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WO2017168014A1 - Markersequenzen für rheumatoide arthritis - Google Patents

Markersequenzen für rheumatoide arthritis Download PDF

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WO2017168014A1
WO2017168014A1 PCT/EP2017/057896 EP2017057896W WO2017168014A1 WO 2017168014 A1 WO2017168014 A1 WO 2017168014A1 EP 2017057896 W EP2017057896 W EP 2017057896W WO 2017168014 A1 WO2017168014 A1 WO 2017168014A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
sequences
marker
rheumatoid arthritis
group
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/EP2017/057896
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English (en)
French (fr)
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WO2017168014A8 (de
Inventor
Angelika LÜKING
Petra Budde
Peter Schulz-Knappe
Dieter ZUCHT
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Protagen GmbH
Original Assignee
Protagen GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Protagen GmbH filed Critical Protagen GmbH
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Priority to EP17719812.4A priority patent/EP3436828A1/de
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Publication of WO2017168014A8 publication Critical patent/WO2017168014A8/de
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
    • G01N2800/101—Diffuse connective tissue disease, e.g. Sjögren, Wegener's granulomatosis
    • G01N2800/102—Arthritis; Rheumatoid arthritis, i.e. inflammation of peripheral joints

Definitions

  • the present invention relates to a novel method for the identification of marker sequences for rheumatoid arthritis, the novel marker sequences found by means of the method and their diagnostic use. Furthermore, the present invention relates to a novel method for the identification of marker sequences for rheumatoid arthritis, the novel marker sequences found by means of the method and their diagnostic use. Furthermore, the present invention relates to a novel method for the identification of marker sequences for rheumatoid arthritis, the novel marker sequences found by means of the method and their diagnostic use. Furthermore, the
  • Marker sequences for rheumatoid arthritis in particular a protein biochip or beads and their use.
  • RA Rheumatoid arthritis
  • Diagnosis can progress the joint destruction.
  • markers for the early detection of RA or prognosis and therapy control are enormous important, especially in those patients of rheumatoid arthritis (RA), who are already in drug treatment.
  • the current classification criteria jointly published by the American College for Rheumatology (ACR) and the European League against Rheumatism (EULAR) in 2010 (Aletaha, Neogi et al., 2010), aim to identify autoantibodies (AAB) against citrullinated antigens (AAB).
  • ACR American College for Rheumatology
  • EULAR European League against Rheumatism
  • ACPA autoantibodies are present in about 75% of patients
  • the RA is considered a disease in the predominantly
  • Autoantibodies are produced against citrullinated peptides. Autoantibodies to post-translationally unmodified proteins or peptides have also been described in a few papers (Hueber, Tomooka et al., 2009, Somers, Geusens et al., 2011), but have not been systematically reviewed for new ones
  • EULAR European League against Rheumatism
  • Protein biochips are gaining an increasing industrial
  • Protein biochips require the necessary proteins to be available. In particular,
  • GATEWAY recombinational cloning application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeems. Methods Enzymol, 328, 575-592).
  • ORFeems open reading frames
  • the cDNA of a particular tissue is transformed into a bacterial or eukaryotic expression vector, e.g. Yeast, cloned.
  • the vectors used for the expression are generally characterized by the fact that they carry inducible promoters, with which the timing of protein expression can be controlled.
  • expression vectors have sequences for so-called
  • Affinity epitopes or proteins on the one hand, the specific detection of the recombinant fusion proteins by means of an anti-affinity epitope
  • Antibody on the other hand becomes the specific one
  • IMAC affinity chromatography
  • expression libraries could be expressed and purified at high throughput (Braun P., Hu, Y., Shen, B., Halleck, A., Koundinya, M., Harlow, E. and LaBaer, J. Biol.
  • Such protein biochips based on cDNA expression libraries are in particular the subject of WO 99/57311 and WO 99/57312.
  • RA Arthritis
  • the arrays are incubated with the serum samples and conjugated to anti-human IgG via Alexa Fluor 647
  • Auger et al. does not disclose the diagnostic use of the identified antigens.
  • EP 1 731 608 A1 discloses a method to identify "RA susceptible genes" by gene mapping using microsatellite markers and PCR technique
  • the genes were TNXB, NOTCH4 (chromosomes 6), RAB6A, MPRL48, FLJ11848, UCP2 and UCP3 (chromosome 11) found in human genomic DNA
  • EP 1 731 608 A1 claims a marker gene for an RA assay consisting of a partial DNA sequence of one of the marker genes found and comprising at least one SNP in the human genomic DNA of RA comprising recovering partial DNA sequences corresponding to one of the marker genes from a subject to be examined, determining the nucleotide sequence of the partial DNA sequence and comparing the nucleotide sequence with the corresponding nucleotide sequence derived from a
  • test kit for RA comprising one of the marker genes or one of them
  • WO 2009/138408 A2 claims a diagnostic method in which an autoantigen marker comprising the catalytic domain of BRAF or an antibody fragment thereof, for
  • Detection of RA is used and optionally also anti-PAD4 antibodies are detected in the biological sample of the subject to be examined.
  • WO 2009/138408 A2 discloses a detection kit for the detection of anti-BRAF Autoantibodies, an array of autoantigen markers comprising BRAF and PAD4 for the diagnosis of RA and the use of an autoantigen marker comprising BRAF for the diagnosis of RA, preferably in patients who are CCP negative (page 3, paragraph 1).
  • WO 2007/039280 AI claims a method for
  • Bone, cartilage or synovial membrane can be used.
  • WO 2007/039280 A1 further claims the use of a panel comprising anti-CCP and ANA for the diagnosis of RA and a test kit. Nicoaise et al. (2008) Arthritis Research Therapy, Biomed
  • Antibodies for the diagnosis of RA in CCP-negative patients and use for monitoring during therapy with infliximab are groups of patients with RA and CCP and with RA and without CCP, patients with other rheumatic Diseases (Psoriatic Rheumatism, Primary Sjögren Syndrome, Ankylosis Spondylitis) and healthy controls
  • US 2007/0254300 AI uses a yeast two-hybrid system to identify anti-inflammatory compounds ([0504] to [0506]) and claims a protein complex wherein the first protein is PAK, a fragment thereof, or a fusion protein containing the same, and the second protein ERK3, PRKAR1A, KRT23 (209), PN7098, AL117237, PCNT2, PROX1, HOOK1, IGHG1, GOLGA2, KIAA0555, LRPPRC or a fragment thereof
  • Microarray which includes this protein complex and a
  • Marker sequences for rheumatoid arthritis in particular a protein biochip and its use.
  • Marker sequences for diagnosis of RA methods for diagnosing RA using these marker sequences, methods for stratifying, an array of marker sequences, an assay / protein biochip, the use of the assembly,
  • Diagnostics comprising the marker sequences, a target for treatment and therapy, and the use of the marker sequences to perform apheresis.
  • the RA-specific expression clones were obtained in DE 10 2007 041 656 AI in that 10 or more patient samples were individually screened against a cDNA expression library and identified by comparison with 10 or more healthy samples.
  • Fig. 1 the differential
  • the object of the present invention is therefore to find better marker sequences for rheumatoid arthritis and their diagnostic use.
  • RA rheumatoid arthritis
  • the invention relates to a method for the identification of marker sequences for rheumatoid arthritis (RA), comprising the steps: a) serum samples from RA patients are contacted with more than 5,000 antigens coupled to (Luminex) beads, the binding of the individual antigens Serum RA proteins were measured by immunofluorescence assay and the median fluorescence intensity (MFI) determined for each individual antigen;
  • MFI median fluorescence intensity
  • markers are selected from the sequences SEQ ID o. 1 to 84, partial sequences or fragments thereof,
  • planar substrates are used, to the marker sequences or sequences to be examined
  • Sequences immobilized on a solid, flat support An alternative arrangement or panel of marker sequences or sequences to be examined is possible on beads, which therefore differ from conventional microarrays, inter alia with regard to their sensitivity and specificity.
  • bead arrays are either impregnated with beads at different concentrations
  • Fluorescent dye or e.g. created by barcode technology.
  • the beads are addressable and can be used to detect specific binding events occurring on their own
  • Bead technology is based on microscopically small spherical beads or platelets called microspheres or beads. These beads can be used analogously to ELISA and Western Blot as
  • Solid phase for biochemical detection reactions serve.
  • bead types which differ for example in their fluorescent color and each of which carries its own specific detection reagent on the surface. In this way, a corresponding number of different detection reactions can be carried out simultaneously in a very small sample volume.
  • Bead arrays are the specific interaction of two defined biochemical compounds detectable. Compared to conventional microarrays
  • marker sequences for RA can be identified which differ in their sensitivity and
  • the invention also relates to a marker sequence for
  • Rheumatoid arthritis obtainable by a method according to the invention and wherein the marker sequence is selected from the group of the sequences SEQ ID o. 1 to 84, partial sequences or fragments thereof, homologues of the sequences SEQ ID NO. 1 to 84 with at least 90% homology.
  • the invention also provides the use of one or more marker sequence (s) according to the invention for the diagnosis of rheumatoid arthritis.
  • One embodiment relates to the use according to the invention, wherein the marker sequence (s) on or from one to
  • One embodiment relates to the use according to the invention, characterized in that 2 or 3, preferably 4 or 5, more preferably 6, 7 or 8 or more different
  • Marker sequences for example 10 to 20 or 30 or more different marker sequences on or from one to
  • One embodiment relates to the use according to the invention, characterized in that the marker sequence (s) is / are applied to a solid support, the solid support being selected from filters, membranes, wafers, for example Silicon wafers, glass, metal, plastic, chips,
  • mass spectrometric targets for example magnetic, coated or labeled beads, such as
  • the invention also provides a method for the diagnosis of rheumatoid arthritis, wherein a. ) at least one marker sequence according to the invention is applied to a solid support, preferably to a bead, and b. ) is brought into contact with body fluid or tissue extract of a patient and
  • the detection of such an interaction can, for example, by a probe, in particular by an antibody
  • the invention also provides a method for
  • Marker sequence is used to examine a sample of the patient.
  • One embodiment relates to a method according to the invention for the diagnosis of rheumatoid arthritis, wherein the
  • the invention also relates to an arrangement or panel comprising or consisting of one or more
  • the subject of the invention is also an assay or
  • Protein array comprising an arrangement or panel according to the invention.
  • the invention is also the use of a
  • Identification and / or characterization of a substance for rheumatoid arthritis containing means for detecting a binding success, characterized in that an assembly / panel or an assay or protein array is contacted with a.) At least one substance to be examined and b.) Demonstrates a binding success becomes.
  • the invention also provides a diagnostic agent for
  • Diagnosis of rheumatoid arthritis containing at least one marker sequence according to the invention and optionally further excipients and additives.
  • the invention also provides a target for the treatment or therapy of rheumatoid arthritis, wherein the target is selected from the marker sequences according to the invention.
  • the invention also provides the use of at least one marker sequence according to the invention for identifying a subgroup of patients within the group of
  • Marker sequences for the diagnosis of rheumatoid arthritis wherein at least one marker sequence selected from the group of marker sequences SEQ ID o. 1 to 84 and / or genomic sequences containing one of the sequences SEQ ID NO. 1 to 42 and / or a by the sequences SEQ ID No. 43 to 84 coded protein, partial sequences or fragments thereof, homologues of the sequences SEQ ID NO. 1 to 84 with at least 90% homology to or from a patient to be examined.
  • Another embodiment of the invention relates to
  • marker sequence (s) for the diagnosis of rheumatoid arthritis, characterized in that the determination is carried out by means of in-vitro diagnosis.
  • Marker sequences for rheumatoid arthritis can be identified.
  • Beads (beads, globules, originally also called latex particles) denote so-called microspheres or
  • Microparticles used as carriers for biomolecules in tests and assays are required, which are produced by special chemical processes. These methods are known to the person skilled in the art. Beads for different applications are also commercially available (eg Fa. Progen Biotechnik GmbH) . Beads can be made of different materials, for example glass, polystyrene, PMMA and
  • Beads can be labeled with different dyes or dye mixtures and provided with coatings. At yours
  • the surface of the beads may be modified such that directional coupling of the biomolecules on the bead surface, e.g. in connection with spacers, tags or special modifications is possible and whereby the
  • rheumatoid arthritis is for example after
  • Juvenile idiopathic arthritis (ICD-10: M08.-, abbr .: JIA) Older synonyms: Juvenile rheumatoid arthritis, juvenile chronic arthritis, Still's disease or more popular: childlike
  • the marker sequences according to the invention can also be combined, supplemented, fused or extended with known biomarkers for this indication.
  • the determination of the marker sequences takes place outside the human body and the determination takes place in an ex vivo / in vitro diagnosis.
  • Diagnosis in the sense of this invention means the positive detection of rheumatoid arthritis by means of
  • Marker sequences of the invention and the assignment of patients to the indication rheumatoid arthritis.
  • diagnosis includes medical diagnostics and
  • diagnosis also includes the
  • the invention relates to a method for
  • Marker sequence according to the invention is determined on a patient to be examined. Also included is the
  • therapy control also includes the classification of patients into responders and non-responders with regard to a therapy or its course of therapy.
  • stratification also: stratification
  • therapy control in the sense of this invention means that the inventive method decisions for the treatment and therapy of the
  • the term "stratification" includes in particular the
  • patient is understood to mean any subject - human or mammal - with the proviso that the subject is being examined for rheumatoid arthritis.
  • marker sequences in the sense of this invention means that the nucleic acid sequence, for example the mRNA, cDNA or the respective polypeptide or protein obtainable therefrom, are significant for rheumatoid arthritis.
  • the mRNA or cDNA or the respective polypeptide or protein obtainable therefrom may interact with substances from the body fluid or tissue extract of a rheumatoid arthritis patient (e.g., (auto) antigen (epitope) / (auto) antibody (paratope).
  • substances from the body fluid or tissue extract of a rheumatoid arthritis patient e.g., (auto) antigen (epitope) / (auto) antibody (paratope).
  • Marker sequence selected from the group of marker sequences SEQ ID o. 1 to 84 and / or genomic sequences, the one of the sequences SEQ ID o. 1 to 42 and / or a by the sequences SEQ ID No. 43 to 84 coded protein,
  • a binding in particular a binding substance to at least one of the marker sequences according to the invention or in the case of a cDNA hybridization with a suitable
  • Hybridization conditions are: hybridization in 4 x SSC at 65 ° C (alternatively in 50% formamide and 4X SSC at 42 ° C), followed by several washes in 0.1 x SSC at 65 ° C for a total of about one hour.
  • An example of less stringent hybridization conditions is hybridization in 4 x SSC at 37 ° C, followed by several washes in 1 x SSC
  • such substances are constituents of a body fluid, in particular blood, whole blood, blood plasma, blood serum, patient serum, urine, cerebrospinal fluid, synovial fluid or a tissue extract of the patient.
  • the marker sequences according to the invention may be present in a significantly higher or lower expression rate or concentration in the subjects are present, compared to the expression rate or concentration of the subject
  • Marker sequence in a healthy or a subject without RA is an indication of rheumatoid arthritis and the diagnosis of RA.
  • Marker sequences according to the invention can be determined, for example, by means of proteomics or nucleic acid blots.
  • the protein is preferred for a protein
  • the marker sequences according to the invention recognize autoantibodies which are specific for RA or which in the formation and the
  • Progression of RA disease can be formed and / or increased or decreased.
  • Two or more marker sequences according to the invention can be used to detect autoantibody profiles or changes in
  • SEQ ID no. 1 to 84 are the subject of Table 1 and can by the respective
  • the invention also relates to the full-length sequences of the marker sequences according to the invention and the marker sequences as defined in the tables about the known database entries as well as the attached sequence listing
  • marker sequences in particular of the nucleic acid sequences SEQ ID No. 1 to 42 and the protein sequences SEQ ID No. 43 to 84.
  • Preferred marker sequences having P values less than or equal to 0.006, preferably less than or equal to 0.001 or less than or equal to 0.0001, more preferably less than or equal to 0.00001 (see Tables 2 and 3).
  • SEQ ID No. 4 and 46 DCTN1 with reactivity in all patient cohorts.
  • SEQ ID no. 5 and 47 GPTG
  • SEQ ID NO. 6 and 48 HNRNPA1
  • SEQ ID No. 7 and 49 IFG3
  • an arrangement or panel containing at least one sequence selected from the group SEQ ID no. 4 and 46 (DCTN1), SEQ ID No. 5 and 47 (GNPTG), SEQ ID No. 6 and 48 (HNRNPA1) and SEQ ID No. 7 and 49 (ITFG3) and optionally further marker sequences according to the invention.
  • homologs of the marker sequences according to the invention are included.
  • Homologues can be protein or
  • nucleic acid sequences are those sequences which are 50 to 100 nucleotides or amino acids, preferably 70-120
  • Nucleotides or amino acids particularly preferably 100 to 200 nucleotides or amino acids of one of the marker sequences SEQ ID No. 1 to 84.
  • the marker sequences also include such
  • nucleotide sequence for example the cDNA sequence and the corresponding amino acid sequence, such as
  • Marker sequence may be represented in different amounts in one or more areas on a solid support, for example a bead. This allows a variation of the sensitivity.
  • the regions may each comprise a total of marker sequences, i. a sufficient number
  • marker sequences in particular 2 to 5 or 10 or more marker sequences and, if appropriate, further nucleic acids and / or proteins, in particular biomarkers. However, at least 96 to 25,000 (numerically) or more of different or identical marker sequences and more are preferred
  • Nucleic acids and / or proteins in particular biomarkers. Further preferred are more than 2,500, particularly preferred
  • arrangement or “panel” synonymously means “array” and insofar as this "array” is used to identify substances to be bound to marker sequences, This is to be understood as meaning an “assay” or a diagnostic device
  • arrangement is designed in such a way that that on the device
  • marker sequences in the form of a grid on a solid support. Furthermore, such arrangements are preferred which allow a high density array of marker sequences and spotting the marker sequences. Such high density spotted assemblies are
  • the term "assay" or diagnostic device also includes such embodiments of a device, such as ELISA (e.g., individual wells
  • Examples are diagnostic ELISA kits from the company Phadia or multiplex ELISA kits
  • Marker sequences according to the invention or combinations of marker sequences are robot-supported on membranes
  • Example “Euroline” from Euroimmun AG Western Blot (example “Euroline-WB” from Euroimmun AG), immunochromatographic methods (eg lateral flow immunoassays, marker sequences or combinations of marker sequences are applied to test strips (membranes, US Pat
  • One or more marker sequences may be present several times in the totality of all marker sequences and be present in different amounts relative to one spot. Furthermore, the marker sequences can be standardized on the solid support (e.g., by serial dilution series of, e.g., human globulins as internal calibrators to
  • the invention therefore relates to an assay or protein biochip or one or more beads (bead-based assay) consisting of an array or panel containing marker sequences according to the invention.
  • the marker sequences are present as clones.
  • Such clones can be obtained, for example, by means of a cDNA expression library according to the invention (Büssow et al., 1998 (supra)).
  • such expression libraries become
  • These expression vectors preferably contain inducible promoters. The induction of
  • Expression can e.g. by means of an inductor, such as IPTG.
  • IPTG inductor
  • Suitable expression vectors are described in Terpe et al. (Terpe T Appl Microbiol Biotechnol 2003 Jan; 60 (5): 523-33).
  • Expression libraries are known to the person skilled in the art, these can be prepared according to standard works, such as Sambrook et al., Molecular Cloning, Laboratory Laboratory, 2nd edition (1989), CSH press, Cold Spring Harbor, New York Further preferred are such expression libraries
  • tissue specific e.g., human tissue, especially human organs.
  • expression libraries are also included according to the invention, which can be obtained by exon trapping. Instead of expression library can be spoken synonymously from an expression bank.
  • protein biochips or beads or corresponding expression libraries which have no redundancy (so-called: UnicloneO library) and according to the teachings of WO 99/57311 and WO 99/57312, for example
  • Libraries have a high content of non-defective, fully expressed proteins of a cDNA expression library.
  • the clones may not be such as transformed bacteria, recombinant phage or transformed cells of mammals, insects, fungi, yeasts or plants.
  • the clones are fixed on a solid support, spotted or immobilized. Therefore, the invention relates to an arrangement, wherein the
  • Marker sequences are present as clones.
  • marker sequences may be in the form of a fusion protein in the particular form
  • the tag may be one such as c-myc, His-tag, Arg-tag, FLAG, alkaline phosphatase, V5 tag, T7 tag or Strep tag, HAT tag, NusA, S-tag, SBP tag , Thioredoxin, DsbA, a fusion protein, preferably a cellulose-binding one
  • Protein Protein, calmodulin-binding protein, glutathione S-transferase or lacZ.
  • a marker sequence can also be made up of several individual ones
  • marker sequences This may involve cloning individual fragments into a large common fragment and expressing this combined fragment.
  • solid support includes embodiments such as a filter, a membrane, a magnetic or fluorophore-labeled bead
  • Silicon wafer, glass, metal, plastic, a chip, a mass spectrometric target or a matrix Silicon wafer, glass, metal, plastic, a chip, a mass spectrometric target or a matrix.
  • a filter and beads are preferred according to the invention.
  • PVDF polyvinyl styrene
  • nitrocellulose polymethyl methacrylate
  • nylon polymethyl methacrylate
  • filters eg Immobilon P Millipore, Protran Whatman, Hybond N + Amersham.
  • this corresponds to a grid having the order of a microtiter plate (8-12 wells strips, 96 wells, 384 wells or more), a silicon wafer, a chip, a mass spectrometric target or a matrix.
  • beads are used as beads.
  • bead-based multiplex assays are used.
  • the analysis and evaluation of the bead-based assays can be carried out, for example, with a Luminex analysis system, which is carried out on the method of flow cytometry using two different lasers.
  • CVs coefficients of variation
  • Luminex ie bead-based protein arrays
  • the UNIarray concept is not bound to Luminex, but can also be used on other platforms such as Randox, VBC-Genomics etc.
  • the high measurement accuracy and the low VKs of the individual measurements allow the use of better and new statistical
  • the invention relates to an assay or protein biochip for identifying and
  • Characterizing a substance for rheumatoid arthritis characterized in that an arrangement or assay according to the invention is brought into contact with a.) At least one substance to be investigated, and b.) A binding success
  • the substance to be tested may be any native or non-native biomolecule
  • Substance library After the substance to be examined contacts a marker sequence, the binding success is evaluated, which is carried out, for example, using commercially available image analysis software (GenePix Pro (Axon Laboratories), Aida (Raytest), ScanArray (Packard Bioscience).
  • protein to marker sequence e.g., protein to marker sequence
  • Antigen / antibody or corresponding "means for detecting the binding success" can, for example, by means of
  • Fluorescence labeling, biotinization, radioisotope labeling or colloidal gold or latex particle Marking done in the usual way. Detection of bound antibodies takes place with the help of secondary antibodies
  • reporter enzymes such as alkaline
  • a readout is e.g. by means of a microarray laser scanner, a CCD camera or visually.
  • Protein biochips each performed from a cDNA expression library of a patient and a healthy subject and the differential clones are detected by fluorescence labeling and bioinformatorisch evaluated.
  • the 6,000 antigens were recombinantly expressed in E. coli and purified.
  • 5 cDNA banks (oligo (dT) primed, His-tag) from human tissue were used (inter alia, intestine, lung, liver)
  • Vidalain PO Clingingsmith TR, Hartley JL, Esposito D, Cheo D, Moore T, Simmons B, Sequerra R, Bosak S, Doucette Tribe L, Le Peuch C, Vandenhaute J, Cusick ME, Albala JS, Hill DE, Vidal M : Human ORFeome version 1.1: a platform for reverse proteomics. Genome Res 2004, 14: 2128-2135). recombinant
  • Escherichia coli is dependent on the availability of the DNA gene product. 1989, 85: 109-114). Proteins were obtained from harvested and lysed cells (Overnight Express autoxidation medium, Novagen®, 6M guanidinium HCl, 0.1M
  • Luminex Corporation conducted according to Luminex protocol, wherein for each single-coupling reaction up to 12.5 pg antigen and 8.8 x 105 MagPlexTM beads of one color region (ID)
  • Cohort C (seronegative RA cohort): 184 patients with ACPA-negative RA according to 2010 ACR / EULAR criteria (age 60.2 ⁇ 13.8 years, 62.5%% female, all therapy naive) compared with 343 healthy controls 343 (age 47.7 ⁇ 11.7years, 58.3 %% female).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Identifizierung von Markersequenzen für Rheumatoide Arthritis, die mit Hilfe des Verfahrens gefundenen neuen Markersequenzen und deren diagnostische Verwendung. Ferner betrifft die Erfindung diagnostische Vorrichtungen enthaltend solche Markersequenzen für Rheumatoide Arthritis, insbesondere einen Proteinbiochip oder Beads (Kügelchen) und deren Verwendung.

Description

Markersequenzen für Rheumatoide Arthritis
Besehreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Identifizierung von Markersequenzen für Rheumatoide Arthritis, die mit Hilfe des Verfahrens gefundenen neuen Markersequenzen und deren diagnostische Verwendung. Ferner betrifft die
Erfindung diagnostische Vorrichtungen enthaltend solche
Markersequenzen für Rheumatoide Arthritis, insbesondere einen Proteinbiochip oder Beads und deren Verwendung.
Die Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine Autoimmunerkrankung an der etwa 1% der der Bevölkerung der westlichen Welt leiden. Chronisch-entzündliche Prozesse führen bereits im ersten Jahr der Erkrankung (frühe RA) zu einer fortschreitenden
gelenkzerstörenden Synovitis. Wird die RA nicht rechtzeitig erkannt und in einem bestimmten Zeitfenster („window of opportunity" ) aggressiv behandelt, dann führt dies zu einer Gelenkzerstörung mit erheblichen körperlichen Einschränkungen und systematischen Manifestationen, die zu Behinderungen und verkürzter Lebenserwartung führen.
In der Frühphase der Erkrankung ist für Patienten mit einer Gelenkentzündung, die Kriterien für die Diagnose einer RA und eine Unterscheidung zwischen einer Arthritis und einer reinen Arthralgie (Gelenkbeschwerden) häufig schwierig. Dies
verzögert die Therapiesteuerung für Patienten mit einer möglicherweise frühen RA, so dass bei einer ungeklärten
Diagnose die Gelenkzerstörung voranschreiten kann.
Daher sind Marker zur Früherkennung der RA bzw. Prognose und Therapiesteuerung immens wichtig, insbesondere bei solchen Patienten der rheumatoiden Arthritis (RA) , die bereits in medikamentöser Behandlung sind. Die aktuellen Klassifikationskriterien, welche das American College for Rheumatology (ACR) und die European League Against Rheumatism (EULAR) in 2010 gemeinsam veröffentlicht haben (Aletaha, Neogi et al . 2010)) sollen durch die Bestimmung von Autoantikörpern (AAB) gegen citrullinierte Antigene (ACPA) , eine frühe Diagnose der RA erleichtern, so daß eine
krankheitsmodifizierende Therapie möglichst früh eingeleitet wird und irreversible Krankheitsfolgen verhindert werden.
ACPA Autoantikorper sind in etwa 75% von Patienten mit
etablierter RA positiv nachweisbar, jedoch nur in etwa 62% der Patienten mit früher RA.
Dies unterstreicht den Bedarf an weiteren Markern für die Frühdiagnose der RA, Prognose und Therapiesteuerung.
Bisher gilt die RA als eine Erkrankung in der vorwiegend
Autoantikorper gegen citrullinierte Peptide produziert werden. In einigen wenigen Publikationen wurden auch Autoantikorper gegen posttranslational unmodifizierte Proteine oder Peptide beschrieben (Hueber, Tomooka et al . 2009; Somers, Geusens et al . 2011), jedoch wurde nicht systematisch nach neuen
Autoantikörpern gesucht oder diese für die Identifizierung von Patientensubgruppen eingesetzt.
Auf Basis der 2010 veröffentlichten Empfehlungen der die
European League Against Rheumatism (EULAR) für die Behandlung der RA ist das primäre Behandlungsziel, die
Krankheitsprogression zu stoppen und die Krankheitsremission zu erreichen (Smolen, Landewe et al . 2010) .
Proteinbiochips gewinnen eine zunehmende industrielle
Bedeutung in der Analytik und Diagnostik sowie in der
Pharmaentwicklung . Proteinbiochips haben sich als
Screeninginstrumente etabliert. Hierbei wird die schnelle und hochparallele Detektion einer Vielzahl spezifisch bindender Analysemoleküle in einem
einzigen Experiment ermöglicht. Zur Herstellung von
Proteinbiochips ist es erforderlich, die benötigten Proteine zur Verfügung zu haben. Hierzu haben sich insbesondere
Protein-Expressionsbibliotheken etabliert. Die Hochdurchsat z- Klonierung von definierten offenen Leserahmen ist eine
Möglichkeit (Heyman, J.A., Cornthwaite, J., Foncerrada, L., Gilmore, J.R., Gontang, E., Hartman, K.J., Hernandez, C.L., Hood, R., Hull, H.M., Lee, W.Y., Marcil, R., Marsh, E.J., Mudd, K.M., Patino, M.J., Purcell, T.J., Rowland, J.J.,
Sindici, M.L. and Hoeffler, J.P. (1999) Genome-scale cloning and expression of individual open reading frames using
topoisomerase I-mediated ligation. Genome Res, 9, 383-392; Kersten, B., Feilner, T . , Kramer, A., Wehrmeyer, S., Possling, A., Witt, I., Zanor, M.I., Stracke, R., Lueking, A.,
Kreut zberger, J., Lehrach, H. and Cahill, D.J. (2003)
Generation of Arabidopsis protein chip for antibody and serum Screening. Plant Molecular Biology, 52, 999-1010; Reboul, J., Vaglio, P., Rual, J.F., Lamesch, P., Martinez, M., Armstrong,
C. M., Li, S., Jacotot, L., Bertin, . , Janky, R., Moore, T., Hudson, J.R., Jr . , Hartley, J.L., Brasch, M.A., Vandenhaute, J., Boulton, S., Endress, G.A., Jenna, S., Chevet, E.,
Papasotiropoulos , V., Tolias, P.P., Ptacek, J., Snyder, M., Huang, R., Chance, M.R., Lee, H., Doucette-Stamm, L., Hill,
D. E. and Vidal, M. (2003) C. elegans ORFeome version 1.1:
experimental verification of the genome annotation and
resource for proteome-scale protein expression. Nat Genet, 34, 35-41.; Walhout, A.J., Temple, G.F., Brasch, M.A., Hartley, J.L., Lorson, M.A., van den Heuvel, S. and Vidal, M. (2000)
GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol, 328, 575-592). Allerdings hängt ein solcher Ansatz stark mit dem Fortschritt der Genom-Sequenzierungsprojekte und der Annotierung dieser Gensequenzen zusammen. Darüber hinaus ist die Bestimmung der exprimierten Sequenz aufgrund
differenzieller Spleißvorgänge nicht immer eindeutig. Dieses Problem kann durch die Anwendung von cDNA-
Expressionsbibliotheken umgangen werden (Büssow, K., Cahill, D., Nietfeld, W., Bancroft, D., Scherzinger, E., Lehrach, H. and Walter, G. (1998) A method for global protein expression and antibody Screening on high-density filters of an arrayed cDNA library. Nucleic Acids Research, 26, 5007-5008; Büssow, K., Nordhoff, E., Lübbert, C., Lehrach, H. and Walter, G.
(2000) A human cDNA library for high-throughput protein expression Screening. Genomics, 65, 1-8; Holz, C., Lueking, A., Bovekamp, L., Gut jähr, C., Bolotina, N., Lehrach, H. and Cahill, D.J. (2001) A human cDNA expression library in yeast enriched for open reading frames. Genome Res, 11, 1730-1735; Lueking, A., Holz, C., Gotthold, C., Lehrach, H. and Cahill, D. (2000) A System for dual protein expression in Pichia pastoris and Escherichia coli, Protein Expr. Purif., 20, 372- 378) . Hierbei wird die cDNA eines bestimmten Gewebes in einen bakteriellen oder einen eukaryotischen Expressionsvektor, wie z.B. Hefe, einkloniert. Die für die Expression verwendeten Vektoren zeichnen sich im Allgemeinen dadurch aus, dass sie induzierbare Promotoren tragen, mit denen sich der Zeitpunkt der Proteinexpression steuern lässt. Darüber hinaus weisen Expressionsvektoren Sequenzen für so genannte
Affinitätsepitope oder -proteine auf, die zum einen den spezifischen Nachweis der rekombinanten Fusions-Proteine mittels eines gegen das Äffinitätsepitop gerichteten
Antikörpers erlauben, zum anderen wird die spezifische
Aufreinigung über Affinitätschromatographie (IMAC) ermöglicht. Beispielsweise wurden die Genprodukte einer cDNA- Expressionsbibliothek aus humanem fötalem Hirngewebe in dem bakteriellen Expressionssystem Escherichia coli im Hochdichte- Format auf einer Membran angeordnet und konnten erfolgreich mit unterschiedlichen Antikörpern gescreent werden. Es konnte gezeigt werden, dass der Anteil an Volllänge-Proteinen bei mindestens 66% liegt. Die rekombinanten Proteine aus
Expressionsbibliothek konnten darüber hinaus im Hochdurchsatz exprimiert und aufgereinigt werden (Braun P., Hu, Y., Shen, B., Halleck, A., Koundinya, M., Harlow, E. and LaBaer, J.
(2002) Proteome-scale purification of human proteins from bacteria. Proc Natl Acad Sei U S A, 99, 2654-2659; Büssow (2000) supra; Lueking, A., Horn, M., Eickhoff, H., Büssow, K., Lehrach, H. and Walter, G. (1999) Protein microarrays for gene expression and antibody Screening. Analytical Biochemistry,
270, 103-111) . Solche Proteinbiochips auf der Basis von cDNA- Expressionsbibliotheken sind insbesondere Gegenstand der WO 99/57311 und WO 99/57312.
Auger et al . (2009) Annais of the Rheumatic Diseases, British Medical Association, London, GB, Bd. 68, Nr. 4, S. 591-594 offenbart ein Verfahren zur Identifizierung von IgG
Autoantikörpern in Seren von Patienten mit Rheumatoider
Arthritis (RA) . Dabei werden Serumproben von Patienten mit RA mit denen von gesunden Kontrollpersonen auf dem Invitrogen ProtoArray (8268 humane Proteine als GST Fusionsproteine, unter nativen Bedingungen gereinigt und gespottet auf eine Nitrocellulose beschichtete Glasplatte) vergleichend
untersucht. Die Arrays werden mit den Serumproben inkubiert und über Alexa Fluor 647 konjugiert an anti-human IgG
nachgewiesen. Die Auswertung eines Panels von Messwerten erfolgt über Z-Score, CIP (Chebyshev Inequality Precision) und CV (Coefficient of Variation) . In Auger et al . wurden mit diesem Verfahren die Antigene Peptidyl Arginin Deiminase 4 (PÄD4 ) , Protein Kinase Cßl (PKCßl), Phosphatidylinositol-4- Phosphate-5-Kinase Typ II γ (PIP4K2C) und v raf murine sarcoma viral oncogene homologue Bl catalytic domain (BRAF)
identifiziert. Auger et al . offenbart nicht die diagnostische Verwendung der identifizierten Antigene.
EP 1 731 608 AI offenbart eine Methode, „RA anfällige Gene" durch Gene Mapping mit Hilfe von Mikrosatellit Markern und PCR Technik zu identifizieren. Mit Hilfe des Verfahrens wurden die Gene TNXB, NOTCH4 (Chromosome 6), RAB6A, MPRL48, FLJ11848, UCP2 und UCP3 (Chromosom 11) in humaner genomischer DNA gefunden. EP 1 731 608 AI beansprucht ein Markergen für einen RA Test bestehend aus einer partiellen DNA Sequenz eines der gefunden Markergene und umfassend mindestens ein SNP in der humanen genomischen DNA. Außerdem ein Verfahren zum Nachweis von RA umfassend die Gewinnung von partiellen DNA Sequenzen, die zu einem der Markergene korrespondieren von einem zu untersuchenden Subjekt, Bestimmung der Nukleotidsequenz der partiellen DNA Sequenz und Vergleich der Nukleotidsequenz mit der korrespondierenden Nukleotidsequenz , die von einem
normalen Individuum erhalten wurde. Weiterhin einen Test Kit für RA umfassend eines der Markergene oder eines davon
abgeleiteten Primers, ein Polypeptid kodiert durch eines der Markergene und ein Screeningverfahren . WO 2009/138408 A2 beansprucht ein diagnostisches Verfahren, bei dem ein Autoantigen-Marker, der die katalytische Domaine von BRAF oder ein Antikörper Fragment davon umfasst, zum
Nachweis von RA verwendet wird und wobei ggf. auch anti-PAD4 Antikörper in der biologischen Probe des zu untersuchenden Subjekts detektiert werden. Ferner offenbart WO 2009/138408 A2 einen Detektionskit zum Nachweis von anti-BRAF Autoantikörpern, einen Array mit Autoantigenmarkern umfassend BRAF und PAD4 zur Diagnose von RA und die Verwendung eines Autoantigen Markers umfassend BRAF zur Diagnose von RA, vorzugsweise in Patienten, die CCP negativ sind (S. 3, Abs. 1) .
In WO 2009/138408 A2 wurden die Biomarker dadurch
identifiziert, dass Serum von RA Patienten und Kontrollen (Patienten mit Spondylarthropathy (AS) ) , Systemic lupus erythematosus (SLE) , Systemic sclerosis (SSC) und Gesunden) mit dem ProtoArray Human Protein Microarray (Invitrogen) gescreent wurden, wobei der Nachweis mittels anti-human IgG konjugiert an Alex Fluor 647 erfolgte. Ein Panel von
Messwerten wurde über Z-Score, CIP und CV ausgewertet.
WO 2007/039280 AI beansprucht ein Verfahren zur
differentiellen Diagnose von RA durch Bestimmung der
Konzentration von anti-CCP und antinuclear Antikörpern in einer Probe und Korrelation mit der Diagnose von RA. Dabei können zusätzlich die Marker CRP, SAA, IL-6, S100,
Osteopontin, RF, MMP-1, MMP-3, Haluronsäure , sCD14,
Angiogenese Marker und Produkte aus dem Metabolismus von
Knochen, Knorpel oder Synovial Membran verwendet werden. WO 2007/039280 AI beansprucht ferner die Verwendung eines Panels umfassend anti-CCP und ANA zur Diagnose von RA und einen Test- Kit . Nicaise et al . (2008) Arthritis Research Therapy, Biomed
Central LTD, GB, Bd. 10, Nr. 6, S. R142-R142.7 untersucht die Eignung von anti-MCV (mutated citrullinated vimentin)
Antikörpern für die Diagnose von RA in CCP-negativen Patienten und die Verwendung zur Überwachung während einer Therapie mit Infliximab. Dabei werden Gruppen von Patienten mit RA und CCP und mit RA und ohne CCP, Patienten mit anderen rheumatischen Erkrankungen (Psoriatic Rheumatism, Primary Sjögren Syndrom, Ankylosis Spondylitis) und gesunde Kontrollpersonen
verglichen. Die Verwendung eines Arrays/einer Anordnung wird nicht beschrieben. Vossenaar et al . (2004) Clinical and Applied Immunology
Reviews 4, 239-262 betrifft die Verwendung von citrullinierten Autoantigenen und von anti-CCP Antikörpern und deren Antigenen als serologische Marker zum Nachweis von RA. Vossenaar et al . schlägt vor, die Mikroarray Technologie anzuwenden, um
Autoantikörper Profile von RA Patienten zu analysieren (S. 254, Abs . 2) .
US 2007/0254300 AI verwendet ein Yeast Two-Hybrid System, um anti-inflammatorische Verbindungen zu identifizieren ([0504] bis [0506]) und beansprucht einen Proteinkomplex, wobei das erste Protein PAK, ein Fragment davon oder ein Fusionsprotein enthaltend dieses ist und das zweite Protein ERK3, PRKAR1A, KRT23(209), PN7098, AL117237, PCNT2, PROX1, HOOK1, IGHG1, GOLGA2, KIAA0555, LRPPRC oder ein Fragment von diesen
Proteinen ist. US 2007/0254300 AI offenbart auch einen
Mikroarray, der diesen Proteinkomplex umfasst und ein
Verfahren, um damit „Modulatoren" des Proteinkomplexes zu finden. Es wird auch ein Verfahren zum Nachweis einer
Veränderung in einer entzündlichen Erkrankung, beispielsweise RA, beansprucht und wobei die Probe eines Patienten
dahingehend untersucht wird, ob eine Veränderung in dem
Expressionslevel eines der Proteine in den Tabellen 1 bis 82 (82 verschiedene Proteine sind hier genannt) oder in der Nukleotidsequenz eines Gen, das für die 82 Proteine kodiert, im Vergleich zu Patienten ohne diese entzündliche Erkrankung, festgestellt wird. WO 2009/030226 offenbart Markersequenzen für Rheumatoide
Arthritis und deren diagnostische Verwendung samt einem
Verfahren zum Screenen von potentiellen Wirkstoffen für
Rheumatoide Arthritis mittels dieser Markersequenzen. Ferner eine diagnostische Vorrichtung enthaltend solche
Markersequenzen für Rheumatoide Arthritis, insbesondere einen Proteinbiochip und dessen Verwendung.
DE 10 2007 041 656 AI offenbart die Verwendung von
Markersequenzen zur Diagnose von RA, Verfahren zur Diagnose von RA unter Verwendung dieser Markersequenzen, Verfahren zum Stratifizieren, eine Anordnung von Markersequenzen, einen Assay/Proteinbiochip, die Verwendung der Anordnung,
Diagnostika umfassend die Markersequenzen, ein Target zur Behandlung und Therapie und die Verwendung der Markersequenzen zur Durchführung einer Apherese.
Die RA-spezifischen Expressionsklone wurden in DE 10 2007 041 656 AI dadurch erhalten, dass 10 oder mehr Patientenproben individuell gegen eine cDNA Expressionsbibliothek gescreent und durch einen Vergleich mit 10 oder mehr gesunden Proben identifiziert wurden. In Fig. 1 wird das differentielle
Screenen zwischen zwei Proteinbiochips aus jeweils einer cDNA- Expressionsbank eines Patienten und einem gesunden Probanden gezeigt. Die differentiellen Klone werden mittels
Fluoresenzmarkierung nachgewiesen und bioinformatisch
ausgewertet.
Es besteht weiterhin ein hohes Bedürfnis an
indikationsspezifischen diagnostischen Vorrichtungen für
Rheumatoide Arthritis. Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher das Auffinden von besseren Markersequenzen für Rheumatoide Arthritis und deren diagnostische Verwendung.
Die Bereitstellung von spezifischen Markersequenzen erlaubt eine sichere Diagnose und Stratifizierung von Patienten mit Rheumatoider Arthritis (RA) , besonders vorteilhaft bei
seronegativen RA-Patienten .
In einem mehrstufigen Verfahren umfassend zunächst die Auswahl von Markersequenz-Kandidaten mit Hilfe von Proteinbiochips und deren anschließende Validierung mittels Beads werden
hochspezifische Markersequenzen für Rheumatoide Arthritis gefunden .
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung von Markersequenzen für Rheumatoide Arthritis (RA) , umfassend die Schritte: a) Serumproben von RA Patienten werden mit mehr als 5.000 an (Luminex-) Beads gekoppelten Antigenen in Kontakt gebracht, die Bindung der einzelnen Antigene an Proteine im Serum der RA Patienten durch Immunfluoreszenzassay gemessen und die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI = median fluorescence intensity) für jedes einzelne Antigen bestimmt;
b) Serumproben von Gesunden werden mit denselben an (Luminex- ) Beads gekoppelten Antigenen in Kontakt gebracht, die
Bindung der einzelnen Antigene an Proteine im Serum von Gesunden durch Immunfluoreszenzassay gemessen und daraus die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI = median fluorescence intensity) für jedes einzelne Antigen bestimmt;
c) die MFI Daten jedes einzelnen Antigens aus a) und b) werden statistisch mittels univariater Analyse ausgewertet und dadurch Marker identifiziert, mit denen RA-Patienten von Gesunden differenziert werden können;
d) und wobei die Marker ausgewählt werden aus den Sequenzen SEQ ID o. 1 bis 84, Teilsequenzen oder Fragmente davon,
Homologen der Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 84 mit mindestens
90 % Homologie.
Im Bereich der Mikroarrays werden ebene Substrate verwendet, an die Markersequenzen oder zu untersuchende Sequenzen
gebunden sind. In Proteinbiochips sind die zu untersuchenden Markersequenzen oder die an diese Markersequenzen bindenden
Sequenzen auf einem festen, ebenen Träger immobilisiert. Eine alternative Anordnung oder Panel von Markersequenzen oder zu untersuchenden Sequenzen ist auf Beads möglich, die sich deshalb unter anderem hinsichtlich ihrer Sensitivität und Spezifität von herkömmlichen Mikroarrays unterscheiden. Bead Arrays werden beispielsweise durch Imprägnieren von Kügelchen entweder mit unterschiedlichen Konzentrationen an
Fluoreszenzfarbstoff oder z.B. durch Strichcode-Technologie erstellt. Die Kügelchen sind adressierbar und können verwendet werden, um spezifische Bindungsereignisse, die auf ihrer
Oberfläche auftreten, zu identifizieren. Grundlage der Bead- Technologie sind mikroskopisch kleine sphärische Kügelchen oder Plättchen, die Mikrosphären oder Beads genannt werden. Diese Beads können analog zu ELISA und Western Blot als
Festphase für biochemische Nachweisreaktionen dienen. Es sind verschiedenste Bead-Typen verfügbar, die sich beispielsweise in ihrem Fluoreszenzfarbton unterscheiden und von denen jeder ein eigenes spezifisches Nachweisreagenz auf der Oberfläche trägt. Auf diese Weise können entsprechend viele verschiedene Nachweisreaktionen in einem sehr geringen Probenvolumen simultan durchgeführt werden. Mit Bead Arrays sind spezifische Interaktion zweier definierter biochemischer Verbindungen nachweisbar. Im Vergleich zu herkömmlichen Mikroarrays
zeichnet sich die Bead-basierte Validierung durch eine
besonders hohe Sensitivität und Spezifität aus. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und der Verwendung von Beads zur Validierung können Markersequenzen für RA identifiziert werden, die sich hinsichtlich ihrer Sensitivität und
Spezifität von den bisher bekannten Markersequenzen
unterscheiden .
Gegenstand der Erfindung ist auch eine Markersequenz für
Rheumatoide Arthritis erhältlich durch ein erfindungsgemäßes Verfahren und wobei die Markersequenz ausgewählt wird aus der Gruppe der Sequenzen SEQ ID o. 1 bis 84, Teilsequenzen oder Fragmente davon, Homologen der Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 84 mit mindestens 90 % Homologie. Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung von einer oder mehreren erfindungsgemäßen Markersequenz (en) zur Diagnose von Rheumatoider Arthritis.
Eine Ausführungsform betrifft die erfindungsgemäße Verwendung, wobei die Markersequenz (en) an oder von einem zu
untersuchenden Patienten bestimmt wird/werden.
Eine Ausführungsform betrifft die erfindungsgemäße Verwendung dadurch gekennzeichnet, dass 2 oder 3, vorzugsweise 4 oder 5, besonders bevorzugt 6, 7 oder 8 oder mehr verschiedene
Markersequenzen, beispielsweise 10 bis 20 oder 30 oder mehr verschiedene Markersequenzen an oder von einem zu
untersuchenden Patienten bestimmt werden.
Eine Ausführungsform betrifft die erfindungsgemäße Verwendung dadurch gekennzeichnet, dass die Markersequenz (en) auf einen festen Träger aufgebracht wird/werden, wobei der feste Träger ausgewählt wird aus Filter, Membranen, Wafer, beispielsweise Silizium-Wafer, Glas, Metall, Kunststoff, Chips,
massenspektrometrische Targets, Matrix, Beads, beispielsweise magnetische, beschichtete oder markierte Beads, wie
Fluorophor-markierte Beads oder Luminex-Beads . Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Diagnose von Rheumatoider Arthritis, wobei a. ) mindestens eine erfindungsgemäße Markersequenz auf einen festen Träger, vorzugsweise auf ein Bead aufgebracht wird und b. ) mit Körperflüssigkeit oder Gewebeauszug eines Patienten in Kontakt gebracht wird und
c. ) der Nachweis einer Wechselwirkung der Körperflüssigkeit oder des Gewebeauszugs mit der Markersequenz aus a.) erfolgt.
Der Nachweis einer solchen Wechselwirkung kann beispielsweise durch eine Sonde, insbesondere durch einen Antikörper
erfolgen.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zum
Stratifizieren, insbesondere zur Risikostratifizierung, oder zur Therapiesteuerung eines Patienten mit Rheumatoider
Arthritis, wobei mindestens eine erfindungsgemäße
Markersequenz verwendet wird, um eine Probe des Patienten zu untersuchen .
Eine Ausführungsform betrifft ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Diagnose von Rheumatoider Arthritis, wobei das
Stratifizieren oder die Therapiesteuerung Entscheidungen zur Behandlung und Therapie des Patienten, insbesondere
Hospitalisierung des Patienten, Einsatz, Wirkung und / oder Dosierung eines oder mehrerer Arzneimittel, eine
therapeutische Maßnahme oder die Überwachung eines
Krankheitsverlaufes sowie Therapieverlaufs, Ätiologie oder Klassifizierung einer Erkrankung samt Prognose umfasst. Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls eine Anordnung oder Panel umfassend oder bestehend aus ein oder mehreren
erfindungsgemäße Markersequenz (en) .
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein Assay oder
Proteinarray umfassend eine erfindungsgemäße Anordnung oder Panel .
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung einer
erfindungsgemäßen Anordnung / Panel oder eines
erfindungsgemäßen Assays oder Proteinarrays zur
Identifizierung und/oder Charakterisierung einer Substanz für Rheumatoide Arthritis enthaltend Mittel zum Nachweis eines Bindungserfolges, dadurch gekennzeichnet, dass eine Anordnung / Panel oder ein Assay oder Proteinarray mit a.) mindestens einer zu untersuchenden Substanz in Kontakt gebracht wird und b.) ein Bindungserfolg nachgewiesen wird.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Diagnostikum zur
Diagnose von Rheumatoider Arthritis enthaltend mindestens eine erfindungsgemäße Markersequenz und gegebenenfalls weitere Hilfs- und Zusatzstoffe. Gegenstand der Erfindung ist auch ein Target zur Behandlung oder Therapie von Rheumatoider Arthritis, wobei das Target aus den erfindungsgemäßen Markersequenzen ausgewählt wird.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung mindestens einer erfindungsgemäßen Markersequenz zur Identifizierung einer Subgruppe von Patienten innerhalb der Gruppe der
Patienten mit Rheumatoider Arthritis, wobei die Patienten der Subgruppe nicht mittels des Markers CCP und/oder nicht mit den im Stand der Technik bekannten Markern beziehungsweise
Markersequenzen für Rheumatoide Arthritis identifiziert werden können. Daher betrifft die Erfindung die Verwendung von
Markersequenzen zur Diagnose von Rheumatoider Arthritis, wobei mindestens eine Markersequenz ausgewählt aus der Gruppe der Markersequenzen SEQ ID o. 1 bis 84 und / oder der genomischen Sequenzen, die eine der Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 42 und / oder ein durch die Sequenzen SEQ ID No . 43 bis 84 kodiertes Protein, Teilsequenzen oder Fragmente davon, Homologen der Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 84 mit mindestens 90 % Homologie an oder von einem zu untersuchenden Patienten bestimmt wird. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die
Verwendung der erfindungsgemäßen Markersequenz (en) zur Diagnose von Rheumatoider Arthritis, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung mittels in-vitro Diagnose erfolgt.
Die erfindungsgemäßen Markersequenzen konnten mittels
differentiellem Screening von Proben von gesunden Probanden mit Patientenproben mit Rheumatoider Arthritis identifiziert werden. Die erfindungsgemäßen Markersequenzen wurden
exprimiert und nach Kopplung der exprimierten Markersequenz- Kandidaten an Luminex-Beads mit Hilfe der Luminex-Beads validiert, z.T. vergleichend gegen bekannte Biomarker für Rheumatoide Arthritis. Dadurch konnten hochspezifische
Markersequenzen für Rheumatoide Arthritis identifiziert werden .
„Beads" (Perlen, Kügelchen, ursprünglich auch Latex-Partikel genannt) bezeichnen sogenannte Mikrosphären oder
Mikropartikel , die als Träger für Biomoleküle in Tests und Assays eingesetzt werden. Für Tests und Assays werden uniforme (etwa gleichgroße) Mikropartikel benötigt, die über spezielle chemische Verfahren hergestellt werden. Diese Verfahren sind dem Fachmann bekannt. Beads für unterschiedliche Anwendungen sind auch kommerziell erhältlich (z.B. Fa. Progen Biotechnik GmbH) . Beads können aus unterschiedlichen Materialien bestehen, beispielsweise Glas, Polystyrol, PMMA und
verschiedenen anderen, zum Teil auch Kopolymeren. Beads können mit unterschiedlichen Farbstoffen oder Farbstoffgemischen markiert werden und mit Coatings versehen werden. An ihre
Oberfläche können Biomoleküle gekoppelt werden. Dafür stehen unterschiedliche Kopplungsmethoden zur Verfügung, die dem Fachmann bekannt sind, beispielsweise Adsorption oder
kovalente Kopplung. Die Oberfläche der Beads kann modifiziert sein, so dass eine gerichtet Kopplung der Biomoleküle auf der Bead-Oberfläche, z.B. in Verbindung mit Spacern, Tags oder speziellen Modifikationen möglich ist und wodurch die
analytische Sensitivität weiter erhöht werden kann.
Der Begriff „Rheumatoide Arthritis (RA)" ist z.B. nach
Pschyrembel, de Gruyter, 261. Auflage (2007), Berlin
definiert. Erfindungsgemäß umfasst ist ebenfalls die „juvenile idiopathische Arthritis " (ICD-10: M08.-. Abk.: JIA. Ältere Synonyme: Juvenile rheumatoide Arthritis, Juvenile chronische Arthritis, Morbus Still oder volkstümlicher: kindliches
Rheuma) , die eine Sammelbezeichnung für eine Reihe von
vorwiegend gelenkbefallenden Erkrankungen (Arthritis) des rheumatischen Formenkreises im Kindesalter (juvenil)
(Definition z.B. nach Pschyrembel, de Gruyter, 261. Auflage (2007), Berlin) . Es handelt sich hierbei um eine polygene Erkrankung, die mittels der erfindungsgemäßen Markersequenzen, vorzugsweise SEQ ID o. 1 bis 84 besonders vorteilhaft
diagnostiziert werden kann.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die erfindungsgemäßen Markersequenzen ebenfalls mit bekannten Biomarker für diese Indikation kombiniert, ergänzt, fusioniert oder erweitert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bestimmung der Markersequenzen außerhalb des menschlichen Körpers und die Bestimmung erfolgt in einer ex vivo / in vitro Diagnose.
„Diagnose" im Sinne dieser Erfindung bedeutet die positive Feststellung von Rheumatoider Arthritis mittels der
erfindungsgemäßen Markersequenzen sowie die Zuordnung der Patienten zur Indikation Rheumatoide Arthritis. Der Begriff der Diagnose umfasst die medizinische Diagnostik und
diesbezügliche Untersuchungen, insbesondere die in-vitro Diagnostik und Labordiagnostik, ebenfalls Proteomics und
Nukleinsäureblots . Weitere Untersuchungen können zur
Absicherung und zum Ausschluss anderen Krankheiten vonnöten sein. Daher umfasst der Begriff Diagnose ebenfalls die
Differentialdiagnose von Rheumatoider Arthritis mittels der erfindungsgemäßen Markersequenzen sowie die Prognose bei festgestellter Rheumatoider Arthritis.
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum
Stratifizieren, insbesondere zur Risikostratifizierung und / oder Therapiesteuerung eines Patienten mit Rheumatoider
Arthritis, beispielsweise bei einem Patienten mit einem sehr frühen Stadium von RA oder RA, dass nicht mittels des Markers CCP nachgewiesen werden kann, wobei mindestens eine
erfindungsgemäße Markersequenz an einem zu untersuchenden Patienten bestimmt wird. Umfasst ist ebenfalls die
Stratifizierung der Patienten mit Rheumatoider Arthritis in neue oder etablierte Subgruppen innerhalb der Erkrankung
Rheumatoide Arthritis, sowie die sinnvolle Auswahl von
Patientengruppen für die klinische Entwicklung von neuen
Therapeutika oder die Auswahl für die Therapie mit bestimmten Wirkstoffen. Der Begriff Therapiesteuerung umfasst ebenfalls die Einteilung von Patienten in Responder und Nicht-Responder bezüglich einer Therapie oder dessen Therapieverlauf. „Stratifizieren (auch: Stratifikation) oder Therapiesteuerung" im Sinne dieser Erfindung bedeutet, dass das erfindungsgemäße Verfahren Entscheidungen zur Behandlung und Therapie des
Patienten erlaubt, sei es Hospitalisierung des Patienten, Einsatz, Wirkung und / oder Dosierung eines oder mehrerer Arzneimittel, eine therapeutische Maßnahme oder die
Überwachung eines Krankheitsverlaufes sowie des
Therapieverlaufs bzw. Ätiologie oder Klassifizierung von RA, z.B. in einen neuen oder bestehenden Subtyp oder die
Differenzierung von RA und den betreffenden Patienten.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst der Begriff „Stratifizierung" insbesondere die
Risikostratifizierung mit der Prognose eines „outcome" eines nachteiligen gesundheitlichen Ereignisses. Im Rahmen dieser Erfindung wird unter „Patient" ein beliebiger Proband - Mensch oder Säugetier - verstanden, mit der Maßgabe, dass der Proband auf Rheumatoide Arthritis untersucht wird.
Der Begriff „Markersequenzen" im Sinne dieser Erfindung bedeutet, dass die Nukeinsäuresequenz , beispielsweise die mRNA, cDNA oder das jeweils daraus erhältliche Polypeptid oder Protein signifikant für Rheumatoide Arthritis sind.
Beispielsweise können die mRNA oder cDNA oder das jeweils daraus erhältliche Polypeptid oder Protein eine Wechselwirkung mit Substanzen aus der Körperflüssigkeit oder Gewebeauszug eines Patienten mit Rheumatoider Arthritis aufweisen (z.B. (Auto) Antigen (Epitop) / (Auto) Antikörper (Paratop)
Wechselwirkung) .
Im Sinne der Erfindung bedeutet „wobei mindestens eine
Markersequenz ausgewählt aus der Gruppe der Markersequenzen SEQ ID o. 1 bis 84 und / oder der genomischen Sequenzen, die eine der Sequenzen SEQ ID o. 1 bis 42 und / oder ein durch die Sequenzen SEQ ID No . 43 bis 84 kodiertes Protein,
Teilsequenzen oder Fragmente davon, Homologen der Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 84 mit mindestens 90 % Homologie
an oder von einem zu untersuchenden Patienten bestimmt wird", dass eine Wechselwirkung zwischen der Körperflüssigkeit oder dem Gewebeauszug eines Patienten und der/den erfindungsgemäßen Markersequenzen nachgewiesen wird. Eine solche Wechselwirkung ist z.B. eine Bindung, insbesondere eine bindende Substanz an mindestens eine der erfindungsgemäßen Markersequenzen oder im Fall einer cDNA die Hybridisierung mit einer geeigneten
Substanz unter gewählten Bedingungen, insbesondere stringenten Bedingungen (z.B. wie üblich definiert in J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd Edition, Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Habor, USA oder Ausubel, "Current Protocols in
Molecular Biology", Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)). Ein Beispiel für stringente
Hybridisierungsbedingungen ist: Hybridisierung in 4 x SSC bei 65° C (alternativ in 50% Formamid und 4 X SSC bei 42° C) , gefolgt von mehreren Waschschritten in 0,1 x SSC bei 65°C für insgesamt etwa eine Stunde. Ein Beispiel für wenig stringente Hybridisierungsbedingungen ist Hybridisierung in 4 x SSC bei 37° C, gefolgt von mehreren Waschritten in 1 x SSC bei
Raumtemperatur.
Solche Substanzen sind erfindungsgemäß Bestandteil einer Körperflüssigkeit, insbesondere Blut, Vollblut, Blutplasma, Blutserum, Patientenserum, Urin, Cerebrospinalflüssigkeit , Synovialflüssigkeit oder eines Gewebeauszuges des Patienten. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die erfindungsgemäßen Markersequenzen in einer signifikant höheren oder niedrigeren Expressionsrate oder Konzentration in dem untersuchten Probanden vorliegen, im Vergleich zu der Expressionsrate oder Konzentration der betreffenden
Markersequenz in einem Gesunden bzw. einem Probanden ohne RA. Die erhöhte bzw. erniedrigte Expressionsrat oder Konzentration ist ein Hinweis auf Rheumatoide Arthritis und die Diagnose RA. Die relativen Expressionsraten krank / gesund der
erfindungsgemäßen Markersequenzen können beispielsweise mittels Proteomics oder Nukleinsäureblots bestimmt werden.
Die erfindungsgemäßen Markersequenzen verfügen in einer weiteren Ausführungsform der Erfindung über ein
Erkennungssignal, welches an die zu bindende Substanz
adressiert ist (z.B. Antikörper, Nukleinsäure).
Erfindungsgemäß bevorzugt ist für ein Protein das
Erkennungssignal Epitop und / oder Paratop und / oder Hapten und für eine cDNA eine Hybridisierungs- oder Bindungsregion.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung erkennen die erfindungsgemäßen Markersequenzen Autoantikörper, die für RA spezifisch sind bzw. die bei der Entstehung und dem
Fortschreiten der RA Erkrankung gebildet werden und/oder verstärkt bzw. verringert gebildet werden. Zwei oder mehr erfindungsgemäße Markersequenzen können verwendet werden, um Autoantikörperprofile nachzuweisen bzw. Veränderungen in
Autoantikörperprofilen während einer Therapie oder des
Krankheitsverlaufs oder im Rahmen der Nachsorge zu überwachen. Die erfindungsgemäßen Markersequenzen SEQ ID No. 1 bis 84 sind Gegenstand der Tabelle 1 und können durch den jeweilig
zitierten Datenbankeintrag (auch mittels Internet:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) eindeutig identifiziert werden (siehe RefSeq Accession bzw. Gl Accession) . Daher betrifft die Erfindung ebenfalls die Volllängesequenzen der erfindungsgemäßen Markersequenzen und die Markersequenzen wie in den Tabellen über die bekannten Datenbankeinträge definiert sowie die im anliegenden Sequenzprotokoll
angegebenen Markersequenzen.
Weiterhin umfasst sind ebenfalls analoge Ausführungsformen der Markersequenzen, insbesondere der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID No . 1 bis 42 und der Proteinsequenzen SEQ ID No . 43 bis 84.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind
Markersequenzen bevorzugt, die P-Werte kleiner oder gleich 0.006 aufweisen, vorzugsweise kleiner oder gleich 0.001 oder kleiner oder gleich 0.0001, besonders bevorzugt kleiner oder gleich 0.00001 (siehe Tabellen 2 und 3).
Ganz besonders bevorzugt ist SEQ ID No . 4 und 46 (DCTN1), wobei eine Reaktivität in allen Patientenkohorten vorliegt. Weiterhin bevorzugt sind SEQ ID No. 5 und 47 (GNPTG) , SEQ ID No. 6 und 48 (HNRNPA1), SEQ ID No . 7 und 49 (ITFG3).
Weiterhin ist bevorzugt eine Anordnung oder Panel enthaltend mindestens eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID No. 4 und 46 (DCTN1), SEQ ID No . 5 und 47 (GNPTG), SEQ ID No . 6 und 48 (HNRNPA1) und SEQ ID No . 7 und 49 (ITFG3) und ggfs. weitere erfindungsgemäße Markersequenzen.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind Homologe der erfindungsgemäßen Markersequenzen umfasst. Insbesondere solche Homologen, die eine Identität von 70 %, 80 % oder 85 %, vorzugsweise 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % oder 95% Identität, insbesondere 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder mehr Identität mit den erfindungsgemäßen Markersequenzen aufweisen und für die erfindungsgemäße Verwendung - den Nachweis von Rheumatoider Arthritis geeignet sind (sog. „Homologe", homologe
Markersequenzen) . Homologe können Protein- oder
Nukleinsäuresequenzen sein. Teilsequenzen oder Fragmente sind solche Sequenzen, die 50 bis 100 Nukleotide oder Aminosäuren, vorzugsweise 70-120
Nukleotide oder Aminosäuren, besonders bevorzugt 100 bis 200 Nukleotide oder Aminosäuren einer der Markersequenzen SEQ ID No . 1 bis 84 aufweisen.
Erfindungsgemäß umfassen die Markersequenzen auch solche
Modifikationen der Nukleotidsequenz , beispielsweise der cDNA- Sequenz und der entsprechenden Aminosäuresequenz, wie
chemische Modifikation, beispielsweise Citrullinierung,
Acetylierung, Phosphorylierung, Glykosilierung oder polyA- Strang und weiteren dem Fachmann einschlägig bekannte
Modifikationen .
In einer weiteren Ausführungsform kann die jeweilige
Markersequenz in unterschiedlichen Mengen in einem oder mehreren Bereichen auf einem festen Träger, beispielsweise einem Bead repräsentiert sein. Dies erlaubt eine Variation der Sensitivität . Die Bereiche können jeweils eine Gesamtheit von Markersequenzen aufweisen, d.h. eine genügende Zahl an
verschiedenen Markersequenzen, insbesondere 2 bis 5 oder 10 oder mehr Markersequenzen und ggfs. weitere Nukleinsäuren und/oder Proteine, insbesondere Biomarker. Bevorzugt sind jedoch mindestens 96 bis 25.000 (numerisch) oder mehr aus verschiedenen oder gleichen Markersequenzen und weiteren
Nukleinsäuren und/oder Proteinen, insbesondere Biomarkern. Weiterhin bevorzugt sind mehr als 2.500, besonders bevorzugt
10.000 oder mehr verschiedene oder gleiche Markersequenzen und ggfs. weitere Nukleinsäuren und/oder Proteine, insbesondere Biomarker .
Im Rahmen dieser Erfindung bedeutet „Anordnung" oder „Panel" synonym „Array" und sofern dieser „Array" zur Identifizierung von zu bindenden Substanzen an Markersequenzen verwendet wird, ist hierunter ein „Assay" oder eine diagnostische Vorrichtung zu verstehen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Anordnung derart gestaltet, dass die auf der Anordnung
repräsentierten Markersequenzen in Form eines Gitters auf einem festen Träger vorliegen. Ferner sind solche Anordnungen bevorzugt, die eine hochdichte (high-density) Anordnung von Markersequenzen erlauben und die Markersequenzen gespottet werden. Solche hochdichte gespotteten Anordnungen sind
beispielsweise in der WO 99/57311 und WO 99/57312 offenbart und können vorteilhaft in einem robotergestützten
automatisierten High-Throughput Verfahren zur Anwendung kommen .
Im Rahmen dieser Erfindung umfasst der Begriff „Assay" oder diagnostische Vorrichtung ebenfalls solche Ausführungsformen einer Vorrichtung, wie ELISA (z.B. einzelne Wells einer
Mikrotiterplatte werden mit den erfindungsgemäßen
Markersequenzen oder Kombinationen von Markersequenzen
beschichtet, ggfs. robotergestützt in die einzelnen Wells der Mikrotiterplatte aufgebracht; Beispiele sind diagnostische ELISA-Kits der Fa. Phadia oder Multiplex-ELISA-Kits
„Searchlight" der Fa. Pierce/Thermo Fisher Scientific), Bead- based Assay (spektral unterscheidbare bead-Populationen werden mit Markersequenzen/Kombinationen von Markersequenzen
beschichtet. Die Patientenprobe wird mit dieser bead- Population inkubiert und gebundene (Auto-) -Antikörper werden mittels eines weiteren Fluoreszenz-markierten
Sekundärantikörpers oder ein Detektionsreagenz über Messung der Fluoreszenz nachgewiesen; z. B. Borrelia IgG-Kit oder Athena-Multilyte der Fa. Multimetrix) , Line Assay
(erfindungsgemäßen Markersequenzen oder Kombinationen von Markersequenzen werden robotergestützt auf Membranen
immobilisiert, welche mit der Patientenprobe untersucht beziehungsweise inkubiert werden; Beispiel „Euroline" der Fa. Euroimmun AG), Western Blot (Beispiel „Euroline-WB" der Fa. Euroimmun AG), immunchromatographische Verfahren (z.B. Lateral Flow Immunoassays ; Markersequenzen bzw. Kombinationen von Markersequenzen werden auf Teststreifen (Membranen, US
5,714,389 u.v.a) immobilisiert; Beispiel „One Step HBsAg" Test Device von Acon Laboratories) oder ähnliche immunologische Single- oder Multiplex-Nachweisverfahren . Daher betrifft die Erfindung ebenfalls die Aufgabe eine diagnostische Vorrichtung oder einen Assay, insbesondere einen Proteinbiochip, bereitzustellen, der für die Rheumatoide
Arthritis eine Diagnose oder Untersuchung erlaubt.
Zur Lösung dieser Aufgabe sind die erfindungsgemäßen
Markersequenzen der Anordnung oder Panel auf einen festen Träger fixiert, vorzugsweise jedoch gespottet oder
immobilisiert oder aufgedruckt, d.h. reproduzierbar
aufgebracht. Ein oder mehrere Markersequenzen können mehrfach in der Gesamtheit aller Markersequenzen präsent sein und in unterschiedlichen Mengen bezogen auf einen Spot vorliegen. Ferner können die Markersequenzen auf dem festen Träger standardisiert sein (z.B. mittels serieller Verdünnungsreihen von z.B. Humanglobulinen als interne Kaiibratoren zur
Datennormalisierung und quantitativen Auswertung) . Daher betrifft die Erfindung einen Assay oder Proteinbiochip oder ein oder mehrere Beads (Bead-basierter Assay) bestehend aus einer Anordnung oder Panel enthaltend erfindungsgemäße Markersequenzen .
In einer weiteren Ausführungsform liegen die Markersequenzen als Klone vor. Solche Klone können beispielsweise mittels einer erfindungsgemäßen cDNA-Expressionsbibliothek erhalten werden (Büssow et al . 1998 (supra) ) . In einer bevorzugten Ausführungsform werden solche Expressionsbibliotheken
enthaltend Klone mittels Expressionsvektoren aus einer
exprimierenden cDNA Bibliothek bestehend aus den cDNA
Markersequenzen erhalten. Diese Expressionsvektoren enthalten vorzugsweise induzierbare Promotoren. Die Induktion der
Expression kann z.B. mittels eines Induktors, solche wie IPTG, erfolgen. Geeignete Expressionsvektoren sind beschrieben in Terpe et al . (Terpe T Appl Microbiol Biotechnol. 2003 Jan; 60 (5) : 523-33) .
Expressionsbibliotheken sind dem Fachmann bekannt, diese können nach Standardwerken, wie Sambrook et al, "Molecular Cloning, A laboratory handbook, 2nd edition (1989), CSH press, Cold Spring Harbor, New York hergestellt werden. Weiterhin bevorzugt sind solche Expressionsbibliotheken, die
gewebespezifisch sind (z.B. humanes Gewebe, insbesondere humane Organe) . Ferner sind erfindungsgemäß ebenfalls solche Expressionsbibliotheken mit eingeschlossen, die mittels exon- trapping erhalten werden können. Statt Expressionsbibliothek kann synonym von einer Expressionsbank gesprochen werden.
Weiterhin bevorzugt sind Proteinbiochips oder Beads oder entsprechende Expressionsbibliotheken, die keine Redundanz aufweisen (so genannte: UnicloneO-Bibliothek) und nach den Lehren der WO 99/57311 und WO 99/57312 beispielsweise
hergestellt werden können. Diese bevorzugten Uniclone-
Bibliotheken weisen einen hohen Anteil an nicht-fehlerhaften vollständig exprimierten Proteinen einer cDNA- Expressionsbibliothek auf.
Im Rahmen dieser Erfindung können die Klone ebenfalls nicht abschließend solche sein, wie transformierte Bakterien, rekombinante Phagen oder transformierte Zellen von Säugern, Insekten, Pilzen, Hefen oder Pflanzen.
Die Klone werden auf einen festen Träger fixiert, gespottet oder immobilisiert. Daher betrifft die Erfindung eine Anordnung, wobei die
Markersequenzen als Klone vorliegen.
Zusätzlich können die Markersequenzen in der jeweiligen Form in Form eines Fusionsproteins vorliegen, welches
beispielsweise mindestens ein Affinitätsepitop oder "Tag" enthält. Der Tag kann ein solcher sein wie wie c-myc, His-Tag, Arg-tag, FLAG, alkalische Phosphatase, V5-Tag, T7-Tag oder Strep-Tag, HAT-tag, NusA, S-tag, SBP-tag, Thioredoxin, DsbA, ein Fusionsprotein, vorzugsweise eine Cellulose-bindende
Domäne, grünfluoreszierendes Protein, Maltose bindendes
Protein, calmodulin-bindendes Protein, Glutathione S- transferase oder lacZ enthalten.
Eine Markersequenz kann sich auch aus mehreren einzelnen
Markersequenzen zusammensetzen. Dies kann die Klonierung einzelner Fragmente zu einem großen gemeinsamen Fragment und die Expression dieses kombinierten Fragmentes beinhalten.
In sämtlichen Ausführungsformen umfasst der Begriff "fester Träger" Ausführungen wie einen Filter, eine Membran, ein magnetisches oder Fluorophor-markiertes Kügelchen, ein
Silizium-Wafer, Glas, Metall, Kunststoff, ein Chip, ein massenspektrometrisches Target oder eine Matrix. Ein Filter und Beads sind jedoch erfindungsgemäß bevorzugt.
Als Filter ist weiterhin PVDF, Nitrocellulose oder Nylon bevorzugt (z.B. Immobilon P Millipore, Protran Whatman, Hybond N+ Amersham) . In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der
erfindungsgemäßen Anordnung entspricht diese einem Gitter, dass die Größenordnung einer Mikrotiterplatte (8-12 Wells Streifen, 96 Wells, 384 Wells oder mehr) , eines Silizium- Wafers, eines Chips, eines massenspektrometrischen Targets oder einer Matrix besitzt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden Kügelchen sogenannte Beads als Träger verwendet. Vorzugsweise werden dabei Bead-basierte multiplex Assays verwendet. Die Analyse und Auswertung der Bead-basierten Assays kann beispielsweise mit einem Luminex-Analysesystem erfolgen, welches auf der Methode der Durchflusszytometrie unter Verwendung zweier unterschiedlicher Laser durchgeführt wird.
Während die Messungen auf planaren Proteinarrays lediglich einen dynamischen Bereich von 1,5 - 2 Größenordnungen (10er
Potenzen) bieten, kann durch die Verwendung von Luminex-Beads ein dynamischer Bereich von 3,5-4 Größenordnungen abgedeckt werden. Wobei auch die Messungen in den niedrigen
Responsbereichen sehr gute Variationskoeffizienten (VKs) , d.h. nicht mehr als 10 % liefern.
Während die Messungen auf planaren Proteinarrays lediglich Variationskoeffizienten (VKs) von 10 bis 25 % (intra-Array Vergleich) bzw. 10 bis 50 % (inter-Array Vergleich) liefern, befinden sich die VKs der Luminex-Messungen zwischen 3 bis 10 %. Dadurch ergibt sich eine Assayqualität , die kommerzielle
ELISAS im Allgemeinen nicht erreichen. Die bekannten Nachteile (limitierte Plexing-Rate durch Interferenz unterschiedlicher Detektionsantikörper) für Luminex-basierte Analyse- und
Diagnostikverfahren treffen auf das UNIarray-Konzept nicht zu, da als Detektionssonde lediglich ein einziges
fluoreszenzmarkiertes anti—human IgG aus Ziege, Schaf oder Maus eingesetzt wird. Durch den Transfer des UNIarray- Konzeptes auf Luminex (also Bead-basierte Protein-Arrays ) können zusätzlich mehrere Geräte eingespart, d.h. Protein- Drucker, Hybridisiermaschine und Array-Reader, und durch ein Gerät ersetzt werden. Dabei ist das UNIarray-Konzept nicht an Luminex gebunden, sondern kann auch auf anderen Plattformen wie z.B. Randox, VBC-Genomics etc eingesetzt werden. Die hohe Messgenauigkeit und die niedrigen VKs der Einzelmessungen erlauben den Einsatz besserer und neuer statistischer
Verfahren zur Identifizierung von potenten Einzelmarkern sowie zur schnellen Aussortierung von Falschpositiven.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Assay oder Proteinbiochip zum Identifizieren und
Charakterisieren einer Substanz für Rheumatoide Arthritis, dadurch gekennzeichnet, dass eine erfindungsgemäße Anordnung oder Assay mit a.) mindestens einer zu untersuchenden Substanz in Kontakt gebracht wird und b.) ein Bindungserfolg
nachgewiesen wird. Die zu untersuchende Substanz kann ein beliebiges natives oder nicht-natives Biomolekül, ein
synthetisches chemisches Molekül, eine Mischung oder eine
Substanzbibliothek sein. Nachdem die zu untersuchende Substanz eine Markersequenz kontaktiert, erfolgt die Auswertung des Bindungserfolges, die beispielsweise unter Verwendung mit handelsüblicher Image-Analyse Software (GenePix Pro (Axon Laboratories) , Aida (Raytest) , ScanArray (Packard Bioscience) erfolgt .
Die Visualisierung erfindungsgemäßer Protein-Protein- Wechselwirkungen (z.B. Protein an Markersequenz, wie
Antigen/Antikörper) oder entsprechende „Mittel zum Nachweis des Bindungserfolges" kann beispielsweise mittels
Fluoresenzmarkierung, Biotiniylierung, Radio-Isotopen- Markierung oder kolloidale Gold- oder Latex-Partikel- Markierung in üblicher Weise erfolgen. Ein Nachweis von gebundenen Antikörpern erfolgt mit Hilfe von sekundären
Antikörpern, die mit handelsüblichen Reportermolekülen
markiert sind (z.B. Cy-, Alexa-, Dyomics, FITC- oder ähnliche Fluoreszenzfarbstoffe, , kolloidale Gold- oder Latex- Partikel) , oder mit Reporter-Enzymen wie alkalischer
Phosphatase, Meerrettichperoxidase, usw. und den
entsprechenden colorimetrischen, fluoreszenten oder
chemolumineszenten Substraten. Eine Auslesung erfolgt z.B. mittels eines Microarray-Laserscanners , einer CCD-Kamera oder visuell .
Beispiele :
Beispiel 1: Auswahl der Markersequenz-Kandidaten und
Herstellung der Luminex-Beads Patientenkohorten wurden individuell gegen eine cDNA
Expressionsbibliothek gescreent. Die Identität der
Markersequenzen wurde durch DNA-Sequenzierung ermittelt.
Es wird ein differentielles Screenen zwischen zwei
Proteinbiochips aus jeweils einer cDNA-Expressionsbank eines Patienten und einem gesunden Probanden durchgeführt und die differentiellen Klone werden mittels Fluoresenzmarkierung nachgewiesen und bioinformatorisch ausgewertet.
Es wurden 6.000 Proteine in Untersuchungen mit Proteinbiochips einbezogen, die als Antigene für entzündlichen Erkrankungen detektiert wurden.
Diese 6.000 Proteine wurden daraufhin in größeren Mengen
(mehrere mg) hergestellt, gereinigt und auf Luminex-Beads gekoppelt. Zusätzlich wurden bereits bekannte Biomarker
(public domain) , wie z.B. CCP für Rheumatoide Arthritis, Aquaporin 4 für Neuromyolitis Optica, diverse Zytokine, typische Autoimmunmarker etc. hergestellt und zusammen mit den 6.000 Proteinen gemessen. Die Inklusion von bekannten
Autoantigen in Screening und Validierung ist insofern von Bedeutung als hierdurch sehr schnell die besten neuen
Kandidaten ausgewählt werden können.
Multiplex Bead-basierte Austoantikörper Detektion:
Die 6.000 Antigene wurden rekombinant in E.coli exprimiert und gereinigt. Hierzu wurden 5 cDNA Banken (oligo (dT) primed, His- Tag) aus Humangewebe herangezogen (u.a. Darm, Lunge, Leber)
(Büssow (1998), supra) und in den Expressionsvektor pQE30-NST einkloniert (ORFeome) (Rual J-F, Hirozane-Kishikawa T, Hao T, Bertin N, Li S, Dricot A, Li N, Rosenberg J, Lamesch P,
Vidalain P-O, Clingingsmith TR, Hartley JL, Esposito D, Cheo D, Moore T, Simmons B, Sequerra R, Bosak S, Doucette-Stamm L, Le Peuch C, Vandenhaute J, Cusick ME, Albala JS, Hill DE, Vidal M: Human ORFeome version 1.1: a platform for reverse proteomics. Genome Res 2004, 14:2128-2135). Rekombinante
Genexpression erfolgte in E. Coli SCSI mittels pSElll für verbesserte Expression von Humangenen (Brinkmann U, Mattes RE, Buckel P: High-level expression of recombinant genes in
Escherichia coli is dependent on the availability of the dnaY gene product . Gene 1989, 85:109-114). Proteine wurden aus geernteten und lysierten Zellen (Overnight Express auto- induction medium, Novagen®, 6 M guanidinium-HCl , 0.1 M
NaH2P04, 0.01 M Tris-HCl, pH 8.0) gewonnen und aufgereinigt (Protino® Ni-IDA 1000 Funnel Column (Macherey-Nagel®) und gewaschen und eluiert (6 M urea, 0.1 M NaH2P04, 0.01 M Tris- HCl, 0.5% (w/v) trehalose pH 4.5) und bei -20 Grad C gelagert. Der Bead-basierte Assay wird mittels MagPlexTM microspheres,
Luminex Corporation nach Luminex-Protokoll durchgeführt, wobei für jede Einzel-Kupplungsreaktion bis zu 12.5 pg Antigen und 8.8 x 105 MagPlexTM Beads von einer Farbenregion (ID)
verwendet wurde. Die Beads wurden in einem Flexmap3D Gerät von Luminex Corp. ausgewertet (DD gate 7.500-15.000; sample size: 80 μΐ; 1000 events per bead ID; timeout 60 sek.) und die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI = median fluorescence intensity) bestimmt.
Statistische Auswertung:
Die statistische Auswertung erfolgt mit dem Mann-Whitney Test unter Berücksichtigung der p-Werte und der absoluten Werte der fold-change der Patientenkohorten (unten) , siehe auch Tabellen 2 und 3.
Die Normalisierung der Daten erfolgt nach Bolstad BM, Irizarry RA, Astrand M, Speed TP: A comparison of normalization methods for high density oligonucleotide array data based on variance and bias. Bioinforma Oxf Engl 2003, 19:185-193, wobei die „Statistical Software R" (version 2.14.2 (2012-02-29))
[http://www.r-project.org] für alle Analysen als auch der reactome algorithm [http://www.reactome.com] verwendet wurde. Beispiel 2: Auswahl der Patienten und Probanden für die
Validierung der Markersequenzen
Patientenkohorten waren wie folgt: Kohorte A: 84 konsekutive Patienten mit RA gemäß dem American College of Rheumatology (ACR) / European League Against Rheumatism (EULAR) 2010
Kriterien (age 56.1 ± 13.3 years, 73.6% female, Disease
Activity Score for 28 joints (DAS28) 3.5 ± 2.3, Therapie:
Methotrexat 40%, Leflunomid 12,5%, Tumor necrosis factor alpha (TNF) -Blockade 18%), Heinrich-Heine-University Düsseldorf, verglichen mit 71 Gesundkontrollen (age 54.6 ± 11.3 years, 73.2% female) . Kohorte B (frühe RA) : 116 Patienten mit früher RA von der HIT HARD Studie (Detert J, Bastian H, Listing J, Weiß A,
Wassenberg S, Liebhaber A, Rockwitz K, Alten R, Krüger K, Rau R, Simon C, Gremmelsbacher E, Braun T, Marsmann B, Höhne- Zimmer V, Egerer K, Buttgereit F, Burmester G-R: Induction therapy with adalimumab plus methotrexate for 24 weeks
followed by methotrexate monotherapy up to week 48 versus methotrexate therapy alone for DMARD-naive patients with early rheumatoid arthritis: HIT HARD, an investigator-initiated study. Ann Rheum Dis 2013, 72:844-850) (age 49.8 ± 13.8 years, 71.3% female, DAS28 6.1 ± 1.0, alle therapy naive), ,
verglichen mit 116 Gesundkontrollen (age 49.8 ± 12.8 years, 71.6% female) .
Kohorte C (seronegative RA Kohorte) : 184 Patienten mit ACPA- negativer RA gemäß 2010 ACR/EULAR Kriterien (age 60.2 ± 13.8 years, 62.5% % female, all therapy naive) verglichen mit 343 Gesundkontrollen 343 (age 47.7 ± 11.7years, 58.3% % female).
Beispiel 3: Identifizierung der erfindungsgemäßen
MarkerSequenzen Tabelle 1 fasst die identifizerten Sequenzen SEQ ID No . 1 bis 84 zusammen. Die Details zu den Sequenzdaten ergeben sich aus dem anliegenden Sequenzprotokoll.
Tabelle 1:
SEQ SEQ Gene Gene Gene Name Gruppe
ID ID ID Symbol
No No
1 43 6475 CCDC13 coiled-coil domain Gruppe
3 6 gi 1319655558 containing 136 1
2 44 3281 HSBP1 heat shock factor Gruppe gi 14557647 binding protein 1 1
3 45 3485 IGFBP2 insulin-like growth Gruppe factor binding 1 gi 155925576 protein 2, 36kDa
4 46 1639 DCTN1 dynactin 1 Gruppe gi 113259508 2
Figure imgf000034_0001
SEQ SEQ Gene Gene Gene Name Gruppe
ID ID ID Symbol
No No
26 68 60 ACTB actin, beta Gruppe gi 14501885 4
27 69 1315 CRYBG3 beta-gamma crystallin Gruppe
44 gi 1390979647 domain containing 3 4
28 70 8454 CUL1 cullin 1 Gruppe gi 132307161 4
29 71 2300 DAAM1 dishevelled Gruppe
2 associated activator 4
gi 1395394053 of morphogenesis 1
30 72 3329 HSPD1 heat shock 60kDa Gruppe protein 1 4 gi 141399285 (chaperonin)
31 73 5187 PER1 period circadian Gruppe gi 1194097341 clock 1 4
32 74 8608 RDH16 retinol dehydrogenase Gruppe gi 1150247226 16 (all-trans) 4
33 75 2597 SH2B1 SH2B adaptor protein Gruppe
0 gi 1224926830 1 4
34 76 6604 SMARCD SWI/SNF related, Gruppe
3 matrix associated, 4
actin dependent
regulator of
chromatin, subfamily
gi 151477702 d, member 3
35 77 5695 SMYD2 SET and MYND domain Gruppe
0 gi 1188035871 containing 2 4
36 78 5485 WDR55 WD repeat domain 55 Gruppe
3 gi 138327642 4
37 79 Gruppe
3818 KLKB1 gi 1972775890 kallikrein Bl 4
38 80 MX dynamin like Gruppe
4599 MX1 gi 1544711184 GTPase 1 4
39 81 Gruppe
1665 DHX15 gi 168509925 DEAH-box helicase 15 4
40 82 fumarylacetoacetate Gruppe
5101 hydrolase domain 4 1 FAHD2A gi 1156231348 containing 2A
41 83 5485 gon-4-like (C. Gruppe
6 GO 4L gi 1544583540 elegans ) 4
42 84 charged Gruppe
5151 multivesicular body 4 0 CHMP5 gi 1306966144 protein 5
Die statistischen Ergebnisse zu den validierten Markersequenz- Kandidaten (erfindungsgemäße Markersequenzen für Rheumatoide Arthritis) sind in den Tabellen 2 und 3 angegeben. Tabelle 2: Frühe RA (HitHard)
Sens. (%) gene Gene Fold- p-value bei 90% ID Symbol change
Nr Gruppe Spez .
CCDC13
0,031 1,7 2
1 Gruppe 1 64753 6
2 Gruppe 1 3281 HSBP1 0, 002 1,3 19
3 Gruppe 1 3485 IGFBP2 0,0004 1,5 13
4 Gruppe 2 1639 DCTN1 0,001 1,5 19
5 Gruppe 2 84572 GNPTG 0,001 1,3 13
HNRNPA 0,000000
1,3 34
6 Gruppe 2 144983 1 1
7 Gruppe 2 83986 ITFG3 0, 014 1, 1 23
ATP6V1
0, 042 1,3 11
8 Gruppe 3 523 A
9 Gruppe 3 337 APOA4 0,001 1,2 11
10 Gruppe 3 10970 CKAP4 0,000 1,3 28
11 Gruppe 3 1181 CLCN2 0,016 1,2 10
12 Gruppe 3 9988 DMTF1 0, 022 1,3 11
13 Gruppe 3 2934 GSN 0,001 1,4 12
14 Gruppe 3 23708 GSPT2 0,043 1,3 8
15 Gruppe 3 4841 NONO 0,016 1,3 17
16 Gruppe 3 118471 PRAP1 0, 035 1, 6 9
RABGGT
0,046 1, 1 10
17 Gruppe 3 5876 B
18 Gruppe 3 10743 RAH 0, 020 1, 1 14
19 Gruppe 3 6741 SSB 0, 042 1, 1 17
20 Gruppe 3 79613 TMC07 0, 00005 1,5 20
21 Gruppe 3 84196 USP48 0, 034 1,7 11
22 Gruppe 3 7431 VIM 0,000 1,7 38
23 Gruppe 3 6714 YES1 0,010 1,2 13
ZFAND2
0, 002 1,3 22
24 Gruppe 3 130617 B
25 Gruppe 3 150946 FAM59B 0,0004 1,5 15
Tabelle 3: frühe RA (HitHard) ACPA
negative
Gene gene Fol- Sens. (%) at
Nr p-value
Gruppe Symbol ID change 90% Spec.
4 Gruppe 2 DCTN1 1639 0, 005 1,4 20
5 Gruppe 2 GNPTG 84572 0,001 1,4 16 Gruppe 2 HNRNPAl 144983 0, 0000002 1,4 41
Gruppe 2 ITFG3 83986 0,001 1,3 29
Gruppe 4 ACTB 60 0,004 1,1 20
Gruppe 4 CUL1 8454 0,048 1,2 29
Gruppe 4 HSPD1 3329 0,008 1, 6 14
Gruppe 4 PER1 5187 0.0003 2,2 24
Gruppe 4 RDH16 8608 0, 047 1, 6 22
Gruppe 4 SH2B1 25970 0,016 1,4 12
Gruppe 4 SMARCD3 6604 0,016 1,3 14
Gruppe 4 SMYD2 56950 0,007 1, 6 10
Gruppe 4 CRYBG3 131544 0,046 1,1 14
Gruppe 4 DAAMI 23002 0, 026 2,1 16
Gruppe 4 WDR55 54853 0,004 1,0 31

Claims

Patentansprüche
Verfahren zur Identifizierung von Markersequenzen für Rheumatoide Arthritis (RA) umfassend die Schritte: a) Serumproben von RA Patienten werden mit mehr als 5.000 an Beads gekoppelten Antigenen in Kontakt gebracht, die Bindung der einzelnen Antigene an Proteine im Serum der RA Patienten durch
Immunfluoreszenzassay gemessen und die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI = median fluorescence intensity) für jedes einzelne Antigen bestimmt; b) Serumproben von Gesunden werden mit denselben an Beads gekoppelten Antigenen in Kontakt gebracht, die Bindung der einzelnen Antigene an Proteine im Serum von Gesunden durch Immunfluoreszenzassay gemessen und daraus die mittlere
Fluoreszenzintensität (MFI = median fluorescence intensity) für jedes einzelne Antigen bestimmt; c) die MFI Daten jedes einzelnen Antigens aus a) und b) werden statistisch mittels univariater Analyse ausgewertet und dadurch Marker identifiziert, mit denen RA-Patienten von Gesunden differenziert werden können;
d) und wobei die Marker ausgewählt werden aus den
Sequenzen SEQ ID No. 4 und 46 und/oder SEQ ID o. 1 bis 84, Teilsequenzen oder Fragmente davon,
Homologen der Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 84 mit mindestens 90 % Homologie.
Markersequenz für Rheumatoide Arthritis erhalten durch ein Verfahren nach Anspruch 1 und wobei die
Markersequenz ausgewählt ist aus der Gruppe der Sequenzen SEQ ID No. 4 und 46 und/oder SEQ ID o. 1 bis 84, Teilsequenzen oder Fragmente davon, Homologen der Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 84 mit mindestens 90 %
Homologie .
Markersequenzen nach Anspruch 2 ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID No . 4 und 46 (DCTN1), SEQ ID No . 5 und 47 (GNPTG) , SEQ ID No . 6 und 48 (HNRNPA1) und/oder SEQ ID No. 7 und 49 (ITFG3) .
Verwendung von einer oder mehreren Markersequenz (en) nach Anspruch 2 oder 3 zur Diagnose von Rheumatoider Arthritis, wobei die Markersequenz (en) an oder von einem zu untersuchenden Patienten bestimmt
wird/werden .
Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass 2 oder 3, vorzugsweise 4 oder 5, besonders bevorzugt 6, 7 oder 8 oder mehr verschiedene
Markersequenzen, beispielsweise 10 bis 20 oder 30 oder mehr verschiedene Markersequenzen an oder von einem zu untersuchenden Patienten bestimmt werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Markersequenz (en) auf einem festen Träger aufgebracht wird/werden, wobei der feste Träger ausgewählt wird aus Filter, Membranen, Wafer, beispielsweise Silizium-Wafer, Glas, Metall,
Kunststoff, Chips, massenspektrometrische Targets, Matrix, Beads, beispielsweise magnetische,
beschichtete oder markierte Beads, wie Fluorophor- markierte Beads oder Luminex-Beads .
Verfahren zur Diagnose von Rheumatoider Arthritis, wobei a. ) mindestens eine Markersequenz nach Anspruch 2 oder
3 auf einen festen Träger, vorzugsweise auf ein Bead aufgebracht wird und
b. ) mit Körperflüssigkeit oder Gewebeauszug eines Patienten in Kontakt gebracht wird und
c. ) der Nachweis einer Wechselwirkung der
Körperflüssigkeit oder des Gewebeauszugs mit der
Markersequenz aus a.) erfolgt.
8. Verfahren zum Stratifizieren, insbesondere zur
Risikostratifizierung, oder zur Therapiesteuerung eines Patienten mit Rheumatoider Arthritis, wobei mindestens eine Markersequenz nach Anspruch 2 oder 3 verwendet wird, um eine Probe des Patienten zu
untersuchen .
9. Anordnung oder Panel umfassend eine oder mehrere
Markersequenz (en) nach Anspruch 2 oder 3.
10. Anordnung oder Panel umfassend eine oder mehrere
Markersequenz (en) ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID No .
4 und/oder 46 (DCTN1), SEQ ID No . 5 und/oder 47
(GNPTG) , SEQ ID No . 6 und/oder 48 (HNRNPA1) und SEQ ID No. 7 und/oder 49 (ITFG3) .
11. Assay oder Proteinarray umfassend eine Anordnung oder Panel nach Anspruch 9 oder 10.
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