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WO2017146145A1 - ｐＨ応答性蛍光化合物並びにそれを用いたマイトファジー検出用組成物及び細胞内におけるマイトファジーの検出方法 - Google Patents

ｐＨ応答性蛍光化合物並びにそれを用いたマイトファジー検出用組成物及び細胞内におけるマイトファジーの検出方法 Download PDF

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WO2017146145A1
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WO
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compound
mitophagy
fluorescent compound
cells
responsive fluorescent
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PCT/JP2017/006824
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English (en)
French (fr)
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秀文 岩下
亮 坂本
石山　宗孝
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Dojindo Laboratory and Co Ltd
Original Assignee
Dojindo Laboratory and Co Ltd
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Priority to JP2018501758A priority patent/JP6592585B2/ja
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    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2835—Movement disorders, e.g. Parkinson, Huntington, Tourette

Definitions

  • the present invention relates to a novel pH-responsive fluorescent compound, a composition for detecting mitophagy using the same, and a method for detecting mitophagy in cells.
  • autophagy In cells, there is a process of decomposing in order to reuse or metabolize unnecessary proteins, organelles, etc. in the cell, which is called autophagy (autophagy). In this process, unwanted substances are covered with an isolation membrane called an autophagosome composed of a lipid bilayer membrane, and decomposed through fusion with lysosomes.
  • the mechanism of mitochondria selective degradation through autophagy is called mitophagy, and is thought to play a role of protecting the living body from diseases involving mitochondrial dysfunction.
  • Keima a pH-responsive fluorescent protein expressed in mitochondria, and the fluorescence intensity derived from Keima is monitored (for example, see Non-Patent Document 1).
  • the excitation spectrum changes with pH.
  • the neutral environment the short wavelength side (440 nm) is dominant, but in the acidic environment, the long wavelength side (550 nm) is dominant.
  • the Ratio value is low in Keima under a neutral environment, and the Ratio value is high in Keima under an acidic environment. .
  • mitophagy can be detected by reading the change in mitochondrial pH associated with mitophagy from the fluorescence image.
  • this method is not applicable to all cells because it is necessary to express Keima in the cells.
  • Non-Patent Document 2 a pH-responsive fluorescent dye that can be introduced into cells through the cell membrane, specifically localized in the mitochondria, and whose luminescence intensity changes in response to changes in mitochondrial pH.
  • This compound consists of a triphenylphosphonium group that specifically localizes to mitochondria, a piperazine ring with a pH sensor function, a chloromethyl group that is a reactive functional group that can be covalently bonded to mitochondrial proteins, and a naphthaleneimide that is a fluorescent chromophore. In the molecule.
  • Non-Patent Document 2 since the pH-responsive fluorescent compound having naphthaleneimide as a fluorescent chromophore described in Non-Patent Document 2 has a maximum excitation wavelength of around 400 nm, excitation using a 488 nm laser of a widely used fluorescence microscope (B excitation) ), The emission intensity is lowered and the intracellular fluorescent substance is also excited, so that the background is increased. Therefore, there exists a problem that the detection sensitivity of mitophagy becomes low. Increasing the concentration of the pH-responsive fluorescent compound to eliminate the lack of sensitivity increases the damage to the mitochondria, and the pH-responsive fluorescent compound to detect intracellular mitophagy induces mitophagy. Therefore, there is a concern that the mitophagy in the cell cannot be accurately detected. Therefore, it is desirable to use a pH-responsive fluorescent compound having high fluorescence intensity by B excitation or G excitation (546 nm) at as low a concentration as possible.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, can be specifically localized in the mitochondria in the cell, exhibits strong fluorescence emission under a weakly acidic pH environment in the lysosome, and exhibits autofluorescence and other intracellular functions. It is an object of the present invention to provide a novel pH-responsive fluorescent compound that is not easily disturbed by background fluorescence derived from the fluorescent substance, a composition for detecting mitophagy using the same, and a method for detecting mitophagy in cells.
  • the first aspect of the present invention that meets the above object is to solve the above-mentioned problems by providing a pH-responsive fluorescent compound represented by the following general formula.
  • L represents a linker
  • X represents a pharmaceutically acceptable anion
  • Y represents a reactive functional group that can be covalently bonded to a functional group on the mitochondrial protein.
  • the second aspect of the present invention solves the above problem by providing a composition for detecting mitophagy containing a pH-responsive fluorescent compound represented by the above general formula.
  • a third aspect of the present invention includes a step of administering a pH-responsive fluorescent compound represented by the above general formula into a cell, and a step of measuring fluorescence emission from the cell after incubation for a predetermined time.
  • the pH-responsive fluorescent compound may be a compound represented by the following formula 9.
  • the pH-responsive fluorescent compound represented by the above general formula includes a triphenylphosphonium group that is specifically localized to the mitochondria, a piperazine ring that has a pH sensor function, a reactive functional group that can be covalently bound to a mitochondrial protein, and fluorescence development It has a hydrophobic perylene imide as a group in the molecule. Therefore, this compound can be introduced into cells through the cell membrane, is localized specifically in mitochondria, and is covalently bound to and immobilized on mitochondrial proteins.
  • the pH-responsive fluorescent compound represented by the above general formula has peryleneimide as a fluorescent chromophore, both the absorption wavelength and the fluorescence wavelength appear on the longer wavelength side than naphthaleneimide or the like. Therefore, excitation by G excitation as well as B excitation widely used in fluorescence microscopes becomes possible. This allows selective excitation even in the presence of other organelles in the cell or other fluorescent dyes that are endogenous to the cell, thus reducing the influence of background and autofluorescence and detecting with high sensitivity. It becomes possible to do.
  • the pH-responsive fluorescent compound represented by the above general formula has a wide ⁇ -conjugated plane, it has the property of self-associating and quenching in a polar solvent. Therefore, since the fluorescent light is not emitted in the state diffused in the cytoplasm, the background can be further reduced.
  • the present invention can be specifically localized in the mitochondria in the cell, exhibits strong fluorescence emission under weakly acidic pH environment in the lysosome, autofluorescence and intracellular
  • a novel pH-responsive fluorescent compound that is not easily disturbed by background fluorescence derived from other fluorescent substances, a composition for detecting mitophagy using the same, and a method for detecting mitophagy in cells.
  • the pH-responsive fluorescent compound of the present invention is represented by the following general formula.
  • L represents a linker
  • X represents a pharmaceutically acceptable anion
  • Y represents a reactive functional group that can be covalently bonded to a functional group on the mitochondrial protein.
  • Linker (L) The linker (L) that links the perylene imide, a fluorescent chromophore, with the triphenylphosphonium group that is specifically localized in mitochondria, is the fluorescence emission characteristics of the perylene imide group (emission wavelength, emission intensity, pH dependence of emission intensity). As long as it does not affect the localization to the mitochondria, etc., any atomic group can be used without limitation.
  • Specific examples of the linker L include an oxygen atom, a nitrogen atom, a sulfur atom, an ester, an amide, a urethane, a urea, a cycloalkylene group, an aryl group, a heteroaryl group, or the like between CC bonds or side chains. Or an alkylene group which may have a branch.
  • the anion X which is the counter ion of the triphenylphosphonium group, includes fluorescence characteristics of the perylene imide group (emission wavelength, emission intensity, pH dependence of emission intensity, excitation wavelength, etc.), localization to mitochondria, mitochondrial protein and Any organic or inorganic anion that is pharmaceutically acceptable can be used without particular limitation as long as it does not affect the reactivity and the like and does not exhibit cytotoxicity.
  • Specific examples of the anion X include halide ions such as chloride ions and bromide ions, organic acid ions such as acetate ions, propionate ions, lactate ions, citrate ions and tartrate ions, nitrate ions and sulfate ions.
  • An inorganic acid ion etc. are mentioned.
  • Reactive functional group (Y) Reactive functional groups that react with functional groups on mitochondrial proteins to form covalent bonds include peryleneimide group fluorescence characteristics (emission wavelength, emission intensity, pH dependence of emission intensity, excitation wavelength, etc.), locality to mitochondria It has an atom or atomic group on the side that has a moderate reactivity that does not react with other intracellular proteins etc. before it is localized in mitochondria without affecting the presence etc., and piperidine at the other end Any functional group bonded on the ring nitrogen atom can be used without particular limitation.
  • Specific examples of the reactive functional group Y include an ⁇ -chloroalkylene group, an ⁇ -bromoalkylene group, and a 4-chloromethylbenzyl group.
  • the compound represented by the above general formula can be synthesized by using any known synthesis route (reaction and conditions) such as those shown in Examples described later.
  • the compound represented by the above general formula (hereinafter sometimes abbreviated as “the same compound”) has permeability to the cell membrane, a special method is used for introducing the compound into the cell. It can be carried out simply by contacting the compound with a cell without using it. In this manner, mitophagy in the cell is detected by incubating the cell into which the compound has been introduced for a predetermined time and measuring the fluorescence emission from the cell using any known means such as a fluorescence microscope. Can do.
  • An embodiment of the present invention includes a step of administering a pH-responsive fluorescent compound represented by the above general formula into a cell, and a step of measuring fluorescence emission from the cell after incubation for a predetermined time. The present invention relates to a method for detecting mitofuzzy.
  • the compound When the compound is introduced into cells, the compound can be dissolved or dispersed in a suitable solvent or buffer solution at a predetermined concentration.
  • An embodiment of the present invention relates to a composition in which the same compound is dissolved or dispersed in a solvent or a buffer at a predetermined concentration.
  • Example 1 Synthesis of pH-responsive fluorescent compound According to the scheme shown below, the pH-responsive fluorescent compound represented by the above-mentioned formula 9 (hereinafter, represented by “formula n (n is an integer of 1 to 9)”. The “compound” was sometimes abbreviated as “compound n”.
  • Compound 9 has perylene imide as a fluorescent chromophore. Since perylene imide has a maximum excitation wavelength of 530 nm, it is a fluorescent molecule corresponding to a widely used laser microscope and is a dye that can be detected with high sensitivity. Further, since the excitation wavelength is longer, it is possible to avoid the excitation of the endogenous fluorescent substance in the cell, and it is expected to lower the background. In addition, this compound has a piperidine ring as a pH sensor, a triphenylphosphonium group as a mitochondrial localization group, and a chlorobenzyl group as an immobilization group.
  • This compound uses the fluorescence quenching phenomenon caused by light-induced electron transfer (PET) from the piperidine ring to the perylene imide group, and the fluorescence intensity is low in the pH environment near the mitochondria, while the fluorescence is weak in the weakly acidic pH environment in the lysosome. It is characterized by high strength. Furthermore, it is induced in the intracellular mitochondria by a triphenylphosphonium salt in a membrane potential-dependent manner, via a covalent bond formed by the reaction of a chlorobenzyl group and a functional group on the mitochondrial protein (for example, an SH group on a cysteine residue). And immobilized on the accumulated mitochondria.
  • PTT light-induced electron transfer
  • Example 2 Fluorescence characteristics of compound 9 It was found that compound 9 has the ability to promote self-association and weaken fluorescence intensity in polar solvents due to the wide conjugate plane. That is, since the compound 9 diffused in the cytoplasm is non-fluorescent, high-sensitivity imaging with low background can be expected.
  • excitation spectra (“Excitation” in FIG. 1)
  • fluorescence spectra (“Fluorescence” in FIG. 1)
  • pH 4.0 and 7.4 were compared with 50% acetonitrile. Measured in a buffer containing The obtained excitation spectrum and fluorescence spectrum are shown in FIG.
  • the compound 9 has a feature that the Stokes shift is large. Furthermore, it was found that the fluorescence intensity is higher in the case of pH 4.0 than in the case of pH 7.4, and the maximum fluorescence wavelength is shifted to the short wavelength side by 30 nm.
  • the fluorescence intensity of each compound 9 at each pH was measured in a buffer solution containing 50% DMSO. The results are shown in FIG. It has been found that the fluorescence intensity of compound 9 increases as it goes from the neutral region to the acidic region. This can be expected as a fluorescent dye that is less susceptible to other organelles in the cell because fluorescence increases more on the acidic side than the naphthylimide type pH-responsive fluorescent compounds already reported.
  • Example 3 Evaluation of mitophagy detection using HeLa cells
  • HeLa cells were seeded in ⁇ -slide 8 well (Ibidi) and cultured overnight at 37 ° C. in a CO 2 incubator. 100 nmol / L of Compound 9 diluted with Hanks' HEPES buffer was added and incubated for 30 minutes. After washing twice with Hanks 'HEPES buffer, serum-free Krebs' Buffer containing 1 ⁇ M glucagon and 7.5 ⁇ M pepstatin A was added, incubated at 37 ° C. for an appropriate time, starved, and then observed with a fluorescence microscope. . The observation results of HeLa cells before and after mitophagy induction are shown in FIG.
  • Example 4 Evaluation of mitophagy detection using HeLa cells (2)
  • the induction of mitophagy includes a selective method via the Parkin gene and the enzyme PINK1 in addition to the bulk method such as starvation induction used in Example 3 described above.
  • the latter has been found to be associated with Parkinson's disease and has been suggested to be associated with poor mitochondrial quality control (eg, Derek Narendra, Atsushi Tanaka, Der-Fen Suen and Richard J. Youle, J. Cell Biol., 2008, 183, 795-803.).
  • CCCP mitochondrial depolarizing agent carbonyl cyanide-m-chlorophenylhydrazone
  • ⁇ Confocal laser scanning imaging detection using Parkin-expressing HeLa cells HeLa cells were seeded in ⁇ -slide 8 well (Ibidi) and cultured overnight at 37 ° C. in a CO 2 incubator. Parkin plasmid was introduced into the cells using HilyMax (manufactured by Dojindo Laboratories) and further cultured overnight. After washing with serum-containing medium, a solution of 100 nmol / L compound 9 diluted with Hanks' HEPES buffer was added and incubated for 30 minutes. After washing with a serum-containing medium, the cells were cultured for 24 hours in a culture medium containing 10 ⁇ mol / L CCCP.
  • Fluorescence from compound 9 was weakly observed in Parkin-unexpressed HeLa cells (Parkin ( ⁇ )) from the fluorescence image (see FIG. 4) obtained with a confocal laser microscope.
  • Parkin-expressing HeLa cells Parkin (+)
  • fluorescence derived from compound 9 was observed and was found to be co-stained with a lysosome dye (Lyso Dye) (see FIG. 4). This indicates that mitochondria are fused with lysosome, suggesting that compound 9 is a dye that can detect mitophagy even under mitochondrial selective induction conditions.
  • FCM Flow cytometry analysis using Parkin-expressing HeLa cells
  • HeLa cells were seeded in a 24-well plate and cultured overnight at 37 ° C. in a CO 2 incubator. Parkin plasmid was introduced into the cells using HilyMax (manufactured by Dojindo Laboratories) and further cultured overnight. After washing with serum-containing medium, a solution of Compound 9 at 100 nmol / L diluted with Hanks' HEPES buffer was added and incubated for 30 minutes. After washing with a serum-containing medium, the cells were cultured for 24 hours in a culture medium containing 10 ⁇ mol / L CCCP. After washing with PBS, the cells were detached with trypsin and EDTA. The cells were collected by centrifugation, suspended in 0.5 mL of HBSS, and analyzed by FCM (BD FACS cant II).
  • FCM BD FACS cant II

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Abstract

細胞内のミトコンドリアに特異的に局在化可能で、リソソーム中の弱酸性ｐＨ環境下で強い蛍光発光を示し、自家蛍光や、細胞内の他の蛍光物質に由来するバックグラウンド蛍光の妨害を受けにくい新規なｐＨ応答性蛍光化合物として、下記の一般式で表されるｐＨ応答性蛍光化合物並びにそれを用いたマイトファジー検出用組成物及び細胞内におけるマイトファジーの検出方法が開示されている。ただし、上記一般式において、Ｌはリンカーを表し、Ｘは薬学的に許容される陰イオンを表し、Ｙはミトコンドリアタンパク質上の官能基と共有結合可能な反応性官能基を表す。

Description

ｐＨ応答性蛍光化合物並びにそれを用いたマイトファジー検出用組成物及び細胞内におけるマイトファジーの検出方法
　本発明は、新規なｐＨ応答性蛍光化合物並びにそれを用いたマイトファジー検出用組成物及び細胞内におけるマイトファジーの検出方法に関する。
　細胞には、細胞内の不要なタンパク質、細胞小器官等を再利用又は代謝するために分解する過程が存在し、オートファジー（Ａｕｔｏｐｈａｇｙ：自食）と呼ばれている。この過程において、不要物は脂質二重膜で構成されるオートファゴソームと呼ばれる隔離膜に覆われ、リソソームとの融合を経て分解される。オートファジーを介したミトコンドリア選択的な分解除去機構は、マイトファジー（Ｍｙｔｏｐｈａｇｙ）と呼ばれており、ミトコンドリアの機能障害が関与する疾患から生体を防御する役割を果たしていると考えられている。
　マイトファジーを検出する一般的な方法としては、細胞を溶解し、得られたｍＲＮＡからマイトファジー関連因子の発現をウエスタンブロットで確認する方法が挙げられる。この方法は、細胞を破砕するためライブセルイメージングはできない。
　細胞内イメージングの代表的な方法としては、ミトコンドリアにＫｅｉｍａと呼ばれるｐＨ応答蛍光タンパク質を発現させ、Ｋｅｉｍａに由来する蛍光強度をモニタリングする方法がある（例えば、非特許文献１参照）。Ｋｅｉｍａは、励起スペクトルがｐＨにより変化する。中性環境下では短波長側（４４０ｎｍ）が優勢であるが、酸性環境下では長波長側（５５０ｎｍ）が優勢になる。この２つの励起波長による画像データから得られるＲａｔｉｏ（５５０ｎｍ／４４０ｎｍ）画像で観察すると、中性環境下にあるＫｅｉｍａでは、Ｒａｔｉｏ値は低くなり、酸性環境下にあるＫｅｉｍａでは、Ｒａｔｉｏ値は高くなる。この現象を利用して、マイトファジーに伴うミトコンドリアのｐＨ変化を蛍光画像から読み出することにより、マイトファジーを検出することができる。ただし、この方法では、細胞内にＫｅｉｍａを発現させる必要があるため、あらゆる細胞に適用できるわけではない。
　そこで、細胞膜を透過して細胞内に導入可能で、ミトコンドリアに特異的に局在化し、ミトコンドリアのｐＨ変化に応答して発光強度が変化するｐＨ応答性の蛍光色素として、下記の式で表される化合物が提案されている（非特許文献２参照）。この化合物は、ミトコンドリアに特異的に局在化するトリフェニルホスホニウム基、ｐＨセンサー機能を持つピペラジン環、ミトコンドリアタンパク質と共有結合可能な反応性官能基であるクロロメチル基、蛍光発色団であるナフタレンイミドを分子内に有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
Kogure,　T.,　Karasawa,　S.,　Araki,　T.,　Saito,　K.,　Kinjo,　M.,　and　Miyawaki,　A.,　A　fluorescent　variant　of　a　protein　from　the　stony　coral　Montipora　facilitates　dual-color　single-laser　fluorescence　cross-correlation　spectroscopy;Nature　Biotechnology.　24:577-581(2006). Mitochondria-Immobilized　pH-Sensitive　Off-On　Fluorescent　Probe,　Min　Hee　Lee,　Nayoung　Park,　Chunsik　Yi,　Ji　Hye　Han,　Ji　Hye　Hong,　Kwang　Pyo　Kim,　Dong　Hoon　Kang,　Jonathan　L.　Sessler,　Chulhun　Kang,　and　Jong　Seung　Kim,　　J.　Am.　Chem.　Soc.　2014,　136,　14136-14142.
　しかしながら、非特許文献２に記載のナフタレンイミドを蛍光発色団として有するｐＨ応答性蛍光化合物は、最大励起波長が４００ｎｍ付近であるため、汎用されている蛍光顕微鏡の４８８ｎｍレーザーを用いて励起（Ｂ励起）した場合、発光強度が低くなる上に、細胞内在性の蛍光物質も励起されるために、バックグラウンドが高くなる。そのため、マイトファジーの検出感度が低くなるという問題がある。感度不足を解消するために、ｐＨ応答性蛍光化合物の濃度を増大させると、ミトコンドリアに与えるダメージが大きくなり、細胞内のマイトファジーを検出するためのｐＨ応答性蛍光化合物がマイトファジーを誘発してしまい、細胞内のマイトファジーを正確に検知できないことも懸念される。そのため、Ｂ励起やＧ励起（５４６ｎｍ）で高い蛍光強度を有するｐＨ応答性蛍光化合物を、できるだけ低濃度で用いることが望ましい。
　本発明はかかる事情に鑑みてなされたもので、細胞内のミトコンドリアに特異的に局在化可能で、リソソーム中の弱酸性ｐＨ環境下で強い蛍光発光を示し、自家蛍光や、細胞内の他の蛍光物質に由来するバックグラウンド蛍光の妨害を受けにくい新規なｐＨ応答性蛍光化合物並びにそれを用いたマイトファジー検出用組成物及び細胞内におけるマイトファジーの検出方法を提供することを目的とする。
　前記目的に沿う本発明の第１の態様は、下記の一般式で表されるｐＨ応答性蛍光化合物を提供することにより上記課題を解決するものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　ただし、上記一般式において、
　Ｌはリンカーを表し、
　Ｘは薬学的に許容される陰イオンを表し、
　Ｙはミトコンドリアタンパク質上の官能基と共有結合可能な反応性官能基を表す。
　本発明の第２の態様は、上記の一般式で表されるｐＨ応答性蛍光化合物を含むマイトファジー検出用組成物を提供することにより上記課題を解決するものである。
　本発明の第３の態様は、上記の一般式で表されるｐＨ応答性蛍光化合物を細胞内に投与する工程と、所定時間インキュベート後、細胞からの蛍光発光を測定する工程とを含むことを特徴とする細胞内におけるマイトファジーの検出方法を提供することにより上記課題を解決するものである。
　本発明の第１から第３の態様において、前記ｐＨ応答性蛍光化合物が下記の式９で表される化合物であってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　上記一般式で表されるｐＨ応答性蛍光化合物は、ミトコンドリアに特異的に局在化するトリフェニルホスホニウム基、ｐＨセンサー機能を持つピペラジン環、ミトコンドリアタンパク質と共有結合可能な反応性官能基、蛍光発色団である疎水性のペリレンイミドを分子内に有する。そのため、この化合物は、細胞膜を透過して細胞内に導入可能であり、ミトコンドリアに特異的に局在化し、ミトコンドリアタンパク質に共有結合し固定化される。
　中性又は塩基性条件では、ピペラジン環内の窒素原子のうち、ペリレン環のπ電子系と共役していないアミンの窒素原子上の非共有電子対から、ペリレン環のπ電子系への光誘起電子移動（ＰＥＴ）により消光され、蛍光発光を起こさないのに対し、ペリレン環のπ電子系と共役していないアミンのｐＫａよりもｐＨが小さい酸性条件下では、窒素原子がプロトン化され、光誘起電子移動が起こらなくなるため、ペリレン環のπ電子系からの蛍光発光が起きるようになる。そのため、ミトコンドリアが細胞質中に存在する場合には蛍光発光が起こらないのに対し、ミトコンドリアがマイトファジーを受けリソソーム内に移行した場合に、「Ｏｎ－Ｏｆｆ」的に蛍光発光が起こることから、マイトファジーを受けたミトコンドリアを蛍光像により見分けることができる。
　また、上記一般式で表されるｐＨ応答性蛍光化合物は、ペリレンイミドを蛍光発色団として有しているため、ナフタレンイミド等よりも、吸収波長及び蛍光波長共に長波長側に現れる。そのため、蛍光顕微鏡で広く用いられるＢ励起のみならず、Ｇ励起での励起が可能になる。これにより、細胞内の他のオルガネラや細胞内在性の他の蛍光色素との共存下でも選択的に励起することが可能になるため、バックグラウンドや自家蛍光の影響を低減でき、高感度で検出することが可能になる。更に、上記一般式で表されるｐＨ応答性蛍光化合物は、広いπ共役平面を有しているため、極性溶媒中では自己会合し濃度消光するという性質を併せ持つ。そのため、細胞質中に拡散した状態では蛍光発光を示さないため、バックグラウンドを更に低減できる。
　これらの効果が相俟って、本発明によると、細胞内のミトコンドリアに特異的に局在化可能で、リソソーム中の弱酸性ｐＨ環境下で強い蛍光発光を示し、自家蛍光や、細胞内の他の蛍光物質に由来するバックグラウンド蛍光の妨害を受けにくい新規なｐＨ応答性蛍光化合物並びにそれを用いたマイトファジー検出用組成物及び細胞内におけるマイトファジーの検出方法が提供される。
本発明の一実施の形態に係るｐＨ応答性蛍光化合物の吸収スペクトル及び蛍光スペクトルを示す図である。 同ｐＨ応答性蛍光化合物の蛍光強度のｐＨ変化を示すグラフである。 同ｐＨ応答性蛍光化合物を導入したＨｅＬａ細胞のマイトファジー誘導前後の蛍光顕微鏡像を示す写真である。 同ｐＨ応答性蛍光化合物を導入したＰａｒｋｉｎ発現ＨｅＬａ細胞及びＰａｒｋｉｎ未発現ＨｅＬａ細胞の蛍光顕微鏡像を示す写真である。 Ｐａｒｋｉｎ発現ＨｅＬａ細胞及びＰａｒｋｉｎ未発現ＨｅＬａ細胞のフローサイトメトリー測定の結果を示すグラフである。
　続いて、本発明を具体化した実施の形態につき説明し、本発明の理解に供する。
　本発明のｐＨ応答性蛍光化合物は、下記の一般式で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　ただし、上記一般式において、
　Ｌはリンカーを表し、
　Ｘは薬学的に許容される陰イオンを表し、
　Ｙはミトコンドリアタンパク質上の官能基と共有結合可能な反応性官能基を表す。
リンカー（Ｌ）
　蛍光発色団であるペリレンイミドと、ミトコンドリアに特異的に局在化するトリフェニルホスホニウム基を連結するリンカー（Ｌ）としては、ペリレンイミド基の蛍光発光特性（発光波長、発光強度、発光強度のｐＨ依存性、励起波長等）、ミトコンドリアへの局在性等に影響を与えない限りにおいて、任意の原子団を制限なく用いることができる。リンカーＬの具体例としては、Ｃ－Ｃ結合間又は側鎖に、酸素原子、窒素原子、硫黄原子、エステル、アミド、ウレタン、尿素、シクロアルキレン基、アリール基、ヘテロアリール基等を有していてもよく、分岐を有していてもよいアルキレン基が挙げられる。
陰イオン（Ｘ）
　トリフェニルホスホニウム基の対イオンである陰イオンＸとしては、ペリレンイミド基の蛍光発光特性（発光波長、発光強度、発光強度のｐＨ依存性、励起波長等）、ミトコンドリアへの局在性、ミトコンドリアタンパク質との反応性等に影響を与えず、細胞毒性等を示さない限りにおいて、薬学的に許容される任意の有機又は無機陰イオンを特に制限なく用いることができる。陰イオンＸの具体例としては、塩化物イオン、臭化物イオン等のハロゲン化物イオン、酢酸イオン、プロピオン酸イオン、乳酸イオン、クエン酸イオン、酒石酸イオン等の有機酸イオン、硝酸イオン、硫酸イオン等の無機酸イオン等が挙げられる。
反応性官能基（Ｙ）
　ミトコンドリアタンパク質上の官能基と反応し共有結合を形成する反応性官能基としては、ペリレンイミド基の蛍光発光特性（発光波長、発光強度、発光強度のｐＨ依存性、励起波長等）、ミトコンドリアへの局在性等に影響を与えず、ミトコンドリアに局在化する前に他の細胞内タンパク質等と反応しない程度の適度な反応性を有する原子又は原子団を一旦側に有し、他端側でピペリジン環の窒素原子上に結合した任意の官能基を特に制限なく用いることができる。反応性官能基Ｙの具体例としては、ω－クロロアルキレン基、ω－ブロモアルキレン基、４－クロロメチルベンジル基等が挙げられる。
　好ましいｐＨ応答性蛍光化合物の一例としては、例えば、下記の式９で表されるものが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　上記の一般式で表される化合物は、例えば後述する実施例に示すもの等の、任意の公知の合成ルート（反応及び条件）を用いて合成することができる。
　上記の一般式で表される化合物（以下、「同化合物」と略称する場合がある。）は、細胞膜に対する透過性を有しているため、同化合物の細胞への導入は、特別な方法を用いることなく、単に同化合物を細胞に接触させることにより行うことができる。このようにして、同化合物を導入した細胞を所定時間インキュベートし、蛍光顕微鏡等の任意の公知の手段を用いて、細胞からの蛍光発光を測定することにより、細胞内におけるマイトファジーを検出することができる。本発明のある実施形態は、上記の一般式で表されるｐＨ応答性蛍光化合物を細胞内に投与する工程と、所定時間インキュベート後、細胞からの蛍光発光を測定する工程とを含む細胞内におけるマイトファジーを検知する方法に関する。
　同化合物の細胞への導入の際には、同化合物を適当な溶媒又は緩衝液に、所定の濃度で溶解又は分散させた状態で行うことができる。本発明のある実施形態は、溶媒又は緩衝液に所定の濃度で同化合物を溶解又は分散させた組成物に関する。
　次に、本発明の作用効果を確認するために行った実施例について説明する。
実施例１：ｐＨ応答性蛍光化合物の合成
　下記に示すスキームにしたがって、上述の式９で表されるｐＨ応答性蛍光化合物（以下、「式ｎ（ｎは１～９の整数）で表される化合物」を、「化合物ｎ」と略称する場合がある。）の合成を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
化合物２の合成
　金属製オートクレーブに、ペリレン－３，４，９，１０－テトラカルボン酸二無水物（化合物１）５．５ｇ（１４ｍｍｏｌ）、２，５－ジ－ｔｅｒｔ－ブチルアニリン１．５７ｇ（７．６ｍｍｏｌ）、酢酸亜鉛二和物１．９８ｇ（９．０ｍｍｏｌ）、イミダゾール１４ｇ（２０５．６ｍｍｏｌ）、水１２ｍＬを加えスパーテルでよく混合し、２００℃で２４時間反応させた。反応終了後、内容物を５００ｍＬビーカーに移し、全量２００ｍＬ程度のＥｔＯＨで洗いこんだ。濃塩酸１ｍＬを滴下し、室温で１時間撹拌後、ＥｔＯＨを留去した。残留物にＣＨＣｌ３を加え、分液ロートに移し、水で３回洗浄した。ＣＨＣｌ３層をＮａ２ＳＯ３で乾燥後濃縮乾固した。精製はシリカゲルカラムを使用し、クロロホルム／酢酸エチル＝９／１で行った（T,　Dentani;　et　al.,　Dyes　Pigments.,　2007,　72(3),　303-307.）。
1H-NMR(400　MHz,　CDCl3)δ:1.30(s,　9H),　1.33(s,　9H),　7.03(s,　1H),　7.45(d,　1H,　J＝8.4　Hz),　7.58-7.65(m,　3H),　7.90(d,　2H,　J＝7.9　Hz),　8.44(m,　3H),　8.64(d,　2H,　J＝7.8　Hz)
化合物３の合成
　５ｇの化合物２（９ｍｍｏｌ）を反応容器に入れ、ＴＨＦ　１０ｍＬを加え溶解し、これにｔ－ＢｕＯＨ　４００ｍＬを加えた。フレーク状のＫＯＨ　３６ｇ（６４５ｍｍｏｌ）を加え、１１０℃で２時間還流した。４００ｍＬの酢酸を滴下し、室温で２時間撹拌した。析出した黒色結晶をろ取し、減圧乾燥した。得られた化合物は有機溶媒への溶解性が悪く、ＮＭＲ分析ができないことから、そのまま次段階の反応に使用した。
化合物４の合成
　化合物３　１．５ｇ（４．５ｍｍｏｌ）、β－アラニンベンジルエステルｐ－トルエンスルホン酸塩１．８６ｇ（５．３ｍｍｏｌ）、酢酸亜鉛７９５ｍｇ（３．６ｍｍｏｌ）、キノリン１５０ｍＬを加え、アルゴン雰囲気下、１２０℃で一晩撹拌した。反応混合物にＣＨＣｌ３を加え、３Ｎ　ＨＣｌで３回洗浄した。ＣＨＣｌ３層をＮａ２ＳＯ３で乾燥後濃縮乾固した。精製はシリカゲルカラムを使用し、クロロホルム／酢酸エチル＝９／１で行った。
1H-NMR(400　MHz,　CDCl3)　δ:2.85 (t,　2H,　J＝7.2　Hz),　4.53(t,　2H,　J＝7.2　Hz),　5.14(s,　2H),　7.26-7.32(m,　4H),　7.61(t,　2H,　J＝7.6　Hz),　7.88(d,　2H,　J＝8.0　Hz),　8.32(d,　2H,　J＝7.4　Hz),　8.38(d,　2H,　J＝7.1　Hz),　8.51(d,　2H,　J＝8.0　Hz)
化合物５の合成
　化合物４　１．０ｇ（２．０ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ８０ｍＬ－ＥｔＯＨ２０ｍＬの混合溶液に溶解した。１０％Ｐｄ／Ｃをスパーテル大さじ１杯（５０ｍｇ程度）加え、Ｈ２ガス雰囲気下、室温で終夜撹拌した。得られた化合物は有機溶媒への溶解性が悪く、ＮＭＲ分析ができないことから、そのまま次段階の反応に使用した。
化合物６の合成
　未精製の化合物５をＤＭＦ２５０ｍＬに溶解した。臭化（２－アミノエチル）トリフェニルホスホニウム（Maryanoff,　B.　E.;et　al.,　J.　Am.　Chem.　Soc.　1985,　107,　217-226に記載の方法に準拠して合成した。）９８１ｍｇ（１．０当量、２．５４ｍｍｏｌ）、ＤＭＴ－ＭＭ　８３０ｍｇ（１．２当量、３．０５ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ　５ｍＬを加え室温で一晩撹拌した。反応の進行を確認後、反応溶液をエバポレーターで留去した。精製はシリカゲルカラムを使用し、クロロホルム／メタノール＝９／１で行った。
1H-NMR(400　MHz,　CDCl3)　δ:2.65(t,　2H,　J＝7.4　Hz),　3.73-3.81(m,　2H),　3.86-3.93(m,　2H),　4.40(t,　2H,　J＝7.4　Hz),　7.56(t,　2H,　J＝7.7　Hz),　7.69-7.86(m,　15H),　8.20(d,　2H,　J＝8.1　Hz),　8.29(d,　2H,　J＝7.6　Hz),　8.38(d,　2H,　J＝8.0　Hz)　,　8.80(bt,　1H)
化合物７の合成
　化合物６　１ｇに１，２－ジクロロエタン１５０ｍＬを加え、Ｋ２ＣＯ３　５３９ｍｇ（３．０当量、３．９ｍｍｏｌ）を加え攪拌した。臭素８５μＬ（２．５当量、３．２８ｍｍｏｌ）を１，２－ジクロロエタン５ｍＬで希釈し、反応溶液に滴下後、１００℃で２時間攪拌した。反応の進行はＥＳＩ－ＭＳ分析により確認した。生成するＢｒ体は原料と同じ極性のため、ＴＬＣによる反応の進行確認は困難であった。ＭＳ解析の結果、原料のピーク（m/z:761　[M+H+]）はほぼ検出されず、生成物のピーク（m/z:839　[M+H+]）が得られたため溶媒をエバポレーターで留去した。精製はシリカゲルカラムを使用し、クロロホルム／メタノール＝９／１で行った。
1H-NMR(400　MHz,　CDCl3)　δ:2.65(t,　2H,　J＝7.3　Hz),　2.79(bs,　4H),　3.24(bs,　4H),　3.68(s,　2H),　3.72-3.77(m,　2H),　3.83-3.88(m,　2H),　4.41(t,　2H,　J＝7.3　Hz),　4.6(s,　2H),　7.66-7.86(m,　17H),　8.13(d,　1H,　J＝7.3　Hz),　8.25(d,　2H,　J＝8.3　Hz),　8.29(d,　1H,　J＝7.3　Hz),　8.38(d,　1H,　J＝7.4　Hz),　8.43-8.48(m,　2H),　9.19(bt,　1H)
化合物８の合成
　化合物７　５００ｍｇに、２－メトキシエタノール１５０ｍＬ、ピペラジン３．５ｇ（６６．６当量、４０ｍｍｏｌ）を加え、１４０℃で１晩攪拌した。反応の進行を確認後、溶媒を留去した。精製はシリカゲルカラムを使用し、クロロホルム／メタノール＝８／２で行った。
1H-NMR(400　MHz,　CD3OD)　δ:2.56(t,　2H,　J＝6.7　Hz),　3.15(m,　1H),　3.50(m,　1H),　3.52-3.63(m,　4H),　4.40(t,　2H,　J＝6.8　Hz),　7.20(d,　1H,　J＝8.4　Hz),　7.58(t,　1H,　J＝7.9　Hz),　7.74-7.93(m,　15H),　8.09-8.19(m,　5H,　J＝8.5　Hz),　8.30(d,　1H,　J＝7.4　Hz),　8.36(d,　1H).
化合物９の合成
　化合物８　３００ｍｇ、α，α’－ジクロロ－ｐ－キシレン１２４５ｍｇ（２０当量、７．１ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３　５０ｍｇ（１．０当量、０．３５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル１５０ｍＬに溶解し、終夜還流した。ＴＬＣにより反応の進行を確認した。過剰のα，α’－ジクロロ－ｐ－キシレンを取り除くため、ろ過後反応溶液をエバポレーターで留去した。精製はシリカゲルカラムを使用し、クロロホルム／メタノール＝９／１で行った。
1H-NMR(400　MHz,　CDCl3)　δ:2.65(t,　2H,　J＝7.3　Hz),　2.79(bs,　4H),　3.24(bs,　4H),　3.68(s,　2H),　3.72-3.77(m,　2H),　3.83-3.88(m,　2H),　4.41(t,　2H,　J＝7.3　Hz),　4.6(s,　2H),　7.16(d,　1H,　J＝7.3　Hz),　7.37-7.42(m,　4H),　7.57(t,　1H,　J＝7.9　Hz),　7.68-7.84(m,　15H),　8.13-8.28(m,　4H),　8.33-8.41(m,　3H),　9.19(bt,　1H)
　化合物９はペリレンイミドを蛍光発色団として有している。ペリレンイミドは最大励起波長が５３０ｎｍであるため、汎用されているレーザー顕微鏡に対応する蛍光分子であり、高感度に検出できる色素である。更に励起波長がより長波長であることから細胞内の内在性蛍光物質の励起をさけることができ、バックグラウンドを下げることが期待される。本化合物はその他に、ｐＨセンサーとしてピペリジン環、ミトコンドリア局在基としてトリフェニルホスホニウム基、固定化基としてクロロベンジル基を有する。本化合物はピペリジン環からペリレンイミド基への光誘起電子移動（ＰＥＴ）による蛍光の消光現象を利用し、ミトコンドリア近傍でのｐＨ環境下では蛍光強度が低く、一方リソソーム内の弱酸性ｐＨ環境下において蛍光強度が高いという特徴を有している。さらにトリフェニルホスホニウム塩により膜電位依存的に細胞内ミトコンドリアに誘導され、クロロベンジル基とミトコンドリアタンパク質上の官能基（例えば、システイン残基上のＳＨ基）との反応により形成された共有結合を介して、集積したミトコンドリア上に固定化される。
実施例２：化合物９の蛍光特性
　化合物９は共役平面が広い影響により極性溶媒中では自己会合が促進し蛍光強度が弱くなる性能を持つことがわかった。つまり、細胞質中に拡散した化合物９は無蛍光であるため、バックグラウンドが低い高感度のイメージングが期待できる。化合物９の蛍光発光のｐＨ依存性を確認するため、ｐＨ４．０及び７．４における励起スペクトル（図１中の「Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ」）及び蛍光スペクトル（図１中の「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ」）を、５０％アセトニトリルを含む緩衝液中で測定した。得られた励起スペクトル及び蛍光スペクトルを図１に示す。図１より明らかなように、化合物９は、ストークスシフトが大きいという特徴を有している。さらに、ｐＨ７．４の場合よりも、ｐＨ４．０の場合の方が、蛍光強度が高く、極大蛍光波長は３０ｎｍ短波長側へシフトすることが分かった。
　化合物９の各ｐＨにおける蛍光強度を、５０％ＤＭＳＯを含む緩衝液中で測定した。結果を図２に示す。化合物９は中性領域から酸性領域になるにしたがって、蛍光強度が高くなることが分かった。このことはすでに報告されているナフチルイミド型のｐＨ応答性蛍光化合物に比べ、より酸性側で蛍光が増大することから、細胞内のその他のオルガネラの影響を受けにくい蛍光色素として期待できる。
実施例３：ＨｅＬａ細胞を用いたマイトファジー検出評価（１）
　ＨｅＬａ細胞をμ-slide　8　well(Ibidi)に播種し、３７℃、ＣＯ２インキュベーターにて一晩培養した。Hanks’　HEPES　bufferで希釈した１００ｎｍｏｌ／Ｌの化合物９を添加し３０分インキュベートした。Hanks’　HEPES　bufferで２回洗浄後、１μＭのグルカゴンと７．５μＭペプスタチンＡを含む血清不含Krebs’　Bufferを加え３７℃で適切な時間インキュベートし、飢餓誘導を行った後、蛍光顕微鏡で観察した。マイトファジー誘導前と誘導後のＨｅＬａ細胞の観察結果を図３に示す。化合物９のリソソームへの取込を確認するため、Hanks’　HEPES　bufferで希釈した１μＭ　Lyso　Dyeを３７℃で３０分間インキュベートした。Hanks’　HEPES　bufferで２回洗浄後、蛍光顕微鏡で共染色が起こっていることが確認された。
実施例４：ＨｅＬａ細胞を用いたマイトファジー検出評価（２）
　マイトファジーの誘導は、上述の実施例３で用いた飢餓誘導等のバルク的な方法によるものに加え、Ｐａｒｋｉｎ遺伝子と酵素ＰＩＮＫ１を介した選択的な方法が挙げられる。後者はパーキンソン病に関係していることが分かってきており、不良ミトコンドリアの品質管理との関連が示唆されている（例えば、Derek　Narendra,　Atsushi　Tanaka,　Der-Fen　Suen　and　Richard　J.　Youle,　J. Cell Biol., 2008, 183, 795-803.参照）。ミトコンドリア選択的オートファジーの検出を評価するため、Ｐａｒｋｉｎ発現ＨｅＬａ細胞を調製し、化合物９に加え、ミトコンドリア脱分極剤であるカルボニルシアニド－ｍ－クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）を添加してインキュベーションすることにより、マイトファジーを誘導した。
＜Parkin発現ＨｅＬａ細胞を用いた共焦点レーザー顕微鏡イメージング検出＞
　μ-slide　8　well　(Ibidi)にＨｅＬａ細胞を播種し、３７℃、ＣＯ２インキュベーターにて一晩培養した。HilyMax (同仁化学研究所製) を用いてParkin プラスミドを細胞に導入し、さらに一晩培養した。血清含有培地で洗浄後、Hanks’　HEPES　bufferで希釈した１００ｎｍｏｌ／Ｌの化合物９の溶液を添加し、３０　分インキュベートした。血清含有培地で洗浄後、１０μｍｏｌ／Ｌ　ＣＣＣＰを含む培養培地で２４時間培養した。蛍光顕微鏡でマイトファジーが起きていることを確認後、１μＭ　Lyso　Dyeを３７℃で３０分間インキュベートした。Hanks’　HEPES　bufferで２回洗浄後、蛍光顕微鏡で共染色を確認した。
　共焦点レーザー顕微鏡による蛍光画像（図４参照）から、Ｐａｒｋｉｎ未発現ＨｅＬａ細胞（Ｐａｒｋｉｎ（－））では、化合物９由来の蛍光は弱く観察された。一方、Ｐａｒｋｉｎ発現ＨｅＬａ細胞（Ｐａｒｋｉｎ（＋））では、化合物９由来の蛍光が観察され、リソソーム染色剤（Lyso　Dye）と共染色されることが分かった（図４参照）。このことはミトコンドリアがリソソームと融合していることを示しており、化合物９が、ミトコンドリア選択的誘導条件下においてもマイトファジーを検出できる色素であることを示唆している。
＜Parkin発現ＨｅＬａ細胞を用いたフローサイトメトリー（FCM）解析＞
　24ウェルプレートにＨｅＬａ細胞を播種し、３７℃、ＣＯ２インキュベーターにて一晩培養した。HilyMax (同仁化学研究所製) を用いてParkin プラスミドを細胞に導入し、さらに一晩培養した。血清含有培地で洗浄後、Hanks’　HEPES　bufferで希釈した１００ｎｍｏｌ／Ｌの化合物９の溶液を添加し、３０分インキュベートした。血清含有培地で洗浄後、１０μｍｏｌ／Ｌ　ＣＣＣＰを含む培養培地で２４　時間培養した。ＰＢＳで洗浄後、トリプシン及びＥＤＴＡで細胞を剥離した。遠心にて細胞を回収後、０．５ｍＬのＨＢＳＳで懸濁させＦＣＭ（BD　FACS　cantII）にて解析した。
　フローサイトメトリー（ＦＣＭ）を用いた定量解析の結果、ＣＣＣＰによるマイトファジーの誘導において約１．３倍の蛍光増大が観測された（図５）。以上の結果より、化合物９は、蛍光イメージング及びＦＣＭを用いることでマイトファジーの現象を検出可能な蛍光色素であることが確認された。

Claims (6)

  1. 　下記の一般式で表されるｐＨ応答性蛍光化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     　ただし、上記一般式において、
    　Ｌはリンカーを表し、
    　Ｘは薬学的に許容される陰イオンを表し、
    　Ｙはミトコンドリアタンパク質上の官能基と共有結合可能な反応性官能基を表す。
  2. 　前記ｐＨ応答性蛍光化合物が下記の式９で表される化合物であることを特徴とする請求項１に記載のｐＨ応答性蛍光化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
  3. 　下記の一般式で表されるｐＨ応答性蛍光化合物を含むマイトファジー検出用組成物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     　ただし、上記一般式において、
    　Ｌはリンカーを表し、
    　Ｘは薬学的に許容される陰イオンを表し、
    　Ｙはミトコンドリアタンパク質上の官能基と共有結合可能な反応性官能基を表す。
  4. 　前記ｐＨ応答性蛍光化合物が下記の式９で表される化合物であることを特徴とする請求項３に記載のマイトファジー検出用組成物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
  5. 　下記の一般式で表されるｐＨ応答性蛍光化合物を細胞内に投与する工程と、
    　所定時間インキュベート後、細胞からの蛍光発光を測定する工程とを含むことを特徴とする細胞内におけるマイトファジーの検出方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     　ただし、上記一般式において、
    　Ｌはリンカーを表し、
    　Ｘは薬学的に許容される陰イオンを表し、
    　Ｙはミトコンドリアタンパク質上の官能基と共有結合可能な反応性官能基を表す。
  6. 　前記ｐＨ応答性蛍光化合物が下記の式９で表される化合物であることを特徴とする請求項５に記載の細胞内におけるマイトファジーの検出方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
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