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WO2017009999A1 - 微生物検出法及び微生物検出キット - Google Patents

微生物検出法及び微生物検出キット Download PDF

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Publication number
WO2017009999A1
WO2017009999A1 PCT/JP2015/070406 JP2015070406W WO2017009999A1 WO 2017009999 A1 WO2017009999 A1 WO 2017009999A1 JP 2015070406 W JP2015070406 W JP 2015070406W WO 2017009999 A1 WO2017009999 A1 WO 2017009999A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
iridium
nucleic acid
cells
amplification
test sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2015/070406
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
隆志 副島
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Morinaga Milk Industry Co Ltd
Original Assignee
Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Morinaga Milk Industry Co Ltd filed Critical Morinaga Milk Industry Co Ltd
Priority to PCT/JP2015/070406 priority Critical patent/WO2017009999A1/ja
Publication of WO2017009999A1 publication Critical patent/WO2017009999A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting microorganisms contained in foods and biological samples, microorganisms contained in environments such as industrial water and city water, and a microorganism detection kit. More specifically, the present invention relates to a detection method and a microorganism detection kit that can selectively detect living cells of microorganisms contained in an environment such as foods, biological samples, wiped samples, industrial water, and city water.
  • a plate culture method has been used to measure the number of general viable bacteria in foods, biological samples, wiped samples, or the environment.
  • the plate culture method has a problem that it takes about 2 days to 1 month to obtain the result, and it is difficult to identify bacteria.
  • a test sample is treated with a crosslinking agent that crosslinks DNA such as ethidium monoazide (EMA), a topoisomerase inhibitor and / or a DNA gyrase inhibitor, and then a chromosome in a microorganism in the sample.
  • EMA ethidium monoazide
  • a technique for detecting viable bacteria in a sample by selectively amplifying DNA by a nucleic acid amplification reaction has been proposed, and results have been achieved (Patent Documents 1 to 4).
  • topoisomerase inhibitor and DNA gyrase inhibitor as described above enter the cell, they bind to or intercalate with DNA to inhibit the action of topoisomerase or DNA gyrase (enzyme), or DNA As a result, chromosomal DNA is destroyed (fragmentation / cutting). Since these drugs are more permeable to the cell walls of dead and damaged bacteria than the cell walls of live bacteria, the chromosomal DNA of the damaged or dead bacteria is preferentially fragmented over the live bacteria. Therefore, viable bacteria can be selectively detected compared with damaged or dead bacteria by PCR targeting a specific region of chromosomal DNA.
  • the EMA crosslinks between DNA molecules by hydrogen bonding to DNA and then irradiation with light having a wavelength of 350 to 700 nm. Therefore, although light irradiation to a sample is essential, in order to prevent the sample from being heated by a light source, light irradiation is usually performed by immersing the sample in ice water, and the process is complicated. In addition, a method using an LED as a light source has been proposed, but there are problems such as insufficient light intensity and a decrease in the crosslinking ability of the crosslinking agent over time. Furthermore, a drug such as EMA or a sample containing the drug needs to be shielded from light such as in a dark room except for light irradiation to the sample in order to prevent the drug from being denatured.
  • the PCR target region is a region having a certain length or more, for example, a length of 900 bases (bp) or more. Is generally used. However, in order to amplify a region of 900 bp or more by PCR compared with a target region of about 80 to 200 bp currently used in general quantitative PCR, each cycle takes several times longer, and It cannot be said that there is no problem in quantitativeness.
  • Non-Patent Document 1 discloses an iridium complex that binds to histidine and emits fluorescence.
  • the luminescent material includes DNA, a conductive polymer having at least one amino group that can be protonated in the main chain or side chain, intertwined with DNA, and a cationic functional group that binds to the anion portion of DNA.
  • a luminescent material is known that includes a lipid compound having a fluorescent compound and a metal complex such as fluorescent iridium that binds to the anion portion of DNA (Patent Document 5). In this luminescent material, the metal complex is bonded to the anion portion of DNA to which no conductive polymer or lipid compound is bonded by electrostatic interaction.
  • the present inventors can distinguish between live cells and dead cells by nucleic acid amplification method by using platinum complexes (Patent Document 6) and palladium complexes (Patent Document 7) as in EMA and the like. Is disclosed.
  • An object of the present invention is to provide a method capable of detecting living cells of a microorganism in a simple process and, in a preferred embodiment, even if the target region is relatively short.
  • the present inventors treat a test sample with a drug and selectively amplify chromosomal DNA in a microorganism in the sample by a nucleic acid amplification reaction to use a drug used in a technique for detecting a living cell in the sample.
  • a drug used in a technique for detecting a living cell in the sample was examined.
  • an iridium complex is used, it is possible to detect living cells of microorganisms without requiring light irradiation, cooling, and light-shielding environment, and in a preferred embodiment, a region having a relatively short chain length is used as a target region. Even when set, the present inventors have found that living cells of microorganisms can be detected with high accuracy, and have completed the present invention.
  • the present invention is a method for detecting living cells of microorganisms in a test sample by distinguishing them from dead cells and / or damaged cells, and includes the following steps: a) adding an iridium complex to the test sample; b) a step of amplifying a target region of DNA or RNA of a microorganism contained in a test sample by a nucleic acid amplification method, and c) a step of analyzing an amplification product, I will provide a.
  • the amplification of the target region is preferably performed without extracting nucleic acid from cells. Further, in the above method, it is preferable that the amplification of the target region is performed by adding an agent that suppresses the action of a nucleic acid amplification inhibitor, a magnesium salt, and an organic acid salt or phosphate to the test sample. It is said. Moreover, the said method makes it the preferable aspect that amplification of the said target area
  • the said method makes it a preferable aspect that the said test sample is any one of a foodstuff, a biological sample, drinking water, industrial water, environmental water, drainage, soil, or a wiping sample. Moreover, the said method makes it a preferable aspect that the said microorganisms are bacteria or a virus. Moreover, the said method makes it a preferable aspect that the said bacteria are Gram negative bacteria or Gram positive bacteria. Further, the method is preferably such that the target region is a target region of 50 to 5000 bases.
  • the method has a preferable aspect in which the target region is a target region corresponding to a gene selected from 5S rRNA gene, 16S rRNA gene, 23S rRNA gene, and tRNA gene of DNA of the test sample.
  • the method has a preferred embodiment in which the nucleic acid amplification method is a PCR method, a LAMP method, an ICAN method, an SDA method, an LCR method, a TMA method, a TRC method, an HC method, an SMAP method, or a microarray method.
  • the method is preferably such that the PCR method is performed by a real-time PCR method, and PCR and amplification product analysis are performed simultaneously.
  • the said method makes it a preferable aspect that the analysis of the said amplification product is performed using the standard curve which shows the relationship between the amount of microorganisms produced using the standard sample of microorganisms, and an amplification product.
  • the present invention is a kit for detecting a living cell of a microorganism in a test sample by distinguishing it from a dead cell and / or a damaged cell by a nucleic acid amplification method, and includes the following elements: 1) Iridium complex or An iridium compound that forms an iridium complex when dissolved in an organic solvent capable of binding to iridium as a ligand or a solution containing a substance capable of binding to iridium as a ligand; 2) a primer for amplifying a target region of DNA or RNA of a microorganism to be detected by a nucleic acid amplification method; I will provide a.
  • the kit of the present invention preferably further includes a drug that suppresses the action of the nucleic acid amplification inhibitor, a magnesium salt, and an organic acid salt or phosphate.
  • the kit preferably includes a surfactant.
  • the iridium complex includes NH 3 , RNH 2 , halogen element (Cl, F, Br, I, At), carboxylate (—CO—O—) group, pyridine group, H 2 O , CO 3 2 ⁇ , OH ⁇ , NO 3 ⁇ , ROH, N 2 H 4 , PO 4 3 ⁇ , R 2 O, RO ⁇ , ROPO 3 2 ⁇ , (RO) 2 PO 2 ⁇ , NO 2 ⁇ , N 2 , N 3 ⁇ , R 2 S, R 2 P ⁇ , R 3 P, RS ⁇ , CN ⁇ , RSH, RNC, (RS) 2 PO 2 ⁇ , (RO) 2 P (O) S ⁇ , SCN ⁇ , CO, H ⁇ , and R 2 — includes a ligand selected from the group (provided that the expression “R” represents a saturated or unsaturated organic group).
  • the ligand is NH 3 , RNH 2 , halogen element (Cl, F, Br, I, At), carboxylate (—CO—O—) group, pyridine group, H 2. O, CO 3 2 ⁇ , OH ⁇ , NO 3 ⁇ , ROH, N 2 H 4 , PO 4 3 ⁇ , R 2 O, RO ⁇ , ROPO 3 2 ⁇ , (RO) 2 PO 2 ⁇ , R 2 S, From R 2 P ⁇ , R 3 P, RS ⁇ , CN ⁇ , RSH, RNC, (RS) 2 PO 2 ⁇ , (RO) 2 P (O) S ⁇ , SCN ⁇ , CO, H ⁇ , and R ⁇ It is a preferred embodiment to be selected from the group consisting of
  • the iridium complex is di- ⁇ -chlorobis [( ⁇ -cycloocta-1,5-diene) iridium (I)] and 2-hydroxy-N-pyridine (pentamethylcyclopenta
  • a preferred embodiment is selected from dienyl) iridium (III) dichloride.
  • the method of the present invention is a method for detecting living cells of microorganisms in a test sample by distinguishing them from dead cells and / or damaged cells, and includes the following steps. . a) adding an iridium complex to the test sample; b) a step of amplifying a target region of DNA or RNA of a microorganism contained in a test sample by a nucleic acid amplification method; and c) a step of analyzing an amplification product.
  • the target of amplification may be any nucleic acid in general, and specific examples include single-stranded DNA, double-stranded DNA, single-stranded RNA, and double-stranded RNA. it can.
  • test sample is a target for detecting living cells of microorganisms present therein, and the presence is detected by amplification of a specific region of chromosomal DNA or RNA by a nucleic acid amplification method.
  • a nucleic acid amplification method A foodstuff, biological sample, drinking water, industrial water, environmental water, drainage, soil, or a wipe sample etc. are mentioned.
  • foods include soft drinks, carbonated drinks, nutrition drinks, fruit juice drinks, lactic acid bacteria drinks and other drinks (including concentrated concentrates and powders for preparation of these drinks); ice cream such as ice cream, ice sherbet and shaved ice; Dairy products such as milk, processed milk, milk drinks, fermented milk, butter; enteral nutritional foods, liquid foods, milk for childcare, sports drinks; functional foods such as foods for specified health use and health supplements are preferred.
  • Biological samples include blood samples, urine samples, spinal fluid samples, synovial fluid samples, pleural effusion samples, sputum samples, stool samples, nasal mucus samples, laryngeal mucus samples, gastric lavage fluid samples, pus juice samples, skin mucosa samples, oral cavity
  • Examples include mucus samples, respiratory mucosa samples, digestive mucosa samples, eye conjunctiva samples, placenta samples, germ cell samples, birth canal samples, breast milk samples, saliva samples, vomiting, blister contents, and the like.
  • examples of the environmental water include city water, ground water, river water, and rain water.
  • the test sample may be a food, biological sample, drinking water, industrial water, environmental water, waste water, soil, or a wipe sample itself as described above, or a diluted or concentrated product thereof.
  • pretreatment other than the treatment according to the method of the present invention may be performed. Examples of the pretreatment include heat treatment, filtration, and centrifugation.
  • cells other than microorganisms, protein colloid particles, fats and carbohydrates, etc. present in the test sample may be removed or reduced by treatment with an enzyme having an activity of decomposing them.
  • Examples of cells other than microorganisms present in the test sample include bovine leukocytes and mammary epithelial cells when the test sample is milk, dairy products, or foods made from milk or dairy products.
  • the test sample is a biological sample such as a blood sample, urine sample, spinal fluid sample, synovial fluid sample or pleural effusion sample, red blood cells, white blood cells (granulocytes, neutrophils, basophils, monocytes, lymphoid cells) Spheres), and platelets.
  • the enzyme is not particularly limited as long as it can decompose the contaminants and does not damage the living cells of the microorganism to be detected.
  • a lipolytic enzyme a proteolytic enzyme, and a carbohydrase Enzymes.
  • the enzyme one kind of enzyme may be used alone, or two or more kinds of enzymes may be used in combination, but both lipolytic enzyme and proteolytic enzyme, or lipolytic enzyme, proteolytic enzyme It is preferable to use all of saccharide-degrading enzymes.
  • lipolytic enzyme examples include lipase and phosphatase
  • examples of the proteolytic enzyme include serine protease, cysteine protease, proteinase K, and pronase
  • examples of the saccharide-degrading enzyme include amylase, cellulase, and N-acetylmuramidase.
  • a “microorganism” is an object to be detected by the method of the present invention, can be detected by a nucleic acid amplification method, and an action of an iridium complex that binds to DNA or RNA on a microorganism is a living cell or a dead cell.
  • preferred examples include bacteria, filamentous fungi, yeasts, viruses, and the like.
  • Bacteria include both gram-positive bacteria and gram-negative bacteria.
  • Gram-positive bacteria include Staphylococcus, such as Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis; Micrococcus; Streptococcus spp., Streptococcus spp. Bacillus genus Bacillus (subtilis), Bacillus Basubtilis, Bacillus licheniformis (preferably vegetative cells); Clostridium genus such as Clostridium botulinum and Clostridium perfringens; Mycobacterium tuberculosis and M.
  • Mycobacterium genus mycobacteria and atypical mycobacteria group
  • Mycobacterium intracellulare Mycobacterium abium; Rae bacteria; Actinomyces; Nocardia; Nocardiopsis; Actinomadura; Streptomyces Genus Derumatofirusu genus; Eubacterium; Corynebacterium; Propionibacterium genus, and the like.
  • Gram-negative bacteria include Legionella spp .; Salmonella spp .; Enterohemorrhagic Escherichia coli including O-157, O-26, O-11, O-145; Campylobacter spp .; Alcobacter spp .; Helicobacter spp.
  • Pseudomonas genus such as fungi; Burkholderia genus; Acinetobacter genus; Alcaligenes genus; Chryseobacterium genus; Moraxella genus; Cochella genus; Haemophilus influenzae and other Haemophilus genus; Pasteurella genus; Chromobacterium genus; Streptobacillus genus Bacter, Hafnia, Prezio Enterobacteriaceae such as Monas, Proteus, Providencia, Morganella, Serratia, etc .; Vibrio; Eromonas; Bacteroides; Prevotella; Porphyroonas; Fusobacterium; Leptotricia; Genus Treponema; dysentery spirochete; Borrelia; Mycoplasma; Rickettsia; Chlamydia and the like.
  • Viruses include Poxviridae, Herpesviridae, Adenoviridae, Papillomaviridae, Polyomaviridae, Parvoviridae, Picornaviridae, Caliciviridae, Astroviridae, Coronaviridae, Togaviridae, Examples include Flaviviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Bornaviridae, Arenaviridae, Bunyaviridae, Reoviridae, Retroviridae, and Hepatitis virus .
  • Examples 1 and 3 below it was shown that treatment with an iridium complex makes it possible to distinguish between live and dead cells of Escherichia coli, which is a Gram-negative bacterium. Further, as shown in Examples 2 and 4, it was shown that live cells and dead cells of Staphylococcus aureus can be distinguished by iridium complexes. From these results, it is considered that the iridium complex can be used to distinguish between living cells and dead cells for all microorganisms. Furthermore, it is considered that a virus having the outermost envelope of the same component as the outer cell membrane of Gram-negative bacteria can also be used for distinguishing between live cells and dead cells.
  • virus particles are also referred to as “cells” for convenience.
  • PMA propidium monoazide
  • enteric viruses without envelopes.
  • PMA sodium monoazide
  • PMA is originally a drug that allows clear distinction between bacterial live and dead cells (A. Nocker et al., J. Microbiol. Methods.
  • nucleocapsids are available.
  • the iridium complex is similar to PMA in intestinal viruses that have only nucleocapsids (the enveloped viruses are morphologically very similar to gram-negative bacteria). Therefore, there is a high possibility that the infectious type and the non-infectious type can be clearly determined.
  • a “live cell” is a state (Viable-and-Culturable cell state) that can proliferate when cultured under suitable culture conditions and exhibits the metabolic activity of the microorganism. A microorganism with almost no damage to the cell wall.
  • the metabolic activity mentioned here can be exemplified by ATP activity and esterase activity.
  • virus particles are also referred to as “cells” for convenience.
  • Live cell refers to a state in which a mammalian cell can be infected and propagated with respect to a virus.
  • “Dead cells” are microorganisms that cannot grow even when cultured under suitable culture conditions and do not exhibit metabolic activity (Dead). In addition, although the structure of the cell wall is maintained, the cell wall itself is highly damaged, and a weakly permeable nuclear stain such as propidium iodide penetrates the cell wall. “Dead cells” with respect to viruses refers to a state in which mammalian cells cannot be infected.
  • “Injured cells” (Viable-but-Non Culturable cells) are damaged by human or environmental stress, and are generally proliferated even when cultured under suitable culture conditions. Although it is difficult, the microorganism has a metabolic activity that is lower than that of living cells, but is significantly more active than that of dead cells. Regarding virus, it means a state in which, even if a mammalian cell is infected, it cannot grow in the cell.
  • live cells”, “dead cells” and “damaged cells” mean live cells, dead cells and damaged cells of microorganisms.
  • the present invention is not limited to detection of living cells, but living cells It is intended to provide a method for detecting microorganisms that can be distinguished from dead cells and / or damaged cells.
  • the unit of the number of living cells, damaged cells, and dead cells is usually expressed by the number of cells / ml.
  • the number of viable cells can be approximated by the number of colonies formed (cfu / ml or CFU / ml (colony forming units / ml)) when cultured under suitable culture conditions on a suitable plate medium.
  • a standard sample of damaged cells and / or dead cells can be prepared, for example, by subjecting a living cell suspension to heat treatment, for example, heat treatment in boiling water, in which case damaged cells and / or dead cells are prepared.
  • the number of cells can be approximated by cfu / ml of the live cell suspension before the heat treatment.
  • the heating time in boiling water for preparing damaged cells and / or dead cells varies depending on the type of microorganism. For example, in the case of bacteria described in the examples, it is possible to prepare damaged cells in about 50 seconds. it can. If the heating time is lengthened, the ratio of dead cells becomes higher than damaged cells.
  • a standard sample of damaged cells and / or dead cells can also be prepared by antibiotic treatment.
  • the number of damaged cells and / or dead cells is determined by using a live cell suspension as an antibiotic. After removing the antibiotic, measure the transmittance of visible light (wavelength 600nm), that is, turbidity, and compare it with the turbidity of the live cell suspension whose live cell number concentration is known in advance. It can be approximated by the number of colonies formed (cfu / ml) when cultured under suitable culture conditions on a suitable plate medium.
  • plaque-forming units pfu or PFU (plaque-forming units)
  • the method of the present invention is intended for detection of live cells, and the microorganisms distinguished from live cells may be damaged cells or dead cells.
  • “detection of living cells” includes both determination of the presence or absence of living cells in the test sample and determination of the amount of living cells. Further, the amount of living cells is not limited to an absolute amount, and may be an amount relative to a control sample. Further, “detecting a living cell by distinguishing it from a dead cell and / or a damaged cell” means that a living cell is selectively detected as compared with a dead cell and / or a damaged cell. The “discrimination between live cells and dead cells and / or damaged cells” includes discrimination between live cells and both dead cells and damaged cells.
  • the test sample may have an activity of degrading cells other than microorganisms, protein colloid particles, fat, or carbohydrates present in the test sample.
  • the process of processing with the enzyme which has may be included.
  • Step a) An iridium complex (hereinafter also referred to as “agent of the present invention” or simply “agent”) is added to the test sample. That is, the microorganism in the test sample is treated with the drug. The drug is presumed to inhibit the PCR reaction of the target region by binding or interfering directly with nucleic acid (DNA or RNA) or indirectly via protein or the like.
  • the drug has a different action on living cells and damaged or dead cells, bovine leukocytes and other somatic cells, leukocytes, platelets, etc., more specifically, than the cell walls of live cells. It is preferable that it is highly permeable to cell walls of damaged cells or dead cells, or somatic cells such as bovine leukocytes, and cell membranes such as leukocytes and platelets.
  • the iridium complex is not particularly limited as long as it has different permeability to the cell wall between living cells, damaged cells, and / or dead cells, and can bind to nucleic acid in the cells to inhibit the PCR reaction of the target region,
  • a ligand at least NH 3 , RNH 2 , halogen element (Cl, F, Br, I, At), carboxylate (—CO—O—) group, pyridine group, H 2 O, CO 3 2 ⁇ , OH ⁇ , NO 3 ⁇ , ROH, N 2 H 4 , PO 4 3 ⁇ , R 2 O, RO ⁇ , ROPO 3 2 ⁇ , (RO) 2 PO 2 ⁇ , NO 2 ⁇ , N 2 , N 3 ⁇ , R 2 S, R 2 P ⁇ , R 3 P, RS ⁇ , CN ⁇ , RSH, RNC, (RS) 2 PO 2 ⁇ , (RO) 2 P (O) S ⁇ , SCN ⁇ ,
  • saturated organic group examples include alkyl groups such as methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, cyclobutyl, pentyl, cyclopentyl, hexyl, cyclohexyl, octyl, and cyclooctyl.
  • unsaturated organic group examples include benzyl group (benzene ring), naphthyl group (naphthalene ring), allyl group, cyclooctadienyl group, cyclooctene group, pentamethylcyclopentadienyl group, and indenyl group. .
  • These saturated organic groups and unsaturated organic groups may have a substituent.
  • Examples of the ligand include NH 3 , RNH 2 , halogen element (Cl, F, Br, I, At), carboxylate (—CO—O—) group, pyridine group, H 2 O, CO 3 2 ⁇ , OH ⁇ , NO 3 ⁇ , ROH, N 2 H 4 , PO 4 3 ⁇ , R 2 O, RO ⁇ , ROPO 3 2 ⁇ , (RO) 2 PO 2 ⁇ , R 2 S, R 2 P ⁇ , R 3
  • a halogen element Cl, F, Br, I, At
  • carboxylate —CO—O—
  • iridium complex examples include the following compounds. Di- ⁇ -chlorobis [( ⁇ -cycloocta-1,5-diene) iridium (I)] (Di- ⁇ -chlorobis [( ⁇ -cycloocta-1,5-diene) iridium (I)]) C 16 H 24 Cl 2 Ir 2 2-hydroxy-N-pyridine (pentamethylcyclopentadienyl) iridium (III) dichloride C 15 H 20 Cl 2 IrNO (Acetylacetonato) dicarbonyliridium (I)) C 7 H 7 IrO 4 (Acetylacetonato) (1,5-cyclooctadiene) iridium (I) C 13 H 19 IrO 2 (Acetylacetonato) (1,5-cyclooctadiene) iridium (I) C 13 H 19 IrO 2 (Acetylacetonato) (1,5-cycloocta
  • Preferred examples of the complex include the following compounds.
  • Di- ⁇ -chlorobis [( ⁇ -cycloocta-1,5-diene) iridium (I)] also known as: bis (1,5-cyclooctadiene) diiridium (I) dichloride (bis (1,5-cyclooctadiene) diiridium (I) dichloride)) (Chemical Formula 1, Molecular Weight (MW) or Formula Weight (FW): 671.70) 2-Hydroxy-N-pyridine (pentamethylcyclopentadienyl) iridium (III) dichloride (Chemical Formula 2, Molecular Weight (MW) or Formula Weight (FW): 493.45)
  • the iridium complex examples include an iridium complex formed by dissolving an iridium compound in an organic solvent capable of binding to iridium as a ligand or a solution containing a substance capable of binding to iridium as a ligand.
  • examples of such an iridium compound include an iridium compound that forms a macromolecule by a covalent bond between iridium and another element or group.
  • the element or group include halogen elements (Cl, F, Br, I, At), OH ⁇ , NO 3 ⁇ , CH 3 COO ⁇ , PO 4 3 ⁇ , RO ⁇ , CO 3 2 ⁇ , ROPO 3 2 ⁇ .
  • the iridium compound include iridium chloride, iridium bromide, iridium fluoride, iridium iodide, iridium hydroxide, iridium nitrate, iridium carbonate, iridium acetate, dimethoxyiridium, iridium methoxyphosphate, iridium phosphate, and chloride.
  • Examples include iridium acid, disulfmethyl iridium, dicyano iridium, dithiocyanate iridium, iridium dihydride, methyl iridium, iridium oxide, iridium pentachloride (IV) diammonium (diammonium hexachloroiridium (IV)), and the like.
  • preferable compounds include iridium chloride, iridium bromide, iridium fluoride, and iridium iodide, and particularly preferable compounds include iridium chloride.
  • Examples of iridium chloride include iridium (III) chloride and iridium (IV) chloride.
  • Examples of the organic solvent include dimethyl sulfoxide (DMSO) and benzonitrile.
  • Examples of the complex obtained by dissolving iridium chloride in DMSO include dichlorobis (dimethylsulfoxide) iridium (III).
  • a harmaline solution for example, an aqueous solution of harmaline hydrochloride
  • a diferrocenyl-phosphine solution for example, DMSO of diferrocenyl phosphine And the like.
  • the iridium complex may be a multimer such as a dimer (a dimer having two iridium elements in one complex).
  • dimer a dimer having two iridium elements in one complex.
  • dimer include Di- ⁇ -chlorobis [( ⁇ -cycloocta-1,5-diene) iridium (I)].
  • iridium complexes and iridium compounds that form macromolecules by covalent bonding of iridium and other elements or groups are commercially available (for example, Wako Pure Chemical Industries, Sigma), and can be used.
  • Wako Pure Chemical Industries, Sigma Wako Pure Chemical Industries, Sigma
  • one type of drug may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • Conditions for treatment with a drug can be set as appropriate. For example, after adding various concentrations of the drug to the suspension of living and dead cells and / or damaged cells of the microorganism to be detected, and for various times, the cells are separated by centrifugation or the like, By analyzing by a nucleic acid amplification method, it is possible to determine conditions that make it easy to distinguish between live cells and dead cells and / or damaged cells. Furthermore, after adding various concentrations of drugs to living cells of microorganisms to be detected and somatic cells such as bovine leukocytes or suspensions of platelets, and leaving them to stand for a predetermined time, the cells and the above-mentioned various kinds are obtained by centrifugation or the like. By separating the cells and analyzing them by the nucleic acid amplification method, it is possible to determine conditions that make it easy to distinguish between living cells and various cells.
  • the final concentration is 20 to 3000 ⁇ M, preferably 25 to 300 ⁇ M, 4 to 43 ° C. Examples are 5 minutes to 2 hours.
  • 2-Hydroxy-N-pyridine (pentamethylcyclopentadienyl) iridium (III) dichloride the final concentration is 20 to 3000 ⁇ M, preferably 50 to 300 ⁇ M, 4 to 43 ° C., 5 minutes to 2 hours.
  • conditions can be set in accordance with these iridium complexes.
  • the addition of the drug to the test sample may be performed by adding the drug to the suspension of the test sample as described above, or may be performed by adding the test sample to the drug solution. .
  • the agent of the present invention is more permeable to the cell wall of dead cells and / or damaged cells than the cell wall of living cells. Therefore, within the action time shown above, the cell wall / cell membrane of living cells of microorganisms does not substantially permeate, and the cell membrane of damaged cells or dead cells of microorganisms or somatic cells that are dead cells permeate. Conceivable. As a result, the drug enters the somatic and microbial dead cells as well as the damaged cells and subsequently binds or interferes directly or indirectly with chromosomal DNA or RNA, resulting in It is presumed that DNA or RNA to which a drug is bound does not serve as a template for nucleic acid amplification reaction.
  • chromosomal DNA or RNA When drugs permeate preferentially to damaged or dead cells over live cells, the target region of chromosomal DNA or RNA is amplified by nucleic acid amplification in live cells, whereas in damaged or dead cells, chromosomal DNA or The drug binds or interferes with RNA directly or indirectly, and the nucleic acid amplification reaction is inhibited. Therefore, live cells can be selectively detected compared to damaged cells and dead cells.
  • the treatment with the agent in step a) may be performed once or may be repeated a number of times.
  • the concentration of the drug is preferably higher in the first drug treatment than in the second time and lower, and lower in the second and subsequent drug processes than in the first time. In the first drug treatment, it is preferable to shorten the treatment time compared to the second and subsequent drug treatments.
  • a step of removing unreacted drug may be added between the previous drug process and the subsequent drug process.
  • the method for removing the drug include a method of centrifuging a test sample, separating a precipitate containing a microorganism and a supernatant containing a drug, and removing the supernatant.
  • Step b) the target region of the DNA or RNA of the microorganism contained in the test sample after the drug treatment is amplified by a nucleic acid amplification method.
  • the DNA or RNA used as a template for nucleic acid amplification may be extracted from a microbial cell, or a sample treated with a drug without extracting nucleic acid from the cell may be used as it is. It is preferable not to extract the nucleic acid.
  • a nucleic acid amplification reaction may be performed by adding an agent that suppresses the action of a nucleic acid amplification inhibitor to a nucleic acid amplification reaction solution containing a test sample. Preferred (see Japanese Patent No. 4825313, WO2011 / 010740).
  • a magnesium salt and an organic acid salt or phosphate it is more preferable to add a magnesium salt and an organic acid salt or phosphate to the nucleic acid amplification reaction solution containing the test sample.
  • a surfactant it is particularly preferable to add a surfactant to the nucleic acid amplification reaction solution containing the test sample.
  • a surfactant, a magnesium salt, or an organic acid salt or phosphate to the amplification reaction solution in addition to the agent that suppresses the action of the nucleic acid amplification inhibitor, Alternatively, any two or more of them can be used in combination, and it is particularly preferable to add all of them.
  • the order of addition of the agent that suppresses the action of the nucleic acid amplification inhibitor, the surfactant, the magnesium salt, and the organic acid salt or phosphate is not limited, and they may be added simultaneously. If necessary, the nucleic acid elongation enzyme may be added at a concentration higher than that used in the normal PCR method, for example, 2 to 10 times.
  • a nucleic acid amplification inhibitor is a substance that inhibits a nucleic acid amplification reaction or a nucleic acid extension reaction.
  • the positive charge inhibitor include calcium ions, polyamines, and heme.
  • Examples of the negative charge inhibitor include phenol, phenolic compounds, heparin, and Gram-negative bacterial cell wall outer membrane. Foods and clinical specimens are said to contain many substances that inhibit such nucleic acid amplification reactions.
  • drugs that suppress the action of the nucleic acid amplification inhibitor as described above include albumin, dextran, T4 gene 32 protein, acetamide, betaine, dimethyl sulfoxide, formamide, glycerol, polyethylene glycol, soybean trypsin inhibitor, ⁇ 2-macroglobulin, tetra
  • examples thereof include one or more selected from methylammonium chloride, lysozyme, phosphorylase, and lactate dehydrogenase.
  • polyethylene glycol examples include polyethylene glycol 400 and polyethylene glycol 4000.
  • betaine examples include trimethylglycine and its derivatives.
  • phosphorylase and lactate dehydrogenase examples include glycogen phosphorylase and lactate dehydrogenase derived from rabbit muscle.
  • glycogen phosphorylase glycogen phosphorylase b is preferable. In particular, it is preferable to use albumin, dextran, T4 gene 32 protein, or lysozyme.
  • albumin typified by BSA may reduce nucleic acid amplification inhibition by binding to a nucleic acid amplification inhibitor such as heme (the Abu Al- Soud et al.)
  • T4 Gene 32 protein is a single-stranded DNA-binding protein that binds in advance to the single-stranded DNA that is the template in the nucleic acid amplification process and the template is free from degradation by nucleolytic enzymes, thus inhibiting the nucleic acid amplification reaction.
  • Two possibilities are considered that nucleic acid amplification proceeds without being inhibited by binding to a nucleic acid amplification inhibitor similar to BSA (Abu Al-Soud et al.) .
  • BSA, T4 Gene 32 protein, and proteinase inhibitor can reduce proteolytic activity by binding to proteinase and maximize the function of nucleic acid synthase.
  • proteolytic enzymes may remain in milk and blood, and at that time, nucleic acid synthase is degraded by the addition of BSA or proteolytic enzyme inhibitors (soybean trypsin inhibitor or ⁇ 2-macroglyblin).
  • BSA proteolytic enzyme inhibitors
  • Dextran is a polysaccharide generally synthesized by lactic acid bacteria using glucose as a raw material. It has been reported that a similar polysaccharide-peptide complex called mucin adheres to the intestinal mucosa (Ruas-Madiedo, P., Applied and Environmental Microbiology, 74: 1936-1940, 2008), and dextran is a negative charge inhibitor. It is presumed that there is a possibility of binding to these inhibitory substances by adsorbing in advance (adsorbed on nucleic acid synthase) or positive charge inhibitory substance (adsorbed on nucleic acid). In addition, it is inferred that lysozyme is adsorbed to a nucleic acid amplification inhibitor thought to be contained in a large amount in milk (Abu Al-Soud et al.).
  • albumin T4 gene 32 protein
  • dextran a substance represented by albumin
  • lysozyme drugs that suppress the action of nucleic acid amplification inhibitors.
  • Albumin includes bovine serum albumin, ovalbumin, milk albumin, human serum albumin and the like. Of these, bovine serum albumin (BSA) is preferred. Albumin may be a purified product and may contain other components such as globulin as long as the effects of the present invention are not impaired. Moreover, a fraction may be sufficient.
  • the concentration of albumin in the test sample (nucleic acid amplification reaction solution) is, for example, usually 0.0001 to 1%, preferably 0.01 to 1%, more preferably 0.2 to 0.6%.
  • dextran examples include dextran 40 and dextran 500. Of these, dextran 40 is preferred.
  • concentration of dextran in the test sample (nucleic acid amplification reaction solution) is, for example, usually 1 to 8%, preferably 1 to 6%, more preferably 1 to 4%.
  • the concentration of T4 gene 32 protein (for example, Roche: also called gp32) in the test sample (nucleic acid amplification reaction solution) is usually 0.01 to 1%, preferably 0.01 to 0.1%. Preferably, the content is 0.01 to 0.02%.
  • Lysozyme is lysozyme derived from egg white.
  • the concentration of lysozyme in the test sample (nucleic acid amplification reaction solution) is, for example, usually 1 to 20 ⁇ g / ml, preferably 6 to 15 ⁇ g / ml, more preferably 9 to 13 ⁇ g / ml.
  • Non-ionic surfactants such as Triton (registered trademark of Union Carbide), Nonidet (registered trademark of Shell), Tween (registered trademark of ICI), Brij (registered trademark of ICI), etc.
  • anionic surfactants such as SDS (sodium dodecyl sulfate) and cationic surfactants such as stearyldimethylbenzylammonium chloride.
  • Triton is Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether), Nonidet is Nonidet P-40 (octylphenyl-polyethylene glycol), etc.
  • Tween is Tween 20 (polyethylene glycol sorbitan monolaurate), Tween 40 (polyethylene glycol sorbitan monopalmitate), Tween 60 (polyethylene glycol sorbitan monostearate), Tween 80 (polyethylene glycol sorbitan monooleate), etc.
  • Brij as Brij56 (polyoxyethylene (10) cetyl ether), Brij58 (polyoxyethylene (20) cetyl ether) and the like.
  • the kind and concentration of the surfactant in the nucleic acid amplification reaction solution are not particularly limited as long as they promote the penetration of the PCR reagent into the cells of the microorganism and substantially inhibit the nucleic acid amplification reaction.
  • the range of 0.0005 to 0.01% is preferable when an anionic surfactant is used, and the range of 0.0005 to 0.01% is preferable when a cationic surfactant is used.
  • SDS for example, it is usually 0.0005 to 0.01%, preferably 0.001 to 0.01%, more preferably 0.001 to 0.005%, more preferably 0.00. 001 to 0.002%.
  • the range of 0.001 to 1.5% is preferable.
  • Nonidet P-40 it is usually in the range of 0.001 to 1.5%, preferably 0.002 to 1.2%, more preferably 0.9 to 1.%. 1%.
  • Tween 20 Tween 40, Tween 60, or Tween 80, it may be usually in the range of 0.001 to 1.5%, preferably 0.002 to 1.2%, more preferably 0.9. -1.1%.
  • Brij56 or Brij58 it is usually in the range of 0.1 to 1.5%, preferably 0.4 to 1.2%, more preferably 0.7 to 1.1%.
  • the enzyme solution used for the nucleic acid amplification reaction contains a surfactant, only the surfactant derived from the enzyme solution may be used, or the same or different surfactant may be added.
  • magnesium salts include magnesium chloride, magnesium sulfate, magnesium carbonate and the like.
  • concentration of the magnesium salt in the test sample (nucleic acid amplification reaction solution) is, for example, usually 1 to 10 mM, preferably 2 to 6 mM, more preferably 2 to 5 mM.
  • organic acid salts include salts of citric acid, tartaric acid, propionic acid, butyric acid, and the like.
  • the salt include sodium salt and potassium salt.
  • pyrophosphate etc. are mentioned as a phosphate. These may be one kind, or a mixture of two or more kinds.
  • the concentration of the organic acid salt or phosphate in the test sample (nucleic acid amplification reaction solution) is, for example, usually 0.1 to 20 mM, preferably 1 to 10 mM, more preferably 1 to 5 mM in total amount (patent) No. 4127847, see WO2007 / 094077).
  • the extraction method is not particularly limited as long as the extracted DNA can function as a template in nucleic acid amplification, and is performed according to a commonly used method for extracting microbial DNA. be able to.
  • nucleic acid When nucleic acid is not extracted from a test sample, DNA or RNA present in cells in the presence of a drug that suppresses the action of the nucleic acid amplification inhibitor and, if necessary, other components Is amplified by a nucleic acid amplification method.
  • a microbial cell suspension or a suspension of microbial cells treated with proteolytic enzyme, lipolytic enzyme, glycolytic enzyme, etc. is used, and nucleic acid is not extracted for template preparation. It is preferable.
  • the target region is amplified by a nucleic acid amplification method by an ordinary method using the extracted DNA or RNA as a template.
  • the nucleic acid amplification method preferably includes a step of heat denaturation of nucleic acid at a high temperature, for example, 90 to 95 ° C., preferably 93 to 95 ° C., more preferably 94 to 95 ° C.
  • Nucleic acid amplification methods include PCR methods (Polymerase chain reaction: White, TJet et al., Trends Genet, 5, 185 (1989)), LAMP method (Loop-Mediated Isothermal Amplification: New gene amplification method (LAMP method)) Principles and Applications, Nobutomi Tsuyoshi, Hase Satoshi, BIO INDUSTRY, Vol.18, No.2, 15-23, 2001), ICAN method (Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids: Masamitsu Hamada et al., Bedside ICAN Development of Chlamydia / Phosphorus Gene Detection Reagents by Method, 2002, 51st Annual Meeting of the Japanese Society for Medical Examination, 121, Hiroyuki Mukai, Development and Application of the ICAN Method, 2002, 14th Hokkaido Transfusion Symposium, 20), SDA method (Strand Displacement Amplification: Edward L.
  • HC method Hybrid Capture: Nazarenko I., Kobayashi L. et al., J. Virol. Methods, vol.154: p. 76-81, 2008
  • SMAP method Smart Amplification Process, Smart Amp method; Mitani Y., et al., Nature Methods, vol.4, No.3, p.257-262 (2007)
  • microarray method Richard P. Spence, et al., J. Clin. Microbiol., Vol.46, No.5, .p.1620-1627, 2008
  • PCR methods include quantitative PCR methods (Quantitative PCR or Real-TimeilPCR: VanGuilder HD, et al., Biotechniques, 2008, Apr; 44 (5), 619-26, Spackman E., et al., Methods Mol Biol ., 2008, Vol.436, p.19-26), RT-PCR method (Reverse Transcription PCR: Freeman WM, et al., Biotechniques, 1999, Jan; 26 (1), 112-22, 124-5) Real-time PCR method (Nogva et al., Appl. Environ.
  • the “target region” refers to a region of chromosomal DNA or RNA that can be amplified by a nucleic acid amplification method using a primer used in the present invention, and can detect a microorganism to be detected. If it does not restrict
  • the target region preferably has a sequence specific to the microorganism to be detected. Further, depending on the purpose, it may have a sequence common to a plurality of types of microorganisms. Furthermore, the target area may be single or plural.
  • the amount of living cells of the detection target microorganism and the number of living cells of many types of microorganisms can be calculated. Can be measured simultaneously.
  • the length of the target region is usually 50 to 5000 bases or 50 to 3000 bases. In a preferred embodiment of the method of the present invention, it is possible to distinguish between live cells and dead cells and / or damaged cells even if the target region is shorter than the conventional method, for example, about 400 bases in length.
  • Primers used for nucleic acid amplification can be appropriately set based on the principles of various nucleic acid amplification methods, and are not particularly limited as long as they can specifically amplify the target region.
  • target regions are various specific genes such as 5S rRNA gene, 16S rRNA gene, 23S rRNA gene, tRNA gene, and pathogenic gene.
  • One or a part of these genes may be targeted, and a region spanning two or more genes may be targeted.
  • a part of the 16S rRNA gene specific to Cronobacter sakazaki can be amplified.
  • a commercially available primer for 16S rRNA gene amplification may also be used.
  • the target region includes a pathogenic gene.
  • pathogenic genes include Listeria ricin O (hlyA) gene of Listeria, enterotoxin (enterotoxin) gene and invasion (invA) gene of Salmonella, pathogenic E. coli O-157, O-26, O-111, etc.
  • Verotoxin gene Enterobacter genus or Cronobacter genus outer-membrane-protein) A (ompA) gene (Cronobacter sakazaki) and macromolecular synthesis (MMS) operon (Cronobacter sakazaki), Legionella bacterium -invasion protein (mip) gene, heat-resistant hemolytic toxin gene of Vibrio parahaemolyticus, heat-resistant hemolytic toxin-like toxin gene, Shiga and intestinal invasive Escherichia coli ipa (invasion plasmid antigen gene) and invE gene (invasion gene) , Staphylococcus aureus enterotoxin gene, Bacillus Reus bacteria cereulide (emetic toxin) gene and enterotoxin gene, various toxin genes such as Clostridium botulinum and the like.
  • ompA Enterobacter genus or Cronobacter genus outer-me
  • hemagglutinin (H protein) gene In the case of an influenza virus having an envelope, hemagglutinin (H protein) gene, neuraminidase (N protein) gene, RNA polymerase gene of Caliciviridae virus represented by norovirus, gene regions encoding various capsid proteins, etc. Can be mentioned.
  • noroviruses rotaviruses and adenoviruses are available as food poisoning viruses.
  • the target genes are gene regions encoding RNA polymerase genes and capsid proteins as in the case of noroviruses.
  • a primer common to multiple types of microorganisms living cells of multiple types of microorganisms in a test sample can be detected.
  • a primer specific to a specific bacterium used, a living cell of a specific bacterial species in a test sample can be detected.
  • the nucleic acid amplification reaction conditions are specific according to the principle of each nucleic acid amplification method (PCR method, LAMP method, ICAN method, SDA method, LCR method, TMA method, TRC method, HC method, SMAP method, microarray method, etc.) As long as general amplification occurs, there is no particular limitation, and it can be set as appropriate.
  • Step c) Analyze amplification products amplified by the nucleic acid amplification method.
  • the analysis of the amplification product is performed following step b) or simultaneously with step b), depending on the nucleic acid amplification method employed in step b). For example, in the case of real-time PCR, step c) can be performed simultaneously with step b).
  • the analysis method is not particularly limited as long as the nucleic acid amplification product can be detected or quantified, and examples thereof include electrophoresis.
  • the amount and size of the nucleic acid amplification product can be evaluated. Further, according to the real-time PCR method, the PCR amplification product can be rapidly quantified.
  • the change in fluorescence intensity is generally a noise level and is equal to zero until the number of amplification cycles is 1 to 10. Therefore, these are regarded as sample blanks with zero amplification products, and their standard deviation SD is calculated.
  • a value obtained by multiplying the SD value by 10 is referred to as a threshold value, and the number of PCR cycles that first exceeds the threshold value is referred to as a cycle threshold value (Ct value).
  • the presence or absence of an amplification product can also be determined by analyzing the melting temperature (TM) pattern of the amplification product.
  • TM melting temperature
  • analysis of nucleic acid amplification products can be performed using a standard curve that shows the relationship between the amount of microorganisms prepared using a standard sample of the identified microorganism and the amplification product.
  • a standard curve prepared in advance can be used, but it is preferable to use a standard curve prepared by performing each step of the present invention on the standard sample simultaneously with the test sample. If the correlation between the amount of microorganism and the amount of DNA or RNA is examined in advance, DNA or RNA isolated from the microorganism can also be used as a standard sample.
  • kit of the present invention is a kit for distinguishing and detecting living cells of microorganisms in a test sample from dead cells and / or damaged cells by a nucleic acid amplification method. Including complexes.
  • the kit of the present invention may further include a primer for amplifying a target region of DNA or RNA of a microorganism to be detected by a nucleic acid amplification method.
  • the kit of the present invention may further contain a drug that suppresses the action of a nucleic acid amplification inhibitor, a magnesium salt, and an organic acid salt or phosphate, or two or more of these. In a more preferred embodiment, it may contain all of an agent that suppresses the action of a nucleic acid amplification inhibitor, a magnesium salt, and an organic acid salt or phosphate. Furthermore, it is more preferable that the nucleic acid elongation enzyme contains a concentration 2 to 10 times the concentration used in normal PCR or normal real-time PCR. Moreover, the kit of the present invention may further contain a surfactant.
  • the kit of the present invention can be used for carrying out the method of the present invention.
  • an enzyme having an activity of degrading cells other than microorganisms, protein colloid particles, fat, or carbohydrates present in a test sample can be added to the kit of the present invention.
  • the nucleic acid amplification reaction may be a PCR method (including quantitative PCR method, RT-PCR method, real-time PCR method), LAMP method, ICAN method, SDA method, LCR method, TMA method, TRC method, HC method, SMAP method, or The microarray method is preferred.
  • the drug such as a crosslinking agent is the same as that described in the method of the present invention.
  • kits of the present invention are the same as the compounds described for the method of the present invention.
  • drugs that suppress the action of nucleic acid amplification inhibitors include albumin, dextran, and T4 gene 32 protein, acetamide, betaine, dimethyl sulfoxide, formamide, glycerol, polyethylene glycol, soybean trypsin inhibitor, ⁇ 2-macroglobulin, tetramethyl Any one or plural kinds selected from ammonium chloride, lysozyme, phosphorylase, and lactate dehydrogenase can be exemplified.
  • examples of the magnesium salt include magnesium chloride, magnesium sulfate, magnesium carbonate and the like.
  • organic acid salt examples include salts of citric acid, tartaric acid, propionic acid, butyric acid and the like.
  • examples of the salt include sodium salt and potassium salt.
  • pyrophosphate etc. are mentioned as a phosphate. These may be one kind, or a mixture of two or more kinds.
  • the enzyme can decompose non-microorganism cells, protein colloid particles, fats and carbohydrates, etc. present in the test sample, and does not damage the living cells of the target microorganism. If it is, it will not restrict
  • the enzyme one kind of enzyme may be used alone, or two or more kinds of enzymes may be used in combination, but both lipolytic enzyme and proteolytic enzyme, or lipolytic enzyme, proteolytic enzyme It is preferable to use all of saccharide-degrading enzymes.
  • lipolytic enzyme examples include lipase and phosphatase
  • examples of the proteolytic enzyme include serine protease, cysteine protease, proteinase K, and pronase
  • examples of the saccharide-degrading enzyme include amylase, cellulase, and N-acetylmuramidase.
  • the kit of the present invention can further contain a diluent, a reaction solution for reaction with an iridium complex, an enzyme and reaction solution for nucleic acid amplification, instructions describing the method of the present invention, and the like.
  • Example 1 Identification of living and dead cells of Escherichia coli by Di- ⁇ -chlorobis [( ⁇ -cycloocta-1,5-diene) iridium (I)]
  • an iridium complex is used. E. coli live cells and dead cells were identified.
  • Di- ⁇ -chlorobis [( ⁇ -cycloocta-1,5-diene) iridium (I)] which is an iridium complex dimer (a dimer having two iridium elements in one complex), was used as the iridium complex. .
  • test Materials and Methods 1-1) A live cell suspension (1.2 ⁇ 10 7 cfu / ml) of E. coli JCM1649 strain was prepared using sterilized water. A portion of this live cell suspension is immersed in boiling water for 3 minutes to give a damaged / dead cell suspension (1.2 ⁇ 10 7 cells / ml. Hereinafter, the damaged and dead cells are collectively referred to as dead cells). Prepared). 90 ⁇ l of each of these live cell suspensions and dead cell suspensions was subjected to the following test.
  • the JCM1649 strain can be obtained from JCM (National Institute of Physical and Chemical Research, BioResource Center, Microbial Materials Development Office (3-1-1 Takanodai, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture 305-0074)).
  • test sample 10 ⁇ l of each of the above iridium complex solutions was added to 90 ⁇ l of the live cell suspension or 90 ⁇ l of the dead cell suspension and kept at 37 ° C. for 30 minutes in a constant temperature water bath. . Thereafter, the mixture was cooled and centrifuged (4 ° C., 15,000 ⁇ G, 5 minutes), and the supernatant was removed. The precipitate (pellet) was washed with 1 ml of sterilized water. The washed pellet (corresponding to 5 ⁇ l of cell suspension) was used as a PCR amplification sample.
  • PCR amplification A concentrated solution of a mixture of drugs that suppresses the action of a nucleic acid amplification inhibitor necessary for efficient PCR without extracting nucleic acids from cells (this solution is used as a concentrated direct component, cDBC Was prepared).
  • bovine serum albumin (BSA; Sigma A7906), trisodium citrate dihydrate (TSC: Tri-Sodium Citrate Dihydrate; Kanto Chemical, Tokyo), magnesium chloride hexahydrate (31404-15 Nacalai Tesque) , Kyoto), egg white lysozyme (126-02671 Lysozyme from egg white; Wako Pure Chemicals, Osaka), Brij58 (P5884-100G; Sigma) stock solutions were mixed to the concentrations shown in Table 1, and cDBC was mixed. Prepared.
  • Brij 58, MgCl 2 and TSC were dissolved in sterilized water, autoclaved (121 ° C., 20 minutes), cooled to room temperature, returned to room temperature, and used as a stock solution.
  • a stock solution was prepared with sterilized water, and sterilized by filtration through a 0.22 ⁇ m filter to obtain a stock solution.
  • real-time PCR shown in Table 2 without performing extraction of nucleic acids from cells is hereinafter referred to as “direct real-time PCR”.
  • a master mix master mix for direct real-time PCR
  • the above-mentioned Taq DNA Polymerase with Standard Taq Buffer is used as a qPCR buffer, 4 times the amount of Taq polymerase is used as usual, and a predetermined amount of cDBC (10 x DBC) is added to this buffer.
  • a PCR (DqPCR) master mix was prepared.
  • the master mix for direct real-time PCR was added to the previously prepared PCR amplification sample, and real-time PCR amplification (40 cycles) was performed twice.
  • NEB New England Biolabs product
  • Primer ENT-16S forward Enterobacteriaceae-specific 16S rRNA gene detection forward primer (5'-GTTGTAAAGCACTTTCAGTGGTGAGGAAGG-3 ': SEQ ID NO: 1)
  • Primer ENT-16S reverse Intestine A reverse primer (5′-GCCTCAAGGGCACAACCTCCAAG-3 ′: SEQ ID NO: 2) for detection of 16S rRNA gene specific for Enterobacteriaceae was used as a PCR primer (both primers were outsourced to Nippon Gene).
  • the fragment length of the amplified rRNA gene is 424 bp.
  • an oligonucleotide having the sequence of SEQ ID NO: 3 (5 '-/ 56-FAM / AACTGCATC / ZEN / TGATACTGGCAGGCT / 3lABkFQ / -3') was used. .
  • This probe was consigned and manufactured by Integrated DNA Technologies with a specification that a fluorescent substance 56-FAM was placed at the 5 ′ end of the oligonucleotide, a quencher dye of 31ABkFQ was placed at the center and ZEN at the center, and 31ABkFQ.
  • the nucleotide sequence information on the primers of SEQ ID NOs: 1 and 2 was obtained from Nakano, S. et al., J. Food Prot. 66: 1798-1804, 2003, and the nucleotide sequence of ENA-16S TaqMan probe of SEQ ID NO: 3 Sequence information was obtained by selecting the complementary region of the 16S rRNA gene in the Enterobacteriaceae family from the GenBank database (http://www.ebi.ac.uk/genbank/).
  • Real-time PCR was performed twice using the real-time PCR apparatus (StepOnePlus Real-Time PCR System; Applied Biosystems) under the following PCR thermal cycle conditions. 1) 95 °C, 20 seconds (1 cycle) 2) 95 °C, 5 seconds; 60 °C, 1 minute (40 cycles) As a negative control, 5 ⁇ l of sterilized water was used as a template.
  • Table 3 shows the results of real-time PCR.
  • No Agent indicates a negative control.
  • Example 2 Identification of live and dead cells of Staphylococcus aureus by Di- ⁇ -chlorobis [( ⁇ -cycloocta-1,5-diene) iridium (I)] Using iridium complex dimers, it has been shown that it is possible to clearly distinguish between live and dead cells of E. coli, a representative gram-negative bacterium. In this example, it was examined whether live and dead cells of S. aureus, which is a gram-positive bacterium, can be clearly distinguished by the same iridium complex dimer.
  • Test Materials and Methods 1-1) A live cell suspension (4.5 ⁇ 10 7 cfu / ml) of S. aureus ATCC 6538P strain was prepared using sterilized water. A part of this live cell suspension was immersed in boiling water for 3 minutes to prepare a dead cell suspension (4.5 ⁇ 10 7 cells / ml). 90 ⁇ l of each of these live cell suspensions and dead cell suspensions was subjected to the following test.
  • test sample with iridium complex 10 ⁇ l of each of the above iridium complex solutions is added to 90 ⁇ l of the live cell suspension or 90 ⁇ l of the dead cell suspension, and 15 ° C. at 37 ° C. in a constant temperature bath. Hold for a minute. Thereafter, the mixture was cooled and centrifuged (4 ° C., 15,000 ⁇ G, 5 minutes), and the supernatant was removed. The pellet was washed with 1 ml of sterile water. The washed pellet (corresponding to 5 ⁇ l of cell suspension) was used as a PCR amplification sample.
  • PCR amplification A direct real-time PCR (DqPCR) master mix was prepared with the composition shown in Table 4 below. Specifically, SYBRPremix Ex Taq TM PCR Master Mix (2 ⁇ ) (Takara-Bio Co., Ltd, Otsu, Japan) is used as a real-time PCR buffer, and Bacteria Screening PCR Kit as a PCR amplification forward primer and reverse primer. Primer Mix BS (5 ⁇ M each) attached to (Takara-Bio) was used. This primer mix is a primer that enables detection of both Staphylococcus and Bacillus, and the length of the amplified gene is about 380 bp. Real-time PCR was performed twice.
  • real-time PCR was performed under the following PCR thermal cycle conditions. 1) 95 °C, 1 minute (1 cycle) 2) 95 °C, 10 seconds; 59 °C, 30 seconds; 72 °C, 30 seconds (40 cycles)
  • a negative control 5 ⁇ l of sterilized water was used as a template.
  • Table 5 shows the results of real-time PCR.
  • S. aureus which is a gram-positive bacterium
  • iridium complex (dimer) treatment
  • Example 3 Identification of live and dead cells of E. coli by 2-Hydroxy-N-pyridine (pentamethylcyclopentadienyl) iridium (III) dichloride E. coli and S. aureus gram-negative bacteria, gram-positive bacteria live and dead cells can be clearly distinguished. In this example, it was examined whether live cells and dead cells of E. coli can be distinguished using an iridium complex monomer.
  • Test Material and Method 1 A live cell suspension (2.1 ⁇ 10 7 cfu / ml) of E. coli JCM1649 strain was prepared using sterilized water. A part of this live cell suspension was immersed in boiling water for 3 minutes to prepare a dead cell suspension (2.1 ⁇ 10 7 cells / ml). 90 ⁇ l of each of these live cell suspensions and dead cell suspensions was subjected to the following test.
  • DqPCR Direct real-time PCR
  • Table 6 shows the results of real-time PCR.
  • Example 4 Discrimination of live and dead cells of S. aureus by 2-Hydroxy-N-pyridine (pentamethylcyclopentadienyl) iridium (III) dichloride
  • Example 3 live cells of E. coli were treated with an iridium complex monomer. It was shown that it was possible to clearly distinguish between the cells and dead cells. In this example, it was examined whether live cells and dead cells of S. aureus could be clearly distinguished by the same iridium complex monomer.
  • Test Materials and Methods 1-1) A live cell suspension (6.6 ⁇ 10 7 cfu / ml) of S. aureus ATCC 6538P strain was prepared using sterilized water. A portion of this live cell suspension was immersed in boiling water for 3 minutes, and 90 ⁇ l of each of these live cell suspensions or dead cell suspensions prepared for dead cell suspensions was subjected to the following test. .
  • test sample with iridium complex 10 ⁇ l of each of the above iridium complex solutions is added to 90 ⁇ l of the live cell suspension or 90 ⁇ l of the dead cell suspension, and 15 ° C. at 37 ° C. in a constant temperature bath. Hold for a minute. Thereafter, the mixture was cooled and centrifuged (4 ° C., 15,000 ⁇ G, 5 minutes), and the supernatant was removed. The pellet was washed with 1 ml of sterile water. The washed pellet (corresponding to 5 ⁇ l of cell suspension) was used as a PCR amplification sample.
  • Table 7 shows the results of real-time PCR.
  • S. aureus which is a gram-positive bacterium
  • iridium complex monomer
  • living cells of microorganisms can be detected and distinguished from dead cells and / or damaged cells by a simple process.
  • simple and rapid food and biological samples, wiped samples, industrial water, environmental water, wastewater, and other environmental microorganisms can be easily distinguished by nucleic acid amplification methods. .
  • the compound represented by Chemical Formula 2 described above is used as a metal catalyst in the field of organic chemistry or organic synthetic chemistry, and is less dangerous than a drug such as EMA. Conceivable. Furthermore, preferred iridium complexes are cheaper than drugs such as EMA and are industrially advantageous.

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Abstract

以下の工程により、被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞及び／又は損傷細胞と識別して検出する。 ａ）前記被検試料にイリジウム錯体を添加する工程、 ｂ）被検試料に含まれる微生物のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅する工程、及び ｃ）増幅産物を解析する工程。

Description

微生物検出法及び微生物検出キット
　本発明は、食品や生体試料中に含まれる微生物、工業用水や市水等の環境中に含まれる微生物の検出法、及び微生物検出キットに関する。さらに詳しくは、食品や生体試料、拭き取り試料、工業用水や市水等の環境中に含まれる微生物の生細胞の選択的な検出が可能な検出法及び微生物検出キットに関する。
　食品や生体試料、拭き取り試料、又は環境中の一般生菌数の測定には、従来、平板培養法が用いられてきた。しかし、平板培養法は結果が得られるまでに２日間から一ヶ月程度の時間を要し、細菌の同定も困難であるという問題があった。
　近年では、被検試料をエチジウムモノアザイド（ＥＭＡ、ethidium monoazide）等のＤＮＡを架橋する架橋剤や、トポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤で処理した後、試料中の微生物中の染色体ＤＮＡを選択的に核酸増幅反応により増幅することによって、試料中の生菌を検出する技術が提案され、成果を挙げている（特許文献１～４）。
　上記のような架橋剤、トポイソメラーゼ阻害剤及びＤＮＡジャイレース阻害剤は、細胞内に侵入すると、ＤＮＡに結合もしくはインターカレートしてトポイソメラーゼやＤＮＡジャイレース（酵素）の働きを阻害したり、又はＤＮＡを架橋し、その結果、染色体ＤＮＡが破壊（断片化・切断）される。これらの薬剤は、生菌の細胞壁よりも死菌及び損傷菌の細胞壁の方が透過しやすいため、生菌よりも損傷菌や死菌の染色体ＤＮＡが優先的に断片化される。したがって、染色体ＤＮＡの特定の領域をターゲットとしたＰＣＲにより、生菌を損傷菌や死菌に比べて選択的に検出することができる。
　尚、上記ＰＣＲの鋳型としては、従来、被検試料に含まれる微生物細胞から抽出した核酸が用いられていたが、細胞からの核酸の抽出を行わずに、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤の存在下でＰＣＲを行うことで、迅速に生菌を検出する方法が開示されている（特許文献４）。
　前記ＥＭＡは、ＤＮＡに水素結合した後、３５０～７００ｎｍの波長の光照射を行うことによりＤＮＡの分子間を架橋する。したがって、試料への光照射が必須であるが、光源による試料への加熱を防ぐため、通常、氷水中に試料を浸漬して光照射が行われており、工程が煩雑となっている。また、光源にＬＥＤを用いる方法も提案されているが、光強度が不十分であり、また、経時的に架橋剤の架橋能の低下がみられる等の問題がある。さらに、ＥＭＡ等の薬剤やそれを含む試料は、薬剤の変性等を防ぐため、前記の試料への光照射を除いて、暗室中などの遮光下におく必要がある。
　また、これまでの方法では、生菌を死菌及び／又は損傷菌と区別するために、ＰＣＲのターゲット領域としては、一定以上の長さ、例えば９００塩基（ｂｐ）以上の長さを有する領域を用いるのが一般的である。しかしながら、現在一般的な定量ＰＣＲにて使用されている８０～２００ｂｐ程度のターゲット領域に比べて、９００ｂｐ以上の領域をＰＣＲにより増幅するためには、各サイクルに数倍の時間を要し、また、定量性にも問題がないとはいえない。
　一方、試料を架橋剤で処理した後、試料に培地を加えて加温し、再度架橋剤による処理を行うこと（特許文献３）、又は、ＥＭＡとトポイソメラーゼ阻害剤及び／又はＤＮＡジャイレース阻害剤とを併用すること（特許文献２）により、１００ｂｐ程度のターゲット領域であっても、生菌と死菌又は損傷菌との区別が可能なことが知られている。しかしながら、これらの方法は、工程または薬剤調製が煩雑である。
　ところで、イリジウム錯体は、造影剤や発光材料、又はそれらの成分等として知られている。造影剤としては、例えば、非特許文献１には、ヒスチジンに結合して蛍光を発するイリジウム錯体が開示されている。また、発光材料としては、ＤＮＡと、主鎖又は側鎖にプロトン化可能なアミノ基を少なくとも１つ有し、ＤＮＡと絡み合う導電性高分子と、ＤＮＡのアニオン部に結合するカチオン性官能基を有する脂質化合物と、ＤＮＡのアニオン部に結合する蛍光発光性のイリジウム等の金属錯体とを含む発光材料が知られている（特許文献５）。この発光材料中では、金属錯体は導電性高分子や脂質化合物が結合していないＤＮＡのアニオン部に、静電相互作用により結合されている。
　また、本発明者らは、ＥＭＡ等と同様に、白金錯体（特許文献６）やパラジウム錯体（特許文献７）を用いることによって、核酸増幅法による生細胞と死細胞の識別が可能であることを開示している。
　しかしながら、イリジウム錯体が微生物の生死判定に利用できることを示唆する従来技術は知られていない。
国際公開第2001/077379 国際公開第2007/094077 国際公開第2009/022558 国際公開第2011/010740 特開2012-036228 国際公開第2014/021351 国際公開第2014/021352
Chemical & Engineering News, 89(28):31-32, 2011
　本発明は、簡便な工程で、かつ、好ましい態様ではターゲット領域が比較的短くても、微生物の生細胞の検出が可能な方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、被検試料を薬剤で処理し、試料中の微生物中の染色体ＤＮＡを選択的に核酸増幅反応により増幅することによって、試料中の生細胞を検出する技術において、使用する薬剤について検討した。そして、イリジウム錯体を用いると、試料への光照射、冷却、及び遮光環境を必要とせずに、微生物の生細胞の検出ができること、及び、好ましい態様ではターゲット領域として比較的短鎖長の領域を設定した場合でも、高精度で微生物の生細胞を検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞及び／又は損傷細胞と識別して検出する方法であって、以下の工程を含む方法：
　ａ）前記被検試料にイリジウム錯体を添加する工程、
　ｂ）被検試料に含まれる微生物のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅する工程、及び
　ｃ）増幅産物を解析する工程、
を提供する。
　前記方法は、前記ターゲット領域の増幅が、細胞からの核酸の抽出を行わずに行われることを好ましい態様としている。
　また、前記方法は、前記ターゲット領域の増幅が、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、マグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩を前記被検試料に添加して行われることを好ましい態様としている。
　また、前記方法は、前記ターゲット領域の増幅が、界面活性剤の存在下で行われることを好ましい態様としている。
　また前記方法は、前記被検試料が、食品、生体試料、飲料水、工業用水、環境用水、排水、土壌、又は拭き取り試料のいずれかであることを好ましい態様としている。
　また、前記方法は、前記微生物が、細菌又はウイルスであることを好ましい態様としている。
　また、前記方法は、前記細菌が、グラム陰性細菌又はグラム陽性細菌であることを好ましい態様としている。
　また、前記方法は、前記ターゲット領域が、５０～５０００塩基のターゲット領域であることを好ましい態様としている。
　また、前記方法は、前記ターゲット領域が、被検試料のＤＮＡの５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、及びｔＲＮＡ遺伝子から選択される遺伝子に対応するターゲット領域であることを好ましい態様としている。
　また、前記方法は、前記核酸増幅法が、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ＳＤＡ法、ＬＣＲ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法、ＨＣ法、ＳＭＡＰ法、又はマイクロアレイ法であることを好ましい態様としている。
　また、前記方法は、前記ＰＣＲ法が、リアルタイムＰＣＲ法により行われ、ＰＣＲと増幅産物の解析が同時に行われることを好ましい態様としている。
　また、前記方法は、前記増幅産物の解析が、微生物の標準試料を用いて作成された微生物量及び増幅産物との関連を示す標準曲線を用いて行われることを好ましい態様としている。
　また、本発明は、核酸増幅法により、被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞及び／又は損傷細胞と識別して検出するためのキットであって、下記の要素を含むキット：
　１）イリジウム錯体、又は、
　配位子としてイリジウムに結合し得る有機溶媒、もしくは配位子としてイリジウムに結合し得る物質を含む溶液に溶解したときに、イリジウム錯体を生成するイリジウム化合物、
　２）検出対象の微生物のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅するためのプライマー、
を提供する。
　前記本発明のキットは、さらに、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、マグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩を含むことを好ましい態様としている。
　また、前記キットは、さらに界面活性剤を含むことを好ましい態様としている。
　本発明の方法及びキットは、前記イリジウム錯体が、NH３、RNH２、ハロゲン元素（Cl、F、Br、I、At）、カルボキシレート（-CO-O-）基、ピリジン基、H２O、CO３ ２－、OH－、NO３ －、ROH、N２H４、PO４ ３－、R２O、RO－、ROPO３ ２－、(RO)２PO２－、NO２ －、N２、N３ －、R２S、R２P－、R３P、RS－、CN－、RSH、RNC、(RS)２PO２ －、(RO)２P(O)S－、SCN－、CO、H－、およびR－からなる群から選ばれる配位子を含むものであることを好ましい態様としている（ただし、前記「R」の表記は、いずれも飽和又は不飽和有機基を表す）。
　また、前記方法及びキットは、前記配位子が、NH３、RNH２、ハロゲン元素（Cl、F、Br、I、At）、カルボキシレート（-CO-O-）基、ピリジン基、H２O、CO３ ２－、OH－、NO３ －、ROH、N２H４、PO４ ３－、R２O、RO－、ROPO３ ２－、(RO)２PO２－、R２S、R２P－、R３P、RS－、CN－、RSH、RNC、(RS)２PO２ －、(RO)２P(O)S－、SCN－、CO、H－、およびR－からなる群から選ばれることを好ましい態様としている。
　また、前記方法及びキットは、前記イリジウム錯体が、ジ-μ-クロロビス[(η-シクロオクタ-1,5-ジエン)イリジウム(I)]、及び、2-ヒドロキシ-N-ピリジン(ペンタメチルシクロペンタジエニル)イリジウム(III)ジクロリドから選ばれることを好ましい態様としている。
　次に、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示（質量％）である。
＜１＞本発明の方法
　本発明の方法は、被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞及び／又は損傷細胞と識別して検出する方法であって、以下の工程を含む方法である。
　ａ）前記被検試料にイリジウム錯体を添加する工程、
　ｂ）被検試料に含まれる微生物のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅する工程、及び
　ｃ）増幅産物を解析する工程。
　本発明の方法においては、増幅の対象は核酸全般のいずれであってもよく、具体的には１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、及び２本鎖ＲＮＡを例示することができる。
　本明細書において、「被検試料」とは、その中に存在する微生物の生細胞を検出する対象であり、核酸増幅法による染色体ＤＮＡ、又はＲＮＡの特定領域の増幅によって存在を検出することが可能なものであれば特に制限されないが、食品、生体試料、飲料水、工業用水、環境用水、排水、土壌、又は拭き取り試料等が挙げられる。
　特に、食品としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調製用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の氷菓；殺菌ミルク、加工乳、乳飲料、発酵乳、バター等の乳製品；経腸栄養食品、流動食、育児用ミルク、スポーツ飲料；特定保健用食品、健康補助食品等の機能性食品等が好ましい。
　また、生体試料としては、血液試料、尿試料、髄液試料、滑液試料、胸水試料、喀痰試料、糞便試料、鼻腔粘液試料、喉頭粘液試料、胃洗浄液試料、膿汁試料、皮膚粘膜試料、口腔粘液試料、呼吸器粘膜試料、消化器粘膜試料、眼結膜試料、胎盤試料、生殖細胞試料、産道試料、母乳試料、唾液試料、嘔吐物、又は水疱内容物等が例示される。
　さらに、環境用水としては、市水、地下水、河川水、又は雨水等が例示される。
　本発明においては、被検試料は、前記のような食品、生体試料、飲料水、工業用水、環境用水、排水、土壌、又は拭き取り試料等そのものであってもよく、これらを希釈もしくは濃縮したもの、又は本発明の方法による処理以外の前処理をしたものであってもよい。前記前処理としては、加熱処理、濾過、遠心分離等が挙げられる。
　また、被検試料中に存在する微生物以外の細胞、タンパク質コロイド粒子、脂肪及び糖質等の夾雑物は、これらを分解する活性を有する酵素による処理等によって除去又は低減させてもよい。前記被検試料中に存在する微生物以外の細胞としては、被検試料が乳、乳製品、又は乳若しくは乳製品を原料とする食品である場合には、ウシ白血球及び乳腺上皮細胞等が挙げられる。また、被検試料が血液試料、尿試料、髄液試料、滑液試料又は胸水試料等の生体試料の場合には、赤血球、白血球（顆粒球、好中球、好塩基球、単球、リンパ球等）、及び血小板等が挙げられる。
　前記酵素としては、前記夾雑物を分解することができ、かつ、検出対象の微生物の生細胞を損傷しないものであれば特に制限されないが、例えば、脂質分解酵素、タンパク質分解酵素、及び糖質分解酵素が挙げられる。前記酵素は、１種類の酵素を単独で用いてもよいし、２種又はそれ以上の酵素を併用してもよいが、脂質分解酵素及びタンパク質分解酵素の両方、又は脂質分解酵素、タンパク質分解酵素、及び糖質分解酵素の全てを用いることが好ましい。
　脂質分解酵素としては、リパーゼ、フォスファターゼ等が、タンパク質分解酵素としてはセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、プロテイナーゼＫ、プロナーゼ等が、糖質分解酵素としてはアミラーゼ、セルラーゼ、Ｎ－アセチルムラミダーゼ等が挙げられる。
　「微生物」は、本発明の方法により検出される対象であり、核酸増幅法により検出することが可能であって、かつ、ＤＮＡ又はＲＮＡに結合するイリジウム錯体の微生物に対する作用が生細胞と死細胞や損傷細胞とで異なるものであれば、特に制限されないが、好ましくは細菌、糸状菌、酵母、又はウイルス等が挙げられる。細菌としては、グラム陽性菌及びグラム陰性菌のいずれもが含まれる。
　グラム陽性菌としては、黄色ブドウ球菌や表皮ブドウ球菌などのブドウ球菌属；ミクロコッカス属；Streptcoccus pyogenes、Streptococcus pneumoniae（肺炎球菌）等のストレプトコッカス属；Enterococcus faecalisなどエンテロコッカス属；エロコッカス属；Bacillus cereus（セレウス菌）、Bacillus subtilis（バチラス・ズブチリス）、Bacillus licheniformis（バチラス・リヘニフォルミス）等のバチラス属（栄養型細胞が望ましい）；ボツリヌス菌やウエルシュ菌などのクロストリジウム属；ヒト型結核菌やウシ型結核菌；マイコバクテリウム・イントラセルラー、マイコバクテリウム・アビウムなどのマイコバクテリウム属（抗酸菌及び非定型抗酸菌群）；ライ菌；アクチノミセス属；ノカルジア属；ノカルジオプシス属；アクチノマズラ属；ストレプトミセス属；デルマトフィルス属；ユーバクテリウム属；コリネバクテリウム属；プロピオニバクテリウム属等が挙げられる。
　また、グラム陰性菌としては、レジオネラ属；サルモネラ属；O-157、O-26、O-11、O-145を始めとする腸管出血性大腸菌；カンピロバクター属；アルコバクター属；ヘリコバクター属；緑膿菌などのシュードモナス属；バークホルデリア属；アシネトバクター属；アルカリゲネス属；クリセオバクテリウム属；モラクセラ属；コクシェラ属；ブルセラ属；野兎病菌（Francisella tularensis）等のフランシセラ属；バルトネラ属；ボルデテラ属；インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）等のヘモフィルス属；パスツレラ属；クロモバクテリウム属；ストレプトバシラス属；赤痢菌等のシゲラ属、エルシニア属、エシェリヒア・コリなどエシェリヒア属、クレブシェラ属、シトロバクター属、エドワージエラ属、エンテロバクター属、ハフニア属、プレジオモナス属、プロテウス属、プロビデンシア属、モルガネラ属、セラチア属等の腸内細菌科；ビブリオ属；エロモナス属；バクテロイデス属；プレボテラ属；ポルフィロオナス属；フソバクテリウム属；レプトトリキア属；ベイヨネラ属；ブラキスピラ属；レプトスピラ属；トレポネーマ属；ブタ赤痢スピロヘータ；ボレリア属；マイコプラズマ；リケッチア；クラミジア等が挙げられる。
　ウイルスとしては、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、アデノウイルス科、パピローマウイルス科、ポリオーマウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、カリシウイルス科、アストロウイルス科、コロナウイルス科、トガウイルス科、フラビウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、ボルナウイルス科、アレナウイルス科、ブニヤウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科、肝炎ウイルスが挙げられるなどが挙げられる。
　後記実施例１、３に示されるように、イリジウム錯体による処理によりグラム陰性細菌であるエシェリヒア・コリの生細胞と死細胞の識別が可能であることが示された。また、実施例２、４に示されるように、イリジウム錯体によりスタフィロコッカス・アウレウスの生細胞と死細胞の識別が可能であることが示された。これらの結果から、イリジウム錯体は、微生物全般について生細胞と死細胞の識別に使用できると考えられる。
　さらに、グラム陰性細菌の細胞壁外膜と同成分の最外殻エンベロープを有するウイルスについても、生細胞と死細胞の識別に使用できると考えられる。また、エンベロープを有しない所謂ヌクレオカプシド（タンパク質膜）のみ保有するウイルスは、外膜を有さず、直接ペプチドグリカン層が外界と接触するグラム陽性細菌に比較的類似しているため、イリジウム錯体による生細胞と死細胞の識別が可能であると考えられる。尚、後述するように、本発明においては、ウイルス粒子も、便宜的に「細胞」と呼ぶ。
　エンベロープを有しない腸管系ウイルスの感染型（生細胞に相当）・非感染型（死細胞に相当）の識別に、PMA（プロピジウムモノアジド）という、物理的損傷のある非感染型にのみ透過して非感染型の核酸に共有結合し、核酸を鋳型として不活性化させる薬剤を用いて、腸管系ウイルスにて明瞭な感染型・非感染型の判定を可能した技術も存在する（S. Parshionikar et al., Appl. Envrion. Microbiol. 76, 4318-4326, 2010）。
　PMAは元来、細菌の生細胞と死細胞の明瞭な識別を可能とする薬剤であるが（A. Nocker et al., J. Microbiol. Methods. 67, 310-320, 2006）、ヌクレオカプシドしか有しない腸管系ウイルスでも明瞭な前記識別を可能としているので、イリジウム錯体も、PMAと同様に、ヌクレオカプシドしか有しない腸管系ウイルスにおいて（エンベロープを有するウイルスはグラム陰性細菌に形態学的に酷似しているため勿論含まれる）、明瞭に感染型・非感染型を判定できる可能性が高い。
　本発明において「生細胞」（Live cell）とは、一般に好適な培養条件によって培養した際に増殖が可能であって、その微生物が有する代謝活性を示す状態（Viable-and-Culturable state）であり、細胞壁の損傷がほとんど無い微生物をいう。なお、ここでいう代謝活性とはＡＴＰ活性やエステラーゼ活性を例示することができる。本発明においては、ウイルス粒子も、便宜的に「細胞」と呼ぶ。「生細胞」は、ウイルスに関しては、哺乳動物細胞に感染し、増殖できる状態をいう。
　「死細胞」（Dead cell）とは、好適な培養条件によって培養した場合であっても増殖は不可能であって、代謝活性を示さない状態（Dead）の微生物である。また、細胞壁の構造は維持されているものの、細胞壁自体は高度に損傷を受けており、ヨウ化プロピジウムのような弱透過性の核染色剤等が細胞壁を透過する状態である。ウイルスに関する「死細胞」とは、哺乳動物細胞に感染できない状態をいう。
　「損傷細胞」（Injured cell又はViable-but-Non Culturable cell）とは、人為的ストレス又は環境的ストレスにより損傷を受けているために、一般に好適な培養条件によって培養した場合であっても、増殖は困難であるが、その微生物が有する代謝活性は、生細胞と比較すると低下しているものの死細胞と比較すると有意に活性を有する状態の微生物である。ウイルスに関しては、哺乳動物細胞に感染したとしても、細胞中で増殖できない状態をいう。
　本明細書においては、特記しない限り、「生細胞」、「死細胞」及び「損傷細胞」は、微生物の生細胞、死細胞及び損傷細胞を意味する。
　特に、食品衛生検査や臨床検査において、穏和な加熱処理や抗生物質投与により、損傷細胞の状態を呈した細菌の検出が注目されており、本発明は、生細胞の検出のみならず、生細胞と死細胞及び／又は損傷細胞との識別も可能な微生物の検出方法を提供するものである。
　尚、生細胞、損傷細胞及び死細胞の細胞数単位は、通常、いずれも細胞数cells/ml で表される。
　生細胞の細胞数は、好適な平板培地上で、好適な培養条件で培養したときのコロニー形成数（cfu/ml又はCFU/ml（colony forming units / ml））で近似させることができる。
　損傷細胞及び／又は死細胞の標準試料は、例えば、生細胞けん濁液を加熱処理、例えば沸騰水中で加熱処理することにより調製することができるが、その場合は、損傷細胞及び／又は死細胞の細胞数は、加熱処理する前の生細胞けん濁液のｃｆｕ／ｍｌで近似させることができる。尚、損傷細胞及び／又は死細胞を調製するための沸騰水中での加熱時間は、微生物の種類により異なるが、例えば実施例に記載された細菌では、５０秒程度で損傷細胞を調製することができる。加熱時間を長くすると、損傷細胞よりも死細胞の割合が高くなる。
　また、損傷細胞及び／又は死細胞の標準試料は、抗生物質処理によっても調製することができるが、その場合は、損傷細胞及び／又は死細胞の細胞数は、生細胞けん濁液を抗生物質で処理した後、抗生物質を除去し、可視光（波長600nm）の透過度、すなわち濁度を測定し、生細胞数濃度が予め判っている生細胞けん濁液の濁度と比較することにより、好適な平板培地上で好適な培養条件で培養したときのコロニー形成数（cfu/ml）で近似させることができる。
　ウイルスでは、細胞数単位は、プラーク形成単位（pfu又はPFU（plaque-forming units））で表される。
　尚、本発明の方法は、生細胞の検出が目的であり、生細胞と区別される微生物は、損傷細胞であっても死細胞であってもよい。
　本発明において、「生細胞の検出」とは、被検試料中の生細胞の有無の判別及び生細胞の量の決定のいずれをも含む。また、生細胞の量とは、絶対的な量に限られず、対照試料に対する相対的な量であってもよい。また、「生細胞を、死細胞及び／又は損傷細胞と識別して検出する」とは、生細胞を、死細胞及び／又は損傷細胞に比べて選択的に検出することを意味する。尚、「生細胞と死細胞及び／又は損傷細胞との識別」には、生細胞と、死細胞及び損傷細胞の両方との識別も含まれる。
　以下、本発明の方法を工程毎に説明する。尚、前記したように、以下の工程の前に、任意の工程として、被検試料を、被検試料中に存在する微生物以外の細胞、タンパク質コロイド粒子、脂肪、又は糖質を分解する活性を有する酵素で処理する工程を含んでいてもよい。
（１）工程ａ）
　被検試料に、イリジウム錯体（以下、「本発明の薬剤」、又は単に「薬剤」とも記載する。）を添加する。すなわち、被検試料中の微生物を、前記薬剤で処理する。
　前記薬剤は、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）に直接的に、又はタンパク質等を介して間接的に結合もしくは干渉して、ターゲット領域のＰＣＲ反応を阻害すると推定される。
　前記薬剤は、生細胞と、損傷細胞もしくは死細胞、又はウシ白血球等の体細胞、白血球、血小板等とに対する作用が異なるものであることが好ましく、より具体的には、生細胞の細胞壁よりも損傷細胞もしくは死細胞の細胞壁、又はウシ白血球等の体細胞、白血球、血小板等の細胞膜に対して透過性が高いものであることが好ましい。
　イリジウム錯体としては、生細胞と損傷細胞及び／又は死細胞との細胞壁に対する透過性が異なり、かつ、細胞内の核酸に結合してターゲット領域のＰＣＲ反応を阻害し得る限り、特に制限されないが、例えば、配位子として、少なくともNH３、RNH２、ハロゲン元素（Cl、F、Br、I、At）、カルボキシレート（-CO-O-）基、ピリジン基、H２O、CO３ ２－、OH－、NO３ －、ROH、N２H４、PO４ ３－、R２O、RO－、ROPO３ ２－、(RO)２PO２－、NO２ －、N２、N３ －、R２S、R２P－、R３P、RS－、CN－、RSH、RNC、(RS)２PO２ －、(RO)２P(O)S－、SCN－、CO、H－、およびR－からなる群から選ばれる一つを含むイリジウム錯体が挙げられる（ただし、前記「R」の表記は、いずれも飽和又は不飽和有機基を表す）。イリジウム錯体は、上記のような配位子を一つ含んでいてもよく、同一又は異なる配位子を複数含んでいてもよい。また、上記以外の配位子を含んでいてもよい。
　前記飽和有機基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、シクロブチル、ペンチル基、シクロペンチル、ヘキシル基、シクロヘキシル基、オクチル基、シクロオクチル基等のアルキル基等が挙げられる。また、不飽和有機基としては、ベンジル基（ベンゼン環）、ナフチル基（ナフタレン環）、アリル基、シクロオクタジエニル基、シクロオクテン基、ペンタメチルシクロペンタジエニル基、インデニル基等が挙げられる。これらの飽和有機基及び不飽和有機基は置換基を有していてもよい。
　上記配位子としては、NH３、RNH２、ハロゲン元素（Cl、F、Br、I、At）、カルボキシレート（-CO-O-）基、ピリジン基、H２O、CO３ ２－、OH－、NO３ －、ROH、N２H４、PO４ ３－、R２O、RO－、ROPO３ ２－、(RO)２PO２－、R２S、R２P－、R３P、RS－、CN－、RSH、RNC、(RS)２PO２ －、(RO)２P(O)S－、SCN－、CO、H－、およびR－からなる群から選ばれる一つ又はそれ以上が好ましい（ただし、前記「R」の表記は、いずれも飽和又は不飽和有機基を表す）。これらの中では、ハロゲン元素（Cl、F、Br、I、At）、ピリジン基、OH－、R－が特に好ましい。
　イリジウム錯体として具体的には、下記の化合物が挙げられる。
ジ-μ-クロロビス[(η-シクロオクタ-1,5-ジエン)イリジウム(I)]（Di-μ-chlorobis[(η-cycloocta-1,5-diene)iridium(I)]） C16H24Cl2Ir2
2-ヒドロキシ-N-ピリジン(ペンタメチルシクロペンタジエニル)イリジウム(III)ジクロリド（2-Hydroxy-N-pyridine(pentamethylcyclopentadienyl)iridium(III)dichloride） C15H20Cl2IrNO
(アセチルアセトナト)ジカルボニルイリジウム(I)（Acetylacetonato)dicarbonyliridium(I)) C7H7IrO4
(アセチルアセトナト)(1,5-シクロオクタジエン)イリジウム(I) C13H19IrO2
(アセチルアセトナト)(1,5-シクロオクタジエン)イリジウム(I) C13H19IrO2
クロロビス(シクロオクテン)イリジウム(I)ダイマー（Chlorobis(cyclooctene)iridium(I)dimer） C32H56Cl2Ir2
クロロジヒドリド[ビス(2-ジイソプロピルホスフィノ)エチルアミン]イリジウム(III)（Chlorodihydrido[bis(2-diisopropylphosphino)ethylamine]iridium(III)） C16H39ClIrNP2
クロロ(5-メトキシ-2-{1-[(4-メトキシフェニル)イミノ-N]エチル}フェニルl-C)(1,2,3,4,5-ペンタメチルシクロペンタジエニル)イリジウム(III)（Chloro(5-methoxy-2-{1-[(4-methoxyphenyl)imino-N]ethyl}phenyl-C)(1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadienyl)iridium(III)） C26H31ClIrNO2
ジクロロテトラキス(2-(2-ピリジニル)フェニル)ジイリジウム(III)（Dichlorotetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III)） C44H32Cl2Ir2N4
ジヨード(ペンタメチルシクロペンタジエニル)イリジウム(III)ダイマー（Diiodo(pentamethylcyclopentadienyl)iridium(III) dimer） C20H30I4Ir2
イリジウム(III)ブロミド水和物（Iridium(III) bromide hydrate） Br3Ir・xH2O
イリジウム(IV)クロリド水和物（Iridium(IV) chloride hydrate） Cl4Ir・xH2O
ペンタアンミンクロロイリジウム(III)クロリド（Pentaamminechloroiridium(III) chloride） H15Cl3IrN5
テトライリジウムドデシルカルボニル（Tetrairidium dodecacarbonyl） C12Ir4O12
イリジウム(III)アセチルアセトナート（Iridium(III)acetylacetonate） C15H21IrO6
(1,5-シクロオクタジエン)-η5-インデニル)イリジウム(I)（(1,5-cyclooctadiene)-η5-indenyl)iridium(I)） C17H18Ir
(1,5-シクロオクタジエン)ビス(メチルジフェニルホスフィン)イリジウム(I)ヘキサフルオロホスファート（(1,5-cyclooctadiene)bis(methyldiphenylphosphine)iridium(I)hexafluorophospate） C34H38F6IrP3
(1,5-シクロオクタジエン)(ピリジン)(トリシクロヘキシルホスフィン)-イリジウム(I)ヘキサフルオロホスファート（(1,5-cyclooctadiene)(pyridine)(tricyclohexylphosphine)-iridium(I)hexafluorophosphate） C31H50F6IrNP2
(1,5-シクロオクタジエン)(ヘキサフルオロアセチルアセトナト)イリジウム(I)（(1,5-cyclooctadiene)(hexafluoroacetylacetonato)iridium） C13H13F6IrO2
(1,5-シクロオクタジエン)(メトキシ)イリジウム(I)ダイマー（(1,5-cyclooctadiene)(methoxy)iridium(I)dimer） C18H30Ir2O2
ビス(シクロオクタジエン)イリジウム(I)テトラキス(3,5-ビス(トリフルオロメチル)フェニル)ボラート（bis(cyclooctadiene)iridium(I)tetrakis (3,5-bis(tryfluoromethyl)phenyl)borate） C48H36BF24Ir
ビス(1,5-シクロオクタジエン)イリジウム(I)テトラフルオロボラート（bis(1,5-cyclooctadiene)iridium(I)tetrafluoroborate） C16H24BF4Ir
ビス[1,2-ビス(ジフェニスホスフィノ)エタン]カルボニルクロロイリジウム(I)（bis[1,2-bis(diphenylphosphino)ethane]carbonylchloroiridium(I)） C53H48ClIrOP4
ペンタメチルシクロペンタジエニルイリジウム(III)クロリドダイマー（pentamethylcyclopentadienyliridium(III)chloride dimer） C20H30Cl4Ir2
クロロトリカルボニルイリジウム（Chlorotricarbonyliridium(I)） C3ClIrO3
カルボニルクロロビス(トリフェニルホスフィン)イリジウム(I)（Carbonylchlorobis(triphenylphosphine)iridium(I)）C37H30ClIrOP2
　好ましい錯体としては、下記の化合物が挙げられる。
　Di-μ-chlorobis[(η-cycloocta-1,5-diene)iridium(I)]（別名：ビス(1,5-シクロオクタジエン)ジイリジウム(I)ジクロリド（bis(1,5-cyclooctadiene)diiridium(I)dichloride））（化１、分子量（M.W.）又は式量（F.W.）：671.70）
　2-Hydroxy-N-pyridine(pentamethylcyclopentadienyl)iridium(III)dichloride（化２、分子量（M.W.）又は式量（F.W.）：493.45)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　また、イリジウム錯体として、イリジウム化合物を、配位子としてイリジウムに結合し得る有機溶媒、又は配位子としてイリジウムに結合し得る物質を含む溶液に溶解することにより生成するイリジウム錯体が挙げられる。このようなイリジウム化合物としては、例えば、イリジウムと他の元素又は基との共有結合により、巨大分子を形成するイリジウム化合物が挙げられる。
　前記元素又は基としては、ハロゲン元素（Cl、F、Br、I、At）、OH－、NO３ －、CH３COO－、PO４ ３－、RO－、CO３ ２－、ROPO３ ２－、(RO)２PO２ －、RS－、CN－、(RS)２PO２ －、(RO)２P(O)S－、SCN－、H－、R－（ただし、前記「R」の表記は、いずれも飽和又は不飽和有機基を表す）等が挙げられる。
　前記イリジウム化合物として具体的には、塩化イリジウム、臭化イリジウム、フッ化イリジウム、ヨウ化イリジウム、水酸化イリジウム、硝酸イリジウム、炭酸イリジウム、酢酸イリジウム、ジメトキシイリジウム、メトキシリン酸イリジウム、リン酸イリジウム、塩化イリジウム酸、ジスルフメチルイリジウム、ジシアノイリジウム、ジチオシアネートイリジウム、二水素化イリジウム、メチルイリジウム、酸化イリジウム、五塩化イリジウム（IV）ジアンモニウム（ヘキサクロロイリジウム（IV）酸二アンモニウム）等が挙げられる。これらのうち、好ましい化合物としては塩化イリジウム、臭化イリジウム、フッ化イリジウム、及びヨウ化イリジウムが挙げられ、特に好ましい化合物として塩化イリジウムが挙げられる。塩化イリジウムとしては、塩化イリジウム（III）、塩化イリジウム（IV）が挙げられる。
　有機溶媒としては、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ベンゾニトリル（benzonitrile）等が挙げられる。塩化イリジウムをDMSOに溶解して得られる錯体としては、ジクロロビス（ジメチルスルホキシド）イリジウム（III）が挙げられる。
　また、配位子としてイリジウムに結合し得る物質を含む溶液としては、ハルマリン（harmaline）溶液、例えばハルマリン塩酸塩の水溶液等、及び、ジフェロセニル・ホスフィン（diferrocenyl-phosphine）溶液、例えばジフェロセニル・ホスフィンのDMSO溶液等、が挙げられる。前記のようなイリジウムを含む巨大分子をこれらの溶液に溶解すると、イリジウムはハルマリンやジフェロセニル・ホスフィンにこれらを配位子として結合し直し、イリジウム錯体として低分子化される。このようにして生成するイリジウム錯体も、本発明に使用することができる。
　イリジウム錯体は、二量体（１錯体に２個のイリジウム元素を有するダイマー）等の多量体であってもよい。二量体としては、例えば、Di-μ-chlorobis[(η-cycloocta-1,5-diene)iridium(I)]が挙げられる。
　イリジウム錯体、及び、イリジウムと他の元素又は基との共有結合により巨大分子を形成するイリジウム化合物は、各種市販されており（例えば、和光純薬工業、シグマ）、それらを使用することができる。また、Weiss R.B., Christian M.C. (1993) Drugs 46:360; Gordon M., Hollander S. (1993) 24: 209; Khokhar A.R., Lopez-Berestein G., Perez-Soler P., US Patent 5 117 022, 1992; Brown D.B., Kohkhar A.R., Hacker M.P., McCommack J.J., European Patent EP 0130 482 b1, 1988; Yanai J., Japanese Patent JP 09 132 583 A2, 1997; Lippert B., Cisplatin: Chemistry and Biochemistry of Leading Anti-cancer Drugs, 1st Ed., John Wiley and sons, ltd., 1999に記載の方法に準拠して合成することもできる。
　本発明の方法において、薬剤は１種類を単独で用いてもよいし、２種又はそれ以上を併用してもよい。
　薬剤による処理の条件は、適宜設定することが可能である。例えば、検出対象の微生物の生細胞と死細胞及び／又は損傷細胞とのけん濁液に、種々の濃度の薬剤を加えて、種々の時間置いた後、遠心分離等によって菌体を分離し、核酸増幅法で分析することによって、生細胞と死細胞及び／又は損傷細胞とを区別しやすい条件を決定することができる。
　さらに、検出対象の微生物の生細胞、及びウシ白血球等の体細胞又は血小板等のけん濁液に、種々の濃度の薬剤を加えて、所定時間放置した後、遠心分離等によって菌体及び前記各種細胞を分離し、核酸増幅法で分析することによって、生細胞と各種細胞を区別しやすい条件を決定することができる。
　このような条件として、具体的には、Di-μ-chlorobis[(η-cycloocta-1,5-diene)iridium(I)]では終濃度２０～３０００μＭ、好ましくは２５～３００μＭ、４～４３℃、５分～２時間が例示される。2-Hydroxy-N-pyridine(pentamethylcyclopentadienyl)iridium(III)dichlorideでは終濃度２０～３０００μＭ、好ましくは５０～３００μＭ、４～４３℃、５分～２時間が例示される。
　他のイリジウム錯体についても、これらのイリジウム錯体に準じて条件を設定することができる。また、細胞数が既知の試料を用いて、細胞を種々の条件でイリジウム錯体で処理して、試料に含まれる微生物のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅し、増幅産物を解析することによって、好適な条件を選択することができる。
　被検試料への薬剤の添加は、上記のように被検試料のけん濁液に薬剤を添加することによって行ってもよいが、薬剤の溶液に被検試料を添加することによって行ってもよい。
　尚、エチジウムモノアザイド等を用いる従来の方法では、それらの架橋剤をＤＮＡ又はＲＮＡと水素結合させた後に、ＤＮＡ又はＲＮＡの分子間を架橋させるために３５０ｎｍ～７００ｎｍの波長の光照射を必要としているが、本発明の薬剤を用いる本発明の方法では、光照射を必要としない。また、そのため、光照射による試料の加熱を防ぐための冷却、例えば氷水への試料の浸漬も必要としない。
　また、ＥＭＡ等の薬剤では、露光による薬剤の変性を防ぐため、試料への光照射を除けば、暗室中などの遮光下におく必要があるが、本発明の薬剤を用いる場合は、遮光の必要もない。
　本発明の薬剤は、生細胞の細胞壁よりも、死細胞及び／又は損傷細胞の細胞壁の方が透過しやすい。したがって、前記に示す作用時間内であれば、微生物の生細胞の細胞壁・細胞膜は実質的に透過せず、微生物の損傷細胞もしくは死細胞、または死細胞になっている体細胞の細胞膜は透過すると考えられる。
　その結果、薬剤は、体細胞の死細胞及び微生物の死細胞、並びに損傷細胞の細胞内に進入し、続いて、染色体ＤＮＡ又はＲＮＡに、直接的、又は間接的に結合もしくは干渉し、その結果、薬剤が結合したＤＮＡ又はＲＮＡは、核酸増幅反応の鋳型とはならなくなると推定される。
　生細胞よりも損傷細胞や死細胞に優先的に薬剤が透過すると、生細胞では染色体ＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域が核酸増幅法により増幅されるのに対し、損傷細胞や死細胞では、染色体ＤＮＡ又はＲＮＡに、薬剤が直接的、又は間接的に結合もしくは干渉し、核酸増幅反応が阻害される。そのために、生細胞は損傷細胞や死細胞に比べて選択的に検出することができる。
　工程ａ）の薬剤による処理は、一回でもよく、又はそれ以上の回数を繰り返して行ってもよい。薬剤の濃度は、一回目の薬剤処理では、二回目以降よりも高くし、二回目以降の薬剤処理では、一回目よりも低くすることが好ましい。
　また、一回目の薬剤処理では、二回目以降の薬剤処理よりも処理時間を短くすることが好ましい。
　先の薬剤処理と、それ以降の薬剤処理との間で、未反応の薬剤を除去する工程を追加してもよい。薬剤を除去する方法としては、被検試料を遠心分離して、微生物を含む沈殿と薬剤を含む上清とを分離し、上清を除去する方法が挙げられる。この場合、薬剤を除去した後、適宜、洗浄剤で微生物を洗浄する工程を追加することも可能である。
　また、薬剤処理した試料は、下記工程ｂ）の前に、未反応の薬剤を除去しておくことが好ましい。
（２）工程ｂ）
　次に、薬剤処理後の被検試料に含まれる微生物のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を、核酸増幅法により増幅する。
　核酸増幅の鋳型となるＤＮＡ又はＲＮＡは、微生物の細胞から抽出したものを用いてもよいし、細胞からの核酸の抽出を行わずに薬剤処理した試料をそのまま用いてもよいが、細胞からの核酸の抽出を行わないことが好ましい。
　細胞からの核酸の抽出を行わずに核酸増幅を行う場合は、被検試料を含む核酸増幅反応液に、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤を添加して、核酸増幅反応を行うことが好ましい（特許第4825313号、WO2011/010740参照）。
　また、被検試料を含む核酸増幅反応液に、さらにマグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩を添加することがより好ましい。また、被検試料を含む核酸増幅反応液に、さらに界面活性剤を添加することが特に好ましい。増幅反応液に、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤に追加して、界面活性剤、マグネシウム塩、又は有機酸塩又はリン酸塩を添加する場合は、これらのうち、いずれか一種を、又は任意の二種以上を組合わせて使用することができ、これらの全てを添加することが特に好ましい。
　前記核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、界面活性剤、マグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩の添加の順序は問わず、また、同時に添加してもよい。必要に応じ、核酸伸長酵素も通常のＰＣＲ法で使用している濃度よりも高い濃度、例えば２倍～１０倍の濃度で添加してもよい。
　核酸増幅阻害物質とは、核酸増幅反応又は核酸伸張反応を阻害する物質であって、例えば、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の鋳型に吸着する正電荷阻害物質、又は核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼなど）に吸着する負電荷阻害物質等が挙げられる。前記正電荷阻害物質としては、カルシウムイオン、ポリアミン、ヘム（heme）等が挙げられる。また、負電荷阻害物質としては、フェノール、フェノール系化合物、ヘパリン、グラム陰性細菌細胞壁外膜等が挙げられる。食品や臨床検体中には、このような核酸増幅反応を阻害する物質が多く含まれているといわれている。
　上記のような核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤としては、アルブミン、デキストラン、Ｔ４ジーン３２プロテイン、アセトアミド、ベタイン、ジメチルスルホキシド、ホルムアミド、グリセロール、ポリエチレングリコール、大豆トリプシンインヒビター、α２－マクログロブリン、テトラメチルアンモニウムクロライド、リゾチームから、ホスホリラーゼ、及び乳酸脱水素酵素から選択される１種又は複数種を例示することができる。
　前記ポリエチレングリコールとしては、ポリエチレングリコール４００又はポリエチレングリコール４０００が例示される。ベタインとしては、トリメチルグリシンやその誘導体等が挙げられる。また、ホスホリラーゼ及び乳酸脱水素酵素としては、ウサギ筋肉由来のグリコーゲンホスホリラーゼ及び乳酸脱水素酵素が挙げられる。なお、グリコーゲンホスホリラーゼとしては、グリコーゲンホスホリラーゼｂが好ましい。
　特に、アルブミン、デキストラン、Ｔ４ジーン３２プロテイン、又はリゾチームを使用することが好ましい。
　血液、糞便、及び肉を検査材料として想定し、それら検査材料中に含まれる核酸増幅阻害物質の阻害作用を低減させる試みとして、上記のような物質をＰＣＲ反応液に加えることによる、前記阻害作用の低減が評価されている（Abu Al-Soud, W. et al, Journal of Clinical Microbiology, 38:4463-4470, 2000）。
　ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）に代表されるアルブミンは、ヘム（heme）のような核酸増幅阻害物質に結合することにより、核酸増幅阻害を低減させている可能性が示唆されている（前記Abu Al-Soudら）。また、Ｔ４ジーン３２プロテインは１本鎖ＤＮＡ結合性タンパク質であり、核酸増幅過程で鋳型となっている１本鎖ＤＮＡに予め結合して鋳型が核酸分解酵素による分解から免れ、核酸増幅反応が阻害されず促進されるか、又は、ＢＳＡと同様の核酸増幅阻害物質に結合することにより、核酸増幅が阻害されず進行する、という二つの可能性が考えられている（前記Abu Al-Soudら）。
　さらに、ＢＳＡ、Ｔ４ジーン３２プロテイン、及びタンパク質分解酵素阻害剤（proteinase inhibitor）はタンパク質分解酵素（proteinase）に結合することによりタンパク質分解活性を低減させ、核酸合成酵素の働きを最大限に引き出す可能性が示唆されている。事実、牛乳や血液にはタンパク質分解酵素が残存していることもあり、その際、ＢＳＡ又はタンパク質分解酵素阻害剤（大豆トリプシンインヒビターやα２-マクログリブリン）の添加により核酸合成酵素が分解を受けず、核酸増幅反応が良好に進行したケースも紹介されている（前記Abu Al-Soudら）。
　また、デキストランは一般にグルコースを原料として乳酸菌が合成する多糖類である。ムチンという同様の多糖類－ペプチド複合体が腸管粘膜に接着することも報告されており（Ruas-Madiedo, P., Applied and Environmental Microbiology, 74:1936-1940, 2008）、デキストランが負電荷阻害物質（核酸合成酵素に吸着）、又は正電荷阻害物質（核酸に吸着）に予め吸着することにより、それら阻害物質に結合する可能性は十分あるものと推察される。
　また、リゾチームは、牛乳中に多数含まれていると考えられる核酸増幅阻害物質と吸着しているものと推察される（前記Abu Al-Soudら）。
　以上のことから、アルブミン、Ｔ４ジーン３２プロテイン、デキストラン、及びリゾチームに代表される上記物質は、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤であるといえる。
　アルブミンとしては、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミン、乳アルブミン、ヒト血清アルブミン等が挙げられる。これらの中ではウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が好ましい。アルブミンは精製品でもよく、本発明の効果を損わない限りグロブリン等の他の成分を含んでいてもよい。また、分画物であってもよい。被検試料（核酸増幅反応液）中のアルブミンの濃度は、例えば、通常０．０００１～１％、好ましくは０．０１～１％、より好ましくは０．２～０．６％である。
　デキストランとしては、デキストラン４０やデキストラン５００等が挙げられる。これらの中ではデキストラン４０が好ましい。被検試料（核酸増幅反応液）中のデキストランの濃度は、例えば、通常１～８％、好ましくは１～６％、より好ましくは１～４％である。
　Ｔ４ジーン３２プロテイン（例えば、ロシュ社製：ｇｐ３２とも呼ばれる）の被検試料（核酸増幅反応液）中の濃度は、通常０．０１～１％、好ましくは０．０１～０．１％、より好ましくは０．０１～０．０２％である。
　リゾチームとしては、卵白由来のリゾチームが挙げられる。被検試料（核酸増幅反応液）中のリゾチームの濃度は、例えば、通常１～２０μｇ／ｍｌ、好ましくは６～１５μｇ／ｍｌ、より好ましくは９～１３μｇ／ｍｌである。
　界面活性剤としては、Triton（ユニオンカーバイド社の登録商標）、Nonidet（シェル社の登録商標）、Tween（ICI社の登録商標）、Brij（ICI社の登録商標）等の非イオン系界面活性剤、SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）等の陰イオン系界面活性剤、塩化ステアリルジメチルベンジルアンモニウム等の陽イオン系界面活性剤が挙げられる。
　TritonとしてはTriton X-100（ポリエチレングリコール tert－オクチルフェニルエーテル）等が，NonidetとしてはNonidet P-40（オクチルフェニル－ポリエチレングリコール）等が、TweenとしてはTween 20（ポリエチレングリコールソルビタンモノラウラート）、Tween 40（ポリエチレングリコールソルビタンモノパルミタート）、Tween 60（ポリエチレングリコールソルビタンモノステアラート）、Tween 80（ポリエチレングリコールソルビタンモノオレアート）等が、BrijとしてはBrij56（ポリオキシエチレン(10) セチルエーテル）、Brij58（ポリオキシエチレン(20) セチルエーテル）等が挙げられる。
　核酸増幅反応液中の界面活性剤の種類及び濃度は、微生物の細胞内へのＰＣＲ試薬の透過を促進し、核酸増幅反応を実質的に阻害しない限り特に制限されない。例えば、陰イオン系界面活性剤が用いられる場合は０．０００５～０．０１％の範囲が好ましく、陽イオン系界面活性剤が用いられる場合は０．０００５～０．０１％の範囲が好ましい。
　具体的には、SDSの場合は、例えば、通常０．０００５～０．０１％、好ましくは０．００１～０．０１％、より好ましくは０．００１～０．００５％、より好ましくは０．００１～０．００２％である。
　他の界面活性剤の場合、例えば、非イオン系界面活性剤が用いられる場合は０．００１～１．５％の範囲が好ましい。
　具体的には、Nonidet P-40の場合は、通常、０．００１～１．５％の範囲であれば良く、好ましくは０．００２～１．２％、より好ましくは０．９～１．１％である。
　Tween 20、Tween 40、Tween 60、又はTween 80の場合は、通常、０．００１～１．５％の範囲であれば良く、好ましくは０．００２～１．２％、より好ましくは０．９～１．１％である。
　Brij56又はBrij58の場合は、通常０．１～１．５％の範囲であれば良く、好ましくは０．４～１．２％、より好ましくは０．７～１．１％である。
　核酸増幅反応に用いる酵素溶液に界面活性剤が含まれている場合は、同酵素溶液由来の界面活性剤のみでもよいし、さらに同種又は異なる界面活性剤を追加してもよい。
　マグネシウム塩としては、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、炭酸マグネシウム等が挙げられる。被検試料（核酸増幅反応液）中のマグネシウム塩の濃度は、例えば、通常１～１０ｍＭ、好ましくは２～６ｍＭ、より好ましくは２～５ｍＭである。
　有機酸塩としては、クエン酸、酒石酸、プロピオン酸、酪酸等の塩が挙げられる。塩の種類としては、ナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。また、リン酸塩として、ピロリン酸塩等が挙げられる。これらは、１種でもよく、２種又は３種以上の混合物であってもよい。被検試料（核酸増幅反応液）中の有機酸塩又はリン酸塩の濃度は、例えば、通常合計量で０．１～２０ｍＭ、好ましくは１～１０ｍＭ、より好ましくは１～５ｍＭである（特許第4127847号、WO2007/094077参照）。
　被検試料から核酸を抽出する場合は、抽出方法は、抽出されたＤＮＡが核酸増幅における鋳型として機能し得る限り特に制限されず、一般的に用いられている微生物のＤＮＡの抽出法にしたがって行うことができる。
　ＤＮＡの抽出法は、例えば、Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook, J.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に記載されている。
　被検試料からの核酸の抽出を行わない場合は、上記核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、及び必要に応じて他の各成分の存在下で、細胞内に存在しているＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅する。核酸増幅の鋳型には、微生物細胞けん濁液、又はタンパク質分解酵素、脂質分解酵素、又は糖分解酵素等で処理した微生物細胞のけん濁液を用い、鋳型調製のための核酸の抽出は行わないことが好ましい。
　被検試料から核酸の抽出を行う場合は、抽出したＤＮＡ又はＲＮＡを鋳型として、通常の方法によりターゲット領域を核酸増幅法により増幅する。
　核酸増幅法は、高温、例えば９０～９５℃、好ましくは９３～９５℃、より好ましくは９４～９５℃における核酸の熱変性のステップを含むことが好ましい。
　核酸増幅法としては、ＰＣＲ法（Polymerase chain reaction：White,T.J. et al., Trends Genet., 5, 185(1989)）、ＬＡＭＰ法（Loop-Mediated Isothermal Amplification：新規遺伝子増幅法（LAMP法）の原理と応用 、納富継宣、長谷哲、BIO INDUSTRY, Vol.18, No.2, 15-23, 2001）、ＩＣＡＮ法（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids：嶌田雅光ら、ベッドサイドICAN 法によるクラミジア／リン菌遺伝子検出試薬の開発、2002年、第51回日本医学検査学会抄録集、121、向井博之、ICAN 法の開発と応用、2002年、第14回北海道輸血シンポジウム、20）、ＳＤＡ法（Strand Displacement Amplification：Edward L. Chan, et al.,Arch. Pathol. Lab. Med., 124:1649-1652, 2000）、ＬＣＲ法（Ligase Chain Reaction：Barany, F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.88, p.189-193, 1991）、ＴＭＡ法（Transcription-Mediated-Amplification：Sarrazin C. et al., J. Clin. Microbiol., vol.39: p.2850-2855 (2001)）、ＴＲＣ法（Transcription-Reverse Transcription-Concerted method：Nakaguchi Y. et al., J. Clin. Microbiol., vol.42: p.4284-4292 (2004)）、ＨＣ法（Hybrid Capture：Nazarenko I., Kobayashi L. et al., J. Virol. Methods, vol.154: p.76-81, 2008）、ＳＭＡＰ法（Smart Amplification Process、Smart Amp法；Mitani Y., et al., Nature Methods, vol.4, No.3, p.257-262 (2007)）、マイクロアレイ法（Richard P. Spence, et al., J. Clin. Microbiol., Vol.46, No.5, p.1620-1627, 2008）等がそれぞれ例示される。
　なお、本発明においては、ＰＣＲ法を利用することが特に好ましいが、これに制限されない。ＰＣＲ法には、定量ＰＣＲ法（Quantitative PCR 又は Real-Time PCR：VanGuilder HD, et al., Biotechniques, 2008, Apr;44(5), 619-26、Spackman E., et al., Methods Mol Biol., 2008, Vol.436, p.19-26）、ＲＴ－ＰＣＲ法（Reverse Transcription PCR：Freeman WM, et al., Biotechniques, 1999, Jan;26(1), 112-22, 124-5）、リアルタイムＰＣＲ法（Nogva et al., Appl. Environ. Microbiol., vol.66, 2000, pp.4266-4271、 Nogva et al., Appl. Environ. Microbiol., vol.66, 2000, pp.4029-4036）等の改変法が含まれるが、それらに制限されない。
　本発明において「ターゲット領域」とは、染色体ＤＮＡ、又はＲＮＡのうち、本発明に用いるプライマーを用いた核酸増幅法により増幅され得る領域であり、検出対象の微生物を検出することができるものであれば特に制限されず、目的に応じて適宜設定することができる。例えば、被検試料に検出対象の微生物と異なる種類の細胞が含まれる場合には、ターゲット領域は、検出対象の微生物に特異的な配列を有することが好ましい。また、目的によっては、複数種の微生物に共通する配列を有するものであってもよい。さらに、ターゲット領域は単一であっても、複数であってもよい。
　検出対象の微生物に特異的なターゲット領域に対応するプライマーセットと、広汎な微生物の核酸に対応するプライマーセットを用いると、検出対象の微生物の生細胞量と、多数種の微生物の生細胞量を、同時に測定することができる。ターゲット領域の長さとしては、通常５０～５０００塩基、又は５０～３０００塩基が挙げられる。
　本発明の方法の好ましい態様では、ターゲット領域が従来法よりも短い、例えば４００塩基程度の長さであっても、生細胞と死細胞及び／又は損傷細胞との識別が可能である。
　核酸の増幅に用いるプライマーは、各種核酸増幅法の原理に基づいて、適宜設定することが可能であって、上記ターゲット領域を特異的に増幅することができるものであれば特に制限されない。
　好ましいターゲット領域の例は、５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、ｔＲＮＡ遺伝子、及び病原遺伝子等の各種特異遺伝子である。これらの遺伝子の一つ又はその一部をターゲットとしてもよく、２又はそれ以上の遺伝子にまたがる領域をターゲットとしてもよい。例えば、配列番号１及び２に示すプライマーセットを用いることにより、クロノバクター・サカザキ菌に特異的な１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の一部を増幅することができる。また、市販されている１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子増幅用プライマーを用いてもよい。
　また、検出対象の微生物が病原性細菌である場合には、ターゲット領域としては病原遺伝子が挙げられる。病原遺伝子としては、リステリア属細菌のリステリオリシンＯ（ｈｌｙＡ）遺伝子、サルモネラ属細菌のenterotoxin（エンテロトキシン）遺伝子やinvasion（ｉｎｖＡ）遺伝子、病原性大腸菌Ｏ－１５７、Ｏ－２６、Ｏ－１１１等のベロ毒素遺伝子、エンテロバクター属又はクロノバクター属細菌のouter-membrane-protein A（ｏｍｐＡ）遺伝子（クロノバクター・サカザキ菌）及びmacromolecular synthesis（ＭＭＳ）オペロン（クロノバクター・サカザキ菌）、レジオネラ属細菌のmacrophage-invasion protein（ｍｉｐ）遺伝子、腸炎ビブリオ細菌の耐熱性溶血毒遺伝子、耐熱性溶血毒類似毒素遺伝子、赤痢菌及び腸管侵入性大腸菌のｉｐａ遺伝子（invasion plasmid antigen gene）や、ｉｎｖＥ遺伝子（invasion gene）、黄色ブドウ球菌エンテロトキシン遺伝子、バチルス・セレウス菌のセレウリド（嘔吐毒素）遺伝子やエンテロトキシン遺伝子、ボツリヌス菌の各種毒素遺伝子等が挙げられる。
　また、エンベロープを有するインフルエンザウイルスの場合、ヘマグルチニン（Ｈタンパク質）遺伝子やノイラミニダーゼ（Ｎタンパク質）遺伝子、ノロウイルスに代表されるカリシウイルス科ウイルスのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子、各種カプシドタンパクをコードしている遺伝子領域等が挙げられる。食中毒ウイルスとしてノロウイルスの他、ロタウイルス、アデノウイルスもあり、対象遺伝子はノロウイルス同様、ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子、カプシドタンパクをコードしている遺伝子領域が標的領域となる。
　複数種の微生物に共通するプライマーを用いると、被検試料中の複数種の微生物の生細胞を検出することができる。また、特定の細菌に特異的なプライマーを用いると、被検試料中の特定の菌種の生細胞を検出することができる。
　核酸増幅反応の条件は、各核酸増幅法（ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ＳＤＡ法、ＬＣＲ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法、ＨＣ法、ＳＭＡＰ法、及びマイクロアレイ法等）の原理に則った特異的な増幅が起る限り特に制限されず、適宜設定することができる。
（３）工程ｃ）
　核酸増幅法により増幅した増幅産物を解析する。増幅産物の解析は、工程ｂ）で採用する核酸増幅法に応じて、工程ｂ）に続いて行われるか、又は、工程ｂ）と同時に行われる。例えば、リアルタイムＰＣＲの場合は、工程ｃ）は工程ｂ）と同時に行われ得る。
　解析法は、核酸増幅産物の検出又は定量が可能なものであれば特に制限されず、電気泳動法等が例示される。
　電気泳動法によれば、核酸増幅産物の量、及びその大きさを評価することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法によれば、迅速にＰＣＲ増幅産物の定量を行うことができる。
　リアルタイムＰＣＲ法を採用する場合、一般に増幅サイクル数１～１０までは蛍光強度の変化はノイズレベルでありゼロに等しいので、それらを増幅産物ゼロのサンプルブランクと見なし、それらの標準偏差ＳＤを算出し、そのＳＤ値に１０を乗じた値をスレッショールド値とし、そのスレッショールド値を最初に上回るＰＣＲサイクル数をサイクルスレッショールド値（Ｃｔ値）という。従って、ＰＣＲ反応溶液に初期のＤＮＡ鋳型量が多い程、Ｃｔ値は小さな値となり、鋳型ＤＮＡ量が少ない程、Ｃｔ値は大きな値となる。また、鋳型ＤＮＡ量が同じでも、その鋳型内のＰＣＲのターゲット領域に切断が生じている割合が多くなる程、同領域のＰＣＲ反応のＣｔ値は大きな値となる。
　また、増幅産物の有無は、増幅産物の融解温度（ＴＭ）パターンを解析することによっても行うことができる。
　上記の各方法は、本発明の方法における諸条件の最適化に際しても使用することができる。
　本発明の方法によって生細胞を検出する場合、核酸増幅産物の解析は、同定されている微生物の標準試料を用いて作成された微生物量及び増幅産物との関連を示す標準曲線を用いると、生細胞の有無又は定量の精度を高めることができる。標準曲線は予め作成しておいたものを用いることができるが、被検試料と同時に標準試料について本発明の各工程を行って作成した標準曲線を用いることが好ましい。また、予め微生物量とＤＮＡ量又はＲＮＡ量との相関を調べておけば、その微生物から単離されたＤＮＡ又はＲＮＡを標準試料として用いることもできる。
＜２＞本発明のキット
　本発明のキットは、核酸増幅法により、被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞及び／又は損傷細胞と識別して検出するためのキットであって、イリジウム錯体を含む。
　本発明のキットは、さらに、検出対象の微生物のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅するためのプライマーを含んでいてもよい。
　本発明のキットは、好ましい態様では、さらに核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、マグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩のいずれか、又はこれらの２種以上を含んでいてもよい。より好ましい態様では、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、マグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩のすべてを含んでいてもよい。更に、核酸伸長酵素を、通常のＰＣＲもしくは通常のリアルタイムＰＣＲ時に使用する濃度の２倍～１０倍濃度を含んだ方が、より好ましい。また、本発明のキットは、さらに界面活性剤を含んでいてもよい。
　本発明のキットは、前記本発明の方法を実施するために用いることができる。
　また、本発明のキットには、被検試料中に存在する微生物以外の細胞、タンパク質コロイド粒子、脂肪、又は糖質を分解する活性を有する酵素を追加することが可能である。
　酵素、イリジウム錯体、及び必要に応じて、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、並びにマグネシウム塩、有機酸塩又はリン酸塩、及び界面活性剤は、これらの成分を全て含む単一の組成物であってもよいし、各成分を任意の組合わせで含む複数の溶液又は組成物であってもよい。
　前記核酸増幅反応は、ＰＣＲ法（定量ＰＣＲ法、ＲＴ－ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法を含む）、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ＳＤＡ法、ＬＣＲ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法、ＨＣ法、ＳＭＡＰ法、又はマイクロアレイ法であることが好ましい。なお、上記キットにおいて、架橋剤等の薬剤は、本発明の方法で説明したものと同様である。
　本発明のキットに含まれるイリジウム錯体として好ましいものは、前記本発明の方法について記載した化合物と同様である。
　また、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤としては、アルブミン、デキストラン、及びＴ４ジーン３２プロテイン、アセトアミド、ベタイン、ジメチルスルホキシド、ホルムアミド、グリセロール、ポリエチレングリコール、大豆トリプシンインヒビター、α２－マクログロブリン、テトラメチルアンモニウムクロライド、リゾチーム、ホスホリラーゼ、及び乳酸脱水素酵素から選択されるいずれか一種又は複数種を例示することができる。
　また、マグネシウム塩としては、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、炭酸マグネシウム等が挙げられる。
　また、有機酸塩としては、クエン酸、酒石酸、プロピオン酸、酪酸等の塩が挙げられる。塩の種類としては、ナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられる。また、リン酸塩として、ピロリン酸塩等が挙げられる。これらは、１種でもよく、２種又は３種以上の混合物であってもよい。
　また、酵素としては、被検試料中に存在する微生物以外の細胞、タンパク質コロイド粒子、脂肪及び糖質等の夾雑物を分解することができ、かつ、検出対象の微生物の生細胞を損傷しないものであれば特に制限されないが、例えば、脂質分解酵素、タンパク質分解酵素、及び糖質分解酵素が挙げられる。前記酵素は、１種類の酵素を単独で用いてもよいし、２種又はそれ以上の酵素を併用してもよいが、脂質分解酵素及びタンパク質分解酵素の両方、又は脂質分解酵素、タンパク質分解酵素、及び糖質分解酵素の全てを用いることが好ましい。
　脂質分解酵素としては、リパーゼ、フォスファターゼ等が、タンパク質分解酵素としてはセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、プロテイナーゼＫ、プロナーゼ等が、糖質分解酵素としてはアミラーゼ、セルラーゼ、Ｎ－アセチルムラミダーゼ等が挙げられる。
　本発明のキットは、さらに、希釈液、イリジウム錯体による反応用の反応液、核酸増幅用の酵素及び反応液、本発明の方法を記載した説明書等を含めることもできる。
　以下に、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕Di-μ-chlorobis[(η-cycloocta-1,5-diene)iridium(I)]による大腸菌（Escherichia coli）の生細胞・死細胞の識別
　本実施例では、イリジウム錯体を用いたE. coliの生細胞及び死細胞の識別を行った。イリジウム錯体としては、イリジウム錯体二量体（１錯体に２個のイリジウム元素を有するダイマー）であるDi-μ-chlorobis[(η-cycloocta-1,5-diene)iridium(I)]を用いた。
１．試験材料及び方法
１－１）滅菌水を用いてE. coli JCM1649株の生細胞けん濁液（1.2 × 10７cfu/ml）を調製した。この生細胞けん濁液の一部を沸騰水中に3分浸漬し、損傷細胞／死細胞けん濁液（1.2×10７ cells/ml。以下、損傷細胞と死細胞を包括して死細胞と表記する）を調製した。これらの生細胞けん濁液、又は死細胞けん濁液のそれぞれ90 μlを下記試験に供した。JCM1649株は、JCM（国立研究開発法人 理化学研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室（〒305-0074 茨城県つくば市高野台3-1-1））から入手できる。
１－２）イリジウム錯体溶液の調製
　Di-μ-chlorobis[(η-cycloocta-1,5-diene)iridium(I)]（Wako）3.92 mg（5.84 μmol）を秤量し、116.7 μlのジメチルスルフォキシド（DMSO、D8418-50ML, Sigma）に溶解して50 mM溶液を調製した。この溶液を生理食塩水で希釈して100μM、250μM、1000μMのイリジウム錯体溶液を準備した。
１－３）イリジウム錯体による被検試料の処理
　前記の各イリジウム錯体溶液10μlを、上記生細胞けん濁液90μl又は死細胞けん濁液90μlに添加し、恒温水槽にて37℃で30分間保持した。その後、冷却遠心処理（4℃、15,000×G、5分）し、上清を除去した。沈殿物（ペレット）を1mlの滅菌水にて洗浄した。洗浄後のペレット（細胞けん濁液5μlに相当）をPCR増幅用試料とした。
１－４）PCR増幅
　細胞からの核酸の抽出を行わずにＰＣＲを効率よく行うために必要な核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤の混合物の濃縮液（この溶液を、濃縮ダイレクトコンポーネント、cDBCと記載する）を調製した。
　具体的には、ウシ血清アルブミン（BSA; Sigma A7906）、クエン酸三ナトリウム2水和物（TSC: Tri-Sodium Citrate Dihydrate; 関東化学、東京）、塩化マグネシウム6水和物（31404-15 ナカライテスク、京都）、卵白リゾチーム（126-02671 Lysozyme from egg white; 和光純薬、大阪）、Brij58（P5884-100G; Sigma）の各ストック溶液を、表１に示す濃度となるように混合し、cDBCを調製した。
　例えば、ＰＣＲ 200検体用として16.6% Brij58、4.8% BSA、333 mM TSC、1 M MgCl２、2.5 mg/ml lysozymeの各ストック溶液を、それぞれ250μl、200μl、15μl、15μl、20μlの容量にて混和すれば、表１に示す500μlのcDBC（10×DBC）を調製することができる。尚、後述するTaq DNA Polymerase with Standard Taq Buffer (New England Biolabs Japan Inc.; M0273S)を用いて、メーカーマニュアルに従ってリアルタイムPCRマスターミックス（qPCR）を調製すると、終濃度として2 mM相当のMgCl２が含まれていると推察されるため、合計のMgCl２は5 mM相当と推測された。
　Brij 58、 MgCl２、及びTSCは滅菌水にて溶解後、オートクレーブ（121℃、20分）し、水冷後室温に戻し、ストック溶液として使用した。BSA、Lysozymeは滅菌水にてストック溶液を調製し、0.22μmフィルターにて濾過滅菌し、ストック溶液とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　次に、表２に示される、細胞からの核酸の抽出を行わずにリアルタイムＰＣＲ（細胞からの核酸の抽出せずに行うリアルタイムＰＣＲを、以降「ダイレクト・リアルタイムＰＣＲ」と記載する。）を行うためのマスターミックス（ダイレクト・リアルタイムＰＣＲ用マスターミックス）を調製した。具体的には、前記Taq DNA Polymerase with Standard Taq BufferをqPCRバッファーとして用い、これにTaqポリメラーゼを通常使用の4倍量を加え、同バッファーにcDBC（10 × DBC）を所定量添加したダイレクト・リアルタイムＰＣＲ（DqPCR）マスターミックスを調製した。
　先に調製したＰＣＲ増幅用試料にダイレクト・リアルタイムＰＣＲ用マスターミックスを添加して、リアルタイムPCR増幅(40 cycles)を２回実施した。尚、以下、New England Biolabs製品はNEBと記載する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　PCR増幅には、Primer ENT-16S forward: 腸内細菌科菌群（Enterobacteriaceae）特異的16S rRNA遺伝子検出用フォワードプライマー（5'-GTTGTAAAGCACTTTCAGTGGTGAGGAAGG -3'：配列番号１）、Primer ENT-16S reverse: 腸内細菌科菌群（Enterobacteriaceae）特異的16S rRNA遺伝子検出用リバースプライマー（5'-GCCTCAAGGGCACAACCTCCAAG-3'：配列番号２）をＰＣＲプライマーとして使用した（両プライマーはニッポンジーンに製造委託した）。増幅されるrRNA遺伝子の断片長は424 bpである。
　腸内細菌科菌群（Enterobacteriaceae）ENT-16S TaqMan probeとしては、配列番号３（5'-/56-FAM/AACTGCATC/ZEN/TGATACTGGCAGGCT/3lABkFQ/ -3'）の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。このブローブは、オリゴヌクレオチドの５’末端に蛍光物質56-FAM、中央部にZEN、３’末端に31ABkFQという消光色素（クエンチャー）を配置した仕様で、Integrated DNA Technologies社にて委託製造した。
　尚、配列番号１及び２のプライマーに関する塩基配列情報は、Nakano, S. et al., J. Food Prot. 66:1798-1804, 2003から入手し、配列番号３のENA-16S TaqMan probeに関する塩基配列情報はGenBank database（http://www.ebi.ac.uk/genbank/）より腸内細菌科菌群内の16S rRNA遺伝子の相補的領域を選択することにより得た。
　リアルタイムＰＣＲ装置（StepOnePlus Real-Time PCR System; Applied Biosystems）を用いて、下記のＰＣＲサーマルサイクル条件により、リアルタイムＰＣＲを２回実施した。
1) 95℃, 20秒（1サイクル）
2) 95℃, 5秒; 60℃, 1分（40サイクル）
　尚、陰性コントロールとして、滅菌水5μlを鋳型として使用した。
２．結果及び考察
　リアルタイムPCRの結果を表３に示す。表３中、「No Agent」は陰性コントロールを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表３によれば、Di-μ-chlorobis[(η-cycloocta-1,5-diene)iridium(I)]をE. coliの生細胞及び死細胞に作用させたとき、死細胞のCt値は薬剤濃度依存的に大きくなり、当該イリジウム錯体100 μMの濃度にて死細胞由来のPCR増幅が完全に抑制された。一方、生細胞に関しては、濃度が高くなるにつれ若干薬剤の透過現象が観察されるが、前記死細胞由来のPCRを完全に抑制した薬剤濃度では、未処理生細胞のCt値と比較して3.6程度の上昇（増幅の遅れ）に留まり、当該イリジウム錯体100 μMにて明瞭な生細胞と死細胞の識別が可能であった。
〔実施例２〕Di-μ-chlorobis[(η-cycloocta-1,5-diene)iridium(I)]によるスタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）の生細胞・死細胞の識別
　実施例１では、イリジウム錯体二量体を用いて、グラム陰性細菌の代表的菌種であるE. coliの生細胞及び死細胞の明瞭な識別が可能であることが示された。本実施例では、同じイリジウム錯体二量体により、グラム陽性細菌であるS. aureusの生細胞と死細胞とを明瞭に識別できるかを検討した。
１．試験材料及び方法
１－１）滅菌水を用いてS. aureus ATCC 6538P株の生細胞けん濁液（4.5 × 10７ cfu/ml）を調製した。この生細胞けん濁液の一部を沸騰水中に3分浸漬し、死細胞懸濁液（4.5 × 10７ cells/ml）を調製した。これらの生細胞けん濁液、又は死細胞けん濁液のそれぞれ90 μlを下記試験に供した。
１－２）イリジウム錯体溶液の調製
　Di-μ-chlorobis[(η-cycloocta-1,5-diene)iridium(I)] 4.45 mg（6.63 μmol）を秤量し、132.5 μlのジメチルスルフォキシドに溶解して50 mM溶液を調製した。この溶液を生理食塩水で希釈して100 μM、250 μM、1000μMのイリジウム錯体溶液を準備した。
１－３）イリジウム錯体による被検試料の処理
　前記の各イリジウム錯体溶液10 μlを、上記生細胞けん濁液90 μl又は死細胞けん濁液90 μlに添加し、恒温水槽にて37℃で15分間保持した。その後、冷却遠心処理（4℃、15,000 × G、5分）し、上清を除去した。ペレットを1 mlの滅菌水にて洗浄した。洗浄後のペレット（細胞けん濁液5 μlに相当）をPCR増幅用試料とした。
１－４）PCR増幅
　下記表４に示される組成にて、ダイレクト・リアルタイムＰＣＲ（DqPCR）マスターミックスを調製した。具体的には、SYBRPremix Ex TaqＴＭ PCR Master Mix (2×)（Takara-Bio Co., Ltd, Otsu, Japan）をリアルタイムPCR用バッファーとして用い、ＰＣＲ増幅用forward primer及びreverse primerとしてBacteria Screening PCR Kit (Takara-Bio)添付Primer Mix BS (5μM each)を使用した。尚、本プライマーミックスはスタフィロコッカス属及びバチラス属を共に検出可能とするプライマーであり、増幅遺伝子長は約380 bpである。リアルタイムＰＣＲは２回実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　リアルタイムＰＣＲ装置を用いて、下記のＰＣＲサーマルサイクル条件により、リアルタイムＰＣＲを実施した。
1) 95℃, 1分（1サイクル）
2) 95℃, 10秒; 59℃, 30秒; 72℃, 30秒（40サイクル）
　尚、陰性コントロールとして、滅菌水5μlを鋳型として使用した。
２． 結果及び考察
　リアルタイムＰＣＲの結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表５によれば、グラム陽性細菌であるS. aureusについても、イリジウム錯体（二量体）処理により生細胞と死細胞との識別が可能であることが示された。すなわち、イリジウム錯体によりグラム陰性細菌及びグラム陽性細菌に関して、生細胞と死細胞との明瞭な識別が可能であることが示された。
〔実施例３〕2-Hydroxy-N-pyridine(pentamethylcyclopentadienyl)iridium(III)dichlorideによるE. coliの生細胞・死細胞の識別
　実施例１及び２にて、イリジウム錯体二量体を用いて、E. coli及びS. aureusというグラム陰性細菌、グラム陽性細菌の生細胞と死細胞との明瞭な識別ができることが示された。本実施例では、イリジウム錯体単量体を用いてE. coliの生細胞と死細胞とが識別できるかを検討した。
１．試験材料及び方法
１－１）滅菌水を用いてE. coli JCM1649株の生細胞けん濁液（2.1 × 10７ cfu/ml）を調製した。この生細胞懸濁液の一部を沸騰水中に3分浸漬し、死細胞懸濁液（2.1 × 10７ cells/ml）を調製した。これらの生細胞けん濁液、又は死細胞けん濁液のそれぞれ90 μlを下記試験に供した。
１－２）イリジウム錯体溶液の調製
　2-Hydroxy-N-pyridine(pentamethylcyclopentadienyl)iridium(III)dichloride（関東化学（株）、東京）4.22 mg (8.55 μmol)を秤量し、855.3 μlのジメチルスルフォキシド（Sigma）に溶解して10 mM溶液を調製した。この溶液を生理食塩水で希釈して250 μM、500 μM、2000μMのイリジウム錯体溶液を準備した。
１－３）イリジウム錯体による被検試料の処理
　前記の各イリジウム錯体溶液10 μlを、上記生細胞けん濁液90 μl又は死細胞けん濁液90 μlに添加し、恒温水槽にて37℃で30分間保持した。その後、冷却遠心処理（4℃、15,000 × G、5分）し、上清を除去した。ペレットを1 mlの滅菌水にて洗浄した。洗浄後のペレット（細胞けん濁液5 μlに相当）をPCR増幅用試料とした。
１－４）PCR増幅
　実施例１と全く同じ条件（すなわち、表２に示すダイレクト・リアルタイムPCRマスターミックス使用）にて、ダイレクト・リアルタイムPCR（DqPCR）を実施した。
２．結果及び考察
　リアルタイムPCRの結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表６によれば、2-Hydroxy-N-pyridine(pentamethylcyclopentadienyl)iridium(III)dichlorideをE. coliの生細胞及び死細胞に作用させたとき、死細胞のCt値は薬剤濃度依存的に大きくなり、当該イリジウム錯体200 μMの濃度にて死細胞由来のPCR増幅が完全に抑制された。一方、生細胞に関しては、濃度が高くなるにつれ若干薬剤の透過現象が観察されるが、前記死細胞由来のPCRを完全に抑制した薬剤濃度では、未処理生細胞のCt値と比較して4.3程度の上昇（増幅の遅れ）に留まり、当該イリジウム錯体200 μMにて生細胞と死細胞との明瞭な識別が可能であった。
　すなわち、イリジウム錯体は二量体のみならず単量体においてもE. coliの生細胞と死細胞との明瞭な識別が可能であることが示された。
〔実施例４〕2-Hydroxy-N-pyridine(pentamethylcyclopentadienyl)iridium(III)dichlorideによるS. aureusの生細胞・死細胞の識別
　実施例３においては、イリジウム錯体単量体によりE. coliの生細胞と死細胞との明瞭な識別が可能であることが示された。本実施例では、同じイリジウム錯体単量体によりS. aureusの生細胞と死細胞とを明瞭に識別できるかを検討した。
１．試験材料及び方法
１－１）滅菌水を用いてS. aureus ATCC 6538P株の生細胞けん濁液（6.6 × 10７ cfu/ml）を調製した。この生細胞けん濁液の一部を沸騰水中に3分浸漬し、死細胞懸濁液を調製したこれらの生細胞けん濁液、又は死細胞けん濁液のそれぞれ90 μlを下記試験に供した。
１－２）イリジウム錯体溶液の調製
　2-Hydroxy-N-pyridine(pentamethylcyclopentadienyl)iridium(III)dichloride(関東化学（株）、東京) 3.89 mg (7.88 μmol)を秤量し、788.1 μlのジメチルスルフォキシド（Sigma）に溶解して10 mM溶液を調製した。この溶液を生理食塩水で希釈して250 μM、500 μM、2000μMのイリジウム錯体溶液を準備した。
１－３）イリジウム錯体による被検試料の処理
　前記の各イリジウム錯体溶液10 μlを、上記生細胞けん濁液90 μl又は死細胞けん濁液90 μlに添加し、恒温水槽にて37℃で15分間保持した。その後、冷却遠心処理（4℃、15,000 × G、5分）し、上清を除去した。ペレットを1 mlの滅菌水にて洗浄した。洗浄後のペレット（細胞けん濁液5 μlに相当）をPCR増幅用試料とした。
１－４）PCR増幅
　実施例２と同様にして、リアルタイムＰＣＲを２回実施した。
２． 結果及び考察
　リアルタイムＰＣＲの結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表７によれば、グラム陽性細菌であるS. aureusについても、当該イリジウム錯体（単量体）処理により、生細胞と死細胞との識別が可能であることが示された。すなわち、二量体や単量体に関わらず、イリジウム錯体により、広くグラム陰性細菌及びグラム陽性細菌に関して、生細胞と死細胞との明瞭な識別が可能であることが示された。
　本発明の方法によれば、簡便な工程で、微生物の生細胞を、死細胞及び／又は損傷細胞と識別して検出することができる。本発明により、核酸増幅法による簡易かつ迅速な食品及び生体試料、拭き取り試料、工業用水、環境用水、排水等の環境中の微生物の生細胞・損傷細胞・死細胞の簡便な判別が可能となる。
　また、本発明に用いるイリジウム錯体のうち、例えば、前述する化２に示される化合物は有機化学や有機合成化学の分野において金属触媒として使用されおり、ＥＭＡ等の薬剤に比べて危険性が低いと考えられる。さらに、好ましいイリジウム錯体は、ＥＭＡ等の薬剤に比べて安価であり、産業上有利である。

Claims (26)

  1. 　被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞及び／又は損傷細胞と識別して検出する方法であって、以下の工程を含む方法：
    　ａ）前記被検試料にイリジウム錯体を添加する工程、
    　ｂ）被検試料に含まれる微生物のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅する工程、及び
    　ｃ）増幅産物を解析する工程。
  2. 　前記イリジウム錯体が、NH３、RNH２、ハロゲン元素、カルボキシレート基、ピリジン基、H２O、CO３ ２－、OH－、NO３ －、ROH、N２H４、PO４ ３－、R２O、RO－、ROPO３ ２－、(RO)２PO２－、NO２ －、N２、N３ －、R２S、R２P－、R３P、RS－、CN－、RSH、RNC、(RS)２PO２ －、(RO)２P(O)S－、SCN－、CO、H－、およびR－（ただし、前記「R」の表記は、いずれも飽和又は不飽和有機基を表す）からなる群から選ばれる配位子を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記配位子が、NH３、RNH２、ハロゲン元素、カルボキシレート基、ピリジン基、H２O、CO３ ２－、OH－、NO３ －、ROH、N２H４、PO４ ３－、R２O、RO－、ROPO３ ２－、(RO)２PO２－、R２S、R２P－、R３P、RS－、CN－、RSH、RNC、(RS)２PO２ －、(RO)２P(O)S－、SCN－、CO、H－、およびR－からなる群から選ばれる、請求項２に記載の方法。
  4. 　前記イリジウム錯体が、ジ-μ-クロロビス[(η-シクロオクタ-1,5-ジエン)イリジウム(I)]、及び、2-ヒドロキシ-N-ピリジン(ペンタメチルシクロペンタジエニル)イリジウム(III)ジクロリドから選ばれる、請求項１に記載の方法。
  5. 　前記イリジウム錯体が、イリジウム化合物を、配位子としてイリジウムに結合し得る有機溶媒、又は配位子としてイリジウムに結合し得る物質を含む溶液に溶解することにより生成するイリジウム錯体である、請求項１に記載の方法。
  6. 　前記有機溶媒がジメチルスルホキシドである、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記ターゲット領域の増幅が、細胞からの核酸の抽出を行わずに行われることを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　前記ターゲット領域の増幅が、微生物細胞内で行われることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
  9. 　前記ターゲット領域の増幅が、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、マグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩を前記被検試料に添加して行われることを特徴とする、請求項７又は８に記載の方法。
  10. 　前記ターゲット領域の増幅が、界面活性剤の存在下で行われることを特徴とする、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 　前記ターゲット領域が、５０～５０００塩基のターゲット領域である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 　前記ターゲット領域が、被検試料のＤＮＡの５Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、及びｔＲＮＡ遺伝子から選択される遺伝子に対応するターゲット領域である、請求項１１に記載の方法。
  13. 　前記被検試料が、食品、生体試料、飲料水、工業用水、環境用水、排水、土壌、又は拭き取り試料のいずれかである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 　前記微生物が、細菌又はウイルスである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 　前記細菌が、グラム陰性細菌又はグラム陽性細菌である、請求項１４に記載の方法。
  16. 　前記核酸増幅法が、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ＳＤＡ法、ＬＣＲ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法、ＨＣ法、ＳＭＡＰ法、又はマイクロアレイ法である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 　前記ＰＣＲ法が、リアルタイムＰＣＲ法により行われ、ＰＣＲと増幅産物の解析が同時に行われることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
  18. 　前記増幅産物の解析が、微生物の標準試料を用いて作成された微生物量及び増幅産物との関連を示す標準曲線を用いて行われることを特徴とする、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 　核酸増幅法により、被検試料中の微生物の生細胞を、死細胞及び／又は損傷細胞と識別して検出するためのキットであって、下記の要素を含むキット：
    　１）イリジウム錯体、又は、
    　配位子としてイリジウムに結合し得る有機溶媒、もしくは配位子としてイリジウムに結合し得る物質を含む溶液に溶解したときに、イリジウム錯体を生成するイリジウム化合物、
    　２）検出対象の微生物のＤＮＡ又はＲＮＡのターゲット領域を核酸増幅法により増幅するためのプライマー。
  20. 　前記イリジウム錯体が、NH３、RNH２、ハロゲン元素、カルボキシレート基、ピリジン基、H２O、CO３ ２－、OH－、NO３ －、ROH、N２H４、PO４ ３－、R２O、RO－、ROPO３ ２－、(RO)２PO２－、NO２ －、N２、N３ －、R２S、R２P－、R３P、RS－、CN－、RSH、RNC、(RS)２PO２ －、(RO)２P(O)S－、SCN－、CO、H－、およびR－（ただし、前記「R」の表記は、いずれも飽和又は不飽和有機基を表す）から選ばれる配位子を含む、請求項１９に記載のキット。
  21. 　前記配位子が、NH３、RNH２、ハロゲン元素、カルボキシレート基、ピリジン基、H２O、CO３ ２－、OH－、NO３ －、ROH、N２H４、PO４ ３－、R２O、RO－、ROPO３ ２－、(RO)２PO２－、R２S、R２P－、R３P、RS－、CN－、RSH、RNC、(RS)２PO２ －、(RO)２P(O)S－、SCN－、CO、H－、およびR－からなる群から選ばれる、請求項２０に記載のキット。
  22. 　前記イリジウム錯体が、ジ-μ-クロロビス[(η-シクロオクタ-1,5-ジエン)イリジウム(I)]、及び、2-ヒドロキシ-N-ピリジン(ペンタメチルシクロペンタジエニル)イリジウム(III)ジクロリドから選ばれる、請求項１９に記載のキット。
  23. 　さらに、配位子としてイリジウムに結合し得る有機溶媒を含む、請求項１９に記載のキット。
  24. 　前記有機溶媒がジメチルスルホキシドである、請求項２３に記載のキット。
  25. 　さらに、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、マグネシウム塩、及び有機酸塩又はリン酸塩を含む、請求項１９～２４のいずれか一項に記載のキット。
  26. 　さらに界面活性剤を含む、請求項１９～２５のいずれか一項に記載のキット。
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