WO2017099119A1

WO2017099119A1 - 家禽の飼育方法

Info

Publication number: WO2017099119A1
Application number: PCT/JP2016/086360
Authority: WO
Inventors: 矢島　麗嘉; 幹佐藤
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2015-12-08
Filing date: 2016-12-07
Publication date: 2017-06-15
Anticipated expiration: 2018-06-08
Also published as: US20180271930A1; JPWO2017099119A1; CN108366586A; BR112018010202A2

Abstract

ニワトリ等の家禽の増体重を向上させるために有効な飼育方法、家禽の筋肉量を増大させる方法、及び、初生ヒナにおけるミオスタチン又は／及びミオゲニンの発現量を低減させる方法を提供することを解決課題とする。　本発明では、酸化型グルタチオンを含有する飼料を、孵化から孵化後２４～１６８時間までの期間に、家禽に摂取させることにより、成長後のニワトリにおける筋肉量を効率的に増大させ、効率的な家禽の生産を可能にする。本発明ではまた、酸化型グルタチオンを含有する家禽用の初期飼料組成物を提供する。

Description

家禽の飼育方法

　本発明は、ニワトリなどの家禽の飼育方法および家禽用の初期飼料組成物に関する。

　本発明はまた、家禽の筋肉量を増大させる方法に関する。

　本発明はまた、家禽のヒナにおいて骨格筋の分化を抑制する因子、増殖を抑制する因子、又は増殖分化を促進する因子の発現量を低減させる方法、好ましくはミオスタチン、又は/及びミオゲニンの発現量を低減させる方法に関する。

　本発明者らはこれまでにインスリン、インスリン様因子、或いは抗酸化物質をブロイラー初生ヒナの最初の飼料として給餌すると骨格筋細胞の分化が抑制され、増殖が促進し、成長後の食肉生産、或いは増体を改善することを明らかにした（非特許文献１）。

　一方、グルタチオンは、Ｌ－システイン、Ｌ－グルタミン酸、グリシンの３つのアミノ酸から成るペプチドで、人体だけでなく、他の動物や植物、微生物など多くの生体内に存在し、活性酸素の消去作用、解毒作用、アミノ酸代謝など、生体にとって重要な化合物である。

　グルタチオンは生体内で、Ｌ－システイン残基のチオール基が還元されたＳＨの形態である還元型のグルタチオン（以下「ＧＳＨ」と称することがある）と、Ｌ－システイン残基のチオール基が酸化されグルタチオン２分子間でジスルフィド結合を形成した形態である酸化型グルタチオン（以下「ＧＳＳＧ」と称することがある）とのいずれかの形態で存在する。

　グルタチオンを動物飼育用の飼料に配合することが複数の文献に記載されている。例えば特許文献１では高湿分物質を含む家禽用飼料に、抗酸化剤としてグルタチオンを含有してよいことが記載されている。特許文献２では腎損傷の治療に有効な量のピルベートを含むコンパニオン動物用の飼料に、抗酸化剤としてグルタチオンを含有してよいことが記載されている。特許文献３ではネコ科動物における酸化的ストレスを減少させるための飼料の有効成分としてグルタチオンを配合することが開示されている。特許文献４では家畜、ペット等の動物のための睡眠誘導剤としてグルタチオンが有効であることが開示されている。

　特許文献５では機能性食品または飲料中に配合する抗酸化剤としてグルタチオンを使用することが記載されており、グルタチオンとビタミンＣ、Ｅとの併用によって筋肉組織の老化を防止できることが示唆されている。

　特許文献１～５のいずれにもグルタチオンとして特に酸化型グルタチオンを使用することは記載されていない。

特表平１１－５０６６１７号公報特表２０１３－５１５７８０号公報特開２０１３－８２７１３号公報特開２００８－５６６２８号公報特開２００３－２６７９９２号公報国際公開ＷＯ２０１３／００２３１７

General and Comparative Endocrinology 175(2012),457-463

　ニワトリなどの家禽による食肉生産を効率化するために、家禽の増体重が求められている。従来、家禽の増体重のために種々の飼料が提供されているが、必ずしも満足できるものではなかった。特許文献１～４には飼料組成物中にグルタチオンを配合してよいことが記載されているが、家禽の増体重を実現できるか否かは一切考慮されていない。

　そこで本発明は、家禽の増体重を向上させるために有効な飼育方法、家禽の筋肉量を増大させる方法を提供することを目的とする。本発明はまた、家禽の初生ヒナにおいて、骨格筋細胞の増殖を促進するために、骨格筋細胞の分化を促進するミオスタチン又は／及びミオゲニンの発現量を低減させる方法を提供することを目的とする。本発明はまたこれらの方法に適した、家禽用の初期肥料組成物を提供することを目的とする。

　本発明者らは驚くべきことに、家禽の初生ヒナに酸化型グルタチオンを含有する飼料を摂取させることにより、成長後の家禽の筋肉量を増大させ体重を増大させることができること、並びに、初期ヒナの骨格筋において、骨格筋細胞の分化を促進するミオスタチン、又は／及びミオゲニンの発現量が低減し、その結果、骨格筋細胞が増殖することを見出し、本発明を完成するに至った。具体的には、本発明は以下の発明を包含する。
（１）家禽の飼育方法であって、孵化から孵化後２４～１６８時間までの期間に、酸化型グルタチオンを含有する飼料を家禽に摂取させる工程を含む方法。
（２）家禽の筋肉量を増大させる方法であって、孵化から孵化後２４～１６８時間までの期間に、酸化型グルタチオンを含有する飼料を家禽に摂取させる工程を含む方法。
（３）孵化から孵化後２４～１６８時間までの期間に、酸化型グルタチオンを含有する飼料を家禽に摂取させる工程を含む、前記期間における、家禽の骨格筋での、ミオスタチン又は／及びミオゲニンの発現量を低減させる方法。
（４）酸化型グルタチオンを含有することを特徴とする、家禽用の初期飼料組成物。この組成物は、より好ましくは、孵化から孵化後２４～１６８時間までの生育段階にある家禽用の初期飼料組成物である。

　上記（１）の方法によれば、食肉生産に適した家禽を効率的に生産することができる。

　上記（２）の方法によれば、家禽の筋肉量を効率的に増大させることができる。

　上記（３）の方法によれば、家禽のヒナの骨格筋において、骨格筋細胞の分化を促進するミオスタチン又は／及びミオゲニンの発現量を低減させることができ、その結果、骨格筋細胞の増殖を促進することができる。

　上記（４）の家禽用初期飼料組成物は、初生ヒナに摂取させて家禽の増体重を向上させることができる。

　本発明は更に、以下の発明を包含する。
（５）孵化から孵化後２４～１６８時間までの期間に家禽に摂取させるための、酸化型グルタチオン、又は、酸化型グルタチオンを含有する飼料組成物。
（６）孵化から孵化後２４～１６８時間までの期間に家禽に摂取させることで前記家禽の筋肉量を増大させるための、酸化型グルタチオン、又は、酸化型グルタチオンを含有する飼料組成物。
（７）孵化から孵化後２４～１６８時間までの期間に家禽に摂取させることで、前記期間における、前記家禽の骨格筋での、ミオスタチン又は／及びミオゲニンの発現量を低減させるための、酸化型グルタチオン、又は、酸化型グルタチオンを含有する飼料組成物。
（８）孵化から孵化後２４～１６８時間までの期間に家禽に摂取させるための飼料組成物の製造のための、酸化型グルタチオンの使用。
（９）孵化から孵化後２４～１６８時間までの期間に家禽に摂取させることで前記家禽の筋肉量を増大させるための飼料組成物の製造のための、酸化型グルタチオンの使用。
（１０）孵化から孵化後２４～１６８時間までの期間に家禽に摂取させることで、前記期間における、前記家禽の骨格筋での、ミオスタチン又は／及びミオゲニンの発現量を低減させるための飼料組成物の製造のための、酸化型グルタチオンの使用。
（１１）孵化から孵化後２４～１６８時間までの期間に家禽に摂取させるための、酸化型グルタチオン、又は、酸化型グルタチオンを含有する飼料組成物の使用。
（１２）孵化から孵化後２４～１６８時間までの期間に家禽に摂取させることで前記家禽の筋肉量を増大させるための、酸化型グルタチオン、又は、酸化型グルタチオンを含有する飼料組成物の使用。
（１３）孵化から孵化後２４～１６８時間までの期間に家禽に摂取させることで、前記期間における、前記家禽の骨格筋での、ミオスタチン又は／及びミオゲニンの発現量を低減させるための、酸化型グルタチオン、又は、酸化型グルタチオンを含有する飼料組成物の使用。

　上記（１）～（３）の方法は典型的には非医療的方法である。

　上記（４）の初期飼料組成物は典型的には非医療用の初期飼料組成物である。

　上記（５）～（７）の酸化型グルタチオン又は飼料組成物は医療用であってもよいし非医療用であってもよい。

　上記（８）～（１０）のおける飼料組成物は医療用であってもよいし非医療用であってもよい。

　上記（１１）～（１３）の使用は典型的には非医療的使用である。

　なお本明細書において「医療」とは家禽に対する医療を指す。

　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１５－２３９３４８号の開示内容を包含する。

　本発明によれば、家禽の増体重を向上させるために有効な飼育方法、家禽の筋肉量を増大させる方法、及び、家禽の初期ヒナにおいてミオスタチン又は／及びミオゲニンの発現量を低減させる方法が提供される。本発明では更に、これらの方法に適した、家禽用の初期肥料組成物が提供される。

調査１での各飼料組成物を給与した時の浅胸筋における骨格筋細胞分化関連遺伝子発現（ｎ＝６）を示す図である。（Ａ）はＭｙｏＤの、（Ｂ）はミオゲニンの、（Ｃ）はミオスタチンの、（Ｄ）はＩＧＦ－Ｉの発現量の相対値をそれぞれ示す。各因子の発現量の相対値は、各因子の発現量の値をＲＰＳ９の発現量の値で割った値を平均±標準偏差で示したものである。異符号はＴｕｋｅｙ－ｋｒａｍｅｒによる多重比較検定で有意な差を示す（Ｐ＜０．０５）。調査３での骨格筋細胞の分化期におけるＧＳＳＧ添加時の骨格筋細胞分化関連遺伝子の発現量（ｎ＝６）を示す図である。（ａ）はＭｙｏＤの、（ｂ）はミオスタチンの、（ｃ）はＩＧＦ－Ｉの、（ｄ）はＰａｘ７の発現量の相対値をそれぞれ示す。各因子の発現量の相対値は、各因子の発現量の値をＲＰＳ９の発現量の値で割った値を平均±標準偏差で示している。異符号はＴｕｋｅｙ－ｋｒａｍｅｒによる多重比較検定で有意な差を示す（Ｐ＜０．０５）。調査４での各飼料組成物を給与した時の浅胸筋における骨格筋細胞分化関連遺伝子発現（ｎ＝４）を示す図である。（Ａ）はミオゲニンの、（Ｂ）はミオスタチンの、（Ｃ）はＰａｘ７の発現量の相対値をそれぞれ示す。各因子の発現量の相対値は、各因子の発現量の値をＲＰＳ９の発現量の値で割った値を平均±標準偏差で示したものである。

１．対象とする家禽
　本発明における「家禽」は、飼育される鳥であれば特に限定されず、ニワトリ、ウズラ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、合鴨等の家禽であることができ、特にニワトリであることが好ましい。家禽は採肉用の家禽、及び、採卵用の家禽のどちらも含むが、好ましくは採肉用の家禽である。ニワトリとしては、採肉用ニワトリであるブロイラー、採卵用ニワトリであるレイヤー、或いはこれらの種鶏のいずれも本発明における家禽に含まれるが、より好ましくはブロイラーである。ブロイラーの具体的な品種としては、チャンキー、コッブが挙げられる。
２．酸化型グルタチオンを含有する飼料
　酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）とは、還元型グルタチオン（ＧＳＨ、Ｎ－（Ｎ－γ－Ｌ－グルタミル－Ｌ－システイニル）グリシン）の２分子がジスルフィド結合を介して結合して形成される物質である。

　本発明では、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）とは、他の物質と結合しておらずイオン化していないフリー体、ＧＳＳＧと酸又は塩基とで形成される塩、これらの水和物、これらの混合物等の、各種形態のＧＳＳＧを包含し得る。フリー体の形態のＧＳＳＧを上記式に示す。さらに、ＧＳＳＧは、ＧＳＳＧが産生される細胞中にある形態でもよいし、該細胞の破砕物の形態でもよい。同様に本発明では、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）は、他の物質と結合しておらずイオン化していないフリー体、ＧＳＨと酸又は塩基とで形成される塩、これらの水和物、これらの混合物等の、各種形態のＧＳＨを包含し得る。さらに、ＧＳＨは、ＧＳＨが産生される細胞中にある形態でもよいし、該細胞の破砕物の形態でもよい。

　本発明で用いられる飼料は、酸化型グルタチオンに加えて、還元型グルタチオンを含有するものであってもよいが、該飼料中では酸化型グルタチオンの質量が、還元型グルタチオンの質量よりも相対的に多いことが好ましく、実質的に還元型グルタチオンを含まないことがより好ましい。より好ましくは、本発明に用いられる飼料において、酸化型グルタチオンと還元型グルタチオンとの総質量（全てフリー体として換算した質量）に対して酸化型グルタチオンの総質量（フリー体として換算した質量）は、合計で７０質量％以上、より好ましくは８０質量％以上、より好ましくは９０質量％以上、更に好ましくは９５質量％以上、更に好ましくは９８質量％以上、最も好ましくは１００質量％である。

　ＧＳＳＧの塩としてはアンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リチウム塩等の肥料として許容される１種以上の塩であれば特に限定されないが、好ましくはアンモニウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩から選択される１種以上の塩である。特許文献６に開示されている通り、ＧＳＳＧの固体状のアンモニウム塩、カルシウム塩又はマグネシウム塩は低潮解性であり取扱いが容易であるとともに高水溶性であることから特に好ましい。このような塩は、特許文献６に記載されている通り、アンモニウムイオン、カルシウムカチオン、及びマグネシウムカチオンから選択される少なくとも１種を生成し得る物質の存在下、ＧＳＳＧを水及び／又は水可溶性媒体から選択される水性媒体と接触させながら温度３０℃以上に加温することにより固体として得ることができる。加温温度は３０℃以上であれば特に限定されないが、好ましくは３３℃以上、より好ましくは３５℃以上、特に好ましくは４０℃以上であり、上限は特に限定されないが例えば８０℃以下、好ましくは７０℃以下、特に好ましくは６０℃以下であり、工業規模での生産においては５３～６０℃の範囲が特に好ましい。前記水性媒体は、単独で用いてもよく２種以上を適宜組み合わせてもよいが、水と水可溶性媒体とを組み合わせて用いることが推奨される。この場合、水が酸化型グルタチオンの富溶媒として機能し、水可溶性媒体が貧溶媒として機能する。水可溶性媒体の容量は、水１０容量部に対して、例えば、１～１０００容量部程度、好ましくは５～５００容量部程度、さらに好ましくは１０～１００容量部程度、特に１２～５０容量部程度である。水可溶性媒体としてはアルコール類（メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、エチレングリコールなど）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトンなど）等を用いることができる。この方法で得られるＧＳＳＧ塩としてはＧＳＳＧの１アンモニウム塩、ＧＳＳＧの０．５カルシウム塩又は１カルシウム塩、ＧＳＳＧの０．５マグネシウム塩又は１マグネシウム塩等が例示できる。

　本発明で用いる飼料中における酸化型グルタチオンの含有量は特に限定されないが、フリー体換算量として、飼料の全量（湿重量基準）に対して好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上であり、好ましくは１．０質量％以下、より好ましくは０．１質量％以下、より好ましくは０．０７質量％以下、より好ましくは０．０５質量％以下である。

　本発明で用いる飼料の他の成分としては一般的な家禽用飼料に使用させる飼料原料、すなわち穀物（トウモロコシ、大麦、小麦、マイロなど）、油粕類（大豆粕、綿実粕、ナタネ粕、ゴマ粕、アマニ粕など）、食品製造粕類（ぬか、フスマ、そうこう類、トウモロコシ製造粕など）、発酵副産物、乳製品副産物、屠場副産物、油脂（動物由来、植物由来など）等である。

　飼料の、酸化型グルタチオンを含む上記各成分は、家禽に摂取させる前に予め混合された飼料組成物として提供されることが好ましいが、それには限定されず、それぞれが１種又は複数種の上記成分を含む、複数の組成物として家禽に与えられてもよい。

　飼料の形態としては、液状、練り状、固体状、粉末状、顆粒状等が挙げられる。

　本発明で用いる飼料は好ましくは家禽用の初期飼料組成物の形態で提供される。「家禽用の初期飼料組成物」とは、家禽の初期成長期のヒナ、具体的には孵化した後、孵化後約１６８時間後までの期間のヒナ、に与えるのに適した飼料組成物でありプレスターター飼料とも呼ばれる。
３．飼料の摂取
　本発明の各方法では、家禽に、孵化から孵化後２４～１６８時間までの期間に、酸化型グルタチオンを含有する前記飼料を摂取させることを特徴とする。当該期間は、より好ましくは、孵化から孵化後２４～１２０時間までの期間であり、他の好ましい態様としては、孵化から、孵化後４０時間以上の時点までの期間である。この期間の間、酸化型グルタチオン含有飼料のみを摂取させることが好ましいが限定されず、酸化型グルタチオンを含有しない飼料も併せて摂取させてもよい。孵化後に出荷されるヒナを使用する場合、ヒナの入荷以後に前記酸化型グルタチオン含有飼料の給与を開始すればよく、給与開始後は前記期間の終了時まで毎日前記酸化型グルタチオン含有飼料を給与することが好ましく、ここで孵化後のヒナは例えば孵化後２４時間以内に入荷される。

　飼料を家禽に与える方法としては、チックガード内に敷紙、餌付け箱、自動給餌器などの一般的な家禽の餌付け用・育成用の給餌法で行うことができる。前記期間の家禽による飼料の摂取量は、１日齢で１５～１７ｇ、２日齢で２０～２２ｇ、３日齢以降は不断給餌とすることが例示できる。

　前記期間中に１羽のヒナが摂取する酸化型グルタチオンの総量としては、フリー体換算量として、例えば１ｍｇ以上、好ましくは１０ｍｇ以上とすることができ、上限は特に限定されないが、例えば３００ｍｇ以下、好ましくは１００ｍｇ以下とすることができる。前記期間中での酸化型グルタチオンの摂取総量がこの範囲となるようにすることで、成長後の家禽の筋肉量を増大させ体重を増大させることができるとともに、初期ヒナの骨格筋において、骨格筋細胞の分化を促進するミオスタチン、又は／及びミオゲニンの発現量が低減し、その結果、骨格筋細胞が増殖することができる。前記期間終了までに、酸化型グルタチオンの摂取総量が前記の範囲となるようにするには、酸化型グルタチオン含有飼料を家禽のヒナに一回で又は数回（例えば２又は３回）に分割して摂取させてもよいが、ヒナの孵化後（孵化したヒナを入荷して使用する場合は入荷後）から前記期間が終了するまで、酸化型グルタチオン含有飼料を継続的に摂取させること、具体的には毎日摂取させることが好ましい。

　本発明の方法では、孵化から孵化後２４～１６８時間までの期間、或いは前記のより好ましい期間、に、酸化型グルタチオンを含有する前記飼料を家禽に摂取させた後は、通常飼料を摂取させ、出荷時体重（ブロイラーでは例えば３ｋｇ）になるまで飼育する。「通常飼料」とは、酸化型グルタチオンを含まない又は実質的に含まない飼料を指す。家禽の出荷日齢は、通常は孵化後４２日齢以降の家禽を指すが、本発明の効果は２１日齢以降の家禽全てに適用される。すなわち、本発明の方法によれば、家禽の筋肉量を増加させることができ、出荷日齢の短縮、出荷時体重の増加等、効率的な食肉生産を可能にする。
４．ミオスタチンの発現量の低減
　本発明の一実施形態は、孵化から孵化後２４～１６８時間までの期間における、家禽の骨格筋でのミオスタチンの発現量を低減させる方法に関する。この方法では該期間の全体にわたってミオスタチンの発現量が低減されている必要はなく、酸化型グルタチオンの総摂取量が有効量に達した段階、例えば少なくとも前記期間の終了時点までに、ミオスタチンの発現量が無摂取の場合と比較して低減されていればよい。

　本発明のこの形態においてミオスタチンの発現量は以下の測定方法により求められた発現量である。すなわち、骨格筋又は骨格筋細胞からＴｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出し、逆転写を行い、得られたｃＤＮＡを鋳型とした定量ＰＣＲでミオスタチンの増幅産物量を定量することにより求めることができる。これらの操作は既存の試薬キットを利用して実施してもよい。ミオスタチンの増幅産物量は、サンプル中に存在する総ＲＮＡあたりに換算するため、同様の手順で求めたＲＰＳ９の増幅産物量で割った値で示すことができる。ミオスタチンＤＮＡ増幅用プライマーセットとしては配列番号３で示す塩基配列からなるセンスプライマーと配列番号４で示す塩基配列からなるアンチセンスプライマーとのセットが使用できるが、これらには限定しない。ＲＰＳ９ＤＮＡ増幅用プライマーセットとしては配列番号１で示す塩基配列からなるセンスプライマーと配列番号２で示す塩基配列からなるアンチセンスプライマーとのセットが使用できるが、これらには限定しない。定量ＰＣＲとしてはリアルタイム法が使用できるが、適宜他の方法も使用することができる。
５．ミオゲニンの発現量の低減
　本発明の一実施形態は、孵化から孵化後２４～１６８時間までの期間における、家禽の骨格筋でのミオゲニンの発現量を低減させる方法に関する。この方法では該期間の全体にわたってミオゲニンの発現量が低減されている必要はなく、酸化型グルタチオンの総摂取量が有効量に達した段階、例えば少なくとも前記期間の終了時点までに、ミオゲニンの発現量が無摂取の場合と比較して低減されていればよい。

　本発明のこの形態においてミオスゲニンの発現量は、ミオスタチンＤＮＡ増幅用プライマーセットの代わりにミオゲニンＤＮＡ増幅用プライマーセットを用いて定量ＰＣＲを行うこと以外はミオスタチンの発現量の測定方法として上記した方法と同じ方法により測定することができる。ミオゲニンＤＮＡ増幅用プライマーセットとしては配列番号５で示す塩基配列からなるセンスプライマーと配列番号６で示す塩基配列からなるアンチセンスプライマーとのセットが使用できるが、これらには限定しない。

　以下、本発明を、具体例を参照して説明する。しかしながら以下の具体例は本発明の特範囲を限定するものではない。
調査１
調査方法
　孵化直後のチャンキー種のブロイラーヒナ（Ｒｏｓｓ３０８、Ｒｏｓｓ　Ｂｒｅｅｄｅｒｓ　Ｌｔｄ．）を供試した。対照区、試験区をそれぞれ設定し（３区×添加濃度２レベル）、３日間飼料組成物を給与し、屠殺した。ここで３日間の給与とは、ヒナは０日齢で入荷し、入荷後７２時間まで各試験飼料組成物を給与したことを指す。血液、骨格筋を採取し、ＭｙｏＤ、ミオゲニン、ミオスタチン、ＩＧＦ－Ｉ（インスリン様増殖因子－Ｉ）の遺伝子発現レベルを観察した。

　ＭｙｏＤおよびミオゲニンはＭｙｏＤファミリーに属し、筋衛星細胞を筋芽細胞に分化誘導する因子である。また、ミオスタチンは筋芽細胞の増殖を抑制する因子である。ＩＧＦ－Ｉは筋芽細胞の増殖と、筋繊維への分化形成を促進する因子である。ニワトリの初期成長期では、孵化後３日齢までは筋衛星細胞の増殖と筋芽細胞への分化が続き、４日齢以後は筋衛星細胞の増殖と筋芽細胞への分化は停止する。骨格筋細胞を増やして成長後のニワトリ成体の筋肉量を増大させるには、ＭｙｏＤ、ミオゲニン又はミオスタチンの３日齢前後までの骨格筋細胞での発現を抑制すればよいと考えられる。

　上記各因子の骨格筋での遺伝子発現のレベルの測定方法は以下の通りである。

　ホモゲナイズした骨格筋試料から市販のＴｏｔａｌ　ＲＮＡ抽出試薬（ＴＲＩＺＯＬ，　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＴｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。次いで、市販の逆転写酵素（Ｍ－ＭＬＶ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＴｏｔａｌ　ＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。このｃＤＮＡを鋳型としＲＰＳ９、ＩＧＦ－Ｉ、ミオスタチン、ＭｙｏＤ又はミオゲニンのＤＮＡを増幅するリアルタイムＰＣＲを行った。リアルタイムＰＣＲは、９６　ｗｅｌｌ　ＰＣＲプレートのウェル内にｃＤＮＡ、プライマーセット及び他の必要な試薬を加え、サーマルサイクラーにより、９５℃３分間のプレヒーティング後、変性、アニーリング、伸長の各工程を３５サイクル繰り返し、伸長工程後の吸光度をサイクル毎に測定した。求められたＩＧＦ－Ｉ、ミオスタチン、ＭｙｏＤ又はミオゲニンの増幅産物量を、ＲＰＳ９の増幅産物量で割った相対値を、各遺伝子の発現量とした。ＰＣＲに用いた各遺伝子増幅用のプライマーセット及びＰＣＲ条件を次表に示す。

　酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）としてはアンモニウム塩を用いた。該ＧＳＳＧでは、酸化型グルタチオンは９５．６質量％、還元型グルタチオンの混入は０．１質量％以下であった。

　酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）の添加レベルを０．０１質量％および０．１質量％に設定した飼料組成物は、トウモロコシ、大豆粕、コーングルテンミール、油脂、タンカル（粉）、第３リンカル、食塩、ＤＬ－メチオニン、塩化Ｌ－リジン、塩化コリン及びビタミンミネラルＮＲＣ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｕｎｃｉｌ，米国）要求量を含むＭＥ３，１００ｋｃａｌ／ｋｇ、ＣＰ２１の飼料組成物に、ＧＳＳＧを０．０１質量％および０．１質量％となるようにそれぞれ添加した組成物である。ここでＧＳＳＧ量は酸化型グルタチオンのフリー体として換算した量であり、以下の調査においても全て同様とした。

　なお上記及び以下の説明において「ＭＥ」とは「代謝エネルギー」を指す。「ＣＰ」とは「粗タンパク質」を指し、「ＣＰ２１」、「ＣＰ１８」はそれぞれ粗タンパク質含量が２１質量％、１８質量％であることを指す。

　各飼料組成物は、ヒナに敷紙を用いて餌付けし、３日以降は餌箱を用いて給餌することで与えた。前記期間の家禽による飼料の摂取量は１日齢で１５～１７ｇ、２日齢で２０～２２ｇ、３日齢以降は不断給餌とした。
調査時期
　６月初旬（飼養試験）、分析６～７月
結果
　３日齢時の体重を表２に示した。３日齢の体重は、０．０１質量％グルタチオンの添加により、増加する傾向が認められたが、有意ではなかった。

　３日齢時の骨格筋細胞の分化因子の遺伝子発現量の測定結果を図１に示した。ＧＳＳＧ添加区ではミオゲニン発現量（図１（Ｂ））およびミオスタチン発現量（図１（Ｃ））が対照区に比べ有意に低下した。このことから、初生ヒナの骨格筋細胞の分化を抑制する可能性が示唆された。
調査２－１
調査方法
　孵化直後のブロイラーヒナ（Ｒｏｓｓ　Ｂｒｅｅｄｅｒｓ　Ｌｔｄ．）に、調査１から適切だと推定されるＧＳＳＧ配合量０．０１質量％の飼料組成物を３日間給与し、その後、共通の通常飼料組成物に切り替えて孵化後２１日齢および２８日齢まで飼育し、増体や産肉性に影響が認められるかを明らかにした。
調査時期
　１０月（飼養試験）、分析１１月
試験区
　対照区および０．０１質量％ＧＳＳＧの添加区の計２区を設定した。

　各区雄６羽、雌６羽を供試し、０日齢で入荷したヒナに入荷後７２時間まで試験飼料組成物（初期飼料組成物）を給与し、その後、調査１で用いたのと同じ、ＧＳＳＧを添加していないＭＥ３，１００ｋｃａｌ／ｋｇ、ＣＰ２１の飼料組成物で２１日齢および２８日齢まで飼育して、体重およびムネ肉量、モモ肉量、肝臓重量を測定した。

　初期飼料組成物としては、ＧＳＳＧ添加区では、調査１で用いた０．０１質量％ＧＳＳＧ含有飼料組成物を用い、対照区では、調査１で用いた、ＧＳＳＧを添加していないＭＥ３，１００ｋｃａｌ／ｋｇ、ＣＰ２１の飼料組成物を用いた。

　各飼料組成物は、ヒナに敷紙を用いて餌付けし、３日以降は餌箱を用いて給餌することで与えた。前記期間の家禽による飼料の摂取量は１日齢で１５～１７ｇ、２日齢で２０～２２ｇ、３日齢以降は不断給餌とした。

　酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）としてはアンモニウム塩を用いた。該ＧＳＳＧでは、酸化型グルタチオンは９５．６質量％、還元型グルタチオンの混入は０．１質量％以下であった。
結果
　ＧＳＳＧ区では、対照区との有意差は認められなかったものの、２１日齢時および２８日齢時の体重が対照区に比べ増加する傾向が認められた（表３）。

調査２－２
調査方法
　孵化直後のブロイラーヒナ（Ｒｏｓｓ３０８，Ｒｏｓｓ　Ｂｒｅｅｄｅｒｓ　Ｌｔｄ．）に、調査２－１と同様に、試験飼料組成物を３日間給与し、その後、共通の通常飼料組成物に切り替えて４０日齢まで飼育し、４０日齢の増体、正肉歩留まりおよび飼料要求率に影響が認められるかを明らかにした。
調査時期
　１月～２月
試験区
　対照区および０．０１質量％ＧＳＳＧ添加区の計２区を設定した。

　各区雄６羽、雌６羽を供試し、０日齢で入荷したヒナに入荷後７２時間まで試験飼料組成物（初期飼料組成物）を給与し、その後、調査１で用いたのと同じ、ＧＳＳＧを添加していないＭＥ３，１００ｋｃａｌ／ｋｇ、ＣＰ２１の飼料組成物で２１日齢まで飼育、その後、ＧＳＳＧを添加していないＭＥ３，２００ｋｃａｌ／ｋｇ、ＣＰ１８の飼料組成物で４０日齢まで飼育して、体重、正肉歩留り、飼料要求率を測定した。

　上記の、ＭＥ３，２００ｋｃａｌ／ｋｇ、ＣＰ１８の飼料組成物は、トウモロコシ、マイロ、大豆粕、チキンミール、魚粉、油脂、タンカル（粉）、第３リンカル、食塩、ＤＬ－メチオニン、塩酸Ｌ－リジン、塩化コリン及びビタミンミネラルＮＲＣ要求量を含む。

　「飼料要求率」とは１ｇの増体に必要な飼料の量（ｇ）を意味する。

　「正肉歩留まり」とは、体重に対する骨や脂肪などを除いた肉の割合を指し、屠殺後解体して、肉部分のみを採取して重量を測定して求めることができる。
結果
　結果を表４に示す。

　ＧＳＳＧ区では有意な体重増加を示し、飼料要求率も有意な改善傾向（Ｐ＝０．０６）が認められた。

調査３
調査方法
　孵化直後のブロイラーヒナ（Ｒｏｓｓ３０８，　Ｒｏｓｓ　Ｂｒｅｅｄｅｒｓ　Ｌｔｄ．）から採取した骨格筋細胞の分化促進培養系（初生ヒナの骨格筋細胞の状態を模倣した培養条件）に酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を添加し、シグナル因子のリン酸化をウエスタン・ブロットにより解析し、分化抑制メカニズムを考察した。

　筋形成に関する遺伝子としてＭｙｏＤ、ミオスタチン、ＩＧＦ－Ｉ、Ｐａｘ７の発現量を測定した。Ｐａｘ７は筋衛星細胞のマーカーである。ＭｙｏＤ、ミオスタチン、ＩＧＦ－Ｉの発現量の測定法は調査１に記載の通りである。Ｐａｘ７の発現量は、プライマーセットとして次表で示すプライマーセットを用いた以外は調査１に記載の方法で求めた。

調査時期
　１２月、分析１月
試験区
　非特許文献１に記載された骨格筋細胞の分化促進培養系（初生ヒナの骨格筋細胞の状態を模倣した培養条件）を用いた実験を行った。この実験の詳細は非特許文献１に記載の通りであり、その概略を以下に示す。

　０日齢のブロイラーヒナから調製した筋芽細胞を、φ９０ｍｍディッシュに５×１０^３／ｃｍ^２の濃度で播き、培地（ＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ）とＭ１９９（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ）が４：１になるよう混合し、ＦＢＳ（ウシ胎児血清：ｂｉｏ　ｗｅｓｔ）が１０％、ペニシリン・ストレプトマイシン（Ｐｅｎ　Ｓｔｒｅｐ：ｇｉｂｃｏ）が１％になるよう加えた培地）を加え、３７℃、５％濃度ＣＯ_２の環境下で培養した。細胞がサブコンフルエントな状態になったのを確認し、１２穴プレート（住友ベークライト、コラーゲン　ＴｙｐｅＩコート）に細胞を播き直し、撒き直し１２時間後に分化用培地（前記培地でのＦＢＳ濃度が２％となるように調整した培地）に置換して実験を開始した。前記分化用培地への置換と同時に、ＧＳＳＧを１００μＭ添加し、０、１２、２４時間後の細胞を回収し、筋形成に関する遺伝子の発現を測定した。

　酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）としてはアンモニウム塩を用いた。該ＧＳＳＧでは、酸化型グルタチオンは９５．６質量％、還元型グルタチオンの混入は０．１質量％以下であった。
結果
　遺伝子発現変動を図２に示した。調査１と同様、ＧＳＳＧの添加により骨格筋細胞増殖抑制因子であるミオスタチンのｍＲＮＡ発現量は有意に低下した（図２（ｂ））。同様に、増殖可能な筋細胞のマーカーであるＰａｘ７の発現は培養１２時間目にＧＳＳＧ添加区で対照区に比べ有意に上昇した（図２（ｄ））。
調査１～３からの結論
　ＧＳＳＧは、骨格筋細胞増殖抑制因子であるミオゲニン又は/及びミオスタチンの遺伝子発現の抑制を介して、分化誘導期（初期成長期と同様の状況）における増殖可能な筋細胞を増加させることが明らかになった。
調査４
調査方法
　孵化直後のブロイラーヒナ（Ｒｏｓｓ　Ｂｒｅｅｄｅｒｓ　Ｌｔｄ．）を供試した。対照区（＝無添加区）、０．０１質量％ＧＳＳＧ添加区、０．０１質量％ＧＳＨ添加区を、各区雄５羽雌５羽となるように設定し、３日間飼料組成物を給与した。ここで３日間の給与とは、ヒナは０日齢で入荷し、入荷後７２時間まで各試験飼料組成物を給与したことを指す。この時点で各区雄２羽雌２羽を屠殺し、血液、骨格筋を採取し、ＭｙｏＤファミリー（ミオゲニン、ミオスタチン、Ｐａｘ７）の遺伝子発現レベルを観察した。残りの各区雄３羽雌３羽については共通の通常飼料組成物に切り替えて３５日齢まで飼育を継続し、増体や産肉性に影響が認められるかを明らかにした。統計は、雌雄とその交互作用を考慮した混合モデルで解析した。

　上記各因子の骨格筋での遺伝子発現のレベルの測定方法は既述の通りである。

　還元型グルタチオン（ＧＳＨ）としては、還元型グルタチオン９９．４質量％、酸化型グルタチオンの混入は、０．１％質量％以下のものを用いた。

　酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）の添加量を０．０１質量％に設定した飼料組成物は調査１において詳述した通りである。

　還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の添加量を０．０１質量％に設定した飼料組成物は、調査１において詳述したＧＳＳＧ含有飼料組成物において、０．０１質量％ＧＳＳＧの代わりにＧＳＨを０．０１質量％となるように配合したものである。

　対照区で孵化後３日間与えた無添加の飼料組成物は、調査１と同様に、ＧＳＳＧ及びＧＳＨを含まないＭＥ３，１００ｋｃａｌ／ｋｇ、ＣＰ２１の飼料組成物である。

　孵化後３日経過後以降に与える通常飼料組成物としては、ＧＳＳＧ及びＧＳＨを含まないＭＥ３，１００ｋｃａｌ／ｋｇ、ＣＰ２１の飼料組成物を用いた。

　各飼料組成物は、ヒナに敷紙を用いて餌付けし、３日以降は餌箱を用いて給餌することで与えた。前記期間の家禽による飼料の摂取量は１日齢で１５～１７ｇ、２日齢で２０～２２ｇ、３日齢以降は不断給餌とした。
調査時期
　８月初旬（飼養試験）、分析９～１０月
結果
　３５日齢まで飼育した個体での体重の測定結果を表６に示す。ＧＳＳＧ添加区では体重の増加傾向（Ｐ＝０．０７）が認められた。一方、ＧＳＨでは有意な差は認められなかった。

　３日齢時の骨格筋細胞の分化因子の遺伝子発現量の測定結果を図３に示した。ＧＳＳＧ添加区ではミオゲニンの発現量が、対照区と比較して有意に低下していたが、ＧＳＨ添加区では対照区と比較した低下の程度が小さかった。

　これらの結果からブロイラーの増体促進作用はＧＳＳＧがＧＳＨよりも大きいと推測された。

調査５
　還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を主成分とするグルタチオン酵母の増体改善効果を確認した。
調査方法
　孵化直後のブロイラー雄ヒナ（Ｒｏｓｓ　Ｂｒｅｅｄｅｒｓ　Ｌｔｄ．）を供試した。対照区（＝無添加区）、グルタチオン酵母をＧＳＨ換算で０．０１質量％となるように飼料に添加した試験区、グルタチオン酵母をＧＳＨ換算で０．１質量％となるように飼料に添加した試験区を、各区６羽あるいは８羽となるように設定し、３日間飼料組成物を給与した。ここで３日間の給与とは、ヒナは０日齢で入荷し、入荷後７２時間まで各試験飼料組成物を給与したことを指す。その後、共通の通常飼料組成物に切り替えて２１日齢まで、或いは、４２日齢まで飼育し、増体や産肉性に影響が認められるかを明らかにした。通常飼料組成物としては、調査２－２と同様に、２１日齢まではＭＥ３，１００ｋｃａｌ／ｋｇ、ＣＰ２１の飼料組成物を用い、その後はＭＥ３，２００ｋｃａｌ／ｋｇ、ＣＰ１８の飼料組成物を用いて飼育した。

　グルタチオン酵母をＧＳＨ換算で０．０１質量％又は０．１質量％となるように添加した飼料組成物は、調査１において詳述したＧＳＳＧ含有飼料組成物において、ＧＳＳＧの代わりにグルタチオン酵母を所定量となるように配合したものである。

　対照区で孵化後３日間与えた無添加の飼料組成物は、調査１と同様に、グルタチオン酵母を含まないＭＥ３，１００ｋｃａｌ／ｋｇ、ＣＰ２１の飼料組成物である。

　正肉歩留り及び飼料要求率の定義は調査２－２に記載の通りである。
調査時期
　１０月、１１月（飼養試験）
結果
　結果を表７、８に示す。

　グルタチオン酵母を初生ヒナに３日間与え、その後通常飼育した場合、有意な増体効果は示されなかった。還元型グルタチオンを含むグルタチオン酵母を飼料に配合しても、増体効果は期待できないことが分かる。

調査６
調査方法
　孵化直後のブロイラーヒナ（Ｒｏｓｓ　Ｂｒｅｅｄｅｒｓ　Ｌｔｄ．）に、ＧＳＳＧ配合量０．０１質量％または０．０５質量％の飼料組成物を３日間給与し、その後、共通の通常飼料組成物に切り替えて孵化後２１日齢まで飼育し、増体に影響が認められるかを明らかにした。
調査時期
　９月
試験区
　対照区、０．０１質量％ＧＳＳＧの添加区および０．０５質量％ＧＳＳＧの添加区の計３区を設定した。

　各区雄６羽、雌６羽を供試し、０日齢で入荷したヒナに入荷後７２時間まで試験飼料組成物（初期飼料組成物）を給与し、その後、調査１で用いたのと同じ、ＧＳＳＧを添加していないＭＥ３，１００ｋｃａｌ／ｋｇ、ＣＰ２１の飼料組成物で２１日齢まで飼育して、体重を測定した。

　初期飼料組成物として用いた、ＧＳＳＧ添加レベルを０．０１質量％および０．０５質量％に設定した飼料組成物は、調査１と同様に、トウモロコシ、大豆粕、コーングルテンミール、油脂、タンカル（粉）、第３リンカル、食塩、ＤＬ－メチオニン、塩化Ｌ－リジン、塩化コリン及びビタミンミネラルＮＲＣ要求量を含むＭＥ３，１００ｋｃａｌ／ｋｇ、ＣＰ２１の飼料組成物に、ＧＳＳＧを０．０１質量％および０．０５質量％となるようにそれぞれ添加した組成物である。対照区では、調査１で用いた、ＧＳＳＧを添加していないＭＥ３，１００ｋｃａｌ／ｋｇ、ＣＰ２１の飼料組成物を用いた。

　ＧＳＳＧとしてはアンモニウム塩を用いた。該ＧＳＳＧでは、酸化型グルタチオンは９５．６質量％、還元型グルタチオンの混入は０．１質量％以下であった。
結果
　２１日齢時の各試験区の体重の測定結果を表９に示す。０．０５質量％ＧＳＳＧ添加区では、対照区と比較して有意に２１日齢時の体重が高かった。また、０．０１質量％ＧＳＳＧ添加区についても、対照区と比較して２１日齢時の体重が高い傾向が認められた。

調査７
調査方法
　孵化直後のブロイラーヒナ（Ｒｏｓｓ　Ｂｒｅｅｄｅｒｓ　Ｌｔｄ．）に、ＧＳＳＧ配合量０．０５質量％の飼料組成物を孵化後３日齢、７日齢又は１４日齢になるまで給与し、３日齢又は７日齢まで給与した場合はその後、共通の通常飼料組成物に切り替えて孵化後１４日齢まで飼育し、増体に影響が認められるかを明らかにした。
調査時期
　９月
試験区
　対照区、０．０５質量％ＧＳＳＧ添加飼料を３日齢まで添加した試験区１、０．０５質量％ＧＳＳＧ添加飼料を７日齢まで添加した試験区２、０．０５質量％ＧＳＳＧ添加飼料を１４日齢まで添加した試験区３の計４区を設定した。

　各区雄６羽、雌６羽を供試し、０日齢で入荷したヒナに３日齢（孵化後７２時間）まで（試験区１）、７日齢（孵化後１６８時間）まで（試験区２）又は１４日齢（孵化後３３６時間）まで（試験区３）、試験飼料組成物（初期飼料組成物）を給与し飼育した。試験区１及び試験区２では、その後、調査１で用いたのと同じ、ＧＳＳＧを添加していないＭＥ３，１００ｋｃａｌ／ｋｇ、ＣＰ２１の飼料組成物で１４日齢まで飼育した。１４日齢まで飼育した後、体重を測定した。対照区では、調査１で用いた、ＧＳＳＧを添加していないＭＥ３，１００ｋｃａｌ／ｋｇ、ＣＰ２１の飼料組成物を用い、１４日齢まで飼育した後、体重を測定した。

　試験区１～３において初期飼料組成物として用いた、ＧＳＳＧ添加レベルを０．０５質量％に設定した飼料組成物は、調査１と同様に、トウモロコシ、大豆粕、コーングルテンミール、油脂、タンカル（粉）、第３リンカル、食塩、ＤＬ－メチオニン、塩化Ｌ－リジン、塩化コリン及びビタミンミネラルＮＲＣ要求量を含むＭＥ３，１００ｋｃａｌ／ｋｇ、ＣＰ２１の飼料組成物に、ＧＳＳＧを０．０５質量％となるようにそれぞれ添加した組成物である。

　ＧＳＳＧとしてはアンモニウム塩を用いた。該ＧＳＳＧでは、酸化型グルタチオンは９５．６質量％、還元型グルタチオンの混入は０．１質量％以下であった。
結果
　１４日齢時の対照区及び試験区１～３の体重の測定結果を表１０に示す。

　３日齢までＧＳＳＧ添加飼料を給与した試験区１および７日齢までＧＳＳＧ添加飼料を給与した試験区２では、対照区と比較して、１４日齢時体重の増加が認められた。一方、１４日齢時まで連続してＧＳＳＧ添加飼料を給与した試験区３では、１４日齢時体重について対照区と大きな差は認められなかった。ＧＳＳＧ添加飼料は７日齢までの給与にとどめておくことが好ましいことが示唆された。

　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims

　家禽の飼育方法であって、孵化から孵化後２４～１６８時間までの期間に、酸化型グルタチオンを含有する飼料を家禽に摂取させる工程を含む方法。
　家禽の筋肉量を増大させる方法であって、孵化から孵化後２４～１６８時間までの期間に、酸化型グルタチオンを含有する飼料を家禽に摂取させる工程を含む方法。
　孵化から孵化後２４～１６８時間までの期間に、酸化型グルタチオンを含有する飼料を家禽に摂取させる工程を含む、前記期間における、家禽の骨格筋での、ミオスタチン又は／及びミオゲニンの発現量を低減させる方法。
　酸化型グルタチオンを含有することを特徴とする、家禽用の初期飼料組成物。