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WO2017002943A1 - 癌組織の不均一性マーカー及びその使用 - Google Patents

癌組織の不均一性マーカー及びその使用 Download PDF

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WO2017002943A1
WO2017002943A1 PCT/JP2016/069529 JP2016069529W WO2017002943A1 WO 2017002943 A1 WO2017002943 A1 WO 2017002943A1 JP 2016069529 W JP2016069529 W JP 2016069529W WO 2017002943 A1 WO2017002943 A1 WO 2017002943A1
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WO
WIPO (PCT)
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cancer
calml3
lgals7
clca2
csta
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2016/069529
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English (en)
French (fr)
Inventor
秀行 佐谷
好美 有馬
隆 千場
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Keio University
Original Assignee
Keio University
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Publication date
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Priority to US15/740,214 priority patent/US20180188258A1/en
Priority to EP16818051.1A priority patent/EP3318632B8/en
Priority to JP2017503971A priority patent/JP6202659B2/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a cancer tissue heterogeneity marker and use thereof. More specifically, a gene marker for determining whether a cancer tissue contains a heterogeneous cancer cell population, a protein marker, a kit, and a method for determining whether a cancer tissue sample contains a heterogeneous cancer cell population About.
  • This application claims priority on July 1, 2015 based on Japanese Patent Application No. 2015-133303 for which it applied to Japan, and uses the content here.
  • Non-Patent Document 1 It is known that cancer cells with different properties may coexist in one cancer tissue. Such a condition is called intratumor heterogeneity, and is considered to be one of the causes that make cancer treatment difficult (see, for example, Non-Patent Document 1).
  • Tumor heterogeneity is an active process maintained by a mutant EGFR-induced cytokine circuit in glioblastoma., Genes Dev., 24 (16), 1731-1745, 2010.
  • an object of the present invention is to provide a genetic marker for determining whether or not a cancer tissue contains a heterogeneous cancer cell population.
  • the present invention also provides a protein marker for determining whether or not a cancer tissue contains a heterogeneous cancer cell population, a kit for determining whether or not a cancer tissue contains a heterogeneous cancer cell population, and a cancer tissue that is heterogeneous. It is an object of the present invention to provide a method for determining whether or not a cancer cell population is included.
  • the present invention is as follows. (1) Calmodulin-like protein 3 (CALML3), Biglycan (BGN), Chloride channel accession 2 (CLCA2), Cystatin A (CSTA), Aldehyde dehydrogenase Whether the cancer tissue includes a heterogeneous cancer cell population selected from the group consisting of S100-calcium-binding protein A8 (S100A8), Elastin (ELN), SNRPN upstream reading frame (SNURF), and Galectin-7 (LGALS7) Genetic marker for determining whether or not.
  • the cancer tissue contains a heterogeneous cancer cell population encoded by a gene selected from the group consisting of CALML3, BGN, CLCA2, CSTA, ALDH1A1, NGFR, S100A8, ELN, SNURF and LGALS7 Protein marker for determination.
  • a marker for prognosis of cancer comprising a gene selected from the group consisting of CALML3, BGN, CLCA2, CSTA, ALDH1A1, NGFR, S100A8, ELN, SNURF and LGALS7, or a protein encoded by the gene.
  • a heterogeneous cancer tissue comprising a specific binding substance for a protein encoded by at least one gene selected from the group consisting of SNURF and LGALS7 Whether or not the determination kit including a cancer cell population.
  • the method for determining whether or not the cancer tissue sample includes a heterogeneous cancer cell population is (7) The determination method according to (6), wherein the detection step is performed by detecting mRNA of the gene. (8) The determination method according to (6), wherein the detection step is performed by detecting a protein encoded by the gene.
  • the breast cancer is an estrogen receptor ( ⁇ ) progesterone receptor ( ⁇ ) HER2 ( ⁇ ) breast cancer.
  • the heterogeneous cancer cell population includes ZEB1 (+) CLDN1 ( ⁇ ) cells and ZEB1 ( ⁇ ) CLDN1 (+) cells.
  • (13) A heterogeneous cancer cell population expressing a gene selected from the group consisting of CALML3, BGN, CLCA2, CSTA, ALDH1A1, NGFR, S100A8, ELN, SNURF, and LGALS7.
  • a genetic marker and a cDNA marker for determining whether or not a cancer tissue contains a heterogeneous cancer cell population.
  • a protein marker for determining whether or not a cancer tissue contains a heterogeneous cancer cell population a kit for determining whether or not a cancer tissue contains a heterogeneous cancer cell population, and a cancer cell population with a heterogeneous cancer tissue can be provided.
  • (A) is a graph showing the analysis results of the expression of the ZEB1 gene in a plurality of breast cancer cell lines.
  • (B) is a graph showing the analysis results of CLDN1 gene expression in a plurality of breast cancer cell lines.
  • 10 is a graph showing the results of Experimental Example 3.
  • (A) is a photograph showing the result of staining a sliced tissue specimen of cancer tissue with an anti-ZEB1 antibody.
  • (B) is a photograph showing the result of staining a sliced tissue specimen with almost the same visual field as (a) with an anti-CLDN1 antibody.
  • (A) And (b) is a graph which shows the result of Experimental example 6.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of Experimental Example 7. It is a figure which shows the analysis result of Experimental example 8.
  • (A) to (j) are photographs showing the results of Experimental Example 10.
  • (A) to (j) are graphs showing the results of quantitative real-time PCR of Experimental Example 11.
  • the present invention includes CALML3 (Calmodulin-like protein 3, accession number: NM_005185, SEQ ID NO: 25), BGN (Biglycan, accession number: NM_001711, SEQ ID NO: 26), CLCA2 (Chloride channel accessor, Accession number: NM — 006536, SEQ ID NO: 27), CSTA (Cystatin A (Stefin A), Accession number: NM — 005213, SEQ ID NO: 28), ALDH1A1 (Aldehyde dehydrogenase 1 family, member A1, Accession number: NM_0006 ), NGFR (Nerve growth factor receive) or, accession number: NM_002507, SEQ ID NO: 30), S100A8 (S100-calcium-binding protein A8, accession number: NM_002964, SEQ ID NO: 31), ELN (Elastin,
  • the marker of this embodiment is selected from the group consisting of CALML3 cDNA, BGN cDNA, CLCA2 cDNA, CSTA cDNA, ALDH1A1 cDNA, NGFR cDNA, S100A8 cDNA, ELN cDNA, SNURF cDNA, and LGALS7 cDNA, and has no cancer tissue. It may be a cDNA marker for determining whether or not it contains a uniform cancer cell population.
  • the inventors have unexpectedly considered that by mixing a cell line that does not form a tumor with a single transplant and a cell line that also forms a tumor with a single transplant and transplanting it into a nude mouse.
  • a cancer tissue composed of a heterogeneous cell population could be prepared.
  • the present invention is completed by identifying CALML3, BGN, CLCA2, CSTA, ALDH1A1, NGFR, S100A8, ELN, SNURF, and LGALS7 as genes that are specifically expressed in cancer tissues including heterogeneous cancer cell populations. did.
  • the expression of any one or more of these genes is detected in a cancer tissue, it can be determined that the cancer tissue contains a heterogeneous cancer cell population.
  • a gene and cDNA selected from the group consisting of CALML3, BGN, CLCA2, CSTA, ALDH1A1, NGFR, S100A8, ELN, SNURF and LGALS7 are gene markers for prognosis of cancer.
  • a cancer patient having the cancer tissue can be predicted to have a poor prognosis.
  • poor prognosis means that cancer cells grow rapidly, cancer metastasis ability is high, cancer tissue resistance is high, or patient survival is low.
  • the above gene marker may be a splicing variant of the above gene by alternative splicing or the like.
  • the gene marker may be a mutant of the gene including a single nucleotide polymorphism (SNP).
  • the marker for determining whether or not the cancer tissue contains a heterogeneous cancer cell population may be a protein encoded by the above gene. That is, the determination marker may be a protein marker.
  • a protein encoded by a gene selected from the group consisting of CALML3, BGN, CLCA2, CSTA, ALDH1A1, NGFR, S100A8, ELN, SNURF, and LGALS7 is a protein for determining prognosis of cancer. It can also be said to be a marker.
  • Expression of the above gene marker or protein marker in cancer tissue can be detected by RT-PCR, DNA array analysis, Northern blotting, immunostaining, ELISA, Western blotting, flow cytometry analysis and the like.
  • CALML3, BGN, CLCA2, CSTA, ALDH1A1, NGFR, S100A8, ELN, SNURF and LGALS7 genes, cDNA, or the gene is encoded.
  • CALML3, CLCA2, CSTA and LGALS7 genes, cDNA, or a protein encoded by the gene is more preferable.
  • the expression of CALML3, CLCA2, CSTA, and LGALS7 genes has been confirmed in human breast cancer clinical samples.
  • the present invention provides a primer set for amplifying a cDNA of at least one gene selected from the group consisting of CALML3, BGN, CLCA2, CSTA, ALDH1A1, NGFR, S100A8, ELN, SNURF and LGALS7, CALML3 , BGN, CLCA2, CSTA, ALDH1A1, NGFR, S100A8, ELN, SNURF, and LGALS7, a probe that specifically hybridizes to mRNA of at least one gene, or CALML3, BGN, CLCA2, CSTA, ALDH1A1 A specific binding substance for a protein encoded by at least one gene selected from the group consisting of NGFR, S100A8, ELN, SNURF and LGALS7, Comprising, providing whether determination kit cancerous tissue comprises a heterogeneous population of cancer cells.
  • the kit of this embodiment is a prognosis determination kit for cancer.
  • the kit of this embodiment includes a primer set for amplifying cDNA of at least one gene selected from the group consisting of CALML3, BGN, CLCA2, CSTA, ALDH1A1, NGFR, S100A8, ELN, SNURF and LGALS7. Also good.
  • the sequence of the primer set is not particularly limited as long as at least a part of cDNA of these genes can be amplified.
  • Specific examples of the base sequence of the primer set include those described later in the examples.
  • At least one primer constituting the above primer set may have a base sequence including the boundary between exons in the base sequence of any of the above genes. Such a primer has a base sequence that does not exist in nature.
  • the kit of this embodiment includes a probe that specifically hybridizes to mRNA of at least one gene selected from the group consisting of CALML3, BGN, CLCA2, CSTA, ALDH1A1, NGFR, S100A8, ELN, SNURF, and LGALS7. May be.
  • the probe may be a nucleic acid fragment having a base sequence complementary to the base sequence of at least a part of the mRNA of the above gene, for example.
  • the probe may have various chemical modifications for the purpose of improving stability, specificity during hybridization, and the like.
  • the phosphate residue may be substituted with a chemically modified phosphate residue such as phosphorothioate (PS), methylphosphonate, phosphorodithionate, etc.
  • at least one part may be comprised with nucleic acid analogs, such as a peptide nucleic acid (PNA).
  • PNA peptide nucleic acid
  • the probe may have a base sequence including a boundary between exons in the base sequence of any of the above genes.
  • Such a probe has a base sequence that does not exist in nature.
  • the probe may be fixed on a solid phase.
  • the solid phase include beads, a plate substrate, and a film.
  • the probe may be fixed to the surface of the plate substrate to form a microarray, for example.
  • RNA is extracted from a cancer tissue sample, labeled with a fluorescent substance, hybridized with the microarray, and RNA bound to the probe on the microarray is detected, thereby expressing the above gene in the cancer tissue. Can be detected.
  • the expression of any one or more of the above genes is detected, it can be determined that the cancer tissue contains a heterogeneous cancer cell population.
  • the kit of this embodiment comprises a specific binding substance for a protein encoded by at least one gene selected from the group consisting of CALML3, BGN, CLCA2, CSTA, ALDH1A1, NGFR, S100A8, ELN, SNURF and LGALS7. May be.
  • Examples of specific binding substances include antibodies, antibody fragments, aptamers and the like.
  • the antibody can be produced, for example, by immunizing an animal such as a mouse with the above protein as an antigen. Alternatively, it can be prepared by screening an antibody library such as a phage library.
  • Examples of antibody fragments include Fv, Fab, scFv and the like. The above antibody or antibody fragment may be polyclonal or monoclonal.
  • An aptamer is a substance having a specific binding ability to a labeling substance.
  • examples of aptamers include nucleic acid aptamers and peptide aptamers.
  • the nucleic acid aptamer having a specific binding ability to the protein can be selected by, for example, the systematic evolution of ligand by exponential enrichment (SELEX) method.
  • the peptide aptamer having a specific binding ability to the above protein can be selected by, for example, a two-hybrid method using yeast.
  • the specific binding substance is not particularly limited as long as it can specifically bind to the above protein, and may be a commercially available one.
  • the presence of the protein can be detected by immunostaining a sliced specimen of a fixed cancer tissue using the specific binding substance.
  • the detection of the presence of the protein may be performed by Western blotting, ELISA, or flow cytometry analysis.
  • the presence of any one or more of the above proteins indicates that the cancer tissue contains a heterogeneous cancer cell population.
  • the present invention detects the expression of at least one gene selected from the group consisting of CALML3, BGN, CLCA2, CSTA, ALDH1A1, NGFR, S100A8, ELN, SNURF and LGALS7 in a cancer tissue sample.
  • a detection step and a step of determining that the cancer tissue sample includes a heterogeneous cancer cell population when expression of the gene is detected, whether or not the cancer tissue sample includes a heterogeneous cancer cell population A method for determining whether or not
  • the determination method of the present embodiment is a cancer prognosis determination method.
  • the detection step may be performed by detecting mRNA of the gene. Alternatively, the detection step may be performed by detecting a protein encoded by the gene.
  • the mRNA of the above gene can be detected by RT-PCR, DNA array analysis, Northern blotting, or the like.
  • the protein encoded by the gene can be detected by immunostaining, ELISA, Western blotting, flow cytometry analysis, or the like.
  • the cancer tissue sample contains a heterogeneous cancer cell population.
  • the above cancer tissue sample may be derived from breast cancer, melanoma, lung cancer or pancreatic cancer. Some of these cancers contain a heterogeneous cancer cell population, and those containing a heterogeneous cancer cell population are known to have a poor prognosis.
  • the breast cancer may be an estrogen receptor ( ⁇ ) progesterone receptor ( ⁇ ) HER2 ( ⁇ ) breast cancer, that is, a breast cancer that does not express an estrogen receptor, a progesterone receptor and HER2.
  • ⁇ progesterone receptor
  • HER2 HER2
  • Such a breast cancer is also called a triple negative breast cancer, and is known to have a poor prognosis.
  • the heterogeneous cancer cell population includes ZEB1 (+) CLDN1 ( ⁇ ) cells, ie, cells expressing ZEB1 but not CLDN1, and ZEB1 ( ⁇ ) CLDN1 (+) cells, ie, expressing ZEB1. And cells expressing CLDN1 may be included.
  • ZEB1 Zinc finger E-box-binding homebox 1
  • epithelial-mesenchymal transition which is a phenomenon in which epithelial cells lose their cell polarity and cell adhesion function with surrounding cells and acquire migration and invasion ability to change into mesenchymal-like cells It is a transcription factor.
  • CLDN1 Claudin1
  • cancer tissues containing a heterogeneous cancer cell population include cancer tissues containing ZEB1 (+) CLDN1 ( ⁇ ) cells and ZEB1 ( ⁇ ) CLDN1 (+) cells. .
  • the present invention provides a heterogeneous cancer cell population that expresses a gene selected from the group consisting of CALML3, BGN, CLCA2, CSTA, ALDH1A1, NGFR, S100A8, ELN, SNURF and LGALS7.
  • the cancer cell population of the present embodiment is preferably formed in vivo. As described later in the Examples, for example, transplanting a mixture of cancer cells that are ZEB1 (+) CLDN1 ( ⁇ ) and cancer cells that are ZEB1 ( ⁇ ) CLDN1 (+) to immunodeficient mice, A heterogeneous cancer cell population can be formed as a cancer tissue of a tumor-bearing mouse.
  • the present invention provides a cDNA of a gene selected from the group consisting of CALML3, BGN, CLCA2, CSTA, ALDH1A1, NGFR, S100A8, ELN, SNURF and LGALS7.
  • these cDNAs can be used as genetic markers for determining whether or not a cancer tissue contains a heterogeneous cancer cell population, or as markers for determining the prognosis of cancer.
  • the present invention selects a cancer tissue sample from a patient, and is selected from the group consisting of CALML3, BGN, CLCA2, CSTA, ALDH1A1, NGFR, S100A8, ELN, SNURF, and LGALS7 in the cancer tissue sample.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a method for detecting the expression of the gene in a cancer tissue sample is provided.
  • the present invention selects a cancer tissue sample from a patient, and is selected from the group consisting of CALML3, BGN, CLCA2, CSTA, ALDH1A1, NGFR, S100A8, ELN, SNURF, and LGALS7 in the cancer tissue sample.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a method for determining whether a cancer tissue sample contains a heterogeneous cancer cell population is provided. It can also be said that the determination method of the present embodiment is a cancer prognosis determination method.
  • FIG. 1 (a) is a graph showing the analysis results of the expression of the ZEB1 gene in each breast cancer cell line.
  • FIG.1 (b) is a graph which shows the analysis result of the expression of CLDN1 gene in each breast cancer cell line.
  • the inventors found that the MDA-MB-231 cell line was ZEB1 (+) CLDN1 ( ⁇ ). It was also found that the HCC1937 cell line is ZEB1 ( ⁇ ) CLDN1 (+).
  • MDA-MB-231 cell line and HCC1937 cell line are preferably combined such that the number of cells in the HCC1937 cell line is greater than the number of cells in the MDA-MB-231 cell line: MDA-MB-
  • a 9: 1 mixed mixture was transplanted into the 4th mammary adipose tissue of an immunodeficient mouse (4 weeks old, female, BALB / c-nu) so that the cell number of the 231 cell line was 2: 1 or more.
  • a tumor-bearing mouse was prepared (hereinafter sometimes referred to as “Mix mouse”).
  • FIG. 2 is a graph showing changes over time in tumor volume in each tumor-bearing mouse. As a result, it was revealed that no tumor was formed in 1937 mice transplanted with only the HCC1937 cell line. In addition, although no tumor was formed in 1937 mice, tumors were formed in the Mix mice transplanted with the MCC-MB-231 cell line mixed with the HCC1937 cell line. In addition, it was revealed that a larger tumor was formed in the Mix mouse than in the 231 mouse transplanted with only the same number of MDA-MB-231 cell lines.
  • Example 4 Immunostaining of cancer tissues of tumor-bearing mice
  • a cancer tissue was excised from a Mix mouse prepared in the same manner as in Experimental Example 2 16 days after the transplantation of the cancer cell line. Subsequently, the excised cancer tissue was fixed with paraformaldehyde and embedded in paraffin. Subsequently, sliced tissue specimens of cancer tissues were prepared, and the expression of ZEB1 protein and CLDN1 protein was examined by immunostaining.
  • FIG. 3 (a) is a photograph showing the result of staining a sliced tissue sample of cancer tissue with an anti-ZEB1 antibody (catalog number “sc-10572”, Santa Cruz).
  • FIG. 3 (b) is a photograph showing the result of staining a sliced tissue specimen having almost the same visual field as FIG. 3 (a) with an anti-CLDN1 antibody (catalog number “ab15098”, Abcam).
  • ZEB1 (+) CLDN1 ( ⁇ ) cells and ZEB1 ( ⁇ ) CLDN1 (+) cells exist in a mixture in the cancer tissues of Mix mice, and heterogeneous cancer tissues are formed. Was confirmed.
  • a model mouse having heterogeneous cancer tissue can be produced by transplanting a mixture of the MDA-MB-231 cell line and the HCC1937 cell line into an immunodeficient mouse.
  • heterogeneous cancer tissues formed larger tumors, indicating that the malignancy is higher than that of uniform cancer tissues.
  • FIG. 4 (a) is a graph showing the results of 231 mice.
  • FIG.4 (b) is a graph which shows the result of a Mix mouse.
  • “paclitaxel” indicates the result of the paclitaxel administration group
  • “control” indicates the result of the control group.
  • Example 7 (Examination of the prognosis of patients with ZEB1 (+) CLDN1 (+) breast cancer) Microarray gene expression analysis results of cancer tissue samples derived from 295 breast cancer patients (ChangH. Y. et al., Robustness, scalability, and integration of a wound-response geneexpression signature in predicting breast cancer survival., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 102 (10), 3738-3743, 2005.
  • FIG. 5 is a graph showing the examination results. As a result, it became clear that the survival rate of ZEB1 (+) CLDN1 (+) breast cancer patients is low. From this result, it was shown that the heterogeneous cancer tissue has higher malignancy.
  • RNA samples were extracted from each cancer-bearing mouse, and RNA was extracted. Subsequently, a library was prepared using a kit (trade name “TruSeq RNA Sample Preparation Kit v2”, Illumina). Subsequently, sequence analysis was performed using a next-generation sequencer (model “Genome Analyzer IIx”, Illumina), and bioinformatics analysis was performed.
  • the detected base sequence was separated into a human-derived base sequence and a mouse-derived base sequence using the software “Xenome”. Subsequently, the obtained base sequence data was mapped to a reference sequence using software “Tophat”. Subsequently, the mapped base sequence data was visualized together with the known gene sequence, and the mRNA expression between the samples was compared using the software “Avadis”.
  • FIG. 6 is a diagram showing an analysis result using the software “Avadis”.
  • cancer tissues were extracted from Mix mice, 231 mice, and 1937 mice prepared in the same manner as in Experimental Example 2, and RNA was extracted from a part thereof. A part was fixed with paraformaldehyde and embedded in paraffin, and used for later experiments.
  • cDNA was synthesized from the extracted RNA, and the expression of the candidate gene was analyzed by quantitative real-time PCR.
  • the CALML3, BGN, CLCA2, CSTA, ALDH1A1, NGFR, S100A8, ELN, SNURF and LGALS7 genes which were hardly expressed in the 231 and 1937 mice in the transcriptome analysis of Example 8, were quantitatively real-time. It was also confirmed by PCR that it was highly expressed in cancer tissues of Mix mice. That is, since these genes are transplanted by mixing MDA-MB-231 cells and HCC1937 cells, the cancer cell population exhibits heterogeneity and high expression is detected. It was shown that it can be used as a genetic marker for determining whether or not it is contained.
  • CALML3, BGN, CLCA2, CSTA, ALDH1A1, NGFR, ELN, and LGALS7 genes were not observed to increase in expression even when MDA-MB-231 cells and HCC1937 cells were mixed in in vitro experiments described below. Regardless (see FIG. 8), high expression was shown in cancer tissues of Mix mice. In the transcriptome analysis, the difference in the expression level was large compared to the expression level in cancer tissues of 231 and 1937 mice.
  • Table 1 shows the names and sequence numbers of primers used for quantitative real-time PCR of CALML3, BGN, CLCA2, CSTA, ALDH1A1, NGFR, S100A8, ELN, SNURF and LGALS7 genes.
  • tissue tissue specimens were prepared by slicing the cancer tissue specimens of the Mix mouse and 231 mouse prepared in Experimental Example 9, and were subjected to hematoxylin-eosin staining and immunostaining.
  • FIGS. 7A to 7J are photographs showing typical results of immunostaining.
  • FIG. 7A is a photograph showing the result of staining a cancer tissue specimen of a Mix mouse with an anti-CALML3 antibody (catalog number “GTX114954”, Gene Tex).
  • FIG. 7 (b) is a photograph showing the result of staining a cancer tissue specimen of 231 mice with an anti-CALML3 antibody (same as above) as a control.
  • FIG. 7 (c) is a photograph showing the result of staining a cancer tissue specimen of a Mix mouse with an anti-CLCA2 antibody (catalog number “NBP2-33482”, Novus Biologicals).
  • FIG. 7A is a photograph showing the result of staining a cancer tissue specimen of a Mix mouse with an anti-CLCA2 antibody (catalog number “NBP2-33482”, Novus Biologicals).
  • FIG. 7A is a photograph showing the result of staining a cancer tissue specimen of a Mix
  • FIG. 7 (d) is a photograph showing the result of staining a cancer tissue specimen of 231 mice with an anti-CLCA2 antibody (same as above) as a control.
  • FIG. 7 (e) is a photograph showing a result of staining a cancer tissue specimen of a Mix mouse with an anti-CSTA antibody (catalog number “HPA001031”, ATRAS antibodies).
  • FIG. 7 (f) is a photograph showing the result of staining a cancer tissue specimen of 231 mice with an anti-CSTA antibody (same as above) as a control.
  • FIG. 7 (g) is a photograph showing the result of staining a cancer tissue specimen of a Mix mouse with an anti-LGALS7 antibody (catalog number “HPA001549”, ATRAS antibodies).
  • FIG. 7 (h) is a photograph showing the result of staining a cancer tissue specimen of 231 mice with an anti-LGALS7 antibody (same as above) as a control.
  • FIG. 7 (i) is a photograph showing a result of staining a cancer tissue specimen of a Mix mouse with an anti-S100A8 antibody (catalog number “NBP2-25269”, Novus Biologicals).
  • FIG. 7 (j) is a photograph showing the result of staining a cancer tissue specimen of 231 mice with an anti-S100A8 antibody (same as above) as a control.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of quantitative real-time PCR.
  • 231 indicates a result of 231 cells
  • 1937 indicates a result of 1937 cells
  • mixture indicates a mixture of 231 cells and 1937 cells in a 1: 1 ratio. Indicates the result.
  • the gene marker for determining whether or not the cancer tissue contains a heterogeneous cancer cell population is not highly expressed simply by mixing and culturing cancer cells in vitro, and the heterogeneous cancer cell population in vivo. It became clear that it was highly expressed for the first time.
  • immunohistochemical staining was performed using a formalin-fixed paraffin-embedded sliced tissue specimen of a tissue obtained by surgery of a breast cancer patient for whom informed consent was obtained, and CALML3, CLCA2, CSTA And the expression of LGALS7 protein was examined.
  • a genetic marker for determining whether or not a cancer tissue contains a heterogeneous cancer cell population can be provided.
  • a protein marker for determining whether or not a cancer tissue contains a heterogeneous cancer cell population a kit for determining whether or not a cancer tissue contains a heterogeneous cancer cell population, and a cancer cell population with a heterogeneous cancer tissue can be provided.

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Abstract

ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用遺伝子マーカー。

Description

癌組織の不均一性マーカー及びその使用
　本発明は、癌組織の不均一性マーカー及びその使用に関する。より具体的には、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用遺伝子マーカー、タンパク質マーカー、キット、及び癌組織試料が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定方法に関する。本願は、２０１５年７月１日に、日本に出願された特願２０１５－１３３０３３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　１つの癌組織中に性質の異なる癌細胞が混在している場合があることが知られている。このような状態は、腫瘍内不均一性（intratumor heterogeneity）と呼ばれ、癌治療を困難にしている一因であると考えられている（例えば、非特許文献１を参照。）。
Inda M. M., et al., Tumor heterogeneity is an active process maintained by a mutant EGFR-induced cytokine circuit in glioblastoma., Genes Dev., 24(16), 1731-1745, 2010.
　従来、癌組織の不均一性（癌組織が不均一な癌細胞集団を含む状態）を判定する方法は知られていなかった。そこで、本発明は、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用遺伝子マーカーを提供することを目的とする。本発明はまた、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用タンパク質マーカー、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用キット、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定方法を提供することを目的とする。
　本発明は以下の通りである。
（１）Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　３（ＣＡＬＭＬ３）、Ｂｉｇｌｙｃａｎ（ＢＧＮ）、Ｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｃｈａｎｎｅｌ　ａｃｃｅｓｓｏｒｙ　２（ＣＬＣＡ２）、Ｃｙｓｔａｔｉｎ　Ａ（ＣＳＴＡ）、Ａｌｄｅｈｙｄｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　１　ｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ　Ａ１（ＡＬＤＨ１Ａ１）、Ｎｅｒｖｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮＧＦＲ）、Ｓ１００－ｃａｌｃｉｕｍ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ８（Ｓ１００Ａ８）、Ｅｌａｓｔｉｎ（ＥＬＮ）、ＳＮＲＰＮ　ｕｐｓｔｒｅａｍ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ（ＳＮＵＲＦ）及びＧａｌｅｃｔｉｎ－７（ＬＧＡＬＳ７）からなる群より選択される、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用遺伝子マーカー。
（２）ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される遺伝子にコードされる、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用タンパク質マーカー。
（３）ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される遺伝子、又は前記遺伝子にコードされるタンパク質からなる、癌の予後判定用マーカー。
（４）ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、又はＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子にコードされるタンパク質に対する特異的結合物質、を備える、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用キット。
（５）ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、又はＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子にコードされるタンパク質に対する特異的結合物質、を備える、癌の予後判定用キット。
（６）癌組織試料中の、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を検出する検出工程と、前記遺伝子の発現が検出された場合に前記癌組織試料は不均一な癌細胞集団を含むと判定する工程と、を備える、癌組織試料が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定方法。
（７）前記検出工程は、前記遺伝子のｍＲＮＡを検出することにより行われる、（６）に記載の判定方法。
（８）前記検出工程は、前記遺伝子がコードするタンパク質を検出することにより行われる、（６）に記載の判定方法。
（９）前記癌組織試料が、乳癌、メラノーマ、肺癌又は膵臓癌に由来するものである、（６）～（８）のいずれかに記載の判定方法。
（１０）前記乳癌が、エストロゲン受容体（－）プロゲステロン受容体（－）ＨＥＲ２（－）乳癌である、（９）に記載の判定方法。
（１１）不均一な前記癌細胞集団が、ＺＥＢ１（＋）ＣＬＤＮ１（－）細胞及びＺＥＢ１（－）ＣＬＤＮ１（＋）細胞を含む、（６）～（１０）のいずれかに記載の判定方法。
（１２）癌組織試料中の、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を検出する検出工程と、前記遺伝子の発現が検出された場合に前記癌組織試料が由来する患者は予後不良であると判定する工程と、を備える、癌の予後判定方法。
（１３）ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される遺伝子を発現する、不均一な癌細胞集団。
　本発明によれば、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用遺伝子マーカー及びｃＤＮＡマーカーを提供することができる。また、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用タンパク質マーカー、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用キット、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定方法を提供することができる。
（ａ）は、複数の乳癌細胞株におけるＺＥＢ１遺伝子の発現の解析結果を示すグラフである。（ｂ）は、複数の乳癌細胞株におけるＣＬＤＮ１遺伝子の発現の解析結果を示すグラフである。 実験例３の結果を示すグラフである。 （ａ）は、癌組織の薄切組織標本を抗ＺＥＢ１抗体で染色した結果を示す写真である。（ｂ）は、（ａ）とほぼ同視野の薄切組織標本を抗ＣＬＤＮ１抗体で染色した結果を示す写真である。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例６の結果を示すグラフである。 実験例７の結果を示すグラフである。 実験例８の解析結果を示す図である。 （ａ）～（ｊ）は、実験例１０の結果を示す写真である。 （ａ）～（ｊ）は、実験例１１の定量的リアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。
［癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用マーカー］
　１実施形態において、本発明は、ＣＡＬＭＬ３（Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　３、アクセッション番号：ＮＭ＿００５１８５、配列番号２５）、ＢＧＮ（Ｂｉｇｌｙｃａｎ、アクセッション番号：ＮＭ＿００１７１１、配列番号２６）、ＣＬＣＡ２（Ｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｃｈａｎｎｅｌ　ａｃｃｅｓｓｏｒｙ　２、アクセッション番号：ＮＭ＿００６５３６、配列番号２７）、ＣＳＴＡ（Ｃｙｓｔａｔｉｎ　Ａ（Ｓｔｅｆｉｎ　Ａ）、アクセッション番号：ＮＭ＿００５２１３、配列番号２８）、ＡＬＤＨ１Ａ１（Ａｌｄｅｈｙｄｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　１　ｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ　Ａ１、アクセッション番号：ＮＭ＿０００６８９、配列番号２９）、ＮＧＦＲ（Ｎｅｒｖｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、アクセッション番号：ＮＭ＿００２５０７、配列番号３０）、Ｓ１００Ａ８（Ｓ１００－ｃａｌｃｉｕｍ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ８、アクセッション番号：ＮＭ＿００２９６４、配列番号３１）、ＥＬＮ（Ｅｌａｓｔｉｎ、アクセッション番号：ＮＭ＿０００５０１、配列番号３２）、ＳＮＵＲＦ（ＳＮＲＰＮ　ｕｐｓｔｒｅａｍ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ、アクセッション番号：ＮＭ＿００５６７８、配列番号３３）及びＬＧＡＬＳ７（Ｇａｌｅｃｔｉｎ－７、アクセッション番号：ＮＭ＿００２３０７、配列番号３４）からなる群より選択される、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用遺伝子マーカー及びこれらの遺伝子のｃＤＮＡであるｃＤＮＡマーカーを提供する。
　すなわち、本実施形態のマーカーは、ＣＡＬＭＬ３　ｃＤＮＡ、ＢＧＮ　ｃＤＮＡ、ＣＬＣＡ２　ｃＤＮＡ、ＣＳＴＡ　ｃＤＮＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１　ｃＤＮＡ、ＮＧＦＲ　ｃＤＮＡ、Ｓ１００Ａ８　ｃＤＮＡ、ＥＬＮ　ｃＤＮＡ、ＳＮＵＲＦ　ｃＤＮＡ及びＬＧＡＬＳ７　ｃＤＮＡからなる群より選択される、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用ｃＤＮＡマーカーであってもよい。
　実施例において後述するように、発明者らは、単独の移植では腫瘍を形成しない細胞株と、単独の移植でも腫瘍を形成する細胞株とを混合してヌードマウスに移植することにより、予想外にも不均一な細胞集団からなる癌組織を作製することができた。そして、不均一な癌細胞集団を含む癌組織において特異的に発現する遺伝子として、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７を同定したことにより、本発明を完成した。
　したがって、癌組織中にこれらの遺伝子のいずれか１つ又は複数の発現が検出された場合、当該癌組織は不均一な癌細胞集団を含んでいると判断することができる。
　また、実施例において後述するように、発明者らは、不均一な癌細胞集団を含む癌組織は、予後が悪い傾向にあることを見出した。したがって、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される遺伝子及びｃＤＮＡは、癌の予後判定用遺伝子マーカーであるということもできる。
　癌組織中にこれらの遺伝子のいずれか１つ又は複数の発現が検出された場合、当該癌組織を有する癌患者は予後が悪いと予測することができる。
　本明細書において、予後が悪いとは、癌細胞の増殖が速い、癌の転移能が高い、癌組織の抗癌剤耐性が高い、又は患者の生存率が低いこと等を意味する。
　上記の遺伝子マーカーは、オータネーティブスプライシング等による上記遺伝子のスプライシングバリアントであってもよい。また、上記の遺伝子マーカーは、１塩基多型（ＳＮＰ）等を含む上記遺伝子の変異体であってもよい。
　また、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用マーカーは、上記の遺伝子にコードされるタンパク質であってもよい。すなわち、判定用マーカーはタンパク質マーカーであってもよい。
　また、上述した遺伝子マーカーと同様に、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される遺伝子にコードされるタンパク質は、癌の予後判定用タンパク質マーカーであるということもできる。
　癌組織における上記の遺伝子マーカー又はタンパク質マーカーの発現は、ＲＴ－ＰＣＲ、ＤＮＡアレイ解析、ノーザンブロッティング、免疫染色、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリー解析等により検出することができる。
　癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用マーカーとしては、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７遺伝子、ｃＤＮＡ、又は当該遺伝子にコードされるタンパク質の中でも、特にＣＡＬＭＬ３、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ及びＬＧＡＬＳ７遺伝子、ｃＤＮＡ、又は当該遺伝子にコードされるタンパク質がより好ましい。実施例において後述するように、ＣＡＬＭＬ３、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ及びＬＧＡＬＳ７遺伝子は、実際にヒト乳癌の臨床検体において発現が確認できている。
［癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用キット］
　１実施形態において、本発明は、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、又はＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子にコードされるタンパク質に対する特異的結合物質、を備える、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用キットを提供する。
　上述したように、癌組織中に上記の遺伝子のいずれか１つ又は複数の発現が検出された場合、当該癌組織を有する癌患者は予後が悪いと予測することができる。したがって、本実施形態のキットは、癌の予後判定用キットであるということもできる。
（プライマーセット）
　本実施形態のキットは、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセットを備えていてもよい。
　プライマーセットは、これらの遺伝子のｃＤＮＡの少なくとも１部を増幅することができれば、その配列は特に限定されない。具体的なプライマーセットの塩基配列としては、一例として、実施例において後述するものを挙げることができる。
　上記のプライマーセットを構成する少なくとも一方のプライマーは、上記のいずれかの遺伝子の塩基配列においてエクソンとエクソンとの境目を含む塩基配列を有していてもよい。このようなプライマーは自然界には存在しない塩基配列を有している。
（プローブ）
　本実施形態のキットは、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブを備えていてもよい。
　プローブは、例えば上記の遺伝子のｍＲＮＡの少なくとも１部の塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸断片であってもよい。また、プローブは、安定性やハイブリダイゼーション時の特異性等を向上させる等の目的で、種々の化学修飾を有していてもよい。例えば、ヌクレアーゼ等の加水分解酵素による分解を抑制するために、リン酸残基を、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換してもよい。また、少なくとも一部がペプチド核酸（ＰＮＡ）等の核酸類似体により構成されていてもよい。
　また、上記のプローブは、上記のいずれかの遺伝子の塩基配列においてエクソンとエクソンとの境目を含む塩基配列を有していてもよい。このようなプローブは自然界には存在しない塩基配列を有している。
　プローブは固相上に固定されていてもよい。固相としては、例えば、ビーズ、板状基板、膜等が挙げられる。
　プローブは、例えば、板状基板の表面に固定されてマイクロアレイを形成していてもよい。この場合、例えば、癌組織試料からＲＮＡを抽出して蛍光物質で標識し、マイクロアレイとハイブリダイゼーションさせてマイクロアレイ上のプローブに結合したＲＮＡを検出することにより、癌組織中に上記の遺伝子の発現を検出することができる。上記の遺伝子のいずれか１つ又は複数の発現が検出された場合、当該癌組織は不均一な癌細胞集団を含んでいると判断することができる。
（特異的結合物質）
　本実施形態のキットは、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子にコードされるタンパク質に対する特異的結合物質を備えていてもよい。
　特異的結合物質としては、例えば、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。抗体は、例えば、マウス等の動物に上記のタンパク質を抗原として免疫することにより作製することができる。あるいは、ファージライブラリー等の抗体ライブラリーのスクリーニング等により作製することができる。また、抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。上記の抗体又は抗体断片は、ポリクローナルであってもよく、モノクローナルであってもよい。
　アプタマーとは、標識物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。上記のタンパク質に特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、systematic evolution of ligand by exponential enrichment（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、上記のタンパク質に対する特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
　特異的結合物質は、上記のタンパク質に特異的に結合することができれば特に制限されず、市販のものであってもよい。
　例えば、固定した癌組織の薄切標本を上記の特異的結合物質を用いて免疫染色することにより、上記のタンパク質の存在を検出することができる。上記のタンパク質の存在の検出は、ウエスタンブロッティング法により行ってもよいし、ＥＬＩＳＡ法により行ってもよいし、フローサイトメトリー解析等により行ってもよい。
　上記のタンパク質のいずれか１つまたは複数の存在は、癌組織が不均一な癌細胞集団を含んでいることを示す。
［癌組織試料が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定方法］
　１実施形態において、本発明は、癌組織試料中の、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を検出する検出工程と、前記遺伝子の発現が検出された場合に前記癌組織試料は不均一な癌細胞集団を含むと判定する工程と、を備える、癌組織試料が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定方法を提供する。
　上述したように、癌組織試料中に上記の遺伝子のいずれか１つ又は複数の発現が検出された場合、当該癌組織を有する癌患者は予後が悪いと予測することができる。したがって、本実施形態の判定方法は、癌の予後判定方法であるということもできる。
　上記の検出工程は、上記遺伝子のｍＲＮＡを検出することにより行われてもよい。あるいは、上記の検出工程は、上記遺伝子がコードするタンパク質を検出することにより行われてもよい。
　上記遺伝子のｍＲＮＡの検出は、ＲＴ－ＰＣＲ、ＤＮＡアレイ解析、ノーザンブロッティング等により行うことができる。また、上記遺伝子がコードするタンパク質の検出は、免疫染色、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリー解析等により行うことができる。
　上記の遺伝子のいずれか１つ又は複数の発現が検出された場合、当該癌組織試料は不均一な癌細胞集団を含んでいると判断することができる。
　上記の癌組織試料は、乳癌、メラノーマ、肺癌又は膵臓癌に由来するものであってもよい。これらの癌には不均一な癌細胞集団を含むものが存在し、不均一な癌細胞集団を含むものは予後が悪いことが知られている。
　上記の乳癌は、エストロゲン受容体（－）プロゲステロン受容体（－）ＨＥＲ２（－）乳癌、すなわち、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体及びＨＥＲ２を発現していない乳癌であってもよい。このような乳癌はトリプルネガティブ乳癌とも呼ばれ、予後が悪い乳癌であることが知られている。
　また、上記の不均一な癌細胞集団は、ＺＥＢ１（＋）ＣＬＤＮ１（－）細胞、すなわちＺＥＢ１を発現しＣＬＤＮ１を発現していない細胞と、ＺＥＢ１（－）ＣＬＤＮ１（＋）細胞、すなわちＺＥＢ１を発現しておらずＣＬＤＮ１を発現している細胞と、を含むものであってもよい。
　ＺＥＢ１（Ｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ　Ｅ－ｂｏｘ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｈｏｍｅｏｂｏｘ
　１）は、上皮細胞がその細胞極性や周囲細胞との細胞接着機能を失い、遊走、浸潤能を得ることで、間葉系様の細胞へと変化する現象である、上皮間葉転換を誘導する転写因子である。また、ＣＬＤＮ１（Ｃｌａｕｄｉｎ１）は、タイトジャンクションに存在する主要なタンパク質である。
　実施例において後述するように、不均一な癌細胞集団を含む癌組織の一例として、ＺＥＢ１（＋）ＣＬＤＮ１（－）細胞及びＺＥＢ１（－）ＣＬＤＮ１（＋）細胞を含む癌組織を挙げることができる。
［不均一な癌細胞集団］
　１実施形態において、本発明は、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される遺伝子を発現する、不均一な癌細胞集団を提供する。本実施形態の癌細胞集団は、インビボで形成したものであることが好ましい。実施例において後述するように、例えば、免疫不全マウスに、ＺＥＢ１（＋）ＣＬＤＮ１（－）である癌細胞及びＺＥＢ１（－）ＣＬＤＮ１（＋）である癌細胞を混合した混合物を移植することにより、担癌マウスの癌組織として不均一な癌細胞集団を形成することができる。
［その他の実施形態］
　１実施形態において、本発明は、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される遺伝子のｃＤＮＡを提供する。上述したように、これらのｃＤＮＡは、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用遺伝子マーカー、又は癌の予後判定用マーカーとして用いることができる。
　１実施形態において、本発明は、癌組織試料を患者から採取する工程と、癌組織試料中の、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される遺伝子又はｃＤＮＡの発現を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、マイクロアレイを用いた遺伝子発現解析、又は前記遺伝子にコードされるタンパク質に対する特異的結合物質との結合の検出により検出する工程と、を備える、癌組織試料中の前記遺伝子の発現を検出する方法を提供する。
　１実施形態において、本発明は、癌組織試料を患者から採取する工程と、癌組織試料中の、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される遺伝子又はｃＤＮＡの発現を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、マイクロアレイを用いた遺伝子発現解析、又は前記遺伝子にコードされるタンパク質に対する特異的結合物質との結合の検出により検出する工程と、を備える、癌組織試料が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定方法を提供する。本実施形態の判定方法は、癌の予後判定方法であるということもできる。
　次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜不均一な癌組織を有するモデルマウスの作製＞
［実験例１］
（乳癌細胞株におけるＺＥＢ１及びＣＬＤＮ１の発現の検討）
　発明者らは、トリプルネガティブ乳癌細胞株である、ＭＤＡ－ＭＢ－４３６、ＢＴ５４９、ＭＤＡ－ＭＢ－１５７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＣＣ１９３７、ＢＴ２０、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞における、ＺＥＢ１遺伝子及びＣＬＤＮ１遺伝子の発現を、定量的リアルタイムＰＣＲにより検討した。ＺＥＢ１遺伝子の増幅にはプライマーＺＥＢ１　Ｆｗ（配列番号１）及びＺＥＢ１　Ｒｖ（配列番号２）を使用した。また、ＣＬＤＮ１遺伝子の増幅にはプライマーＣＬＤＮ－ｓ（配列番号３）及びＣＬＤＮ－ａｓ（配列番号４）を使用した。
　図１（ａ）は、各乳癌細胞株におけるＺＥＢ１遺伝子の発現の解析結果を示すグラフである。また、図１（ｂ）は、各乳癌細胞株におけるＣＬＤＮ１遺伝子の発現の解析結果を示すグラフである。
　その結果、発明者らは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株が、ＺＥＢ１（＋）ＣＬＤＮ１（－）であることを見出した。また、ＨＣＣ１９３７細胞株が、ＺＥＢ１（－）ＣＬＤＮ１（＋）であることを見出した。
［実験例２］
（担癌マウスの作製）
　ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株とＨＣＣ１９３７細胞株とを、ＨＣＣ１９３７細胞株の細胞数がＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株の細胞数より多くなるように、好ましくはＨＣＣ１９３７細胞株の細胞数：ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株の細胞数が２：１以上になるように、例えば９：１で混合した混合物を免疫不全マウス（４週齢、メス、ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ）の４番乳腺脂肪組織に移植し担癌マウスを作製した（以下、「Ｍｉｘマウス」という場合がある。）。対照として、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株のみ、及びＨＣＣ１９３７細胞株のみを、それぞれ免疫不全マウス（４週齢、メス、ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ）の４番乳腺脂肪組織に移植し、担癌マウスを作製した（以下、それぞれ「２３１マウス」、「１９３７マウス」という場合がある。）。
［実験例３］
（腫瘍体積の経時変化の観察）
　実験例２で作製した、Ｍｉｘマウス、２３１マウス及び１９３７マウスの腫瘍径を、癌細胞の移植後約３０日間経時的に測定し、腫瘍体積の経時変化を観察した。
　図２は、各担癌マウスにおける腫瘍体積の経時変化を示すグラフである。その結果、ＨＣＣ１９３７細胞株のみを移植した１９３７マウスでは、腫瘍が形成されないことが明らかとなった。また、１９３７マウスでは腫瘍が形成されなかったにもかかわらず、ＨＣＣ１９３７細胞株にＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株を混合して移植したＭｉｘマウスでは腫瘍が形成された。また、Ｍｉｘマウスでは、同数のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株のみを移植した２３１マウスよりも大きな腫瘍が形成されることが明らかとなった。
［実験例４］
（担癌マウスの癌組織の免疫染色）
　実験例２と同様にして作製したＭｉｘマウスから、癌細胞株の移植１６日後に癌組織を摘出した。続いて、摘出した癌組織をパラホルムアルデヒドで固定しパラフィン包埋した。続いて、癌組織の薄切組織標本を作製し、免疫染色により、ＺＥＢ１タンパク質及びＣＬＤＮ１タンパク質の発現を検討した。
　図３（ａ）は、癌組織の薄切組織標本を抗ＺＥＢ１抗体（カタログ番号「ｓｃ－１０５７２」、サンタクルーズ社）で染色した結果を示す写真である。図３（ｂ）は、図３（ａ）とほぼ同視野の薄切組織標本を抗ＣＬＤＮ１抗体（カタログ番号「ａｂ１５０９８」、アブカム社）で染色した結果を示す写真である。
　実験例３の結果から、１９３７マウスでは腫瘍が形成されないことが明らかとなった。
この結果から、Ｍｉｘマウスの癌組織は、ＺＥＢ１（＋）ＣＬＤＮ１（－）であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のみで構成され、ＣＬＤＮ１タンパク質が発現していない可能性が考えられた。これに対し、予想外にも、Ｍｉｘマウスの癌組織において、ＺＥＢ１タンパク質だけでなくＣＬＤＮ１タンパク質の発現が確認された。また、ＺＥＢ１タンパク質の発現とＣＬＤＮ１タンパク質の発現は相互排他的であり、ＺＥＢ１（＋）細胞はＣＬＤＮ１（－）であり、ＣＬＤＮ１（＋）細胞はＺＥＢ１（－）であることが示された。
　すなわち、Ｍｉｘマウスの癌組織中にはＺＥＢ１（＋）ＣＬＤＮ１（－）細胞とＺＥＢ１（－）ＣＬＤＮ１（＋）細胞とが混合して存在しており、不均一な癌組織が形成されていることが確認された。
　実験例３及び４の結果から、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株とＨＣＣ１９３７細胞株との混合物を免疫不全マウスに移植することにより、不均一な癌組織を有するモデルマウスを作製できることが明らかとなった。また、不均一な癌組織は、より大きな腫瘍を形成したことから、均一な癌組織よりも悪性度が高いことが示された。
＜不均一な癌組織の悪性度の評価＞
［実験例５］
（肺転移の評価）
　実験例２で作製したＭｉｘマウス及び２３１マウスから、癌細胞株の移植１１週後に肺を摘出してパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋した。続いて、肺の薄切組織標本を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色して顕微鏡で観察し、癌の肺転移巣の存在を検討した。
　その結果、Ｍｉｘマウスでは、２３１マウスと比較して、肺転移巣の形成が多かった。
この結果からも、不均一な癌組織は、均一な癌組織よりも悪性度が高いことが示された。
［実験例６］
（抗癌剤による治療効果の検討）
　実験例２と同様にして作製したＭｉｘマウス及び２３１マウスに、パクリタキセル（３ｍｇ／ｋｇ）を週１回腹腔内投与して腫瘍径を経時的に測定し、腫瘍体積の経時変化を観察した（それぞれｎ＝５）。対照として、パクリタキセルの代わりに生理的食塩水を腹腔内投与した群（対照群）についても腫瘍体積の経時変化を観察した（それぞれｎ＝５）。
　図４（ａ）は、２３１マウスの結果を示すグラフである。また、図４（ｂ）は、Ｍｉｘマウスの結果を示すグラフである。図中、「パクリタキセル」は、パクリタキセル投与群の結果を示し、「対照」は、対照群の結果を示す。その結果、Ｍｉｘマウスの癌組織は、２３１マウスの癌組織と比較して、パクリタキセルに対する耐性が高いことが明らかとなった。この結果からも、不均一な癌組織は、均一な癌組織よりも悪性度が高いことが示された。
［実験例７］
（ＺＥＢ１（＋）ＣＬＤＮ１（＋）乳癌患者の予後の検討）
　乳癌患者２９５名に由来する癌組織試料のマイクロアレイ遺伝子発現解析結果（ChangH. Y. et al., Robustness, scalability, and integration of a wound-response geneexpression signature in predicting breast cancer survival., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 102(10), 3738-3743, 2005. PMID: 15701700 を参照。）を用いて、ＺＥＢ１（＋）ＣＬＤＮ１（＋）乳癌患者、ＺＥＢ１（－）ＣＬＤＮ１（＋）乳癌患者、ＺＥＢ１（＋）ＣＬＤＮ１（－）乳癌患者及びＺＥＢ１（－）ＣＬＤＮ１（－）乳癌患者の予後（生存率）を検討した。ここで、ＺＥＢ１（＋）ＣＬＤＮ１（＋）である癌組織は、ＺＥＢ１（＋）ＣＬＤＮ１（－）細胞及びＺＥＢ１（－）ＣＬＤＮ１（＋）細胞が混在した不均一な癌組織であると考えられた。
　図５は、検討結果を示すグラフである。その結果、ＺＥＢ１（＋）ＣＬＤＮ１（＋）乳癌患者の生存率は低いことが明らかとなった。この結果からも、不均一な癌組織は、より悪性度が高いことが示された。
　以上、実験例４～７の結果から、不均一な癌組織は、より悪性度が高いことが示された。
＜癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用マーカーの探索＞
［実験例８］
（網羅的トランスクリプトーム解析）
　実験例２と同様にして作製した、Ｍｉｘマウス、２３１マウス及び１９３７マウスの癌組織における網羅的トランスクリプトーム解析を行った。
　まず、各担癌マウスから癌組織を摘出し、ＲＮＡを抽出した。続いて、キット（商品名「ＴｒｕＳｅｑ　ＲＮＡ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ｖ２」、イルミナ社）を用いてライブラリーを作製した。続いて、次世代シーケンサー（型式「ＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｚｅｒＩＩｘ」、イルミナ社）を用いてシーケンス解析を行い、バイオインフォマティクス解析を行った。
　より具体的には、検出された塩基配列を、ソフトウエア「Ｘｅｎｏｍｅ」を用いてヒト由来の塩基配列とマウス由来の塩基配列に分離した。続いて、得られた塩基配列データをソフトウエア「Ｔｏｐｈａｔ」を用いてリファレンス配列にマッピングした。続いて、マッピングされた塩基配列データを既知遺伝子配列とともに可視化し、ソフトウエア「Ａｖａｄｉｓ」を用いて、各試料間のｍＲＮＡ発現を比較した。
　図６は、ソフトウエア「Ａｖａｄｉｓ」を用いた解析結果を示す図である。ソフトウエア「Ａｖａｄｉｓ」を用いた解析の結果、Ｍｉｘマウスの癌組織で高発現し、２３１マウス及び１９３７マウスの癌組織では発現がほとんど認められない遺伝子として、図６の中央下領域における、丸で囲んだ領域に示される遺伝子が見出された。これらの遺伝子は、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用遺伝子マーカーの候補である。
［実験例９］
（定量的リアルタイムＰＣＲによる候補遺伝子の発現解析）
　実験例８で、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用遺伝子マーカーの候補として見出された遺伝子について、定量的リアルタイムＰＣＲによる発現解析を行った。
　まず、実験例２と同様にして作製した、Ｍｉｘマウス、２３１マウス及び１９３７マウスから癌組織を摘出し、一部からＲＮＡを抽出した。また、一部をパラホルムアルデヒドで固定しパラフィン包埋して後の実験に用いた。
　続いて、抽出したＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、定量的リアルタイムＰＣＲにより候補遺伝子の発現を解析した。
　その結果、実施例８のトランスクリプトーム解析において２３１マウス及び１９３７マウスでほとんど発現の見られなかったＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７遺伝子は、定量的リアルタイムＰＣＲによっても、Ｍｉｘマウスの癌組織で高発現していることが確認された。すなわち、これらの遺伝子は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞及びＨＣＣ１９３７細胞を混合して移植し癌細胞集団が不均一性を示して高発現が検出されることから、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用遺伝子マーカーとして使用できることが示された。中でも、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、ＥＬＮ、ＬＧＡＬＳ７遺伝子は、後述のインビトロ実験でＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞とＨＣＣ１９３７細胞を混合しても発現量の増加は認められなかったにもかかわらず（図８参照）、Ｍｉｘマウスの癌組織において高発現を示した。その発現量は、トランスクリプトーム解析では、２３１マウス及び１９３７マウスの癌組織における発現量と比較してその差が大きかった。
　表１に、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７遺伝子の定量的リアルタイムＰＣＲに使用したプライマーの名称及び配列番号を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［実験例１０］
（免疫染色による候補遺伝子の発現解析）
　実験例８で、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用遺伝子マーカーの候補として見出された遺伝子について、免疫染色により発現を検討した。
　より具体的には、実験例９で作製したＭｉｘマウス及び２３１マウスの癌組織の標本を薄切して組織切片標本を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色及び免疫染色を行った。
　図７（ａ）～（ｊ）は免疫染色の代表的な結果を示す写真である。図７（ａ）は、Ｍｉｘマウスの癌組織標本を抗ＣＡＬＭＬ３抗体（カタログ番号「ＧＴＸ１１４９５４」、Ｇｅｎｅ　Ｔｅｘ社）で染色した結果を示す写真である。図７（ｂ）は、対照として、２３１マウスの癌組織標本を抗ＣＡＬＭＬ３抗体（同上）で染色した結果を示す写真である。
図７（ｃ）は、Ｍｉｘマウスの癌組織標本を抗ＣＬＣＡ２抗体（カタログ番号「ＮＢＰ２－３３４８２」、Ｎｏｖｕｓ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）で染色した結果を示す写真である。図７（ｄ）は、対照として、２３１マウスの癌組織標本を抗ＣＬＣＡ２抗体（同上）で染色した結果を示す写真である。図７（ｅ）は、Ｍｉｘマウスの癌組織標本を抗ＣＳＴＡ抗体（カタログ番号「ＨＰＡ００１０３１」、ＡＴＲＡＳ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社）で染色した結果を示す写真である。図７（ｆ）は、対照として、２３１マウスの癌組織標本を抗ＣＳＴＡ抗体（同上）で染色した結果を示す写真である。図７（ｇ）は、Ｍｉｘマウスの癌組織標本を抗ＬＧＡＬＳ７抗体（カタログ番号「ＨＰＡ００１５４９」、ＡＴＲＡＳ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社）で染色した結果を示す写真である。図７（ｈ）は、対照として、２３１マウスの癌組織標本を抗ＬＧＡＬＳ７抗体（同上）で染色した結果を示す写真である。図７（ｉ）は、Ｍｉｘマウスの癌組織標本を抗Ｓ１００Ａ８抗体（カタログ番号「ＮＢＰ２－２５２６９」、Ｎｏｖｕｓ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）で染色した結果を示す写真である。図７（ｊ）は、対照として、２３１マウスの癌組織標本を抗Ｓ１００Ａ８抗体（同上）で染色した結果を示す写真である。
　その結果、ＣＡＬＭＬ３、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＬＧＡＬＳ７及びＳ１００Ａ８タンパク質は、Ｍｉｘマウスの癌組織において高発現し、２３１マウスの癌組織ではほとんど発現が認められないことが確認された。
［実験例１１］
（インビトロ試料を用いた定量的リアルタイムＰＣＲによる候補遺伝子の発現解析）
　実験例８で、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用遺伝子マーカーの候補として見出された遺伝子について、インビトロ試料を用いて定量的リアルタイムＰＣＲによる発現解析を行った。
　まず、２３１細胞、１９３７細胞、及び２３１細胞と１９３７細胞を１：１で混合した細胞を、培養皿内で５日間培養し、インビトロ試料とした。続いて、各細胞試料からそれぞれＲＮＡを抽出した。続いて、抽出したＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、定量的リアルタイムＰＣＲにより候補遺伝子の発現を解析した。定量的リアルタイムＰＣＲは実験例９と同様にして行った。
　図８は定量的リアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。図８中、「２３１」は２３１細胞の結果であることを示し、「１９３７」は１９３７細胞の結果であることを示し、「ｍｉｘ」は２３１細胞と１９３７細胞を１：１で混合した細胞の結果であることを示す。
　その結果、インビトロで２３１細胞と１９３７細胞を混合した試料では、実験例９及び１０において得られた移植癌細胞集団からのインビボ試料でみられたような、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨＡ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７遺伝子の高発現は確認できなかった。
　この結果から、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用遺伝子マーカーは、インビトロで癌細胞を混合して培養しただけでは高発現せず、インビボにおいて不均一な癌細胞集団を形成した場合に初めて高発現することが明らかとなった。
［実験例１２］
（乳癌手術検体の免疫染色）
　実験例８で、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用遺伝子マーカーの候補として見出された遺伝子について、臨床検体の免疫染色により発現を検討した。
　より具体的には、インフォームドコンセントが取得された乳癌患者の、手術によって得られた組織のホルマリン固定パラフィン包埋された薄切組織標本を用いて、免疫組織染色を行い、ＣＡＬＭＬ３、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ及びＬＧＡＬＳ７タンパク質の発現を検討した。
　その結果、ＣＡＬＭＬ３、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ及びＬＧＡＬＳ７タンパク質の染色が確認され、ヒト乳癌手術検体において、これらのマーカータンパク質の発現が検出できることが確認された。
　この結果は、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用遺伝子マーカー、ｃＤＮＡマーカー、及びタンパク質マーカーが、実際にヒト試料において使用できることを示す。
　本発明によれば、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用遺伝子マーカーを提供することができる。また、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用タンパク質マーカー、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用キット、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定方法を提供することができる。

Claims (13)

  1. 　Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　３（ＣＡＬＭＬ３）、Ｂｉｇｌｙｃａｎ（ＢＧＮ）、Ｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｃｈａｎｎｅｌ　ａｃｃｅｓｓｏｒｙ　２（ＣＬＣＡ２）、Ｃｙｓｔａｔｉｎ　Ａ（ＣＳＴＡ）、Ａｌｄｅｈｙｄｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　１　ｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ　Ａ１（ＡＬＤＨ１Ａ１）、Ｎｅｒｖｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮＧＦＲ）、Ｓ１００－ｃａｌｃｉｕｍ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ８（Ｓ１００Ａ８）、Ｅｌａｓｔｉｎ（ＥＬＮ）、ＳＮＲＰＮ　ｕｐｓｔｒｅａｍ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ（ＳＮＵＲＦ）及びＧａｌｅｃｔｉｎ－７（ＬＧＡＬＳ７）からなる群より選択される、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用遺伝子マーカー。
  2. 　ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される遺伝子にコードされる、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用タンパク質マーカー。
  3. 　ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される遺伝子、又は前記遺伝子にコードされるタンパク質からなる、癌の予後判定用マーカー。
  4. 　ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、
    　ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、又は
    　ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子にコードされるタンパク質に対する特異的結合物質、
    　を備える、癌組織が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定用キット。
  5. 　ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、
    　ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、又は
    　ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子にコードされるタンパク質に対する特異的結合物質、
    　を備える、癌の予後判定用キット。
  6. 　癌組織試料中の、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を検出する検出工程と、前記遺伝子の発現が検出された場合に前記癌組織試料は不均一な癌細胞集団を含むと判定する工程と、を備える、癌組織試料が不均一な癌細胞集団を含むか否かの判定方法。
  7. 　前記検出工程は、前記遺伝子のｍＲＮＡを検出することにより行われる、請求項６に記載の判定方法。
  8. 　前記検出工程は、前記遺伝子がコードするタンパク質を検出することにより行われる、請求項６に記載の判定方法。
  9. 　前記癌組織試料が、乳癌、メラノーマ、肺癌又は膵臓癌に由来するものである、請求項６～８のいずれか一項に記載の判定方法。
  10. 　前記乳癌が、エストロゲン受容体（－）プロゲステロン受容体（－）ＨＥＲ２（－）乳癌である、請求項９に記載の判定方法。
  11. 　不均一な前記癌細胞集団が、ＺＥＢ１（＋）ＣＬＤＮ１（－）細胞及びＺＥＢ１（－）ＣＬＤＮ１（＋）細胞を含む、請求項６～１０のいずれか一項に記載の判定方法。
  12. 　癌組織試料中の、ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を検出する検出工程と、前記遺伝子の発現が検出された場合に前記癌組織試料が由来する患者は予後不良であると判定する工程と、を備える、癌の予後判定方法。
  13. 　ＣＡＬＭＬ３、ＢＧＮ、ＣＬＣＡ２、ＣＳＴＡ、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＮＧＦＲ、Ｓ１００Ａ８、ＥＬＮ、ＳＮＵＲＦ及びＬＧＡＬＳ７からなる群より選択される遺伝子を発現する、不均一な癌細胞集団。
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