで分泌されるサイトカインが異なるので、そのようなサイトカインを指標に選別して、所望のＴｈタイプを有するＴ細胞を単離することができる。また、グランザイムやパーフォリンなどの分泌又は産生を指標として、細胞傷害性（キラー）Ｔ細胞を単離することが出来る。
　癌や感染症に関連する抗原に対して特異的な細胞傷害性Ｔ細胞は、当該抗原を発現する癌あるいは対象とする感染症に罹患している患者またはかかる癌や感染症の既往のある対象から単離し、増殖させても、健常人から得られた細胞から誘導してもよい。
　特定の抗原特異的ヒトＴ細胞を単離する場合、当該抗原特異的Ｔ細胞を含むヒト培養細胞またはヒトの組織より、目的の抗原を固定化したアフィニティカラム等を用いて精製する方法を採用することができる。また、所望の抗原を結合させたＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）を４量体化させたもの（いわゆる「ＭＨＣテトラマー」）を用いて、ヒトの組織より特定の抗原特異性を有するＴ細胞を精製する方法も採用することができる。
　ある抗原に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞は、ヒトより常法により取得したリンパ球、例えば末梢血単核細胞を、当該抗原またはそのエピトープペプチドにて刺激して得ることができる。多くの疾患、例えば癌、自己免疫疾患、感染症等に関連する抗原タンパク質あるいはそのエピトープペプチドが知られており、目的に応じて適宜選択すれば良い。リンパ球を抗原にて刺激して抗原特異的ＣＴＬ細胞を誘導する方法は良く知られている。
　所望の抗原特異性を有するＴ細胞にはまた、遺伝子操作によって得られるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有するＣＡＲ－Ｔ細胞を含む。ＣＡＲ－Ｔ細胞は文献記載の方法によって得ることができるThemeli, M. et al., Nat Biotechnol 31, 928-933 (2013) および Themeli, M. et al., Cell Stem Cell 16, 357-366 (2015)。（本文献は引用により本願の一部を構成する。）
　上記のごとく得られる所望の抗原特異性を有するＴ細胞からiPS細胞を誘導する。Ｔ細胞からiPS細胞を得るには、例えばVizcardo et al., Cell Stem Cell 12, 31-36 2013に記載の方法を用いてもよい。例えば治療対象とする疾患に対する免疫を獲得した対象から所望の抗原特異的Ｔ細胞を得、この細胞へヤマナカ因子を導入してT-iPＳ細胞を得ることができる(Takahashi and Yamanaka, Cell 126, 663-673 (2006), Takahashi et al., Cell 131, 861-872(2007)および Grskovic et al., Nat. Rev. Drug Dscov. 10,915-929(2011))。（ここに挙げる文献は引用により本願の一部を構成する。）
　ｉＰＳ細胞は、特定の初期化因子を、体細胞に作用させることによって作製することができる、ＥＳ細胞とほぼ同等の特性を有する体細胞由来の人工の幹細胞である(K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；国際公開WO 2007/069666）。初期化因子は、ＥＳ細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはｎｏｎ－ｃｏｒｄｉｎｇ　ＲＮＡまたはＥＳ細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-coding RNA、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５－２、Ｔｃｌ１、ｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎ、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３またはＧｌｉｓ１等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO 2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotechnol., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9.に記載の組み合わせが例示される。（ここに挙げる文献は引用により本願の一部を構成する。）
　初期化因子は、その形態に応じた公知の方法にて体細胞へ接触、または体細胞内へ導入すればよい。
　タンパク質の形態の場合、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、ＨＩＶ由来のＴＡＴおよびポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。
　ＤＮＡの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007）、アデノウイルスベクター（Science, 322, 945-949, 2008）、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（WO 2010/008054）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ、ＰＡＣ）などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる（Science, 322:949-953, 2008）。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ＦＬＡＧなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞へ一旦導入して作用させた後、初期化因子をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にＬｏｘＰ配列を有してもよい。（ここに挙げる文献は引用により本願の一部を構成する。）
　初期化因子がＲＮＡの形態の場合、例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入しても良い。分解を抑制するため、５－メチルシチジンおよびpseudouridine(TriLink Biotechnologies)を取り込ませたＲＮＡを初期化因子として用いても良い（Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7:618-630）。（ここに挙げる文献は引用により本願の一部を構成する。）
　ｉＰＳ細胞誘導のための培養液は、例えば、１０～１５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２又はＤＭＥ培養液（これらの培養液にはさらに、ＬＩＦ、penicillin/streptomycin、puromycin、Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸類、β－メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）または市販の培養液［例えば、マウスＥＳ細胞培養用培養液（ＴＸ－ＷＥＳ培養液、トロンボＸ社）、霊長類ＥＳ細胞培養用培養液（霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培養液、リプロセル社）、無血清培地（mTeSR, STEMCELL Technologies社）］などが例示される。
　ｉＰＳ細胞誘導の例としては、たとえば、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ又はＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液上で体細胞と初期化因子とを接触させ約４～７日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞（たとえば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上にまきなおし、体細胞と初期化因子の接触から約１０日後からｂＦＧＦ含有霊長類ＥＳ細胞培養用培養液で培養することによって、該接触から約３０～約４５日又はそれ以上ののちにＥＳ様コロニーを生じさせることができる。
　あるいは、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、フィーダー細胞（たとえば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上で１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液（これにはさらに、ＬＩＦ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸類、β－メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で体細胞と初期化因子を接触させて培養し、約２５～約３０日又はそれ以上ののちにＥＳ様コロニーを生じさせることができる。望ましくは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4:e8067またはWO2010/137746）、もしくは細胞外基質（例えば、Laminin-5（WO2009/123349）、Laminin-10（US2008/0213885）、その断片（WO2011/043405）およびマトリゲル（ＢＤ社））を用いる方法が例示される。（ここに挙げる文献は引用により本願の一部を構成する。）
　この他にも、血清を含有しない培地を用いてｉＰＳ細胞を樹立する方法も例示される(Sun N, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:15720-15725)。さらに、樹立効率を上げるため、低酸素条件（０．１％以上、１５％以下の酸素濃度）によりｉＰＳ細胞を樹立しても良い（Yoshida Y, et al.(2009), Cell Stem Cell. 5:237-241またはWO2010/013845)。（ここに挙げる文献は引用により本願の一部を構成する。）
　ｉＰＳ細胞の樹立効率を高めるための成分として、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤［例えば、バルプロ酸（ＶＰＡ）、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、ＭＣ１２９３、Ｍ３４４等の低分子阻害剤、ＨＤＡＣに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ（例、HDAC1 siRNA Smartpool(TM)（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、HuSH29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、ＭＥＫ阻害剤（例えば、ＰＤ１８４３５２、ＰＤ９８０５９、Ｕ０１２６、ＳＬ３２７およびＰＤ０３２５９０１）、Glycogen synthase kinase-3阻害剤（例えば、ＢｉｏおよびＣＨＩＲ９９０２１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、５－ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、ＢＩＸ－０１２９４等の低分子阻害剤、Ｓｕｖ３９ｈｌ、Ｓｕｖ３９ｈ２、ＳｅｔＤＢｌおよびＧ９ａに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ等の核酸性発現阻害剤など）、L-channel calcium agonist（例えばＢａｙｋ８６４４）、酪酸、ＴＧＦβ阻害剤またはＡＬＫ５阻害剤（例えば、ＬＹ３６４９４７、ＳＢ４３１５４２、６１６４５３およびＡ－８３－０１）、ｐ５３阻害剤（例えばｐ５３に対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ）、ＡＲＩＤ３Ａ阻害剤（例えば、ＡＲＩＤ３Ａに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ）、ｍｉＲ－２９１－３ｐ、ｍｉＲ－２９４、ｍｉＲ－２９５およびｍｉｒ－３０２などのｍｉＲＮＡ、Wnt Signaling（例えばsoluble Wnt3a）、神経ペプチドＹ、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンＥ２およびプロスタグランジンＪ２）、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ、ＵＴＦ１、ＩＲＸ６、ＧＬＩＳｌ、ＰＩＴＸ２、ＤＭＲＴＢｌ等が知られている。ｉＰＳ細胞の樹立の際にはかかる樹立効率の改善目的にて用いられる成分を添加した培養液を用いてもよい。
　上記培養の間には、培養開始２日目以降から毎日１回新鮮な培養液と培養液交換を行う。核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ１００ｃｍ２あたり約５×１０３～約５×１０６細胞の範囲である。
　ｉＰＳ細胞は、形成したコロニーの形状により選択することが可能である。一方、体細胞が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、Oct3/4, Nanog）と連動して発現する薬剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として導入し、対応する薬剤を含む培養液（選択培養液）で培養を行うことにより樹立したｉＰＳ細胞を選択することができる。また、マーカー遺伝子として蛍光タンパク質遺伝子を導入し、蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、ｉＰＳ細胞を選択することができる。誘導されたｉＰＳ細胞（T-iPS細胞）は由来するＴ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子を維持する。
　所望の抗原特異的Ｔ細胞受容体遺伝子を有する多能性幹細胞を得る他の方法としては、所望の抗原特異的ＴＣＲの遺伝子を多能性幹細胞へ導入する方法が挙げられる。
　種々のがんに対する抗原特異的ＴＣＲ遺伝子が報告されている。ＴＣＲ遺伝子はまた、所望の抗原特異的Ｔ細胞をがん患者から単離し、あるいは健常人より誘導し、当該Ｔ細胞からＴＣＲの遺伝子を単離してもよい。抗原特異的ＴＣＲ遺伝子としては、特定の抗原特異性を有するキメラ抗原受容体遺伝子もまた含まれる。
　所望の抗原特異的ＴＣＲ遺伝子を多能性幹細胞、例えばｉＰＳ細胞へ導入する。ＴＣＲ遺伝子のｉＰＳ細胞への導入は常套の方法で行えばよく、例えばMorgan R.A. et al, Science, 314:126. 2006に記載の方法に準じて行えば良い。具体的にはＴＣＲ遺伝子を適当なベクターに載せてｉＰＳ細胞へ導入すればよい。例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ、ＰＡＣ）などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる。ベクターには、ＴＣＲが発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ＦＬＡＧなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。
　本願の方法において、多能性幹細胞はＴ細胞以外の体細胞から誘導されたｉＰＳ細胞や、ＥＳ細胞であってもよい。本明細書ならびに請求の範囲で使用する「体細胞」なる用語は、精子、精母細胞、卵子、卵母細胞、ES細胞などの生殖系列細胞または分化多能性細胞を除くあらゆる動物細胞（好ましくは、ヒトを含む哺乳動物細胞）をいう。体細胞には、胎児(仔)の体細胞、新生児(仔)の体細胞、および成熟した健全個体の体細胞もしくは疾患を有する個体の体細胞のいずれも包含される。また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は分化した細胞、例えば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、組織前駆細胞、リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等が例示される。体細胞からｉＰＳ細胞を誘導する方法は、上記のＴ細胞からｉＰＳ細胞を誘導する方法と同様の方法を用いることができる。
　多能性幹細胞を、ＤＰ細胞およびＤＮ細胞を含むＴ細胞集団へと分化誘導する。多能性幹細胞からＴ細胞への分化誘導方法としては、例えばTimmermans et al., Journal of Immunology, 2009, 182: 6879-6888に記載の方法が挙げられる（本文献は引用により本願の一部を構成する）。
　一の態様において、多能性幹細胞を、ＯＰ９ストローマ細胞、例えばマウスのＯＰ９ストローマ細胞培養物と共培養して血球前駆細胞を得る。得られた血球前駆細胞を次いでＯＰ９／ＤＬＬ１細胞と共培養する。ＯＰ９／ＤＬＬ１共培養の際には培地にＩＬ－７、ＦｌＴ－３ＬおよびＳＣＦ（Stem Cell Factor）を添加する。かかる方法にて多能性幹細胞を分化誘導した場合、ＤＮ細胞およびＤＰ細胞を含む細胞培養物が得られる。
　本発明者らはＤＮ細胞とＤＰ細胞の混合物をＣＤ３抗体により刺激した場合、ＤＮ細胞がＤＰ細胞を殺傷することを見出した。よって続くステップにおいて細胞培養物よりＤＮ細胞を取り除く。ＤＮ細胞を除いた細胞培養物はＤＮ細胞を実質的に含まないものが好ましく、例えばＤＮ細胞の含有量を５％以下、好ましくは３％以下、より好ましくは１％未満とすることが好ましい。以下、ＤＰ細胞とＤＮ細胞を含む細胞培養物よりＤＮ細胞を除去する工程を「ＤＰ細胞の濃縮」とし、ＤＮ細胞を除去した細胞培養物を「濃縮したＤＰ細胞培養物」として説明する。細胞培養物からＤＮ細胞以外の細胞を同時に、あるいは個別に除去する場合も同様に「ＤＰ細胞の濃縮」および「濃縮したＤＰ細胞培養物」という。
　多能性細胞のＴ細胞への分化誘導の過程において、ＤＮ細胞およびＤＰ細胞を含む細胞培養物はＣＤ８ＳＰ細胞が含まれる場合がある。かかるＣＤ８ＳＰＣ細胞がＣＤ８ααホモダイマー型Ｔ細胞である可能性があり、ＤＰ細胞の濃縮、即ちＤＮ細胞の除去に当たってはＣＤ８ＳＰ細胞、特にＣＤ８ααホモダイマー型Ｔ細胞も同時に取り除くことが好ましい。細胞培養物からＤＮ細胞、ＣＤ８ＳＰ細胞を除く方法は限定的ではない。一の態様においてはＣＤ４抗体を結合させた担体、例えばＭＡＣＳビーズを用いてＣＤ４陽性細胞を回収することによってＣＤ８ＳＰ細胞並びにＤＮ細胞を除去することができる。さらにＣＤ８βを結合させた担体、例えばＭＡＣＳビーズを用いてＣＤ８ＳＰαβヘテロダイマー型Ｔ細胞を回収することによってＣＤ８ααホモダイマー型Ｔ細胞を除去することができる。他の態様としては、セルソーターにてＤＮ細胞画分を除去することによってＤＮ細胞を実質的に含まない細胞培養物を、あるいはセルソーターにてＤＰ細胞画分を集めることによって、ＤＮ細胞、ＣＤ８ＳＰ細胞を実質的に含まない細胞培養物を得ることができる。さらに、セルソーターにてＣＤ８ＳＰαβヘテロ接合型の細胞画分を集めることによってＣＤ８ＳＰααホモ接合型の細胞を実質的に含まない細胞培養物を集めることができる。
　濃縮したＤＰ細胞培養物を、次いでＣＤ８ＳＰ細胞へと分化誘導する。ＤＰ細胞からＣＤ８ＳＰ細胞への誘導は、Ｔ細胞受容体に刺激を加えた時に生じる活性化経路の何れかを直接活性化することによって行うことができる。例えば、PMAとIonomysinを添加することによりTCR刺激に類似した形でT細胞を活性化することができる。TCRを介した刺激としては、例えば、ＤＰ細胞をＣＤ３抗体により刺激しながら培養することが例示される。ＣＤ３抗体による刺激に加え、ＩＬ－７およびＩＬ－２を培養液に添加するのが好ましい。ＣＤ３抗体を含む培養液による培養期間は３～１０日間、例えば４～８日、例えば約６日間とすればよい。
　ＤＰ細胞培養物が、所望の抗原に対する特異的受容体、例えばＴＣＲを有する多能性幹細胞から誘導されたＤＰ細胞培養物である場合には、当該抗原による刺激あるいは、当該抗原を提示する抗原提示細胞による刺激を加えることによってもＤＰ細胞からＣＤ８ＳＰ細胞へ分化誘導することが可能である。同様に、CARを発現する場合は、CARが認識する抗原を可溶性分子として添加する、ビーズや培養器にコートして共培養する、別な細胞に発現させて共培養するなどの方法で刺激を入れることができる。
　濃縮したＤＰ細胞培養物をＴ細胞受容体に刺激を加えた時に生じる活性化経路の何れかを直接活性化することによって分化誘導して得られるＣＤ８ＳＰ細胞はそのほとんどがＣＤ８αβヘテロダイマーを発現するＣＤ８αβ型のＴ細胞である。以下に示す参考例２において、ＤＰ細胞の濃縮を行わずにＤＮ細胞やＣＤ８ＳＰ細胞を含む細胞培養物からＣＤ３抗体刺激によるＣＤ８ＳＰ細胞を誘導した場合、得られた細胞のほとんどがＣＤ８ααホモダイマーであった。ＣＤ８ααホモダイマー型Ｔ細胞は抗原特異的細胞傷害活性が低いが、比較的高いＮＫ様細胞傷害活性を示す。
　本願の別の態様として、ＤＮ細胞の除去を行わずにＤＮ細胞の細胞傷害活性を抑制する物質と共に以下のＣＤ３抗体を含む培養液を含む培養を行ってもよい。ＤＮ細胞の細胞傷害活性を抑制する物質としては、パーフォリン阻害剤、グランザイム阻害剤、Fas経路阻害剤、カスパーゼ阻害剤、NK活性化レセプター阻害抗体等が例示される。
　本願の方法により、再構成されたＴＣＲ遺伝子あるいはＣＡＲ遺伝子を有する多能性幹細胞から分化誘導されるＣＤ８ＳＰ細胞は、強い抗原特異的細胞傷害活性を示す。例えばヒトＣＴＬ細胞からＴ-ｉＰＳ細胞を誘導し、Ｔ-ｉＰＳ細胞からＤＰ細胞の濃縮工程を経てＣＤ８ＳＰ細胞(再生ＣＴＬ細胞)を誘導した場合、最終的に得られる再生ＣＴＬ細胞として元のＣＴＬ細胞と遜色無い抗原特異的ＣＴＬ活性を示す細胞を得ることが可能である。なお、再構成されたＴＣＲ遺伝子あるいはCAR遺伝子を有する多能性幹細胞を用いる場合、Ｔ細胞を誘導する前に、ＴＣＲ遺伝子等の更なる再構成が起こらないようにするために、ＷＯ２０１６／０１０１４８に記載されている技術等を用いて、多能幹細胞の段階でＲａｇ１あるいはＲａｇ２遺伝子をゲノム編集技術等により破壊し、その後にＴ細胞への分化誘導を開始してもよい。ＣＡＲ遺伝子を有する多能性幹細胞の作成法ならびにその多能性幹細胞からCAR発現T細胞の分化誘導については分献記載の方法によって得ることができる[Themeli, M. et al., Nat Biotechnol 31, 928-933 (2013) および Themeli, M. et al., Cell Stem Cell 16, 357-366 (2015)]。（ここに挙げる文献は引用により本願の一部を構成する。）
　本願のさらに別の態様においては、多能性幹細胞から分化誘導されるＣＤ８ＳＰ細胞培養物に所望の抗原特異性を有するTCR遺伝子を発現させることによって、所望の抗原に特異的な細胞傷害性T細胞を得てもよい。本態様において、多能性幹細胞はＴＣＲ遺伝子あるいはＣＡＲ遺伝子を有しているものであっても、かかる遺伝子を有していないものであってもよい。所望の抗原特異的ＴＣＲの遺伝子をＣＤ８ＳＰ細胞培養物に発現させるには、上記多能性幹細胞に所望の抗原特異的ＴＣＲの遺伝子を発現させる方法に準じて行えばよい。ＴＣＲを発現させる際に、生成したＣＤ８ＳＰ細胞が発現しているＴＣＲはｓｉＲＮＡ等により抑制すればよい。
　あるいは、ＣＤ８ＳＰ細胞培養物から所望の抗原に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有するＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を作製してもよい。CAR遺伝子をＣＤ８ＳＰ細胞に導入することによって、CAR発現細胞を得ることができる。
　本願の方法により得られる抗原特異的ＣＴＬ細胞は、当該抗原自体、あるいは当該抗原提示する抗原提示細胞にて刺激する、もしくは抗ＣＤ３抗体により刺激するなど公知の方法によって、さらに増殖させた上で用いても良い。
　多くのがんに発現しているタンパク質として、ＬＭＰ２、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ１を含む数多くのものが知られている。これらのタンパク質のエピトープペプチドもがん抗原ペプチドとしてまた公知である。また、これらのがん抗原に特異的なＴＣＲ遺伝子も数多くの公知のものがある。本願の方法によって、がんに対して特異的な細胞傷害活性を有する高品質のＣＤ８ＳＰ細胞を高い純度で含む細胞集団を得ることが可能となり、免疫細胞療法において有用である。
　本願の実施例にて示すように、本願の方法によって得られたＣＤ８ＳＰ細胞を投与することによって、ヒト腫瘍播種マウスモデルに対する治療効果が確認された。また、この再生細胞を投与したマウスで他の組織が損傷を受けるなどの副作用はみられていない。さらに、投与した細胞ががん化するような事象は観察されていない。本発明の方法は、癌や感染症に特異的な抗原に特異的なＣＴＬ細胞を患者に投与する免疫細胞療法において、有効性、安全性とも、臨床応用できるレベルに相当近いと考えられる。
　本願によって、様々な抗原をターゲットとする免疫細胞療法用Ｔ細胞製剤が提供される。具体例として、健常人から特定の抗原特異的Ｔ細胞を誘導し、かかる細胞からＴ－ｉＰＳ細胞を作製し、そのＴ－ｉＰＳ細胞から本願の方法によりＣＤ８ＳＰ細胞を作成することができる。Ｔ－ｉＰＳ細胞が由来する健常人の細胞を用いてそのＴ－ｉＰＳ細胞から本願の方法にて再生されたＣＤ８ＳＰ細胞の機能を確認した上で、そのＴ－ｉＰＳ細胞をバンク化して保存しておく。あるいは、ＣＤ８ＳＰ細胞を作成し、増殖させた上で小分けにしてバンク化して保存しておくことが考えられる。
　治療対象とする当該抗原を発現するがんに罹った患者のＨＬＡを調べ、バンク化したＴ－ｉＰＳ細胞から適合するＨＬＡ由来の細胞を選択し、当該Ｔ－ｉＰＳ細胞から本願の方法にて誘導したＣＤ８ＳＰ細胞を用いて細胞免疫治療が可能である。あるいは、ＣＤ８ＳＰ細胞を保存しておけば、患者へ迅速に必要な細胞を届けることができる。
　本願の免疫細胞療法においては、誘導されたＣＤ８ＳＰ細胞を適当な媒体、例えば生理的食塩水やＰＢＳに懸濁してＨＬＡが一定以上一致する対象とする患者へ投与する。ドナーと患者とのＨＬＡ型は、完全に一致する場合、ドナーがＨＬＡハプロタイプホモ（ホモ接合型）の場合には、少なくともその一方のＨＬＡハプロタイプが一致する場合が例示される。患者への投与は経静脈的に行えばよい。投与量は限定的ではないが、１０６－１０７細胞／ｋｇで、１回ないし複数回、患者へ経静脈投与する。
　頻度の高いHLAハプロタイプをホモで有するひとをドナーとして用いることにより、汎用性の高いiPS細胞バンクを構築するプロジェクトが日本において現在進行中である（CYRANOSKI, Nature vol. 488, 139(2012)）。（本文献は引用により本願の一部を構成する。）本願の方法を用いて、免疫細胞療法のためのＣＤ８ＳＰ細胞を作製するに当たり、多能性幹細胞としてかかるハプロタイプホモ接合型のドナー由来の細胞から誘導されたｉＰＳ細胞が特に好適に用いられる。
　投与細胞数は特に限定されず、患者の年齢、性別、身長、体重、対象疾患、症状等に応じて適宜定めればよい。最適な投与細胞数は臨床試験により適宜決定すればよい。Ｔ細胞は多様な抗原を攻撃対象とすることができ、本願の方法はがん、感染症、自己免疫疾患、アレルギーなどいろいろな疾患を対象とした免疫細胞療法への応用が可能である。
参考例１
T-iPS細胞の樹立
末梢血単核細胞、自己LCLセルラインおよびC1R-A*24:02セルラインの準備
　HLA-A*24:02を有する健常人ボランティアから末梢血単核細胞（PBMC）を、骨髄単核細胞を白血病患者から常法にしたがって単離した。末梢血Ｂリンパ球をEpstein-Barr virus (EBV)にて形質転換して自己B-lymphoblastoid cell line (自己)を得た。またヒトLCL細胞株であるC1RにHLA-A*24:02遺伝子を導入してHLA A*24:02のみを発現するC1R-A*24:02細胞株を得た。
LMP2およびWT1ペプチド特異的CTLの増殖
　健常人ボランティアから得たPBMC2.5x105を、９６ウェルのＵ底プレート(Falcon)の各ウェルに播種し、10％ヒトAB血清(Sigma)、ペニシリン(100 U/ml)-ストレプトマイシン(100 μg/ml)混合溶液(Nacalaitesque)およびLMP2 (TYGPVFMSL:配列番号１)またはWT1 (CYTWNQMNL:配列番号２)(Tsuboi, A et al. (2002)Cancer Immunol Immunother 51, 614-620)合成ペプチド(10 μｇ／ｍｌ; Eurofins)を添加したRPMI 1640培地中で培養した。２日後、組み換えヒトIL-2 (12.5 U/ml)(Peprotech)、IL-7(10 ng/ml) (Peprotech)およびIL-21(30 ng/ml)(Peprotech)を各ウェルに加えた。
　四量体染色法により抗原特異的CTLを含むCD8陽性Ｔ細胞を単離した。100 nMのLMP2またはWT1合成ペプチドと共に予め培養し、放射線照射したHLA-A*24:02+ LCLと得られた細胞を共培養した。培養２日後、IL-2、IL-7およびIL-21を、最初の刺激と同じ濃度で加えた。CTL細胞はその後２週間毎にLCLで刺激して増幅させた。得られたCTL細胞を「元のCTL細胞」という。
LMP2およびWT1特異的T-iPSCの樹立
　腫瘍抗原特異的T-iPS細胞を、非特許文献１に記載の方法をわずかに改変した方法により樹立した。簡単には、腫瘍抗原特異的CTLを、CD8マイクロビーズ(Milteny Biotec)またはFACSAria IIIセルソーター(BD Biosciences)により濃縮した。1x106 個の濃縮した腫瘍抗原特異的CTLを、４つの山中因子およびMOI 3のSV40ラージT抗原(LTa) (Addgene)を含むセンダイウイルスベクターを用いて形質転換した(Nishimura, K. et al., (2011) J Biol Chem 286, 4760-4771)。スピンインフェクション後、形質転換細胞を、マウス胚性線維芽細胞(MEF)フィーダー細胞上に播種し、10％ ヒトAB血清およびIL-2 (12.5U/ml)、IL-7 (10 ng/ml)、IL-21 (30 ng/ml)を添加したT細胞培地であるRPMI-1640中で培養した。２日目に、培地の半分を、20％ノックアウト血清代替添加物(Gibco)、非必須アミノ酸 (0.1 mM) (Gibco)、2-メルカプトエタノール (10 mM) (Nacalai Tesque)および塩基性線維芽細胞増殖因子(5 ng/ml) (Wako)を添加したヒトiPSC培地であるダルベッコ改変イーグル培地／F12 (Sigma)に交換した。コロニーは、２１～３５日目に出現し始めた。各コロニーを採取し、増殖させた。
　LMP2ペプチド特異的CTLから得たT-iPS細胞、WT1ペプチド特異的CTLから得たT-iPS細胞のクローンをそれぞれ一つずつ選択して以下の実験に供した。以下それぞれLMP2-T-iPS細胞およびWT1-T-iPS細胞という。
参考例２
従来法によるT-iPS細胞からCD8SP細胞の誘導
　参考例１で得たLMP2-T-iPS細胞より非特許文献１の方法にてＴ細胞を誘導した。35日目までは、下記実施例1と同じ操作を行った。誘導35日目の細胞をFACSにて解析した。LMP2抗原特異的T細胞を含む細胞培養物中、DP細胞は12.0％、DN細胞は68.0％含まれていた（図１）。この細胞をCD3抗体による刺激下で６日間培養したところ、CD8SP細胞を68.9％含む細胞培養物が得られた。得られたCD8SP細胞は、LMP2テトラマーに特異的であり、ほぼ全てがCD8ααホモダイマー型Ｔ細胞であった(図２）。また、得られた細胞のTCR遺伝子を解析したところ、元のLMP2特異的CTLのTCR遺伝子と同一であった(データ示さず）。以下、得られた細胞を再生CTL細胞という。
　元のLMP2特異的CTL細胞並びに再生CTL細胞のペプチド特異的細胞傷害活性を、LMP2ペプチドでパルスしたHLA A*24:02陽性ヒト白血病細胞株であるTHP1を対象に調べた。CTL細胞と白血病細胞株をエフェクター：ターゲット（E:T）比0:1、1:9、1:3、1:1、3:1、9:1の割合で混合後、37℃5％CO2の環境下で６時間培養を行った。その後、Annexin V陽性細胞の割合で、細胞傷害活性を評価した。結果を図３および図４に示す。また、ＥＴ比３：１に固定した場合の両者の細胞傷害活性を図５に示す。再生CTL細胞のペプチド特異的細胞傷害活性は元のCTL細胞の約1/100程度であった。
　また、再生CTL細胞のK562細胞に対するNK細胞様細胞傷害活性を調べた。結果を図６に示す。再生CTL細胞は高いNK様細胞傷害活性を有していることが確認された。
　参考例１で得たLMP2-T-iPS細胞クローンを使用した。図７に概略を示す手順にて、T-iPS細胞からT細胞を再生させた。
１）T-iPS細胞からDP細胞およびDN細胞を含む細胞群への分化
使用した培地は下記である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 ＊ペニシリン／ストレプトマイシン溶液は、ペニシリン１００００Ｕ／ｍＬおよびストレプトマイシン１００００μｇ／ｍＬからなり、それぞれの最終濃度を１００Ｕ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
OP9細胞の準備
　０．１％ゼラチン／ＰＢＳ溶液５ｍｌを１０ｃｍ培養ディッシュに入れ、室温で３０分以上静置した。コンフルエントになったOP9細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ溶液で剥がし、１／４相当量をゼラチンコートした１０ｃｍ培養ディッシュに播種した。培地はmedium Aを１０ｍｌとなるように加えた。
　４日後に播種したOP9細胞培養ディッシュに新たにmedium Aを１０ｍｌ加え、全量が２０ｍｌとなるようにした。
OP9/DLL1細胞（２４穴プレート）の準備
　コンフルエントになったOP9/DLL1細胞をトリプシン/EDTA溶液で剥がし、1/4相当量を全量12mlのmedium Aに懸濁し、24穴プレートに0.5mlずつ播種した。播種２日後にOP9/DLL1細胞培養ディッシュを使用した。
T-iPS細胞からの血球前駆細胞誘導
　T-iPS細胞培養ディッシュ（６ｃｍディッシュ）より解離液を用いてiPS細胞コロニーを回収し、ピペッティングにより細かく砕いた。４℃、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、ペレットを10mlのmedium Aに懸濁させた。およそ６ｃｍディッシュ１枚分の細かく砕いたiPS細胞塊を予め用意したOP9細胞上に播種した。
Ｄａｙ　１　（培地交換）
iPS細胞塊が接着し分化し始めているかどうかを確認し、培地を新しいmedium A　２０ｍｌに交換した。

Ｄａｙ　５　（培地半量交換）
半量分の培地を新しいmedium A　１０ｍｌに交換した。

Ｄａｙ　９　　（培地交換）
半量分の培地を新しいmedium A　１０ｍｌに交換した。

Ｄａｙ　１３　（誘導した中胚葉細胞をOP9細胞上からOP9/DLL1細胞上へ移しかえた）
　培地を吸引し、ＨＢＳＳ（＋Ｍｇ＋Ｃａ）で細胞表面上の培地を洗い流した。その後２５０Ｕ　collagenase IV/HBSS(+Mg+Ca)溶液６ｍｌを加え、３７℃で４５分間培養した。
　Collagenase溶液を吸引し、ＰＢＳ（－）１０ｍｌで洗い流した。その後２ｍｌの０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を加え、３７℃で２５分培養した。培養後、medium Aを8ml加え細胞が膜状に剥がれてくるので、ピペッティングにより物理的に細かくし、接着細胞同士を離した。さらに３７℃で４５分間培養した。
　培養後、浮遊細胞を含む上清を、７０μｍのメッシュを通して回収した。４℃、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、ペレットを１０ｍｌのmedium Bに懸濁させた。このうち１／５０をFACS解析用にとりわけ、残りの細胞を新たに用意したOP9/DLL1細胞上に播種した。複数枚のディッシュから得た細胞をプールした場合、元々の枚数と同じ枚数になるように再分配して細胞を播き直した。
　得られた細胞に造血前駆細胞が含まれているかどうかを確かめるために抗CD34抗体、抗CD43抗体を用いてFACS解析した。CD34lowCD43+細胞分画に十分な細胞数が確認できたことから、造血前駆細胞が誘導されていると確認した。(図８）
Day 15 (細胞の継代)
　OP9/DLL1細胞に緩く接着している細胞を、穏やかに複数回ピペッティングし50mlコニカルチューブに回収した。4℃、1200rpmで5分間遠心し、ペレットを10mlのmedium Bに懸濁させた。これらの細胞を新たに用意したOP9/DLL1細胞上に播種した。10cmディッシュ2～3枚分を1枚のディッシュに集約した。
Day 22 (細胞の継代): 血液細胞コロニーが見え始めた。
　OP9/DLL1細胞に緩く接着している細胞を、穏やかに複数回ピペッティングし50mlコニカルチューブに回収した。4℃、1200rpmで5分間遠心し、ペレットを10mlのmedium Bに懸濁させ、新たに用意したOP9/DLL1細胞上に播種した。
Day 29 (細胞の継代): 
　OP9/DLL1細胞に緩く接着している細胞を、穏やかに複数回ピペッティングし、50mlコニカルチューブに回収した。4℃、1200rpmで5分間遠心し、ペレットを10mlのmedium Cに懸濁させ、新たに用意したOP9/DLL1細胞上に播種した。
Day 36 (細胞の継代): 
　OP9/DLL1細胞に緩く接着している細胞を、穏やかに複数回ピペッティングし、 50mlコニカルチューブに回収した。4℃、1200rpmで5分間遠心し、ペレットを10mlのmedium Cに懸濁させ、新たに用意したOP9/DLL1細胞上に播種した。
DP細胞の濃縮（DN細胞およびCD8SP細胞の除去）
　下記培養液を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Day 40: DP細胞の濃縮（DN細胞およびCD8SP細胞の除去）

　OP9/DLL1細胞に緩く接着している細胞を、穏やかに複数回ピペッティングし、50mlコニカルチューブに回収した。4℃、1200rpmで5分間遠心し、ペレットを180μLのMACSバッファーに懸濁した。CD4抗体を結合させたMACS beads 20μL加え、15分４℃で反応させた。以下MACSプロトコルどおりにMACSカラムを用いてCD4陽性細胞を回収した。濃縮前と濃縮後のCD4/CD8のFACSパターンを図９に示す。濃縮前は、DP細胞が27.6％、DN細胞が51.8％、CD8SP細胞が18.4%含まれていたが、濃縮によってDP細胞を96.3％、DN細胞を0.263%およびCD8SP細胞を0.072%含む細胞培養物とした。
濃縮DP細胞からＣＤ８αβＳＰ細胞の誘導
　上記で得た濃縮DP細胞培養物を最終濃度が5x105細胞/mlとなるようにmedium Dで懸濁した。予め準備したOP9/DLL1細胞培養ディッシュの培地を吸引し、細胞懸濁液を1ml/wellとなるよう播種し、培養した。6日後細胞を回収し、FACSにて確認を行った。結果を図１０に示す。
　得られた全細胞培養物中、CD8SP細胞は95.3％であった。CD8SP細胞をFACSにて分析したところ、その87.5％がCD8αβ型T細胞であった。以下、得られた細胞を再生ＣＤ８αβＳＰ細胞という。
　一方、40日目においてDN細胞のみを含む細胞画分を濃縮してDN細胞を約99%含む細胞培養物を得た。得られたDN細胞濃縮培養物を、上記と同様にしてCD3抗体により刺激して6日間培養した。同じくLMP2テトラマー陽性、CD3陽性のCD8SP細胞が得られたが、得られたCD8SP細胞の約87％がCD8αα型T細胞であった。
再生ＣＤ８αβＳＰ細胞の増殖
　再生ＣＤ８αβＳＰ細胞を、LMP2抗原を提示する抗原提示細胞(APC)にて刺激して増殖させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
抗原提示細胞APCの準備
　自己LCLにLMP2抗原ペプチド：TYGPVFMSL（配列番号１）を添加して培養し、APCとして用いた。LCLをカルチャーボトルから回収し、50Gy放射線照射を行った。4℃、1200rpmで5分間遠心し、ペレットを5x106/mlの濃度でmedium Aに懸濁した。ペプチドを最終濃度が100nMになるように添加し、2時間37℃でインキュベーションおこなった。
再生ＣＤ８αβＳＰ細胞のAPCによる刺激
　上記で用意したペプチド添加LCLを、4℃、1200rpmで5分間遠心した。ペレットを4x105/mlの濃度でmedium Aに懸濁した。再生ＣＤ８αβＳＰ細胞も同様に、4℃、1200rpmで5分間遠心した。再生ＣＤ８αβＳＰ細胞ペレットを1x106/mlの濃度でx2 medium Eに懸濁した。24穴プレートに上記ペプチド刺激LCL懸濁液とＣＤ８αβＳＰ細胞懸濁液それぞれ0.5mlを混和し、共培養を行った。
　共培養14日目のFACSパターンを図１１に示す。7日目に培地を新しいこの刺激を7日から14日毎に繰り返し刺激を行い増幅させた。３回試験を行った。各回の細胞の増幅曲線を図１２に示した。
再生ＣＤ８αβＴ細胞の抗原特異的細胞傷害活性
　再生ＣＤ８αβＴ細胞の抗原特異的細胞傷害活性を参考例２と同じ方法にて試験した。結果を図１３に示す。また、E:T比を3:1として参考例で得た元のCTL細胞とその細胞傷害活性を比較した。結果を図１３に示す。再生ＣＤ８αβＴ細胞(再生CD8αβCTL細胞)は、元のCTL細胞と比べて遜色のないペプチド特異的細胞傷害活性を示した。
参考例３
DP細胞とDN細胞との共培養
　実施例１と同じプロトコルに従って、参考例１で得たLMP2-T-iPS細胞クローンをDay 40まで培養した。得られた細胞培養物をFACSによりDP細胞とDN細胞にソートし、それぞれCell Trace VioletとCFSEにてラベルした。DP細胞、DN細胞の純度はいずれも99％以上である。3×104個のDP細胞に、DN細胞を混合比が1:0、3:1、1:1、および1:3となるよう混合し、CD3抗体の存在/非存在下で5時間培養した。得られた細胞をAnnexin VとPIにて染め、両方についてネガティブな細胞を生存細胞とした。Violet陽性細胞、即ちDP細胞における生細胞の％、並びに培養開始時のDP細胞に対する生存細胞の割合を図１４に示す。CD3抗体刺激下でDN細胞がDP細胞を殺傷していることがわかる。
WT1特異的CD8SP細胞のWT1ペプチド特異的細胞傷害活性
　参考例１で得たWT1-T-iPS細胞から実施例１と同じ手順にて再生CD8SP細胞を誘導した。40日目にDP細胞を84.7%含有する濃縮DP細胞培養物を得た。得られた濃縮DP細胞培養物をCD3Abにて刺激して、再生CD8SP細胞を含む細胞培養物を得た。得られた再生CD8SP細胞培養物の89.2%がCD8αβ型T細胞であった。再生CD8SP細胞のWT1抗原特異的細胞傷害活性を評価した。
　C1R A*24:02（ヒトLCL細胞株）にWT1ペプチド（CYTWNQMNL：配列番号２）を様々な濃度で加え2時間培養した。各C1R A*24:02を回収し、再生CD8SP細胞とC1R A*24:02をＥ：Ｔ比0:1、1:3、1:1、3:1、9:1の割合で混合後、37℃5％CO2の環境下で６時間培養を行った。その後、Annexin V陽性細胞の割合で、細胞傷害活性を評価した。結果を図１５に示す。
　ペプチド濃度および細胞数依存的に細胞傷害活性が高まっていることが示され、再生CD8SP細胞がWT1抗原特異的な細胞傷害活性を持つことが裏付けられた。
　再生CD8SP細胞による細胞傷害活性を元のWT1特異的CTL細胞の細胞傷害活性と比較した。結果を図１６に示す。再生CD8SP細胞は元のCTLとほぼ同等のWT1ペプチド特異的なキラー活性を有することが分かった。以下実施例３～５において再生CD8SP細胞を再生CTL細胞という。
WT1特異的CD8SP細胞のTCR特異的細胞傷害活性（対白血病細胞株）
　実施例2で得た再生CTL細胞を用いて、WT1を内因性に発現する白血病細胞株および患者由来白血病細胞に対する細胞傷害活性について評価した。
　内因性にWT1タンパク質を発現し、HLA A*24:02陽性のヒト白血病細胞株であるHL60およびTHP1を対象に、再生CTL細胞のin vitroで細胞傷害活性を評価した。TCR特異的な細胞傷害活性であるか否かを評価するため、ネガティブコントロールのウェルでは白血病細胞株をHLA-I阻害抗体（クローン：W6/32）を10ng/mlで加えて1時間反応させた後の白血病細胞株を再生CD8SP細胞と混合した。再生CTLと白血病細胞株を0:1、1:3、1:1、3:1、9:1の割合で混合後、37℃5％CO2の環境下で６時間培養を行った。その後、Annexin V陽性細胞の割合で、細胞傷害活性を評価した。結果を図１７に示す。
　いずれの白血病細胞株に対しても細胞数依存的に細胞傷害活性が高まった。一方で、HLA-I阻害抗体により細胞傷害活性が阻害された。これらの結果より、WT1-T-iPS細胞から誘導した再生CTL細胞は、内因性のWT1抗原に対してTCR特異的な細胞傷害活性を示すことが確認された。
WT1特異的CD8SP細胞のTCR特異的細胞傷害活性(対初代白血病細胞）
　WT1高発現HLA A*24:02陽性の患者由来白血病細胞に対する細胞傷害活性を、実施例３と同様にして評価した。細胞傷害活性がTCR依存性であるか否かを評価するために、ネガティブコントロールのウェルでは白血病細胞をHLA-I阻害抗体（クローン：W6/32）を10ng/mlで加えて1時間反応させた。白血病細胞として、WT1を高発現している細胞を3種類選んで試験を行った。再生CTL細胞と白血病細胞を0:1、1:3、1:1、3:1、9:1の割合で混合後、37℃5％CO2の環境下で６時間培養を行った。その後、Annexin V陽性細胞の割合で、細胞傷害活性を評価した。結果を図１８に示す。
　いずれの腫瘍細胞に対しても再生CTL細胞数依存的に細胞傷害活性が増加した。また、かかる細胞傷害活性はHLA-I阻害抗体により阻害された。これらの結果より、WT1-T-iPS細胞から再生したCTL細胞は、患者由来の初代白血病細胞に対してもWT1抗原特異的な細胞傷害活性を持つことが裏付けられた。
マウスの異種移植の系を用いたin vivoでの機能評価
　実験の概略を図１９に示す。免疫不全マウスであるNOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug /Jic (NOG)（公益財団法人実験動物中央研究所より購入）を用いた。8-10週齢のNOGマウスへ、WT1高発現HLA A*24:02陽性、CD33陽性の白血病細胞株HL60、２×104細胞をＰＢＳに懸濁したものを腹腔内に投与した（０日）。1、8、15および22日にPBS(コントロール）または再生CD8SP細胞(再生CTL細胞）を5x106細胞ずつ腹腔内へ投与した。各群5匹で行った。CD8SP細胞の生存を確保するために、IL-2およびIL-7の腹腔内投与を週3回、4週間行った。37日と52日に末梢血を採取し、末梢血中の腫瘍細胞（CD33陽性細胞）および再生CTL細胞（CD8陽性細胞）の存在を確認した。また、各マウスの生存期間を確認した（図２０、２１）。
　図２０から明らかなように、PBSを投与したマウスにおいては、末梢血中に腫瘍細胞が流入し、血中にCD8T細胞は認められなかった。一方で再生CTL細胞を投与したマウスにおいては、血中へのCD８T細胞の移行が確認され、また末梢血への腫瘍細胞の移行が認められなかった。また、コントロールと比べて再生CTL細胞を投与したマウスでは顕著に長い生存期間が確認された。
　試験終了後、全てのマウスを解剖して組織の損傷の有無を調べた。再生CTL細胞を投与したマウスにおいて、組織の損傷等は特に認められなかった。
WT1ペプチド特異的TCR-iPS細胞からのCD8SP細胞の誘導
　WT1抗原特異的TCRを導入したiPS細胞の作製
　導入する対象の細胞としては京都大学再生医科学研究所再生免疫学分野（日本国京都府京都市）にて作製された、日本で二番目の頻度のHLAハプロタイプをホモで有する単核細胞由来のiPS細胞を用いた。
　WT1ペプチド特異的TCR遺伝子を導入したiPS細胞はWO 2016/010154に記載の方法にて調製した。用いたWT1ペプチド特異的TCR遺伝子は実施例2で示された再生WT1特異的CTLからクローニングしたものである。以下、導入するTCRをWT1-TCRとする。
１) WT1-TCRを組み込んだレンチウィルスベクターの作製
　独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター細胞運命情報解析技術開発サブチーム（日本国茨城県つくば市）より提供されたCS-UbC-RfA-IRES2-Venusベクターを用い、GatewayシステムによりWT1-TCRを導入したCS-UbC-RfA-IRES2-Venus/WT1-TCRを作製した。
２) WT1-TCRを組み込んだレンチウィルス上清の作製
CS-UbC-RfA-IRES2-Venus/WT1-TCRをX-treamGENE9（ロシュ社）を用いてパッケージング細胞LentiX-293Tに導入した。翌日に培地交換を行い、2日目にレンチウィルスを含む培養上清を回収し、レンチウィルス上清として用いた。
３) WT1-TCR transduced-T-iPS細胞の樹立
　iPS細胞をTryp LE Select (ライフテクノロジーズ社)を用いて完全な単一細胞とした。遠心後、ペレットをレンチウィルス上清で懸濁し、30℃、3000rpmで1時間遠心しiPS細胞に感染させることでWT1-TCRをiPS細胞に導入した。
　感染後、フィーダー細胞（ＭＦＦ）上に播種して培養し、14日後にWT1-TCRが導入されたiPS細胞をVenusタンパク質の発現によって蛍光顕微鏡下で選択した。各クローンを個別に樹立した。ひとつのクローンを選択して以下の試験に供した。以下TCRを導入して得たiPS細胞を「TCR-iPS細胞」という。
　得られたTCR-iPS細胞を実施例１と同じ手順（図７）にてDP細胞とDN細胞を含む細胞培養物を得た（図２２）。得られた細胞培養物中、DP細胞は79.1%、DN細胞は12.0％、CD8SP細胞は6.60%含まれていた。MACSビーズを用いてDP細胞を濃縮し、濃縮DP細胞培養物から培地（medium D）ではなく下記(medium D')を用いる以外は、実施例と同一の方法にてCD8SP細胞へと誘導した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　即ち、濃縮DP細胞培養物を最終濃度が5x105細胞/mlとなるようにmedium D'で懸濁した。予め準備したOP9/DLL1細胞培養ディッシュの培地を吸引し、細胞懸濁液を1ml/wellとなるよう播種し、培養した。6日後細胞を回収し、FACSにて確認を行った。結果を図２３に示す。
　得られた全細胞培養物中、CD8SP細胞は87.86％であった。CD8SP細胞をFACSにて分析したところ、得られたCD8SP細胞の79.7%がCD8αβ型T細胞であった。
　得られた全細胞培養物中、CD8SP細胞は87.86％であった。CD8SP細胞をFACSにて分析したところ、得られたCD8SP細胞の79.7%がCD8αβ型T細胞であった。
　TCR-iPS細胞から再生したCTLと実施例2で示したT-iPS細胞から再生したCTLの細胞傷害活性を比較した。両者は同じTCRを発現している。図16と同じくC1R A*24:02（ヒトLCL細胞株）にWT1ペプチド（CYTWNQMNL：配列番号２）を様々な濃度で加え2時間培養した。各C1R A*24:02を回収し、再生CD8SP細胞とC1R A*24:02をＥ：Ｔ比3:1の割合で混合後、37℃5％CO2の環境下で６時間培養を行った。その後、Annexin V陽性細胞の割合で、細胞傷害活性を評価した。結果を図２４に示す。TCR-iPS細胞から再生したCTLとT-iPS細胞から再生したCTLは同等の抗原特異的細胞傷害活性を示した。

Claims (27)

  1. 　（１）多能性幹細胞を分化誘導して、ＣＤ４－ＣＤ８－Ｔ細胞並びにＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む細胞培養物を得る工程、
    　（２）（１）で得られた細胞培養物よりＣＤ４－ＣＤ８－Ｔ細胞を除く工程、および
    　（３）（２）で得られた細胞培養物中のＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞へと分化させる工程
    を含む、ＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導する方法。
  2. 　工程（２）において、細胞培養物よりＣＤ８抗原がＣＤ８α鎖のホモ接合型であるＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞がさらに除去される、請求項１記載の方法。
  3. 　工程（２）で得られる細胞培養物が、ＣＤ４－ＣＤ８－Ｔ細胞を実質的に含まない、請求項１または２記載の方法。
  4. 　（１）多能性幹細胞を分化誘導して、ＣＤ４－ＣＤ８－Ｔ細胞並びにＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む細胞培養物を得る工程、
    　（２）ＣＤ４－ＣＤ８－Ｔ細胞の細胞傷害活性を抑制する物質の共存下で、（１）で得られた細胞培養物中のＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞へと分化させる工程
    を含む、ＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導する方法。
  5. ＣＤ４－ＣＤ８－Ｔ細胞の細胞傷害活性を抑制する物質がパーフォリン阻害剤、グランザイム阻害剤、Fas経路阻害剤、カスパーゼ阻害剤、NK活性化レセプター阻害抗体からなる群から選択される、請求項４記載の方法。
  6. 　得られるＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ８抗原がＣＤ８α鎖とＣＤ８β鎖のヘテロ接合型である、請求項１～５いずれかに記載の方法。
  7. 　多能性幹細胞が、iPS細胞である、請求項１～６いずれかに記載の方法。
  8. 　多能性幹細胞が、HLAハプロタイプホモ接合型のiPS細胞である、請求項７に記載の方法。
  9. 　多能性幹細胞が所望の抗原に特異的な再構成済Ｔ細胞受容体またはキメラ抗原受容体遺伝子を有し、当該抗原に特異的な細胞傷害活性を有するＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞が誘導される、請求項１～８いずれかに記載の方法。
  10. 　多能性幹細胞が、所望の抗原に特異的な再構成済Ｔ細胞受容体遺伝子を有する、請求項９記載の方法。
  11. 　多能性幹細胞が、所望の抗原に特異的な再構成済Ｔ細胞受容体遺伝子を有するヒトＴ細胞から誘導されたＴ－ｉＰＳ細胞である、請求項１０に記載の方法。
  12. 　多能性幹細胞が、所望の抗原に特異的な再構成済Ｔ細胞受容体遺伝子をヒト多能性幹細胞へ導入して得られたＴＣＲ－ｉＰＳ細胞である、請求項１０に記載の方法。
  13. 　ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞へと分化させる工程が、Ｔ細胞受容体に刺激を加えた時に起こる活性化経路のいずれかの部分を直接活性化することによる、請求項９～１２いずれかに記載の方法。
  14. 　ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞へと分化させる工程が、抗CD3抗体を用いることによって行われる、請求項１３に記載の方法。
  15. 　ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞へと分化させる工程が、当該所望の抗原による刺激を加えることによって行われる、請求項１３に記載の方法。
  16. 　ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞へと分化させる工程が、当該所望の抗原を提示する抗原提示細胞による刺激を加えることによって行われる、請求項１５に記載の方法。
  17. 　ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞へと分化させる工程が、キメラ抗原受容体の標的抗原による刺激を加えることによって行われる、請求項１３に記載の方法。
  18. 　誘導されたＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞へ、所望の抗原に特異的なＴ細胞受容体またはキメラ抗原受容体を導入する工程を更に含み、当該抗原に特異的な細胞傷害活性を有するＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞を作製する、請求項１～８いずれかに記載の方法。
  19. 　誘導されたＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞へ、所望の抗原に特異的なＴ細胞受容体を導入する、請求項１８に記載の方法。
  20. 　得られた所望の抗原に特異的なＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞をさらに増殖させる工程を更に含む、請求項９～１９何れかに記載の方法。
  21. 　得られた抗原特異的ＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞をさらに増殖させる工程が、T細胞受容体に刺激を加えた時に起こる活性化経路のいずれかの部分を直接活性化することによる、請求項２０に記載の方法。
  22. 　得られた抗原特異的ＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞をさらに増殖させる工程が、抗CD3抗体を用いることによって行われる、請求項２０に記載の方法。
  23. 　得られた抗原特異的ＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞をさらに増殖させる工程が、当該所望の抗原による刺激を加えることによって行われる、請求項２０に記載の方法。
  24. 　得られた抗原特異的ＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞をさらに増殖させる工程が、当該所望の抗原を提示する抗原提示細胞による刺激によって行われる、請求項２３に記載の方法。
  25. 　得られた抗原特異的ＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞をさらに増殖させる工程が、キメラ抗原受容体の標的抗原による刺激を加えることによって行われる、請求項２０に記載の方法。
  26. 　同一の抗原特異性を有するＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞を９０％以上含有する細胞培養物。
  27. 　同一のＴ細胞受容体遺伝子を有するＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞を９０％以上含有する、請求項２６記載の細胞培養物。
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