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WO2017002945A1 - 青系花色を有するキクの作出方法 - Google Patents

青系花色を有するキクの作出方法 Download PDF

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WO2017002945A1
WO2017002945A1 PCT/JP2016/069536 JP2016069536W WO2017002945A1 WO 2017002945 A1 WO2017002945 A1 WO 2017002945A1 JP 2016069536 W JP2016069536 W JP 2016069536W WO 2017002945 A1 WO2017002945 A1 WO 2017002945A1
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WO
WIPO (PCT)
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chrysanthemum
seq
polynucleotide
blue
amino acid
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2016/069536
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
尚信 野田
間　竜太郎
智 本郷
早苗 佐藤
田中　良和
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Agriculture and Food Research Organization
Suntory Holdings Ltd
Original Assignee
National Agriculture and Food Research Organization
Suntory Holdings Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Agriculture and Food Research Organization, Suntory Holdings Ltd filed Critical National Agriculture and Food Research Organization
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Priority to US15/740,944 priority patent/US10870861B2/en
Priority to CA2990942A priority patent/CA2990942C/en
Priority to JP2017526443A priority patent/JP6782450B2/ja
Publication of WO2017002945A1 publication Critical patent/WO2017002945A1/ja
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    • A01H6/1424—Chrysanthemum
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0073—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen 1.14.13
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/13—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.13)
    • C12Y114/13088—Flavonoid 3',5'-hydroxylase (1.14.13.88)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)

Definitions

  • the present invention relates to an anthocyanin 3 ′, 5′-O-glucosyltransferase gene (CtA3′5′GT) derived from a pea and a flavonoid 3 ′, 5′-hydroxylase gene (CamF3′5′H) derived from a campanula.
  • CtA3′5′GT 5′-O-glucosyltransferase gene
  • CamF3′5′H 5′-hydroxylase gene
  • the present invention relates to a method for producing a transformed chrysanthemum plant having a product (especially a cut flower product), a tissue or a cell, and a blue flower color.
  • Chrysanthemum roses, carnations and lilies are industrially important flowers worldwide. Chrysanthemum, in particular, has the second largest market in the flower industry in the world, and is the first flower in Japan, accounting for 40% of cut flower production and 30% of output.
  • it is difficult to produce varieties with blue flower color by conventional cross breeding and mutation breeding due to the fact that there are no blue wild flower species among the related species that can be crossed. It was. The creation of a completely new blue-based flower color will stimulate new demand accompanying the expansion of the use of flowers, leading to an increase in production and consumption. Therefore, flowers with blue flower color have been created by genetic engineering techniques and are now commercially available in carnations and roses.
  • F3′5′H is known as a gene to be introduced in flower color modification aimed at flower blueening (Patent Document 1).
  • the flower color can be altered in the blue direction by converting the anthocyanins of the petals into a delphinidin type (Fig. 1).
  • Kiku when CamF3'5'H (Non-patent document 1, Patent document 2) is introduced, it can be modified to purple (RHS color chart Violet group 83) or blue violet (Violet group 88) with a hue angle of about 315 °.
  • Patent Document 3 Non-Patent Document 2.
  • Patent Document 1 It is also known that chrysanthemum obtained by expression of pansy F3′5′H (Patent Document 1) and suppression of endogenous F3′H becomes purple (Purple-Violet group N82) or blue-violet (Violet group 84).
  • Patent Document 4 Non-Patent Document 3
  • A3'5'OMT (Patent Document 5) and CamF3'5'H are co-expressed to synthesize and accumulate malvidin-type anthocyanins, a hue angle of 305 ° to 315 ° (blue purple) on the blue side is exhibited. Chrysanthemum is obtained (Non-Patent Document 4).
  • Non-patent document 5 rose (patent document 6, non-patent document 6), lily (patent document 7), dahlia (non-patent document 7), moth orchid (patent document 8, patent document 9) are similarly purple and It has been reported that transformants with blue-violet flowers can be produced.
  • Patent Document 10 Patent Document 11
  • Patent Document 12 patent document 13, patent document 14, non-patent document 9
  • synthesis of anthocyanin and co-pigment causing intermolecular association Patent document 15, patent document 16, patent document 17
  • Patent Literature 18 genes responsible for adjustment of intracellular pH
  • Patent Literature 20 Non-Patent Literature 10
  • synthesis of metal complex-constituting flavones Patent Literature 21
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a transformed chrysanthemum plant having a blue flower color, or a self-propagating or other breeding progeny thereof, or a vegetative propagation body thereof, a part of the plant body, a tissue, or a cell. It is.
  • anthocyanin 3 ′, 5′-O-glucosyltransferase gene (CtA3′5′GT) derived from a pea and a flavonoid 3 derived from a campanula
  • CtA3′5′GT an anthocyanin 3 ′, 5′-O-glucosyltransferase gene
  • the present invention is as follows. [1] The following (1-a) to (1-e): (1-a) a polynucleotide comprising the base sequence of SEQ ID NO: 1; (1-b) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, wherein sugars are present at the 3'-position and 5'-position hydroxyl groups of anthocyanins.
  • a polynucleotide encoding a protein having activity to transfer (1-c) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; (1-d) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted, and / or added, and at the 3′-position and 5′-position of anthocyanin
  • a polynucleotide encoding a protein having an activity of transferring a sugar to a hydroxyl group and (1-e) an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and an anthocyanin 3
  • a transformed chrysanthemum plant comprising the expression cassette according to any one of [1] to [4], or a self-propagating or cross-bred progeny thereof, or a vegetative propagation body thereof, a part of the plant body, a tissue, or cell.
  • a method for producing a transformed chrysanthemum plant having a blue flower color The following (1-a) to (1-e) are applied to the host: (1-a) a polynucleotide comprising the base sequence of SEQ ID NO: 1; (1-b) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, wherein sugars are present at the 3'-position and 5'-position hydroxyl groups of anthocyanins.
  • a polynucleotide encoding a protein having activity to transfer (1-c) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; (1-d) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted, and / or added, and at the 3 ′ and 5 ′ positions of anthocyanin
  • a polynucleotide encoding a protein having an activity of transferring a sugar to a hydroxyl group and (1-e) an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and an anthocyanin 3
  • the above blue floral color is 230 or 290 ° in hue angle of the Blue group or Violet-Blue group and / or CIEL * a * b * color system in the RHS color chart.
  • the method of. [13] A transformed chrysanthemum plant produced by the method according to any one of [10] to [12], or a self-propagating or other progeny thereof, or a vegetative propagation body thereof, a part of the plant body, a tissue, Or cell. [14] The transformed chrysanthemum plant according to [13] or a cut flower of a self-bred or other progeny thereof, or a processed product made from the cut flower.
  • the newly synthesized major anthocyanins were delphinidin 3- (6 ′′ -malonyl) glucoside-3′5′-diglucoside.
  • trace anthocyanins are delphinidin 3,3 ', 5'-triglucoside (preternatin C5), delphinidin 3- (3 ", 6" -dimalonyl) glucoside-3'5'-diglucoside, delphinidin 3 -(6 ′′ -malonyl) glucoside-3′-glucoside, cyanidin 3- (6 ′′ -malonyl) glucoside-3′-glucoside, which is polyacylated with an aromatic organic acid that develops blue color by intramolecular association. No anthocyanins were detected.
  • blue flower color traits can be imparted to chrysanthemum only by hydroxylating and glycosylating the 3 ′ and 5 ′ positions of anthocyanins.
  • the present invention is based on a blue expression control technique that is completely different from conventional theories and techniques that do not require polyacylation with an aromatic acyl group that has been required for blue expression.
  • FIG. 4 shows polyacylation of anthocyanins with aromatic organic acids that cause intramolecular association (example of peanut ternatin biosynthesis).
  • the HPLC-MS analysis result of the main anthocyanins contained in a blue chrysanthemum petal is shown.
  • the chemical structure and LC-MS / MS analysis results of major anthocyanins contained in blue chrysanthemum petals are shown.
  • the present invention provides the following (1-a) to (1-e): (1-a) a polynucleotide comprising the base sequence of SEQ ID NO: 1; (1-b) a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, wherein sugars are present at the 3'-position and 5'-position hydroxyl groups of anthocyanins.
  • a polynucleotide encoding a protein having activity to transfer (1-c) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; (1-d) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted, and / or added, and at the 3 ′ and 5 ′ positions of anthocyanin
  • a polynucleotide encoding a protein having an activity of transferring a sugar to a hydroxyl group and (1-e) an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and an anthocyanin 3
  • polynucleotide means DNA or RNA, and in the expression cassette of the present invention, the first polynucleotide is an anthocyanin 3 ′, 5′-O-glucosyltransferase derived from a pea.
  • encode means that the protein of interest is expressed in a state having the activity.
  • encode includes both the meaning of encoding the protein of interest as a continuous structural sequence (exon) or encoding via an intervening sequence (intron).
  • Anthocyanin 3 ', 5'-O-glucosyltransferase is an enzyme that catalyzes the sequential transfer of sugars to the 3' and 5 'hydroxyl groups of anthocyanin, and is found in the blue petals of sturgeon Yes.
  • the pea petals appear to have a blue color due to the accumulation of polyacylated delphinidin modified by aromatic acyl groups in which both the 3 'and 5' positions of anthocyanin hydroxyl groups are glycosylated. It has been.
  • Flavonoid 3 ', 5'-hydroxylase is an enzyme that hydroxylates the 3' and 5 'positions of flavonoids and has been found in campanula blue petals and the like.
  • stringent conditions refers to conditions that enable selective and detectable specific binding between a polynucleotide or oligonucleotide and genomic DNA.
  • Stringent conditions are defined by a suitable combination of salt concentration, organic solvent (eg, formamide), temperature, and other known conditions. That is, stringency increases depending on whether the salt concentration is decreased, the organic solvent concentration is increased, or the hybridization temperature is increased.
  • washing conditions after hybridization also affect stringency. This wash condition is also defined by salt concentration and temperature, and the stringency of the wash increases with decreasing salt concentration and increasing temperature.
  • the term “stringent conditions” means that the degree of “identity” between each base sequence is, for example, about 80% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more on the average on the whole. Further, it means a condition that specifically hybridizes only between nucleotide sequences having high identity, such as 97% or more, most preferably 98% or more.
  • Examples of the “stringent conditions” include conditions where the sodium concentration is 150 to 900 mM, preferably 600 to 900 mM, pH 6 to 8 at a temperature of 60 ° C.
  • Hybridization may be performed by a method known in the art, such as the method described in Current Protocols in Molecular Biology (edited by Frederick M, Ausubel et al, 1987), or the like. It can carry out according to the method according to it. Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in an attached instruction manual.
  • the gene selected by such hybridization may be naturally derived, for example, a plant-derived gene or a non-plant-derived gene.
  • the gene selected by hybridization may be cDNA, genomic DNA, or chemically synthesized DNA.
  • amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added is, for example, 1 to 20, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 Means an amino acid sequence wherein a certain number of amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added.
  • Site-directed mutagenesis which is one of genetic engineering techniques, is useful because it can introduce a specific mutation at a specific position. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory It can be performed according to the method described in Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, etc.
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted, and / or added can be obtained.
  • the polynucleotide is a nucleic acid using a primer designed based on the nucleotide sequence of the target gene using a method known to those skilled in the art, for example, a chemical synthesis method such as the phosphoramidide method, a plant nucleic acid sample as a template. It can be obtained by an amplification method or the like.
  • the term “identity” refers to each amino acid residue constituting the chain between two chains in a polypeptide sequence (or amino acid sequence) or a polynucleotide sequence (or base sequence). Or the amount (number) of each base that can be determined to be the same in each other's fitness, meaning the degree of sequence correlation between two polypeptide sequences or two polynucleotide sequences “Identity” can be easily calculated. Many methods are known for measuring identity between two polynucleotide or polypeptide sequences, and the term “identity” is well known to those skilled in the art (eg, Lesk, A. M. (Ed. ), Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988); Smith, D. W.
  • the numerical value of “identity” described in the present specification may be a numerical value calculated using an identity search program known to those skilled in the art, unless otherwise specified. It is a numerical value calculated using the ClustalW program of the application (version 9.5 Oxford Molecular Ltd., Oxford, England).
  • the degree of “identity” between amino acid sequences is, for example, about 80% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more, more preferably about 97% or more, and most preferably About 98% or more.
  • a gene having a natural base sequence can be obtained, for example, by analysis using a DNA sequencer.
  • a polynucleotide encoding an enzyme having a modified amino acid sequence can be synthesized using a conventional site-directed mutagenesis or PCR method based on a polynucleotide having a native base sequence.
  • a polynucleotide fragment to be modified is obtained by restriction enzyme treatment of native cDNA or genomic DNA, and this is used as a template, and site-directed mutagenesis or PCR is performed using a primer into which a desired mutation has been introduced.
  • the polynucleotide fragment into which this mutation has been introduced may be ligated with a DNA fragment encoding another part of the target enzyme.
  • a polynucleotide encoding an enzyme consisting of a shortened amino acid sequence for example, an amino acid sequence longer than the target amino acid sequence
  • a polynucleotide encoding a full-length amino acid sequence is cleaved with a desired restriction enzyme, If the resulting polynucleotide fragment does not encode the entire target amino acid sequence, a DNA fragment consisting of the missing portion sequence may be synthesized and ligated.
  • the obtained polynucleotide encodes a protein having a desired activity by expressing the obtained polynucleotide using a gene expression system in Escherichia coli and yeast and measuring the enzyme activity.
  • a protein having a desired activity which is a polynucleotide product, can be obtained by expressing the polynucleotide.
  • an antibody against a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is used, a protein having an activity of transferring a sugar to the hydroxyl groups at the 3′-position and the 5′-position of anthocyanin can be obtained.
  • a polynucleotide encoding a protein having an activity of transferring a sugar to the 3′-position and the 5′-position hydroxyl group of anthocyanins derived from other organisms can be obtained using an antibody against the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • a polynucleotide encoding a protein having an activity of hydroxylating the 3′-position and the 5′-position of flavonoids derived from other organisms can be cloned.
  • the “expression cassette” means a polynucleotide fragment in which a promoter and a terminator are arbitrarily linked to a polynucleotide.
  • the expression cassette of the present invention comprises a first polynucleotide encoding an anthocyanin 3 ′, 5′-O-glucosyltransferase or an analog thereof derived from sturgeon, and a flavonoid 3 ′, 5′-hydroxylase derived from campanula
  • Each of the second polynucleotide encoding the analog is operably linked to a first promoter and / or a first terminator, and a second polynucleotide operably linked to the second polynucleotide.
  • a promoter and / or a second terminator can further be included.
  • the promoter and terminator used in the expression cassette of the present invention are an anthocyanin 3 ′, 5′-O-glucosyltransferase gene (CtA3′5′GT) and a campanula-derived flavonoid 3 ′, 5′-hydroxylase gene.
  • the first promoter is preferably chrysanthemum F3H promoter, particularly chrysanthemum F3H1k and chrysanthemum F3H500, and the first promoter is not particularly limited as long as (CamF3′5′H) can be co-expressed in chrysanthemum petals.
  • the terminator is preferably an Arabidopsis HSP terminator or an Agrobacterium nos terminator
  • the second promoter is preferably a chrysanthemum F3H promoter
  • the second terminator is preferably an Arabidopsis HSP terminator or an Agrobacterium nos. It is a terminator.
  • the present invention also relates to a (recombinant) vector comprising the above expression cassette, in particular an expression vector, and a chrysanthemum plant transformed with the vector.
  • the present invention relates to the first polynucleotide encoding a protein having an activity of transferring a sugar to the 3′-position and 5′-position hydroxyl group of anthocyanin and / or 3′-position and 5′-position of flavonoid.
  • a transformed chrysanthemum plant obtained by introducing the second polynucleotide encoding a protein having an oxidative activity into the host as an exogenous polynucleotide, or a self-bred or cross-bred progeny thereof, or a vegetative propagation body thereof, It relates to a part of a plant body, a tissue, or a cell.
  • the introduction of the polynucleotide can be achieved by transforming the host with the expression cassette or vector of the present invention.
  • the anthocyanin 3 ', 5'-O-glucosyltransferase gene (CtA3'5'GT) or campanula flavonoid 3', 5'-hydroxylase gene (CamF3'5'H) When either one is expressed, only one of the first polynucleotide and the second polynucleotide needs to be introduced into the host.
  • the term “Asteraceae plant” means a plant of the Chrysanthemum family of the Asteraceae family.
  • the chrysanthemum (Chrysanthemum), commonly referred to as wild chrysanthemum, chrysanthemum japonense (C. Japonense), Datura wild chrysanthemum (C. zawadskii var. Latilobum), high striped Kangiku (C. indicum var. Procumbens), Iwagiku (C. zawadskii), chrysanthemum pacificum ( C. pacificum ).
  • the type of chrysanthemum plant used as a host in the present invention is not particularly limited, and various chrysanthemum varieties and lines selected and bred for different purposes such as spray chrysanthemum, ring chrysanthemum, pot mum, anemone bloom, and decora bloom
  • various chrysanthemum varieties and lines selected and bred for different purposes such as spray chrysanthemum, ring chrysanthemum, pot mum, anemone bloom, and decora bloom
  • a variety of chrysanthemum varieties and lines with different flower shapes such as blooming pom-poms and daisy-blooming (single-blooming) can be used.
  • the major anthocyanins of the chrysanthemum plants showing the flower color of Red group, Red-Purple group and Purple group used as hosts are cyanidin 3- (6 ′′ -malonyl) glucoside and cyanidin 3- (3 ′′, 6 ′′ -dimalonyl) ) Glucosides.
  • the major anthocyanin of transformed chrysanthemum obtained by introducing and functioning the F3′5′H gene such as campanula is delphinidin 3- (6 ′′ -malonyl) glucoside, and a trace amount of delphinidin 3- (3 ′′, 6 "-dimalonyl) glucoside is also included.
  • the maximum absorption wavelength of cyanidin 3- (6 ''-malonyl) glucoside and cyanidin 3- (3 '', 6 ''-dimalonyl) glucoside is 518 nm
  • delphinidin 3- (6 ''-malonyl) For glucoside it is 527 nm. Due to this shift toward the long wavelength side, the transformed chrysanthemum mainly containing delphinidin 3- (6 ′′ -malonyl) glucoside is purple or blue-purple.
  • blue chrysanthemum produced by expressing chumilla A3'5'GT gene in chrysanthemum petal together with campanula F3'5'H gene is delphinidin 3- (6 ''-malonyl) glucoside-3 ', Delphinidin 3,3 ', 5'-triglucoside (Preternatin C5), delphinidin 3- (3 ", 6"-) containing 5'-diglucoside (Ternatine C5) and demaronyl form of Ternatine C5 as a trace pigment Found to contain dimalonyl) glucoside-3'5'-diglucoside, delphinidin 3- (6 ''-malonyl) glucoside-3'-glucoside, and cyanidin 3- (6 ''-malonyl) glucoside-3'-glucoside did.
  • Delphinidin 3- (6 ′ ′-malonyl) glucoside-3 ′, 5′-diglucoside (Ternatine C5), the main anthocyanin of blue chrysanthemum, has a maximum visible absorption wavelength of 512 nm, and has the original red or pink color. It was shifted to shorter wavelengths than cyanidin 3- (6 ′′ -malonyl) glucoside, an anthocyanin. This means that delphinidin 3- (6 ′′ -malonyl) glucoside-3 ′, 5′-diglucoside (Ternatine C5) has a red petal color even though it is more red than the original pigment To do.
  • the petals appear blue due to the interaction of delphinidin 3- (6 ′′ -malonyl) glucoside-3 ′, 5′-diglucoside (Ternatine C5) and chrysanthemum endogenous pigment.
  • delphinidin 3- (6 ′′ -malonyl) glucoside-3 ′, 5′-diglucoside (Ternatine C5)
  • chrysanthemum endogenous pigment The red color in which both the 3 'and 5' hydroxyl groups of anthocyanin B ring, such as delphinidin 3- (6 "-malonyl) glucoside-3 ', 5'-diglucoside (Ternatine C5) are glycosylated
  • anthocyanins exhibiting blue expression have been reported so far, and the present invention is a blue expression that is completely different from conventional theories and techniques that do not require polyacylation with an aromatic acyl group that has been required for blue expression. It is based on control technology.
  • the present invention also relates to the transformed chrysanthemum plant obtained above or a cut flower of its own or other breeding progeny, or a processed product produced from the cut flower (particularly a processed cut flower product).
  • the cut flower processed product includes, but is not limited to, a pressed flower using the cut flower, a preserved flower, a dried flower, a resin sealed product, and the like.
  • HANS-F3Hpro1k-Fd (5′-CCAAGCTTGGCGCGCCGCGGCCGCATTTAAAT TTACAAAACCATGTGCAAGAATG -3 ′; underlined F3H SEQ ID NO: 5) and SNM-F3Hpro-Rv (5′-ACTAGTGCTAGCACGCGT TTTTTATTTTTTCTTCACACACTTG -3 ′; the underlined sequence anneals to DNA containing the F3H promoter region; SEQ ID NO: 5 By PCR using 6) as a primer, a DNA fragment containing the CmF3H promoter 1k with HindIII, AscI, NotI, SwaI restriction enzyme sites on the 5 'side and SpeI, NheI restriction enzyme sites on the 3' side was amplified, and pGEM TA cloning into -T easy (Progemga) followed by digestion with HindIII and SpeI gave
  • SSS-NOSter-Fd (5′-GAGCTCACTAGTGTCGAC GATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAG -3 ′; the underlined portion is a sequence that anneals to DNA containing the NOS terminator region; SEQ ID NO: 7) and ESP-NOSter-Rv (5′- CGAATTCAGGCCTGTTTAAAC GATCTAGTAACATAGATGACAC -3 ′; the underlined portion is a sequence that anneals with DNA containing the NOS terminator region; SacI, EcoICRI (Ecl136II), SpeI, SalI restriction enzymes on the 5 ′ side by PCR using SEQ ID NO: 8) as a primer A DNA fragment containing the Agrobacterium nos terminator with PmeI, SrfI, and EcoRI restriction enzyme sites added on the 3 ′ side was amplified and TA-cloned into pCR2.1 (Invitrogen), then digested with SacI
  • a DNA fragment containing the bacterial nos terminator was obtained. After replacing the DNA fragment of the CmF3H promoter 1k and the NOS terminator with the restriction enzyme site added to the HindIII-XbaI region containing the CaMV 35S promoter of pBI221 and the SacI-EcoRI region containing the NOS terminator, HindIII and EcoRI
  • the HANS-CmF3Hp1k: GUS: NOSt-PSE cassette obtained by digestion and the plasmid fragment obtained by digesting pSPORT2 (Invitrogen) with HindIII and EcoRI are ligated continuously to the binary vector.
  • pMCE5 an entry vector.
  • the restriction enzyme site on the promoter 5 ′ side of the entry vector pMCE5 for continuous ligation of the gene expression cassette to the binary vector is modified to HindIII, FseI, AscI, StuI, SwaI, and the terminator is changed from Agrobacterium nos terminator to Arabidopsis.
  • pMCE5-2 was prepared by replacing the heat shock proteins (HSP) 18.2 terminator (AtHSPter, Plant Cell Physiol. 51 (2): 328-332 (2010); SEQ ID NO: 37).
  • HSP heat shock proteins 18.2 terminator
  • hFAStSw-proCmF3H-Fd (5′-AAGCTTGGCCGGCCTAGGCGCGCCAGGCCTATTTAAAT TTACAAAACCATGTGCAAGAATG -3 ′; the underlined sequence is annealed to the F3H promoter region DNA; '-ACTAGTGCTAGCACGCGT TTTTTATTTTTTCTTCACACACTTG -3'; the underlined part is a sequence that anneals to the DNA of the F3H promoter region; a DNA fragment amplified by PCR using SEQ ID NO: 6) as a primer is cloned into pCR-BluntII-TOPO (Life Technologies) PCR-FASS-CmF3Hpro1k was obtained.
  • SSS-terHSP-Fd 5' -GAGCTCACTAGTGTCGAC ATATGAAGATGAAGATGAAAT -3 '; underlined is the DNA sequence that anneals with AtHSPter; SEQ ID NO: 10) and KESP-terHSP-Rv (5'- GGTACCGGTCCGGAATTCGTTTAAACGCCCGGGC CTTATCTTTAATCATATTCCATAGTCC -3 '; underlined DNA sequence that anneals with AtHSPter; DNA fragment amplified by PCR using SEQ ID NO: 11) as a primer was cloned into pCR-BluntII-TOPO (Life Technologies) and pCR-SSS-AtHSPter -I got PSEK.
  • the DNA fragment of AtHSPter obtained by digesting this plasmid with KpnI and SacI was ligated with the vector DNA fragment obtained by digesting pMCE5-FASS with SacI and KpnI
  • pB423 (pBCtA3 ′ 5′GT + CamF3′5′H) was obtained.
  • PB423 which expresses this CamF3′5′H with chrysanthemum F3H promoter and Arabidopsis HSP terminator, and expresses sturgeon A3′5′GT with chrysanthemum F3H promoter, is the simplest gene transfer construct, with a high rate of 48%. I got a blue chrysanthemum. Moreover, by using the Arabidopsis HSP as the terminator of the campanula-derived F3′5′H gene, blue chrysanthemum was produced at a higher rate than when the Agrobacterium nos terminator was used (Examples 4 and 12-18). .
  • Anthocyanins contained in chrysanthemum cultivar “Ohira” with blue character were analyzed by liquid chromatography / mass spectrum (ACQUITY UPLC / tandem quadrupole MS ACQUITY TQD, Nihon Waters). Distilled water containing 1% formic acid was used as solvent A, and acetonitrile containing 1% formic acid was used as solvent B. Gradient elution with a solvent flow rate of 0.1 ml / min, solvent B from 0 to 5% in 0-5 minutes, 5 to 35% in 5-20 minutes, and then maintained at 35% for 20-25 minutes It was.
  • peak 1 is delphinidin 3,3 ', 5'-triglucoside (preternatin) C5)
  • peak 2 is delphinidin 3- (6 "-malonyl) glucoside-3 ', 5'-diglucoside (Ternatine C5)
  • peak 3 is cyanidin 3- (6" -malonyl) glucoside-3'-glucoside Yes, it was modified to the target anthocyanin structure by the expression of introduced campanula F3'5'H and butterfly A3'5'GT.
  • delphinidin 3- (6 ′ ′-malonyl) glucoside-3 ′, 5′-diglucoside (Ternatine C5) and delphinidin 3,3 ′, 5′-triglucoside (Preternatin C5)
  • a blue color was developed.
  • Delphinidin 3- (6 "-malonyl) glucoside-3 ', 5'-diglucoside (Ternatin C5), Delphinidin 3,3', 5'-triglucoside (Preternatin C5), Cyanidine 3- (6" -malonyl) Accumulation of newly synthesized anthocyanins such as glucoside-3'-glucoside was also detected by thin layer chromatography (TLC).
  • Example 3 Introduction of pB423 into chrysanthemum line “T37” (Chrysanthemum A3′5′GT gene under chrysanthemum F3H promoter 1k and Agrobacterium nos terminator control, chrysanthemum F3H promoter 1k and Arabidopsis HSP terminator under control) Campanula F3′5′H gene co-expression)] [1] Construction of vector According to Example 1, pB423 (pBCtA3′5′GT + CamF3′5′H) was prepared.
  • delphinidin 3- (6 ′′ -malonyl) glucoside-3 ′, 5′-diglucoside (ternatine C5) and delphinidin 3,3 ′, 5′-triglucoside (preternatin C5) Confirmed the accumulation.
  • Their flower color has been changed to the Violet-Blue group.
  • “T37” gave blue chrysanthemum at a high rate of 60%.
  • Table 3 shows the colorimetric values of the transformants in which the modification of the flower color in the blue direction was confirmed.
  • a DNA fragment obtained by digesting pBSII-ADH-CtA3'5'GT obtained in Reference Example 1 with NheI and EcoICRI, and a vector obtained by digesting pMCE5-2 (FASS-CmF3Hp-AtHSPt) with NheI and EcoICRI The fragments of pMCE5-2NFADHNF-CtA3′5′GT were obtained.
  • pMCE5-2 ADHNF-CtA3′5′GT ⁇ digested with FseI and PmeI CmF3Hp1k ADHNF-CtA3′5′GT: AtHSPt cassette, pB315 digested with FseI and SwaI and a binary vector DNA fragment By ligating, pB425 (pBCam2 + CtA3′5′GT) was obtained.
  • the major anthocyanins are delphinidin 3- (6 ′ ′-malonyl) glucoside-3 ′, 5′-diglucoside (ternatine C5) and delphinidin 3,3 ′, 5′-triglucoside (preternatine C5). ) was confirmed.
  • blue chrysanthemum can be produced by expressing two genes, the A3′5′GT gene derived from butterfly and the F3′5′H gene derived from campanula.
  • Table 4 below shows the colorimetric values of the transformants in which the modification of the flower color in the blue direction was confirmed.
  • a DNA fragment directly linked to the start codon was amplified and cloned into pCR-bluntII-TOPO to obtain pCR-ADHNF-IhDFR-5 ′.
  • a pUC El2-35Sp: ADHNF-IrisDFR: D8t was obtained by ligating a DNA fragment obtained by digesting this plasmid with SalI and EcoRV and a plasmid DNA fragment obtained by digesting pSPB909 with SalI and EcoRV.
  • the underlined portion is a sequence that anneals with DbDFR; SEQ ID NO: 16) and a DNA fragment amplified by PCR using DbDFR_NcoI_Rv (5′-CCATGGTGTACTTATAGTTGAATCC-3 ′; SEQ ID NO: 17) as primers, and pBI221 ADH-221 as a template XbaI-ADH-Fd (5′-ACGCGTTCTAGA GTCTATTTAACTCAGTATTC -3 ′; the underlined portion is an annealed sequence with NtADH-5′UTR 94bp; SEQ ID NO: 14) and DbDFR_ORF_ADH_Rv (5′-TTCTACAGTCAT TTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC- 3 ′; A sequence that anneals with NtADH-5′UTR 94
  • This blunt-end amplification product was subjected to a reaction to add dA, and then TA-cloned into pCR2.1 (Invitrogen) to obtain pCR-ADHNF-DbDFR-5 ′.
  • a fragment obtained by digesting this plasmid with SmaI and NcoI and a DNA fragment of a plasmid obtained by digesting pDbDFR4-8 with SmaI and NcoI were ligated to obtain pBS-ADHNF-DbDFR.
  • AB185901 containing the DFR gene derived from petals of Clitoria ternatea ' Double Blue ' A DNA fragment amplified by PCR using SEQ ID NO: 19) and CtDFR_SphI_Rv (5′-GCATGCTCTCATTATGTCAAG-3 ′; SEQ ID NO: 20) as primers, and XbaI-ADH using pBI221 ADH-221 as a template.
  • a DNA fragment was obtained in which -5′UTR 94 bp was directly linked to the start codon of the peanut DFR gene.
  • TA cloning into pCR2.1 yielded pCR-ADHNF-CtDFR-5 ′.
  • a fragment obtained by digesting this plasmid with XbaI and SphI and a DNA fragment of a plasmid obtained by digesting pBSCtDFR20 with XbaI and SphI were ligated to obtain pBS-ADHNF-CtDFR.
  • CmF3'H_3'-Fd for dsRNA (5'-CACCCCGAACTCATTCGTCATCCAC-3 '; SEQ ID NO: 24) and CmF3'H_3'-Rv for dsRNA (5'-TCAATCCATACGCTTCTTCCATG-3'; SEQ ID NO: 25)
  • a DNA fragment (SEQ ID NO: 38) that triggers RNAi amplified by PCR used as a primer was ligated to pENTR-D / TOPO (Invitrogn) to obtain pENTR-CmF3′HC.
  • pENTR-CmF3′HC and pANDA35K were subjected to LR reaction to obtain pANDA-CmF3′HC IR.
  • pB332 (pBF3′H-Ci + CamF3′5′H) obtained by digesting a binary vector DNA fragment obtained by digesting with FseI and SwaI and pMCE5-2 ADHNF-CtA3′5′GT with FseI and PmeI CmF3Hp1k: ADHNF-CtA3′5′GT: AtHSPt cassette was ligated to obtain pB428 (pBF3′H-Ci + CamF3′5′H + CtA3′5′GT).
  • a color spectrometer CD100, Yokogawa Instruments
  • the RHS color chart changes in flower color in the blue direction were confirmed in 6 lines (60%), and 3 lines (30% of the total).
  • Example 9 Introduction of pB428 into chrysanthemum line “T27” (control of chrysanthemum F3H promoter 1k and Agrobacterium nos terminator suppresses chrysanthemum endogenous F3′H gene and chrysanthemum F3H promoter 1k and Arabidopsis HSP terminator control) Under the co-expression of campanula F3′5′H gene and butterfly A3′5′GT gene)] [1] Construction of vector According to Example 8, pB428 (pBF3′H-Ci + CamF3′5′H + CtA3′5′GT) was prepared.
  • the main anthocyanins are delphinidin 3- (6-malonyl) glucoside 3 ', 5'-diglucoside (ternatine C5) and delphinidin 3,3', 5'-triglucoside (preternatine C5 ) Was confirmed (FIG. 5).
  • the flower color of these lines has been changed to the Violet-Blue group.
  • Arabidopsis HSP as the terminator of the campanula-derived F3′5′H gene, blue chrysanthemum was produced at a higher rate than when Agrobacterium nos terminator was used (Examples 4 and 12-18).
  • Table 10 shows the colorimetric values of the transformants in which the modification of the flower color in the blue direction was confirmed.
  • the major anthocyanins are delphinidin 3- (6 ′ ′-malonyl) glucoside-3 ′, 5′-diglucoside (ternatine C5) and delphinidin 3,3 ′, 5′-triglucoside (preternatine C5). ) was confirmed.
  • Table 12 below shows the colorimetric values of the transformants in which the flower color modification in the blue direction was confirmed.
  • the major anthocyanins are delphinidin 3- (6 ′ ′-malonyl) glucoside-3 ′, 5′-diglucoside (ternatine C5) and delphinidin 3,3 ′, 5′-triglucoside (preternatine C5). ) was confirmed.
  • Table 13 below shows the colorimetric values of the transformants in which the flower color modification in the blue direction was confirmed.
  • the major anthocyanins are delphinidin 3- (6 ′ ′-malonyl) glucoside-3 ′, 5′-diglucoside (ternatine C5) and delphinidin 3,3 ′, 5′-triglucoside (preternatine C5). ) was confirmed.
  • Table 17 below shows the colorimetric values of the transformants in which the flower color modification in the blue direction was confirmed.
  • Example 21 Introduction of pB423 into chrysanthemum strain “T10” (Chrysanthemum A3′5′GT gene under chrysanthemum F3H promoter 1k and Agrobacterium nos terminator control, chrysanthemum F3H promoter 1k and Arabidopsis HSP terminator under control) Campanula F3′5′H gene co-expression)] [1] Construction of vector According to Example 1, pB423 (pBCtA3′5′GT + CamF3′5′H) was prepared.
  • Example 22 Introduction of pB423 into chrysanthemum line “T24” (Chrysanthemum A3′5′GT gene under chrysanthemum F3H promoter 1k and Agrobacterium nos terminator control, chrysanthemum F3H promoter 1k and Arabidopsis HSP terminator under control) Campanula F3′5′H gene co-expression)] [1] Construction of vector According to Example 1, pB423 (pBCtA3′5′GT + CamF3′5′H) was prepared.
  • Example 23 Introduction of pB423 into chrysanthemum strain “T27” (Chrysanthemum A3′5′GT gene under chrysanthemum F3H promoter 1k and Agrobacterium nos terminator control, chrysanthemum F3H promoter 1k and Arabidopsis HSP terminator under control) Campanula F3′5′H gene co-expression)] [1] Construction of vector According to Example 1, pB423 (pBCtA3′5′GT + CamF3′5′H) was prepared.
  • Example 24 Introduction of pB423 into chrysanthemum strain “T44” (Chrysanthemum A3′5′GT gene under chrysanthemum F3H promoter 1k and Agrobacterium nos terminator control, chrysanthemum F3H promoter 1k and Arabidopsis HSP terminator under control) Campanula F3′5′H gene co-expression)] [1] Construction of vector According to Example 1, pB423 (pBCtA3′5′GT + CamF3′5′H) was prepared.
  • Example 25 Introduction of pB423 into chrysanthemum strain “T57” (Chrysanthemum A3′5′GT gene under chrysanthemum F3H promoter 1k and Agrobacterium nos terminator control, chrysanthemum F3H promoter 1k and Arabidopsis HSP terminator under control) Campanula F3′5′H gene co-expression)] [1] Construction of vector According to Example 1, pB423 (pBCtA3′5′GT + CamF3′5′H) was prepared.
  • a DNA fragment was obtained in which H-5′UTR 94bp was directly linked to the start codon of the peanut A3′5′GT gene. After TA cloning this DNA fragment into pCR2.1, the approximately 600 bp DNA fragment obtained by digesting with XbaI and HindIII, and the vector DNA fragment obtained by digesting pBlueScript II SK (+) with XbaI and HindIII Ligation gave pBSII-ADH-5′-CtBGT1-HindIII.
  • a plasmid DNA fragment obtained by digesting this plasmid with HindIII and XhoI and a DNA fragment obtained by digesting pBSCtBGT1DB24 with HindIII and XhoI were ligated to obtain pBSII-ADH-CtA3′5′GT.
  • NheI-ADH-Fd2 (5′-GCTAGC GTCTATTTAACTCAGTATTCAGAAAC- 3 ′; the underlined portion is a sequence that anneals with NtADH-5′UTR 94bp; SEQ ID NO: 29) and Ct3′5′GT-SacI- A blunt-ended DNA product amplified by PCR using Rv (5′-GAGCTC TTAGCTAGAGGAAATCATTTCCAC -3 ′; the underlined portion is a sequence that anneals with the Ct3′5′GT coding region; SEQ ID NO: 30) is used as a pCR- Cloning in Blunt II-TOPO (Invitrogen) gave pCR ADHNF-CtA3′5′GT.
  • the column was Inertsil ODS-2 (particle size 5 ⁇ m, 4.6 ⁇ 250 mm, GL Science), the flow rate was 0.8 ml / min, the mobile phase contained 1.5% phosphoric acid, 5% acetic acid, 6.25% acetonitrile to 20% acetic acid, After a 20% linear gradient of 25% acetonitrile, isocratic elution was performed for 5 minutes with 25% acetonitrile containing 1.5% phosphoric acid and 20% acetic acid.
  • an Agilent 1100 series diode array detector GL Science was used to detect a wavelength region from 250 nm to 600 nm.
  • ADH-CtHCAGT-Fd (5′-CAAGAAAAATAA ATGGGGTCTGAAGCTTCGTTTC- 3 ′; the underlined portion is a sequence that anneals with the CtAGS gene coding region; SEQ ID NO: 31) and StuI-CtHCAGT DNA fragment amplified by PCR using -Rv (5'-AGGCCTCATGTTCACAAACTTC-3 '; SEQ ID NO: 32) and pBI221 ADH-221 as a template, XbaI-ADH-Fd (5'-ACGCGTTCTAGA GTCTATTTAACTCAGTATTC -3' The underlined portion is the sequence that anneals with NtADH-5′UTR 94bp; SEQ ID NO: 14) and CtHCAGT-ADH-Rv (5′-TTCAGACCCCAT TTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC- 3 ′; the
  • This DNA fragment is TA-cloned into pCR2.1 (Invitrogen) and then digested with XbaI and StuI, and obtained by digesting pBSII-CtGT11-4-14 with XbaI and StuI. Vector fragments were ligated to obtain pBSII-ADH-CtAGS. After blunting the XhoI digestion product of this plasmid, the DNA fragment obtained by digesting with XbaI and the vector fragment obtained by digesting pMCE5 with NheI and EcoICRI were ligated to obtain pMCE5-ADH-AGS .
  • pBSII-CtAT1-19 which is one of the CtSCPL1 cDNA clones described in Japanese Patent No. 4418865 containing the A3'AT gene, which is considered to have 3'AT activity and 5'AT activity (Fig. 2).
  • -CtAT1-Fd (5'-CAAGAAAAATAA ATGGCAGCCTTCAGTTCAAC -3 '; the underlined region anneals to CtAT1; SEQ ID NO: 34) and Pst-CtAT1-Rv (5'-CTGCAGCATCTGTTCTAGCATAA-3'; SEQ ID NO: 35) as primers
  • XbaI-ADH-Fd (5′-ACGCGTTCTAGA GTCTATTTAACTCAGTATTC -3 ′; the underlined portion is a sequence that anneals with NtADH-5′UTR 94bp; DNA amplified by PCR using SEQ ID NO: 14) and CtAT1-ADH-Rv (5'-GAAGGCTGCCAT TTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC -3 '; the underlined portion is a sequence that anneals to NtADH-5'UTR
  • XbaI-ADH-Fd (SEQ ID NO: 14) and Pst-CtAT1-Rv (SEQ ID NO: 35)
  • NtADH-5'UTR 94 bp was amplified a DNA fragment which is directly connected to the start codon of CtAT gene.
  • This DNA fragment was digested with XbaI and PstI and ligated with the DNA fragment obtained by digesting pBSII-CtAT1-19 with SpeI and PstI to obtain pBSII-ADHNF-CtAT1-19.
  • a binary vector DNA fragment obtained by digesting pBI121-CtBGT + AGS with SwaI and AscI and an expression cassette obtained by digesting pMCE5-ADH-CtAT1 with AscI and PmeI (AscI-CmF3Hp1k: NtADH-5′UTR: Ct3′AT: nost-PmeI)
  • Binary DNA vector for ligation of butterfly A3′5′GT, butterfly AGS and butterfly 3′AT under the control of chrysanthemum F3H promoter 1k and Agrobacterium nos terminator pB250 was obtained.
  • Blue chrysanthemum was not obtained by the method of expressing the A3'5'GT gene, acylglucose synthase gene, and A3'AT gene of chrysanthemum with chrysanthemum F3H promoter (FIG. 6).
  • the hue angle of the most bluish line is 315 degrees, and only the lines of Violet group or Purple-Vioret group can be obtained by colorimetry with RHSCC, and the flower color changes when only the F3′5′H gene is expressed. Did not change (Table 30).
  • the hue angle is 230 ° to 290 ° and / or the Violet-Blue group / Blue group Blue chrysanthemum showing the flower color was not obtained.

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Abstract

青系花色を有する形質転換キク植物、又はその自殖もしくは他殖後代、あるいはそれらの栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞を提供する。　チョウマメ由来アントシアニン3',5'-O-グルコシル基転移酵素遺伝子(CtA3'5'GT）及びカンパニュラ由来フラボノイド3',5'-水酸化酵素遺伝子（CamF3'5'H）をキク花弁で共発現させる。

Description

青系花色を有するキクの作出方法
　本発明は、チョウマメ由来アントシアニン3′,5′-O-グルコシル基転移酵素遺伝子(CtA3′5′GT）及びカンパニュラ由来フラボノイド3′,5′-水酸化酵素遺伝子（CamF3′5′H）をキク花弁で共発現させるための発現カセット、該発現カセットを含むベクター及び形質転換キク植物、又はその自殖もしくは他殖後代、あるいはそれらの栄養繁殖体、植物体の一部（特に切り花）もしくはその加工品（特に切り花加工品）、組織又は細胞、ならびに青系花色を有する形質転換キク植物を作製するための方法に関する。
　キク、バラ、カーネーション、ユリ等は世界的に産業上重要な花きである。特にキクは世界の花き産業においてバラに次ぐ市場規模を有し、日本国内では切り花産出量の４割、産出額の３割を占める第１位の花きである。しかしながら、上記主要花きでは、交雑可能な近縁種に青系の花色の野生種が無いなどの問題により、従来の交雑育種や突然変異育種では、青系花色を有する品種の作出は困難であった。全く新しい青系花色の創出は、花きの利用場面の拡大に伴う新たな需要を喚起し、生産や消費の拡大に繋がる。そこで、遺伝子工学的手法により青系花色をもつ花きが作出され、カーネーションとバラでは市販されるに至っている。ただ、これまでの青系花色を目指した花色改変では、紫色（RHSカラーチャート色相グループ：Purpleグループ）や青紫色（Purple-Violetグループ, Violetグループ）が限界であり、紫青色（Violet-Blueグループ）や青色（Blueグループ）の花色をもつ青色の花きは作出されていない。したがって、青色の花きは、リンドウ、デルフィニウムやブルースターなどに現在も限られており、真に青色の花色をもつ花きの作出を可能にするための青色発現制御技術の開発が依然として望まれている。
　花の青色化を目指した花色改変において、導入される遺伝子としてはF3′5′Hが知られている（特許文献１）。F3′5′H単独または、内在性のF3′HやDFRの発現を抑制するコンストラクトと共に導入し，花弁のアントシアニンをデルフィニジン型にすることで青色方向に花色を改変できる（図１）。キクではCamF3′5′H（非特許文献１，特許文献２）を導入すると、色相角315°程度の紫色（RHSカラーチャート Violetグループ 83）または青紫色（Violetグループ 88）に改変されることが知られている（特許文献３，非特許文献２)。また、パンジーF3′5′H（特許文献１）の発現と内在性F3′Hの抑制で得られるキクでは、紫色（Purple-Violetグループ N82）や青紫色（Violetグループ 84）になることが知られている（特許文献４，非特許文献３)。さらに、A3′5′OMT（特許文献５）とCamF3′5′Hを共発現してマルビジン型アントシアニンを合成・蓄積させると、より青色側の色相角305°～315°（青紫色）を示すキクが得られる（非特許文献４）。カーネーション（非特許文献５)、バラ(特許文献６，非特許文献６)、ユリ（特許文献７）、ダリア(非特許文献７）、コチョウラン（特許文献８，特許文献９）でも同様に紫色や青紫色の花を持つ形質転換体を作出できることが報告されている。
　F3′5′H、A3′5′OMT等を用いた従来の青色化技術では、紫色や青紫色の花色を作出できるが、Violet-BlueグループやBlueグループで色相角230°～290°を示す本当に青色の花色をもつ形質転換体は作出できない。また花の様々な青色発現機構が解明され（非特許文献８）、それらに関与する遺伝子として、分子内会合を引き起こす芳香族有機酸によるアントシアニンのポリアシル化（図２）（特許文献１０，特許文献１１，特許文献１２，特許文献１３，特許文献１４，非特許文献９)、分子間会合を引き起こすアントシアニンと補助色素（コピグメント）の合成（特許文献１５，特許文献１６，特許文献１７）、液胞内pHの調整（特許文献１８，特許文献１９）、液胞への金属イオンの輸送（特許文献２０，非特許文献１０）、金属錯体構成フラボンの合成（特許文献２１）等を担う遺伝子も報告されているが、これらを導入した花きの青色化の成功例はない。また、芳香族有機酸によるポリアシル化はアントシアニンの糖残基に起きるが、この糖残基の付与を担うチョウマメ由来アントシアニン3′,5′-O-グルコシル基転移酵素遺伝子(CtA3′5′GT）が報告されている（特許文献２２）。かかる遺伝子をデルフィニジン3-グルコシドを蓄積する藤色のロベリアに導入した結果、青色に花色が変化したことが報告されているが、花弁に蓄積しているアントシアニンの約７０％は、ロベリア内在性の3′－アシル基転移酵素（3′AT）および5′ATの働きにより、3′位,5′位のグルコシル基が芳香族アシル基により修飾されていた。このポリアシル化アントシアニンの蓄積がロベリアの青色への花色改変の要因であることから、CtA3′5′GT導入による青色花の作出には、Ct3′ATなどの芳香族アシル基転移酵素遺伝子を共発現させることの必要性が示されている（非特許文献１１）。事実、キクにCtA3′5′GTだけ導入したとしても、青色化は達成されないことが判明している（参考例１，２）。
　青色発現機構を再現するためには複数の遺伝子を組み合わせて、その全ての遺伝子を機能させる必要があるが、導入する宿主で機能するとは限らないため、青色発現機構の解明やそれを担う遺伝子の報告例だけでは、真に青色の花を作出できるとは言えない。
国際公開第2004/020637号 国際公開第2013/157502号 国際公開第2010/122849号 国際公開第2009/062253号 国際公開第2003/062428号 国際公開第2005/017147号 国際公開第2012/036290号 特許第5285304号公報 国際公開第2008/136434号 特許第4853853号公報 特許第4982782号公報 国際公開第1996/025500号 国際公開第2006/046780号 国際公開第2011/016260号 国際公開第2008/156211号 国際公開第2008/156214号 国際公開第2008/156206号 国際公開第2001/14560号 特許第507282号公報 特許第4958247号公報 国際公開第2012/096307号 特許第4418865号公報
Biosci. Biotechnol. Biochem. (2003) 67:161 Plant Cell Physiol (2013) 54:1684 Plant Cell Physiol (2013) 54:1696 ICP2014:251 Phytochemistry (2003) 63:15 Plant Cell Physiol (2007) 48:1589 農耕と園藝(2012)10月号 p.42，農業技術体系追録第15号330の1の192 Nat Prod Rep (2009) 26:857 Plant Cell Physiol (2015) 56:28 Plos one (2012)7:e43189 日本植物細胞分子生物学会つくば大会・シンポジウム講演要旨集（2006）p.40
　本発明が解決しようとする課題は、青系花色を有する形質転換キク植物、又はその自殖もしくは他殖後代、あるいはそれらの栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞を提供することである。
　本願発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討し、実験を重ねた結果、チョウマメ由来アントシアニン3′,5′-O-グルコシル基転移酵素遺伝子(CtA3′5′GT）及びカンパニュラ由来フラボノイド3′,5′-水酸化酵素遺伝子（CamF3′5′H）をキク花弁で共発現させると、従来得られなかった青系花色（RHSカラーチャート第５版：Violet-Blueグループ／Blueグループかつ／または色相角：230°～290°）を有する形質転換キク植物が得られることを発見し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下の通りである。
[１]　以下の（１－ａ）～（１－ｅ）：
　（１－ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
　（１－ｂ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、アントシアニンの３′位及び５′位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（１－ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（１－ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アントシアニンの３′位及び５′位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
　（１－ｅ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、アントシアニンの３′位及び５′位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選択される第１のポリヌクレオチド、及び
　以下の（２－ａ）～（２－ｅ）：
　（２－ａ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
　（２－ｂ）配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボノイドの３′位及び５′位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（２－ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（２－ｄ）配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボノイドの３′位及び５′位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
　（２－ｅ）配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボノイドの３′位及び５′位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選択される第２のポリヌクレオチドを含む、発現カセット。
[２]　前記第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１のプロモーター及び第１のターミネーター、ならびに前記第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーター及び第２のターミネーターをさらに含む、[１]に記載の発現カセット。
[３]　前記第１のプロモーターがキクF3Hプロモーターであり、そして前記第１のターミネーターがアラビドプシスHSPターミネーター又はアグロバクテリウムnosターミネーターである、[２]に記載の発現カセット。
[４]　前記第２のプロモーターがキクF3Hプロモーターであり、そして前記第２のターミネーターがアラビドプシスHSPターミネーター又はアグロバクテリウムnosターミネーターである、[２]又は[３]に記載の発現カセット。
[５]　[１]～[４]のいずれかに記載の発現カセットを含むベクター。
[６]　[１]～[４]のいずれかに記載の発現カセットを含む形質転換キク植物、又はその自殖もしくは他殖後代、あるいはそれらの栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞。
[７]　花弁においてチョウマメ由来アントシアニン3′,5′-O-グルコシル基転移酵素遺伝子(CtA3′5′GT）及びカンパニュラ由来フラボノイド3′,5′-水酸化酵素遺伝子（CamF3′5′H）が共発現している、[６]に記載の形質転換キク植物、又はその自殖もしくは他殖後代、あるいはそれらの栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞。
[８]　デルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及び／またはデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）を含有する、[６]又は[７]に記載の形質転換キク植物、又はその自殖もしくは他殖後代、あるいはそれらの栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞。
[９]　[６]～[８]に記載の形質転換キク植物又はその自殖もしくは他殖後代の切り花、あるいは該切り花から作成された加工品。
[１０]　青系花色を有する形質転換キク植物を作製するための方法であって、
　宿主に以下の（１－ａ）～（１－ｅ）：
　（１－ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
　（１－ｂ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、アントシアニンの３′位及び５′位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（１－ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（１－ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アントシアニンの３′位及び５′位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
　（１－ｅ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、アントシアニンの３′位及び５′位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選択される第１のポリヌクレオチド、及び／又は
　以下の（２－ａ）～（２－ｅ）：
　（２－ａ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
　（２－ｂ）配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボノイドの３′位及び５′位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（２－ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（２－ｄ）配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボノイドの３′位及び５′位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
　（２－ｅ）配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボノイドの３′位及び５′位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選択される第２のポリヌクレオチドを導入する工程を含む、方法。
[１１]　[１]～[４]のいずれかに記載の発現カセット又は[５]に記載のベクターで宿主を形質転換することによって行われる、［１０］に記載の方法。
[１２]　前記青系花色が、RHSカラーチャートでBlueグループ又はViolet-Blueグループ、かつ／又はCIEL*a*b*表色系の色相角で230°～290°を示す、[１１]に記載の方法。
[１３]　[１０]～[１２]のいずれかに記載の方法によって作成された形質転換キク植物、又はその自殖もしくは他殖後代、あるいはそれらの栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞。
[１４]　[１３]に記載の形質転換キク植物又はその自殖もしくは他殖後代の切り花、あるいは該切り花から作成された加工品。
　本発明により得られた青色花形質をもつキク形質転換体の花弁アントシアニンを分析した結果、新たに合成された主要アントシアニンは、デルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′5′-ジグルコシド（テルナチンC5），微量アントシアニンは、デルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5），デルフィニジン3-(3′′,6′′-ジマロニル)グルコシド-3′5′-ジグルコシド，デルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′-グルコシド，シアニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′-グルコシドであり、分子内会合により青色発現をする芳香族有機酸でポリアシル化されたアントシアニンなどは検出されなかった。すなわち、本発明により、アントシアニン3′位及び5′位を水酸化及び配糖化するだけで、キクに青色の花色形質を付与することができる。本発明は、青色発現に必要とされてきた芳香族アシル基によるポリアシル化を必要としない従来の理論や技術とは全く異なる青色発現制御技術に基づく。
F3′5′H導入によりキク花弁で合成されるデルフィニジン配糖体を示す。 分子内会合を引き起こす芳香族有機酸によるアントシアニンのポリアシル化（チョウマメのテルナチン生合成の例）を示す。 青色キク花弁に含まれる主要アントシアニンのHPLC-MS分析結果を示す。 青色キク花弁に含まれる主要アントシアニンの化学構造とLC-MS/MS分析結果を示す。 CamF3′5′H及びCtA3′5′GTを導入したキク花色の青色化を示す写真、及び青色キク花弁に含まれる主要アントシアニンのHPLC分析結果である。 CtA3′5′GTを導入したキク花色を示す写真である。
　本発明は、以下の（１－ａ）～（１－ｅ）：
　（１－ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
　（１－ｂ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、アントシアニンの３′位及び５′位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（１－ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（１－ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アントシアニンの３′位及び５′位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
　（１－ｅ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、アントシアニンの３′位及び５′位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選択される第１のポリヌクレオチド、及び
　以下の（２－ａ）～（２－ｅ）：
　（２－ａ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
　（２－ｂ）配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボノイドの３′位及び５′位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（２－ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
　（２－ｄ）配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボノイドの３′位及び５′位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
　（２－ｅ）配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボノイドの３′位及び５′位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選択される第２のポリヌクレオチドを含む、発現カセット、に関する。
　本明細書中、用語「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味し、本発明の発現カセットにおいて、第１のポリヌクレオチドは、チョウマメ由来アントシアニン3′,5′-O-グルコシル基転移酵又はその類似体をコードし、そして、第２のポリヌクレオチドは、カンパニュラ由来フラボノイド3′,5′-水酸化酵素又はその類似体をコードする。ここで、「コードする」とは、着目のタンパク質をその活性を備えた状態で発現させるということを意味している。また、「コードする」とは、着目のタンパク質を連続する構造配列（エクソン）としてコードすること、又は介在配列（イントロン）を介してコードすることの両者の意味を含んでいる。
　アントシアニン3′,5′-O-グルコシル基転移酵素は、アントシアニンの3′位及び5′位水酸基に糖を逐次的に転移する反応を触媒する酵素であり、チョウマメの青色花弁から見出されている。チョウマメの花弁は、アントシアニンの水酸基のうち3′位及び5′位がともに配糖化され、さらに芳香族アシル基による修飾を受けたポリアシル化デルフィニジンが蓄積することにより、青色に発色していると考えられている。また、フラボノイド3′,5′-水酸化酵素は、フラボノイドの3′位及び5′位を水酸化する酵素であり、カンパニュラの青色花弁などから見出されている。F3′5′Hが発現した花弁では、デルフィニジン型アントシアニンが多く蓄積し、これにより藤色、紫色、青紫色や青色に発色することが可能になっていると考えられている。しかしながら、キク植物は、アントシアニン3′,5′-O-グルコシル基転移酵素をコードする遺伝子およびフラボノイド3′,5′-水酸化酵素をコードする遺伝子をともに有していない。また、キクは六倍体という高次倍数性を有し、かつゲノムサイズも大きいことから、形質転換効率が低いのに加えて、導入遺伝子のサイレンシング（不活化）が起こることもあり、これらの遺伝子を導入して、安定に発現する遺伝子組換えキクを得ることは容易ではない。さらに、CtA3′5′GT又はCamF3′5′Hのいずれかを導入したとしても、花弁の青色化は生じず、これまでに青系花色を有する形質転換キク植物は知られていない。
　本明細書中、用語「ストリンジェント条件」とは、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドと、ゲノムDNAとの選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、及びその他公知の条件の適当な組み合わせによって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、又はハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシー（stringency）は増加する。さらに、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。したがって、用語「ストリンジェント条件」とは、各塩基配列間の「同一性」の程度が、例えば、全体の平均で約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上であるような、高い同一性を有する塩基配列間のみで、特異的にハイブリダイズするような条件を意味する。「ストリンジェント条件」としては、例えば、温度６０℃～６８℃において、ナトリウム濃度１５０～９００ｍＭ、好ましくは６００～９００ｍＭ、ｐＨ６～８であるような条件を挙げることができ、具体例としては、５×ＳＳＣ（750mM NaCl、75mM クエン酸三ナトリウム）、１％ＳＤＳ、５×デンハルト溶液５０％ホルムアルデヒド、及び４２℃の条件でハイブリダイゼーションを行い、０．１×ＳＳＣ（15mM NaCl、1.5mM クエン酸三ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ、及び５５℃の条件で洗浄を行うものを挙げることができる。
　ハイブリダイゼーションは、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。このようなハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子としては、天然由来のもの、例えば、植物由来のもの、植物由来以外のものであってもよい。また、ハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子はｃＤＮＡであってもよく、ゲノムＤＮＡであっても化学合成したＤＮＡでもよい。
　上記「１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１～２０個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を意味する。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
　また、ポリヌクレオチドは、当業者に公知の方法、例えば、ホスホアミダイド法等により化学的に合成する方法、植物の核酸試料を鋳型とし、目的とする遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計したプライマーを用いる核酸増幅法などによって得ることができる。
　本明細書中、用語「同一性」とは、ポリペプチド配列（又はアミノ酸配列）あるいはポリヌクレオチド配列（又は塩基配列）における２本の鎖の間で該鎖を構成している各アミノ酸残基同志又は各塩基同志の互いの適合関係において同一であると決定できるようなものの量（数）を意味し、二つのポリペプチド配列又は二つのポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意味するものであり、「同一性」は容易に算出できる。二つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列間の同一性を測定する方法は数多く知られており、用語「同一性」は、当業者には周知である（例えば、Lesk, A. M. (Ed.), Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988); Smith, D. W. (Ed.), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Grifin, A. M. & Grifin, H. G. (Ed.), Computer Analysis of Sequence Data: Part I, Human Press, New Jersey, (1994); von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press, New York, (1987); Gribskov, M. & Devereux, J. (Ed.), Sequence Analysis Primer, M-Stockton Press, New York, (1991)等参照）。
　また、本明細書に記載される「同一性」の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の同一性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、好ましくは、MacVectorアプリケーション（バージョン9.5 Oxford Molecular Ltd.,Oxford,England）のClustalWプログラムを用いて算出される数値である。本発明において、各アミノ酸配列間の「同一性」の程度は、例えば、約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、さらに好ましくは約９７％以上、最も好ましくは約９８％以上である。
　生来の塩基配列を有する遺伝子は、例えば、ＤＮＡシークエンサーによる解析によって得られる。また、修飾されたアミノ酸配列を有する酵素をコードするポリヌクレオチドは生来の塩基配列を有するポリヌクレオチドを基礎として、常用の部位特定変異誘発やＰＣＲ法を用いて合成することができる。例えば、修飾したいポリヌクレオチド断片を生来のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡの制限酵素処理によって得て、これを鋳型にして、所望の変異を導入したプライマーを用いて部位特定変異誘発やＰＣＲ法を実施し、所望の修飾したポリヌクレオチド断片を得る。その後、この変異を導入したポリヌクレオチド断片を目的とする酵素の他の部分をコードするＤＮＡ断片と連結すればよい。
　あるいは短縮されたアミノ酸配列からなる酵素をコードするポリヌクレオチドを得るには、例えば、目的とするアミノ酸配列より長いアミノ酸配列、例えば、全長アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを所望の制限酵素により切断し、その結果得られたポリヌクレオチド断片が目的とするアミノ酸配列の全体をコードしていない場合は、不足部分の配列からなるＤＮＡ断片を合成し、連結すればよい。
　また、得られたポリヌクレオチドを大腸菌及び酵母での遺伝子発現系を用いて発現させ、酵素活性を測定することにより、得られたポリヌクレオチドが所望の活性を有するタンパク質をコードすることを確認することができる。さらに、当該ポリヌクレオチドを発現させることにより、ポリヌクレオチド産物である所望の活性を有するタンパク質を得ることができる。あるいは、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに対する抗体を用いても、アントシアニンの３′位及び５′位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質を取得することができ、かかる抗体を用いて他の生物由来のアントシアニンの３′位及び５′位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローン化することもできる。同様に、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに対する抗体を用いても、フラボノイドの３′位及び５′位を水酸化する活性を有するタンパク質を取得することができ、かかる抗体を用いて他の生物由来のフラボノイドの３′位及び５′位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローン化することもできる。
　本明細書中、「発現カセット」は、ポリヌクレオチドにプロモーターとターミネーターが任意に連結したポリヌクレオチド断片を意味する。本発明の発現カセットは、チョウマメ由来アントシアニン3′,5′-O-グルコシル基転移酵又はその類似体をコードする第１のポリヌクレオチド、及びカンパニュラ由来フラボノイド3′,5′-水酸化酵素又はその類似体をコードする第２のポリヌクレオチドに、それぞれ、作動可能に連結された第１のプロモーター及び／又は第１のターミネーター、ならびに、前記第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーター及び／又は第２のターミネーターをさらに含むことができる。
　本発明の発現カセットに用いられるプロモーター及びターミネーターは、チョウマメ由来アントシアニン3′,5′-O-グルコシル基転移酵素遺伝子(CtA3′5′GT）及びカンパニュラ由来フラボノイド3′,5′-水酸化酵素遺伝子（CamF3′5′H）をキク花弁で共発現させることができる限り特に制限されないが、前記第１のプロモーターは、好ましくはキクF3Hプロモーター、特にはキクF3H1k及びキクF3H500であり、前記第１のターミネーターは、好ましくはアラビドプシスHSPターミネーター又はアグロバクテリウムnosターミネーターであり、前記第２のプロモーターは、好ましくはキクF3Hプロモーターであり、そして前記第２のターミネーターは、好ましくはアラビドプシスHSPターミネーター又はアグロバクテリウムnosターミネーターである。
　本発明は、前記発現カセットを含む（組換え）ベクター、特に発現ベクター、さらに該ベクターによって形質転換されたキク植物にも関する。
　さらに、本発明は、アントシアニンの３′位及び５′位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする前記第１のポリヌクレオチド、及び／又はフラボノイドの３′位及び５′位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードする前記第２のポリヌクレオチドを外因性ポリヌクレオチドとして宿主に導入することによって得られる形質転換キク植物、又はその自殖もしくは他殖後代、あるいはそれらの栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞に関する。ポリヌクレオチドの導入は、宿主を本発明の発現カセット又はベクターで形質転換することによって達成できる。あるいは、宿主において、チョウマメ由来アントシアニン3′,5′-O-グルコシル基転移酵素遺伝子(CtA3′5′GT）又はカンパニュラ由来フラボノイド3′,5′-水酸化酵素遺伝子（CamF3′5′H）のいずれかが発現している場合には、前記第１のポリヌクレオチド又は第２のポリヌクレオチドのうち、一方を宿主に導入するだけでよい。
　現在の技術水準の下では、植物にポリヌクレオチドを導入し、そのポリヌクレオチドを構成的又は組織特異的に発現させるために、当業者に公知の方法、例えば、アグロバクテリウム法、バイナリーベクター法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法、パーティクルガン法等によって行なうことができる。
　本明細書中、用語「キク植物（単に「キク」ともいう）」とは、キク科（Asteraceae）のキク属（Chrysanthemum）の植物を意味する。キク属（Chrysanthemum）には、一般に野菊と呼ばれる、ノジギク（C. japonense）、チョウセンノギク（C. zawadskii var. latilobum）、ハイシマカンギク（C. indicum var. procumbens）、イワギク（C. zawadskii）、イソギク（C. pacificum）などがある。そして一般にイエギクや栽培ギクとも呼ばれ、野生種間の交雑などによりスプレイ菊、大菊、小菊などの多様に品種改良された、キク（Chrysanthemum morifolium；旧種小名：Dendranthema grandiflora，Chrysanthemum grandiflorum））がある。本発明において宿主に用いられるキク植物の種類については特に制限されず、スプレイ菊、輪菊，ポットマムなど仕立て用途の違いで選抜・育種された様々なキクの品種・系統や、アネモネ咲き、デコラ咲き、ポンポン咲き，デージー咲き（一重咲き）など花形の違いを有する多様なキクの品種・系統を用いることができる。以下の実施例においても、宿主としてセイショール（S39）,大平, T27，セイアラベラ（T34），T37, カンデラティエラ，T10, T24, T44, T57 といった多様な品種・系統（色相角の平均値：55°程度～0°（360°）～337°程度；RHSカラーチャート：49C-DのRedグループ～Red-Purpleグループ～75B-Cの Purpleグループ）においても、RHSカラーチャート第５版（英国王立園芸協会）でBlueグループもしくはViolet-Blueグループ、又は色彩色差計や色彩分光計などで測定して得られるCIEL*a*b*表色系の色相角で230°～290°の青系花色を示すことが実証されている。
　宿主に用いたRedグループ、Red-Purpleグループ及びPurpleグループの花色を示すキク植物の主要アントシアニンは、シアニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド及びシアニジン3-(3′′,6′′-ジマロニル)グルコシドである。カンパニュラなどのF3′5′H遺伝子を導入し機能させることで得られる形質転換キクの主要アントシアニンは、デルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシドであり、微量のデルフィニジン3-(3′′,6′′-ジマロニル)グルコシドも含まれる。シアニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド及びシアニジン3-(3′′,6′′-ジマロニル)グルコシドの可視吸収極大波長は518nmであるのに対し、デルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシドでは527nmである。この長波長側へのシフトによってデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシドを主要に含む形質転換キクは紫色や青紫色を示す。一方、カンパニュラF3′5′H遺伝子とともにチョウマメA3′5′GT遺伝子をキク花弁で発現させることにより作出された青いキクは、主要色素としてデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）を含み、微量色素としてテルナチンC5の脱マロニル体であるデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）、デルフィニジン3-(3′′,6′′-ジマロニル)グルコシド-3′5′-ジグルコシド、デルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′-グルコシド、そしてシアニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′-グルコシドを含むことが判明した。青いキクの主要アントシアニンであるデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）は、可視吸収極大波長が512nmであり、もとの赤やピンク色の主要アントシアニンであるシアニジン3-(6′′-マロニル)グルコシドよりも短波長側にシフトしていた。これは、デルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）はもとの色素よりも赤いにもかかわらず、キクの花弁を青色にしていることを意味する。したがって、デルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）とキクの内在性のコピグメント物質などが相互作用することなどにより、花弁は青色発現していると考えられるが、デルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）のようなアントシアニンB環の3′位及び5′位水酸基がともに配糖化された赤色アントシアニンが青色発現をする例はこれまで報告されておらず、本発明は、青色発現に必要とされてきた芳香族アシル基によるポリアシル化を必要としない従来の理論や技術とは全く異なる青色発現制御技術に基づくものである。
　さらに、本発明は、上記で得られた形質転換キク植物又はその自殖もしくは他殖後代の切り花、あるいは該切り花から作成された加工品（特に切花加工品）にも関する。ここで、切花加工品としては、当該切花を用いた押し花、プリザードフラワー、ドライフラワー、樹脂密封品などを含むが、これに限定されるものではない。
　以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。
　分子生物学的手法は特に断らない限り、Molecular Cloning (Sambrook and Russell, 2001)に依った。増幅したPCR産物やクローニングにより得られたプラスミドはDNA配列にエラーがないことを塩基配列を確認することにより決定した。
［実施例１：キク品種「大平」へのpB423の導入（キクF3Hプロモーター1kとアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でのチョウマメA3′5′GT遺伝子及びキクF3Hプロモーター1kとアラビドプシスHSPターミネーター制御下でのカンパニュラF3′5′H遺伝子の共発現）］
［１］ベクターの構築
　鋳型にpBluescript SK- gF3H9(菅野ら（2001）園学雑70（別2）193）を用い、HANS-F3Hpro1k-Fd（5′-CCAAGCTTGGCGCGCCGCGGCCGCATTTAAATTTACAAAACCATGTGCAAGAATG-3′；下線部はF3Hプロモーター領域を含むDNAとアニールする配列である；配列番号５）とSNM-F3Hpro-Rv（5′-ACTAGTGCTAGCACGCGTTTTTTATTTTTTCTTCACACACTTG-3′；下線部はF3Hプロモーター領域を含むDNAとアニールする配列である；配列番号６）をプライマーに用いたPCRにより、5′側にHindIII, AscI, NotI, SwaI制限酵素サイト、3′側にSpeI, NheI制限酵素サイトを付加したCmF3Hプロモーター1kを含むDNA断片を増幅し、pGEM-T easy (Progemga）にTAクローニングした後、HindIIIとSpeIで消化してDNA断片を得た。
　pBI221を鋳型に、SSS-NOSter-Fd（5′-GAGCTCACTAGTGTCGACGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAG-3′；下線部はNOSターミネーター領域を含むDNAとアニールする配列である；配列番号７）とESP-NOSter-Rv（5′-CGAATTCAGGCCTGTTTAAACGATCTAGTAACATAGATGACAC-3′；下線部はNOSターミネーター領域を含むDNAとアニールする配列である；配列番号８）をプライマーに用いたPCRにより、5′側にSacI, EcoICRI(Ecl136II), SpeI, SalI制限酵素サイト、3′側にPmeI, SrfI, EcoRI制限酵素サイトを付加したアグロバクテリウムnosターミネーターを含むDNA断片を増幅し、pCR2.1（Invitrogen）にTAクローニングした後、SacIとEcoRIで消化し、アグロバクテリウムnosターミネーターを含むDNA断片を得た。
　制限酵素サイトを付加したCmF3Hプロモーター1kのDNA断片及びNOSターミネーターのDNA断片それぞれを、pBI221のCaMV 35Sプロモーターを含むHindIII-XbaI領域、NOSターミネーターを含むSacI-EcoRI領域に入れ替えた後、HindIIIとEcoRIで消化して得られるHANS-CmF3Hp1k:GUS:NOSt-PSEカセットと、pSPORT2（Invitrogen）をHindIIIとEcoRIで消化して得られるプラスミド断片を連結して、バイナリーベクターに連続的に遺伝子発現カセットを結合させるためのエントリーベクターであるpMCE5を得た。
　バイナリーベクターに連続的に遺伝子発現カセットを連結させるためのエントリーベクターpMCE5のプロモーター5′側の制限酵素サイトをHindIII, FseI, AscI, StuI, SwaIに改変するとともに、ターミネーターをアグロバクテリウムnosターミネーターからアラビドプシスheat shock proteins (HSP) 18.2ターミネーター（AtHSPter，Plant Cell Physiol. 51(2): 328-332 (2010)；配列番号３７）に入れ替えたpMCE5-2を作製した。AtHSPterの5′側にはEcoICRI，SacI, SpeI, SalI制限酵素サイトを3′側にはSrfI, SmaI, PmeI, EcoRI, KpnIを付与した。
　pBluescript SK- gF3H9を鋳型に、hFAStSw-proCmF3H-Fd（5′-AAGCTTGGCCGGCCTAGGCGCGCCAGGCCTATTTAAATTTACAAAACCATGTGCAAGAATG-3′；下線部はF3Hプロモーター領域のDNAにアニールする配列である；配列番号９）とSNM-F3Hpro-Rv（5′-ACTAGTGCTAGCACGCGTTTTTTATTTTTTCTTCACACACTTG-3′；下線部はF3Hプロモーター領域のDNAにアニールする配列である；配列番号６）をプライマーに用いたPCRにより増幅したDNA断片をpCR-BluntII-TOPO（Life Technologies）にクローニングし、pCR-FASS-CmF3Hpro1k を得た。このプラスミドをHindIIIとNheIで消化して得られるFASS-CmF3Hpro1kのDNA断片と、pMCE5をHindIIIとSpeIで消化して得られるプラスミドのDNA断片を連結して、pMCE5-FASSを得た。
　pCR-HSPを鋳型に、SSS-terHSP-Fd（5′-GAGCTCACTAGTGTCGACATATGAAGATGAAGATGAAAT-3′；下線部はAtHSPterとアニールするDNA配列である；配列番号１０）とKESP-terHSP-Rv (5′-GGTACCGGTCCGGAATTCGTTTAAACGCCCGGGCCTTATCTTTAATCATATTCCATAGTCC-3′；下線部はAtHSPterとアニールするDNA配列である；配列番号１１）をプライマーに用いたPCRで増幅したDNA断片をpCR-BluntII-TOPO（Life Technologies）にクローニングし、pCR-SSS-AtHSPter-PSEKを得た。このプラスミドをKpnIとSacIで消化して得たAtHSPterのDNA断片をpMCE5-FASSをSacIとKpnIで消化したベクターDNA断片と連結し、pMCE5-2を得た。
　pMCE5-2をNheIとEcoICRIで消化して得られるプラスミドのDNA断片と、pCR ADHNF-Campanula F3′5′H（特許5697040号）のKpnI消化産物を平滑末端化した後に、XbaIで消化して得られる約1.7kbのDNA断片を連結し、pMCE5-2 ADHNF-CamF3′5′Hを得た。このプラスミドをAscIとPmeIで消化して得られる発現カセットのDNA断片と、参考例２で得たpB249をAscIとSwaIで消化し得られるバイナリーベクターのDNA断片を連結することで、pB423（pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H）を得た。
［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
　pB423を導入したアグロバクテリウムEHA105（Hood, E.E. et al. (1993) New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants. Transgenic Res. 2, 208-218，Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系で中輪ギクのキク品種「大平」（花き研で無菌培養により維持している遺伝資源を供試）を形質転換し、46系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、26系統（57%）で青色方向への花色の変化が認められた。色彩分光計による測定は最低３花弁を測定し、その平均値を算出した。色相角（Hue°）はarctan (b*/a*)、彩度（C*値）は(a2 + b2)1/2で算出した。そのうちの22系統（全体の48%）で、色相角290°以下の青色を示し、また22系統（全体の48%）で、RHSカラーチャートのViolet-Blueグループの花色を示した。このCamF3′5′HをキクF3HプロモーターとアラビドプシスHSPターミネーターで発現させるとともに、チョウマメA3′5′GTをキクF3Hプロモーターで発現させるpB423が、最も単純な遺伝子導入コンストラクトであり、48%という高い割合で青いキクを得られた。また、カンパニュラ由来F3′5′H遺伝子のターミネーターをアラビドプシスHSPにすることで、アグロバクテリウムnosターミネーターを用いた場合（実施例４，１２－１８）と比べて高い割合で青いキクが作出された。
　青色形質を付与されたキク品種「大平」に含まれるアントシアニンを液体クロマトグラフ・質量スペクトル（ACQUITY UPLC・タンデム四重極MS ACQUITY TQD，日本ウォーターズ）により分析した。溶媒Aに1%ギ酸含有蒸留水、溶媒Bに1%ギ酸含有アセトニトリルを用いた。溶媒の流速を0.1ml/分とし、0-5分間に溶媒Bを0から5%にし、5-20分間に5%から35%にし、その後20-25分間35%を維持するグラジエント溶出を行った。カラムにはガードカラムVanGuard（日本ウォーターズ）を連結した、ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm（2.1 i.d. × 100mm；日本ウォーターズ）を用い、カラム温度35℃で分析した。フォトダイオードアレイで得られたスペクトルデータを530nmで解析した結果、保持時間約9分（ピーク１）、10.5分（ピーク２）、12.7分（ピーク３）にアントシアニンのピークが認められた（図３）。それぞれの質量（[M+H]+）は、最も主要なピーク２がm/z 875、ピーク１がm/z 789、ピーク３がm/z 697であった。また、各ピークの吸収スペクトル測定、チョウマメより調整した標品との比較、LC-MS/MS分析（図４）などの結果より、ピーク１はデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）、ピーク２はデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）、ピーク３はシアニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′-グルコシドであり、導入したカンパニュラF3′5′HとチョウマメA3′5′GTの発現により目的とするアントシアニンの構造に改変された。また、主要色素であるデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）とデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）の蓄積によりキクは青色を発現した。
　デルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）、デルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）、シアニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′-グルコシドなど新たに合成されたアントシアニンの蓄積は、薄層クロマトグラフィー（TLC）によっても検出された。TLC Cellulose Glass Plate (10 X 20 cm, Millipore)の下から1.5cmの位置に10%酢酸花弁抽出液をスッポトし、風乾後、展開溶媒BAW（ブタノール：酢酸：水＝4:1:2（v/v/v））を入れた展開槽中で、原点から7cmの位置まで展開した。展開後、プレートを乾燥させ、蛍光灯下およびUV光（CSN-15AC，コスモバイオ，254/360nm）下で検出した。各アントシアニンのRf値は以下の通りであった。デルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）：0.15、デルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）：0.11、シアニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′-グルコシド：0.30
　花色の青色方向への改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［実施例２：キク品種「セイアラベラ」（系統番号T34）へのpB423の導入（キクF3Hプロモーター1kとアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でのチョウマメA3′5′GT遺伝子及びキクF3Hプロモーター1kとアラビドプシスHSPターミネーター制御下でのカンパニュラF3′5′H遺伝子の共発現）］
［１］ベクターの構築
　実施例１に従い、pB423（pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H）を作製した。
［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
　pB423を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、サーモンピンク色系で中輪デコラ咲きのキク品種「セイアラベラ」（（有）イノチオ精興園；系統番号T34）を形質転換し、47系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、34系統（72%）で青色方向への花色の変化が確認された。そのうちの27系統では、主要アントシアニンとしてデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及びデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）の蓄積を確認できた。これらの系統では花色がRHSカラーチャートのBlueグループまたはViolet-Blueグループの色へと改変された。「大平」と同様に「セイアラベラ」でも72%という高い割合で青いキクを得られた。花色の青色方向への改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［実施例３：キク系統「T37」へのpB423の導入（キクF3Hプロモーター1kとアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でのチョウマメA3′5′GT遺伝子及びキクF3Hプロモーター1kとアラビドプシスHSPターミネーター制御下でのカンパニュラF3′5′H遺伝子の共発現）］
［１］ベクターの構築
　実施例１に従い、pB423（pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H）を作製した。
［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
　pB423を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系で小輪ポンポン咲きのキク系統「T37」（（有）精興園より提供を受けた育成系統を供試）を形質転換し、97系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、58系統（60%）で青色方向への花色の変化が確認された。そのうちの9系統を用いて、主要アントシアニンとしてデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及びデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）の蓄積を確認した。それらの花色はViolet-Blueグループへと改変された。「大平」「セイアラベラ」と同様に「T37」でも60%という高い割合で青いキクを得られた。花色の青色方向への改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［実施例４：キク品種「大平」へのpB425の導入（キクF3Hプロモーター1k及びアラビドプシスHSPターミネーター制御下でのチョウマメA3′5′GT遺伝子及びキクF3Hプロモーター1k及びアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でのカンパニュラF3′5′H遺伝子の共発現］
［１］ベクターの構築
　キクF3′H抑制カセット、CtAGS、CtA3′5′GT、DFR発現カセットなど複数の遺伝子抑制／発現カセットを連結するための、カンパニュラF3′5′H発現バイナリーベクターpB315（pBCam2）を作製した。pBI121-FASS-CmF3H1kをSpeIとEcoICRIで消化して得られるバイナリーベクターのDNA断片とpCR ADHNF-Campanula F3′5′H（特許5697040号）のKpnI消化産物を平滑末端化した後に、XbaIで消化して得られる約1.7kbのDNA断片を連結し、pB315（pBI121-FASS-CmF3Hpro1k:NtADH-5′UTR-カンパニュラF3′5′H:NOSter；pBCam2）を得た。
　参考例１で得たpBSII-ADH-CtA3′5′GTをNheIとEcoICRIで消化して得られるDNA断片と、pMCE5-2（FASS-CmF3Hp-AtHSPt）をNheIとEcoICRIで消化して得られるベクターの断片を連結し、pMCE5-2 ADHNF-CtA3′5′GTを得た。pMCE5-2 ADHNF-CtA3′5′GT をFseIとPmeIで消化して得られる CmF3Hp1k:ADHNF-CtA3′5′GT:AtHSPtカセットと、pB315をFseIとSwaIで消化し得られるバイナリーベクターのDNA断片を連結することで、pB425（pBCam2+CtA3′5′GT）を得た。
［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
　pB425を導入したアグロバクテリウム（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系で中輪ギクのキク品種「大平」（花き研で無菌培養により維持している遺伝資源を供試）を形質転換し、42系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、23系統（55%）で青色方向への花色の変化が認められた。そのうちの11系統（全体の26%）で、色相角290°以下の青色を示した。また12系統（全体の29%）で、RHSカラーチャートのViolet-Blueグループの花色を示した。これら青色花形質を有する系統では、主要アントシアニンとしてデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及びデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）の蓄積を確認した。このように、チョウマメ由来A3′5′GT遺伝子とカンパニュラ由来F3′5′H遺伝子の２つの遺伝子を発現することで青いキクを作出することができる。花色の青色方向への改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
［実施例５：キク品種「大平」へのpB433の導入（キクF3Hプロモーター1kとアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でのチョウマメA3′5′GT遺伝子、キクF3Hプロモーター1kとアラビドプシスHSPターミネーター制御下でのカンパニュラF3′5′H遺伝子及びダッチアイリスDFR遺伝子の共発現］
［１］ベクターの構築
　ダッチアイリス（Iris hollandica）花被片由来のDFR遺伝子（Plant Cell Physiol 48 (2007) 1589，AB332098）を含むプラスミドpSPB909を鋳型に、IrisDFR_ADH_ORF_Fd（5′-CAAGAAAAATAAATGATGAGCCCCGTTGTC-3′，下線部はIhDFRとアニールする配列；配列番号１２）とIrisDFR_NdeI Rv（5′-CATATGTACCTCCCGTTCGCTTC-3′；配列番号１３）をプライマーに用いたPCRで増幅したDNA断片と、pBI221 ADH-221を鋳型にXbaI-ADH-Fd（5′-ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-3′；下線部はNtADH-5′UTR 94bpとアニールする配列である；配列番号１４）とIrisDFR_ORF_ADH_Rv（5′-GGGGCTCATCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3′；下線部はNtADH-5′UTR 94bpとアニールする配列である；配列番号１５）をプライマーに用いたPCRで増幅したDNA断片の二種類を混合して鋳型に用い、XbaI-ADH-Fd（5′-ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-3′；下線部はNtADH-5′UTR 94bpとアニールする配列である；配列番号１４）とIrisDFR_NdeI Rv（5′-CATATGTACCTCCCGTTCGCTTC-3′；配列番号１３）をプライマーに用いたPCRにより、タバコADH-5′UTR 94bpがダッチアイリスDFR遺伝子の開始コドンに直結したDNA断片を増幅し、pCR-bluntII-TOPOにクローニングして、pCR-ADHNF-IhDFR-5′を得た。このプラスミドをSalIとEcoRVで消化して得られるDNA断片とpSPB909をSalIとEcoRVで消化して得られるプラスミドのDNA断片を連結することで、pUC El2-35Sp:ADHNF-IrisDFR:D8tを得た。このプラスミドのXhoI消化産物を平滑末端化した後に、NheIで消化したDNA断片と、pMCE5-2をNheIとEcoICRIで消化して得られるプラスミドのDNA断片を連結してpMCE5-2 ADHNF-IhDFRを得た。pMCE5-2-ADHNF-IhDFRをAscIとPmeIで消化して得られる発現カセットと、AscIとSwaIで消化して得られるpB423バイナリーベクターのDNA断片を連結し、pB433（pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H+IhDFR）を得た。
［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
　pB433を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いてピンク色系で中輪ギクのキク品種「大平」（花き研で無菌培養により維持している遺伝資源を供試）を形質転換し、55系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、青色方向への花色の変化が認められた39系統（71%）のうちの31系統（全体の56%）で、色相角290°以下の青色を示した。また33系統（全体の60%）でRHSカラーチャートのViolet-Blueグループの花色を示した。これら青色花形質を有する系統では、主要アントシアニンとしてデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及びデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）の蓄積を確認した。カンパニュラ由来F3′5′H遺伝子のターミネーターをアラビドプシスHSPにすることで、アグロバクテリウムnosターミネーターを用いた場合（実施例４，１２－１８）と比べて高い割合で青いキクが作出された。花色の青色方向への改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
［実施例６：キク品種「大平」へのpB434の導入（キクF3Hプロモーター1kとアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でのチョウマメA3′5′GT遺伝子、キクF3Hプロモーター1kとアラビドプシスHSPターミネーター制御下でのカンパニュラF3′5′H遺伝子及びデルフィニウムDFR遺伝子の共発現］
［１］ベクターの構築
　デルフィニウム（Delphinium ×belladonna‘Volkerfrieden'）のがく片由来のDFR遺伝子を含むプラスミドpDbDFR4-8（GenBank accession no. AB221083）を鋳型に、DbDFR_ADH_ORF_Fd（5′-CAAGAAAAATAAATGACTGTAGAAACTGTTTGTG-3′；下線部はDbDFRとアニールする配列である；配列番号１６）とDbDFR_NcoI_Rv（5′-CCATGGTGTACTTATAGTTGAATCC-3′；配列番号１７）をプライマーに用いたPCRで増幅したDNA断片と、pBI221 ADH-221を鋳型にXbaI-ADH-Fd（5′-ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-3′；下線部はNtADH-5′UTR 94bpとアニールする配列である；配列番号１４）とDbDFR_ORF_ADH_Rv（5′-TTCTACAGTCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3′；下線部はNtADH-5′UTR 94bpとアニールする配列である；配列番号１８）をプライマーに用いたPCRで増幅したDNA断片の二種類を混合して鋳型に用い、XbaI-ADH-Fd（5′-ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-3′；下線部はNtADH-5′UTR 94bpとアニールする配列である；配列番号１４）とDbDFR_NcoI_Rv（5′-CCATGGTGTACTTATAGTTGAATCC-3′；下線部はNtADH-5′UTR 94bpとアニールする配列である；配列番号１７）をプライマーに、DNAポリメラーゼにPrimeStar（タカラバイオ）を用いたPCRにより、タバコADH-5′UTR 94bpがデルフィニウムDFR遺伝子の開始コドンに直結したDNA断片を得た。この平滑末端の増幅産物にdAを付加する反応を行った後、pCR2.1（Invitrogen）にTAクローニングして、pCR-ADHNF-DbDFR-5′を得た。このプラスミドをSmaIとNcoIで消化して得られる断片と、pDbDFR4-8をSmaIとNcoIで消化して得られるプラスミドのDNA断片を連結し、pBS-ADHNF-DbDFRを得た。このプラスミドのXhoI消化産物を平滑末端化した後に、SpeIで消化したDNA断片と、pMCE5-2をNheIとEcoICRIで消化して得られるプラスミドのDNA断片を連結してpMCE5-2 ADHNF-DbDFRを得た。pMCE5-2 ADHNF-DbDFRをAscIとPmeIで消化して得られる発現カセットと、AscIとSwaIで消化して得られるpB423バイナリーベクターのDNA断片を連結し、pB434（pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H+DbDFR）を得た。
［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
　pB434を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いてピンク色系で中輪ギクのキク品種「大平」（花き研で無菌培養により維持している遺伝資源を供試）を形質転換し、12系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、8系統（67%）で青色方向への花色の変化が認められ、8系統（全体の67%）が色相角290°以下の青色を示した。また7系統（全体の58%）が、RHSカラーチャートのViolet-Blueグループの花色を示した。これら青色花形質を有する系統では、主要アントシアニンとしてデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及びデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）の蓄積を確認した。カンパニュラ由来F3′5′H遺伝子のターミネーターをアラビドプシスHSPにすることで、アグロバクテリウムnosターミネーターを用いた場合（実施例４，１２－１８）と比べて高い割合で青いキクが作出された。花色の青色方向への改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
［実施例７：キク品種「大平」へのpB435の導入（キクF3Hプロモーター1kとアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でのチョウマメA3′5′GT遺伝子、キクF3Hプロモーター1kとアラビドプシスHSPターミネーター制御下でのカンパニュラF3′5′H遺伝子及びチョウマメDFR遺伝子の共発現］
［１］ベクターの構築
　チョウマメ（Clitoria ternatea ‘Double Blue'）の花弁由来のDFR遺伝子を含むプラスミドpBSCtDFR20（GenBank accession no. AB185901）を鋳型に、CtDFR_ADH_ORF_Fd（5′-CAAGAAAAATAAATGGATTCAGCAGCTGAAGTG-3′；下線部はCtDFRとアニールする配列である；配列番号１９）とCtDFR_SphI_Rv（5′-GCATGCTCTCATTATGTCAAG-3′；配列番号２０）をプライマーに用いたPCRで増幅したDNA断片と、pBI221 ADH-221を鋳型にXbaI-ADH-Fd（5′-ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-3′；下線部はNtADH-5′UTR 94bpとアニールする配列である；配列番号１４）とCtDFR_ORF_ADH_Rv（5′-TGCTGAATCCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3′；下線部はNtADH-5′UTR 94bpとアニールする配列である；配列番号２１）をプライマーに用いたPCRで増幅したDNA断片の二種類を混合して鋳型に用い、XbaI-ADH-Fd（5′-ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-3′；下線部はNtADH-5′UTR 94bpとアニールする配列である；配列番号１４）とCtDFR_SphI_Rv（5′-GCATGCTCTCATTATGTCAAG-3′；配列番号２０）をプライマーに、DNAポリメラーゼにPrimeStar（タカラバイオ）を用いたPCRにより、タバコADH-5′UTR 94bpがチョウマメDFR遺伝子の開始コドンに直結したDNA断片を得た。この平滑末端の増幅産物にdAを付加する反応を行った後、pCR2.1（Invitrogen）にTAクローニングして、pCR-ADHNF-CtDFR-5′を得た。このプラスミドをXbaIとSphIで消化して得られる断片と、pBSCtDFR20をXbaIとSphIで消化して得られるプラスミドのDNA断片を連結し、pBS-ADHNF-CtDFRを得た。このプラスミドのXhoI消化産物を平滑末端化した後に、XbaIで消化したDNA断片(090616-2)と、pMCE5-2をNheIとEcoICRIで消化して得られるプラスミドのDNA断片を連結してpMCE5-2 ADHNF-CtDFRを得た。pMCE5-2 ADHNF-CtDFRをAscIとPmeIで消化して得られる発現カセットと、AscIとSwaIで消化して得られるpB423バイナリーベクターのDNA断片を連結し、pB435（pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H+CtDFR）を得た。
［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
　pB435を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いてピンク色系で中輪ギクのキク品種「大平」（花き研で無菌培養により維持している遺伝資源を供試）を形質転換し、34系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、28系統（82%）で青色方向への花色の変化が認められた。23系統（全体の68%）が色相角290°以下の青色を示し、また22系統（全体の65%）RHSカラーチャートでの測色でBlueグループまたはViolet-Blueグループの花色を示した。これら青色花形質を有する系統では、主要アントシアニンとしてデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及びデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）の蓄積を確認した。カンパニュラ由来F3′5′H遺伝子のターミネーターをアラビドプシスHSPにすることで、アグロバクテリウムnosターミネーターを用いた場合（実施例４，12-18）と比べて高い割合で青いキクが作出された。花色の青色方向への改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
［実施例８：キク品種「セイショール」（（有）精興園より提供を受けた品種を供試；系統番号S39）へのpB428の導入（キクF3Hプロモーター1k及びアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でキク内在性F3′H遺伝子を抑制するとともに、キクF3Hプロモーター1k及びアラビドプシスHSPターミネーター制御下でカンパニュラF3′5′H遺伝子及びチョウマメA3′5′GT遺伝子を共発現）］
［１］ベクターの構築
　キク‘アリエッタ’舌状花弁由来cDNAを鋳型に、CmF3′H_full_ORF_F（5′-ATGAACATTTTACCTTTCGTATTTTATG-3′；配列番号２２）とCmF3′H_full_ORF_R（5′-TTAAATACTTTCATATACGTGGG-3′；配列番号２３）をプライマーに、DNAポリメラーゼにLA Taqを用いたPCRで増幅したキクF3′H ORFをpCR2.1にTAクローニングし、pCR2.1-CmF3′H-ORF1を得た。このプラスミドを鋳型に、CmF3′H_3′-Fd for dsRNA（5′-CACCCCGAACTCATTCGTCATCCAC-3′；配列番号２４）とCmF3′H_3′-Rv for dsRNA（5′-TCAATCCATACGCTTCTTCCATG-3′；配列番号２５）をプライマーに用いたPCRにより増幅したRNAiのトリガーとなるDNA断片（配列番号３８）をpENTR-D/TOPO（Invitrogn）に連結して、pENTR-CmF3′H-Cを得た。pENTR-CmF3′H-CとpANDA35K（http://bsw3.naist.jp/simamoto/pANDA/real/pANDA_top.htm）をLR反応し、pANDA- CmF3′H-C IRを得た。このプラスミドをXbaIとEcoICRIで消化して得られる約2.5kbのDNA断片とpBI121-FASS-CmF3H1kをSpeIとEcoICRIで消化して得られるバイナリーベクターのDNA断片を連結し、pB319（pBF3′H-Ci）を得た。
　pMCE5-2をNheIとEcoICRIで消化して得られるプラスミドのDNA断片と、pCR ADHNF-Campanula F3′5′H（特許5697040号）のKpnI消化産物を平滑末端化した後に、XbaIで消化して得られる約1.7kbのDNA断片を連結し、pMCE5-2 ADHNF-CamF3′5′Hを得た。このプラスミドをFseIとPmeIで消化して得られる発現カセットと、FseIとSwaIで消化して得られるpB319のバイナリーベクター断片を連結し、pB332（pBF3′H-Ci+CamF3′5′H）を得た。
　pB332（pBF3′H-Ci+CamF3′5′H）をFseIとSwaIで消化して得られるバイナリーベクターのDNA断片とpMCE5-2 ADHNF-CtA3′5′GT をFseIとPmeIで消化して得られる CmF3Hp1k:ADHNF-CtA3′5′GT:AtHSPtカセットを連結してpB428（pBF3′H-Ci+CamF3′5′H+CtA3′5′GT）を得た。
　pB428を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いてピンク系で大輪デコラ咲きのキク品種「セイショール」（（有）精興園より提供を受けた品種；系統番号S39）を形質転換し、10系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、6系統（60%）で青色方向への花色の変化が確認され、3系統（全体の30%）で、デルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及びデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）の蓄積を確認でき、花色はBlueグループまたはViolet-Blueグループへと改変された（図５）。カンパニュラ由来F3′5′H遺伝子のターミネーターをアラビドプシスHSPにすることで、アグロバクテリウムnosターミネーターを用いた場合（実施例４，12-18）と比べて高い割合で青いキクが作出された。花色の青色方向への改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
［実施例９：キク系統「T27」へのpB428の導入（キクF3Hプロモーター1k及びアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でキク内在性F3′H遺伝子を抑制するとともに、キクF3Hプロモーター1k及びアラビドプシスHSPターミネーター制御下でカンパニュラF3′5′H遺伝子及びチョウマメA3′5′GT遺伝子を共発現）］
［１］ベクターの構築
　実施例８にしたがい、pB428（pBF3′H-Ci+CamF3′5′H+CtA3′5′GT）を作製した。
［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
　pB428を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系で小輪ポンポン咲きのキク系統「T27」（（有）精興園より提供を受けた育成系統を供試）を形質転換し、10系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、６系統（60%）で青色方向への花色の変化が確認された。そのうちの４系統（全体の40%）で、主要アントシアニンとしてデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及びデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）の蓄積を確認できた（図５）。これらの系統では花色がViolet-Blueグループへと改変された。カンパニュラ由来F3′5′H遺伝子のターミネーターをアラビドプシスHSPにすることで、アグロバクテリウムnosターミネーターを用いた場合（実施例４，12-18）と比べて高い割合で青いキクが作出された。青色方向への花色改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
［実施例１０：キク品種「セイアラベラ」（系統番号T34）へのpB428の導入（キクF3Hプロモーター1k及びアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でキク内在性F3′H遺伝子を抑制するとともに、キクF3Hプロモーター1k及びアラビドプシスHSPターミネーター制御下でカンパニュラF3′5′H遺伝子及びチョウマメA3′5′GT遺伝子を共発現）］
［１］ベクターの構築
　実施例８にしたがい、pB428（pBF3′H-Ci+CamF3′5′H+CtA3′5′GT）を作製した。
［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
　pB428を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、サーモンピンク色系で中輪デコラ咲きのキク品種「セイアラベラ」（（有）イノチオ精興園；系統番号T34）を形質転換し、3系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、3系統(100%)で青色方向への花色の変化が確認された。そのうちの2系統（全体の67%）で、主要アントシアニンとしてデルフィニジン3-(6-マロニル)グルコシド 3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及びデルフィニジン 3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）の蓄積を確認できた（図５）。これらの系統の花色はViolet-Blueグループへと改変された。カンパニュラ由来F3′5′H遺伝子のターミネーターをアラビドプシスHSPにすることで、アグロバクテリウムnosターミネーターを用いた場合（実施例４，１２－１８）と比べて高い割合で青いキクが作出された。花色の青色方向への改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
［実施例１１：キク系統「T57」へのpB428の導入（キクF3Hプロモーター1k及びアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でキク内在性F3′H遺伝子を抑制するとともに、キクF3Hプロモーター1k及びアラビドプシスHSPターミネーター制御下でカンパニュラF3′5′H遺伝子及びチョウマメA3′5′GT遺伝子を共発現）］
［１］ベクターの構築
　実施例８にしたがい、pB428（pBF3′H-Ci+CamF3′5′H+CtA3′5′GT）を作製した。
［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
　pB428を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、サーモンピンク色系で中輪デコラ咲きのキク系統「T57］（（有）精興園より提供を受けた育成系統を供試）を形質転換し、1系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、青色方向への花色の変化が確認され、主要アントシアニンとしてデルフィニジン3-(6-マロニル)グルコシド 3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及びデルフィニジン 3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）の蓄積を確認できた。この系統の花色はViolet-Blueグループへと改変されており、測色値を以下の表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
［実施例１２：キク品種「大平」へのpB436の導入（キクF3Hプロモーター1k及びアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でカンパニュラF3′5′H遺伝子、キクF3Hプロモーター1k及びアラビドプシスHSPターミネーター制御下でチョウマメA3′5′GT遺伝子及びダッチアイリスDFR遺伝子を共発現）］
［１］ベクターの構築
　実施例５で得たpMCE5-2 ADHNF-IhDFRをAscIとPmeIで消化して得られる発現カセットと、AscIとSwaIで消化して得られるpB425バイナリーベクターのDNA断片を連結し、pB436（pBCam2+CtA3′5′GT+IhDFR）を得た。
［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
　pB436を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系で中輪ギクのキク品種「大平」（花き研で無菌培養により維持している遺伝資源を供試）を形質転換し、57系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、32系統（56%）で青色方向への花色の変化が認められた。16系統（全体の28%）で、色相角290°以下の青色を示し、また14系統（全体の25%）でRHSカラーチャートでViolet-Blueグループの花色を示した。これら青色花形質を有する系統では、主要アントシアニンとしてデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及びデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）の蓄積を確認した。青色方向への花色改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
［実施例１３：キク品種「大平」へのpB437の導入（キクF3Hプロモーター1k及びアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でカンパニュラF3′5′H遺伝子、キクF3Hプロモーター1k及びアラビドプシスHSPターミネーター制御下でチョウマメA3′5′GT遺伝子及びデルフィニウムDFR遺伝子を共発現）］
［１］ベクターの構築
　実施例６で得たpMCE5-2 ADHNF-DbDFRをAscIとPmeIで消化して得られる発現カセットと、AscIとSwaIで消化して得られるpB425バイナリーベクターのDNA断片を連結し、pB437（pBCam2+CtA3′5′GT+DbDFR）を得た。
［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
　pB437を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系で中輪ギクのキク品種「大平」（花き研で無菌培養により維持している遺伝資源を供試）を形質転換し、38系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、21系統（55%）で青色方向への花色の変化が認められた。そのうちの9系統（全体の24%）で、色相角290°以下の青色を示し、また8系統（全体の21%）でRHSカラーチャートでViolet-Blueグループの花色を示した。これら青色花形質を有する系統では、主要アントシアニンとしてデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及びデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）の蓄積を確認した。青色方向への花色改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表１３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
［実施例１４：キク品種「大平」へのpB438の導入（キクF3Hプロモーター1k及びアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でカンパニュラF3′5′H遺伝子、キクF3Hプロモーター1k及びアラビドプシスHSPターミネーター制御下でチョウマメA3′5′GT遺伝子及びチョウマメDFR遺伝子を共発現）］
［１］ベクターの構築
　実施例７で得たpMCE5-2 ADHNF-CtDFRをAscIとPmeIで消化して得られる発現カセットと、AscIとSwaIで消化して得られるpB425バイナリーベクターのDNA断片を連結し、pB438（pBCam2+CtA3′5′GT+CtDFR）を得た。
［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
　pB438を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系で中輪ギクのキク品種「大平」（花き研で無菌培養により維持している遺伝資源を供試）を形質転換し、55系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、34系統（62%）で青色方向への花色の変化が認められた。そのうちの13系統（全体の24%）で、色相角290°以下の青色を示した。また18系統（全体の33%）で、RHSカラーチャートのViolet-Blueグループの花色を示した。これら青色花形質を有する系統では、主要アントシアニンとしてデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及びデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）の蓄積を確認した。青色方向への花色改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表１４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
［実施例１５：キク品種「大平」へのpB426の導入（キクF3Hプロモーター1k及びアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でカンパニュラF3′5′H遺伝子、キクF3Hプロモーター1k及びアラビドプシスHSPターミネーター制御下でデルフィニウムDFR遺伝子及びチョウマメA3′5′GT遺伝子を共発現）］
［１］ベクターの構築
　実施例６で得たpMCE5-2 ADHNF-DbDFRをFseIとPmeIで消化して得られる発現カセットと、FseIとSwaIで消化して得られるpB315バイナリーベクターのDNA断片を連結し、pBCam2+DbDFRを得た。このバイナリーベクターをFseIとSwaIで消化して得られるDNA断片とpMCE5-2 ADHNF-CtA3′5′GT をFseIとPmeIで消化して得られるCmF3Hp1k:ADHNF-CtA3′5′GT:AtHSPtカセットを連結し、pB426（pBCam2+DbDFR+CtA3′5′GT）を得た。
［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
　pB426を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系で中輪ギクのキク品種「大平」（花き研で無菌培養により維持している遺伝資源を供試）を形質転換し、47系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、28系統（60%）で青色方向への花色の変化が認められた。そのうちの9系統（全体の19%）で、色相角290°以下の青色を示し、また10系統（全体の21%）でRHSカラーチャートでの測色ではViolet-Blueグループの花色を示した。これら青色花形質を有する系統では、主要アントシアニンとしてデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及びデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）の蓄積を確認した。青色方向への花色改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表１５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
［実施例１６：キク品種「大平」へのpB427の導入（キクF3Hプロモーター1k及びアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でカンパニュラF3′5′H遺伝子、キクF3Hプロモーター1k及びアラビドプシスHSPターミネーター制御下でチョウマメDFR遺伝子及びチョウマメA3′5′GT遺伝子を共発現）］
［１］ベクターの構築
　実施例７で得たpMCE5-2 ADHNF-CtDFRをFseIとPmeIで消化して得られる発現カセットと、FseIとSwaIで消化して得られるpB315バイナリーベクターのDNA断片を連結し、pBCam2+CtDFRを得た。このバイナリーベクターをFseIとSwaIで消化して得られるDNA断片とpMCE5-2 ADHNF-CtA3′5′GT をFseIとPmeIで消化して得られるCmF3Hp1k:ADHNF-CtA3′5′GT:AtHSPtカセットを連結し、pB427（pBCam2+CtDFR+CtA3′5′GT）を得た。
［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
　pB427を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系で中輪ギクのキク品種「大平」（花き研で無菌培養により維持している遺伝資源を供試）を形質転換し、24系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、15系統（63%）で青色方向への花色の変化が認められた。そのうちの4系統（全体の17%）で、色相角290°以下の青色を示し、RHSカラーチャートのViolet-Blueグループの花色を示した。これら青色花形質を有する系統では、主要アントシアニンとしてデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及びデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）の蓄積を確認した。青色方向への花色改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表１６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
［実施例１７：キク品種「大平」へのpB419の導入（キクF3Hプロモーター1k及びアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でカンパニュラF3′5′H遺伝子、キクF3Hプロモーター1k及びアラビドプシスHSPターミネーター制御下でチョウマメAGS遺伝子及びチョウマメA3′5′GT遺伝子を共発現）］
［１］ベクターの構築
　pBSII-ADH-CtA3′5′GTをNheIとEcoICRIで消化して得られるDNA断片と、pMCE5-2（FASS-CmF3Hp-AtHSPt）をNheIとEcoICRIで消化して得られるベクターの断片を連結し、pMCE5-2 ADHNF-CtA3′5′GTを得た。このプラスミドをFseIとPmeIで消化して得られる発現カセットと、FseIとSwaIで消化して得られるpB420（pBCam2+CtAGS；参考例４）のバイナリーベクター断片を連結し、pB419（pBCam2+CtAGS+CtA3′5′GT）を得た。
［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
　pB419を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系で中輪ギクのキク品種「大平」（花き研で無菌培養により維持している遺伝資源を供試）を形質転換し、20系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、12系統(60%)で青色方向への花色の変化が認められた。そのうちの5系統(全体の25%)で、色相角290°以下の青色を示した。また、3系統(全体の15%)でRHSカラーチャートでViolet-Blueグループの花色を示した。これら青色花形質を有する系統では、主要アントシアニンとしてデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及びデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）の蓄積を確認した。青色方向への花色改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表１７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
［実施例１８：キク品種「大平」へのpB432の導入（キクF3Hプロモーター1k及びアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でカンパニュラF3′5′H遺伝子、キクF3Hプロモーター1k及びアラビドプシスHSPターミネーター制御下でチョウマメAGS遺伝子、チョウマメA3′5′GT遺伝子及びダッチアイリスDFR遺伝子を共発現）］
［１］ベクターの構築
　pMCE5-2- ADHNF-DbDFRをFseIとPmeIで消化して得られる発現カセットと、FseIとSwaIで消化して得られるpB419（pBCam2+CtAGS+CtA3′5′GT）のバイナリーベクター断片を連結し、pB432（pBCam2+CtAGS+CtA3′5′GT+IhDFR）を得た。
［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
　pB432を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系で中輪ギクのキク品種「大平」（花き研で無菌培養により維持している遺伝資源を供試）を形質転換し、47系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、23系統（49%）で青色方向への花色の変化が認められた。そのうちの12系統（全体の26%）で、色相角290°以下の青色を示した。また13系統（全体の28%）でRHSカラーチャートのBlueグループまたはViolet-Blueグループの色を示した。これら青色花形質を有する系統では、主要アントシアニンとしてデルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′,5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及びデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）の蓄積を確認した。青色方向への花色改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表１８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
［実施例１９：キク品種「セイショール」へのpB423の導入（キクF3Hプロモーター1kとアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でのチョウマメA3′5′GT遺伝子及びキクF3Hプロモーター1kとアラビドプシスHSPターミネーター制御下でのカンパニュラF3′5′H遺伝子の共発現）］
［１］ベクターの構築
　実施例１に従い、pB423（pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H）を作製した。
［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
　pB423を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系で大輪デコラ咲きのキク品種「セイショール」（（有）イノチオ精興園）を形質転換し、2系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、1系統（50%）で色相角290°以下でRHSカラーチャートのViolet-Blueグループを示す青いキクが作出された。花色の青色方向への改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表１９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
［実施例２０：キク品種「カンデラティエラ」へのpB423の導入（キクF3Hプロモーター1kとアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でのチョウマメA3′5′GT遺伝子及びキクF3Hプロモーター1kとアラビドプシスHSPターミネーター制御下でのカンパニュラF3′5′H遺伝子の共発現）］
［１］ベクターの構築
　実施例１に従い、pB423（pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H）を作製した。
［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
　pB423を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系でデコラ咲きのキク品種「カンデラティエラ」（（有）イノチオ精興園）を形質転換し、3系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、1系統（33%）でRHSカラーチャートのViolet-Blueグループを示す青いキクが作出された。花色の青色方向への改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表２０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
［実施例２１：キク系統「T10」へのpB423の導入（キクF3Hプロモーター1kとアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でのチョウマメA3′5′GT遺伝子及びキクF3Hプロモーター1kとアラビドプシスHSPターミネーター制御下でのカンパニュラF3′5′H遺伝子の共発現）］
［１］ベクターの構築
　実施例１に従い、pB423（pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H）を作製した。
［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
　pB423を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、紅色系でデコラ咲きのキク系統「T10」（（有）イノチオ精興園より提供を受けた育成系統を供試）を形質転換し、3系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、1系統（33%）でRHSカラーチャートのViolet-Blueグループを示す青いキクが作出された。花色の青色方向への改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表２１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
［実施例２２：キク系統「T24」へのpB423の導入（キクF3Hプロモーター1kとアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でのチョウマメA3′5′GT遺伝子及びキクF3Hプロモーター1kとアラビドプシスHSPターミネーター制御下でのカンパニュラF3′5′H遺伝子の共発現）］
［１］ベクターの構築
　実施例１に従い、pB423（pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H）を作製した。
［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
　pB423を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系で大輪咲きの厚物キク系統「T24」（（有）イノチオ精興園より提供を受けた育成系統を供試）を形質転換し、4系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、1系統（25%）で色相角290°以下でRHSカラーチャートのViolet-Blueグループを示す青いキクが作出された。花色の青色方向への改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表２２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
［実施例２３：キク系統「T27」へのpB423の導入（キクF3Hプロモーター1kとアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でのチョウマメA3′5′GT遺伝子及びキクF3Hプロモーター1kとアラビドプシスHSPターミネーター制御下でのカンパニュラF3′5′H遺伝子の共発現）］
［１］ベクターの構築
　実施例１に従い、pB423（pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H）を作製した。
［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
　pB423を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系でポンポン咲きのキク系統「T27」（（有）イノチオ精興園より提供を受けた育成系統を供試）を形質転換し、21系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、11系統（52%）で色相角290°以下を示し、17系統（81%）でRHSカラーチャートのViolet-Blueグループを示す青いキクが作出された。花色の青色方向への改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表２３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
［実施例２４：キク系統「T44」へのpB423の導入（キクF3Hプロモーター1kとアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でのチョウマメA3′5′GT遺伝子及びキクF3Hプロモーター1kとアラビドプシスHSPターミネーター制御下でのカンパニュラF3′5′H遺伝子の共発現）］
［１］ベクターの構築
　実施例１に従い、pB423（pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H）を作製した。
［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
　pB423を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系でポンポン咲きのキク系統「T44」（（有）イノチオ精興園より提供を受けた育成系統を供試）を形質転換し、12系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、4系統（33%）で色相角290°以下を示し、3系統（25%）でRHSカラーチャートのViolet-Blueグループを示す青いキクが作出された。花色の青色方向への改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表２４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
［実施例２５：キク系統「T57」へのpB423の導入（キクF3Hプロモーター1kとアグロバクテリウムnosターミネーター制御下でのチョウマメA3′5′GT遺伝子及びキクF3Hプロモーター1kとアラビドプシスHSPターミネーター制御下でのカンパニュラF3′5′H遺伝子の共発現）］
［１］ベクターの構築
　実施例１に従い、pB423（pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H）を作製した。
［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
　pB423を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系でデコラ咲きのキク系統「T57」（（有）イノチオ精興園より提供を受けた育成系統を供試）を形質転換し、2系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、2系統(100%）で色相角290°以下を示し、RHSカラーチャートのViolet-Blueグループを示す青いキクが作出された。花色の青色方向への改変が確認された形質転換体の測色値を以下の表２５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
［参考例１：キク系統「94-765」へのpB248の導入（キクF3Hプロモーター500及びアグロバクテリウムnosターミネーターの制御下で、チョウマメ由来A3′5′GT遺伝子を発現）］
［１］ベクターの構築
　チョウマメA3′5′GT遺伝子を含む、特許第4418865号に記載のpBSCtBGT1DB24プラスミドを鋳型に、ADH-3′5′GT-Fd（5′-CAAGAAAAATAAATGGAAAACAATAAGCATGTC-3′；下線部はCt3′5′GTコード領域とアニールする配列である；配列番号２６）とHind-Ct3′5′GT-Rv（5′-AAGCTTGCGTTTTTAGCATCATTC-3′；配列番号２７）をプライマーに用いてPCRで増幅したDNA断片と、pBI221 ADH-221を鋳型にXbaI-ADH-Fd（5′-ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-3′；下線部はNtADH-5′UTR 94bpとアニールする配列である；配列番号１４）とCt3′5′GT-ADH-Rv（5′-ATTGTTTTCCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3′；下線部はNtADH-5′UTR 94bpとアニールする配列である；配列番号２８）をプライマーに用いてPCRで増幅したDNA断片の二種類を混合して鋳型に用い、XbaI-ADH-FdとHind-Ct3′5′GT-Rvをプライマーに用いたPCRにより、タバコADH-5′UTR 94bpがチョウマメA3′5′GT遺伝子の開始コドンに直結したDNA断片を得た。このDNA断片をpCR2.1にTAクローニングした後に、XbaIとHindIIIで消化して得られる約600bpのDNA断片を、pBlueScript II SK (+)をXbaIとHindIIIで消化して得られるベクターのDNA断片と連結して、pBSII-ADH-5′-CtBGT1-HindIIIを得た。このプラスミドをHindIIIとXhoIで消化して得られるプラスミドのDNA断片と、pBSCtBGT1DB24をHindIIIとXhoIで消化して得られるDNA断片を連結し、pBSII-ADH-CtA3′5′GTを得た。このプラスミドを鋳型に、NheI-ADH-Fd2(5′-GCTAGCGTCTATTTAACTCAGTATTCAGAAAC-3′；下線部はNtADH-5′UTR 94bpとアニールする配列である；配列番号２９)とCt3′5′GT-SacI-Rv(5′-GAGCTCTTAGCTAGAGGAAATCATTTCCAC-3′；下線部はCt3′5′GTコード領域とアニールする配列である；配列番号３０)をプライマーに用いてPCRにより増幅した平滑末端のDNA産物を、pCR-Blunt II-TOPO（Invitrogen）にクローニングしてpCR ADHNF-CtA3′5′GTを得た。このプラスミドをNheIとEcoICRIで消化して得られる約1450bpのADHNF-CtA3′5′GT DNA断片と、pBI121 HANS-CmF3Hp500-X（特許第5697040号）をXbaIとEcoICRIで消化し得られるバイナリーベクターのDNA断片を連結して、pB248（pBI121 CmF3Hp500:ADHNF-チョウマメA3′5′GT:NOSt）を得た。
［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
　pB248を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、濃赤色系で中輪ギクのキク系統「94-765」（（有）精興園より提供を受けた育成系統を供試）を形質転換し、23系統の形質転換体を得た。そのうち、15系統の舌状花弁に含まれるアントシアニン色素を高速液体クロマトグラフィーを用いて以下の条件で分析した。カラムはInertsil ODS-2（粒径5μm, 4.6×250mm, ジーエルサイエンス）を用い、流速0.8ml/minで、移動相は1.5%リン酸を含む、5%酢酸、6.25%アセトニトリルから20%酢酸、25%アセトニトリルの直線濃度勾配20分間の後、1.5%リン酸および20%酢酸を含む25%アセトニトリルで5分間のイソクラティック溶出を行った。検出はAgilent 1100 シリーズ ダイオードアレイ検出器（ジーエルサイエンス）を用い、250nmから600nmの波長領域を検出した。分析の結果、12系統で、宿主花弁の主要アントシアニンであるシアニジン3-(6′′-マロニル）グルコシド及びシアニジン3-(3′′,6′′-ジマロニル）グルコシドそれぞれにグルコシル基が１つ結合したと考えられる２つの主要色素、シアニジン3-(6-マロニル）グルコシド-3′-グルコシド及びシアニジン3-(3′′,6′′-ジマロニル）グルコシド-3′-グルコシド（それぞれのHPLC分析の溶出時間（tR）：9.4分及び7.2分）をもつことが確認された。しかし、もとの94-765と大きく花色の変化した系統は得られず、いずれの形質転換系統もRHSカラーチャートのRed-Purpleグループの花色を示した（表２６）。キクF3Hプロモーター500（長さ約500b）でチョウマメのA3′5′GT遺伝子を発現させるだけでは青いキクは得られなかった(図６）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
［参考例２：キク系統「94-765」へのpB249の導入（キクF3Hプロモーター1k及びアグロバクテリウムnosターミネーターの制御下で、チョウマメ由来A3′5′GT遺伝子を発現）］
［１］ベクターの構築
　pBI121 HANS-CmF3Hp1k-S（特許第5697040号）をSpeIとEcoICRIで消化し得られるバイナリーベクターのDNA断片と、pCR ADHNF-CtA3′5′GTをNheIとEcoICRIで消化して得られる、ADHNF-チョウマメA3′5′GTのDNA断片を連結してpB249（pBI121 CmF3Hp1k:ADHNF-チョウマメA3′5′GT:NOSt）を得た。
［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
　pB249を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、濃赤色系で中輪ギクのキク系統「94-765」（（有）精興園より提供を受けた育成系統を供試）を形質転換し、25系統の形質転換体を得た。そのうち、18系統で舌状花弁に含まれるアントシアニン色素を参考例１の方法で分析した結果、17系統で、シアニジン3-(6′′-マロニル）グルコシド及びシアニジン3-(3′′,6′′-ジマロニル）グルコシドそれぞれにグルコシル基が１つ結合したと考えられる２つの主要色素をもつことが確認された。また、もとの94-765と大きく花色の変化した系統は得られず、いずれもRed-Purpleグループの花色を示した（表２７）。F3Hプロモーター1k（長さ約1kb）でチョウマメのA3′5′GT遺伝子を発現させるだけでは青いキクは得られなかった（図６）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
［参考例３：キク系統「94-765」へのpB250の導入（キクF3Hプロモーター1k及びアグロバクテリウムnosターミネーターの制御下で、チョウマメ由来A3′5′GT遺伝子、チョウマメ由来AGS遺伝子、及びチョウマメ由来A3′AT遺伝子を共発現）］
［１］ベクターの構築
　チョウマメ1-O-アシルグルコース合成酵素（CtAGS，UDP-グルコース：ヒドロキシ桂皮酸1-O-グルコシル基転移酵素，図２）をコードするCtAGS遺伝子を含む、特許第4418865号に記載のpBSII-CtGT11-4-14を鋳型に、ADH-CtHCAGT-Fd（5′-CAAGAAAAATAAATGGGGTCTGAAGCTTCGTTTC-3′；下線部はCtAGS遺伝子コード領域とアニールする配列である；配列番号３１)とStuI-CtHCAGT-Rv（5′- AGGCCTCATGTTCACAAACTTC-3′；配列番号３２）をプライマーに用いてPCRで増幅したDNA断片と、pBI221 ADH-221を鋳型に、XbaI-ADH-Fd（5′-ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-3′；下線部はNtADH-5′UTR 94bpとアニールする配列である；配列番号１４）とCtHCAGT-ADH-Rv（5′-TTCAGACCCCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3′；下線部はNtADH-5′UTR 94bpとアニールする配列である；配列番号３３）をプライマーに用いてPCRで増幅したDNA断片の二種類を混合して鋳型に用い、XbaI-ADH-Fd（配列番号１４）とStuI-CtHCAGT-Rv（配列番号３２）をプライマーに用いたPCRにより、タバコADH-5′UTR 94bpがCtAGS遺伝子の開始コドンに直結したDNA断片を得た。このDNA断片を、pCR2.1（Invitrogen）にTAクローニングした後に、XbaIとStuIで消化して得られる約850bpのDNA断片と、pBSII-CtGT11-4-14をXbaIとStuIで消化して得られるベクター断片を連結し、pBSII-ADH-CtAGSを得た。このプラスミドのXhoI消化産物を平滑末端化した後に、XbaIで消化して得られるDNA断片と、pMCE5をNheIとEcoICRIで消化して得られるベクター断片を連結して、pMCE5-ADH-AGSを得た。このプラスミドをAscIとPmeIで消化して得られる、遺伝子発現カセットAscI-CmF3Hp1k:NtADH-5′UTR:CtAGS:nost-PmeIのDNA断片と、pB249（pBI121 CmF3Hp1k:ADHNF-チョウマメA3′5′GT:NOSt）をSwaIとAscIで消化して得られるバイナリーベクターDNA断片pMCE5-ADH-CtAGSを連結し、pBI121-CtBGT+AGSを得た。
　3′AT活性および5′AT活性（図２）をもつと考えられるチョウマメA3′AT遺伝子を含む特許第4418865号に記載のCtSCPL1 cDNAクローンの１つであるpBSII-CtAT1-19を鋳型に、ADH-CtAT1-Fd（5′-CAAGAAAAATAAATGGCAGCCTTCAGTTCAAC-3′；下線部はCtAT1にアニールする領域である；配列番号３４）とPst-CtAT1-Rv(5′-CTGCAGCATCTGTTCTAGCATAA-3′；配列番号３５) をプライマーに用いてPCRで増幅したDNA断片と、pBI221 ADH-221を鋳型に、XbaI-ADH-Fd（5′-ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-3′；下線部はNtADH-5′UTR 94bpとアニールする配列である；配列番号１４）とCtAT1-ADH-Rv（5′-GAAGGCTGCCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3′；下線部はNtADH-5′UTR 94bpとアニールする配列である；配列番号３６）をプライマーに用いてPCRで増幅したDNA断片の二種類を混合して鋳型に用い、XbaI-ADH-Fd（配列番号１４）とPst-CtAT1-Rv（配列番号３５）をプライマーに用いたPCRにより、NtADH-5′UTR 94bpがCtAT遺伝子の開始コドンに直結したDNA断片を増幅した。このDNA断片をXbaIとPstIで消化し、pBSII-CtAT1-19をSpeIとPstIで消化して得られるDNA断片と連結してpBSII-ADHNF-CtAT1-19を得た。このプラスミドをNotIとXhoIで消化して得られる約1.6kbのDNA断片と、EcoRIで消化した後にセルフライゲーションして環状化させたpCR2.1をNotIとXhoIで消化して得られるプラスミド断片を連結して、pCR-ADHNF-CtAT1-19を得た。また、pBSII-ADHNF-CtAT1-19をEcoICRIとSalIで消化して得られる約1.6kbのDNA断片と、SmaIとSalIで消化したpMCE5プラスミドのDNA断片を連結して、pMCE5-ADH-CtAT1を得た。
　pBI121-CtBGT+AGSをSwaIとAscIで消化して得られるバイナリーベクターのDNA断片とpMCE5-ADH-CtAT1をAscIとPmeIで消化して得られる、発現カセット（AscI-CmF3Hp1k:NtADH-5′UTR:Ct3′AT:nost-PmeI）のDNA断片を連結し、キクF3Hプロモーター1kとアグロバクテリウムnosターミネーターの制御によりチョウマメA3′5′GT、チョウマメAGS及びチョウマメ3′ATを共発現させるためのバイナリーベクターpB250を得た。
［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
　pB250を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、濃赤色系で中輪ギクのキク系統「94-765」（（有）精興園より提供を受けた育成系統を供試）を形質転換し、11系統の形質転換体を得た。そのうち、9系統で舌状花弁にもとのアントシアニン色素、シアニジン3-(6′′-マロニル）グルコシド及びシアニジン3-(3′′,6′′-ジマロニル）グルコシドそれぞれにグルコシル基が１つ結合したと考えられる２つの主要色素をもつことが参考例１と同じ分析方法で確認されたが、チョウマメ由来AGS、及びチョウマメ由来A3′ATの遺伝子産物の働きにより、芳香族アシル基による修飾を受けたシアニジン配糖体を花弁に蓄積した系統は得られなかった。また、もとの94-765と大きく花色の変化した系統は得られず、いずれもRed-Purpleグループの花色を示した（表２８）。キクF3HプロモーターでチョウマメのA3′5′GT遺伝子、アシルグルコース合成酵素遺伝子、及びA3′AT遺伝子を発現させる方法では青いキクは得られなかった（図６）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
［参考例４：キク品種「大平」へのpB420の導入（キクF3Hプロモーター1kとアグロバクテリウムnosターミネーターの制御下で、カンパニュラ由来F3′5′H遺伝子とチョウマメ由来AGS遺伝子を共発現）］
［１］ベクターの構築
　参考例３で得たpBSII-ADH-CtAGSをXhoIで消化した後に平滑末端処理をし、その後XbaIで消化して得られるDNA断片と、pMCE5-2（FASS-CmF3Hp-AtHSPt）をNheIとEcoICRIで消化して得られるベクターの断片を連結し、pMCE5-2 ADHNF-CtAGSを得た。このプラスミドをFseIとPmeIで消化して得られる発現カセットと、FseIとSwaIで消化して得られるpB315（pBCam2）のバイナリーベクター断片を連結し、pB420（pBCam2+CtAGS）を得た。
［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
　pB420を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系で中輪ギクのキク品種「大平」（花き研で無菌培養により維持している遺伝資源を供試）を形質転換し、40系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、17系統で青色方向への花色の変化が認められた。しかし、最も青みの強い系統でも色相角317度で、RHSカラーチャートのPurple-Vioretグループの花色を示し、F3′5′H遺伝子のみ発現させた場合と同程度であった（表２９）。F3′5′H遺伝子にチョウマメ由来のアシルグルコース合成酵素遺伝子（CtAGS）を共発現させる導入遺伝子コンストラクトでは、色相角230°～290°かつ／又はViolet-Blueグループ／Blueグループの花色を示す青いキクは得られなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
［参考例５：キク品種「大平」へのpB430の導入（キクF3Hプロモーター1kおよびアグロバクテリウムnosターミネーターの制御下で、カンパニュラ由来F3′5′H遺伝子、チョウマメ由来AGS遺伝子，及びダッチアイリス由来DFR遺伝子を共発現）］
［１］ベクターの構築
　pMCE5-2- ADHNF-DbDFRをFseIとPmeIで消化して得られる発現カセットと、FseIとSwaIで消化して得られるpB420（pBCam2+CtAGS）のバイナリーベクター断片を連結し、pB430（pBCam2+CtAGS+IhDFR）を得た。
［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
　pB430を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系で中輪ギクのキク品種「大平」（花き研で無菌培養により維持している遺伝資源を供試）を形質転換し、54系統の形質転換体を得た。色彩分光計（CD100，横河インスツルメンツ）とRHSカラーチャートでの測色を行った結果、33系統（63％）で青色方向への花色の変化が認められた。しかし、最も青みの強い系統の色相角は315度で、RHSCCでの測色でもVioletグループまたはPurple-Vioretグループの系統しか得られず、F3′5′H遺伝子のみ発現させた場合と花色の変化は変わらなかった（表３０）。F3′5′H遺伝子にチョウマメ由来のアシルグルコース合成酵素遺伝子（CtAGS）及びダッチアイリス由来DFR遺伝子を共発現させる導入遺伝子コンストラクトでは、色相角230°～290°かつ／又はViolet-Blueグループ／Blueグループの花色を示す青いキクは得られなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
［参考例６：キク品種「大平」へのpB249の導入（キクF3Hプロモーター1k及びアグロバクテリウムnosターミネーターの制御下で、チョウマメ由来A3′5′GT遺伝子を発現）］
［１］ベクターの構築
　参考例２に従って、pB249（pBI121 CmF3Hp1k:ADHNF-チョウマメA3′5′GT:NOSt）を得た。
［２］形質転換体の獲得及びその花色の測定
　pB249を導入したアグロバクテリウムEHA105（Dr. Elizabeth E. Hood氏より分譲）を用いて、ピンク色系で中輪ギクのキク品種「大平」を形質転換し、26系統の形質転換体を得た。もとの「大平」と大きく花色の変化した系統は得られず、やや花色の変化が認められた系統でもPurpleグループ75の花色を示した（表３１）。参考例２の「94-765」の場合と同じく、F3Hプロモーター1k（長さ約1kb）でチョウマメのA3′5′GT遺伝子を発現させるだけでは青いキクは得られなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031

Claims (14)

  1. 　以下の（１－ａ）～（１－ｅ）：
    　（１－ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    　（１－ｂ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、アントシアニンの３′位及び５′位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    　（１－ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    　（１－ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アントシアニンの３′位及び５′位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
    　（１－ｅ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、アントシアニンの３′位及び５′位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    からなる群から選択される第１のポリヌクレオチド、及び
    　以下の（２－ａ）～（２－ｅ）：
    　（２－ａ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    　（２－ｂ）配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボノイドの３′位及び５′位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    　（２－ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    　（２－ｄ）配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボノイドの３′位及び５′位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
    　（２－ｅ）配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボノイドの３′位及び５′位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    からなる群から選択される第２のポリヌクレオチドを含む、発現カセット。
  2. 　前記第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第１のプロモーター及び第１のターミネーター、ならびに前記第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結された第２のプロモーター及び第２のターミネーターをさらに含む、請求項１に記載の発現カセット。
  3. 　前記第１のプロモーターがキクF3Hプロモーターであり、そして前記第１のターミネーターがアラビドプシスHSPターミネーター又はアグロバクテリウムnosターミネーターである、請求項２に記載の発現カセット。
  4. 　前記第２のプロモーターがキクF3Hプロモーターであり、そして前記第２のターミネーターがアラビドプシスHSPターミネーター又はアグロバクテリウムnosターミネーターである、請求項２又は３に記載の発現カセット。
  5. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の発現カセットを含むベクター。
  6. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の発現カセットを含む形質転換キク植物、又はその自殖もしくは他殖後代、あるいはそれらの栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞。
  7. 　花弁においてチョウマメ由来アントシアニン3′,5′-O-グルコシル基転移酵素遺伝子(CtA3′5′GT）及びカンパニュラ由来フラボノイド3′,5′-水酸化酵素遺伝子（CamF3′5′H）が共発現している、請求項６に記載の形質転換キク植物、又はその自殖もしくは他殖後代、あるいはそれらの栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞。
  8. 　デルフィニジン3-(6′′-マロニル)グルコシド-3′5′-ジグルコシド（テルナチンC5）及び／またはデルフィニジン3,3′,5′-トリグルコシド（プレテルナチンC5）を含有する、請求項６又は７に記載の形質転換キク植物、又はその自殖もしくは他殖後代、あるいはそれらの栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞。
  9. 　請求項６～８のいずれか１項に記載の形質転換キク植物又はその自殖もしくは他殖後代の切り花、あるいは該切り花から作成された加工品。
  10. 　青系花色を有する形質転換キク植物を作製するための方法であって、
    　宿主に以下の（１－ａ）～（１－ｅ）：
    　（１－ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    　（１－ｂ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、アントシアニンの３′位及び５′位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    　（１－ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    　（１－ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アントシアニンの３′位及び５′位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
    　（１－ｅ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、アントシアニンの３′位及び５′位の水酸基に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    からなる群から選択される第１のポリヌクレオチド、及び／又は
    　以下の（２－ａ）～（２－ｅ）：
    　（２－ａ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    　（２－ｂ）配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボノイドの３′位及び５′位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    　（２－ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    　（２－ｄ）配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボノイドの３′位及び５′位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
    　（２－ｅ）配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボノイドの３′位及び５′位を水酸化する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    からなる群から選択される第２のポリヌクレオチドを導入する工程を含む、方法。
  11. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の発現カセット又は請求項５に記載のベクターで宿主を形質転換することによって行われる、請求項１０に記載の方法。
  12. 　前記青系花色が、RHSカラーチャートでBlueグループもしくはViolet-Blueグループ、かつ／又はCIEL*a*b*表色系の色相角で230°～290°を示す、請求項１０又は１１に記載の方法。
  13. 　請求項１０～１２のいずれか１項に記載の方法によって作成された形質転換キク植物、又はその自殖もしくは他殖後代、あるいはそれらの栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞。
  14. 　請求項１３に記載の形質転換キク植物又はその自殖もしくは他殖後代の切り花、あるいは該切り花から作成された加工品。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017169699A1 (ja) * 2016-03-31 2017-10-05 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 青系花色を有する植物及びその作出方法
WO2019009257A1 (ja) * 2017-07-03 2019-01-10 サントリーホールディングス株式会社 マロニル基転移酵素遺伝子の使用
WO2019069946A1 (ja) * 2017-10-03 2019-04-11 サントリーホールディングス株式会社 青系花色を有する形質転換植物及びその作出方法
US10870861B2 (en) 2015-07-01 2020-12-22 Suntory Holdings Limited Creation of chrysanthemum with blue flower color
US11685928B2 (en) 2020-09-30 2023-06-27 Nobell Foods, Inc. Recombinant fusion proteins for producing milk proteins in plants

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10894812B1 (en) 2020-09-30 2021-01-19 Alpine Roads, Inc. Recombinant milk proteins
AU2021353004A1 (en) 2020-09-30 2023-04-13 Nobell Foods, Inc. Recombinant milk proteins and food compositions comprising the same
CN113186207A (zh) * 2020-12-28 2021-07-30 南京农业大学 一种通过转蓝目菊OhF3’5’H基因培育蓝色菊花的方法
CN113278648B (zh) * 2021-03-05 2023-06-16 南京农业大学 一种通过共转飞燕草苷合成相关基因培育蓝色菊花的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005095005A (ja) * 2003-09-22 2005-04-14 Aomori Prefecture 新規グルコシル基転移酵素遺伝子
WO2010122849A1 (ja) * 2009-04-24 2010-10-28 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 デルフィニジンを花弁に含有するキク植物を生産する方法

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0656951B1 (en) 1992-08-05 2006-03-22 INTERNATIONAL FLOWER DEVELOPMENTS Pty. Ltd. Genetic sequences encoding flavonol synthase enzymes and uses therefor
JPH0970290A (ja) 1995-02-17 1997-03-18 Suntory Ltd アシル基転移活性を有する蛋白質をコードする遺伝子
JP4368005B2 (ja) 1999-01-29 2009-11-18 インターナショナル フラワー ディベロプメンツ プロプライアタリー リミティド フラボン合成酵素をコードする遺伝子
WO2002086110A2 (de) 2001-04-20 2002-10-31 Technische Universität München Flavonsynthase i enzyme und deren verwendung
JP5598830B2 (ja) 2004-10-29 2014-10-01 サントリーホールディングス株式会社 アントシアニンの３’位への芳香族アシル基転移酵素をコードする遺伝子を用いたアントシアニン色素の安定化ならびに青色化方法
WO2006105598A1 (en) 2005-04-04 2006-10-12 Vereniging Voor Christelijk Hoger Onderwijs, Wetenschappelijk Onderzoek En Patiëntenzorg Plant genetic sequences associated with vacuolar ph and uses thereof
JP4853853B2 (ja) 2005-10-20 2012-01-11 地方独立行政法人青森県産業技術センター 新規芳香族アシル基転移酵素遺伝子
AU2008264439A1 (en) 2007-06-20 2008-12-24 Suntory Holdings Limited Rose containing flavone, and method for production thereof
US20100287668A1 (en) 2007-06-20 2010-11-11 International Flower Developments Proprietary Limi ted Rose containing flavone and delphinidin, and method for production thereof
BRPI0823018A2 (pt) 2008-09-04 2019-02-26 Suntory Holdings Ltd polinucleotídeo, proteína codificada pelo polinucleotídeo, vetor, transformante, métodos para produzir a proteína e para produzir um conjugado glicuronídeo.
USPP21595P3 (en) 2008-12-19 2010-12-28 International Flower Developments Pty Ltd. Dianthus plant named ‘Floriagate’
WO2011016260A1 (ja) 2009-08-07 2011-02-10 国立大学法人東京農工大学 新規糖転移酵素、新規糖転移酵素遺伝子および新規糖供与体化合物
US9365836B2 (en) 2011-01-14 2016-06-14 Suntory Holdings Limited Glycosyltransferase gene and use thereof
CA2870428A1 (en) 2012-04-16 2013-10-24 Suntory Holdings Limited Novel campanula flavonoid 3',5'-hydroxylase gene and its use
CN103695382B (zh) * 2013-12-16 2016-08-17 上海交通大学 郁金香类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶Tf3GT蛋白及其编码基因
RU2016147263A (ru) 2014-05-02 2018-06-05 Сантори Холдингз Лимитед Новый ген гликозилтрансферазы и его применение
US10870861B2 (en) 2015-07-01 2020-12-22 Suntory Holdings Limited Creation of chrysanthemum with blue flower color

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005095005A (ja) * 2003-09-22 2005-04-14 Aomori Prefecture 新規グルコシル基転移酵素遺伝子
WO2010122849A1 (ja) * 2009-04-24 2010-10-28 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 デルフィニジンを花弁に含有するキク植物を生産する方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NODA, NAONOBU ET AL.: "Genetic Engineering of Novel Bluer-Colored Chrysanthemums Produced by Accumulation of Delphinidin-Based Anthocyanins", PLANT CELL PHYSIOLOGY, vol. 54, no. 10, 2013, pages 1684 - 1695 *
SASAKI, NOBUHIRO ET AL.: "Achievements and Perspectives in Biochemistry Concerning Anthocyanin Modification for Blue Flower Coloration", PLANT CELL PHYSIOLOGY, vol. 56, no. 1, January 2015 (2015-01-01), pages 28 - 40 *
YOSHIAKI KANNO ET AL.: "Chomame Yurai Anthocyanin 3',5'-O-Glucosyl-ki Ten'i Koso Idenshi o Donyu shita Keishitsu Tenkan Lobelia no Kaiseki", JAPANESE SOCIETY FOR PLANT CELL AND MOLECULAR BIOLOGY TSUKUBA TAIKAI · SYMPOSIUM KOEN YOSHISHU, vol. 24, 2006, pages 40 *
YOSHIDA, KUMI ET AL.: "Blue flower color development by anthocyanins: from chemical structure to cell physiology", NATURAL PRODUCT REPORTS, vol. 26, 2009, pages 884 - 915, XP002727680, DOI: doi:10.1039/B800165K *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10870861B2 (en) 2015-07-01 2020-12-22 Suntory Holdings Limited Creation of chrysanthemum with blue flower color
WO2017169699A1 (ja) * 2016-03-31 2017-10-05 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 青系花色を有する植物及びその作出方法
US11299742B2 (en) 2016-03-31 2022-04-12 Suntory Holdings Limited Plant having blue flower color and breeding method therefor
WO2019009257A1 (ja) * 2017-07-03 2019-01-10 サントリーホールディングス株式会社 マロニル基転移酵素遺伝子の使用
JPWO2019009257A1 (ja) * 2017-07-03 2020-05-21 サントリーホールディングス株式会社 マロニル基転移酵素遺伝子の使用
JP7146754B2 (ja) 2017-07-03 2022-10-04 サントリーホールディングス株式会社 マロニル基転移酵素遺伝子の使用
WO2019069946A1 (ja) * 2017-10-03 2019-04-11 サントリーホールディングス株式会社 青系花色を有する形質転換植物及びその作出方法
US11685928B2 (en) 2020-09-30 2023-06-27 Nobell Foods, Inc. Recombinant fusion proteins for producing milk proteins in plants

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